JPH09183794A - タンパク質の調製および回収方法 - Google Patents

タンパク質の調製および回収方法

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JPH09183794A JP8330278A JP33027896A JPH09183794A JP H09183794 A JPH09183794 A JP H09183794A JP 8330278 A JP8330278 A JP 8330278A JP 33027896 A JP33027896 A JP 33027896A JP H09183794 A JPH09183794 A JP H09183794A
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 タンパク質、特に酵素の調製および回収 【解決手段】 プロタンパク質含有溶液を、プロテアー
ゼ、および該プロタンパク質またはその機能的に不活性
な分解産物よりも、該タンパク質に対して一層高いアフ
ィニティーを有する固相担体に接触させ、該プロタンパ
ク質を該プロタンパク質をタンパク質加水分解的に開裂
させ、生成するタンパク質を固相担体上に吸着させるこ
とにより選択的に分離することを特徴とする、単一工程
にて制御されたタンパク質分解的開裂によってプロタン
パク質、特にプロ酵素からタンパク質、特に酵素を回
収、調製する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、プロテアーゼを用
いたプロタンパク質の制御された開裂によるタンパク質
の調製および回収方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】生物体において、多数のタンパク質およ
び酵素は不活性な前段階（プロタンパク質（タンパク質
前駆体）またはプロ酵素）として細胞の生合成によって
生成される。必要であれば、ついでこれらの不活性な前
段階は、例えばタンパク質限定分解などにより活性形態
に変換される。従って、ヒトの体内でプロトロンビンは
プロトロンビナーゼ複合体反応においてプロテアーゼＸ
ａ因子によりトロンビンに変換される。不活性なＸ因子
は活性Ｘａ因子へ、例えばプロテアーゼＩＸａ因子によ
り変換される。
【０００３】活性化したタンパク質の回収は、臨床応用
ならびに診断目的のために重要である。純粋な形態の活
性化したタンパク質は、ついで、治療または診断または
特異的な抗体の回収のため、例えば、外科的処置におけ
るトロンビンによる血液凝固などの他のタンパク質加水
分解工程を制御するのに使用されうる。
【０００４】例えばヒト血液などの生物体からは、該活
性のあるタンパク質は非常に限られた量しか回収するこ
とができない。それゆえ、プロタンパク質またはプロ酵
素は、たいていイン・ビトロで適当なプロテアーゼの作
用により活性化した形態に変換される。このような方法
がＥＰ−０ ３７８ ７９８により公知である。この方法
によれば、ヒト血漿から得たプロトロンビンが固相担体
上で吸着され、ついで該原料はＣａ2+イオンで処理さ
れ、それによって血漿に存在するプロテアーゼと共に、
プロトロンビンのトロンビンへの変換が起こる。
【０００５】ＥＰ−Ａ−０ ５６５ ５１１に他の方法が
記載されており、その好ましい態様によれば、活性化さ
れるべきプロタンパク質が担体上で固定化され、ついで
可溶性プロテアーゼにより活性のある酵素へと変換され
る。この変換を制御できるようにするため、該変換は洗
剤またはカオトロピック物質（chaotropic substance）
の存在下で行われる。しかしながら、活性化したタンパ
ク質の回収のために、特に、再びプロテアーゼを分離す
るために精製工程がさらに必要とされる。
【０００６】ＥＰ−Ａ−０ ５４１ ５０７によれば、可
溶性形態のプロトロンビンは、凝固的に活性な塩をプロ
トロンビン含有溶液に添加することによってトロンビン
に変換される。引き続いて、トロンビンはイオン交換ク
ロマトグラフィーおよび／またはアフィニティークロマ
トグラフィーによってさらに精製される。
【０００７】ＥＰ−Ａ−０ ５６５ ５１２によれば、ト
ロンビンはプロトロンビン含有溶液を１５０分間固定化
したトリプシンで処理することにより調製される。この
場合は固定化した形態におけるプロテアーゼの使用によ
り、活性化の後、該プロテアーゼの一層容易な分離が可
能である。ＥＰ−Ａ−０ ４１６ ８９０によれば、組換
えヒトプロテインＣ（ｒＨＰＣ）はガラス製ビーズ上で
固定化したトロンビンでの２時間の処理によって活性化
される。固定化したトロンビンからの活性化したｒＨＰ
Ｃの分離は、遠心によって果たされる。
【０００８】プロ酵素またはプロタンパク質の活性化の
ためにプロテアーゼを使用する場合、タンパク質加水分
解工程が活性のある酵素の段階で終了しないという問題
に遭遇する。むしろさらなるペプチド結合が、反応過程
でプロテアーゼによって加水分解され続け、また、活性
化したタンパク質はさらに再び不活性な状態である低分
子ペプチドに開裂される（キジール（Ｋisiel）および
ハナハン（Ｈanahan）、１９７３、Ｂiochim．Ｂiophy
s．Ａcta ３２９、２２１−２３２）。ゆえに、このよ
うな方法において、プロトロンビンをトロンビンにトリ
プシンにより活性化する場合、収率が低いことが知ら
れ、例えばわずか５０％にすぎない（キジールおよびハ
ナハン、１９７３、Ｂiochem．Ｂiophys．Ａcta ３２
９、２２１−２３２）。
【０００９】アルブミンまたはグリシンなどの安定化剤
を活性化反応に添加することにより、活性化したタンパ
ク質のさらなる分解を減少させるべく、このような方法
を改良する試みがなされている（ランダブル（Ｌandabu
ru）ら、１９６１、Ａm．Ｊ．Ｐhysiol．２０１、２９
８−３０２）。しかしながら、これらの方法の本質的な
欠点は、ゆっくりとした速度であるが、さらにタンパク
質断片への分解が起こり、大量の洗剤またはグリセロー
ルなどの添加剤を含有するタンパク質混合物が生成する
ことである。それゆえ、活性化した酵素を精製する複雑
な方法が必要である。タンパク質断片および洗剤または
カオトロピック物質はＥＰ−Ａ−０ ５６５５１１によ
り、相対的に複雑なクロマトグラフィー方法により除去
された。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明は、タ
ンパク質の高収率が達成でき、非常に高い非活性および
純度を有するタンパク質を単純なやり方で回収すること
を可能にするプロタンパク質からタンパク質を調製する
方法を提供することを目的としている。該方法は特定の
出発溶液に限られるものではなく、広範囲の出発溶液に
適用できるものである。
【００１１】
【発明を解決するための手段】本発明により、この目的
はプロタンパク質含有溶液を、プロテアーゼ、および該
プロタンパク質またはその機能的に不活性な分解産物よ
りも該タンパク質に対して一層高いアフィニティーを有
する固相担体に接触させ、該プロテアーゼにより該プロ
タンパク質をタンパク質加水分解的に開裂させ、生成す
るタンパク質を該固相担体上に吸着させて選択的に分離
することを特徴とする、プロテアーゼを用いたプロタン
パク質の制御されたタンパク質加水分解的開裂によるタ
ンパク質の調製および回収方法により達成される。固定
化タンパク質を使用するのが好ましい。本発明の方法
は、当該物質を、該溶液から容易に分離できるという利
点を提供する。
【００１２】該プロタンパク質含有溶液を、プロタンパ
ク質のタンパク質への開裂を起こすのに十分な接触時間
（しかしながら、機能的に不活性な該タンパク質の分解
産物が実質的に形成されない時間）プロテアーゼで処理
する。プロテアーゼがプロタンパク質に作用する時間
は、生成するタンパク質の品質にとって重要な要因であ
ること、およびあるパラメーターの下でプロテアーゼ／
プロタンパク質間の接触を所定時間維持することが所定
のタンパク質の調製に重要であることが示されている。
接触時間は、プロタンパク質からタンパク質への変換が
起こるが、タンパク質の望ましくない分解がもはやさら
には起こらず、該プロテアーゼの作用がそれ以前に妨害
されるように選択されなければならない。
【００１３】従って、最適な接触時間を決定する重要な
パラメーターは、使用するプロテアーゼ、プロタンパク
質のプロテアーゼに対する比率および反応温度である。
本発明の方法により、どんな当業者も、重要なパラメー
ターが先行技術から知られていない場合でも、反応が開
始される以前に重要なパラメーターを容易に決定し、最
適化できるであろう。特定のタンパク質の調製に最適の
接触時間は、別個の実験機構で接触時間を変化させるだ
