JP3026812B2 - 融合タンパク質またはポリペプチドの生産 - Google Patents

融合タンパク質またはポリペプチドの生産

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JP3026812B2 JP1024142A JP2414289A JP3026812B2 JP 3026812 B2 JP3026812 B2 JP 3026812B2 JP 1024142 A JP1024142 A JP 1024142A JP 2414289 A JP2414289 A JP 2414289A JP 3026812 B2 JP3026812 B2 JP 3026812B2
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    • C07K2319/705—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a protein-A fusion

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は組み換えDNA技術による高純度のタンパク質
およびポリペプチド生成物の製法、そしてより詳しくは
所望のタンパク質またはポリペプチドを包含しかつ容易
に精製され得るものである新規な遺伝子産物の製造への
かかる技術の利用、および場合により所望のタンパク質
またはポリペプチドへのかかる遺伝子産物の変換法にも
関する。本発明はまたかかる新規な遺伝子産物にも関す
る。より詳細には、本発明は血清アルブミンに選択的に
結合しうる融合タンパク質またはポリペプチドの製法、
微生物中で複製しうる組み換えベクター、かかる組み換
えベクターを宿す宿主細菌、および本発明方法により生
産された融合タンパク質またはポリペプチドに関する。
遺伝子融合なる操作は、２個またはそれ以上の遺伝子
のコード配列を一緒にスプライスして結合遺伝子を形成
させて、この結合された遺伝子が適当な宿主細菌中で発
現された場合にそれぞれの遺伝子によりコーデイングさ
れた別々のタンパク質またはポリペプチドが１つの分子
に融合された融合生成物を産生するものとなす操作であ
る。
本発明は組み換えDNA技術に基づく方法により、所望
のタンパク質およびポリペプチドを極度に純粋に取得で
きるタンパク質の固定および精製を促進する手段を提供
するものである。本発明によるこの目的はストレプトコ
ツカス（Streptococcus）株G148からのタンパク質Ｇの
特異的なアルブミン結合性質を下記に説明する遺伝子融
合技術と組み合わせて利用することにより達成された。
本発明によれば、遺伝子融合を用いて、アルブミン結
合性部分をコードする第１のDNA配列を所望のタンパク
質またはポリペプチドをコードする第２のDNA配列と結
合させて前記所望のアルブミン結合性部分を有する融合
生成物を発現しうる機能的な遺伝子となす。そのアルブ
ミン結合能力ゆえに生成されたタンパク質またはポリペ
プチドは適当な担体に固定されたヒト血清アルブミン
（HSA）型の血清アルブミンを用いる慣用のアフイニテ
イクロマトグラフイーにより高い効率で容易に単離され
うる。担体に結合された融合生成物は例えば所望のタン
パク質が酵素である場合はそのまま使用でき、またはこ
のものはアルブミン結合性部分を含めた全体としてもし
くは適当な試薬で開裂させることによりその所望のタン
パク質またはポリペプチド部分のみを担体から遊離させ
ることができる。
従つて本発明は基本的には所望のタンパク質またはポ
リペプチドをコードするDNA配列がアルブミン結合性部
分をコードするDNA配列に操作的に連結されていて、従
つてこれらDNA配列が一緒になつて前記所望のタンパク
質またはポリペプチドおよび前記アルブミン結合性部分
からなるアルブミン結合性融合生成物をコードするもの
となつているDNA配列を含有する組み換えDNAクローニン
グベクターを提供するものである。宿主細菌を形質転換
して前記融合生成物を産生させうるためには（ベクター
がバクテリアフアージである場合も含めて）、そのベク
ターは結合された融合生成物をコーデイングするDNA配
列に対するレプリコンおよびプロモーターをも慣用の様
式で含有する。以下にさらに説明される目的のために
は、前記結合されたDNA配列がそれぞれ所望のタンパク
質およびアルブミン結合性部分をコードするDNA配列の
間に適当な開裂部位をコードする配列を包含していて従
つて融合分子のアルブミン結合性部分が前記したように
開裂されうるようにすることができる。
前記結合されたDNA配列を発現させるのに適合しうる
宿主細菌を前記ベクターで形質転換しそしてこの宿主を
栄養培地中で培養することにより、相当するアルブミン
結合性融合タンパク質またはポリペプチドが生産されよ
う。例えばエンシエリヒア（Esherichia）、バチル（Ba
cillus）およびタフイロコツカス（Staphylococcus）の
菌株のような細菌宿主が本発明による目的にとつて好ま
しいが、酵母および他のカビ、培養植物細胞その他のよ
うな他の宿主の使用ももちろん本発明の範囲に包含され
る。宿主の形質転換はよく知られた方法により行うこと
ができる。
宿主細菌の培養により産生された融合分子のタンパク
質Ｇ部分がアルブミン結合能力を有するゆえに、その融
合分子は適当な担体に固定されたHSAにより細胞培養物
から非常に効率的に単離されうる。もし融合生成物が周
囲の培地中に分泌される場合は担体への結合は培地から
直接行うことができる。他方融合生成物が細胞内に留ま
る場合はかかる結合を行うに先立ち細胞を破壊しなけれ
ばならない。細胞壁の破壊は慣用の方法、例えば高圧、
超音波処理、ホモジナイゼーシヨン、ガラスビーズとの
振盪等により行われうる。生成物がグラム陰性細菌にお
けるように２つの細胞膜の間の細胞周辺腔内にはまり込
んでいる場合は、生成物を浮遊培地中に放出させるのに
浸透シヨツク法が用いられうる。HSAを用いる融合生成
物の単離に先立ち培養細胞または増殖培地を任意の他の
処理にかけることももちろん本発明の範囲内に包含され
る。
慣用の方法においては固定化は適当な培地中でスラリ
ー化したHSA結合担体を用いてバツチ式で、または活性
化された担体のカラムを用いて行われうる。本発明の目
的にとつて充分にHSAを結合できる任意の慣用の担体物
質が使用されうる。HSAをかかる担体物質に結合または
固定させる方法はよく知られており、そしてここで詳細
に記載する必要はないと考える。マイクロタイターウエ
