CN101747449B

CN101747449B - 一种纳米壳聚糖衍生物亲和介质,其制备方法和用途

Info

Publication number: CN101747449B
Application number: CN2008101797171A
Authority: CN
Inventors: 邹霞娟; 钟丽君; 刘丹; 娄雅欣; 杨彬; 彭嘉柔
Original assignee: Peking University
Current assignee: Peking University
Priority date: 2008-11-28
Filing date: 2008-11-28
Publication date: 2012-05-30
Anticipated expiration: 2028-11-28
Also published as: CN101747449A

Abstract

本发明涉及生物医学纳米材料技术领域。具体而言，本发明提供一种纳米壳聚糖衍生物亲和介质，其制备方法，以及利用该亲和介质分离和富集蛋白质分子的方法。所述制备方法包括将壳聚糖溶于稀酸，再与甲基丙烯酸环氧丙酯或丙烯酸环氧丙酯混合，进行自聚反应和接枝反应，从而得到带有活性环氧基团的纳米复合介质壳聚糖衍生物，此复合介质与亚胺基二乙酸或氨基三乙酸或乙二胺三乙酸进行开环加成反应得到带有羧基活性官能团的纳米复合介质壳聚糖衍生物，最后与过渡金属离子发生络合作用而制得最终的纳米壳聚糖衍生物亲和介质。分离和富集蛋白质分子的方法包括在不同的吸附和洗脱条件下，将分析物吸附在此亲和介质上，并用质谱测定和分析保留在此介质上的分析物。该方法可应用于生物、医学和环境领域，包括临床诊断和新药的发现。

Description

一种纳米壳聚糖衍生物亲和介质,其制备方法和用途

一种纳米壳聚糖衍生物亲和介质，其制备方法，以及利用该亲和介质分离和富集蛋白质分子的方法

技术领域

本发明涉及生物医学纳米材料技术领域。具体而言，本发明提供一种纳米壳聚糖衍生物亲和介质，其制备方法，以及利用该亲和介质分离和富集蛋白质分子的方法。此纳米壳聚糖衍生物亲和介质能特异性的吸附结合某些蛋白分子，从而进行复杂生物体系中功能蛋白质的分离。

背景技术

蛋白质组学是1994年由澳大利亚科学家Wilkins等提出的新概念，是后基因组时代生命科学研究的新生长点。它是通过在蛋白质水平上对细胞或机体基因所表达的整体蛋白质的定量研究，以揭示生命的过程和解释基因表达调控的机理。蛋白质组学的研究重点之一是筛选功能蛋白和生物标识物，建立高通量、规模化、高灵敏度和高精确度的蛋白质组组分谱，蛋白质功能连锁谱和蛋白质功能筛选的技术体系，并实用于疾病相关蛋白质群的研究和临床诊断。该领域的核心课题之一是建立复杂生物体系蛋白质组的高效分离、规模化鉴定技术和新方法。

