CN103285814A

CN103285814A - 一种基于强螯合配体的固定金属亲和色谱固定相及其制备方法

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Publication number: CN103285814A
Application number: CN2012104983474A
Authority: CN
Inventors: 钱晓磊; 卫引茂
Original assignee: Northwest University
Current assignee: Northwest University
Priority date: 2012-11-30
Filing date: 2012-11-30
Publication date: 2013-09-11
Anticipated expiration: 2032-11-30
Also published as: CN103285814B

Abstract

本发明公开了一种结构式（I）所示的具有强螯合能力的固定金属亲和色谱固定相及其制备方法，R为甲基或乙基。本发明的色谱固定相可在硅胶表面修饰亚氨基二（亚甲基四唑）得到，本发明色谱固定相用于蛋白质的亲和色谱分离，具有蛋白质的分离效果好，金属离子流失小，蛋白质量回收率高的优点，本发明可在基因工程产品及血浆蛋白的快速分离纯化中获得应用。

Description

一种基于强螯合配体的固定金属亲和色谱固定相及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种新型固定金属亲和色谱固定相及其制备方法，具体涉及一种以亚氨基二（亚甲基四唑）为配体的固定相及其制备方法，属于色谱分离技术领域。

背景技术

生物样品组成极其复杂，而且含量变化范围很大。如何从高度复杂的样品中，选择性分离和富集目标蛋白是生命科学和基因工程领域长期面临的问题。迄今，已经发展了多种生物大分子的分离富集方法。但是，从原理上讲，利用蛋白分子对其配体特有的识别作用而建立的亲和色谱是目前选择性和专一性最好的分离方法。固定金属亲和色谱（IMAC）是亲和色谱技术的一个分支，它具有高的分辨率、可靠性、重现性和处理速度，自从1975年提出以来，经过30多年的发展和完善，已成为蛋白质，特别是基因重组蛋白分离的最有效工具之一。

与其它色谱技术相同，色谱固定相是IMAC技术的核心。经过30余年的发展，IMAC固定相研究取得了长足进步。已经发展了十余种配体固定相，主要包括[V. Gaberc-porekar, et al. J. Biochem. Biophys. 2001, 49, 335-360]：（1）二齿配体，如O-磷酸化丝蛋白(OPS)和8-羟基喹啉(8-HQ)；（2）三齿配体，如亚氨基二乙酸（IDA），二吡啶甲基胺(DPA)；（3）四齿配体，如氮基三乙酸（NTA），三乙烯四胺，乙二胺N,N’-二乙酸，羧甲基天门冬氨酸。（4）五齿配体，如N,N,N’-三羧甲基乙二胺（TED）,四乙烯五胺(TEPA)。其中，以三齿配体制备的固定相既可以与金属离子螯合，同时又对蛋白质有强的亲和作用，所以成为生产中制备IMAC色谱固定相的常用配体。然而，该类配体对金属离子配位的稳定性较差，固定相上的金属离子容易流失到目标产物中，从而导致蛋白药物污染、变性和失活。这一问题是蛋白药物大规模生产中必须解决，但至今未能很好解决的问题[R. A. Musil. In:“Encyclopedia of Chromatography (3rd Edition)” , (J. Cazes, ed.) ,2010, 2, 1177-1179; E. K. M. Ueda, et al. J. Chromatogr. A, 2003, 988(1), 1-23]。如果能从决定金属配位稳定性和分离选择性的关键因素固定相配体研究入手，设计有更强配位能力的配体，则可以很好的解决金属离子流失的问题。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种螯合能力强的固定金属亲和色谱固定相。