ルの表面に被覆の手段としてHSAを吸着させることもで
きる。
HSA−担体に結合された融合タンパク質またはポリペ
プチドの放出または脱着は慣用の方法、例えば酢酸緩衝
液（pH2.7）になるようなpHの低下、高濃度の塩または
カオトロピツクイオンでの処理、または融合タンパク質
またはポリペプチドをHSA担体吸着剤からはずすために
過剰の可溶性HSAを用いる競合的溶離により行われう
る。もちろん脱着法は、個々の所望のタンパク質または
ポリペプチドに関しその所望の活性がその方法により失
われるかまたはかなり低下することのないように選択さ
れるべきである。得られる溶出液から、融合タンパク質
またはポリペプチドは容易に単離でき、そして所望の場
合はさらにゲル過、イオン交換等のような精製工程に
かけることができる。
得られる精製されたタンパク質またはポリペプチドは
以下に記載されるようにそれ自体で価値ある生成物であ
り、それゆえ本発明はさらに、適合しうる宿主を前記ベ
クターで形質転換し、該宿主を栄養培地中で培養し、融
合タンパク質またはポリペプチドをHSA支持担体へのそ
の選択的結合により該宿主培養物から単離し、そして場
合により融合タンパク質またはポリペプチドを担体から
放出させる工程からなる、高度に精製された融合タンパ
ク質またはポリペプチド生成物の製法、ならびにそれに
より得られかかる単離された融合生成物をも提供するも
のである。
かかる融合生成物の価値ある使用の一つはアルブミン
結合性部分に融合されたタンパク質が酵素である場合に
得られる。かかる場合融合生成物のHSA結合活性がHSAを
結合されている担体物質への酵素の固定に利用される。
かかる酵素リアクター系によりいくつかの利点が得られ
る。酵素はHSA結合を介して担体に結合されるので、す
べての酵素分子が正確に同じ方法で担体に結合され、従
つてその最大活性が得られよう。酵素活性が許容できな
い低レベルまで減少した場合は、かかる系はpH変化例え
ばpHを低下させることにより担体から酵素を慣用的に脱
着させそして次に活性酵素を含有する融合生成物をこれ
に結合させることにより容易に再生されうる。問題の融
合酵素をHSA結合担体に結合または吸着させることは適
当に予め処理された細胞または細胞培地から直接に行う
ことができるし、または他のHSA結合吸着剤に吸着およ
び脱着させたのち精製された状態で行うこともできる。
かかる融合タンパク質のもう一つの価値ある用途はEL
ISAのような診断テストに使用される抗原の固定化、特
に該抗原に対する特異的な抗体の存在および／または量
を測定するためのアツセイに用いられる。本発明を用い
ることにより、アルブミン結合性部分に融合されたペプ
チドまたはタンパク質からなる抗原がHSAで被覆された
表面に固定される。次にその抗原部分に対する特異的な
抗体の量が標識されたタンパク質Ａまたは抗−抗体が関
与する知られた方法により分析されうる。ペプチドまた
はタンパク質抗原をかかる融合タンパク質を利用して固
定化することによりいくつかの利点が得られる。すべて
の分子が同じ方法で結合され、そして固定化操作に先立
ち何ら融合タンパク質を精製する必要がないことで、何
故ならアルブミン結合性部分を有しないタンパク質は洗
去されうるからである。さらに、この固定化は何ら化学
的結合を必要とせずそして抗原−固形支持体系は単にpH
を低下させて結合された融合タンパク質を表面被覆HSA
から脱着させるのみで再生されうる。
かかる融合タンパク質のさらにもう一つの価値ある用
途は、アルブミン結合性部分に融合されたペプチドまた
はタンパク質リガンドを固定させる本発明を用いてHSA
マトリツクスをより特異的なアフイニテイマトリツクス
に変換することである。かかる方法においては、HSAカ
ラムはヒトまたは動物血清からの抗原に対する特異的な
抗体を精製するのに使用されうる。このことは特異的な
抗原に対するモノクローナル抗体またはポリクローナル
抗体を濃縮または排除する必要がある場合に有利であ
る。後者は生物学的に重要なタンパク質に対する自己抗
体を有する患者の体外療法に重要でありうる。
融合されたタンパク質またはポリペプチドのアルブミ
ン結合性タンパク質部分はある条件下で開裂させること
ができ、それにより純粋な所望のタンパク質またはポリ
ペプチドが得られる。それゆえ本発明のもう一つの目的
は、適合しうる宿主を前記ベクターで形質転換し、該宿
主を栄養培地中で培養し、該融合タンパク質またはポリ
ペプチドをHSA支持担体へのその選択的結合により細胞
培養物から単離し、そして担体に結合された融合生成物
から直接にかまたはこれを担体から脱着させたのち該融
合タンパク質またはポリペプチドのアルブミン結合性部
分から所望のタンパク質またはポリペプチドを開裂させ
る工程からなる、高純度の所望のタンパク質またはポリ
ペプチドの製法を提供することである。
融合タンパク質またはポリペプチドを開裂させうるに
必要な条件は、もちろん、適当な手段により認識され開
裂されうる独特の開裂部位をそのものが有していること
である。かかる開裂部位は化学的または酵素的手段によ
り認識されうるものでかつ生産される融合生成物のそれ
ぞれ所望のタンパク質またはポリペプチドとアルブミン
結合性部分との間に位置するものである独特のアミノ酸
配列であることができる。かかる特異的なアミノ酸配列
は所望のタンパク質またはポリペプチド内に存在しては
ならず、そして好ましくは融合生成物の結合性部分中に
存在してはならない。酵素性試薬の例には、プロテアー
ゼ例えば第Xa因子（これはある場合にはアミノ酸配列NH
2−Ile−Glu−Gly−Arg−COOHを認識する）；キモシン
（レンニン）（これはMet−Phe結合を開裂させる）；カ
リクレインＢ（これはＸ−Phe−Arg−Ｙ中のArgのカル
ボキシル側を開裂させる）；エンテロキナーゼ（これは
配列Ｘ−（Asp）ｎ−Lys−Ｙ（式中ｎ＝２〜４である）
を認識しそしてLysのカルボキシル側でこれを開裂させ
る）；トロンビン（これは特定のアルギニル結合で開裂
させる）があげられる。化学的試薬の例には、臭化シア
ン（CNBr）（これはMetのあとを開裂させる）；ヒドロ
キシルアミン（これはAsn−Gly結合を開裂させる）；蟻
酸（これは高濃度（〜70％）でAsp−Proを特異的に開裂
させる）があげられる。
前記のことから判るとおり、本発明の決定的に重要な
部分とは、本発明の融合タンパク質またはポリペプチド
をコードする結合された遺伝子を含有しておりそして宿
主細胞を形質転換させてそれを発現させ融合生成物を産
