CN111921509B - 固相萃取柱及其制备方法和乳铁蛋白的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生化检测技术领域，具体涉及一种固相萃取柱及其制备方法和乳铁蛋白的检测方法。该固相萃取柱的制备方法包括如下步骤：提供硅烷偶联剂、螯合剂、载体材料和金属离子前驱体；将所述硅烷偶联剂和所述螯合剂结合，得到交联复合物；将所述交联复合物与所述载体材料和所述金属离子前驱体溶于溶剂中进行反应，得到混合填料；将所述混合填料置于萃取柱模具中进行固化处理，得到固相萃取柱。该制备方法得到的固相萃取柱利用金属螯合亲和层析和固相萃取相结合的原理可以很好地吸附纯化乳铁蛋白，后续与液相色谱结合，可以准确、简便、快速地测定婴幼儿配方奶粉中的乳铁蛋白，具有很好地应用前景。

Description

固相萃取柱及其制备方法和乳铁蛋白的检测方法
技术领域
本发明属于生化检测技术领域，具体涉及一种固相萃取柱及其制备方法和乳铁蛋白的检测方法。
背景技术
乳铁蛋白(lactoferrin，LF)是母乳中的主要蛋白质之一，为了使婴幼儿配方奶粉的营养成分更贴近于母乳，乳铁蛋白作为一种安全性极高、可被婴儿摄入的营养添加剂，被广泛地应用于婴幼儿配方奶粉中。目前市场上的婴幼儿配方奶粉品种众多，而奶粉中的乳铁蛋白含量是否与标签范围相符合，或者是否真正含有乳铁蛋白等问题不得而知。如今国内外还没有测定婴幼儿配方奶粉中乳铁蛋白的国家标准，所以建立准确高效的婴幼儿配方奶粉中乳铁蛋白的检测方法也成为研究热潮。
测定乳铁蛋白的方法有很多种，主要有高效毛细管电泳法、高效液相色谱法、酶联免疫吸附法、高效液相色谱串联质谱法等。高效液相色谱法因为其灵敏度和精密度高、样品用量少、色谱柱可反复使用等优点得到了广泛应用。但是，高效液相色谱法对检测样品纯度要求较高，需要经过复杂的预处理和肝素亲和柱净化后才能进样，而且要手动加压过柱，过柱较为困难费劲、耗时长、过程繁琐，且肝素亲和柱的价格昂贵、不宜重复使用，所以样品的分离纯化限制了高效液相色谱法应用于婴幼儿配方奶粉中乳铁蛋白的测定。
因此，现有技术有待改进。
发明内容
本发明的目的在于提供一种固相萃取柱及其制备方法和乳铁蛋白的检测方法，旨在解决现有乳铁蛋白测定的样品分离纯化繁琐、成本高的技术问题。
为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明一方面提供一种固相萃取柱的制备方法，包括如下步骤：
提供硅烷偶联剂、螯合剂、载体材料和金属离子前驱体；
将所述硅烷偶联剂和所述螯合剂结合，得到交联复合物；
将所述交联复合物与所述载体材料和所述金属离子前驱体溶于溶剂中进行反应，得到混合填料；
将所述混合填料置于萃取柱模具中进行固化处理，得到固相萃取柱。
以及，一种固相萃取柱，所述固相萃取柱由本发明所述的固相萃取柱的制备方法制备得到。
本发明提供的固相萃取柱的制备方法，将硅烷偶联剂和螯合剂进行反应结合得到交联复合物后，与载体材料和金属离子前驱体溶于溶剂中进行反应得到混合填料，然后将混合填料置于萃取柱模具中进行固化处理，即可以得到用于分离纯化乳铁蛋白的固相萃取柱；将该固相萃取柱代替肝素亲和柱，利用金属螯合亲和层析和固相萃取相结合的原理可以很好地吸附纯化乳铁蛋白，后续与液相色谱结合，可以准确、简便、快速地测定婴幼儿配方奶粉中的乳铁蛋白，具有很好地应用前景。
本发明另一方面提供一种乳铁蛋白的检测方法，包括如下步骤：
提供样品溶液；
采用本发明所述地固相萃取柱对所述样品溶液进行萃取处理，得到萃取液；
对所述萃取液进行液相色谱分析。