けで各場合において決定できる。各場合において、得ら
れた生成物を分析し、引き続いて、所望のタンパク質の
最大量およびさらに分解した産物または非開裂のプロタ
ンパク質の最少量が得られる接触時間を所定の接触時間
として規定する。
【００１４】この所定の接触時間は、多くのシステムに
おいて、本来、システム（プロタンパク質／プロテアー
ゼ）ごとに異なるであろうが、しかし２４時間よりは短
いであろう。１秒〜２４時間、特には１秒から５時間、
より特には１秒〜３０分間がプロテアーゼの好ましい作
用時間であることがわかった。本発明によるさらなる手
段として、できるだけ正確にプロテアーゼ作用の接触時
間を維持し、該タンパク質のさらなる分解を防ぐため、
該プロテアーゼ処理の直後に、プロテアーゼにより生成
したタンパク質を、プロタンパク質またはその機能的に
不活性な分解産物よりも該タンパク質に対して一層高い
アフィニティーを有する担体に結合させる。従って、該
タンパク質は反応混合物におけるプロテアーゼによるさ
らなる作用から免れ、タンパク質のさらなる分解はもは
や起こることができなくなる。
【００１５】このことは、例えば、プロタンパク質また
はプロテアーゼ含有溶液に該タンパク質に対するアフィ
ニティー担体を提供することにより、または２つのクロ
マトグラフィーカラムを連続して配置し、第１のカラム
には（固定化した）プロテアーゼを入れ、第２のカラム
には該タンパク質に対する固相担体を入れ、第１のカラ
ムからの溶離液を第２のカラムの上部に直接導入にする
ことにより可能である。本発明の方法の好ましい態様に
より、もし該プロテアーゼ処理が定量的でなければ、溶
液中に残留する非開裂のプロタンパク質を再びリサイク
ルプロセスにおいて（固定化した）プロテアーゼに接触
させ、開裂させ、生成したタンパク質を選択的な担体に
結合させてよい。このことは、例えば、第２の選択的な
担体の出口を第１のプロテアーゼ結合カラムと接触さ
せ、結合しなかったプロタンパク質を再び該プロテアー
ゼの作用を受けやすくすることによって行う。これらの
段階は実質的に全部のプロタンパク質がタンパク質に開
裂するまで反復されてよい。
【００１６】プロテアーゼ処理工程および吸着工程を連
続的に行う好ましい態様に加えて、勿論この方法を不連
続的に行うこともでき、その場合、（固定化した）プロ
テアーゼおよび生成したタンパク質に対して高度に選択
的な担体は、一つの同一の容器に入れられ、また、２つ
の別個の固相担体を使用する場合には、これら２つの別
個の固相担体のうちの１つを選択的に除去してよい（例
えば、プロテアーゼまたはタンパク質を磁気表面または
除去可能な挿入物と結合させることにより）。本発明に
よる方法は勿論、プロテアーゼにより媒体されるプロタ
ンパク質からタンパク質へのすべての変換において使用
することができ、プロ酵素から酵素を調製するのに使用
するのが好ましい。
【００１７】プロタンパク質のタンパク質加水分解的開
裂のためには、多数のプロテアーゼが適当である（例え
ば、キモトリプシン、ジスパーゼ（dispase）、エンド
ペプチダーゼＡｒｇ−Ｃ、エンドプロテイナーゼＬｙｓ
−Ｃ、エンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃ、エンドプロテ
イナーゼＡｓｐ−Ｎ、Ｘａ因子、カリクレイン、パパイ
ン、ペプシン、プラスミン、プロナーゼ、プロテイナー
ゼＫ、スタフィロコアグラーゼ、ズブチリシンファミリ
ーのセリンプロテアーゼ、例えば、ケキシンタイプ（ke
xin-type）またはフリンタイプ（furin-type）プロテア
ーゼまたはズブチリシン、トロンビン、トリプシン（特
にヒト、ウシ、ブタ）、節足動物または微生物からのト
リプシンタイプのプロテアーゼ、例えばストレプロミセ
ス・グリセウス（Streptomyces griseus)のトリプシン
または毒へビからのセリンプロテアーゼ（ヘビ毒プロテ
アーゼ）、例えば、エキス・カリナタスヘビ毒（Ｅchis
carinatus Ｖenom）およびオキシウラナス・スクテラ
タスヘビ毒（Ｏxyuranus scutellatus Ｖenom）のプロ
トロンビンアクチベーター；ラッセル・バイパーヘビ毒
（Ｒussel's Ｖiper Ｖenom）からのＸ因子およびＶ因
子のアクチベーター、またはプロテインＣアクチベータ
ーアグキストロドンコントルトリックスヘビ毒（agkist
rodon contortrix Ｖenom）など）。トリプシン、キモ
トリプシン、カリクレイン、ジスパーゼ、エンドプロテ
イナーゼＧｌｕ−Ｃ、Ｌｙｓ−ＣまたはＡｓｐ−Ｎ、フ
リンまたはＸａ因子がプロテアーゼとして利用するのに
好ましい。勿論、組換えプロテアーゼも使用されてよ
い。
【００１８】上記のように、該プロテアーゼはプロタン
パク質また生成したタンパク質と可溶性形態にて反応す
ることのないよう、固相担体上で固定化されるのが好ま
しい。該プロテアーゼを固定化するには、特にセルロー
ス、セファロース、デキストラン、アガロース、アクリ
レートまたはシリケートが天然または合成担体として適
切である。
【００１９】日常的な方法により使用できる本発明の好
ましい態様により、固定化したプロテアーゼ（プロテア
ーゼゲル）をガラス製のカラムに詰め、ついでプロタン
パク質含有溶液をプロテアーゼゲルを通して濾過する。
流速は固定化したプロテアーゼとプロタンパク質の間の
所定の接触時間が維持されるよう選択する。
【００２０】この態様により、かような活性化したタン
パク質を脱着上清（溶離液）から選択的担体上に直接吸
着する。所望のタンパク質の高純度で高収率の回収のた
め、活性化されていないプロタンパク質は、特異的な担
体によって結合されてはならないし、可能であるなら
ば、選択的担体を含むカラムを自由に通過すべきであ
る。さらなる活性化のため、このプロタンパク質含有画
分を再び所定の接触時間、プロテアーゼゲルと接触させ
ると、さらにタンパク質が生成され、ついで選択的な担
体により該溶液から再び吸着される。プロテアーゼゲル
上での制御された連続的な活性化および溶離、ならびに
選択的な第２担体上での活性化したタンパク質の即座の
吸着により、該プロタンパク質は完全に、活性化したタ
ンパク質がさらにプロテアーゼにより開裂されることな
く活性化したタンパク質に変換される。活性化したタン
パク質は選択的な担体に蓄積し、引き続き担体から溶出
することができる。
【００２１】本発明の方法により調製できる特に好まし
いタンパク質は、タンパク質加水分解により血液凝固酵
素の不活性な前段階より得た機能的に活性な血液凝固酵
素である。本発明により、例えば、トロンビンはプロト
ロンビン（II因子）から、プロIＸ因子からIＸ因子、I
Ｘ因子からIＸａ因子、プロフォンビルブラント因子か
らフォンビルブラント因子、Ｘ因子からＸａ因子、プロ
テインＣから活性化プロテインＣ、ＸIII因子からＸIII
ａ因子、Ｖ因子からＶａ因子を調製することができる。
【００２２】本発明の方法において、出発溶液（プロタ
ンパク質含有溶液）は特定の調製した溶液に限られな
い。しかしながら、好ましいプロタンパク質含有溶液
は、特に純粋なタンパク質調製物とすることが可能であ
るため、精製された形態でのプロタンパク質を含む。し
かしながら、他のタンパク質と混合したプロタンパク質
を含有する溶液も、また、本発明の方法に適している。
なぜなら、その高い特異性のために、混入タンパク質は
本発明の方法の有意の妨害因子ではないからである。従
って、生物由来のプロタンパク質含有溶液、特に血漿ま
たは血漿または血漿画分由来の溶液を本発明の方法にお
いて使用するのが好ましい。
【００２３】本発明に記載のさらに好ましい態様では、
バイオテクノロジーにより調製されたプロタンパク質含
有溶液（特に組換え細胞培養から調製した培養上清）を
出発物質として使用する。マトリックスに固定化したヘ
パリン、固定化したベンズアミジン、固定化したヒルジ
ンまたは断片およびヒルジン誘導体、固定化した各種タ
ンパク質またはペプチド（特に固定化した特異的抗体）
は、調製すべきタンパク質または活性状態で、吸着され
るべきタンパク質の選択的固相担体として、特に適当で
ある。
【００２４】好ましいタンパク質は選択的にアフィニテ
ィー担体から溶離され、その結果、担体に僅かな量でも
（特異的または非特異的に）結合する可能性がある他の
タンパク質を分離しうる。夾雑する可能性のある感染物
質、特にヒトの病原ウイルスを不活性化するために、本
発明の方法の範囲内で従来公知のウイルス不活性化手段
をさらに併用してもよい。
【００２５】本発明の他の態様では、プロタンパク質か
らのタンパク質の調製、好ましくはプロ酵素からの活性
化した酵素の調製（特に活性化II因子、活性化Ｖ因子、
活性化ＶII因子、活性化ＶIII因子、IＸ因子、活性化I