生させうるものである組み換えDNA構造物またはベクタ
ーを提供することである。本発明はいかにしてそれが得
られたかに関係なく例えば当業上よく知られた種々の制
限酵素による切断、連結、形質転換および選別技術を用
いて得られたすべてのかかるベクターならびに任意の適
当なベクター物質および宿主細菌を包含するものであ
る。従つて所望のタンパク質またはポリペプチドをコー
ドするDNA配列が適当なベクター中に挿入されそして次
にアルブミン結合性部分をコーデイングするDNA配列が
挿入されるかまたはその逆であることもできる。あるい
は２種のDNA配列がベクターに同時に導入されてもよ
い。それぞれのDNA配列の一部分をベクター中に挿入す
ることもできる。さらに２種のDNA配列はアルブミン結
合性をコードする配列または所望のタンパク質もしくは
ポリペプチドをコードする配列のいずれかを、結合され
た遺伝子の５′−末端すなわち開始部分に配置すること
ができる。適当な制限部位の具備を含め正確な読み枠を
保持してかかる挿入および組み合せを達成するための特
殊な技術それ自体は当業上よく知られている。
本発明はまた前記組み換えDNA配列を包含し、そして
その３′−末端で生産遺伝子がDNAレベルで融合された
組み換えDNA分子にも関する。この配置によりかかる分
子は融合タンパク質を適当な宿主中で発現する能力を得
る。かかる生産遺伝子はソマトメジンのそれであること
ができる。例をあげれば、生長ホルモンまたは因子例え
ばhGH（ヒト生長ホルモン）、IGF−Ｉ、IGF−II、NGF
（神経生長因子）、EGF（表皮生長因子）およびPDGF
（血小板由来性因子）である。生産遺伝子はまたインタ
ーフエロン、インターロイキン−２、インシユリン、ニ
ユーロペプチド、胃腸ペプチド、組織プラスミノーゲン
活性化因子（tPA）およびそれらの活性誘導体等をコー
ドするものであることもできる。生産遺伝子はまた酵素
またはその一部分の構造遺伝子をコードするものである
こともできる。
本発明はさらに、前記定義された組み換えDNA分子に
より生物学的系中において発現された融合タンパク質を
開裂させる方法をも提供することである。
終りに、本発明は前記組み換えDNA分子を含有するプ
ラスミドベクターにも関する。本発明はまた前記定義さ
れた組み換えDNA分子を宿している細菌細胞にも関す
る。この分子は細菌細胞の染色体中に挿入されうるが、
プラスミドベクター中に包含されることもできる。
宿主細胞は例えばグラム陰性細菌でありそして特に大
腸菌（E.cili）があげられる。
本発明を添付図面を参照して後記非限定的実施例によ
りさらに説明する。
第１図はストレプトコツカスタンパク質Ｇ遺伝子
（Ｇ）およびこの遺伝子のフラグメントを含有する構成
物の概略図である。
第２図はプラスミドpEG（第１図Ｂ）を含有する大腸
菌細胞の増殖培地をゲル電気泳動により分析した結果を
示す写真である。レーン１は清澄化した増殖培地からの
総タンパク質、レーン２はIgG−アフイニテイにより精
製したタンパク質そしてレーン３はHSA−アフイニテイ
により精製したタンパク質を示す。
第３図は２種のサブクローンされたフラグメントから
発現されたフラグメントのIgG−結合およびHSA−結合を
ゲル電気泳動により分析した結果を示す写真である。
異なる構成分を含有する大腸菌細胞からの増殖培地を
HSA−またはIgG−セフアロース上で精製した。溶離され
たタンパク質を凍結乾燥しそしてSDS−PAGEで分析し
た。
A:pB1B2（第１図Ｄ）を含有する細胞。レーン１はIgG−
アフイニテイにより精製したタンパク質（注:IgGのＬ−
鎖およびＨ−鎖）、レーン２はHSA−アフイニテイによ
り精製したタンパク質を示す。
B:pC2C3（第１図Ａ）を含有する細胞。レーン１はIgG−
アフイニテイにより精製したタンパク質を、そしてレー
ン２はHSA−アフイニテイにより精製したタンパク質を
示す。
第４図はプラスミドpZZB1B2（第１図Ｅ）を含有する
細胞の増殖培地からHSA−アフイニテイにより精製され
た物質をゲル電気泳動により分析した結果を示す写真で
ある。
第５図は大腸菌株pASP（レーン１）およびpNP−１
（レーン２）の浸透シヨツクにより得られ、それぞれイ
オン交換クロマトグラフイーおよびHSA−アフイニテイ
クロマトグラフイーにより精製された物質をゲル電気泳
動により分析した結果を示す写真である。
第６図は還元条件下での13％ポリアクリルアミドゲル
上における融合タンパク質のSDS/PAGE分析を示す写真で
ある。レーン１はPB1B2M1を宿す大腸菌細胞の総ペリプ
ラズム内容物、レーン２はHSA−セフアロースでアフイ
ニテイ精製されたBB−M1タンパク質、レーン３はpEZZM1
を宿す大腸菌細胞の総ペリプラズム内容物、レーン４は
IgG−セフアロースでアフイニテイ精製されたZZ−M1タ
ンパク質を示す。数字はおよそその分子量（kDa）を示
す。
第７図はHSAで被覆されたマイクロタイターウエルに
結合された融合タンパク質BB−M1のELISAにおける力価
を示す（□印）。マイクロタイタープレートをCFA中の
融合タンパク質ZZ−M1で免疫したウサギからの抗血清を
1:2000に希釈したものとインキユベーシヨンした。値は
BB−M1のタンパク質Ｇ由来部分を含有する血清の反応性
（OD、0.022〜0.088）を差し引くことにより減少され
た。
第８図はCFA中（■印）またはアジユバントなし（●
印）の融合タンパク質ZZ−M1で免疫したウサギからの抗
血清の融合タンパク質BB−M1との反応性をELISAにおい
て示す。値はBB−M1のタンパク質Ｇ由来部分を含有する
血清の反応性（OD、0.011〜0.158）を差し引くことによ
り低下された。吸光度＞0.1＝陽性。
第９図はCFA中のZZ−M1で免疫したウサギからの抗血
清のBB−M1でのアフイニテイ精製結果を示す。適用され
たIgGフラクシヨン（●印）、フロースルーフラクシヨ
ン（▲印）そして0.2Mグリシン緩衝液で溶離したフラク
シヨン（■印）のBB−M1との反応性をELISAにより示
す。フラクシヨンは精製工程により惹起される希釈に関
し、ほぼ等しい容量に調整された。
第10図は二発現系の基本的概念を示すダイヤグラムで
ある。ZZはSpAに由来するIgG結合性領域、BBはストレプ
トコツカスタンパク質Ｇからの血清アルブミン結合性ド
メイン、Ｐは免疫原性ペプチド、そしてHSAはヒト血清
アルブミンを示す。
本発明の詳しい態様を以下に述べる。
出発物質 E.coli RRI del M15〔Langey他、Proc.Natl.Acad.