本发明的另一目的是提供上述色谱固定相的制备方法。

本发明还有一个目的是提供上述色谱固定相在生物大分子分离中的应用。

本发明实现过程如下：

一种固定金属亲和色谱固定相，其结构式如下：

Figure DEST_PATH_650036DEST_PATH_IMAGE001

。

所述硅胶基质颗粒是球形多孔硅胶，孔径范围为50 Å～1000 Å，粒径为1μm～100μm。

上述的色谱固定相可通过以下两种方法制备得到：

Figure DEST_PATH_222969DEST_PATH_IMAGE002

方法一包括以下步骤：

（1）亚氨基二乙腈与γ-(2,3-环氧丙氧) 丙基三甲氧基硅烷或γ-(2,3-环氧丙氧) 丙基三乙氧基硅烷反应合成双腈基硅烷偶联剂；

（2）硅胶与双腈基硅烷偶联剂反应得到亚氨基二乙腈键合硅胶；

（3）亚氨基二乙腈键合硅胶与叠氮化钠反应得到以亚氨基二（亚甲基四唑）为配体的固定金属亲和色谱固定相。

方法二包括以下步骤：

（1）硅胶首先与γ-(2,3-环氧丙氧) 丙基三甲氧基硅烷或γ-(2,3-环氧丙氧) 丙基三乙氧基硅烷反应制备环氧基活化硅胶；

（2）环氧基活化硅胶再与亚氨基二乙腈反应制备亚氨基二乙腈键合硅胶；

（3）亚氨基二乙腈键合硅胶再与叠氮化钠反应得到以亚氨基二（亚甲基四唑）为配体的固定金属亲和色谱固定相。

上述MeOH表示甲醇，DMF表示N,N-二甲基甲酰胺，Toluene表示甲苯。

本发明的优点与积极效果：

（1）如图1所示，本发明设计的以亚氨基二（亚甲基四唑）为配体的固定相，与常用的商品化亚氨基二乙酸型固定相相比，均属于三齿型配体。现有技术中亚氨基二乙酸配体中的羧基配位能力较弱，而本发明设计的亚氨基二（亚甲基四唑）配体，五元环阴离子比羧基具有更强的配位能力，可以牢固地结合金属离子，以减少金属离子的流失。

（2）本发明固定相用于蛋白质的亲和色谱，金属离子流失小。螯合Cu²⁺后装填的色谱柱（4.6 mm×100 mm）用1.0 mL/min流动相( 20 mmol/L NaAc-HAc, pH 5.0)连续冲洗2天，Cu²⁺的螯合量损失小于5%，比同等条件下螯合Cu²⁺的亚氨基二乙酸固定相金属离子损失减小63%。

（3）本发明固定相螯合不同过渡金属离子对生物样品分离效果好，同时可以提供不同的选择性。在新型色谱固定相上，螯合Zn²⁺后，核糖核酸酶-A、细胞色素-C和溶菌酶均可达到基线分离（图2），而螯合Cu²⁺后，蛋白质的分离明显不同于螯合Zn²⁺的固定相（图3）。经测定，蛋白质的质量回收率大于95%；以溶菌酶为例，活性回收率大于93%。

（4）填料使用寿命长。螯合金属离子后固定相在pH=2.0-8.0情况下连续清洗200小时后，分离性能未见改变。

附图说明

图1为亚氨基二乙酸固定金属离子示意图和亚氨基二（亚甲基四唑）固定金属离子示意图；

图2蛋白在螯合锌离子的亚氨基二（亚甲基四唑）色谱固定相上的色谱分离图；

图3蛋白在螯合铜离子的亚氨基二（亚甲基四唑）色谱固定相上的色谱分离图。

具体实施方式

大孔硅胶（7μm，孔径30nm，兰州化物所），γ-(2,3-环氧丙氧) 丙基三甲氧基硅烷（KH-560），亚氨基二乙腈（上海精纯试剂有限公司），甲醇，叠氮化钠，氯化铵，无水甲苯（用钠重蒸而得），N,N-二甲基甲酰胺（DMF）均为市售商品。

实施例1：亚氨基二（亚甲基四唑）色谱固定相的制备（方法一）

双腈基硅烷偶联剂的制备：称取1.5 g亚氨基二乙腈（IDAN），溶于30 mL甲醇，加入到100 mL烧瓶中，滴加1.2 mL KH-560，于80℃ 搅拌下反应48 h（IDAN与KH-560的配比为3:1）。反应完毕后，蒸发甲醇，得到双腈基硅烷偶联剂。

在100 mL烧瓶中，加入双腈基硅烷偶联剂和50 mL无水甲苯，加热使双腈基硅烷偶联剂完全溶解，再加入2 g干燥硅胶，将烧瓶放入超声中分散10 min，然后置于110℃下回流24 h。反应完毕后，依次用甲苯、丙酮、水、甲醇洗涤数次。50℃下真空干燥，得到亚氨基二乙腈键合硅胶。元素分析结果：碳含量3.116% ，氢含量0.571%，氮含量0.782% ，表明亚氨基二乙腈已键合在硅胶表面。

将上步中得到的亚氨基二乙腈键合硅胶加入到100 mL烧瓶中，再向其中加入3. 0 g叠氮化钠，2.7 g氯化铵，50 mL DMF，超声分散10 min，然后转移至微波反应器中，80℃下反应2 h。反应完毕后，依次用DMF、水、丙酮洗涤数次。50℃真空干燥，得到亚氨基二（亚甲基四唑）色谱固定相。元素分析结果：碳含量3.373% ，氢含量0.491%，氮含量2.002% 。与亚氨基二乙腈键合硅胶相比，氮含量明显上升，表明亚氨基二（亚甲基四唑）色谱固定相制备成功。

