DE68925044T2

DE68925044T2 - Herstellung von Fusionsproteinen oder -polypeptiden

Info

Publication number: DE68925044T2
Application number: DE68925044T
Authority: DE
Inventors: Lars Abrahmsen; Per-Ake Nygren; Mathias Uhlen
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1988-02-05
Filing date: 1989-02-02
Publication date: 1996-05-09
Anticipated expiration: 2009-02-03
Also published as: SE501169C2; ES2080759T3; SE8800378D0; EP0327522A2; EP0327522A3; SE8800378L; ATE131494T1; DE68925044D1; JPH025887A; EP0327522B1; GR3018617T3; JP3026812B2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Protein- und Polypeptidprodukten mit hoher Reinheit durch rekombinante DNA-Technologie und spezieller die Benutzung einer solchen Technologie zur Herstellung neuer Genprodukte, die erwünschte Proteine oder Polypeptide umfassen, wobei diese neuen Genprodukte leicht veredelt werden können, und gegebenenfalls zur Umwandlung solcher Genprodukte in die erwünschten Proteine oder Polypeptide. Spezieller deckt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Fusionsproteins oder -polypeptids, das in der Lage ist, selektiv an Serumalbumin zu binden.
Genfusion ist ein Verfahren, bei dem die kodierende Sequenzen zweier oder mehrerer Gene zusammengefügt werden, um ein kombiniertes Gen zu bilden, welches bei Expression in einem geeigneten Wirtsorganismus ein Fusionsprodukt erzeugen wird, worin die getrennten durch die betreffenden Gene kodierten Proteine oder Polypeptide miteinander zu einem einzigen Molekül verschmolzen werden.
Die vorliegende Erfindung liefert ein Mittel zur Erleichterung der Immobilisierung und Reinigung von Proteinen durch ein Verfahren, das auf rekombinanter DNA-Technologie beruht und welches es erlaubt, erwünschte Proteine und Polypeptide mit extremer Reinheit zu erzeugen. Gemäß der Erfindung erreicht man dies durch Ausnutzung der spezifischen albuminbindenden Eigenschaften von Protein G aus Streptococcus-Stamm G 148 in Kombination mit Genfusionstechnologie, wie nachfolgend erklärt wird.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird Genfusion benutzt um eine erste für einen Albuminbindungsteil kodierende DNA-Sequenz mit einer zweiten für ein erwünschtes Protein oder Polypeptid kodierenden DNA-Sequenz zu einem funktionellen Gen zu vereinigen, das in der Lage ist, das Fusionsprodukt dieses erwünschten Albuminbindungsteils zu expremieren. Infolge der Albuminbindefähigkeit kann das erzeugte Protein oder Polypeptid leicht mit hoher Effizienz mit herkömmlicher Affinitätschromatographie isoliert werden, wobei man Serumalbumin des Typs von menschlichem Serumalbumin (HSA), das an einem geeigneten Träger immobilisiert ist, benutzt. Das trägergebundene Fusionsprodukt kann als solches benutzt werden, z. B. wenn das erwünschte Protein ein Enzym ist, oder es kann von dem Träger entweder als Ganzes einschließlich des Albuminbindungsteils oder nur der erwünschte Proteinoder Polypeptidteil desselben durch Spaltung mit einem geeigneten Mittel abgegeben werden.
Ein grundlegender Aspekt der vorliegenden Erfindung ist somit das Vorsehen eines rekombinanten DNA-klonenden Vehikels oder Vektors, der eine DNA-Sequenz umfaßt welche für ein erwünschtes Protein oder Polypeptid kodiert, das funktionsmäßig mit einer DNA- Sequenz verbunden ist, die für den Albuminbindungsteil kodiert, so daß diese DNA-Sequenzen zusammen für ein albuminbindendes Fusionsprodukt des erwünschten Proteins oder Polypeptids und des Albuminbindungsteils kodieren. Um in der Lage zu sein, einen Wirtsorganismus zu transformieren (was auch den Fall einschließen soll, daß der Vektor ein Bakteriophage ist), um dieses Fusionsprodukt zu erzeugen, umfaßt der Vektor in herkömmlicher Weise weiterhin ein Replicon und einen Promotor für die für das Fusionsprodukt kodierende gebundene DNA- Sequenz. Aus Gründen, die nachfolgend weiter beleuchtet werden, kann die kombinierte DNA- Sequenz eine Sequenz umfassen, die für eine geeignete Spaltungsstelle zwischen den DNA- Sequenzen kodiert, welche ihrerseits jeweils für das erwünschte Protein bzw. den Albuminbindungsteil kodieren, so daß der Albuminbindungsteil des FusionsmoleküIs, wie oben erwähnt, gespalten werden kann.
Durch Transformieren eines kompatiblen Wirtsorganismus mit diesem Vektor, um eine Expression der obigen kombinierten DNA-Sequenz und ein Züchten des Wirts in einem Nährmedium zu gestatten, wird das entsprechende albuminbindende verschmolzene Protein oder Polypeptid erzeugt. Obwohl zum Zwecke der Erfindung Bakterienwirte, wie Stämme beispielsweise von Escherichia, Bacillus und Staphylococcus, bevorzugt sind, liegt es natürlich auch innerhalb des Erfindungsgedankens, andere Wirte, wie Hefen oder andere Pilze, Pflanzenzellen in Kultur usw., zu verwenden. Die Transformation der Wirte kann mit bekannten Methoden erfolgen.
Infolge der Albuminbindungsfähigkeit des Protein G-Restes des durch den gezüchteten Wirtsorganismus erzeugten Fusionsmoleküls kann das Fusionsmolekül sehr effizient aus der Zellkultur mit Hilfe von HSA, das an einem geeigneten Träger immobilisiert ist, isoliert werden. Wenn das Fusionsprodukt in das umgebende Medium abgeschieden wird, kann die Bindung an den Träger direkt aus dem Medium erzeugt werden. Wenn andererseits das Fusionsprodukt in den Zellen bleibt, müssen letztere aufgebrochen werden, bevor eine solche Bindung bewirkt werden kann. Das Aufbrechen der Zellwände kann in herkömmlicher Weise bewirkt werden, wie beispielsweise durch hohen Druck, Ultraschallbehandlung, Homogenisierung, Schütteln mit Glasperlen usw. In Fällen, in denen das Produkt in dem periplasmatischen Raum zwischen zwei Zellmembranen eingeschlossen ist, wie in gramnegativen Bakterien, kann ein osmotisches Schockverfahren verwendet werden, um das Produkt in das Suspensionsmedium freizugeben. Irgendeine andere Behandlung der gezüchteten Zellen oder des Wachstumsmediums vor der mit HSA unterstützten Isolierung des Fusionsproduktes liegt natürlich auch innerhalb des Gedankens der Erfindung.
In herkömmlicher Weise kann das Immobilisierungsverfahren ansatzweise mit dem HSAgekoppelten Träger, der in einem geeigneten Medium aufgeschlämmt ist oder sich auf einer Säule des aktivierten Trägers befindet, durchgeführt werden. Irgendein herkömmliches Trägermaterial, an welches HSA ausreichend für die vorliegenden Zwecke gebunden werden kann, kann verwendet werden. Die Methoden zur Bindung oder Immobilisierung von HSA an solchen Trägermaterialien sind bekannt und brauchen hier nicht im einzelnen beschrieben zu werden. Es ist möglich, eine Adsorption von HSA an Oberfläche von Mikrotiterlöchern als ein Mittel zum Überziehen zu verwenden.