蛋白质组学中常用的技术是二维凝胶电泳和质谱的结合，其优点是能解析几千个蛋白，但是这种技术需要大量的蛋白样品，制作过程复杂，缺泛可靠的重复性，对于分子量低于10Kd的蛋白和低丰度蛋白难以解出，并且不能直接用于临床诊断。由Ciphegen生物系统公司研发的表面增强激光解吸离子化-蛋白质芯片系统(surface enhanced laserdesorption ionization-proteinchip，SELDI-ProteinChip)是最新发展起来的蛋白质组技术平台(United States Patent 6,881,586)。该系统中，蛋白质芯片表面经过某种化学或生化方式处理(表面增强)，使之具备与某一类蛋白特异结合的能力。血清或蛋白抽提物直接加到芯片表面，孵育后洗涤。特异的蛋白因化学(或生化)的特性与芯片结合，从而从蛋白混合物中分离出来。然后该芯片通过“芯片读码器”(一种SELDI-TOF-MS)得到与芯片结合的蛋白质质谱图。SELDI-蛋白质芯片系统可用于比较任何一组对照样品或不同疾病状态下的蛋白质谱变化，以此鉴定生物标记物或疾病相关靶。该系统在样品的制备和分析上容易和省时，并且在检测低丰度、低分子量蛋白方面有独特优势，但是对所吸附的分析物进行鉴定是不可能的。最近开发的材料增强激光解吸离子化方法(material-enhanced laser desorption/ionization，MELDI)是SELDI方法的提升，MELDI方法不仅包含表面衍生物对特异的蛋白的结合，而且还包含了所用材料的物理化学性能(孔径，疏水性等)和材料的形态学。现已报道的MELDI方法的介质成份有硅、纤维素、金刚石、纳米管和聚合物等(R.Terracciano et al.Proteomics2006，6，3243-3250；Feuerstein et al.J.Proteome.Res.Vol.4，No.6，20052321；Vallant et al.J.Proteome.Res.Vol.6，No.1，2007 45；Najam-ul-Haq，M et al.Curr.Nanosci.2006，2，1-7.Rainer，M.；RapidCommun.Mass Spectrom.2006，20，2954-2960)，它们所产生的特征性蛋白质质谱图丰富了SELDI方法和生物标识物的发现。壳聚糖(Chitosan)又称可溶性甲壳质、甲壳胺、几丁聚糖等，化学名为2-氨基-β-1，4-葡聚糖，它是甲壳素经脱乙酰基而得到的一种天然阳离子多糖。具有可降解性、良好的成膜性、良好的生物相容性及一定的抗菌和抗肿瘤等优异性能。广泛应用于医药、食品、化工、环保等行业，素有万能多糖的美誉(R.Jayakumar et al.Carbohydrate Polymers 62(2005)142-158)。甲壳素在自然界分布非常广，是一种廉价易得的原料。本发明提供一种用于蛋白质分子的分离和富集的纳米壳聚糖衍生物亲和介质的制备方法，使壳聚糖与甲基丙烯酸环氧丙酯或丙烯酸环氧丙酯进行自聚反应得到的聚合物进行充分的接枝反应，后与亚胺基二乙酸钠或氨基三乙酸进行开环反应得到羧基活性官能团，再与过渡金属离子发生络合作用而制得此亲和介质，此材料能特异性的吸附结合某些蛋白分子，从而使蛋白分子从复杂的生物体系中得到分离，结合nano-LC-ESI-MS/MS质谱和数据库检索，可对吸附的分析物进行结构鉴定。

发明内容

本发明的目的是提供一种纳米壳聚糖衍生物亲和介质，其制备方法，以及利用该亲和介质分离和富集蛋白质分子的方法。

本发明提供一种纳米壳聚糖衍生物亲和介质，由带有活性羧基官能团的壳聚糖衍生物与过渡金属离子络合而成，其特征在于颗粒大小为1-300nm，优选为20-100nm，以及固载基质为壳聚糖。在一个实施方案中，活性羧基官能团选自亚胺基二乙酸或氨基三乙酸或乙二胺三乙酸。在另一实施方案中，过渡金属离子选自Co²⁺，Cu²⁺，Ni²⁺或Zn²⁺。

本发明提供纳米壳聚糖衍生物亲和介质的制备方法，包括下列步骤：(1)将壳聚糖溶于稀酸水溶液(所述稀酸选自甲酸或乙酸)，与甲基丙烯酸环氧丙酯或丙烯酸环氧丙酯混合，进行自聚反应和接枝反应，得到带有活性环氧基团的壳聚糖衍生物，(2)接着与亚胺基二乙酸钠或氨基三乙酸或乙二胺三乙酸进行开环加成反应，得到带有羧基活性官能团的壳聚糖衍生物，(3)再与选自Co²⁺，Cu²⁺，Ni²⁺或Zn²⁺的过渡金属离子发生络合作用，制得所述纳米壳聚糖衍生物亲和介质，其中自聚和接枝的反应温度为40-100℃，开环反应温度为50-80℃。在一个实施方案中，自聚和接枝的反应加入选自偶氮二异丁腈，正丁基锂，过硫酸钾，硝酸铈铵，硫代碳酸-溴酸钾，二高碘酸铜酸钾，或过硫酸氨和硫代硫酸钠的引发剂。在另一各实施方案中，引发剂加入量为反应单体重量的1-5％。在另一实施方案中，与亚胺基二乙酸钠或氨基三乙酸或乙二胺三乙酸发生开环加成反应时，pH值为8-12。在另一实施方案中，与过渡金属离子发生络合作用时，Cu²⁺的浓度为10mM-100mM。

