CN102760543B - 亲水性金属离子固定化亲和磁球及其制备和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种亲水性金属离子固定化亲和磁球的制备方法,包括有以下步骤:氨基磁球表面通过戊二醛进行氨基的活化;活化后的磁球通过表面修饰反应连接上三磷酸腺苷二钠分子,使其表面键合上含有多个磷酸根和羟基的亲水性功能分子,以利于后续金属离子的固定;最后在含金属离子的溶液中,实现金属离子的固定化,完成亲水性金属离子固定化亲和磁球的制备。本发明的优点为:制备方法简便,与其他金属离子固定化亲和色谱柱或磁球的制备方法相比,本方法所得亲水性金属离子固定化亲和磁球亲水性强,选择性好,对磷酸化肽段有很好的特异性富集能力,制备重现性好,性能稳定,操作简单,可避免复杂的离心操作,在蛋白组学,特别是磷酸化蛋白组学领域有着广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及用于在线或离线磷酸化肽段选择性富集分离的亲水性磁球,具体地说是一种亲水性金属离子固定化亲和磁球及其制备和应用。
背景技术
蛋白质磷酸化是最普遍的翻译后修饰之一,在生命过程中扮演着信号传导、代谢调节、细胞功能调控等重要作用。然而,磷酸化蛋白/肽段通常含量较低,在质谱分析中常受到大量非磷酸化蛋白/肽段的干扰。因此,发展针对磷酸化肽段的选择性富集技术对于深入开展磷酸化蛋白质组研究至关重要。
基于固载金属离子与磷酸根间的特异相互作用的固定化金属亲和色谱是目前最常用的磷酸化富集技术之一(Chaga G S. J. Biochem. Biophys. Methods.2001, 49,313-334)。氨甲基磷酸等以磷酸根为配体的固定化金属亲和材料已成功用于磷酸化肽段的选择性富集,因其与磷酸肽的结合能力远大于次氨基三乙酸等以羧基为配体的固定化金属亲和色谱材料,故对磷酸化肽段的选择性得到了很大的提高 (Hou C Y; Ma J F, Tao D Y, Shan Y C, Liang Z, Zhang L H, Zhang Y K, J proteome Res, 2010, 9, 4093-4101; Dunn J D, Watson J T, Bruening M L, Anal.Chem, 2006,78,1574-1580)。但因氨甲基磷酸等试剂往往只含有一个磷酸根以和金属离子进行螯合,螯合作用较弱,且含有其他甲基等疏水性基团,导致了疏水性肽段的竞争性吸附,故以其为配体制备的固定化金属亲和材料亲水性差,对磷酸化肽的选择性还有待进一步提高。另外这些试剂均有剧毒且易水解,故以这些试剂为配体的固定化金属亲和材料的制备过程对操作人员具有极大的危害性,而且材料的制备过程因该试剂的极易水解导致难于控制,重现性差。磁性材料(或称磁性微球)因其具有较好的磁性响应,极大的方便了材料的制备及应用过程,故其在生物医药方面的应用发展较快,取得了很多成功的应用成果。在磷酸化蛋白组学研究中,磷酸化肽段富集的高选择性、高重现性和富集过程的方便快捷是获得可靠分析结果的必需条件。因此,发展具有高亲水性的固定化金属离子亲和纳米磁球对于实现磷酸化肽段分离鉴定具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种亲水性金属离子固定化亲和磁球及其制备和应用,以期解决金属离子固定化亲和材料的亲水性差、选择性差、制备过程重现性差、所得亲和材料性能不稳定、操作不安全、操作过程繁琐、制备的材料使用时往往需要液相泵或离心机等其他辅助仪器,使用不方便快捷等缺点。该亲水性金属离子固定化亲和磁球主要用于在线或离线选择性富集磷酸肽。
为实现上述目的,本发明采用的技术方案为:
将表面带有氨基的磁球通过表面活化及修饰反应,使其表面键合上含多个磷酸基和羟基的亲水性功能化分子,以用于后续的金属离子固定。最后通入含金属离子的溶液,实现金属离子的固定化。
具体为:
1)磁球表面活化反应过程:将表面带有氨基的磁球和质量浓度为1-50%的戊二醛溶液,溶液的pH值为3-9,在室温下反应0.15-6 h,进行氨基磁球表面的活化反应;磁球表面的氨基通过戊二醛的活化反应,使其表面键合上含羰基的基团,以用于后续的功能化修饰。
在磁球表面活化反应后,用pH值为3-9的溶液清洗3-6次。
2)磁球表面修饰反应过程:将活化后的氨基磁球加入质量浓度为1-200 mg/mL的三磷酸腺苷二钠溶液中,溶液的pH值为3-9,在室温下反应0.5-6 h,进行磁球表面的化学修饰反应,使磁球表面键合上含多个磷酸基和羟基的亲水性功能分子,以用于后续的金属离子固定。
在氨基磁球完成表面功能团修饰反应后,用pH值为3-9的溶液清洗3-6次。
3)金属离子的固定化过程:将表面功能化修饰的磁球加入含有0.05-2 mol/L的可溶性金属离子溶液中,实现金属离子的固定化;在室温下,反应时间0.5-6 h。
金属离子溶液为可溶性金属无机盐溶液中的一种或多种(如氯化盐、硫酸盐、硝酸盐或其他可溶于水的金属盐),其中金属元素包括过渡金属(IB、IIB、IIIB、IVB、VB、VIB、VIIB、VIII)以及主族金属(IIIA、IVA)中的一种或多种。
制备好的金属离子固定化亲和磁球用甲酸体积分数为0.05-0.2 %的溶液冲洗,去除游离的金属离子。
制备得到的亲水性金属离子固定化亲和磁球可用于在线或离线的磷酸化肽段选择性富集快速分离,使用后的亲水性金属离子固定化亲和磁球可通过重复步骤3)的亲水性金属离子的固定化过程实现再生。
本发明的优点为:(1)制备的磁性材料亲水性好,对磷酸化肽段具有很好的选择性和较高的富集容量;(2) 本制备方法无毒无害;(3) 本制备方法简便,步骤少,重现性好; (4) 制备的磁性颗粒性能稳定,使用方便快捷,无需液相泵、离心机等辅助仪器设备。
附图说明
图1是实施例1所得的亲水性钛离子固定化亲和纳米磁球的傅里叶红外表征图(a, 氨基磁球; b, 亲水性钛离子固定化亲和纳米磁球);
图2是实施例1所得的亲水性钛离子固定化亲和纳米磁球的磁性响应图片(a,亲水性钛离子固定化亲和纳米磁球的悬浮液;b,亲水性钛离子固定化亲和纳米磁球对外加磁场的磁性响应);
图3是将磷酸化蛋白(β-酪蛋白)与非磷酸化蛋白(牛血清蛋白)的胰蛋白酶酶解产物按照物质的量比1:100混合,所得混合物富集前后质谱对比图(a,未富集;b,用实施例1所得亲水性钛离子固定化亲和纳米磁球富集后)(磷酸肽用﹡标示,发生中性丢失的磷酸肽用#标示,无标示的均为非磷酸肽)。
具体实施方式
本发明所涉及的表面带有氨基的磁球(氨基磁球)粒径可为纳米级也可为微米级,可参照文献(Y. Li, X. Xu, C. Deng, P. Yang and X. Zhang, J Proteome Res, 2007, 6, 3849-3855.)合成,亦可从深圳市纳微科技有限公司购得。
实施例1:一种亲水性钛离子固定化亲和纳米磁球的制备
将0.1克氨基磁球(粒径为200 纳米)和5毫升质量浓度为20%的戊二醛溶液在室温下反应2 h,溶液的pH值为5,进行氨基磁球表面的活化反应。待磁球表面活化反应完成后,用pH值为5的溶液清洗磁球3次。将活化后的氨基磁球加入3毫升质量浓度为200 mg/mL的三磷酸腺苷二钠溶液中,溶液的pH值为5,在室温下反应2 h,进行磁球表面的化学修饰反应,使磁球表面键合上含多个磷酸基和羟基的亲水性功能分子,以用于后续的钛离子固定。待磁球完成表面功能团修饰反应后,用pH值为5的溶液清洗3次。 最后将表面功能化修饰的磁球加入10毫升含有0.1 mol/L的硫酸钛溶液中,在室温下,反应时间2 h,实现钛离子的固定化。