Die Freisetzung oder Desorption des verschmolzenen Proteins oder Polypeptids, welches an den HSA-Träger gebunden ist, kann mit herkömmlichen Methoden bewirkt werden, wie durch Verminderung des pH-Wertes, z. B. mit Hilfe von Essigsäurepuffer (pH 2,7), Behandlung mit hohen Salzkonzentrationen oder chaotropen Ionen oder durch kompetitives Eluieren unter Verwendung eines Überschusses von löslichem HSA, um das Fusionsprotein oder -polypeptid von dem HSA-Trägeradsorbens zu verdrängen. Die Wahl der Desorptionsmethode sollte natürlich unter Berücksichtigung des speziell erwünschten Proteins oder Polypeptids getroffen werden, so daß eine erwünschte Aktivität desselben dadurch nicht verlorengeht oder wesentlich reduziert wird. Aus dem resultierenden Eluat kann das Fusionsprotein oder -polypeptid leicht isoliert und gegebenenfalls weiteren Reinigungsstufen, wie Gelfiltration, Ionenaustausch usw., unterzogen werden.
Das erhaltene gereinigte Protein oder Polypeptid kann als solches ein wertvolles Produkt sein, wie es nachfolgend beschrieben ist, und ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist daher ein Verfahren zur Erzeugung eines hochgereinigten verschmolzenen Protein- oder Polypeptidproduktes mit den Stufen, in denen man einen kompatiblen Wirt mit dem obigen Vektor transformiert, den Wirt in einem Nährmedium züchtet, das verschmolzene Protein oder Polypeptid aus dieser Wirtskultur durch seine selektive Bindung an einen HSA-Träger isoliert und gegebenenfalls das verschmolzene Protein oder Polypeptid von dem Träger freisetzt, sowie ein dabei erhaltenes isoliertes verschmolzenes Produkt.
Eine wertvolle Verwendung eines solchen Fusionsproduktes ist die, wenn das mit dem Albuminbindungsteil verschmolzene Protein ein Enzym ist. In solchen Fällen wird die HSA- Bindungsaktivität des Fusionsproduktes zum Immobilisieren des Enzyms an einem Trägermaterial mit daran gebundenem HSA ausgenutzt. Ein solches Enzymreaktorsystem bietet mehrere Vorteile. Da das Enzym über die HSA-Bindung an den Träger gebunden wird, werden alle Enzymmoleküle an den Träger in genau der gleichen Weise gebunden, so daß seine maximale Aktivität erhalten wird. Wenn die Enzymaktivität auf einen unannehmbar niedrigen Wert abgenommen hat, kann ein solches System leicht regeneriert werden, indem man in herkömmlicher Weise das Enzym von dem Träger durch einen pH-Wechsel, z. B. durch Senkung des pH-Wertes, und anschließende Bindung von aktives Enzym enhaltendem Fusionsprodukt daran regeneriert. Die Bindung oder Adsorption des fraglichen veschmolzenen Enzyms an den HSAgekoppelten Träger kann entweder direkt aus den geeignet vorbehandelten Zellen oder aus Zellmedium oder in gereinigtem Zustand nach Adsorption und Desorption von einem anderen HSA-gekoppelten Adsorbens bewirkt werden.
Eine andere wertvolle Verwendung eines solchen Fusionsproteins ist die für die gerichtete Immobilisierung eines Antigens, das in diagnostischen Tests, wie ELISA, verwendet wird, insbesondere für Tests zur Bestimmung des Vorhandenseins und/oder der Menge eines für das Antigen spezifischen Antikörpers. Bei Verwendung der vorliegenden Erfindung umfaßt das Antigen ein Peptid oder ein Protein, das mit dem Albuminbindungsteil verschmolzen ist, welcher an einer mit HSA überzogenen Oberfläche immobilisiert ist. Analyse der Menge von für den Antigenrest spezifischen Antikörpern kann dann nach bekannten Methoden durchgeführt werden, die markiertes Protein A oder Anti-Antikörper einschließen. Eine solche fusionsproteingerichtete Immobilisierung des Peptid- oder Proteinantigens bietet mehrere Vorteile. Alle Moleküle werden in der gleichen Weise gebunden, und vor der Immobilisierung ist keine Reinigung des Fusionsproteins erforderlich, da Proteine ohne den Albuminbindungsteil weggewaschen werden können. Außerdem braucht die Immobilisierung keine chemische Bindung, und das Antigen-Feststoffträgersystem kann einfach durch Verminderung des pH- Wertes, um gebundenes Fusionsprotein von der mit HSA beschichteten Oberfläche zu desorbieren, regeneriert werden.
Noch eine andere wertvolle Verwendung eines solchen Fusionsproteins ist die, eine HSA- Matrix in eine Matrix mit spezifischerer Affinität unter Verwendung der vorliegenden Erfindung umzuwandeln, indem man einen mit dem Albuminbindungsteil verschmolzenen Peptid- oder Proteinliganden immobilisiert. Auf eine solche Weise kann die HSA-Säule verwendet werden, um für ein Antigen aus menschlichem oder tierischem Serum spezifische Antikörper zu reinigen. Dies bietet Vorteile, wenn auf ein spezifisches Antigen gerichtete monoklonale oder polyklonale Antikörper konzentriert oder eliminiert werden sollen. Letzteres kann bei einer Therapie außerhalb des Körpers für einen Patienten wichtig sein, der Autoantikörper zu biologisch wichtigen Proteinen hat.
Der albuminbindende Proteinteil des verschmolzenen Proteins oder Polypeptids kann unter bestimmten Bedingungen abgespalten werden, wobei das erwünschte Protein oder Polypeptid erhalten wird. Nach einem anderen Aspekt liefert daher die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines erwünschten Proteins oder Polypeptids hoher Reinheit mit den Stufen, in denen man einen kompatiblen Wirt mit dem obenerwähnten Vektor transformiert, diesen Wirt in einem Nährmedium züchtet, das verschmolzene Protein oder Polypeptid aus der Zellkultur durch selektive Bindung an einen HSA-Träger isoliert und das erwünschte Protein oder Polypeptid von dem Albuminbindungsteil des verschmolzenen Proteins oder Polypeptids entweder direkt von dem trägergebundenen Fusionsprodukt oder nach Desorption desselben von dem Träger abspaltet.
Eine notwendige Bedingung, um die Abspaltung des verschmolzenen Proteins oder Polypeptids zu erlauben, ist natürlich, daß es eine spezielle Spaltungsstelle enthält, die mit geeigneten Mitteln erkannt und gespalten werden kann. Eine solche Spaltungsstelle kann eine spezielle Aminosäuresequenz sein, die mit chemischen oder enzymatischen Mitteln erkennbar ist und zwischen dem erwünschten Protein oder Polypeptid bzw. Albuminbindungsteil des zu erzeugenden verschmolzenen Produktes liegt. Eine solche spezifische Aminosäuresequenz darf nicht in dem erwünschten Protein oder Polypeptid und vorzugsweise nicht in dem Bindungsteil des Fusionsproduktes vorkommen. Beispiele enzymatischer Mittel schließen Proteasen, wie Faktor Xa, welcher in einigen Fällen die Aminosäuresequenz NH&sub2;-Ile-Glu-Gly-Arg-COOH erkennt, Chymosin (Rennin), welches die Met-Phe-Bindung spaltet, Kallikrein B, welches an der Carboxylseite von Arg in X-Phe-Arg-Y spaltet, Enterokinase, welche die Sequenz X-(Asp)n- Lys-Y erkennt, worin n = 2 bis 4, und sie auf der Carboxylseite von Lys spaltet, oder Thrombin, welches an spezifischen Arginylbindungen spaltet, ein. Beispiele chemischer Mittel sind etwa Bromcyan (CNBr), welches nach Met spaltet, Hydroxylamin, welches die Asn-Gly- Bindung spaltet, oder Ameisensäure, welche in hoher Konzentration (etwa 70 %) spezifisch Asp-Pro spaltet.