Ｘ因子、活性化Ｘ因子、活性化ＸIII因子、フォンビル
ブラント因子、プロテインＣ）に本発明の方法を使用す
る。その高純度および高比活性のため、本発明の方法に
よって得られるタンパク質含有フラクションはを医薬製
剤の調製に適しており、その溶離タンパク質を出発材料
として常法により製剤化される。従って、さらに別の本
発明の態様は、本発明の方法により調製した高純度のタ
ンパク質、特に、IIａ因子、Ｖａ因子、ＶIIａ因子、Ｖ
IIIａ因子、IＸ因子、IＸａ因子、Ｘａ因子、ＸIIIａ因
子、活性化プロテインＣおよび／またはフォンビルブラ
ント因子、および１以上の生理学的に許容し得る担体お
よび／または他の医薬添加剤からなる医薬組成物を提供
する。
【００２６】得られるタンパク質のための選択的な固相
担体の選択は、本発明の方法において非常に重要であ
る。固定化したヒルジンおよびポリペプチドおよびそれ
らの断片は、特に好ましい担体であることがわかった
（特に、IIａ因子の調製に適する）。従って、本発明
は、固体表面に固定化されているヒルジンおよびポリペ
プチドおよびそれらのペプチド断片または誘導体にも関
する。該タンパク質のＣ末端領域からのヒルジン由来で
トロンビン結合部位を有するペプチドは、この結合にお
いて特に適当であることがわかった。本発明により、選
択されたペプチドはイオウまたはアミノ基を介して担体
に好適に結合する。
【００２７】本発明の特別な態様によれば、血漿からの
精製したヒトII因子（プロトロンビン、スタゴ・ダイア
グノスティカ（Ｓtago Ｄiagnostica）および精製した
組換えII因子（ファルクナー（Ｆalkner，Ｆ．Ｇ）ら、
Ｔhromb．Ｈaemost．（１９９２）、６８、１１９−１
２４）、II因子含有タンパク質混合物（ファルクナー
ら、Ｔhromb．Ｈaemost．（１９９２）、６８、１１９
−１２４）および精製したＸ因子（ベーリンガー・マン
ハイム）をプロタンパク質含有溶液として使用する。固
定化したトリプシンおよび固定化したＸａ因子の両方
が、その場合、プロテアーゼとして好ましく使用され
る。
【００２８】本発明のさらに別の態様では、本発明方法
により調製される固相担体に吸着されるタンパク質を含
むタンパク質複合体、特に、固相担体、好ましくはヒル
ジンまたは断片またはヒルジン誘導体を含む固相担体
に、吸着されたトロンビンを含有するトロンビン複合
体、を提供する。
【００２９】さらに本発明の別の態様は、本発明の方法
に適した、好ましくは一工程での使用に適した、プロテ
アーゼを含有する容器（Ｉ）および固相担体を含有する
容器（II）（ここで（Ｉ）および（II）は直結してい
る）からなる装置を提供する。容器（Ｉ）および（II）
が各々カラムであり、（Ｉ）の末端部が（II）の頭部に
連結し、そして任意に（II）の末端部が（Ｉ）の頭部に
連結しているものが好ましい。
【００３０】以下に、実施例および図面によって本発明
をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定さ
れない。図１は、実施例１に記載のトリプシンによる組
換えII因子（ｒＦII）のタンパク質加水分解産物の電気
泳動分析を示す。図２は、流速（ｍｌ／分）でのＵ／ｍ
ｌにおける生成したｒＦIIａの活性の依存性を示す。図
３〜１１は、実施例２〜１０に記載のＦIIのＦIIａへの
活性化の電気泳動の結果を示す。図１２は、実施例１１
に記載のＦＸのＦＸａへの活性化の電気泳動アッセイを
示す。
【００３１】
【実施例】
実施例： 活性の測定：IIａ因子（ＦIIａ）の活性の測定は、５０
ｍＭ トリス−ＨＣｌバッファー、（ｐＨ８.０、３００
ｍＭ ＮａＣｌ、０.５％ アルブミン、７.５ｍＭ ＥＤ
ＴＡ）中で３７℃で光度分析法により行った。ＦIIａ特
異的色素原基質ＡｃＯＨ−Ｈ−Ｄ−ＣＨＧ−Ａｌａ−Ａ
ｒｇ−ｐＮＡ（ペンタファーム（Ｐentapharm）から入
手）を０.２ｍＭの濃度で基質として使用した。酵素加
水分解により基質から放出されたパラニトロアニリン
（ｐＮＡ）を、４０５ｎｍで時間経過に従って光度測定
した。ＦIIａ濃度標準（イムノＡＧの）を使用すること
により、該サンプルの活性を基質の加水分解の速度から
算定した。
【００３２】Ｘａ因子（ＦＸａ）の活性の測定は、５０
ｍＭ トリス−ＨＣｌバッファー（ｐＨ７.８、０.５％
アルブミン）中で３７℃で光度分析にて行った。ＦＸａ
特異的色素原基質Ｂｚ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ（ピペリジル）
−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ（クロモジェニックス（Ｃhr
omogenix）から入手）を０.３ｍＭの濃度で基質として
使用した。酵素加水分解により基質から放出されたｐＮ
Ａを、４０５ｎｍで時間経過に従って光度測定した。Ｆ
Ｘａ濃度標準（イムノＡＧの）を使用することにより、
該サンプルの活性を基質の加水分解の速度から算定し
た。
【００３３】天然のII因子および組換えII因子（ＦII／
ｒＦII）およびＦIIａ／ｒＦIIａの各々のタンパク質の
測定は、２８０ｎｍでの吸着を各々１３.８および１７.
９の吸光係数（１％、１ｃｍ）を使用することにより吸
光度を測定して行った（ヒューマン・プロテイン・デー
タ（Ｈuman Ｐrotein Ｄata）、編、ヘバーリ（Ａ．Ｈa
eberli）による、ＶＣＨ ベインハイム（Ｗeinhei
m）、ニュヨーク、１９９２）。
【００３４】ＦＸ因子およびＦＸａ因子の各々のタンパ
ク質の測定は、２８０ｎｍでの吸着を１２.４の吸光係
数（１％、１ｃｍ）を使用することにより吸光度を測定
して行った（ヒューマン・プロテイン・データ、編、ヘ
バーリによる、ＶＣＨ ベインハイム、ニュヨーク、１
９９２）。タンパク質混合物のタンパク質濃度の測定
は、バイオラド（Ｂio Ｒad）からの市販されているシ
ステムを利用して、ブラッドフォード（Ｂradford）法
（Ｍ．Ｂradford）、Ａnal．Ｂiochem．７２（１９７
６）、２４８−２５４）により行った。
【００３５】実施例１ プロトロンビンのトロンビンへのプロテアーゼおよびプ
ロタンパク質間の接触時間に依存する固定化したトリプ
シンによる活性化 組換えプロトロンビン（組換えII因子、ｒＦII）４ｍｌ
を０.５ｍｇ／ｍｌ（活性Ｉ.Ｕ．ＦII／ｍｌ）の濃度
で、２０ｍＭ トリス−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８.０、
１５０ｍＭ ＮａＣｌ）中で、０.１ｍｌの固定化したト
リプシン−アガロースゲル（シグマ（Ｓigma）、ＵＳ
Ａ；８０ユニットのトリプシン／ｍｌ ゲル）と混合
し、室温で撹拌した。サンプルを１分および５分後に採
取し、組換えトロンビン（組換えII因子、ｒＦIIａ）の
内容物に関してアッセイした（データに関しては表１を
参照）。
【００３６】
【表１】
【００３７】得たサンプルをそのタンパク質組成につい
て変成電気泳動の方法でアッセイした（ラエミリ（Ｌae
mili）、Ｎature，Ｖol．２２７：６８０−６８５（１
９７０））。結果を図１に示し、レーンａには分子量マ
ーカー、レーンｂに１分のトリプシン消化およびレーン
ｃに５分のトリプシン消化を示している。
【００３８】これらの結果から、トリプシン消化により
ｒＦIIはｒＦIIａへと変換したことがわかる。４Ｉ.Ｕ.
／ｍｌの活性にてトリプシンをｒＦIIに作用させると、
僅か１分後に、５００Ｉ.Ｕ.／ｍｌの活性を有するｒＦ
IIａが形成した。しかし５分の作用時間では、ｒＦIIａ
の検出可能な活性は非常に低かった。電気泳動によれ
ば、僅か１分のｒＦIIへのトリプシン作用によって、７
００００〜２００００の分子量（Ｄａで）を有するタン
パク質混合物が生じ、そのタンパク質は大部分３１００
０〜３６０００の分子量を有するものであった。トロン
ビンは電気泳動で３３０００の分子質量を有することが
知られており、従って、形成した３１０００−３６００
０の分子質量を有するタンパク質はトロンビンであると
推定される。しかしながら、非活性化ｒＦII（分子量７
００００）の残留物もまたなお存在している。しかし、
ｒＦIIをトリプシンで５分間インキュベートすると、低
分子のペプチドだけが電気泳動で検出された。これはト
リプシンによるｒＦIIの消化が殆ど完全に行われ、ｒＦ
IIａの蓄積がないことを示唆している。
【００３９】実施例２ 固定化トリプシンによる組換えプロトロンビンのトロン
ビンへの活性化 ガラス製カラム（直径１ｃｍ）を０.１ｍｌのトリプシ
ン−アガロ−スゲルで充填した；これはゲルの高さ１.
２５ｍｍに対応する。ｒＦIIをこのトリプシン−アガロ
ースゲルを通して多様な流速で流出した。ｒＦIIを０.