制备好的亲水性钛离子固定化亲和纳米磁球用2毫升甲酸体积分数为0.1 % 的溶液冲洗,去除游离的钛离子后保存于4℃甲酸体积分数为0.1 % 的溶液中。
实施例2:一种亲水性镓离子固定化亲和纳米磁球的制备
金属离子溶液为硝酸镓溶液,其他同实例1,可得亲水性镓离子固定化亲和纳米磁球。
实施例3:一种亲水性铁离子固定化亲和纳米磁球的制备
金属离子溶液为三氯化铁溶液,其他同实例1,可得亲水性铁离子固定化亲和纳米磁球。
应用例1
以本发明的亲水性钛离子固定化亲和纳米磁球为离线磷酸化肽段捕集材料,以含三氟乙酸体积分数为5% ,乙腈体积分数为80%的水溶液为上样缓冲溶液,可在30 min内实现对蛋白样品中磷酸化肽段的选择性捕集。
本发明的优点为:制备方法简便,步骤少,制备过程无毒无害,安全性高且重现性好;与其他金属离子固定化亲和材料的制备方法相比,本方法所得金属离子固定化亲和磁球亲水性强,对磷酸化肽段有很高的特异性富集能力,性能稳定;制备的磁性颗粒使用方便快捷,无需液相泵、离心机等辅助仪器设备。
Claims (9)
1.一种亲水性金属离子固定化亲和磁球的制备方法,其特征在于:是以三磷酸腺苷二钠为磁球表面功能化修饰试剂的亲水性金属离子固定化亲和磁球的制备方法,包括有如下步骤:
(1)将表面带有氨基的磁球表面的氨基通过戊二醛进行活化反应,以利于后续的表面修饰反应;
(2)活化的磁球通过键合三磷酸腺苷二钠分子,使其表面键合上含有一个以上的磷酸基和羟基亲水性基团的功能分子,以用于后续的金属离子固定;
(3)最后在含金属离子的溶液中,实现金属离子的固定化,完成亲水性金属离子固定化亲和磁球的制备。
2.按照权利要求1所述的制备方法,其特征在于:
步骤(1)是以戊二醛为磁球表面氨基的活化剂实现的,即将氨基磁球和质量浓度为1-50%的戊二醛溶液在室温下反应0.15-6h,溶液的pH值为3-9,完成磁球表面的活化反应。
3.按照权利要求1或2所述的制备方法,其特征在于:
在磁球完成表面活化反应后,用pH值为3-9的溶液清洗3-6次。
4.按照权利要求1所述的制备方法,其特征在于:
步骤(2)是以三磷酸腺苷二钠为磁球表面的功能化修饰分子实现的,即将活化后的磁球与质量浓度为1-200mg/mL的三磷酸腺苷二钠溶液在室温下反应0.5-6h,进行磁球表面的化学修饰反应,使磁球表面键合上含一个磷酸基和羟基亲水性基团的功能分子,以用于后续的金属离子固定,溶液的pH值为3-9。
5.按照权利要求1或4所述的制备方法,其特征在于:
在磁球完成表面功能化分子修饰反应后,用pH值为3-9的溶液清洗3-6次。
6.按照权利要求1所述的制备方法,其特征在于:
步骤(3)是以含金属离子的溶液实现金属离子的固定化过程,即将表面功能化修饰的磁球加入含有0.05-2mol/L的可溶性金属盐溶液中,实现金属离子的固定化;在室温下,反应时间0.5-6h。
7.按照权利要求1或6所述的制备方法,其特征在于:制备好的亲水性金属离子固定化亲和磁球用甲酸体积分数为0.05-0.2%的溶液冲洗,去除游离的金属离子。
8.按照权利要求1或6所述的制备方法,其特征在于:金属离子溶液为可溶性金属无机盐溶液中的一种或多种,其中金属元素包括过渡金属B、IIB、IIIB、IVB、VB、VIB、VIIB、VIII以及主族金属IIIA、IVA中的一种或多种。
9.一种权利要求1所述的制备方法,其特征在于:制备得到的亲水性金属离子固定化亲和磁球可用于在线或离线的磷酸化肽段选择性富集快速分离,使用后的亲水性金属离子固定化亲和磁球可通过重复权利要求6的金属离子的固定化过程实现再生。
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