Wie aus dem Obigen ersichtlich ist, ist ein entscheidender Teil der vorliegenden Erfindung das Vorsehen der rekombinanten DNA-Struktur oder des rekombinanten Vektors, die das verschmolzene Gen umfassen, welches für das vorliegende Fusionsprotein oder Polypeptid kodiert und eine Wirtszelle so transformieren kann, daß sie dessen Expression und eine Erzeugung des Fusionsproduktes gestattet. Die vorliegende Erfindung soll einen solchen Vektor einschließen, unabhängig davon, wie er erhalten wurde, beispielsweise unter Verwendung verschiedener Restriktionsenzymspaltungs-, Ligations-, Transformations- und Siebtechniken, die in der Technik wohlbekannt sind, sowie unter Verwendung irgendwelcher geeigneter Vektormaterialien und Wirtsorganismen. So kann die für das erwünschte Protein oder Polypeptid kodierende DNA-Sequenz in einen geeigneten Vektor eingesetzt und anschließend die albuminbindende kodierende DNA-Sequenz eingesetzt werden oder umgekehrt, oder die beiden DNA-Sequenzen können gleichzeitig in den Vektor eingeführt werden. Es ist auch möglich, die betreffenden DNA-Sequenzen in Teilen derselben in den Vektor einzuführen. Außerdem können die beiden DNA-Sequenzen so angeordnet werden, daß entweder die albuminbindende kodierende Sequenz oder die für das erwünschte Protein oder Polypeptid kodierende Sequenz an dem 5'-Ende oder Beginn des verschmolzenen Gens steht. Die speziellen Techniken zur Durchführung solcher Einfügungen und Verschmelzungen mit beibehaltenen korrekten Leserastern einschließlich des Vorsehens geeigneter Restriktionsstellen hierfür sind in der Technik an sich bekannt.
Die Erfindung schließt auch ein rekombinantes DNA-Molekül ein, das die rekombinante DNA-Sequenz, wie oben beschrieben, und an dem DNA-Level 3' verschmolzen ein Produktionsgen umfaßt. Durch diese Anordnung erhält ein solches Molekül die Fähigkeit, ein verschmolzenes Protein in einem geeigneten Wirt zu exprimieren. Ein solches Produktionsgen kann jenes eines Somatomedins sein, von dem Beispiele folgende sind: Wachstumshormone oder -faktoren, wie hGH (menschliches Wachstumshormon), IGF-I, IGF-II, NGF (Nervenwachstumsfaktor), EGF (Epithermwachstumsfaktor) und PDGF (sich von Blutplättchen ableitender Wachstumsfaktor). Das Produktionsgen kann auch ein solches sein, welches für ein Interferon, Interleukin-2, Insulin, Neuropeptid, Gastrointestinalpeptide, Gewebeplasminogen aktivator (tPA) und aktive Derivates hiervon usw. kodiert. Das Produktionsgen kann auch für ein strukturelles Gen für ein Enzym oder Teile hiervon kodieren.
Nach noch einem anderen Aspekt der Erfindung bekommt man ein Verfahren zum Abspalten eines verschmolzenen Proteins, das in einem biologischen System durch das rekombinante DNA-Molekül, wie oben definiert, exprimiert ist.
Schließlich schließt die Erfindung einen Plasmidvektor ein, der das rekombinante DNA- Molekül, wie oben beschrieben, umfaßt. Die Erfindung schließt auch Bakterienzellen ein, die das rekombinante DNA-Molekül, wie oben definiert, enthalten. Das Molekül kann in das Chromosom der Bakterienzelle eingesetzt werden, kann aber auch in einem Plasmidvektor enthalten sein.
Die Wirtszelle ist beispielsweise gramnegativ und besteht insbesondere aus E. coli.
Die Erfindung wird nun nachfolgend weiter durch nichtbeschränkende Beispiele unter Bezugnahme auf die beiliegende Zeichnung erläutert, worin
Fig. 1 eine schematische Zeichnung des Streptococcen-Protein G-Gens (G) und der Fragmente dieses Gens enthaltenden Konstruktion ist,
Fig. 2 eine Analyse des Wachstumsmediums von E. coli-Zellen durch Gelelektrophorese zeigt die Plasmid pEG (Fig. 1B) enthalten; Spalte 1, Gesamtproteine aus geklärtem Wachtumsmedium; Spalte 2, IgG-affinitätsgereinigte Proteine; Spalte 3, HSA-affinitätsgereinigte Proteine,
Fig. 3 eine Analyse von IgG- und HSA-Bindung von Fragmenten durch Gelelektrophorese, die von zwei subgeklonten Fragmenten exprimiert sind, zeigt. Wachstumsmedien aus E. coli-Zellen, die die verschiedenen Konstruktionen enthalten, wurden an HSA- oder IgG-Sepharose gereinigt. Eluierte Proteine wurden lyophilisiert und an SDS-PAGE analysiert.
A. Zellen, die pB1B2 enthalten (Fig. 1 D), Spalte 1, IgG-affinitätsgereinigte Proteine (nämlich die leichten und schweren Ketten von IgG); Spalte 2, HSA-affinitätsgereingte Proteine,
Zellen, die pC2C3 enthalten (Fig. 1A), Spalte 1, IgG-affinitätsgereinigte Proteine; Spalte 2, HSA-affinitätsgereinigte Proteine,
Fig. 4 eine Analyse von HSA-affinitätsgereinigtem Material aus dem Wachstumsmedium von Zellen, die Plasmid pZZB1B2 enthalten (Fig. 1E), durch Gelelektrophorese zeigt,
Fig. 5 eine Analyse von gereinigtem Material, das durch osmotischen Schock von E. coli-Stämmen pASP (Spalte 1) und pNP-1 (Spalte 2), gereinigt mit Ionenaustausch bzw. HSA-Affinitätschromatographie, erhalten wurde, durch Gelelektrophorese zeigt,
Fig. 6 eine SDS/PAGE-Analyse der Fusionsproteine auf einem 13 %igen Polyacrylamidgel unter reduzierenden Bedingungen zeigt; Spalte 1: gesamter periplasmatischer Gehalt von E. coli-Zellen, die pB1B2M1 beherbergen; Spalte 2: BB-M1- Protein, affinitätsgereinigt auf HSA-Sepharose; Spalte 3: gesamter periplasmatischer Gehalt von E. coli-Zellen, die pEZZM1 beherbergen; Spalte 4: ZZ-M1- Protein, affinitätsgereinigt auf IgG-Sepharose; die Zahlen zeigen die ungefähren Molekulargewichte in kDa an,
Fig. 7 eine Titration des Fusionsproteins BB-M1, gebunden an mit HSA überzogenen Mikrotitervertiefungen ( ) in ELISA zeigt die Mikrotiterplatten wurden mit auf 1 : 2000 verdünntem Antiserum aus einem mit dem Fusionsprotein ZZ-M1 in CFA immunisierten Kaninchen inkubiert; Werte wurden durch Substrahieren der Reaktitivät des Serums mit dem von Protein G stammenden Teil von BB- M1 (OD, 0,022 bis 0,088) reduziert,
Fig. 8 die Reaktivität in ELSA mit dem Fusionsprotein BB-M1 von Antiseren aus einem mit dem Fusionsprotein ZZ-M1 in CFA ( ) oder ohne Hilfsmittel ( ) immunisierten Kaninchen zeigt; die Werte wurden durch Substrahieren der Reaktivität der Seren mit dem sich von Protein G herleitenden Teil von BB-M1 (OD, 0,011 bis 0,158) reduziert; Absorption > 0,1 = positiv,
Fig. 9 das Ergebnis einer Affinitätsreinigung von Antiserum aus einem mit ZZ-M1 in CFA immunisierten Kaninchen auf BB-M1 ist; Reaktivität in ELISA mit BB-M1 der angewendeten IgG-Fraktion ( ), der Durchflußfraktion ( ) und der mit 0,2 M Glycinpuffer eluierten Fraktion ( ); Fraktionen wurden so eingestellt, daß Volumina in bezug auf die Verdünnung verglichen wurden, die durch das Reinigungsverfahren verursacht wurde;
Fig. 10 eine schematische Darstellung, die das Grundkonzept des Doppelexpressionssystems zeigt, ist; ZZ: IgG-Bindungsgbereich, der sich von SpA herleitet; BB: Serumalbuminbindungsdomäne von Streptococcenprotein G; P: immunogenes Peptid; HSA: menschliches Serumalbumin; siehe Text bezüglich der Einzelheiten.
Spezielle Ausführungsformen der Erfindung werden nun im einzelnen beschrieben.