５ｍｇ／ｍｌ（３.５ Ｉ.Ｕ．／ｍｌ）で、２０ｍＭ ト
リス−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８.０、１５０ｍＭ Ｎａ
Ｃｌ）中で分解した。ｒＦII溶液のゲルを通る流速は
０.０５ｍｌ／分から１.０ｍｌ／分の間で変化させた。
個々の溶離液についてトロンビン活性（図２参照）およ
び電気泳動によるタンパク質組成（図３参照）を調べ
た。該流速およびトリプシン−アガロースゲルカラムの
規模（容量、ゲル０.１ｍｌ；カラムの直径、１ｃ
ｍ）、層の厚さ、１.２５ｍｍ）に基づいて、ｒＦIIと
固定化トリプシンとの平均接触時間を、流速１.０ｍｌ
／分、０.６ｍｌ／分、０.４ｍｌ／分、０.２ｍｌ／
分、０.１ｍｌ／分、０.０５ｍｌ／分において各々、６
秒、１０秒、１５秒、３０秒、６０秒および１２０秒と
した。
【００４０】図３に示された電気泳動のレーンは以下の
サンプルと共にローディングした（loaded）： ａ：ｒＦII； ｂ：流速１ｍｌ／分； ｃ：流速０.６ｍｌ／分； ｄ：流速０.４ｍｌ／分； ｅ：流速０.２ｍｌ／分； ｆ：流速０.１ｍｌ／分； ｇ：流速０.０５ｍｌ／分； ｈ：分子量マーカー。 これらの結果から、トリプシン消化によるｒＦIIからの
ｒＦIIａの形成は流速すなわち、ｒＦIIと固定化トリプ
シンとの間の接触時間に非常に多大に依存するとことが
わかる。
【００４１】ｒＦIIａの最高の活性は０.４ｍｌ／分で
得られた。一層速い流速（０.６ｍｌ／分および１ｍｌ
／分）で、ｒＦIIａの収率は再び減少した。電気泳動は
これらの流速で、全部ではないが、ｒＦIIがトリプシン
によりｒＦIIａにタンパク質分解的に変換されたことを
示している。一層ゆっくりとした流速（０.０５ｍｌ／
分から０.２ｍｌ／分）で、ｒＦIIａの量は再び減少す
る。該電気泳動アッセイは僅かな量の活性のあるトロン
ビンはｒＦIIと固定化トリプシン間の接触時間が増加す
ると蓄積し、流速が減少すると不活性の低分子のペプチ
ドの形態となうことを示している。
【００４２】実施例３ 固定化トリプシンによる組換えプロトロンビンのトロン
ビンへの活性化およびヒルジン−チオールセファロ−ス
上でのアフィニティークロマトグラフィーによるトロン
ビンの回収。 ４０００抗トロンビンユニット（ＡＴＵ）のヒルジン
（ペンタファームから入手）を還元し、ついで仕様書に
従って、それらを活性化したチオール−セファロース
（ファルマシア（Ｐharmacia）１ｍｌに結合させた。ヒ
ルジン−チオールセファロース（ＨＴＳ）をガラス製カ
ラム（直径１ｃｍ）に充填した。固定化したトリプシン
−アガロースゲル０.１ｍｌを含有したガラス製カラム
（直径１ｃｍ）の出口は、ホース結合によりＨＴＳカラ
ムの入り口と直接連結させた。ＨＴＳカラムの出口は弁
およびポンプを介してＴＡＧカラムの入り口と連結さ
せ、それにより、液体循環が形成した。両カラムを２０
ｍＭ トリス−ＨＣｌバッファー、ｐＨ８.０で平衡化し
た。
【００４３】ｒＦIIを０.４ｍｇ／ｍｌ（活性：３.５
Ｉ.Ｕ．／ｍｌ）で、４ｍｌの２０ｍＭ トリス−ＨＣｌ
バッファー（ｐＨ８.０）中で分解し、ついで流速０.８
ｍｌ／分でＴＡＧカラムを通してくみ出した。そこか
ら、該液体の流れは直接、中断なしにＨＴＳカラムに導
かれ、ＨＴＳカラムの通過後、ポンプによりＴＡＧカラ
ムおよびＨＴＳカラムを通って２回目のくみ出しをされ
た。引き続き、ＨＴＳカラムをＴＡＧカラムから分離さ
せ、５０ｍＭ クエン酸塩バッファー（ｐＨ６.５）で洗
い流し（結合しなかった物質を除去するため）、ついで
５０ｍＭ クエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６.５、
５００ｍＭ ＮａＣｌ）（０.５Ｍ ＮａＣｌ溶離液）で
洗浄した。続いて、ＨＴＳカラムを５０ｍＭ クエン酸
塩バッファー（ｐＨ６.５、１.５Ｍ ＫＳＣＮ）（１.５
Ｍ ＫＳＣＮ溶離液）で溶離した。活性化で得た断片に
ついてトロンビン活性（Ｉ.Ｕ.／ｍｌ）、総活性（Ｉ.
Ｕ.）および比活性（トロンビン活性／ｍｇタンパク
質）をアッセイした。表２に実施例３からのｒＦII活性
の結果を列挙する。
【００４４】
【表２】
【００４５】図４は記載した活性化の電気泳動アッセイ
を示し、レーンａには出発物質（ｒＦII）レーンｂには
１.５Ｍ ＫＳＣＮ溶離液（ｒＦIIａ）およびレーンｃに
は分離している分子量マーカーを示している。該結果
は、実施例３に記載した方法によりｒＦIIが効率良くｒ
ＦIIａに変換したことを示す。形成したｒＦIIａはＨＴ
Ｓカラムに蓄積し、電気泳動的に純粋な形態で得られ、
分子量３３０００でＨＴＳカラムの特異的な溶離により
非常に高い比活性を有する。上記の方法により、１Ｉ.
Ｕ.のｒＦIIから１５０Ｉ.Ｕ.以上の純度のｒＦIIａが
得られた。これは実質的に定量的な変換に対応する。
【００４６】実施例４ 固定化トリプシンによる組換えプロトロンビンのトロン
ビンへの活性化およびチオール−ペプチド−チオールセ
ファロース上でのアフィニティークロマトグラフィーに
よるトロンビンの回収。 アミノ酸配列ＮＨ2−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ
−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−
Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇ
ｌｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−ＣＯＯＨを有する２０
ｍｇのペプチド（チオールペプチド、ＴＰ）を、仕様書
に従って、活性化したチオールセファロ−ス（ファルマ
シア（Ｐharmacia）１ｍｌに結合させた。チオール−ペ
プチド−チオ−ルセファロ−ス（ＴＰＴＳ）をガラス製
カラム（直径１ｃｍ）に充填した。固定化したトリプシ
ン−アガロースゲル（ＴＡＧ）０.１ｍｌを含有したガ
ラス製カラム（直径１ｃｍ）の出口は、ホース結合によ
りＴＰＴＳカラムの入り口と直接連結させた。ＴＰＴＳ
カラムの出口は弁およびポンプを介してＴＡＧカラムの
入り口と連結させ、それにより、液体循環が形成した。
両カラムを２０ｍＭトリス−ＨＣｌバッファー（ｐＨ
８.０）で平衡化した。
【００４７】ｒＦIIを０.４ｍｇ／ｍｌ（活性：３.５
Ｉ.Ｕ．／ｍｌ）で、４ｍｌの２０ｍＭ トリス−ＨＣｌ
バッファー（ｐＨ８.０）中で分解し、ついで流速０.８
ｍｌ／分でＴＡＧカラムを通してくみ出した。そこか
ら、該液体の流れは直接、中断なしにＴＰＴＳカラムに
導かれ、ＴＰＴＳカラムの通過後、弁によりＴＡＧカラ
ムおよびＴＰＴＳカラムを通って２回目のくみ出しをさ
れた。引き続き、ＴＰＴＳカラムをＴＡＧカラムから分
離させ、５０ｍＭ クエン酸塩バッファー（ｐＨ６.５）
で洗い流し（結合しなかった物質を除去するため）、つ
いで５０ｍＭ クエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６.
