CN104841404B - 超支化固定金属亲和色谱固定相及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了结构通式（I）所示的超支化固定金属亲和色谱固定相，其在色谱固定相表面运用超支化的方法对材料表面改性，提高了材料表面功能基团密度，对蛋白有较高的吸附容量。本发明所制备的色谱固定相具有金属螯合色谱分离性能，将其用于分离蛋清中的溶菌酶，可取得很好的分离效果和较高的蛋白回收率。

Description

超支化固定金属亲和色谱固定相及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种超支化固定金属离子亲和色谱固定相及其制备方法。

背景技术

蛋白质作为生命的物质基础，对生命活动有着重要的意义。随着生物科技的发展，对一些医疗产品如抗生素，疫苗，抗体，多肽，治疗性蛋白质等的分离与纯化变得越来越重要。然而蛋白质等生物大分子一般以复杂混合物的形式存在，且具有特殊性质，如对温度，酸碱度，有机溶剂敏感等问题，仅根据其理化性质分离几乎不能取得很好的效果。亲和色谱是一类在分离介质上修饰合适的配基，与蛋白进行特异性结合而实现蛋白纯化的方法，特异性高，应用广泛。作为亲和色谱的一种，固定金属亲和色谱由于其选择性好，重现性高，分辨率高，广泛用于含组氨酸标签蛋白分子的特异性识别与分离。当以膜材料作为色谱固定相时，由于其压降小，轴向扩散路径短，容易扩大生产等优点，成为近几年的研究热点。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种超支化固定金属离子亲和色谱固定相。

本发明另一目的是提供超支化固定金属离子亲和色谱固定相的制备方法，以表面含有羟基的色谱固定相为基质，利用超支化的方法对材料进行表面改性，在膜表面引入大量氨基后，再通过环氧基引入氨基羧酸配基，最后螯合金属离子，成功制备超支化固定金属离子亲和膜。

本发明还进一步提供了上述材料的应用，将该制备的固定化金属亲和色谱固定相用于纯化蛋清中溶菌酶。

本发明实现过程如下：

结构式（I）所示的超支化固定金属亲和色谱固定相，

。

结构式（I）所示的超支化固定金属亲和色谱固定相的制备方法，包括如下步骤：

(1) 色谱固定相预处理：将色谱固定相经甲醇浸泡去除表面油脂及粘附杂质，用甲醇和水反复洗涤干燥，所述的色谱固定相为硅胶、壳聚糖或表面修饰有硅羟基的磁性纳米材料；

(2) 色谱固定相表面氨基化：将色谱固定相先与环氧氯丙烷反应，然后与三-（2-氨基）乙基胺反应得到氨基化色谱固定相；

(3) 将氨基化色谱固定相依次与丙烯酸甲酯和乙二胺通过迈克加成反应和酰胺化反应在膜表面形成超支化结构；

(4)最后引入IDA型配基：将步骤（3）制备的超支化色谱固定相与环氧氯丙烷反应引入环氧基，进一步与氨基羧酸反应使膜表面产生IDA型金属螯合配基；

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螯合有金属离子Co²⁺、Zn²⁺、Cu²⁺、Ni²⁺、Fe³⁺、Ga³⁺、Zr⁴⁺或Ti⁴⁺的超支化固定金属亲和色谱固定相。例如以螯合Cu²⁺为例，将色谱固定相浸入10mM CuSO₄溶液，于摇床中室温吸附12h，使其充分与Cu²⁺螯合，再用 pH=5 NaAc-HAc 缓冲液多次洗涤，水洗，除去色谱固定相表面未螯合的Cu²⁺。

结构式（I）所示的超支化固定金属亲和色谱固定相在蛋白分离与纯化中的应用，当超支化固定金属亲和色谱固定相螯合Co²⁺、Zn²⁺、Cu²⁺或Ni²⁺时，用于His-tagged 蛋白的分离与纯化。螯合Fe³⁺、Ga³⁺、Zr⁴⁺或Ti⁴⁺的超支化固定金属亲和色谱固定相可应用在富集磷酸化钛。

本发明的优点如下：

(1)本发明色谱固定相可采用可再生纤维膜为基质，纤维素属于天然高分子，是一种可再生资源，且具有良好的亲水性，耐污染性，可降解性及生物相容性，具有潜在的应用价值；

(2)本发明采用超支化方法对色谱固定相进行表面改性，通过在表面引入更多的功能基团，增加吸附点来提高蛋白的吸附量，制备了一种对金属离子和蛋白都有较高吸附量的固定金属亲和色谱固定相；