Sci.,USA,72、1254〜1257（1975）〕が実施例で用いら
れた。用いられたクローニングベクターはpUC8〔Viera
およびMessing,Gene、19、259〜268（1982）〕、pEZZ8
〔Ｌwenadler他、Gene58、87〜97（1987）〕、pEMBL8
−〔Dente他、Nucl.Acids Res.11、1645〜53、（198
3）〕、pASP〔Abrahmsｎ他、EMBO J.4、3901〜3906
（1985）〕、pCH39〔HoffmanおよびWright,Proc.Natl.A
cad,Sci.,USA,82、5107〜5111（1985）〕およびM13mp18
（Pharmacia社から市販、Uppsala、スウエーデン）であ
る。すべての菌株およびベクターはスウエーデン国、ス
トツクホルムのRoyal Institute of Technology、生化
学部門で入手できる。プラスミドベクターpNP−１は西
ドイツ微生物収集機関（DSM）に寄託番号DSM−4386の下
1988年２月３日に寄託されている。
緩衝液および培地 PBST:8.0g NaCl、0.2g KH2PO4、2.9g Na2HPO4×12H2O、
0.2g KCL、0.2ml Tween 20および0.2g NaN3に蒸留水を
加えて１となした（pH7.4）。
TSB:30gのトリプシン大豆ブロスを１となしそしてオ
ートクレーブした。
TST:TRIS（25mM）およびこれにHClを加えてpH7.4とな
し、200mM NaCl、0.05％Tween 20を加えたもの。
ルーチン法 分子生物学にルーチンに用いられる方法は記載されな
い（例えば市販の制限酵素、DNA連結、Bal31エキソヌク
レアーゼ、SIヌクレアーゼおよびクレノウポリメラー
ゼ、大腸菌の形質転換およびプラスミドDNAの単離）。
NossalおよびHeppelのJ.of Biol.Chem.,244巻（No.1
3）、3055〜3062頁（1966）に記載される浸透シヨツク
法とは、細胞を0.1mM EDTAを含有する20％スクロースに
露出させ、次に冷５・10-4M MgCl2中に分散させるとペ
リプラズム内容物が放出されるものである。
PHASTシステム（Pharmacia社、Uppsala、スウエーデ
ン）を用いるSDS−PAGEによりタンパク質フラクシヨン
を分析するために、試料を負荷緩衝液〔2.5％SDS、５％
ジチオトレイトール（DTT）および0.01％ブロムフエノ
ールブルー〕中に溶解させた。５％SDS含有グラジエン
ト（８〜25％）ポリアクリルアミドゲルを10mAで30分間
操作しそして次にクマシーブルーで染色した。
実施例 １ ストレプトコツカスタンパク質Ｇのアルブミン結合性フ
ラグメントのクローニングおよび発現 Olsson他（Eur.J.of Biochem.168:319−324（198
7））により記載されるストレプトコツカス株G148から
のタンパク質Ｇをコードする遺伝子の概略を第１図Ｃに
示す。遺伝子の一部分ずつをコードする異なる遺伝子フ
ラグメントが第１図Ａ、ＢおよびＤに概略が示される３
種の構成物を組み立てるのに用いられた。これら構成物
の作製を以下に記載する。
タンパク質Ｇからの３種のIgG結合性領域のコーデイ
ング配列は遺伝子のTha I−BstN Iフラグメント内のヌ
クレオチド1.021と1.852の間に含有される（Olsson他、
（1987）Eur.J.Biochem.168:319−324）。このTha I部
位を合成オリゴヌクレオチドBamH I−リンカー（５′−
CGGATCCG−３′）を連結することによりBamH I部位に変
換しそしてBstN I切断面は付着末端を充填するためにク
レノウポリメラーゼを用いてブラント末端となした。次
にこのフラグメントをpTZ18R（Pharmacia,Sweden）のマ
ルチリンカー中にクローンした。このベクターをはじめ
にXba Iで開裂させ次にクレノウポリメラーゼ処理して
付着末端を充填し続いてBamH Iで消化した。生成するプ
ラスミドはpUG26と呼ばれる。β−ガラクトシダーゼ遺
伝子中への読み進みを阻止するために翻訳停止を付与す
る合成オリゴヌクレオチドをPst I部位中にクローンし
た。タンパク質Ｇ遺伝子は２個のPst I部位を含有する
ので、下記概要で操作が行われた。プラスミドpTZ18Rを
Pst Iで開裂させ、T4ポリメラーゼで処理してブラント
末端を生成させそして普遍翻訳リンカーUTL（Pharmaci
a,スウエーデン）に連結させた。この構成物をEcoR Iお
よびSal Iで消化し、そしてpUG26から単離された860塩
基対EcoR I−Sal Iフラグメントに連結させてプラスミ
ドpUG27を生成させた。pUG27からのBamH I−Hind IIIフ
ラグメントをpEZZ8に挿入してタンパク質Ａに基づく２
個の合成IgG結合性ドメインへの読み枠内融合を有する
プラスミドpEZZGを生成させた。この２個のZZフラグメ
ントをAcc Iでの開裂および再連結により除去した。得
られたプラスミドを分析するとC1およびC2領域の間で相
同組み換えが起つたことが判つた。これによりタンパク
質Ｇ遺伝子のIgG結合性ドメインC1およびC3に読み枠内
で融合されたタンパク質Ａシグナルペプチドを有するプ
ラスミドpEGが得られた。この先端が欠けたレセプター
を第１図Ｂに略示する。
プラスミドpUG27をHind IIIおよび部分的にCla Iで消
化して領域C2およびC3をコードする遺伝子フラグメント
をアガロースゲルで精製した。このフラグメントをプラ
スミドpUC8中Acc IとHind IIIとの間にサブクローンし
た。
pUC8のmp8マルチリンカー中のAcc I部位に近接したEc
oR I部位、およびHind III部位を用いることにより、同
じフラグメントを切り出した。これをpEGの予めEcoR I
およびHind IIIで消化し精製したベクターフラグメント
中に挿入して第１図Ａに示されるベクターpC2C3を生成
させた。
AB領域をサブクローンするには、プラスミドpSPG2（G
uss他、1986）をEcoR Iで消化し、次にクレノウポリメ