本发明提供的乳铁蛋白的检测方法采用了本发明特有的固相萃取柱对样品溶液进行萃取处理，该固相萃取柱利用了金属螯合亲和层析和固相萃取相结合的原理可以很好地吸附纯化乳铁蛋白，将萃取后的萃取液进行液相色谱分析，就可以准确、简便、快速地测定婴幼儿配方奶粉中的乳铁蛋白，进而保障婴幼儿饮食中乳铁蛋白的营养充足，具有很好地应用前景。
附图说明
图1是本发明实施例的固相萃取柱制备时的装柱示意图；
图2是本发明实施例的不同螯合剂种类的效果比较；
图3是本发明实施例的不同搅拌时间对乳铁蛋白回收率的结果比较；
图4是本发明实施例的乳铁蛋白标准工作曲线；
图5是本发明实施例的100.0μg/mL的乳铁蛋白标准品溶液色谱图；
图6是本发明实施例的空白惠氏奶粉样品加标色谱图；
图7是本发明实施例的至初奶粉样品色谱图；
图8是本发明实施例的摇篮奶粉样品色谱图。
具体实施方式
为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
一方面，本发明实施例提供了一种固相萃取柱的制备方法，包括如下步骤：
S01：提供硅烷偶联剂、螯合剂、载体材料和金属离子前驱体；
S02：将所述硅烷偶联剂和所述螯合剂结合，得到交联复合物；
S03：将所述交联复合物与所述载体材料和所述金属离子前驱体溶于溶剂中进行反应，得到混合填料；
S04：将所述混合填料置于萃取柱模具中进行固化处理，得到固相萃取柱。
本发明实施例提供的固相萃取柱的制备方法，将硅烷偶联剂和螯合剂进行反应得到交联复合物后，与载体材料和金属离子前驱体溶于溶剂中进行反应得到混合填料，然后将混合填料置于萃取柱模具中进行固化处理(如图1所示)，即可以得到用于分离纯化乳铁蛋白的固相萃取柱；将该固相萃取柱代替肝素亲和柱，利用金属螯合亲和层析和固相萃取相结合的原理可以很好地吸附纯化乳铁蛋白，后续与液相色谱结合，可以准确、简便、快速地测定婴幼儿配方奶粉中的乳铁蛋白，具有很好地应用前景。
在一个实施例中，所述硅烷偶联剂选自3-缩水甘油氧基丙基三甲氧基硅烷(KH-560)、3-氨丙基三乙氧基硅烷(KH-792)和N-β-氨乙基-γ-氨丙基三甲氧基硅烷(KH-550)中的一种或多种。硅烷偶联剂可以适用于无机材料和有机材料的表面，起着桥梁的作用，对于不同的基质和处理对象，以及有机聚合物及无机材料的特性，选择适宜的硅烷偶联剂，本发明实施例采用三烷氧基型硅烷偶联剂，包括3-缩水甘油氧基丙基三甲氧基硅烷、3-氨丙基三乙氧基硅烷、N-β-氨乙基-γ-氨丙基三甲氧基硅烷。本发明实施例通过对比加入同等体积的硅烷偶联剂KH-560、KH-792、KH-550以及不加入硅烷偶联剂四种情况所分别制成的固相萃取柱测定乳铁蛋白的回收率，结果KH-550平均回收率最高，具体为62.1％，用其制成的固相萃取柱在试液过柱时的流出速度也比其他的快，且发现其色谱图中无杂峰及拖尾现象，符合实验要求，因此优选KH-550。
在一个实施例中，所述螯合剂选自亚氨基二乙酸和L-谷氨酸中的一种或多种；螯合剂为带双羧基的螯合剂，螯合剂的作用主要是与硅烷偶联剂结合合成有双羧基官能团的交联复合物(即硅烷偶联剂-螯合剂复合物)，从而可以固定金属离子，确保金属离子不会流失，并与金属离子形成配位强度适宜的螯合剂，选择性结合乳铁蛋白质。本发明实施例，选用亚氨基二乙酸(IDA)、L-谷氨酸(L-Glu)、两者以1:1的相同物质的量混合(IDA+L-Glu)分别进行填料合成及装柱，其余的条件一致，各自合成的固相萃取柱通过测定空白试剂加标的回收率比较，结果见图2，这三种情况制备的固相萃取柱分离纯化乳铁蛋白的效果基本相似，基于L-谷氨酸的成本要比亚氨基二乙酸的稍高些，且L-谷氨酸的相对分子质量较大，考虑到节约试验试剂、减少试验成本、简化试验操作、提高回收率使试验结果良好，优选亚氨基二乙酸(IDA)作为螯合剂。