本发明提供一种利用纳米壳聚糖衍生物亲和介质分离和富集蛋白质分子的方法，其特征在于在不同的吸附和洗脱条件下，将分析物吸附在上述亲和介质上，并用质谱测定和分析保留在此亲和介质上的分析物。在一实施方案中，选择适当的条件，用质谱技术鉴定生物标识物或疾病相关靶。在另一实施方案中，将上述纳米壳聚糖衍生物亲和介质涂在芯片上进行微量蛋白质分子和多肽的富集和分离。在另一实施方案中，将上述纳米壳聚糖衍生物亲和介质填充入色谱柱中进行大规模的蛋白质分子和多肽的富集和分离。在另一实施方案中，分析物是血清，血浆，体液，组织或细胞裂解液。

本发明纳米壳聚糖衍生物亲和介质相对于传统的材料而言，所选择材料廉价，易得，具有良好的生物相容性，性质稳定，纳米球颗粒大小为1～300nm，具有很大的外比表面积，可制膜和填充于色谱柱中。此外，本发明纳米壳聚糖衍生物亲和介质的材料表面固定有过渡金属，可利用某些功能蛋白分子的结构中富含组氨酸结构，以组氨酸中的咪唑环与固定在材料表面的过渡金属发生相互的络合作用，以发挥过渡金属离子特异性的吸附结合富含组氨酸结构的蛋白分子的功能和所用材料的物理化学性能，从而使蛋白分子从复杂的生物体系中得到分离，再用质谱技术鉴定生物标识物或疾病相关靶。

本发明利用纳米壳聚糖衍生物亲和介质富集和分离蛋白质的过程可按本领域常规操作步骤进行，可将所述纳米壳聚糖衍生物亲和介质涂在芯片上进行微量蛋白质分子和多肽的富集和分离，还可将所述纳米材料作为色谱填料，用于蛋白质分子和多肽的富集和纯化，实现大规模的蛋白质分子和多肽的富集和分离。

本发明具体操作步骤如下：

(1).壳聚糖与甲基丙烯酸环氧丙酯或丙烯酸环氧丙酯自聚反应得到的聚合物进行接枝反应；

(2).与亚胺基二乙酸钠或氨基三乙酸或乙二胺三乙酸进行开环加成反应；

(3).上述纳米壳聚糖衍生物与一定浓度的过渡金属离子发生络合作用，使过渡金属离子固定在纳米材料的表面，过渡金属离子有Co²⁺，Cu²⁺，Ni²⁺，Zn²⁺等；

(4).在不同的吸附和洗脱条件下，将分析物特异性的吸附结合在上述纳米材料上；

(5).用质谱直接测定上述纳米材料所吸附结合蛋白的蛋白质谱图或将特异性的吸附结合蛋白从上述纳米材料中洗脱下来，再进行进一步的分离和质谱的鉴定。

上述(1)反应中，反应介质为稀酸水溶液，其中壳聚糖的含量为1.5％-2.5％，甲基丙烯酸环氧丙酯或丙烯酸环氧丙酯的含量为2％-10％，控制反应温度为40-100℃，自聚接枝反应时间为0.5-4小时为宜。在反应过程中要加入引发剂引发反应，引发剂加入量以反应单体重的1-5％。与亚胺基二乙酸钠或氨基三乙酸或乙二胺三乙酸发生开环反应的反应介质为水溶液，pH值为8-12，反应温度为50-80℃。

下面通过实施例结合附图对本发明给予进一步说明。

附图说明

图1为纳米壳聚糖衍生物亲和介质的合成线路图。

图2为各纳米材料的红外吸收光谱图，其中1为原料壳聚糖，2为壳聚糖-GMA环氧纳米材料，3为壳聚糖-GMA-IDA纳米材料，4为壳聚糖-GMA-IDA-Cu(II)亲和介质纳米材料。

