JPS60214897A - タンパク質の製造法 - Google Patents

タンパク質の製造法

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JPS60214897A
JPS60214897A JP60052572A JP5257285A JPS60214897A JP S60214897 A JPS60214897 A JP S60214897A JP 60052572 A JP60052572 A JP 60052572A JP 5257285 A JP5257285 A JP 5257285A JP S60214897 A JPS60214897 A JP S60214897A
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protein
polypeptide
biospecific
dna
bound
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JP60052572A
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ギユンター・シユミツト‐カストナー
カルル・クツツバツハ
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Bayer AG
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
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    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、所望のタンパク質のためのＤＮＡ配列を２種
の特定の他のペプチドと遺伝子工学法により同時クロー
ニング（ｃｏ−ｃｌｏｎｉｎｇ）することによるタンパ
ク質の製造法に関する。ここで３種の構成成分の化合タ
ンパク質（ｃｏｍｂｉｎｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ）が発現
される。次いで、この化合タンパク質を担体結合生物特
異性相補的物質上へ吸収させそして、残りの構成成分を
除去した後、所望のタンパク質がそれらの断片のうちの
１種であるいくつかの断片のみが存在するように、切り
離す。
６°ｉ伝子丁学によるタンパク質の製造において、発現
されたタンパク質を純粋な形態で多成分の混合物から単
離するという問題が常に存在する。
こうして、本発明は、遺伝子工学によるタンノくり質を
Ｖ造しかつ単離する概念的に新規な方法を提供する。
この新規な方法は、 ａ）このタンパク質について遺伝情報を指定する（ｃｏ
ｄｅ　ｆｏｒ）ＤＮＡ配列、短鎖ペプチドについて遺伝
情報を指定するＤＮＡ配列および生物特異性ポリペプチ
ドについて遺伝情報を指定するＤＮＡ配列を、前記短鎖
ペプチドにつり４でのＤＮＡ配列が他の２つのＤＮＡ配
列の門に存在す、パ るように、生いに結合させ： ｂ）このようにして得られる新し１．ｒ％　Ｄ　Ｎ　Ａ
断片を宿主有機体のＤＮＡ中へ適当な遺伝子工学法によ
り、前記生物特異性ポリペプチド、前記短鎖ペプチドお
よび前記所望のタンパク質から成る化合タンパク質の転
写（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉ。
ｎ）、翻訳（ｔ　ｒａｎｓ　ｌａｔ　ｉ　ｏｎ）および
発現（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）が起こることができるよ
うに、導入し； Ｃ）前記宿主有機体をそれが前記化合タンノ々り質を生
成するように培養し： ｄ）前記培養系の前記化合タンパク質を含有する部分を
、適当ならば他の成分を除去した後、適当な担体物質か
ら成る固定化系と接触させ、前記固定化系には前記生物
特異性ポリペプチドに対して相補的でありかつ所定の反
応条件下でこのポリペプチドへ強く結合する物質が結合
されてお。
す； ｅ）前記化合タンパク質が結合するようになった前記固
定化系を他の成分から適当な方法で分離し、そして前記
結合化合タンパク質から前記短鎖ペプチドを特異的に切
り離す物質で処理し；そしｆ）このように遊離された所
望のタンパク質友、適当な方法で、他の成分から分離し
かり単離オる； ことを特徴とする。
こうして、本発明の方法は、所望のタンパク質を単離さ
れた形態ではなく、２種の他の要素、すなわち、生物特
異性ポリペプチドおよび短鎖ペプチド、と関連させて発
現させることを可能とする１段からなる。
この概念において、所望のタンパク質と生物特異性ポリ
ペプチドとの間に位置する短鎖ペプチドは意図する切断
部位を表わす。したがって、短鎖ペプチドはこの方法の
後の工程において高度に特異的な方法で切除（ｅｘｃｉ