５、５００ｍＭ ＮａＣｌ）（０.５ＭＮａＣｌ溶離液）
で洗浄した。続いて、ＴＰＴＳカラムを５０ｍＭ クエ
ン酸塩バッファー（ｐＨ６.５、１.５Ｍ ＫＳＣＮ）
（１.５Ｍ ＫＳＣＮ溶離液）で溶離した。活性化で得た
断片についてトロンビン活性（Ｉ．Ｕ．／ｍｌ）、総活
性（Ｉ．Ｕ．）および比活性（トロンビン活性／ｍｇタ
ンパク質）をアッセイした。表３に得られたｒＦII活性
化の結果を列挙する。
【００４８】
【表３】
【００４９】図５は固定化トリプシンによる組換えｒＦ
IIのｒＦIIａへの活性化およびチオール−ペプチド−チ
オールセファロ−ス上でのアフィニティークロマトグラ
フィーによるトロンビンの回収の電気泳動アッセイを示
し、レーンａには分子量マーカー、レ−ンｂには出発物
質（ｒＦII）およびレーンｃにはアプライした１.５Ｍ
ＫＳＣＮ溶離液（ｒＦIIａ）を示している。該結果は、
記載した方法によりｒＦIIが効率良くｒＦIIａに変換し
たことを示す。形成したｒＦIIａはＴＰＴＳカラムに蓄
積し、電気泳動的に純粋な形態で得られ、分子量３３０
００で、ＴＰＴＳカラムの特異的な溶離により非常に高
い比活性を有する。上記方法により、１Ｉ.Ｕ.のｒＦII
から１５０Ｉ.Ｕ.以上の純度のｒＦIIａが得られた。
【００５０】実施例５ 固定化トリプシンによる組換えプロトロンビンのトロン
ビンへの活性化およびアミノ−ペプチド−ＣＨセファロ
ース上でのアフィニティークロマトグラフィーによるト
ロンビンの回収。 アミノ酸配列ＮＨ2−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ
−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−
Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇ
ｌｕ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−ＣＯＯＨを有する２０
ｍｇのペプチド（アミノペプチド、ＡＰ）を、仕様書に
従って、活性化したＣＨセファロ−ス（ファルマシア）
１ｍｌに結合させた。アミン−ペプチド−ＣＨセファロ
−ス（ＡＰＣＨＳ）をガラス製カラム（直径１ｃｍ）に
充填した。固定化したトリプシン−アガロ−スゲル（Ｔ
ＡＧ）０.１ｍｌを含有したガラス製カラム（直径１ｃ
ｍ）の出口は、ホース結合によりＡＰＣＨＳカラムの入
り口と直接連結させた。ＡＰＣＨＳカラムの出口は弁お
よびポンプを介してＴＡＧカラムの入り口と連結させ、
それにより、液体循環が形成した。両カラムを２０ｍＭ
トリス−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８.０）で平衡化し
た。
【００５１】ｒＦIIを０.４ｍｇ／ｍｌ（活性：３.５
Ｉ.Ｕ．／ｍｌ）で、４ｍｌの２０ｍＭ トリス−ＨＣｌ
バッファー（ｐＨ８.０）中で分解し、ついで流速０.８
ｍｌ／分でＴＡＧカラムを通してくみ出した。そこか
ら、該液体の流れは直接、中断なしにＡＰＣＨＳカラム
に導かれ、ＡＰＴＳカラムの通過後、ＴＡＧカラムおよ
びＡＰＣＨＳカラムを通ってポンプにより２回目のくみ
出しをされた。引き続き、ＡＰＣＨＳカラムをＴＡＧカ
ラムから分離させ、５０ｍＭ クエン酸塩バッファー
（ｐＨ６.５）で洗い流し（結合しなかった物質を除去
するため）、ついで５０ｍＭ クエン酸ナトリウムバッ
ファー（ｐＨ６.５、５００ｍＭ ＮａＣｌ）（０.５Ｍ
ＮａＣｌ溶離液）で洗浄した。続いて、ＡＰＣＨＳカ
ラムを５０ｍＭ クエン酸バッファー（ｐＨ６.５、１.
５Ｍ ＫＳＣＮ）（１.５Ｍ ＫＳＣＮ溶離液）で溶離し
た。活性化で得た断片についてトロンビン活性（Ｉ.Ｕ.
／ｍｌ）、総活性（Ｉ.Ｕ.）および比活性（トロンビン
活性／ｍｇタンパク質）をアッセイした。表４に得られ
たｒＦII活性化の結果を列挙する。
【００５２】
【表４】
【００５３】図６は固定化トリプシンによるｒＦIIのｒ
ＦIIａへの活性化およびアミノ−ペプチド−ＣＨセファ
ロ−ス上でのアフィニティークロマトグラフィーによる
トロンビンの回収の電気泳動分析を示し、レーンａには
分子量マーカー、レ−ンｂには出発物質（ｒＦII）およ
びレーンｃには分離した１.５Ｍ ＫＳＣＮ溶離液（ｒＦ
IIａ）を示している。該結果は、実施例５に記載した方
法によりｒＦIIが効率良くｒＦIIａに変換されたことを
示す。形成したｒＦIIａはＡＰＣＨＳカラムに蓄積し、
電気泳動的に純粋な形態で得られ、分子量３３０００
で、ＡＰＣＨＳカラムの特異的な溶離により非常に高い
比活性を有する。上記の方法により、１Ｉ.Ｕ.のｒＦII
から１５０Ｉ.Ｕ.以上の純度のｒＦIIａが得られた。
【００５４】実施例６ 固定化トリプシンによる組換えプロトロンビンのトロン
ビンへの活性化およびベンズアミジンセファロース上で
のアフィニティークロマトグラフィーによるトロンビン
の回収。 ２ｍｌのベンズアミジンセファロース（ＢＡＳ、ファル
マシア）をガラス製カラム（直径１ｃｍ）に充填した。
固定化したトリプシン−アガロースゲル（ＴＡＧ）０.
１ｍｌを含有したガラス製カラム（直径１ｃｍ）の出口
は、ホース結合によりＢＡＳカラムの入り口と直接連結
させた。ＢＡＳカラムの出口は弁およびポンプを介して
ＴＡＧカラムの入り口と連結させ、それにより、液体循
環が形成した。両カラムを２０ｍＭ トリス−ＨＣｌバ
ッファー（ｐＨ８.０）で平衡化した。
【００５５】ｒＦIIを０.４ｍｇ／ｍｌ（活性：３.５
Ｉ.Ｕ．／ｍｌ）で、４ｍｌの２０ｍＭ トリス−ＨＣｌ
バッファー（ｐＨ８.０）中で分解し、ついで流速０.８
ｍｌ／分でＴＡＧカラムを通してくみ出した。そこか
ら、該液体の流れは直接、中断なしにＢＡＳカラムに導
かれ、ＢＡＳカラムの通過後、ＴＡＧカラムおよびＢＡ
Ｓカラムを通ってポンプにより２回目のくみ出しをされ
た。引き続き、ＢＡＳカラムをＴＡＧカラムから分離さ
せ、５０ｍＭ クエン酸塩バッファー（ｐＨ６.５）で洗
い流し（結合しなかった物質を除去するため）、ついで
５０ｍＭ クエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６.５、
１５０ｍＭ ＮａＣｌ）（０.１５Ｍ ＮａＣｌ溶離液）
で洗浄した。続いて、ＢＡＳカラムを５０ｍＭ クエン
酸塩バッファー（ｐＨ６.５、０.１Ｍ ベンズアミジ
ン）（０.１Ｍ ベンズアミジン溶離液）で溶離した。活
性化で得た断片についてトロンビン活性（Ｉ.Ｕ.／ｍ
ｌ）、総活性（Ｉ.Ｕ.）および比活性（トロンビン活性
／ｍｇタンパク質）をアッセイした。表５に得られたｒ
ＦII活性化の結果を列挙する。
【００５６】
【表５】
【００５７】図７は固定化トリプシンによるｒＦIIのｒ
ＦIIａへの活性化およびベンズアミジンセファロース上
でのアフィニティークロマトグラフィーによるトロンビ
ンの回収の電気泳動アッセイを示し、レーンａには出発
物質（ｒＦII）、レ−ンｂには０.１Ｍ ベンズアミジン
溶離液（ｒＦIIａ）およびレーンｃにはアプライした分
子量マーカーを示している。該結果は、実施例６に記載
した方法によりｒＦIIが効率良くｒＦIIａに変換された
ことを示す。形成したｒＦIIａはＢＡＳカラムに蓄積
し、電気泳動的に純粋な形態で得られ、分子量３３００
０で、ＢＡＳカラムの特異的な溶離により非常に高い比
活性を有する。上記の方法により、１Ｉ.Ｕ.のｒＦIIか
ら１５０Ｉ.Ｕ.以上の純度のｒＦIIａが得られた。
【００５８】実施例７ 固定化トリプシンによる組換えプロトロンビンのトロン
ビンへの活性化およびヘパリンセファロース上でのアフ
ィニティークロマトグラフィーによるトロンビンの回
収。 ２ｍｌのヘパリン−セファロースファスト・フロウ（Ｆ
ast Ｆlow）（ＨＳ、ファルマシア）をガラス製カラム
（直径１ｃｍ）に充填した。固定化したトリプシン−ア
ガロ−スゲル（ＴＡＧ）０.１ｍｌを含有したガラス製
カラム（直径１ｃｍ）の出口は、ホース結合によりＨＳ
カラムの入り口と直接連結させた。ＢＡＳカラムの出口
は弁およびポンプを介してＴＡＧカラムの入り口と連結
させ、それにより、液体循環が形成した。両カラムを２
０ｍＭ トリス−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８.０）で平衡
化し、ｒＦIIを０.４ｍｇ／ｍｌ（活性：３.５ Ｉ.Ｕ．
／ｍｌ）で、４ｍｌの２０ｍＭ トリス−ＨＣｌバッフ
ァー（ｐＨ８.０）中で分解し、ついで流速０.８ｍｌ／
分でＴＡＧカラムを通してくみ出した。そこから、該液
体の流れは直接、中断なしにＨＳカラムに導かれ、ＨＳ
カラムの通過後、ＴＡＧカラムおよびＨＳカラムを通っ
てポンプにより２回目のくみ出しをされた。引き続き、
ＨＳカラムをＴＡＧカラムから分離させ、５０ｍＭ ク
エン酸塩バッファー（ｐＨ６.５）で洗い流し（結合し
なかった物質を除去するため）、ついで５０ｍＭ クエ
ン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６.５、１５０ｍＭ Ｎ
ａＣｌ）（０.１５Ｍ ＮａＣｌ溶離液）で洗浄した。
続いて、ＨＳカラムを５０ｍＭ クエン酸塩バッファー