ラーゼで処理して付着末端を充填した。合成Sal I−リ
ンカー（GGTCGACC,Pharmacia,Sweden）を連結により付
加した。Sal IおよびPst Iで消化すると640bpフラグメ
ントが放出され、これをアガロースゲルから単離しそし
て正の選択ベクターpEMBL8−中の同じ部位間に挿入し
た。このプラスミドから両方の挿入部位に近接した。Ec
oR I部位およびHind III部位を用いてタンパク質Ｇ遺伝
子フラグメントを切り出し、そして前記のようにしてpE
Gのベクターフラグメント中に挿入した。得られるベク
ターpB1B2（第１図Ｄ）はSPAの制御配列が先にあり、領
域Ｅの最後の３残基から領域C1の初めの24残基までのタ
ンパク質Ｇの一部分をコードする。
アフイニテイクロマトグラフイーには、IgG−セフア
ロースはPharmacia（Uppsala,Sweden）から得られそし
てHSA−セフアロースは精製HSA（Kabi−Vitrum,Stockho
lm,Sweden）をAxen他の（1967）Nature 214,1302−1304
に記載されるようにしてCNBrにより活性化されたセフア
ロース（Pharmacia,Uppsala,Sweden）に結合させること
により調製された。HSA−およびIgG−セフアロースはゲ
ル約4mlずつでカラムに押し込まれた。このカラムをPBS
T−緩衝液で平衡化した。
プラスミドpEG、pC2C3およびpB1B2をそれぞれ含有す
る大腸菌株をTSB200ml＋アンピシリン（70mg/）中37
℃で一夜二通りずつ培養した。細胞を6000×ｇで10分間
遠心分離することによりペレツトとなしそして２通りの
上清をそれぞれIgG−およびHSA−カラムに直接負荷し
た。次にカラムをカラム容量の10倍のPBST緩衝液および
１容量の5mM NH4Ac（pH5.5）で洗つた。この後者は緩衝
液容量を低下させて効率的な溶離を行えるようにするた
めである。0.5M HAc（pH2.8）を用いて溶離し、1mlずつ
のフラクシヨンを集めた。280nmでのODを測定し、そし
て関連するフラクシヨン（３および４）を集め、プール
しそして凍結乾燥した。
凍結乾燥後、種々のフラクシヨンを負荷緩衝液（2.5
％SDS、５％ジチオトレイトール〔DTT〕および0.01％ブ
ロムフエノールブルー）中に溶解させそして提供者によ
り記載されるようにして５％ドデシル硫酸ナトリウムを
含有するグラジエント（８〜25％）ポリアクリルアミド
ゲル（SDS−PAGE）でのフアスト（phast）電気泳動（Ph
armacia,Uppsala,スウエーデン）により分析した。
pEGを含有する大腸菌株に関しては、タンパク質を精
製する前後にSDS−PAGEにより分析した。第２図に示さ
れるように、組み換えSPGは細胞外タンパク質の50％以
上を構成する（レーン１）。IgG−セフアロース（レー
ン２）またはHSA−セフアロース（レーン３）でのアフ
イニテイクロマトグラフイーにより分解が10％未満の純
粋な組み換えタンパク質が高収量で得られた。先端が欠
けたSPGは異常な移動率を示して見かけの寸法約33kDaを
生ずることに留意すべきであり、これは塩基配列から予
測される22kDaよりかなり大きい。これは早期の観察に
よるものである（Guss他、1986）。
pC2C3およびpB1B2を含有する大腸菌株に関しては、ア
フイニテイにより精製された物質の電気泳動の結果を第
３図に示す。第３図ＡはpB1B2によりコードされる30.5k
Daタンパク質がIgG−セフアロース（レーン１）には結
合しないが、HSA（レーン２）には効果的に結合される
ことを示している。これと対照的に、pC2C3によりコー
ドされる17.2kDaタンパク質はIgG−セフアロースには結
合するがHSA−セフアロースには結合しない（第３図
Ｂ、レーン１および２）。
これらの結果はタンパク質Ｇの２つのレセプター活性
が異なる一次構造部分と関連しておりそして機能的に独
立していることを例証している。アルブミン結合活性を
受け持つ部分は２回反復する相同領域Ｂの両側に領域Ａ
が配置されたもの、すなわちＡ−Ｂ−Ａ−Ｂ−Ａ（第１
図Ｃ）から成つている。この部分の最後の64アミノ酸は
構成物の一つpEGによりコードされるアルブミン結合性
タンパク質に包含される、すなわち最後のＢ領域の大部
分および最後のＡ領域の全部である。それゆえ、天然の
タンパク質Ｇの比較的小さなフラグメントでHSA−結合
に充分である。
実施例 ２ アルブミン結合活性を用いる融合タンパク質の精製 発現ベクターpEZZT308はベクターpEZZ8のHind IIIお
よびCla Iの間にtrpTに基づく合成的な翻訳および転写
停止リンカー（５′−AAGCTTAAGTAAGTAAGCCGCCAGTTCCGC
TGGCGGCATTTTTTTTGATATCATCGAT−３′,KabiGen AB,Stoc
knolm,Sweden）を挿入することにより作製された。pZZB
1B2を得るには、pB1B2からのEcoR I−Hind IIIフラグメ
ントを同じ酵素で予め消化されたこのベクター中に挿入
した。このプラスミドは第１図Ｅに略示されるようにSP
Aプロモーターおよびシグナルペプチドが上流にあるス
タフイロコツカスタンパク質Ａ（Nilsson他、1987 Prot
ein Engineering,107−113）に由来するZZとSPGのAB領
域との融合タンパク質をコードする。
pZZB1B2を含有する大腸菌株をTSB200ml＋アンピシリ
ン（70mg/）中37℃で一夜培養し、培養物を収穫しそ
して細胞を6000gで10分間遠心分離することにより清澄
化した。この清澄化された培地を前記のようにしてHSA
−セフアロースによりアフイニテイ精製しそして溶離さ
れた物質をPHAST電気泳動により分析した。第４図に示
されるように、38.7kDaの融合タンパク質はどちらのカ
ラムからも結合および溶離することができた。
これらの結果は、異種構造タンパク質（ZZ）はタンパ
ク質Ｇのアルブミン結合性部分B1B2に融合された場合に
アルブミンに結合しそしてHSA−アフイニテイクロマト
グラフイーにより精製されうることを証明している。