图3为各纳米材料的电镜图，其中3A为壳聚糖-GMA环氧纳米材料的负染透射电镜图，由图可以看出，此纳米材料为球型；图3B为壳聚糖-GMA-IDA纳米材料的负染透射电镜图，由图可以看出，此纳米材料为球型；图3C壳聚糖-GMA-IDA-Cu(II)亲和介质纳米材料的透射电镜图，由图可以看出，此纳米材料为球型，表面与金属铜离子结合。

图4为亲和介质纳米材料对血清的吸附所得质谱图(M/z1kDa-10kDa)，所用基质分别为CHCA(A)，DHB(B)和SA(C)。

图5为亲和介质纳米材料对血清的吸附所得质谱图(M/z1kDa-70kDa)，所用基质分别为CHCA(A)和SA(B)。

图6为用亲和介质纳米材料选择性富集分析物中多肽和蛋白并用质谱进行鉴定的流程图。

图7为用nano-LC-ESI-MS/MS质谱方法分析鉴定所富集的多肽(M/z506.31四电荷峰)的序列实施例。

实施例1

壳聚糖-GMA环氧介质(chitosan-GMA，中间体1)的制备

在装有搅拌器，温度计和冷凝管的100mL三口烧瓶中，将0.5克的壳聚糖(青岛海汇生物有限公司)溶于30mL含有稀乙酸(2wt％)的水溶液中，加入0.5mL的甲基丙烯酸环氧丙酯，搅拌，再加入0.035克过硫酸铵和0.035克硫代硫酸钠，升温至50℃，反应2小时，停止反应，降至室温后，离心去上清液，再用水洗涤，得到固体物。

结构特征：图3A是壳聚糖-GMA环氧介质负染透射电镜图，由图可以看出，此材料为球型，大小为20-100nm；其红外波谱(图2.2)特征峰为：3410.2，2927.2，1730.7，1639.8，1452.3，1259.8，1157.9，1076.9，905.7，846.0，752.4；元素分析结果为C 48.69％，H 7.05％，N 2.51％。壳聚糖的红外波谱(图2.1)特征峰为：3446.5，2925.2，1652.4，1608.2，1510.9，1454.6，1419.6，1380.9，1300.5，1248.6，1155.5，1085.8，1036.6，832.2，666.0，575.8，元素分析结果为C 39.99％，H 7.23％，N 7.19％。

实施例2

壳聚糖-GMA-IDA羧酸介质(chitosan-GMA-IDA，中间体2)的制备

在装有搅拌器，温度计和冷凝管的100mL三口烧瓶中，装入实施例1制备的复合介质，加入0.5克的亚胺基二乙酸钠，0.25克氯化钠和20mL浓度为2N的碳酸钠溶液，升温到60℃，反应5小时，停止反应，降至室温后，过滤，用水洗涤至中性，得到固体物。

结构特征：图3B壳聚糖-GMA-IDA羧酸介质的负染透射电镜图，由图可以看出，此材料为球型，大小为20-100nm；其红外波谱(图2.3)特征峰为：3437.9，2929.8，1929.5，1640.1，1607.3，1452.1，1387.3，1253.4，1154.4，1072.1，908.5，842.1，754.6；元素分析结果为C 46.89％，H 7.19％，N 2.46％。

实施例3

固定过渡金属离子的壳聚糖-GMA-IDA-Cu(II)(chitosan-GMA-IDA-Cu(II))亲和基质的制备

将实施例2制备的壳聚糖-GMA-IDA羧酸介质装入烧杯中，加入20mL浓度为100mM硫酸铜溶液，搅拌，室温反应2小时，过滤，用水洗涤，烘干，碾磨得固体粉末。该亲和介质为纳米材料，颗粒大小为20-100nm。

结构特征：图3C是壳聚糖-GMA-IDA-Cu(II)亲和介质的透射电镜图，由图可以看出，此材料为球型，大小为20-100nm，表面与金属铜离子结合；用原子吸收光谱方法测定铜的含量为25.5mg/g(三次的平均值)；其红外波谱(图2.4)特征峰为：3423.2，2927.8，1729.8，1633.6，1510.4，1452.5，1386.5，1253.1，1154.8，1122.5，1065.3，906.3，841.1，755.6。元素分析为C 49.57％，H 6.90％，N 1.22％。