Ausgangsmaterialien

E. Coli RRI del M15 [Langey et al, Proc. Natl. Acads. Sci., USA, 72, Seiten 1254 bis 1257 (1975)] wurden in den Beispielen verwendet. Die verwendeten Klonusvehikel waren pUC8 [Viera und Messig, Gene, 19, Seiten 259 bis 268 (1982)], pEZZ8 [Löwenadler et al, Gene 58, eiten 87 bis 97 (1987)1 pEMBL8- [Dente et al, Nucl. Acids Res., 11, Seiten 1645 bis 1653 (1983)], pASP [Abrahmsen et al, EMBO J. 4, Seite 3901 bis 3906 (1985)], pCH39 [Hoffman and Wright, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82, Seiten 51078 bis 5111 (1985)] und M13mp18 (im Handel erhältlich bei Pharmacia, Uppsala, Schweden). Alle Stämme und Vektoren sind bei der Abteilung für Biochemie, Königliches Institut für Technologie, Stockholm, Schweden erhältlich. Der Plasmidvektor pNP-1 wurde bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen (DSM), Braunschweig, Bundesrepublik Deutschland unter der Nummer DSM-4386 am 3. Februar 1988 hinterlegt.

Puffer und Medien

PBST: 8,0 g NaCl, 0,2 g KH&sub2;PO&sub4;, 2,9 g Na&sub2;HPO&sub4; x 12H&sub2;O, 0,2 g KCl, 0,2 ml Tween 20 und 0,2 g NaN&sub3;, aufgefüllt auf 1 l mit destilliertem H&sub2;O (pH 7,4).
TSB: 30 g tryptische Sojabrühe, aufgefüllt auf 1 l und im Autoklaven behandelt.
TST: TRIS (25 mM) und HCl bis pH 7,4, 200 mM NaCl, 0,05 % Tween 20.

Routinemethoden

Routinemäßig in der Molekularbiologie verwendete Methoden werden nicht beschrieben (wie die Verwendung handelsüblicher Restriktionsenzyme, DNA-Ligationen, Bal 31 -Exonuclease, S1-Nuclease und Klenow-Polymerase, Transformation von E. coli und Isolierung von Plasmid-DNA).
Das von Nossal und Heppel, J. of Biol. Chem., Band 244, Nr. 13, Seiten 3055 bis 3062 (1966) beschriebene osmotische Schockverfahren schließt ein, daß die Zellen 20 %igem Rohrzucker mit 0,1 mM EDTA ausgesetzt werden und danach in kaltem 5 . 10&supmin;&sup4; M MgCl&sub2; dispergiert werden, was bewirkt, daß der periplasmatische Gehalt freigesetzt wird.
Um Proteinfraktionen durch SDS-PAGE unter Verwendung des PHAST-Systems (Pharmacia, Uppsala, Schweden) zu analysierne, wurden die Proben in Puffer [2,5 % SDS, 5 % Dithiothreitol (DTT) und 0,01 %igem Bromphenolblau] gelöst. Polyacrylamidgele mit einem Gefälle (8 bis 25 %) mit 5 % SDS arbeiteten bei 10 mA während 30 min und wurden anschließend mit Coomassie-Blau angefärbt.