将制备的固定相装填成色谱柱（4.6 mm×100 mm）,用20 mmol/L NaAc-HAc（pH=5.0）缓冲溶液平衡30 min，以20 mmol/L Zn²⁺（或Cu²⁺）+ 20 mmol/L NaAc-HAc（pH=5.0）溶液流过柱子90 min（流速：1 mL/min），最后用20 mmol/L NaAc-HAc（pH=5.0）溶液冲洗柱子2 h，洗去色谱柱上吸附的未螯合的金属离子，即得到相应的固定Zn²⁺（或Cu²⁺）的色谱柱。

实施例2：亚氨基二（亚甲基四唑）色谱固定相的制备（方法二）

向100 mL三颈瓶中加入2 g干燥硅胶，加入50 mL无水甲苯，超声10min，然后将2 mL KH-560缓慢滴加到烧瓶中，110℃下回流20 h。反应完毕后，用甲苯、水、甲醇依次洗涤数次，50℃真空干燥，得到环氧基硅胶。

称取1.5 g IDAN，溶于30 mL甲醇，加入到100 mL烧瓶中，再加入上述环氧基硅胶，于80℃搅拌下反应24 h。反应完毕后，用蒸馏水、甲醇洗涤数次，50℃真空干燥，得到亚氨基二乙腈键合硅胶。

将亚氨基二乙腈键合硅胶加入到100 mL烧瓶中，再加入3.0 g叠氮化钠,2.7 g氯化铵和50 mL DMF，超声分散10 min，120℃下反应24 h。反应完毕后，依次用DMF、水、丙酮洗涤数次。50℃真空干燥，得到亚氨基二（亚甲基四唑）色谱固定相。

实施例3：采用实施例1制备的色谱固定相装填成色谱柱（4.6 mm×100 mm）,螯合Zn²⁺，对核糖核酸酶-A、细胞色素-C和溶菌酶的混合物进行分离（图2）。分离效果良好，蛋白质的质量回收率大于95%；以溶菌酶为例，活性回收率大于93%。色谱柱用1.0 mL/min流动相( 20 mmol/L NaAc-HAc, pH 5.0)连续冲洗2天，Zn²⁺的螯合量损失小于8%，比同等条件下螯合Cu²⁺的亚氨基二乙酸固定相金属离子损失减小56%。

色谱柱：100×4.6 mm 不锈钢柱；流动相：A (平衡液)，20 mmol/L 磷酸盐 (pH 7.0)，流动相B (洗脱液): A＋1.0 mol/L NaCl (pH 7.0)；流动相流速: 1.0 mL/min；线性梯度：20 min, 100% A- 100% B, 100% B 延长10min. 标准蛋白：1.核糖核酸酶-A； 2. 细胞色素-C；3. 溶菌酶。

实施例4：采用实施例1制备的色谱固定相，螯合上Cu²⁺后，对核糖核酸酶-A、细胞色素-C和溶菌酶的混合物进行分离（图3）。三种蛋白基本分离蛋白质的质量回收率大于95%；以溶菌酶为例，活性回收率大于94%。该色谱柱用1.0 mL/min流动相( 20 mmol/L NaAc-HAc, pH 5.0)连续冲洗2天，Cu²⁺的螯合量损失小于5%，比同等条件下螯合Cu²⁺的亚氨基二乙酸固定相金属离子损失减小63%。

色谱柱：100×4.6mm 不锈钢柱；流动相：A (平衡液)，20 mmol/L磷酸盐(pH 7.0)，流动相B (洗脱液): A＋1.0 mol/L NaCl (pH 7.0)；流动相流速: 1.0 mL/min；线性梯度20 min, 100% A- 100% B, 100% B 延长10 min。标准蛋白：1.溶剂峰；2. 核糖核酸酶-A； 3. 细胞色素-C；4. 溶菌酶。

Claims

1.一种固定金属亲和色谱固定相，其结构式如下：

。

2.根据权利要求1所述的色谱固定相，其特征在于：所述硅胶基质颗粒是球形多孔硅胶，孔径范围为50 Å～1000 Å。

3.根据权利要求2所述的色谱固定相，其特征在于：所述硅胶基质颗粒的粒径为1μm～100μm。

4.权利要求1所述的色谱固定相的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

5.权利要求1所述的色谱固定相的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

6.权利要求1所述的色谱固定相在生物大分子分离中的应用。

7.装填有权利要求1所述色谱固定相的色谱柱。

8.权利要求7所述色谱柱的装填方法，其特征在于：用pH=5.0的20 mmol/L NaAc-HAc缓冲溶液平衡30 min，以pH=5.0的20 mmol/L Zn²⁺或Cu²⁺与20 mmol/L NaAc-HAc溶液流过柱子90 min，流速为1 mL/min，最后用pH=5.0的20 mmol/L NaAc-HAc溶液冲洗柱子2 h，洗去色谱柱上吸附的未螯合的金属离子即得到固定Zn²⁺或Cu²⁺的色谱柱。