(3)本发明制备的超支化色谱固定相用于纯化蛋清中的溶菌酶时，回收率可达94.3%，比未超支化的固定金属亲和色谱固定相的回收率提高了50%；

(4)本发明制备的固定化金属离子亲和色谱固定相具有较好的重复使用性，经重复吸附-洗脱6次后，蛋白吸附量几乎没有变化。

附图说明

图1为超支化固定金属亲和膜和未超支化固定金属亲和膜的红外光谱图；

图2 为超支化固定金属亲和膜和未超支化固定金属亲和膜吸附Cu²⁺前后颜色对比图；

图3 为超支化固定金属离子亲和膜(a)和未超支化固定亲和膜(b)的等温吸附线；

图4 为两种不同膜对于蛋清中蛋白回收率的测定图(a图为超支化固定金属亲和膜，b图为未超支化固定金属亲和膜)。

具体实施方式

可再生纤维素膜(平均孔径0.45um， 厚度160um，直径47mm，德国赛多利斯公司)；环氧氯丙烷（≥99%，国药化学试剂有限公司），三-（2-氨基）乙基胺（≥98%，国药化学试剂有限公司），丙烯酸甲酯，乙二胺，亚氨基二乙酸（阿拉丁≥98.0%），溶菌酶（＞40000u/mg，西安罗森博生物科技有限公司），其他试剂均为国产分析纯，来自当地供应商。

实施例1

原膜预处理

将一整片可再生纤维素膜剪成8小片，甲醇浸泡半小时，以去除膜表面油脂及粘附杂质，用甲醇和水多次洗涤，在真空干燥箱中40℃烘干备用。

超支化固定金属离子亲和膜的制备

(1)首先通过两步反应在膜表面引入带有氨基的官能团，具体操作为：将24小片剪好的原膜放入100mL三颈瓶，加入40mL，1.4MNaOH，15 mL环氧氯丙烷，60℃反应2h，反应完后，用水和甲醇多次洗涤，将三-（2-氨基）乙基胺溶液的pH用氢氧化钠溶液调为11左右，将上一步反应好的膜加入，80ºC 反应12h；

(2) 接下来将丙烯酸甲酯和乙二胺逐步加入，通过迈克加成反应和酰胺化反应在膜表面形成超支化结构， 具体反应步骤为：将上述膜加入体积比为丙烯酸甲酯：甲醇=1:1的混合溶液，以甲醇作溶剂，35℃反应24h。接下来继续将膜放入乙二胺：甲醇=1:1的混合溶液中，以甲醇作溶剂，35℃反应24h；

(3)最后引入IDA型配基。具体操作为：将上述膜加入40mL环氧氯丙烷与氢氧化钠（体积比=1:4）的混合溶液中，60℃反应2h以引入环氧基，最后将反应完的膜与亚氨基二乙酸在（用碳酸氢钠将溶液pH调为8左右）80 ºC 反应12 h，使膜表面产生IDA型金属螯合配基；

(4)将此膜浸入10mM CuSO₄溶液，于摇床中室温吸附12h，使其充分与Cu²⁺螯合，再用 pH=5 NaAc-HAc 缓冲液多次洗涤，水洗，以除去膜表面未被绑定的Cu²⁺ ，待用。

作为对照的未超支化固定金属亲和膜的制备

将预处理好的原膜先与环氧氯丙烷反应，再与亚氨基二乙酸反应，最后浸入10mMCuSO₄溶液中螯合铜离子制得固定金属离子亲和膜，反应条件如上述。

如图1所示，a图为原膜，b图为三-（2-氨基乙基）胺膜，c图为丙烯酸甲酯反应后膜，d图为乙二胺膜，e图为超支化膜。从图中可以看出，与原膜相比较，出现了很多新的特征峰。当将三-（2-氨基乙基）胺反应在膜表面后，1640 cm^-1， 1565 cm^-1处出现新的特征峰，分别归因于氨基中-N-H的弯曲振动和-C-N伸缩振动。当继续与丙烯酸甲酯反应后，出现1735cm^{-1处酯基中}-C=O的伸缩振动吸收峰，表明迈克加成反应的成功进行，随后加入乙二胺与膜表面丙烯酸甲酯的酯基反应，由图中可以观察到-C=O-O-的特征吸收峰发生蓝移到1654 cm^-1，此峰为酰胺中-C=O的特征吸收峰，证明酰胺化反应的成功进行。同时，1572 cm^-1归因于氨基的-C-N吸收峰强度增加，说明经过超支化反应后，有更多的氨基存在于膜表面。当最后与亚氨基二乙酸反应时，1741 cm^-1出现了-COO-伸缩振动吸收峰，由此证明超支化固定金属亲和膜的成功制备。