Beispiel I

Klonung und Expression des Albuminbindungsfragmentes von Streptococcenprotein G

Eine schematische Zeichnung des Proteins G kodierenden Gens aus dem Streptococcenstamm G 148, wie von Olsson et al beschrieben [Eur. J. of Biochem. 168: Seiten 319 bis 324 (1987)], ist in Fig. 1 C gezeigt. Unterschiedliche Teile des Gens kodierende Genfragmente wurden verwendet, um die drei schematisch in den Fig. 1 A, B und D bezeichneten Konstruktionen zusammenzustellen. Der Aufbau dieser Konstruktionen ist nachfolgend beschrieben.
Die kodierende Sequenz der drei IgG-Bindungsbereiche aus Protein G ist in dem Thal-BstNl- Fragment des Gens zwischen Nucleotiden 1,021 und 1,852 enthalten [Olsson et al (1987) Eur. J. Biochem., 168, Seiten 319 bis 324]. Die Thal-Stelle wurde in eine BamHI-Stelle durch Ligation eines synthetischen Oligonucleotid-BamHI-Linker (5'-CGGATCCG-3') umgewandelt, und das BstNI wurde unter Verwendung von Klenow-Polymerase offenendend gemacht, um das haftende Ende einzufüllen. Dieses Bruchstück wurde dann in den Multilinker von pTZ18R (Pharmacia, Schweden) geklont. Dieser Vektor wurde zunächst mit Xbal gespalten, wonach eine Klenow-Polymerasebehandlung folgte, um das haftende Ende einzufüllen, wonach Zersetzung mit BamHI folgte. Das resultierende Plasmid wurde als pUG26 bezeichnet. Um ein Durchlesen in das β-Galactosidasegen zu verhindern, wurde ein synthetisches Oligonucleotid, das einen Translationsstop ergab, in die PstI-Stelle geklont. Da das Protein G-Gen zwei PstI- Stellen enthält, wurde das folgende Schema verwendet. Plasmid pTZ18R wurde mit PstI gespalten, mit T4-Polymerase behandelt, um offene Enden zu erzeugen, und mit einem Universaltranslationslinker gebunden, UTL (Pharmacia, Schweden). Die Konstruktion wurde mit EcoRI und SalI zersetzt und an die isolierten 860-Basispaare EcoRI-SalI-Bruchstücke von pUG26 gebunden, um das Plasmid pUG27 zu ergeben. Das BamHI-HindIII-Bruchstück von pUG27 wurde in pEZZ8 eingeführt und ergab das Plasmid pEZZG mit einer Verschmelzung im Raster mit zwei auf Protein A basierenden synthetischen IgG-Bindungsdomänen. Die beiden ZZ-Bruchstücke wurden durch Spaltung mit Accl und erneute Ligation entfernt. Analyse des erhaltenen Plasmids ergab, daß eine homologe Rekombination zwischen den C1- und C2- Bereichen stattfand. Dies ergab das Plasmid pEG mit dem Protein A-Signalpeptid, das im Raster mit den IgG-Bindungsdomänen C1 und C3 des Protein G-Gens verschmolzen war. Der verkürzte Rezeptor ist schematisch in Fig. 1B gezeigt.
Das Plasmid pUG27 wurde mit HindIII und teilweise mit ClaI versetzt und ein Bereiche C2 und C3 kodierendes Genbruchstück wurde auf einem Agarosegel gereinigt. Dieses Bruchstück wurde zwischen AccI und HindIII in dem Plasmid pUC8 subkloniert.
Durch die Verwendung der EcoRI-Stelle nahe der AccI-Stelle in dem mp8-Multilinker von pUC8 und der HindIII-Stelle wurde das gleiche Bruchstück abgespalten. Es wurde in das gereinigte Vektorbruchstück von pEG eingesetzt, das vorher mit EcoRI und HindIII zersetzt worden war, um den schematisch in Fig. 1A gezeigten Vektor pC2C3 zu ergeben.
Um den AB-Bereich zu subklonen, wurde das Plasmid pSPG2 (Guss et al, 1986) mit EcoRI aufgeschlossen, wonach eine Behandlung mit Klenow-Polymerase folgte, um die haftenden Enden einzufüllen. Ein synthetischer SalI-Linker (GGTCGACC, Pharmacia, Schweden) wurde durch Ligation hinzugegeben. Ein Aufschluß mit SalI und PstI setzte ein 640 bp-Bruchstück frei, welches von einem Agarosegel isoliert und zwischen den gleichen Stellen in dem positiven Auswahlvektor p EMBLB- ein gesetzt wurde. Das Protein G-Genbruchstück wurde aus diesem Plasmid unter Verwendung der EcoRI-Stelle und der HindIII-Stelle nahe jeder Einsatzstelle herausgeschnitten und in das Vektorbruchstück von pEG wie oben eingeführt. Der resultierende Vektor pB1B2 (Fig. 1D) kodiert einen Teil des Proteins G von den letzten drei Resten des Bereiches E bis zu den ersten 24 von Bereich C1, gefolgt von den SPA-Kontrollsequenzen.
Für Affinitätschromatographie wurde IgG-Sepharose von der Pharmacia (Uppsala, Schweden) erhalten, und HSA-Sepharose wurde durch Bindung von gereinigtem HSA (Kabi-Vitrum, Stockholm, Schweden) an CNBr-aktivierte Sepharose (Pharmacia, Uppsala, Schweden) hergestellt, wie von Axen et al (1967) in Nature 214, Seiten 1302 bis 1304 beschrieben ist. Die HSA- und IgG-Sepharose wurden mit etwa 4 ml Gel in Säulen gestoßen. Die Säulen wurden mit PBST-Puffer äquilibriert.
Die Plasmide pEG, PC2C3 und pB1 B2 enthaltenden Stämme von E. coli wurden doppelt bei 37 ºC über Nacht in 200 ml TSB plus Ampicillin (70 mg/l) gezüchtet. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren mit 6000 g während 10 min pelletisiert, und das Obenschwimmende der Doppelexperimente wurde direkt in die IgG- bzw. HSA-Säulen eingefüllt. Die Säulen wurden danach mit 10 Säulenvolumina PBST-Puffer und 1 Volumen 5 mM NH&sub4;Ac, pH 5,5 gewaschen, letzteres, um die Pufferkapazität zu senken, was das effiziente Eluieren ermöglicht. Eluieren erfolgte mit 0,5 M HAc pH 2,8, und Fraktionen von 1 ml wurden aufgefangen. Das OD bei 280 nm gemessen und die relevanten Fraktionen (3 und 4) wurden gesammelt, vereinigt und lyophilisiert.
Nach dem Lyophilisieren wurden die verschiedenen Fraktionen in Beladungspuffer gelöst (2,5 % SDS, 5 % Dithiothreitol [DTT] und 0,01 % Bromphenolblau) und durch PHAST-Elektrophorese (Pharmacia, Uppsala, Schweden) auf Polyacrylamidgel mit einem Gefälle (8 bis 25 %) mit 5 % Na-Dodecylsulfat (SDS-PAGE), wie von dem Lieferanten beschrieben, analysiert.
Für den pEG enthaltenden Stamm von E. coli wurden die Proteine vor und nach der Reinigung durch SDS-PAGE analysiert. Wie aus Fig. 2 ersichtlich ist, macht das rekombinante SPG mehr als 50 % der extrazellulären Proteine aus (Spalte 1). Affinitätschromatographie entweder auf IGG-Sepharose (Spalte 2) oder auf HSA-Sepharose (Spalte 3) führte zu einer hohen Ausbeute von reinem rekombinantem Protein mit weniger als 10 % Zersetzung. Bemerke, daß das verkürzte SPG eine anomale Wanderungsgeschwindikgeit hat, was eine scheinbare Größe von etwa 33 kDa ergibt, welche wesentlich größer als die 22 kDa ist, die aus der Basissequenz vorhergesagt wird. Dies steht in Übereinstimmung mit früheren Beobachtungen (Guss et al, 1986).
Für die E. coli-Stämme, die pC2C3 und pB1B2 enthalten, sind die Ergebnisse der Elektrophorose des affinitätsgereinigten Materials in Fig. 3 gezeigt. Dies zeigt, daß das durch pB1B2 kodierte Protein mit 30,5 kDa nicht an IgG-Sepharose (Spalte 1) bindet, aber effizient an HSA (Spalte 2) gebunden wird. Im Gegensatz dazu bindet das durch pC2C3 kodierte Protein mit 17,2 kDa an IgG-Sepharose, aber nicht an HSA-Sepharose (Fig. 4, Spalten 1 und 2).
Diese Ergebnisse demonstrieren, daß die beiden Rezeptoraktivitäten von Protein G mit unterschiedlichen Teilen der Primärstruktur verbunden sind und funktionell unabhängig voneinander sind. Der für die Albuminbindungsaktivität verantwortliche Teil setzt sich aus dem homologen Bereich B zweimal wiederholt mit einem Bereich A auf jeder Seite, d. h. A-B- A-B-A (Fig. 1C), zusammen. Die letzten 64 Aminosäuren dieses Teils sind in das Albuminbindungsprotein eingeschlossen, das durch eine der Konstruktionen, pEG, kodiert ist, d. h. das meiste des letzten B-Bereiches und die Gesamtheit des letzten A-Bereiches. Daher ist ein relativ kleines Bruchstück von natürlichem Protein G ausreichend für eine HSA-Bindung.