在一个实施例中，所述硅烷偶联剂和所述螯合剂结合的温度为60-70℃，优选65℃。上述条件下螯合剂可以很好地结合在硅烷偶联剂上，形成双羧基官能团的硅烷偶联剂-螯合剂交联复合物。进一步地，将硅烷偶联剂和螯合剂结合得到交联复合物的步骤包括：将硅烷偶联剂和螯合剂溶于水溶液中，60-70℃下以200～300rpm的转速搅拌反应完成后，将pH至6.8～7.2，如此得到稳定的硅烷偶联剂-螯合剂交联复合物；如此可以更有效地与后续载体材料和金属离子结合成固定相。
在一个实施例中，所述载体材料选自聚苯乙烯-二乙烯基苯微球和羧基微球中一种或多种。固相的载体材料的作用是承载螯合配体，且与金属离子和蛋白质形成的配合物稳定性有关，本发明实施例中，羧基微球可与含有伯氨基的物质结合，性能稳定、非特异吸附作用低，不受样品中杂蛋白的影响，而聚苯乙烯-二乙烯基苯微球化学性能更佳稳定，对乳铁蛋白的回收率更高。因此本发明实施例优选聚苯乙烯-二乙烯基苯微球作为固相萃取柱的固相载体。螯合配体通过间隔臂上的共价键与上述载体材料基质结合形成固定相。
在一个实施例中，所述金属离子前驱体选自镁盐、铁盐、锆盐和镍盐中的一种或多种。乳铁蛋白的球状叶结构中含有铁结合位点，可与多种金属离子发生相互作用，进而将乳铁蛋白吸附保留在固相萃取柱的填料中，再用洗脱剂洗脱。本实验选取了四种金属离子：镁离子(Mg2+)、铁离子(Fe3+)、锆离子(Zr4+)、镍离子(Ni2+)，所用试剂为镁盐、铁盐、锆盐和镍盐，具体各自为硫酸镁(MgSO4)、氯化铁(FeCl3)、硫酸锆(Zr(SO4)2)、氯化镍(NiCl2)，将它们分别配置为相同浓度(0.025mol/L)的溶液，加入的量相同，搅拌时间为2h，分别制作成填料装柱，将空白样品(惠氏启赋较大婴儿配方奶粉)加标试液各自过柱后再用同一洗脱剂洗脱、收集流出液测定回收率来对比它们吸附乳铁蛋白的效果，结果显示Mg2+回收率最高，因此本发明实施例优选的螯合离子为镁离子。金属离子的种类优选为镁离子后，本发明实施例采用氯化镁及硫酸镁两种试剂分别进行填料合成，对比其吸附效果，结果显示使用氯化镁螯合的固相萃取柱的空白样品加标回收率要比用硫酸镁的高出20％以上，因此，本发明实施例优选镁离子前驱体试剂为氯化镁溶液。
在一个实施例中，将所述交联复合物与所述载体材料和所述金属离子前驱体溶于溶剂中进行反应的步骤包括：将所述交联复合物与所述载体材料溶于所述溶剂中进行第一搅拌处理，然后加入金属离子前驱体溶液，进度第二搅拌处理。所述溶剂为水。优选地，所述第一搅拌处理的条件包括：200～300rpm，搅拌0.5～6.5h；所述第二搅拌处理的条件包括：200～300rpm，搅拌0.5～4.5h。所述溶剂为水。
进一步地，将交联复合物与载体材料溶于溶剂中时，该载体材料为活化的载体材料；具体可以用硅烷偶联剂活化，用硅烷偶联剂活化载体材料后与上述交联复合物通过间隔臂上的共价键形成固定相材料，再加入金属离子前驱体溶液，进行螯合反应，从而结合有金属离子。螯合金属离子为固相萃取柱填料合成的关键步骤，固相载体与金属离子的反应时长是决定能否将固相载体偶联上金属离子，以及偶联上的金属离子是否足够多的核心，而这也将直接影响着固相萃取柱吸附乳铁蛋白的效果以及最终乳铁蛋白的回收率。