（ｐＨ６.５、０.５Ｍ ＮａＣｌ）（０.５Ｍ ＮａＣｌ
溶離液）で溶離した。活性化で得た断片についてトロン
ビン活性（Ｉ.Ｕ.／ｍｌ）、総活性（Ｉ.Ｕ.）および比
活性（トロンビン活性／ｍｇタンパク質）をアッセイし
た。表６に実施例７からのｒＦII活性化の結果を列挙す
る。
【００５９】
【表６】
【００６０】図８は固定化トリプシンによるｒＦIIのｒ
ＦIIａへの活性化およびヘパリンセファロース上でのア
フィニティークロマトグラフィーによるトロンビンの回
収の電気泳動分析を示し、レーンａには出発物質（ｒＦ
II）、レ−ンｂには０.５ＭＮａＣｌ溶離液（ｒＦII
ａ）およびレーンｃにはアプライした分子量マーカーを
示している。該結果は、実施例７に記載した方法により
ｒＦIIが効率良くｒＦIIａに変換されたことを示す。形
成したｒＦIIａはＨＳカラムに蓄積し、電気泳動的に純
粋な形態で得られ、分子量３３０００および３５０００
で、ＨＳカラムの特異的な溶離により非常に高い比活性
を有する。上記の方法により、１Ｉ.Ｕ.のｒＦIIから１
５０Ｉ.Ｕ.以上の純度のｒＦIIａが得られた。
【００６１】実施例８ 固定化トリプシンによるタンパク質混合物中における組
換えプロトロンビンのトロンビンへの活性化およびアミ
ノ−ペプチド−ＣＨセファロース上でのアフィニティー
クロマトグラフィーによるトロンビンの回収。 アミノ−ペプチド−ＣＨセファロースカラム（ＡＰＣＨ
Ｓカラム）を実施例５に記載したように調製した。固定
化したトリプシン−アガロースゲル（ＴＡＧ）０.１ｍ
ｌを含有したガラス製カラム（直径１ｃｍ）の出口は、
ホース結合によりＡＰＣＨＳカラムの入り口と直接連結
させた。ＡＰＣＨＳカラムの出口は弁およびポンプを介
してＴＡＧカラムの入り口と連結させ、それにより、液
体循環が形成した。両カラムを２０ｍＭ トリス−ＨＣ
ｌバッファー（ｐＨ８.０）で平衡化した。
【００６２】２０ｍＭ トリス−ＨＣｌバッファー（ｐ
Ｈ８.０）中に、ｒＦII（活性 ３.５ Ｉ.Ｕ．／ｍｌ）
を含む４ｍｌのタンパク質混合物（タンパク質濃度１.
７ｍｇ／ｍｌ）を流速０.８ｍｌ／分でＴＡＧカラムを
通してくみ出した。そこから、該液体の流れは直接、中
断なしにＡＰＣＨＳカラムに導かれ、ＡＰＴＳカラムの
通過後、ＴＡＧカラムおよびＡＰＣＨＳカラムを通って
ポンプにより２回目のくみ出しをされた。引き続き、Ａ
ＰＣＨＳカラムをＴＡＧカラムから分離させ、５０ｍＭ
クエン酸塩バッファー（ｐＨ６.５）で洗い流し（結合
しなかった物質を除去するため）、ついで５０ｍＭ ク
エン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６.５、５００ｍＭ
ＮａＣｌ）（０.５Ｍ ＮａＣｌ溶離液）で洗浄した。
続いて、ＡＰＣＨＳカラムを５０ｍＭ クエン酸塩バッ
ファー（ｐＨ６.５、１.５Ｍ ＫＳＣＮ）（１.５Ｍ Ｋ
ＳＣＮ溶離液）で溶離した。活性化で得た断片について
トロンビン活性（Ｉ.Ｕ.／ｍｌ）、総活性（Ｉ.Ｕ.）お
よび比活性（トロンビン活性／ｍｇタンパク質）をアッ
セイした。表７に実施例８からのｒＦII活性化の結果を
列挙する。
【００６３】
【表７】
【００６４】図９は固定化トリプシンによるタンパク質
混合物中のｒＦIIのｒＦIIａへの活性化およびアミノ−
ペプチド−ＣＨセファロ−ス上でのアフィニティークロ
マトグラフィーによるトロンビンの回収の電気泳動分析
を示し、レーンａには出発物質（タンパク質混合物）、
レ−ンｂには１.５Ｍ ＫＳＣＮ溶離液（ｒＦIIａ）およ
びレーンｃにはアプライした分子量マーカーを示してい
る。該結果は、実施例８に記載した方法により、タンパ
ク質混合物中でｒＦIIが効率良くｒＦIIａに変換された
ことを示す。形成したｒＦIIａはＡＰＣＨＳカラムに蓄
積し、電気泳動的に純粋な形態で得られ、分子量３３０
００でＡＰＣＨＳカラムの特異的な溶離により非常に高
い比活性を有する。上記の方法により、１Ｉ.Ｕ.のｒＦ
IIから１５０Ｉ.Ｕ.以上の純度のｒＦIIａが得られた。
【００６５】実施例９ 固定化トリプシンによるヒトプロトロンビンのトロンビ
ンへの活性化およびベンズアミジンセファロース上での
アフィニティークロマトグラフィーによるトロンビンの
回収。 ２ｍｌのベンズアミジンセファロース（ＢＡＳ、ファル
マシア）をガラス製カラム（直径１ｃｍ）に充填した。
固定化したトリプシン−アガロースゲル（ＴＡＧ）０.
１ｍｌを含有したガラス製カラム（直径１ｃｍ）の出口
は、ホース結合によりＢＡＳカラムの入り口と直接連結
させた。ＢＡＳカラムの出口は弁およびポンプを介して
ＴＡＧカラムの入り口と連結させ、それにより、液体循
環が形成した。両カラムを２０ｍＭ トリス−ＨＣｌバ
ッファー（ｐＨ８.０）で平衡化した。
【００６６】ヒトII因子（ｈＦII）を０.５ｍｇ／ｍｌ
（活性：４ Ｉ.Ｕ．／ｍｌ）で、４ｍｌの２０ｍＭ ト
リス−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８.０）中で分解し、つ
いで流速０.８ｍｌ／分でＴＡＧカラムを通してくみ出
した。そこから、該液体の流れは直接、中断なしにＢＡ
Ｓカラムに導かれ、ＢＡＳカラムの通過後、ＴＡＧカラ
ムおよびＢＡＳカラムを通ってポンプにより２回目のく
み出しをされた。引き続き、ＢＡＳカラムをＴＡＧカラ
ムから分離させ、５０ｍＭ クエン酸塩バッファー（ｐ
Ｈ６.５）で洗い流し（結合しなかった物質を除去する
ため）、ついで５０ｍＭ クエン酸ナトリウムバッファ
ー（ｐＨ６.５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）（０.１５Ｍ
ＮａＣｌ溶離液）で洗浄した。続いて、ＢＡＳカラムを
５０ｍＭ クエン酸塩バッファー（ｐＨ６.５、０.１Ｍ
ベンズアミジン）（０.１Ｍ ベンズアミジン溶離液）で
溶離した。活性化で得た断片についてトロンビン活性
（Ｉ.Ｕ.／ｍｌ）、総活性（Ｉ.Ｕ.）および比活性（ト
ロンビン活性／ｍｇタンパク質）をアッセイした。表８
に実施例９からのｈＦII活性化の結果を列挙する。
【００６７】
【表８】
【００６８】図１０は固定化トリプシンによるｈＦIIの
ＦIIａへの活性化およびベンズアミジンセファロース上
でのアフィニティークロマトグラフィーによるトロンビ
ンの回収の電気泳動分析を示し、レーンａには分子量マ
ーカー、、レ−ンｂには出発物質（ｈＦII）およびレー
ンｃにはアプライした０.１Ｍ ベンズアミジン溶離液
（ＦIIａ）を示している。該結果は、実施例９に記載し
た方法によりｈＦIIが効率良くＦIIａに変換されたこと
を示す。形成したＦIIａはＢＡＳカラムに蓄積し、電気
泳動的に純粋な形態で得られ、分子量３３０００で、Ｂ
ＡＳカラムの特異的な溶離により非常に高い比活性を有
する。上記方法により、１Ｉ.Ｕ.のｈＦIIから１５０
Ｉ.Ｕ.以上の純度のＦIIａが得られた。
【００６９】実施例１０ 固定化Ｘａ因子による組換えプロトロンビンのトロンビ
ンへの活性化およびアミノ−ペプチド−ＣＨセファロー
ス上でのアフィニティークロマトグラフィーによるトロ
ンビンの回収。 アミノ−ペプチド−ＣＨセファロースカラム（ＡＰＣＨ
Ｓカラム）を実施例５に記載したように調製した。２０
ｍｇのプロテアーゼＸａ因子（ベーリンガー・マンハイ
ム）を、仕様書に従って、ＣＮＢｒ−活性化したＣＨセ
ファロース（ファルマシア）１ｍｌに結合させ、ガラス
製カラム（直径１ｃｍ）（ＸａＳカラム）に充填した。
ＸａＳカラムの出口は、ホース結合によりＡＰＣＨＳカ
ラムの入り口と直接連結させた。ＡＰＣＨＳカラムの出
口は弁およびポンプを介してＸａＳカラムの入り口と連
結させ、それにより、液体循環が形成した。両カラムを
２０ｍＭ トリス−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８.０）で平
衡化した。
【００７０】ｒＦIIを０.４ｍｇ／ｍｌ（活性：３.５
Ｉ.Ｕ．／ｍｌ）で、４ｍｌの２０ｍＭ トリス−ＨＣｌ
バッファー（ｐＨ８.０）中で分解し、ついで流速０.１
ｍｌ／分でＸａＳカラムを通してくみ出した。そこか
ら、該液体の流れは直接、中断なしにＡＰＣＨＳカラム
に導かれ、ＡＰＴＳカラムの通過後、ＸａＳカラムおよ
びＡＰＣＨＳカラムを通ってポンプにより２回目のくみ
出しをされた。この手続をさらに３回反復した。引き続
き、ＡＰＣＨＳカラムをＸａＳカラムから分離させ、５
０ｍＭ クエン酸塩バッファー（ｐＨ６.５）で洗い流し
（結合しなかった物質を除去するため）、ついで５０ｍ
Ｍ クエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６.５、５００
ｍＭ ＮａＣｌ）（０.５Ｍ ＮａＣｌ溶離液）で洗浄し
た。続いて、ＡＰＣＨＳカラムを５０ｍＭ クエン酸塩
バッファー（ｐＨ６.５、１.５ＭＫＳＣＮ）（１.５Ｍ
ＫＳＣＮ溶離液）で溶離した。活性化で得た断片につい
てトロンビン活性（Ｉ.Ｕ.／ｍｌ）、総活性（Ｉ.Ｕ.）
および比活性（トロンビン活性／ｍｇタンパク質）をア
ッセイした。表９に実施例１０からのｒＦII活性化の結
果を要約する。
【００７１】
【表９】