Beispiel II

Reinigung eines Fusionsproteins unter Verwendung der Albuminbindungsaktivität

Der Expressionsvektor pEZZT308 wurde durch Einsetzen eines synthetischen Translationsund Transriptionsstoplinkers auf der Basis von trpt (5'-AAGCTTAAGTAAG- TAAGCCGCCAGTTCCGCTGGCGGCATTTTTTTTGATATCATCGAT-3', KabiGen AB, Stockholm, Schweden) zwischen HindIII und ClaI in dem Vektor pEZZ8 gemacht. Um pZZB1B2 zu erhalten, wurde das Bruchstück EcoRI-HindIII von pB1B2 in diesen Vektor eingesetzt, der vorher mit den gleichen Enzymen aufgeschlossen worden war. Dieses Plasmid kodiert ein Fusionsprotein zwischen ZZ, das sich von Staphylococcenprotein A herleitet (Nilsson et al, 1987 Prtein Engineering, Seiten 107 bis 113) und dem AB-Bereich von SPG, dem der SPA- Promotor und das Signalpeptid vorausgeht, wie schematisch in Fig. 1E gezeigt ist.
Der pZZB1B2 enthaltende Stamm von E. coli wurde in 200 ml TSB plus Ampicillin (70 mg/l) bei 37 ºC gezüchtet, und die Übernachtkultur wurde gesammelt, und die Zellen wurden durch Zentrifugieren mit 6000 G während 10 min geklärt. Das geklärte Medium wurde durch HSA-Sepharose, wie oben beschrieben, einer Affinitätsreinigung unterzogen, und das eluierte Material wurde durch PHAST-Elektrophorese analysiert. Wie in Fig. 4 gezeigt ist, konnte das Fusionsprotein mit 38,7 kDa gebunden und aus jeder der Säulen eluiert werden.
Diese Ergebnisse demonstrieren, daß ein heterologes Protein (ZZ) an Albumin bindet und durch HSA-Affinitätschromatographie gereinigt werden kann, wenn es mit dem albuminbindenden B1B2-Teil von Protein G verschmolzen wird.

Beispiel III

Immobilisierung und Reinigung eines Fusionsproteins unter Verwendung der Albuminbindungsaktivität