实施例4

血清中的蛋白特异的富集和MALDI-TOF-MS分析

(1).血清的处理：在100μL血清中加入900μL水；

(2).亲和基质纳米材料的处理：称取1mg上述亲和基质纳米材料，先用200μL醋酸钠(pH4.5)溶液激活，离心去上清液，加入200μL 水洗涤一次，再加入200μL PBS洗涤两次，离心，去上清液；

(3).将200μL按上述处理的血清液加入处理的亲和介质纳米材料中，在室温下，转动混旋2小时，离心去上清液，用PBS缓冲液洗涤两次，再用水洗涤一次，离心，去上清液；

(4).将0.8μL的α-氰基-4-羟基肉桂酸(α-Cyano-4-hydroxycinnamicacid，CHCA)基质(浓度为10mg/mL的50％乙腈和1％三氟乙酸的水溶液)点在靶板上，再与上述结合有蛋白的亲和介质纳米材料的悬浮液0.8μL混合，用枪头抽吸几次，自然晾干，用MALDI-TOF-MS测定得质谱图。所有的MALDI-TOF-MS质谱分析是在岛津的AXIMA-CFPplus(KRATOS Analytical，Shimadzu Group Company)飞行时间质谱仪上完成，N₂脉冲激光的波长为337.1nm，实验中所得数据都在线性正离子模式中进行，质谱分子量的校正采用外标法，所用标准物为细胞色素C和血红蛋白，实验中每个质谱图是200激光点的累加。参见附图4A；

(5).分析结果：由图4A可见，此亲和介质纳米材料能大量选择性富集血清中分子量在1kDa-10kDa的多肽和蛋白质，这是传统的二维凝胶电泳无法检出的范围。

实施例5-6

与实施例4的基本方法一样，除了用于(MALDI-TOF-MS)质谱分析的基质分别为芥子酸(sinapinic acid，SA)(浓度为20mg/mL的50％乙腈和1％三氟乙酸的水溶液)和2，5-二羟基苯甲酸(DHB浓度为20mg/mL的50％乙腈和1％磷酸的水溶液)之外。参见附图4B和4C。

分析结果：比较图4A，4B和4C，可以看出，基质CHCA和DHB在分子量小于5000时，能检出更多的峰，其中用基质DHB所得质谱峰的信燥比更高；基质SA在较大分子量处检出峰更多，并且用基质CHCA和SA可检出白蛋白的峰(M/z 66kDa)(图5A和图5B)，说明此亲和介质纳米材料有广泛的吸附和富集血清中的多肽和蛋白的能力。

实施例7

血清中特异富集的多肽的鉴定(nano-LC-ESI-MS/MS)

称取2mg上述亲和介质纳米材料，按照实施例3的方法处理此亲和介质纳米材料，将100μL血清稀释10倍，取500μL加入亲和介质纳米材料中，在室温下，转动混旋2小时，离心去上清液，用PBS缓冲液洗涤两次，再用水洗涤一次，离心，去上清液。

用含50％乙腈和5％三氟乙酸的水溶液洗脱二次，将洗脱液浓缩为3μL的溶液，取1.4μL进行nano-LC-ESI-MS/MS分析，对分析的肽断进行检索并鉴定之。所有的nano-LC-ESI-MS/MS是在沃特斯公司的毛细管液相色谱仪(Capillary liquid chromatography system；Waters)及四极杆飞行时间质谱仪(Q-TOF Ultima Global mass spectrometer；Waters)上进行nano-LC-ESI-MS/MS全自动分析。自动进样系统装备一个C18脱盐预柱(5mm×350μm)和一个C18毛细管柱(100mm×75μm)进行梯度洗脱。毛细管电压为3.5KV，碰撞气为氩气，源温150℃，锥孔电压50V，TOF加速电压9.1kV，进样流速为200～300nL/min进行正离子的M S/M S测定。用200 fmol/uL[Glu1]-Fibrinopeptide B的M S/MS质谱进行外标校正，分子质量误差为±0.1 Dalton。测定后的数据经ProteinLynx 2.0(Waters)软件处理，通过Mascot(http://www.matrixscience.com)检索NCBInr数据库进行蛋白质鉴定。