実施例 ３ アルブミン結合活性を用いる融合タンパク質の固定およ
び精製 プラスミドpB1B2を制限酵素EcoR IおよびSal Iで消化
し、クレノイポリメラーゼで処理しそして再連結してpB
1B2 R/Sを生成させた。予めPst IおよびHind IIIで開裂
させたpB1B2 R/S中に合成オリゴヌクレオチド（TGCAAGA
TCTTTCAATTTCCCTATCCTCGAGAATTCTAAGCTTおよびその相補
性配列）を挿入してPst I抵抗性プラスミドpB1B2HIVを
生成させた。M13mp18に由来する多目的クローニングリ
ンカーをEcoR IおよびHind III制限部位間にクローン化
すると、すぐ下流に位置するLacZ′遺伝子が発現され
た。生成するプラスミドはpB1B2HIVmp18と呼ばれた。
アルカリホスフアターゼをコードする遺伝子をアルブ
ミン結合性タンパク質をコードする配列に融合させるに
は、プラスミドpCH39を遺伝子源として用いた。Pst Iで
開裂させると、予めPst Iで消化されたpB1B2HIVmp18へ
の読み枠内融合に適合する、アルカリホスフアターゼを
コードする遺伝子を含有する3kbpフラグメントが放出さ
れた。連結期間中にpCH39の残余もトリプル連結で組み
込まれて所望の融合の他に、アンピシリンに対するのみ
ならずテトラサイクリンに対する抵抗性をもコードする
プラスミドが得られた。pNP−１で示されるこの構成物
を含有する大腸菌細胞のサンプルはDSMに寄託番号DSM−
4386の下に寄託されている。
分泌されるアルカリホスフアターゼをコードするプラ
スミドpASPを含有する大腸菌が対照として用いられた。
それぞれpNP−１およびpASPを含有する大腸菌株を、染
色体アルカリホスフアターゼ遺伝子を抑制するためにア
ンピシリン（70mg/）および0.9％KH2PO4を補添したTS
B200ml中で別々に培養した。細胞周辺腔に局在するタン
パク質を知られた技法による浸透シヨツク法を用いて放
出させた。
この操作により放出されたアルカリホスフアターゼ活
性を提供者により記載されるようにしてｐ−ニトロフエ
ニルホスフエート（Sigma104−０）とインキユベートす
ることにより２種のサンプルについて測定した。酵素活
性により基質が加水分解されてｐ−ニトロフエノールが
放出されそれが410nmでの吸光度変化として測定されう
る。活性の単位は一夜培養物1mlに相当するサンプル量
に関する１分当りの410nmでの吸光度変化％として定義
された。
融合タンパク質がHSA含有マトリツクスに選択的に固
定されうるか否かを判定するために以下のテストが行わ
れた。２種の菌株の浸透シヨツク法により得られた物質
３μずつをTST0.5mlおよびHSA−セフアロース50μ
と室温で30分間別々に混合した。10,000gで１分間遠心
分離したのち、上清中のホスヘート活性を測定した。ゲ
ルをTST1mlで２回洗いそしてゲルに結合された活性を前
記のようにして測定した。
その結果を下記第１表に示す。
この表において「合計」とは浸透シヨツク法により放
出された活性を示す。この結果は、pASP（対照）を含有
する細胞からのアルカリホスフアターゼはHSA−セフア
ロースに結合しないことを示している。反対に、pNP−
１によりコードされるアルカリホスフアターゼ融合タン
パク質の大きな部分がHSA−マトリツクスに結合する。
このことはアルブミン結合性ドメインが完全無欠な酵素
活性を保有したまま異種構造のタンパク質を固定するの
に使用されうることを示している。
２種の大腸菌株から浸透シヨツク法により得られた物
質を実施例１に記載されるようにしてHSA−セフアロー
スクロマトグラフイーにより別々にアフイニテイ精製し
た。pASP（対照）を含有する大腸菌株からの前記ペリプ
ラズムフラクシヨンを用い、溶離された物質を280nmで
の吸光度により測定しても何らのタンパク物質もカラム
に結合されなかつた。これと反対にPNP−１株から生成
されたタンパク質は結合され、このものは低pHで溶離で
きた。この物質のPHAST電気泳動による分析を第５図レ
ーン２に示す。それによれば、予想される寸法（71kD
a）を有する主要な結合が、標準操作に記載されるよう
にしてイオン交換およびゲル過により精製された天然
のアルカリホスフアターゼ（レーン１）よりわずかに大
きいことが示された。
これらの結果により、タンパク質ＧからのB1B2アルブ
ミン結合性フラグメントに融合された活性酵素からなる
タンパク質がHSA−セフアロースにより固定および精製
されうることが証明される。
実施例 ４ プラスモジウム・フアルシパルム（Plasmodium falcipa
rum）抗原Pf155/RESA1の反復配列に対する抗体の生成、
分析および精製に関する二発現系 プラウモジウム・フアルシパルムメロゾイト抗原Pf15
5/RESEのＣ−末端オクタペプチド反復EENVEHDAの四量体
をコードする合成遺伝子フラグメントを発現ベクターpA
TH11（Aslund L.,sjlander A.,Wahlgren M.,Wahlin
B.,Ruangjirachporn W.,Berzins K.,Wigzell H.,Perlma
nn P.and Pettersson U.1987）中に構成物から誘導し
た。合成遺伝子構成物はプラズモジウム・フアルシパル
ム抗原Pf155の反復した高度に免疫原性を有するエピト
ープを発現する（Proc,Natl.Acad.Sci.USA 84:1399）。
この遺伝子フラグメントを制限酵素Xma IおよびHind II
Iで切り出し、そして同じ酵素で予め消化したプラスミ
ドpEZZT308（実施例２記載）中に連結した。この発現ベ
クターpEZZT308はSpAオペロンの転写、翻訳および分泌
シグナルのあとに位置する、SpA由来の二価合成IgG結合
性ドメインをコードする。生成するベクターpEZZMIは二
価IgG結合性ドメインおよびオクタペプチド反復からな
る融合タンパク質をコードする。この融合タンパク質は
ZZ−M1と呼ばれた。
EENVEHDA反復をコードする遺伝子フラグメントを制限
酵素EcoR IおよびHind IIIを用いてプラスミドpEZZMIか