ｓｅ）されうるように位置しなくてはならない。この切
除は好ましくは酵素を用いて実施される。こうして、短
鎖ペプチドの選択は、短鎖ペプチドのアミノ酸配列を認
識【７かつ切り離す（ｓ　ｐ　ｌ　ｉ　ｔ）ことができ
る物質（ａｇｅｎｔ）、例えば、酵素が大手可能である
かどうかに依存する。しかしながら、単に短鎖ペプチド
と所望のタンパク質との間の結合を１つの側において切
り離すことでまた十分である。
このような高度に特異性の酵素の１つの例は、膵臓から
得られる酵素カリクレイン（Ｅ　、　Ｃ。
３．４．２１．８．）である。この酵素はキニノーゲン
のペプチド鎖からデカペプチドＬｙｓ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ
−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−３ｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−
Ａｒｇの配列を切り離す。
このデカペプチドは好ましくは本発明に従い同時クロー
ニングされる。
本発明に従いまた同時クローニングされる生物特異性ポ
リペプチドは、担体結合生物特異性相補的物質へ結合し
、こうして担体を媒質の他の構成成分から、それへ結合
した化合タンパク質と　・緒に分離できるようにする仕
事を有する。当然の帰結として、生物特異性ポリペプチ
ド／相補的物質１ゴ の系はそれらの間に強い結合が所定の反応条件下で起こ
るという要件に従うことになる。
生物学的に活性なポリペプチド、例えば、酵素は／Ｉ：
物学的に活性な相補的物質、例えば、阻害剤と、生物特
異性複合体（ｃｏｍｐ　ｌ　ｅｘ）、例えば、酵素−阻
害剤複合体を形成することができる。
このような生物特異性酵素−阻害剤複合体は高い結合親
和性を有する。その解離定数はそれに応して低い。
酵素−阻害剤複合体の１つの例は、本発明に従い好まし
いトリプシン−アプロチニン複合体（ｔｒｙｐｓｉｎ−
ａｐｒｏｔｉｎｉｎ　ｃｏｍｐｌｅｘ）であり、これは
酵素トリプシンと酵素阻害剤アプロチニンとから形成さ
れる。この複合体の解離定数Ｋｉはわずかに６ＸｌＯ−
”モル／１（ｐＨ＝８．０、ｔ＝２５”）であり、そし
て複合化の速度はｔｌ／２＝６．３秒である。したがっ
て、トリプシン−アプロチニン複合体は非常に急速に形
成し、そして所定の反応条件下で非常に高い安定性を有
する。しかしながら、トリプシン−アプロチニン複合体
の安定性は溶液のｐＨ値に依存し、そしてＰＨ値が低下
するとき減少する。トリプシン−アプロチニン複合体は
、約２゜０のＰＨ値においてほとんど完全に解離する。
このような挙動は本発明の関係においてとくに望ましい
。なぜなら、担体結合相補的物質の再生はその結果容易
に可能であるからである。次いで、この物質はこの方法
において再使用可能である。さらに、生物特異性ポリペ
プチドと担体結合相補的物質との間の結合の形成速度は
高いことがさらに望ましい。担体結合相補的物質と化合
タンパク質の他の部位との起こりうる拮抗反応は、この
ようにして減少されうる。
説明する酵素／阻害剤系は単なる１つの例である。例え
ば、抗原／抗体またはペプチドのホルモン／受容体系を
同様に使用できる。
生物特異的吸収は、生物特異的に相補性の物質が結合す
る水不溶性担体を使用して実施することか々ｒましい。
この結合は既知の固定化法により、スペーサー分子を使
用しであるいは使用しないで、実施することができる。
＋ｉｉｉ　ｐ＋；の３成分のＤＮＡ配列を遺伝子工学の
方法により同時クローニングにし、そしてこのようにし
て得られるＤＮＡを宿主のＤＮＡ中に、例えばプラスミ
ド中に、遺伝子工学の方法により転移する。適当な微生
物は、例えば、バクテリア、とくに、Ｅ、ｃｏｌｉ、ま
たはＢａｃ、５ｕｂｔ　ｉ　１ｉｓ、または酵母を宿主
有機体として使用することができる。同時クローニング
されたＤＮＡの転写、翻訳および、最後に、発現は微生
物の培養中に起こる。醗酵溶液が所望のタンパク質を２
種の同時クローニングされたペプチドと一緒に含有する
場合、細胞を、例えば、遠心または交差流濾過により、
分離し、そして培養物の濾液を単離に使用する。細胞自
体が所望のタンパク質を２種の同１１’、ｒクローニン
グされたペプチドと一諸に含有する場合、細胞を分離し
、破壊し、そして細胞断片を分離により除去する。培養
物の濾液または細胞抽出液は所望の同時クローニングき
れた化合タンパク質のみならず、その上多数の他のタン
パク質、多数の他の生成物およびまた栄養媒質の付着す
る構成成分を含有する。所望の化合タンパク質はここで
この複雑な組成の溶液から単離され、そして精製される
。これは担体結合生物特異的相補性物質、例えば、固定
化トリプシン、を培養物の濾液または抽出液に添加する
ことにより実施する。次の５成分の水不溶性複合体は、
高い複合化速度で直ちに形成する：押体＋生物特異的に