Plasmid pB1 B2 wurde mit Restriktionsenzymen Ecorl und Sail aufgeschlossen, mit Klenow-Polymerase behandelt und wieder einer Ligation unterzogen, um pB1B2 R/S zu ergeben. Ein synthetisches Oligonucleotid (TGCAAGATCTTTCAATTTCCCTATCCTCGA- GAATTCTAAGCTT und seine komplementäre Sequenz) wurde in das vorher mit PstI und Hindlll gespaltene pB1B2 R/S eingefügt, was zu Plasmid pB1B2HIV führte, das gegenüber PstI resistenz ist. Ein Mehrzweckklonungslinker, der sich von M13mp18 herleitet, wurde zwischen den Restriktionsstellen EcoRI und HindIII geklont, was zu der Expression des LacZ'-Gens führte, welches unmittelbar abstromwärts positioniert war. Das resultierende Plasmid wurde als pB1BHIVmp18 bezeichnet.
Um das alkalische Phosphatase kodierende Gen mit der das Albuminbindungsprotein kodierenden Sequenz zu verschmelzen, wurde Plasmid pCH39 als eine Quelle des Gens verwendet. Spaltung mit PstI setzte ein 3 kbp-Buchstück frei, das das Gen enthält, welches alkalische Phosphatase kodiert, angepaßt für die Fusion im Raster mit pB1B2HIVmp18, welches vorher mit PstI aufgeschlossen worden war. Während der Ligation wurde auch der Rest von pCH39 in eine Dreifachligation eingearbeitet, um zusätzlich zu der erwünschten Verschmelzung eine Plasmidkodierungsbeständigkeit nicht nur gegenüber Ampicillin, sondern auch gegenüber Tetracyclin zu ergeben. Proben von E. coli-Zellen, die diese Konstruktion der Bezeichnung pNP-1 enthielten, wurden bei der DSM in Braunschweig hinterlegt und erhielten die Hinterlegungsnummer DSM-4386.
Als eine Kontrolle wurde ein E. coli-Stamm verwendet, der das eine abgeschiedene alkalische Phosphatase kodierende Plasmid pASP enthielt. Die pNP-1 und pASP enthaltenden Stämme von E. coli wurden getrennt in 200 ml TSB, ergänzt mit Ampicillin (70 mg/I) und 0,9 %igem KH&sub2;PO&sub4;, um das alkalische Phosphatasechromosomengen zu unterdrücken, gezüchtet. In dem periplasmatischen Raum lokalisierte Proteine wurden unter Verwendung eines osmotischen Schockverfahrens nach bekannter Methode freigesetzt.
Die durch dieses Verfahren freigesetzte alkalische Phosphataseaktivität wurde für die beiden Proben durch Inkubieren mit p-Nitrophenylphosphat (Sigma 104-0), wie von dem Lieferanten beschrieben, bestimmt. Enzymatische Aktivität ergab Hydrolyse des p-Nitrophenol freigebenden Substrates, welche als die Veränderung der Absorption bei 410 nm gemessen werden kann. Eine Aktivitätseinheit wurde als die Absorptionsveränderung (410 nm) je Minute für ein Probenvolumen entsprechend 1 ml einer Übernachtkultur definiert.
Um zu bestimmen, ob das Fusionsprotein selektiv an HSA-haltiger Matrix immobilisiert werden kann, wurde der folgende Test durchgeführt. 3 ul der aus den osmotischen Schockverfahren der beiden Stämme erhaltenen Materialien wurden getrennt mit 0,5 ml TST und 50 ul HSA-Sepharose während 30 min bei Raumtemperatur vermischt. Nach dem Zentrifugieren mit 10 000 g/min wurde die Phosphataktivität in dem 0benschwimmenden bestimmt. Das Gel wurde zweimal mit 1 ml TST gewaschen, und die an das Gel gebundene Aktivität wurde, wie oben beschrieben, gemessen. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1 Plasmid Gesamt (U) % Aktivität nicht gebunden % Aktivität gebunden
In der Tabelle gibt "Gesamt" die durch das osmotische Schockverfahren freigesetzte Aktivität an. Die Ergebnisse zeigen, daß die alkalische Phosphatase aus pASP enthaltenden Zellen (kontrolle) nicht an HSA-Sepharose bindet. Im Gegensatz dazu bindet ein großer Teil des durch pNP-1 kodierten alkalischen Phosphatase-Fusionsproteins an die HSA-Matrix. Dies demonstriert, daß die Albuminbindungsdomäne benutzt werden kann, um ein heterologes Protein mit intakter enzymatischer Aktivität zu immobilisieren.
Das aus dem osmotischen Schockverfahren der beiden Stämme von E. coli erhaltene Material wurde getrennt einer Affinitätsreinigung durch HSA-Sepharosechromatographie unterzogen, wie in Beispiel 1 beschrieben ist. Kein Proteinmaterial wurde an die Säule unter Verwendung der obigen periplasmatischen Fraktion von E. coli-Stamm mit einem Gehalt von pASP (Kontrolle) gebunden, wie durch die Absorption des eluierten Materials bei 280 nm bestimmt wurde. Im Gegensatz dazu ergab der Stamm pNP-1 gebundenes Protein, das mit niedrigem pH-Wert eluiert werden konnte. Analyse dieses Materials durch PHAST-Elektrophorese ist in Fig. 5, Spalte 2 gezeigt. Diese ergibt eine stärkere Bindung der erwarteten Größe (71 kDa) etwas größer als von natürlicher alkalischer Phosphatase (Spalte 1), gereinigt durch Ionenaustausch und Gelfiltration, wie in Standardverfahren beschrieben.
Diese Ergebnisse demonstrieren, daß ein Protein, das aus einem mit dem albuminbindenden Bruchstück B1B2 aus Protein G verschmolzenen aktiven Enzym besteht, durch HSA- Sepharose immobilisiert und gereinigt werden kann.

Beispiel IV

Ein Doppelexpressionssystem für die Erzeugung, Analyse und Reinigung von Antikörpern zu einer wiederholten Sequenz des Plasmodium falciparum-Antigens Pf155/RESA¹