实施例2：超支化固定金属亲和膜对于Cu²⁺吸附

用pH=5 NaAc-HAc缓冲液配制由低到高不同浓度的铜离子溶液（0.1， 0.2， 0.3，0.5， 1， 2， 3， 5， 10 mM/L），将一片合成好的膜置于50 mL离心管中，加入5mL的铜离子溶液于摇床中室温吸附12 h，将吸附完Cu²⁺膜反复用pH=5 NaAc-HAc缓冲液，水洗，以去除膜表面物理吸附的Cu²⁺，将处理好的膜用10 mL 0.1M EDTA洗脱直至膜表面颜色由蓝色变为无色，用AAS测定洗脱液中Cu²⁺的浓度。该合成的超支化固定金属亲和膜对于Cu²⁺的吸附量可达到3.4 μmol/cm²。

如图2所示，吸附Cu²⁺前后原膜，未超支化对照膜，超支化膜表面颜色变化(①和④为原膜，②和⑤为未超支化膜，③和⑥为超支化固定金属亲和膜。由图可以看出，原膜在螯合Cu²⁺前后，无颜色变化，超支化固定金属亲和膜表面颜色由无色变为深蓝色，而未超支化方法制备的膜的颜色由无色变为淡蓝色，从侧面证明超支化IMAM的成功制备及大量的Cu²⁺吸附在超支化固定金属亲和膜的表面。这是由于经过超支化改性后，膜表面功能基团密度增加，从而可以捕获更多的铜离子，充分体现了超支化方法在材料改性中的突出贡献，大大提高吸附容量。

实施例3：超支化固定金属亲和膜对于蛋白质吸附

以溶菌酶为模型蛋白，探究超支化固定金属亲和膜和对照膜的等温吸附线。首先，将合成好的膜置于离心管中，用20mM PBS+0.2M NaCl pH=7.4 的缓冲液缓冲半小时，然后加入5mL不同浓度的溶菌酶溶液(20mM PBS+0.2M NaCl pH=7.4 的缓冲液配制，浓度分别为0.3，0.5，1，2，3，4，5，6，7，8mg/mL)，25℃，150r/min于恒温摇床中吸附6h至吸附平衡。用紫外可见分光光度计在280nm处测量吸附后上清液中蛋白浓度。如图3所示，该改性膜对于溶菌酶的最大吸附量为162 mg/cm³，高于文献的报道值和未超支化亲和膜对蛋白的吸附量。

实施例4：超支化固定金属亲和膜和未超支化固定金属亲和膜对蛋清中溶菌酶回收率的测定

用前沿色谱法纯化蛋清中的溶菌酶。将16片合成好的直径1.4cm的固定化金属离子亲和膜装填在玻璃凝胶色谱柱中，连接在色谱仪上，在进样前，柱子先用10倍柱体积的(20mM PBS+0.2M NaCl)缓冲液平衡，然后利用色谱仪的蠕动泵以0.5mL/min流速推动已处理好的蛋清溶液经过色谱柱，直到达到突破平衡。分段收集馏分，利用紫外分光光度计测定收集蛋白馏分的浓度，分别用超支化固定金属离子亲和膜和作为对照的未超支化亲和膜做实验，得到两种膜对蛋白的突破曲线。测定并比较两种膜对于溶菌酶的回收率。如图4所示，最终测得超支化固定金属亲和膜的蛋白回收率为94.3%，比未超支化的固定金属亲和膜高出50%，充分体现了超支化的方法在材料表面改性方面的优势。

Claims (4)

1.结构式（I）所示的超支化固定金属亲和色谱固定相，

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2.权利要求1所述超支化固定金属亲和色谱固定相的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

(1) 色谱固定相预处理：将色谱固定相经甲醇浸泡去除表面油脂及粘附杂质，用甲醇和水反复洗涤干燥，所述的色谱固定相为硅胶、壳聚糖或表面修饰有硅羟基的磁性纳米材料；

(2) 色谱固定相表面氨基化：将色谱固定相先与环氧氯丙烷反应，然后与三-（2-氨基）乙基胺反应得到氨基化色谱固定相；

(3) 将氨基化色谱固定相依次与丙烯酸甲酯和乙二胺通过迈克加成反应和酰胺化反应在膜表面形成超支化结构；

(4)最后引入IDA型配基：将步骤（3）制备的超支化色谱固定相与环氧氯丙烷反应引入环氧基，进一步与氨基羧酸反应使膜表面产生IDA型金属螯合配基；

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3.权利要求1所述超支化固定金属亲和色谱固定相在蛋白分离与纯化中的应用。

4.根据权利要求3所述应用，其特征在于：超支化固定金属亲和色谱固定相螯合Co²⁺、Zn²⁺、Cu²⁺或Ni²⁺时，用于His-tagged 蛋白的分离与纯化。