ら切り出した。同じ酵素を用いてプラスミドpB1B2HIV1m
p18（実施例３記載）を切断し、この中に前記フラグメ
ントを連結した。生成するベクターpB1B2BM1はストレプ
トコツカスタンパク質Ｇからのアルブミン結合性領域お
よびオクタペプチド反復からなる、BB−M1で示される融
合タンパク質をコードする。
異なる構成物を宿す大腸菌細胞をアンピシリン（70mg
/）を補添したトリプシン大豆ブロス（30g/）500ml
中37℃で一夜増殖させた。細胞を6000gでペレツトとな
しそしてペリプラズムタンパク質を浸透シヨツクにより
放出させた。２種の培養物からの調製物をIgG−セフア
ロース（Pharmacia、スウエーデン）またはHSA−セフア
ロース（実施例１参照）5mlのカラムに直接加えた。
全ペリプラズム含量をSDS−PAGEにより分析すると組
み換え生成物が２種の発現系において産生された主要タ
ンパク質であることが示された（第６図、レーン１およ
び３）。
ニユージーランド白ウサギをCFA中のまたはアジユバ
ントなしの融合タンパク質ZZ−M1 100μｇを用い筋肉免
疫した。４週および３週後に行われるブースター注射に
はCFAの代りにIFAが用いられた。ウサギから第１回の注
射３週間後および各ブースターの１週間後に採血した、
第31週での採血から得られた抗血清が用いられた。IgG
をタンパク質Ａ−セフアロースカラム（Pharmacia）で
単離した。
BB−M1が特異的な抗体を結合する容量をELISAで測定
した。ポリスチレンマイクロタイタープレート（Dynate
ch、Alexandria、Va,米国）をHSA（10μg/ml）で被覆し
そしてBB−M1をHSAに37℃で３時間結合せしめた。対照
プレートはBB−M1のタンパク質Ｇ由来部分で被覆した。
PBS中の0.5％BSAを用い37℃で３時間遮断したのち、こ
の被覆されたプレートを、免疫されたウサギから得られ
たウサギ抗血清の種々の希釈物と37℃で１時間インキユ
ベートした。アルカリホスフアターゼと接合された羊抗
−ウサギIgGと37℃で１時間、そしてｐ−ニトロフエニ
ルホスヘートと室温で30分間インキユベートしたのち、
生ずる発色を405nmで記録した。
BB−M1の濃度は抗原の抗体結合能力を低下させること
なく200ng/mlまで減少でき、そして反応性の抗体を検出
するにはBB−M1 8ng/mlで充分であつた（第７図参
照）。
ウサギ抗血清とEENVEHDA反復との反応性は被覆抗原と
して1000ng/ml濃度の融合タンパク質BB−M1を用い、ELI
SAで分析した。第８図に示されるように、CFA中または
アジユバントなしのZZ−M1で免疫したウサギはこのアツ
セイにおいてEENVEHDA反復と反応する抗体を産生した。
固定されたHSAへの融合タンパク質BB−M1の結合によ
りペプチド特異的抗体をアフイニテイ精製するための効
果的なシステムが得られよう。固定されたHSAはスペー
サーとして機能でき、そしてBB−M1のタンパク質Ｇ由来
する部分に仲介された融合タンパク質の結合はEENVEHDA
反復の抗体結合能力を冒すべきでない。この前提を試験
するために、精製されたBB−M1を、CNBrにより活性化さ
れたセフアロース（Pharmacia）に結合したHSAに結合さ
せBB−M1 3.8mg/15mgアルブミンそしてグルタルアルデ
ヒドによりHSAに架橋させた（最終濃度0.5％）。この反
応を１％グリシンの添加により停止させた。ゲルをPB
S、0.2M酢酸（pH3.3）、および0.2Mグリシン緩衝液（pH
2.8）を用い逐次的に充分に洗つた。この操作を用い
て、共有結合されたBB−M1が高収率で得られた。低pHで
よく洗つてもマトリツクスからは適用されたBB−M1の15
％未満しか溶離され得なかつた。アフイニテイクロマト
グラフイーするには、ウサギ血清から単離されたIgGフ
ラクシヨン2mgをカラムに適用されたパツクされたビー
ズ1mlとインキユベートした。PBSで充分に洗つたのち、
結合された抗体を0.2Mグリシン緩衝液続いて3M KSCNで
溶離した。溶出後の緩衝液を製造者の教示に従い、PD10
カラム（Pharmacia）上で0.2％BSA含有PBSに交換した。
ウサギ抗血清からの合計IgG、フロースルーフラクシ
ヨンおよび0.2Mグリシン緩衝液で溶離したフラクシヨン
をBB−M1との反応性に関してELISAで試験した。第９図
には、CFA中のZZ−M1で免疫したウサギからの血清をア
フイニテイ精製に使用した実験結果を示す。フロースル
ーフラクシヨンには何らBB−M1との抗体反応性は検出さ
れなかつた。適用されたIgGの0.1％未満しか0.2Mグリシ
ン緩衝液で溶離されなかつた（データは示さず）。第６
図に示されるように、BB−M1反応性に関する高い収率は
グリシンフラクシヨン中に回収された。
これらの結果は、SPGのアルブミン結合性ドメインが
組み換えペプチドを包含する融合タンパク質をHSAを含
有する固形支持体に特異的に固定するのに用いられうる
ことを示している。この固定されたペプチドはさらにそ
のペプチドに対する抗体の分析および精製にも使用され
うる。この実施例の概念をダイヤグラムで示したものが
第10図である。
【図面の簡単な説明】
第１図はストレプトコツカスタンパク質Ｇ遺伝子（Ｇ）
およびこの遺伝子のフラグメントを含有する構成物の概
略図である。 第２図はプラスミドpEG（第１図Ｂ）を含有する大腸菌
細胞の増殖培地のゲル電気泳動分析の結果を示す図であ
る。レーン１は清澄化した増殖培地からの総タンパク
質、レーン２はIgG−アフイニテイにより精製したタン
パク質そしてレーン３はHSA−アフイニテイにより精製
したタンパク質を示す。 第３図は２種のサブクローンされたフラグメントから発
現されたフラグメントのIgG−結合およびHSA−結合のゲ
ル電気泳動による分析を示す図である。 第４図はプラスミドpZZB1B2（第１図Ｅ）を含有する細
胞の増殖培地からの、HSA−アフイニテイにより精製さ
れた物質のゲル電気泳動分析の結果を示す図である。 第５図は大腸菌株pASP（レーン１）およびpNP−１（レ
ーン２）の浸透シヨツクにより得られ、それぞれイオン