故在本发明实施例中，对螯合金属离Mg2+的反应时长进行优化，具体地，加入金属离子前驱体溶液，进度第二搅拌处理时，依次在其搅拌时长为0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h、3h、3.5h、4h、4.5h时将填料取出分别进行装柱，取空白奶粉样品进行加标，加标后浓度为100μg/mL，分别用螯合了镁离子而不同搅拌时间的填料装填的固相萃取柱进行净化，再用高效液相色谱仪测定试样中乳铁蛋白含量，计算回收率，如图3所示，随着搅拌时间的增长，乳铁蛋白的回收率整体呈现先上升后下降、再上升再下降的趋势，数值在71.9％到88.8％之间，当搅拌时长为4h时乳铁蛋白的回收率最大，故选定步骤中与金属离子Mg2+的反应时长为4h。
在一个实施例中，所述硅烷偶联剂、所述螯合剂、所述金属离子前驱体和所述载体材料的质量比为(4-5):(3-4):(130-140):50，优选为4.2:3.2:134:50。
在一个实施例中，将所述混合填料置于萃取柱模具中进行固化处理中，所述固化处理的温度为20-30℃。
本发明实施例还提供一种固相萃取柱，所述固相萃取柱由本发明实施例的上述固相萃取柱的制备方法制备得到。
本发明实施例的固相萃取柱，可以用于婴幼儿配方奶粉中乳铁蛋白的前处理提纯净化，以其替代国标方法《食品安全国家标准食品中乳铁蛋白的测定(征求意见稿)》中的肝素亲和柱，简化前处理过程，提高其测定回收率。
另一方面，本发明实施例还提供了一种乳铁蛋白的检测方法，包括如下步骤：
E01：提供样品溶液；
E02：采用本发明所述地固相萃取柱对所述样品溶液进行萃取处理，得到萃取液；
E03：对所述萃取液进行液相色谱分析。
本发明实施例提供的乳铁蛋白的检测方法采用了本发明实施例特有的固相萃取柱对样品溶液进行萃取处理，该固相萃取柱利用了金属螯合亲和层析和固相萃取相结合的原理可以很好地吸附纯化乳铁蛋白，将萃取后的萃取液进行液相色谱分析，就可以准确、简便、快速地测定婴幼儿配方奶粉中的乳铁蛋白，进而保障婴幼儿饮食中乳铁蛋白的营养充足，具有很好地应用前景。
在一个实施例中，所述样品溶液的制备方法包括：用磷酸氢二钠溶液溶液溶解奶粉样品得到所述样品溶液；奶粉样品进行前处理时，需用提取剂将乳铁蛋白从试样中以溶解的状态释放出来，再通过离心去除其他杂质，保留含有乳铁蛋白的上清液，且提取应保持乳铁蛋白的生物活性，不对其结构等造成影响，故本实验选用磷酸氢二钠溶液溶解提取奶粉样品。比较酸氢二钠溶液溶解浓度分别为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mol/L时的样品回收率，当其浓度为0.2mol/L时，回收率最大，所以选定磷酸氢二钠溶液的浓度为0.2mol/L。当选定酸氢二钠溶液溶解浓度为0.2mol/L，比较其pH分别为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的样品回收率，pH为8.0时，样品的回收率最大，所以选定磷酸氢二钠溶液的pH优选值为8.0。
用磷酸氢二钠溶液提取样品，再经自制固相萃取柱进行净化，高效液相色谱仪检测乳铁蛋白含量。通过对比回收率来优化自制固相萃取柱的合成条件和前处理条件，并和肝素亲和柱的净化效果进行比较。结果：乳铁蛋白标准曲线线性关系良好，线性相关系数大于0.999，且优化后的自制固相萃取柱测定试样中乳铁蛋白回收率可达80％以上；方法的相对标准偏差小于5％，可满足实验要求。结论：自制固相萃取柱可用于奶粉样品中乳铁蛋白的测定前处理过程，灵敏度高、快速准确，已初步实现对乳铁蛋白的提纯作用。