所得结果分别参见下表1和附图7，其中表一列出了用壳聚糖-IDA-Cu(II)亲和介质纳米材料选择性富集血清中的多肽后直接用nano-LC-ESI-MS/MS所鉴定的蛋白；图7是所富集的多肽M/z为506.31的四电荷峰的二级质谱图，鉴定此序列为SSKITHRIHWESASLLR(SEQID NO：1)，数据库检索结果表明它是补体C3蛋白前体，代号为 gi|226159。

表一：用壳聚糖-IDA-Cu(II)亲和介质纳米材料选择性富集血清中的多肽后直接用nano-LC-ESI-MS/MS所鉴定的蛋白

蛋白名称	代号	匹配的序列	分子量	观测分子量
					ComplementC3 precursor	gi\|226159	HRIHWESASLL(SEQ ID NO：2)	1347.7870	674.90
ComplementC3 precursor	gi\|226159	SSKITHRIHWESASLL(SEQ IDNO：3)	1864.1197	622.38
					ComplementC3 precursor	gi\|226159	SSKITHRIHWESASLLR(SEQ IDNO：4)	2020.1877	506.31
inter-alpha(globulin)inhibitor H4	gi\|62088356	FRPGVLSSRQLGLPGPPDVPDHAAYHPF(SEQ ID NO：5)	3026.7357	757.69
					inter-alpha(g1obulin)inhibitor H4	gi\|62088356	NFRPGVLSSRQLGLPGPPDVPDHAAYHPF(SEQ ID NO：6)	3140.8057	786.20
inter-alpha(globulin)inhibitor H4	gi\|62088356	MNFRPGVLSSRQLGLPGPPDVPDHAAYHPF(SEQ ID NO：7)	3271.8389	818.96
					kininogen L	gi\|225724	HGLGHGHEQQHGLGHGHKF(SEQ ID NO：8)	2069.1265	518.29

实施例8

与实施例1的方法相同，除了自聚原料为丙烯酸环氧丙酯之外。

实施例9-10

与实施例1的方法相同，除了引发剂分别为偶氮二异丁腈或正丁基锂之外。

实施例11-14

与实施例3的方法相同，除了过渡金属离子分别为Co²⁺，Ni²⁺或Zn²⁺之外。

实施例15

血清中特异富集的蛋白的鉴定(nano-LC-ESI-MS/MS)

称取2mg上述亲和介质纳米材料，按照实施例3的方法处理此亲和基质纳米材料，将100μL血清稀释10倍，取500μL加入亲和介质纳米材料中，在室温下，转动混旋2小时，离心去上清液，用PBS缓冲液洗涤两次，再用水洗涤一次，离心，去上清液。

用含50％乙腈和5％三氟乙酸的水溶液或50mM的咪唑水溶液洗脱二次，将洗脱液浓缩至干，加入2μL含8M脲素，EDTA(5mM)，andTCEP(10mM)的水溶液在室温下孵化两小时，再加入8μL50mM的NH₄HCO₃溶液以及2μL的0.1mg/mL的胰酶，在37℃下酶解16小时，浓缩至干，加入3μL的含0.1％甲酸和5％乙腈的水溶液，取1.4μL进行nano-LC-ESI-MS/MS分析，对分析的肽断进行检索并鉴定之。方法同例7，通过Mascot(http://www.matrixscience.com)检索NCBInr数据库进行蛋白质鉴定。所得结果参见下表二，其中列出了用壳聚糖-IDA-Cu(II)亲和介质纳米材料选择性富集血清中的蛋白以及用nano-LC-ESI-MS/MS方法所鉴定的蛋白。

表二：用壳聚糖-IDA-Cu(II)亲和介质纳米材料选择性富集血清中的蛋白以及用nano-LC-ESI-MS/MS方法所鉴定的蛋白

蛋白名称	NCBI代号	匹配的肽段数	MASCOT打分
				histidine-rich glycoprotein precursor	gi\|4504489	4	84
kininogen 1，isoform CRA_b	gi\|119598586	3	108
				Ig kappa chain V-III region	gi\|106596	2	169
hemopexin precursor	gi\|386789	5	188
				selenoprotein P	gi\|2654365	2	106
alpha-fibrinogen precursor	gi\|182424	2	100
				apolipoprotein C-III	gi\|521205	2	88
proapolipoprotein	gi\|178775	2	61
				apolipoprotein J precursor	gi\|178855	3	39