交換クロマトグラフイーおよびHSA−アフイニテイクロ
マトグラフイーにより精製された物質のゲル電気泳動分
析の結果を示す図である。 第６図は還元条件下での13％ポリアクリルアミドゲル上
における融合タンパク質のSDS/PAGE分析の結果を示す図
である。レーン１はpB1B2M1を宿す大腸菌細胞の総ペリ
プラズム含量、レーン２はHSA−セフアロース上でアフ
イニテイ精製されたBB−M1タンパク質、レーン３はpEZZ
M1を宿す大腸菌細胞の総ペリプラズム含量、レーン４は
IgG−セフアロースでアフイニテイ精製されたZZ−M1タ
ンパク質を示す。数字はおよその分子量（kDa）を示
す。 第７図はHSAで被覆されたマイクロタイターウエルに結
合された融合タンパク質BB−M1のELISAにおける力価を
示す（□印）。 第８図はCA中（■印）またはアジユバンドなし（●印）
の融合タンパク質ZZ−M1で免疫したウサギからの抗血清
の融合タンパク質BB−M1との反応性をELISAにおいて示
す。 第９図はCFA中のZZ−M1で免疫されたウサギからの抗血
清のBB−M1でのアフイニテイ精製結果を示す。適用され
たIgGフラクシヨン（●印）、フロースルーフラクシヨ
ン（▲印）そして0.2Mグリシン緩衝液で溶離したフラク
シヨン（■印）のELISAにおけるBB−M1との反応性を示
す。 第10図は二発現系の基本的概念を示すダイヤグラムであ
る。ZZはSpAに由来するIgG結合領域、BBはストレプトコ
ツカスタンパク質Ｇからの血清アルブミン結合性ドメイ
ン、Ｐは免疫原性ペプチド、HSAはヒト血清アルブミン
を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:44） (72)発明者 ペル―オーケー・ニユーグレン スウエーデン国エス‐122 51エンシエ ーデ．ピロツトガタン22 (72)発明者 ラース・アブラームセン スウエーデン国エス‐111 31ストック ホルム．シェーラゴーシガタン10 (72)発明者 マティーアス・ウーレン スウエーデン国エス‐752 39ウプサラ. クヴァーンボガタン30 (56)参考文献 特表 昭60−500480（ＪＰ，Ａ) Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ 168 （1987）ｐ．319−324 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＡＩＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＡＩＬＯＧ)

Claims (8)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】血清アルブミンに選択的に結合しうる融合
    タンパク質またはポリペプチドを生産させ、単離するに
    あたり、下記工程： ａ）所望のタンパク質またはポリペプチドをコードする
    第２のDNA配列に操作的に連結されており、かつ血清ア
    ルブミン結合性ポリペプチドフラグメントをコードする
    DNA配列であってタンパク質Ｇをコードする遺伝子に起
    源するDNA配列により構成される第１のDNA配列を含有す
    る組み換えベクターを作製し、 ｂ）前記融合タンパク質またはポリペプチドをコードす
    る合一されたDNA配列が宿主により発現されうるような
    様式で適合しうる宿主を前記組み換えベクターを用いて
    形質転換しそしてこの形質転換された宿主を適当な増殖
    培地中に培養して前記融合タンパク質またはポリペプチ
    ドを産生させ、そして ｃ）その血清アルブミン結合能力を用いて前記融合タン
    パク質またはポリペプチドを単離する ことを特徴とする方法。
  2. 【請求項２】前記タンパク質またはポリペプチドの単離
    が血清アルブミンを含有する担体物質への吸着および場
    合により該担体物質からのこのタンパク質またはポリペ
    プチドの脱着により行われることを特徴とする請求項１
    記載の方法。
  3. 【請求項３】前記第１のDNA配列が第１図に示されるセ
    グメントA1、B1、A2、B2およびA3の少なくとも１つを含
    有することを特徴とする請求項１記載の方法。
  4. 【請求項４】前記第１のDNA配列が第１図に示されるセ
    グメントB2およびA3を含有することを特徴とする請求項
    ３記載の方法。
  5. 【請求項５】担体物質からの融合タンパク質またはポリ
    ペプチドの脱着がpHを約３以下に低下させることにより
    行われることを特徴とする請求項２〜４のいずれかに記
    載の方法。
  6. 【請求項６】所望のタンパク質またはポリペプチドをコ
    ードする第２のDNA配列に操作的に連結されており、か
    つ血清アルブミン結合性ポリペプチドフラグメントをコ
    ードするDNA配列であってタンパク質Ｇをコードする遺
    伝子に起源するDNA配列により構成される第１のDNA配列
    を含有する、微生物中において複製可能な組み換えベク
    ターであって、前記DNA配列の一方が前記融合タンパク
    質またはポリペプチドをコードするもう一方のDNA配列
    の５′−末端から伸びており、前記融合タンパク質をコ
    ーディングする結合配列が好ましくは構造タンパク質Ａ
    をコードする遺伝子のプロモーターおよびシグナル配列
    を含有することを特徴とする組み換えベクター。
  7. 【請求項７】請求項６記載の組み換えベクターにより形
    質転換された宿主細菌。
  8. 【請求項８】エシエリヒア、バチルスまたはスタフイロ
    コツカスの菌株のような細胞宿主である請求項７記載の
    宿主細菌。
JP1024142A 1988-02-05 1989-02-03 融合タンパク質またはポリペプチドの生産 Expired - Fee Related JP3026812B2 (ja)

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