在一个实施例中，所述采用固相萃取柱对所述样品溶液进行萃取处理，得到萃取液的步骤包括：将所述样品溶液通过活化后的所述固相萃取柱，然后用磷酸氢二钠-氯化钠溶液进行洗脱得到洗脱液，将所述洗脱液过滤，得到所述萃取液。洗脱步骤属于固相萃取柱使用过程中比较重要的环节，其目的是将固相萃取柱的填料中吸附的乳铁蛋白目标化合物洗脱下来，也是提高回收率的关键步骤，因此洗脱剂对整个实验至关重要。乳铁蛋白是一类大分子量蛋白质，pH对其结构存在一定的影响，本发明实施例选用磷酸氢二钠-氯化钠溶液为洗脱剂，设定浓度一致，比较其pH值分别为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0时空白奶粉加标的回收率，随着pH值的增加，回收率大体呈现先增加后减少的趋势，但相差不大，其中pH为8.0回收率最高，因此优选磷酸氢二钠-氯化钠溶液为的pH为8.0。再比较洗脱剂所用体积分别为2mL、3mL、4mL、5mL、6mL时的回收率，当洗脱体积为1-4mL时，回收率处于一直升高的趋势，当洗脱体积达到5mL后，回收率的变化不大，说明填料中的乳铁蛋白已基本被洗脱完全，所以本发明实施例优选的磷酸氢二钠-氯化钠溶液的体积为5mL。
本发明实施例，将硅烷试剂先和螯合配体反应结合成具有双羧基官能团的硅烷偶联剂-螯合配体，再用硅烷偶联剂活化固相载体，并与反应结合后的硅烷偶联剂-螯合配体通过间隔臂上的共价键形成固定相，然后螯合金属离子，引入金属离子形成螯合吸附剂与蛋白质发生作用，通过其与乳铁蛋白之间的特殊相互作用来吸附样品中的乳铁蛋白，再用洗脱剂将保留在填料中的乳铁蛋白洗脱收集，用高效液相色谱仪检测其含量。
进一步地，所述液相色谱的色谱条件包括：色谱柱：C4，5μm，300A°孔径；柱温：30℃；检测波长：280nm；以流动相A为乙腈、流动相B为0.1％三氟乙酸溶液，进行梯度洗脱。
本发明先后进行过多次试验，现举一部分试验结果作为参考对发明进行进一步详细描述，下面结合具体实施例进行详细说明。
本发明实施例用到的实验材料
(1)标准品及试剂
乳铁蛋白标准品：纯度为99.5％；乙腈(CH3CN)：色谱纯，Merck德国默克公司；三氟乙酸(CF3COOH)：色谱纯，CNW上海安谱实验科技股份有限公司；氯化钠(NaCl)、磷酸(H3PO4)、浓盐酸(HCl)、磷酸氢二钠(Na2HPO4)、氢氧化钠(NaOH)、亚氨基二乙酸(IDA)、谷氨酸(L-Glu)、氯化铁(FeCl3)、硫酸锆(Zr(SO4)2)、氯化镍(NiCl2)、硫酸镁(MgSO4)：分析纯；氯化镁(MgCl2)：sigma-aldrich西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司；聚苯乙烯-二乙烯基苯微球100μm；羧基微球：100μm，知益微球科技有限公司；3-缩水甘油基氧基丙基三甲氧基硅烷(3-Gly、KH-560，97％)、3-氨丙基三乙氧基硅烷(APS、KH-550，98％)、N-β-氨乙基-γ-氨丙基三甲氧基硅烷(KH-792)：aladdin上海阿拉丁生化科技股份有限公司；实验用水为超纯水：电阻率为18.2MΩ·cm。
(2)标准溶液配制
乳铁蛋白标准溶液(1mg/mL)：用电子分析天平准确称取乳铁蛋白标准品25.25mg(准确至0.01mg)，用水定容至25mL，摇匀。可在0℃～4℃的冰箱中保存一个月左右。
乳铁蛋白标准工作溶液：用移液枪分别准确吸取乳铁蛋白标准溶液0.00mL、0.05mL、0.10mL、0.20mL、0.50mL、1.00mL于10mL容量瓶中，用超纯水稀释至刻度，摇匀。该标准系列浓度分别是0.00μg/mL、5.00μg/mL、10.0μg/mL、20.0μg/mL、50.0μg/mL、100μg/mL，现配现用。