相補性の物質＋生物特異性ポリペプチド＋短鎖ペプチド
＋所望のタンパク質、例えば、５成分すなわち担体十ト
リプシン士アプロチニン十デカペプチド＋所望のタンパ
ク質の複合体。担体結合生物特異的相補性物質を、室温
において、しかしまた、複合化が高速度であるので、低
温、例えば＋２°Ｃにおいて添加することができる。水
不溶性複合体は醗酵溶液中の他のタンパク質からおよび
またすべての他の不純物から簡単な癌過により分離する
ことができる。
タンパク質加水分解性酵素、例えば、トリプシンを１１
：物特毘的相補性物質として使用する場合、これを醗酵
溶液への添加前に低分子量の阻害剤で飽和することがで
きる。しかしながら、低分子量の肝１害剤の解離定数は
生物特異性ポリペプチドのそれよりも大きくなくてはな
らない。解離定数がＷるため、低分子量阻害剤は醗酵溶
液の添加時に生物４ν冗性ポリペプチドから置換される
。担体結合トリプシンのために使用できる低分子量阻害
剤の例は解離定数が１８Ｘ１０−６モル／Ｉであるベン
ズアミジンまたは解離定数が７２Ｘ１０−６モル／１で
あるフェニルグアニジンである。
あるいは、カラムに担体結合生物特異的相補性’＋ｈ質
を充填することができる。次いで、培養物の濾液または
細胞抽出液をこの方ラムに通過する。
この場合においてまた、もっばら所望の化合タンパク′
（（は生物特異性ポリペプチドを介して固体の担体へ結
合されるが、すべての他のタンパク質およびすべての他
の不純物はカラムを流過する。ｐ−！休へ結合した生物
特異的相補性ポリペプチドは結合すべき複合体で出来る
だけ完全に飽和されるべきである。カラムから残留する
４１着する不純物を。
緩衝液または他の適当な溶液で洗浄することにより除去
することができる。複合化速度は高いので、カラムはま
た低温で装填することができる。
最後に、担体へ結合した化合タンパク質は特異性酵素の
作用により切り離す。特異性酵素は短鎖ペプチドのペプ
チド結合をもっばら切り離す。
全体の複合体が成分すなわち担体十トリプシン＋アプロ
チニン十デカペプチド士所望のタンパク質から構成され
る場合、酵素のカリクレインを、前述のように、特異的
酵素として使用することができる。カリクレインはデカ
ペプチドを両側で加水分解し、そして末端に結合する所
望のタンパク質な化合タンパク質から切り離す。短鎖ペ
プチドと所ｑノのタンパク質との間の結合の１つの側の
切り離しは十分である。このような短鎖ペプチドは配列
Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｒｇをもつ前述のデカペプチドから
の最後の３つのＣ末端アミノ酸を多分台イ１する。こう
してカリクレインは、ヘキサペプチド Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−３ｅｒ−Ｔｙｒ−Ｇｉｎ　Ｋ
　＝０．２５ミリモル　またはＰｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ
−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ　Ｋ　＝０．１５ミリモル におけるＡｒｇ−Ｘ間の所望の結合を高度に特異的に切
り離す。所望のタンパク質はデカペプチドと一緒に溶離
され、そして既知の方法、例えば、モレキュラーシーブ
のクロマトグラフィーによりデカペプチドから分離され
ることができる。こうして所望のタンパク質は純粋な形
態で得られる。
化合タンパク質中の意図する切断部位として短鎖ペプチ
ドを選択するときの利点は、切り離し後、概して大きい
分子の形で、小さい短鎖ペプチドから容易に除去するこ
とができる。
生物特異性ポリペプチドは、溶離条件下で相補的物質を
介して担体へ結合されたままである。例えば、緩衝液の
ｐ）（を、例えば、２〜３の値に単に変えることにより
、生物特異性ポリペプチドはカラムから切り離されかつ
洗浄されて出る。それ以上の洗浄作業の後、カラムを次
いで緩衝液で適当なＰＨ値に、トリプシン／アプロチニ
ンを使用する場合ｐＨ８゜０に、することができ、そし
て他の実験に再使用することができる。
本発明の方法により製造できるタンパク質の例として、
なかでも、次のものを述べることができる：ホルモン類
、例えば、ヒトのツマトロピン、エリトロポイエチン、
コルチコトロピン、プレープロインシュリン、プレーミ
ニプロインシュリンおよびインシュリンのＡ鎖およびＢ
鎖のポリペプチド配列、神経伝達物質類、例えば、物質
Ｐまたはβ−エンドモルフインのポリペプチド配列、イ
ンターフェロン類、ＩＮＦ−α、ＩＮＦ−βまたはＩＮ
Ｆ−γ、雑種インターフェロン類およびインタールーキ
７（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ）類のポリペプチド配タリ
、血漿タンパク賀類、例えば、ヒトのα、−抗トリプシ
ン、アルブミンおよび単離因子類、例えば、組織のプラ