[0067] 序列表

<110>北京大学

<120>一种纳米壳聚糖衍生物亲和介质，其制备方法，以及利用该亲和介质分离和富集蛋白质分子的方法

<130>SPI085225-00

<160>8

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>17

<212>PRT

<213>人工序列

<400>1

<210>2

<211>11

<212>PRT

<213>人工序列

<400>2

<210>3

<211>16

<212>PRT

<213>人工序列

<400>3

<210>4

<211>17

<212>PRT

<213>人工序列

<400>4

<210>5

<211>28

<212>PRT

<213>人工序列

<400>5

<210>6

<211>29

<212>PRT

<213>人工序列

<400>6

<210>7

<211>30

<212>PRT

<213>人工序列

<400>7

<210>8

<211>19

<212>PRT

<213>人工序列

<400>8

Claims

1.一种纳米壳聚糖衍生物亲和介质，由带有活性羧基官能团的壳聚糖衍生物与过渡金属离子络合而成，其特征在于颗粒大小为1-300nm，以及固载基质为壳聚糖。

2.权利要求1的纳米壳聚糖衍生物亲和介质，其中所述颗粒大小为20-100nm。

3.权利要求1或2的纳米壳聚糖衍生物亲和介质，其中活性羧基官能团源自亚胺基二乙酸或氨基三乙酸或乙二胺三乙酸。

4.权利要求1或2的纳米壳聚糖衍生物亲和介质，其中过渡金属离子选自Co²⁺，Cu²⁺，Ni²⁺或Zn²⁺。

5.权利要求1-4任一项的纳米壳聚糖衍生物亲和介质的制备方法，包括下列步骤：(1)将壳聚糖溶于稀酸水溶液，与甲基丙烯酸环氧丙酯或丙烯酸环氧丙酯混合，进行自聚反应和接枝反应，得到带有活性环氧基团的壳聚糖衍生物，(2)接着与亚胺基二乙酸钠或氨基三乙酸或乙二胺三乙酸进行开环加成反应，得到带有羧基活性官能团的壳聚糖衍生物，(3)再与选自Co²⁺，Cu²⁺，Ni²⁺或Zn²⁺的过渡金属离子发生络合作用，制得所述纳米壳聚糖衍生物亲和介质，其中自聚和接枝的反应温度为40-100℃，开环反应温度为50-80℃。

6.权利要求5的制备方法，其中所述稀酸选自甲酸或乙酸。

7.权利要求5或6的制备方法，其特征在于自聚和接枝的反应加入选自偶氮二异丁腈，正丁基锂，过硫酸钾，硝酸铈铵，硫代碳酸-溴酸钾，二高碘酸铜酸钾，或过硫酸氨和硫代硫酸钠的引发剂。

8.权利要求7的制备方法，其中引发剂加入量为反应单体重量的1-5％。

9.权利要求5或6的制备方法，其特征在于与亚胺基二乙酸钠或氨基三乙酸或乙二胺三乙酸发生开环加成反应时，pH值为8-12。

10.权利要求5或6的制备方法，其特征在于与过渡金属离子发生络合作用时，Cu²⁺的浓度为10mM-100mM。

11.一种利用权利要求1-4任一项的纳米壳聚糖衍生物亲和介质分离和富集蛋白质分子的方法，其特征在于在不同的吸附和洗脱条件下，将分析物吸附在上述亲和介质上，并用质谱测定和分析保留在此亲和介质上的分析物。

12.权利要求11的方法，其特征是选择适当的条件，用质谱技术鉴定生物标识物。

13.权利要求11的方法，其特征是将上述纳米壳聚糖衍生物亲和介质涂在芯片上进行微量蛋白质分子和多肽的富集和分离。

14.权利要求11的方法，其特征是将上述纳米壳聚糖衍生物亲和介质填充入色谱柱中进行大规模的蛋白质分子和多肽的富集和分离。

15.权利要求11的方法，其中分析物是血清、血浆、体液、组织或细胞裂解液。