(3)其他试剂配制
三氟乙酸溶液(0.1％)：用移液枪移取1mL三氟乙酸至1000mL容量瓶中，用超纯水稀释至刻度，摇匀并超声脱气5min，备用。
磷酸溶液(0.1mol/L)：用移液枪吸取磷酸(质量分数为85％)680μL于100mL容量瓶中，加水稀释至刻度，混匀。
磷酸氢二钠溶液(0.20mol/L)：称取磷酸氢二钠14.2g于烧杯中，加入400mL水搅拌溶解，用0.1mol/L磷酸溶液调节pH至8.00±0.5后转移至500mL容量瓶，用水稀释至刻度，摇匀。
磷酸氢二钠-氯化钠溶液：称取0.710g磷酸氢二钠和5.84g氯化钠，加入适量水溶解，用0.1mol/L磷酸溶液调节pH至8.00±0.5后转移至100mL容量瓶，稀释至刻度，摇匀。
氯化镁溶液(0.025mol/L)：用移液枪吸取1.25mL氯化镁，加水定容至50mL混匀。
氯化铁溶液(0.025mol/L)：称取氯化铁0.20g(精确至0.01g)于烧杯中，用适量水溶解后转移至50mL容量瓶，加水定容至刻度，混匀。
硫酸锆溶液(0.025mol/L)：称取硫酸锆0.35g(精确至0.01g)于烧杯中，用适量水溶解后转移至50mL容量瓶，加水定容至刻度，混匀。
氯化镍溶液(0.025mol/L)：称取氯化镍0.16g(精确至0.01g)于烧杯中，用适量水溶解后转移至50mL容量瓶，加水定容至刻度，混匀。
(4)实验样品
摇篮安宝宝婴儿配方奶粉(0-6月龄，1段)：800克/罐，乳铁蛋白含量为50mg/100g。惠氏启赋较大婴儿配方奶粉：900克/罐，不含乳铁蛋白。喜安智典悦幼儿配方奶粉：750克/罐，乳铁蛋白含量为50mg/100g。至初较大婴儿配方奶粉(6-12月龄，2段)：900克/罐，乳铁蛋白含量为30mg/100g。
(5)主要仪器和设备
实验所用的主要仪器和设备见表1。
表1
Figure BDA0002588000710000111
实施例1固相萃取柱填料合成及装柱过程
(1)分别称取4.24gIDA和2.82gNaOH于500mL锥形瓶中，加入50mL超纯水超声溶解后，在0℃冰水浴条件下缓慢滴加1.4mL3-Gly，再于65℃下以200～300rpm的转速搅拌6h，将普通硅烷试剂先和螯合配体反应结合成具有双羧基官能团的硅烷偶联剂-螯合配体，反应完成后，自然冷却至室温，放入4℃冰箱保存。
⑵从冰箱中取出步骤(1)反应后的材料，缓慢滴加1.6mL3-Gly，在65℃下以200～300rpm的转速搅拌6h，反应完成后，自然冷却至室温，再用浓盐酸调pH至6.8～7.2，放入4℃冰箱保存。
⑶称取50g聚苯乙烯-二乙烯基苯微球，加入200mL超纯水，分别水洗5次，水洗完成后，加入1.17mLAPS和步骤(2)合成的50mLGly-IDA，加水至150mL，常温下以200～300rpm搅拌6h，反应结束后用超纯水水洗4次，放入4℃冰箱保存。
(4)取上述水洗后的材料10g，加水至200mL，加入28.2mL0.025mol/L氯化镁溶液，常温下200～300rpm搅拌4h，反应结束后水洗至上清液澄清，放入4℃冰箱保存。
(5)装柱(如图1)：在SPE空柱里先放一片筛板于柱底，再于固相萃取装置上用步骤(4)合成好的填料进行装柱，每根里装柱的量为1g～2g左右，水洗至填料沉于柱底、且上清液澄清，流出液的pH值大致呈中性后加筛板、上盖和下盖，并在SPE柱内保留些许水分使填料维持湿润，4℃保存。
实施例2乳铁蛋白检测
样品前处理