Ein synthetisches Genbruchstück, das ein Tetramer des Octapeptid-Repeats mit C-Ende EENVEHDA des Plasmodium falciparum-Merozoitantigens Pf155/RESA kodiert, wurde aus einer Konstruktion in dem Expressionsvektor pATH11 abgeleitet (L. Aslund, A. Sjölander, M. Wahlgren, B. Wahlin, W. Ruangjirachuporn, K. Berzins, H. Wigzell, P. Perlmann und U. Pettersson, 1987, Synthetic Gene Contruct Expressing a Repeated and Highly Immunogenic Epitope of the Plasmodium falciparum-Antigen Pf155, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:1399). Das Genbruchstück wurde mit den Restriktionsenzymen XmaI und HindIII herausgeschnitten und in Plasmid pEZZT308 (beschrieben im Beispiel 11) gebunden, welches vorher mit den gleichen Enzymen aufgeschlossen worden war. Der Expressionsvektor pEZZT308 kodiert eine zweiwertige synthetische IgG-Bindungsdomane, die sich von SPA herleitet, wobei Transkriptions-, Translations- und Sekretionssignale des SPA-Operon vorausgehen. Der resultierende Vektor, pEZZM1, kodiert ein Fusionsprotein, das aus einer zweiwertigen IgG-Bindungsdomäne und dem Octapeptid-Repeat besteht. Dieses Fusionsprotein wurde als ZZ-M1 bezeichnet.
Das das EENVEHDA-Repeat kodierende Genfragment wurde unter Verwendung der Restriktionsenzyme EcoRI und HindIII aus dem Plasmid pEZZM1 herausgeschnitten. Die gleichen Enzyme wurden verwendet, um das Plasmid pB1B2HIVmp18 (in Beispiel III beschrieben) herauszuschneiden, in welches das Bruchstück eingebunden worden war. Der resultierende Vektor pB1B2M1 kodiert ein Fusionsprotein, das als BB-M1 bezeichnet wird und aus dem Albuminbindungsbereich von Stroptococcenprotein 6 sowie dem Octapeptid-Repeat besteht.
E. coli-Zellen, die die verschiedenen Konstruktionen beherbergen, wurden über Nacht bei 37 ºC in 500 ml tryptischer Sojabrühe (30 g/l), ergänzt mit Ampicillin (70 mg/l), gezüchtet. Zellen wurden bei 6000 g pelletisiert, und periplasmatische Proteine wurden durch osmotischen Schock freigesetzt. Präparate aus den beiden Kulturen wurden direkt auf Säulen von 5 ml IgG-Sepharose (Pharmacia, Schweden) oder HSA-Sepharose (see Beispiel I) aufgebeben.
Analyse des gesamten periplasmatischen Gehaltes durch SDS-PAGE zeigte, daß das rekombinante Produkt das Hauptprotein war, welches in beiden Expressionssystemen erzeugt wurde (Fig. 6, Spalten 1 und 3).
Weiße Kaninchen von Neuseeland wurden intramuskulär mit 100 pg des Fusionsproteins ZZ-M1 in CFA oder ohne Zusatzstoff immunisiert. Für Zusatzinjektionen, die 4 und 30 Wochen später gegeben wurden, wurde IFA anstelle von CFA verwendet. Den Kaninchen wurde 3 Wochen nach der ersten Injektion und 1 Woche nach jeder Zusatzinjektion Blut abgenommen. Antiseren aus der Blutabnahme in der Woche 31 wurden verwendet. IgG wurde auf einer Protein A-Sepharosesäule (Pharmacia) isoliert.
Die Kapazität von BB-M1, spezifische Antikörper zu binden, wurde in ELISA gemessen. Polystyrol-Mikrotiterplatten (Dynatech, Alexandria, Va., USA) wurden mit HSA (10 pg/ml) beschichtet, und man ließ sich BB-M1 an das HSA während 3 h bei 37 ºC binden. Kontrollplatten wurden mit dem sich von Protein G herleitenden Teil BB-M1 beschichtet. Nach dem Blockieren mit 0,5 %igem BSA in PBS während 3 h bei 37 ºC wurden die beschichteten Platten 1 h bei 37 ºC mit verschiedenen Verdünnungen des Kaninchenantiserums inkubiert, das von dem immunisierten Kaninchen erhalten wurde. Nach Inkubation während 1 h bei 37 ºC mit Schaf-anti-Kaninchen-IgG, konjugiert mit alkalischer Phosphatase, und während 30 min bei Raumtemperatur mit p-Nitrophenylphosphat wurde die resultierende Farbe bei 405 nm registriert.
Die Konzentration von BB-M1 konnte ohne Verminderung der antikörperbindenden Kapazität des Antigens auf 200 ng/ml gesenkt werden, und 8 ng/ml BB-M1 waren ausreichend, um reaktive Antikörper festzustellen (siehe Fig. 7).
Die Reaktivität der Kaninchenantiseren mit EENVEHDA-Repeat wurde in ELISA unter Verwendung des Fusionsproteins BB-M1 bei einer Konzentration von 1000 ng/ml als Überzugsantigen analysiert. Wie in Fig. 8 gezeigt erzeugten die mit ZZ-M1 in CFA oder ohne Zusatzstoff immunisierten Kaninchen Antikörper, die mit dem EENVEHDA-Repeat in diesem Test reagierten.
Bindung des Fusionsproteins BB-M1 an immobilisiertes HSA könnte ein effizientes System für Affinitätsreinigung von peptidspezifischen Antikörpern liefern. Das immobilisierte HSA kann als ein Spacer dienen, und die Bindung des Fusionsproteins mit Hilfe des sich von Protein G herleitenden Teils von BB-M1 sollte die Antikörperbindungskapazität des EENVEHDA- Repeats nicht beeinflussen. Um diese Hypothese zu prüfen, wurde gereinigtes BB-M1 an HSA gebunden, welches an CNBr-aktivierte Sepharose (Pharmacia) (3,8 mg BB-M1/15 mg Albumin/ml Perlenpackung) und durch Glutaraldehyd (Endkonzentration 0,5 %) mit HSA vernetzt war, gebunden. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 1 %igem Glycin gestoppt. Das Gel wurde in aufeinanderfolgenden Stufen mit PBS, 0,2 M Essigsäure, pH 3,3, und 0,2 M Glycinpuffer, pH 2,8 intensiv gewaschen. Eine hohe Ausbeute an kovalent gebundenem BB- M1 wurde bei Verwendung dieses Verfahrens erhalten. Weniger als 15 % des aufgebrachten BB-M1 konnten aus der Matrix durch intensives Waschen bei niedrigem pH-Wert eluiert werden. Für Affinitätschromatographie wurden 2 mg der aus Kaninchenserum isolierten IgG- Fraktion mit 1 ml Packungsperlen, die auf eine Säule aufgebracht wurden, inkubiert. Nach intensivem Waschen mit PBS wurden gebundene Antikörper mit 0,2 M Glycinpuffer eluiert, wonach mit 3 M KSCN eluiert wurde. Der Puffer der Eluate wurde in PBS mit einem Gehalt von 0,2 % BSA auf einer PD10-Säule (Pharmacia) gemäß den Instruktionen des Herstellers geändert.
Das gesamte IGG, die Durchflußfraktion und die mit 0,2 M Glycinpuffer aus Kaninchenantiseren eluierte Fraktion wurden hinsichtlich der Reaktivität mit BB-M1 in ELISA getestet. Fig. 9 zeigt die Ergebnisse eines Experimentes, in welchem Serum aus einem mit ZZ-M1 in CFA immunisierten Kaninchen für Affinitätsreinigung verwendet wurde. Es wurde keine Antikörperreaktivität mit BB-M1 in der Durchflußfraktion beobachtet. Weniger als 0,1 % des aufgebrachten IGG wurde mit 0,2 M Glycinpuffer (Daten nicht gezeigt) eluiert. Wie in Fig. 6 gezeigt ist, wurde eine hohe Ausbeute der BB-M1-Reaktivität in der Glycinfraktion gewonnen.
Diese Ergebnisse demonstrieren, daß die Albuminbindungsdomänen von SPG verwendet werden können, um ein Fusionsprotein, welches ein rekombinantes Peptid einschließt, an einem festen, HSA enthaltenden Träger spezifisch zu immobilisieren. Das immobilisierte Peptid kann weiter für Analyse und Reinigung von Antikorpern fur das Peptid verwendet werden. Eine schematische Abbildung des in diesem Beispiel beschriebenen Konzeptes findet sich in Fig. 10.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung und Isolierung eines Fusionsproteins oder Polypeptids, das in der Lage ist, selektiv an Serumalbumin zu binden, gekennzeichnet durch die Stufen, in denen man

a) einen rekombinanten Vektor aufbaut, der eine erste für ein Serumalbuminbindungs-Polypeptidfragment kodierende erste DNA-Sequenz umfaßt, die funktionsmäßig mit einer für ein erwünschtes Protein oder Polypeptid kodierenden zweiten DNA-Sequenz verbunden ist,

b) einen verträglichen Wirt mit dem rekombinanten Vektor derart transformiert, daß die für das Fusionsprotein oder Polypeptid kodierende kombinierte DNA- Sequenz durch den Wirt exprimiert werden kann, und den transformierten Wirt in einem geeigneten Wachstumsmedium züchtet, um das Fusionsprotein oder Popypeptid zu erzeugen, und

c) das Fusionsprotein oder Polypeptid isoliert, indem man sich seine Serumalbuminbindungskapazität zunutze macht.

2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Isolierung des Proteins oder Polypeptids durch Adsorption an einem Serumalbumin enthaltenden Trägermaterial und gegebenenfalls Desorption des Proteins oder Polypeptids von dem Trägermaterial erfolgt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, bei dem die erste DNA-Sequenz von einer DNA- Sequenz gebildet wird, die aus dem für Protein G kodierenden Gen stammt.

4. Verfahren nach Anspruch 3, bei dem die erste DNA-Sequenz wenigstens eines der Segmente A1, B1, A2, B2, A3, wie in Fig. 1 gezeigt, umfaßt.

5. Verfahren nach Anspruch 4, bei dem die erste DNA-Sequenz Segmente B2 und A3, wie in Fig. 1 gezeigt umfaßt.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 5, bei dem die Desorption des Fusionsproteins oder Polypeptids von dem Trägermaterial durch Senkung des pH-Wertes unter etwa 3 bewirkt wird.