【００７２】図１１は固定化Ｘａ因子によるｒＦIIのｒ
ＦIIａへの活性化およびアミノ−ペプチド−ＣＨセファ
ロ−ス上でのアフィニティークロマトグラフィーによる
トロンビンの回収の電気泳動分析を示し、レーンａには
分子量マーカー、レ−ンｂには出発物質（ｒＦII）およ
びレーンｃにはアプライした１.５Ｍ ＫＳＣＮ溶離液
（ｒＦIIａ）を示している。該結果は、実施例１０に記
載した方法により、ｒＦIIがプロテアーゼ因子Ｘａによ
って効率良くｒＦIIａに変換されたことを示す。形成し
たＦIIａはＡＰＣＨＳカラムに蓄積し、電気泳動的に純
粋な形態で得られ、分子量３３０００で、ＡＰＣＨＳカ
ラムの特異的な溶離により非常に高い比活性を有する。
上記の方法により、１Ｉ.Ｕ.のｒＦIIから１５０Ｉ.Ｕ.
以上の純度のｒＦIIａが得られた。
【００７３】実施例１１ 固定化トリプシンによるＸ因子のＸａ因子への活性化お
よびベンズアミジンセファロース上でのアフィニティー
クロマトグラフィーによるＸａ因子の回収。 ２ｍｌのベンズアミジンセファロース（ＢＡＳ、ファル
マシア）をガラス製カラム（直径１ｃｍ）に充填した。
固定化したトリプシン−アガロースゲル（ＴＡＧ）０.
１ｍｌを含有したガラス製カラム（直径１ｃｍ）の出口
は、ホース結合によりＢＡＳカラムの入り口と直接連結
させた。ＢＡＳカラムの出口は、弁およびポンプを介し
てＴＡＧカラムの入り口と連結させ、それにより、液体
循環が形成した。両カラムを２０ｍＭ トリス−ＨＣｌ
バッファー（ｐＨ８.０）で平衡化した。
【００７４】２ｍｌの因子Ｘ（ＦＸ、ベーリンガー・マ
ンハイム製）の溶液を０.５ｍｇ／ｍｌ（活性：３.５
Ｉ.Ｕ．／ｍｌ）で、２０ｍＭ トリス−ＨＣｌバッファ
ー（ｐＨ８.０）中で分解し、ついで流速０.５ｍｌ／分
でＴＡＧカラムを通してくみ出した。そこから、該液体
の流れは直接、中断なしにＢＡＳカラムに導かれ、ＢＡ
Ｓカラムの通過後、ＴＡＧカラムおよびＢＡＳカラムを
通ってポンプにより２回目のくみ出しをされた。引き続
き、ＢＡＳカラムをＴＡＧカラムから分離させ、５０ｍ
Ｍ クエン酸塩バッファー（ｐＨ６.５）で洗い流し（結
合しなかった物質を除去するため）、ついで５０ｍＭ
クエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６.５、１５０ｍ
Ｍ ＮａＣｌ）（０.１５Ｍ ＮａＣｌ溶離液）で洗浄し
た。続いて、ＢＡＳカラムを５０ｍＭ クエン酸塩バッ
ファー（ｐＨ６.５、０.１Ｍ ベンズアミジン）（０.１
Ｍ ベンズアミジン溶離液）で溶離した。活性化で得た
断片についてトロンビン活性（Ｉ.Ｕ.／ｍｌ）、総活性
（Ｉ.Ｕ.）および比活性（トロンビン活性／ｍｇタンパ
ク質）をアッセイした。表１０に実施例１１からの因子
Ｘの活性化の結果を列挙する。
【００７５】
【表１０】
【００７６】図１２は固定化トリプシンによるＦＸのＦ
Ｘａへの活性化、およびベンズアミジンセファロース上
でのアフィニティークロマトグラフィーによるＦＸａの
回収の電気泳動アッセイを示し、レーンａには出発物質
（ＦＸ）、レ−ンｂには０.１Ｍ ベンズアミジン溶離液
（ＦＸａ）およびレーンｃにはアプライした分子量マー
カーを示している。該結果は、実施例１１に記載した方
法によりＦＸが効率良くＦＸａに変換されたことを示
す。形成したＦＸａはＢＡＳカラムに蓄積し、電気泳動
的に純粋な形態で得られ、分子量３２０００で、ＢＡＳ
カラムの特異的な溶離により非常に高い比活性を有す
る。
【図面の簡単な説明】
【図１】 トリプシンによる組換えII因子（ｒＦII）の
タンパク質加水分解的産物の電気泳動分析の写真。
【図２】 流速（ｍｌ／分）でのＵ／ｍｌにおける形成
したｒＦIIａの活性の依存性を示したグラフである。
【図３】 固定化トリプシンによる組換えプロトロンビ
ンのトロンビンへの活性化の電気泳動図。
【図４】 固定化トリプシンによる組換えプロトロンビ
ンのトロンビンへの活性化およびヒルジン−チオールセ
ファロース上でのアフィニティークロマトグラフィーに
よる回収の電気泳動図。
【図５】 固定化トリプシンによるｒＦIIのＦIIａへの
活性化およびチオール−ペプチド−チオールセファロー
ス上でのアフィニティークロマトグラフィーによる電気
泳動図。
【図６】 固定化トリプシンによるｒＦIIのＦIIａへの
活性化およびアミノ−ペプチド−ＣＨセファロース上で
のアフィニティークロマトグラフィーによる電気泳動
図。
【図７】 固定化トリプシンによるｒＦIIのＦIIａへの
活性化およびベンズアミジンセファロース上でのアフィ
ニティークロマトグラフィーによる電気泳動図。
【図８】 固定化トリプシンによるｒＦIIのＦIIａへの
活性化およびヘパリンセファロース上でのアフィニティ
ークロマトグラフィーによる電気泳動図。
【図９】 固定化トリプシンによるタンパク質混合物中
のｒＦIIのＦIIａへの活性化およびアミノ−ペプチド−
ＣＨセファロース上でのアフィニティークロマトグラフ
ィーによる電気泳動図。
【図１０】 固定化トリプシンによるｈＦIIのＦIIａへ
の活性化およびベンズアミジンセファロース上でのアフ
ィニティークロマトグラフィーによる電気泳動図。
【図１１】 固定化Ｘａ因子によるｒＦIIのＦIIａへの
活性化およびアミノ−ペプチド−ＣＨセファロース上で
のアフィニティークロマトグラフィーによる電気泳動
図。
【図１２】 固定化トリプシンによるＦＸのＦＸａへの
活性化およびベンズアミジンセファロース上でのアフィ
ニティークロマトグラフィーによる電気泳動図。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/00 Ａ６１Ｋ 37/64 (72)発明者 フリードリッヒ・ドルナー オーストリア、アー−1230ヴィーン、ペー ターリニガッセ17番 (72)発明者 ヨハン・アイブル オーストリア、アー−1180ヴィーン、グス タフ−ツェルマークガッセ２番

Claims (37)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 プロタンパク質含有溶液を、プロテアー
    ゼ、および該プロタンパク質またはその機能的に不活性
    な分解産物よりも、該タンパク質に対して一層高いアフ
    ィニティーを有する固相担体に接触させ、該プロタンパ
    ク質をタンパク質加水分解的に開裂させ、生成する該タ
    ンパク質を該固相担体上に吸着させて選択的に分離する
    ことを特徴とする、１つの工程でプロタンパク質からタ
    ンパク質を調製および回収する方法。
  2. 【請求項２】 該プロテアーゼが固定化されている請求
    項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】 該プロタンパク質含有溶液を、プロタン
    パク質がタンパク質に開裂するのに十分であり、該タン
    パク質の機能的に不活性な分解産物が実質的に形成され
    ない所定の接触時間、プロテアーゼで処理する請求項１
    または２に記載の方法。
  4. 【請求項４】 プロテアーゼとの接触およびタンパク質
    の分離後、任意に溶液に残留している非開裂のプロタン
    パク質を再び該プロテアーゼと接触させ、生成したタン
    パク質を固相担体に吸着させ、これらの工程を、任意に
    実質的に全てのプロタンパク質がタンパク質に開裂され
    るまで繰り返す請求項１、２または３に記載の方法。
  5. 【請求項５】 該プロテアーゼ処理工程および吸着工程
    を連続して行う請求項１、２、３または４に記載の方
    法。
  6. 【請求項６】 該プロタンパク質がプロ酵素であり、該
    タンパク質が酵素である請求項１、２、３、４または５
    のいずれかに記載の方法。
  7. 【請求項７】 プロタンパク質とプロテアーゼの接触時
    間が長くても２４時間である請求項１、２、３、４、５
    または６のいずれかに記載の方法。
  8. 【請求項８】 プロタンパク質とプロテアーゼの接触時
    間が１秒〜２４時間、好ましくは１秒から５時間、最も
    好ましくは１秒〜３０分間である請求項１、２、３、
    ４、５、６または７のいずれかに記載の方法。
  9. 【請求項９】 該プロテアーゼがトリプシン、キモトリ
    プシン、Ｘａ因子、ヘビ毒プロテアーゼ、トロンビン、
    プラスミン、ズブチリシンファミリーのセリンプロテア
    ーゼ、特に、ケキシンタイプまたはフリンタイププロテ
    アーゼより選択される請求項１、２、３、４、５、６、
    ７または８のいずれかに記載の方法。
  10. 【請求項１０】 該プロタンパク質がII因子、Ｖ因子、
    ＶII因子、ＶIII因子、IＸプロ因子、IＸ因子、Ｘ因
    子、ＸIII因子、プロテインＣまたはフォンビルブラン
    ト因子などの不活性な前段階の血液凝固因子であり、該
    タンパク質が機能的に活性な凝固タンパク質である請求
    項１、２、３、４、５、６、７、８または９のいずれか
    に記載の方法。
  11. 【請求項１１】 プロタンパク質含有溶液として、精製