准确称取1g(精确至0.01g)婴幼儿配方奶粉试样于50mL烧杯中，待提取。试样中先加入5mL温热的磷酸氢二钠溶液(温度不超过50℃)，搅拌使样品完全溶解，将样品全部转入50mL离心管中。再向原烧杯中加入5mL磷酸氢二钠溶液，转入离心管中合并两次液体。用漩涡振荡器振荡0.5min混匀，再在4℃下以10000r/min的转速离心10min。将离心后的上清液转移至另一个50mL离心管中，再向原离心管中加入5mL磷酸氢二钠溶液，把涡旋、离心步骤重复操作一次，将两次离心所得的上清液合并后作为样品提取液备用。
样品检测
净化：打开上述实施例1制备的固相萃取柱的上盖和下盖，待其中的储存液流出后，加入5mL磷酸氢二钠溶液活化，处理完毕后分次加入全部样品提取液，控制流出速度，约为1～2s一滴，待样液完全流出后，再用10mL磷酸氢二钠溶液淋洗固相萃取柱，弃去全部流出液。最后用5mL磷酸氢二钠-氯化钠溶液洗脱，收集全部流出液，再将流出液用磷酸氢二钠-氯化钠溶液定容至5mL，混匀，用0.45μm的有机滤膜过滤，最后用高效液相色谱检测分析。
色谱条件如下
色谱柱：C4，5μm，300A°(孔径)，250mm×4.6mm(内径)或相当者；柱温：30℃；检测波长：280nm；进样体积：50μL；流速：1.0mL/min；流动相A：乙腈；流动相B：0.1％三氟乙酸溶液。梯度洗脱参数见表2。
表2
Figure BDA0002588000710000131
试样中乳铁蛋白含量测定
将净化后的试液用高效液相色谱仪进行测定，得到相对应的峰面积，再由标准曲线得到试样中乳铁蛋白的浓度，平行测定次数不少于2次。
试样中乳铁蛋白含量按下列公式计算：
Figure BDA0002588000710000132
式中：
X—试样中乳铁蛋白的含量，单位为毫克每百克(mg/100g)；
C—样品峰面积代入标准工作曲线中算得的被测组分溶液浓度，单位为微克每毫升(μg/mL)；
V—样品溶液的定容体积，单位为毫升(mL)；
m—试样的质量，单位为克(g)；
f—稀释倍数。
⑵试样加标回收率计算公式如下：
P＝{(X2-X1)/X0}×100％
式中：
P—加标回收率；
X2—加标后测定试样中乳铁蛋白的含量，单位为毫克每百克(mg/100g)；
X1—空白试样中乳铁蛋白的含量，单位为毫克每百克(mg/100g)；
X0—理论加标量，单位为毫克每百克(mg/100g)。
标准曲线范围及检出限验证
配制的浓度梯度分别为0.00μg/mL、5.00μg/mL、10.0μg/mL、20.0μg/mL、50.0μg/mL、100μg/mL的乳铁蛋白标准工作溶液，按照上述色谱条件进行检测，以系列浓度的乳铁蛋白标准工作溶液的浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制乳铁蛋白的标准曲线(如图4)，由此得到的线性回归方程为：Y＝2175.4*x-1775.9，在质量浓度0～100μg/mL范围内，线性关系良好，线性相关系数R2＝0.9993。在优化条件下，分别按信噪比(S/N)＝3和信噪比(S/N)＞10计算，乳铁蛋白的检出限为6.5mg/100g、定量限为21mg/100g，与国标方法《食品安全国家标准食品中乳铁蛋白的测定(征求意见稿)》基本一致。
回收率和精密度验证
采用同一婴幼儿配方奶粉为空白样品，分别加入不同含量的乳铁蛋白标准品(添加水平分别为10mg/100g、30mg/100g、50mg/100g)，按本实施例所用方法进行样品前处理，用上述固相萃取柱净化后，高效液相色谱仪测定，计算乳铁蛋白的回收率，每个添加水平平行测定6次。扣除奶粉本底后，婴幼儿配方奶粉中乳铁蛋白的平均回收率为81.6％～92.6％，相对标准偏差(RSD)在3.53％～4.54％之间。