スミノーゲン活＋１化因子および因子■のポリペプチド
配列、酵、ド類、例えば、Ｄ−キシロースイソメラーゼ
、ペニシリンアシラーゼ、ウロキナーゼおよびレンニン
のポリペプチド配列、および抗体類、例えば、モノクロ
ナル抗体およびワクチン類のポリペプチド配列、
【図面の簡単な説明】
第１図は、本発明による方法を線図の形で示す。 持前出願人　バイエル拳アクチェンゲセ゛ルシャフト １）ＮＡ−西ど列 第１図

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 ｌ、タンパク質の製造法であって、 ａ）このタンパク質について遺伝情報を指定するＤＮＡ
    配列、短鎖ペプチドについて遺伝情報を指定するＤＮＡ
    配列および生物特異性ポリペプチドについて遺伝情報を
    指定するＤＮＡ配列を、前記１１ｆ鎖ペプチドについて
    のＤＮＡ配列が他の２つのＤＮＡ配列の間に存在するよ
    うに、互いに結合さぜ； ｂ）このようにして得られる新しいＤＮＡ断片を室上有
    機体のＤＮＡ中へ適当な遺伝子工学法により、ｉｆＩ記
    生物特異性ポリペプチド、前記短鎖ペプチドおよび前記
    所望のタンパク質から成る化合タンパク質の転写、翻訳
    および発現が起こることができるように、導入し； ｃ）ｉｉｉｊ記宿主有機体をそれが前記化合タンパク質
    を生成するように培養し； ｄ）前記培養系の前記化合タンパク質を含有する部分を
    、適当ならば他の成分を除去した後、適当な担体物質か
    ら成る固定化系と接触させ、前記固定化系には前記生物
    特異性ポリペプチドに対して相補的でありかつ所定の反
    応条件下でこのポリペプチドへ強く結合する物質が結合
    されており； ｅ）前記化合タンパク質か結合するようになった前記固
    定化系を他の成分から適当な方法で分離し、そして前記
    結合した化合タンパク質から前記短鎖ペプチドを特異的
    に切り離す物質で処理し；そして ｆ）このように遊離された所望のタンパク質を、適当な
    方法で、他の成分から分離しかつ単離する： ことを特徴とするタンパク質の製造法。 ２、生物特異性ポリペプチドは、高速度で、相補的物質
    を結合した担体へ強く結合することを特徴とする特許請
    求の範囲第１項記載の方法。 ３、結合は＋２°Ｃないし室温において実施する特許請
    求の範囲第２項記載の方法。 ４、生物特異性ポリペプチドおよび相補的担体結合物質
    は酵素および関連する阻害剤の系であることを特徴とす
    る特許請求の範囲第１〜３項のいずれかに記載の方法。 ５、生物特異性ポリペプチドはアプロチニンであり、そ
    して相補的担体結合物質はトリプシンであることを特徴
    とする特許請求の範囲第１〜４項のいずれかに記載の方
    法。 ６、短鎖ペプチドはデカペプチドＬｙｓ−Ａｒｇ−Ｐｒ
    ｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−３ｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ
    −Ａｒｇであることを特徴とする特許請求の範囲第１〜
    ５項のいずれかに記載の方ツノ：。 ７、結合した化合、タンパク質から短鎖ペプチドを特苦
    的に切り離す物質は酵素であることを特徴とする特許請
    求の範囲第１〜６項のいずれかに記載の方法。 ８、酵素はカリクレイン（Ｅ、Ｃ，３，４，２１，８，
    ）であることな特徴とする特許請求の範囲第６または７
    項記載の方法。 ９、製造すべきタンパク質は、ホルモン、血清タンパク
    質、凝固因子、酵素、抗体またはワクチンであることを
    特徴とする特許請求の範囲第１〜８項のいずれかに記載
    の方法。。 ｌＯ、タンパク質は因子■であることを特徴とする特許
    請求の範囲第９項記載の方法。
JP60052572A 1984-03-22 1985-03-18 タンパク質の製造法 Pending JPS60214897A (ja)

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DE19843410437 DE3410437A1 (de) 1984-03-22 1984-03-22 Verfahren zur herstellung von proteinen
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JP (1) JPS60214897A (ja)
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DE (1) DE3410437A1 (ja)
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