    された形態のプロタンパク質を含有する溶液を使用する
    請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０
    のいずれかに記載の方法。
  12. 【請求項１２】 該タンパク質とともに他のタンパク質
    を含有する溶液をプロタンパク質含有溶液として使用す
    る請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０ま
    たは１１のいずれかに記載の方法。
  13. 【請求項１３】 生物学的起源の溶液をプロタンパク質
    含有溶液として使用する請求項１、２、３、４、５、
    ６、７、８、９、１０または１２のいずれかに記載の方
    法。
  14. 【請求項１４】 血漿、血漿画分またはそれ由来の溶液
    をプロタンパク質含有溶液として使用する請求項１、
    ２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２ま
    たは１３のいずれかに記載の方法。
  15. 【請求項１５】 バイオテクノロジーの方法により生成
    した溶液をプロタンパク質含有溶液として使用する請求
    項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１ま
    たは１２のいずれかに記載の方法。
  16. 【請求項１６】 組換え細胞培養から調製した培養上清
    をプロタンパク質含有溶液として使用することを特徴と
    する請求項１５に記載の方法。
  17. 【請求項１７】 固相担体が、固定化ヒルジン、ヒルジ
    ン由来のポリペプチドまたは誘導体、固定化ヘパリン、
    固定化ベンズアミジン、固定化タンパク質またはペプチ
    ド、または固定化抗体より選択される請求項１、２、
    ３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１
    ３、１４、１５または１６のいずれかに記載の方法。
  18. 【請求項１８】 該固相担体上に吸着した該タンパク質
    を選択的に該担体から溶離する請求項１、２、３、４、
    ５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、
    １５、１６または１７のいずれかに記載の方法。
  19. 【請求項１９】 プロ酵素から活性化酵素を調製するた
    めの請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１
    ０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７または
    １８のいずれかに記載の方法。
  20. 【請求項２０】 活性化II因子を調製するための請求項
    １、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１
    ２、１３、１４、１５、１６、１７または１８のいずれ
    かに記載の方法。
  21. 【請求項２１】 活性化Ｖ因子を調製するための請求項
    １、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１
    ２、１３、１４、１５、１６、１７または１８のいずれ
    かに記載の方法。
  22. 【請求項２２】 活性化ＶII因子を調製するための請求
    項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、
    １２、１３、１４、１５、１６、１７または１８のいず
    れかに記載の方法。
  23. 【請求項２３】 活性化ＶIII因子を調製するための請
    求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１
    １、１２、１３、１４、１５、１６、１７または１８の
    いずれかに記載の方法。
  24. 【請求項２４】 IＸ因子または活性化IＸ因子を調製す
    るための請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、
    １０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７また
    は１８のいずれかに記載の方法。
  25. 【請求項２５】 活性化Ｘ因子を調製するための請求項
    １、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１
    ２、１３、１４、１５、１６、１７または１８のいずれ
    かに記載の方法。
  26. 【請求項２６】 活性化ＸIII因子を調製するための請
    求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１
    １、１２、１３、１４、１５、１６、１７または１８の
    いずれかに記載の方法。
  27. 【請求項２７】 活性化プロテインＣを調製するための
    請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１
    １、１２、１３、１４、１５、１６、１７または１８の
    いずれかに記載の方法。
  28. 【請求項２８】 活性化フォンビルブラント因子を調製
    するための請求項１、２、３、４、５、６、７、８、
    ９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７
    または１８のいずれかに記載の方法。
  29. 【請求項２９】 請求項１、２、３、４、５、６、７、
    ８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、
    １７または１８のいずれかに記載の方法により調製され
    るタンパク質、特に、高度に純粋な活性化II因子、高度
    に純粋な活性化Ｖ因子、高度に純粋な活性化ＶII因子、
    高度に純粋な活性化ＶIII因子、高度に純粋なIＸ因子、
    高度に純粋な活性化IＸ因子、高度に純粋な活性化Ｘ因
    子、高度に純粋な活性化ＸIII因子、高度に純粋な活性
    化プロテインＣおよび／または高度に純粋なフォンビル
    ブラント因子ならびに１つまたはいくつかの生理学的に
    許容し得る担体を含有する医薬組成物。
  30. 【請求項３０】 固相担体に結合してなる固定化ヒルジ
    ンまたはヒルジン由来の断片または誘導体。
  31. 【請求項３１】 固相担体が請求項３０に記載の固定化
    ヒルジンまたは固定化ヒルジン断片またはヒルジン誘導
    体である請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、
    １０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７また
    は１８のいずれかに記載の方法。
  32. 【請求項３２】 請求項１、２、３、４、５、６、７、
    ８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６ま
    たは１７に記載の方法で調製した、固相担体に吸着した
    タンパク質を含有するタンパク質複合体。
  33. 【請求項３３】 請求項１、２、３、４、５、６、７、
    ８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６ま
    たは１７に記載の方法で調製した、固相担体に吸着した
    トロンビンを含有するトロンビン複合体。
  34. 【請求項３４】 固相担体が、ヒルジンまたはヒルジン
    由来の断片または誘導体を含有する請求項３３に記載の
    トロンビン複合体。
  35. 【請求項３５】 プロテアーゼを含有する容器（Ｉ）お
    よび固相担体を含有する容器（II）が直結してなる、請
    求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１
    １、１２、１３、１４、１５、１６または１７のいずれ
    かに記載の一工程方法を行うための装置。
  36. 【請求項３６】 容器（Ｉ）および（II）が各々カラム
    であり、容器（Ｉ）の末端部が容器（II）の上部に連結
    しており、さらに任意に容器（II）の末端部が容器
    （Ｉ）の上部に連結している請求項３５に記載の装置。
  37. 【請求項３７】 請求項１、２、３、４、５、６、７、
    ８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６ま
    たは１７に記載の方法に使用する請求項３５または３６
    のいずれかに記載の装置。
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