而乳铁蛋白的加标回收率试验和重复性试验验证的回收率都在75％～100％之间，在重复性条件下所得到的两次独立测定结果的绝对差值是平均值的9.6％～11.2％，满足《食品安全国家标准食品中乳铁蛋白的测定(征求意见稿)》中所要求的精密度不超过算术平均值的20％的要求。由此可见，本发明实施例回收率高，重复性及稳定性也好的，因此，本发明实施例的检测方法可以高精密度地准确检测奶粉中的乳铁蛋白。
实施例3
用实施例2的检测方法对浓度为100.0μg/mL的乳铁蛋白标准品溶液、空白奶粉加标、婴幼儿配方奶粉样品中乳铁蛋白进行检测，最终的液相色谱图见图5至图8，由图可知，乳铁蛋白标准品溶液和婴幼儿配方奶粉样品中乳铁蛋白出峰时间分别约为8.84min和8.75min，而且无杂峰干扰，峰型好，基线稳定，说明本发明实施例的固相萃取柱分离纯化乳铁蛋白的效果好。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种乳铁蛋白的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
提供样品溶液；
采用固相萃取柱对所述样品溶液进行萃取处理，得到萃取液；
对所述萃取液进行液相色谱分析；
其中，所述固相萃取柱的制备方法包括如下步骤：
提供硅烷偶联剂、螯合剂、载体材料和金属离子前驱体；
将所述硅烷偶联剂和所述螯合剂结合，得到交联复合物；
将所述交联复合物与所述载体材料和所述金属离子前驱体溶于溶剂中进行反应，得到混合填料；
将所述混合填料置于萃取柱模具中进行固化处理，得到所述固相萃取柱；
所述硅烷偶联剂选自3-缩水甘油氧基丙基三甲氧基硅烷、3-氨丙基三乙氧基硅烷和N-β-氨乙基-γ-氨丙基三甲氧基硅烷中的一种或多种；所述螯合剂选自亚氨基二乙酸和L-谷氨酸中的一种或多种；所述金属离子前驱体选自镁盐、铁盐、锆盐和镍盐中的一种或多种；所述载体材料选自聚苯乙烯-二乙烯基苯微球和羧基微球中一种或多种，所述载体材料为活化的载体材料；所述溶剂为水；所述硅烷偶联剂、所述螯合剂、所述金属离子前驱体和所述载体材料的质量比为（4-5）:（3-4）:（130-140）:50。
2.如权利要求1所述的乳铁蛋白的检测方法，其特征在于，所述样品溶液的制备方法包括：用磷酸氢二钠溶液溶解奶粉样品得到所述样品溶液；和/或，
所述采用固相萃取柱对所述样品溶液进行萃取处理，得到萃取液的步骤包括：将所述样品溶液通过活化后的所述固相萃取柱，然后用磷酸氢二钠-氯化钠溶液进行洗脱得到洗脱液，将所述洗脱液过滤，得到所述萃取液。
3.如权利要求1所述的乳铁蛋白的检测方法，其特征在于，所述硅烷偶联剂和所述螯合剂进行反应的温度为60-70℃；和/或，
所述固化处理的温度为20-30℃。
4.如权利要求1-3任一项所述的乳铁蛋白的检测方法，其特征在于，将所述交联复合物与所述载体材料和所述金属离子前驱体溶于溶剂中进行反应的步骤包括：将所述交联复合物与所述载体材料溶于所述溶剂中进行第一搅拌处理，然后加入金属离子前驱体溶液，进度第二搅拌处理。
5.如权利要求4所述的乳铁蛋白的检测方法，其特征在于，所述第一搅拌处理的条件包括：200~300rpm，搅拌0.5~6.5h；和/或，
所述第二搅拌处理的条件包括：200~300rpm，搅拌0.5~4.5h。
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