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Die
vorliegende Erfindung betrifft Klonieren, Sequenzieren und Exprimieren
von Heparinase III aus Flavobacterium heparinum.
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Die
Heparin- und Heparansulfat-Familie von Molekülen umfasst Glycosaminoglycane
repetitiver Glucosamin- und Hexuronsäurereste, entweder Iduronsäure oder
Glucuronsäure,
in denen die Position 2, 3 oder 6 von Glucosamin oder die Position
2 der Hexuronsäure
sulfatiert sein kann. Variationen beim Ausmaß und dem Ort der Sulfatierung
sowie die Konformation des alternierenden Hexuronsäurerestes
führen
zu hochgradiger Heterogenität
der Moleküle
innerhalb dieser Familie. Herkömmlicherweise
bezieht sich Heparin auf Moleküle,
welche einen hohen Sulfatgehalt aufweisen, 2,6 Sulfate pro Disaccharid,
und eine höhere
Menge an Iduronsäure.
Umgekehrt enthält
Heparansulfat geringere Mengen an Sulfat, 0,7 bis 1,3 Sulfate pro
Disaccharid, und weniger Iduronsäure.
Dennoch gibt es Varianten dazwischenliegender Zusammensetzung, wobei noch
nicht alle Heparine aus allen biologischen Quellen charakterisiert
worden sind.
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Spezifische
Sulfatierungs-/Glycosylierungsmuster von Heparin wurden mit biologischer
Funktion in Zusammenhang gebracht, wie die Antithrombin-Bindungsstelle, die
von Choay et al., Thrombosis Res. 18:573-578 (1980), beschrieben
wurde, und die Fibroblastwachstumsfaktor-Bindungsstelle, die von
Turnbull et al., J. Biol. Chem. 267:10337-10341 (1992) beschrieben
wurde. Aus diesen Beispielen geht deutlich hervor, dass die Wechselwirkung
von Heparin mit bestimmten Molekülen
aus der Konformation resultiert, die durch spezifische Sequenzen
ausgelöst
wird, und nicht nur auf elektrostatische Wechselwirkungen zurückzuführen ist,
die durch seine Zusammensetzung mit hohem Sulfatanteil ausgelöst werden.
Heparin geht eine Wechselwirkung mit einer Reihe von Säugetier-Molekülen ein,
wodurch mehrere biologische Ereignisse wie Hämostase, Zellproliferation,
Migration und Adhäsion
moduliert werden, wie von Kjellen und Lindahl, Ann. Rev. Biochem.
60: 443-475 (1991) und Burgess und Macaig, Ann. Rev. Biochem. 58:
575-606 (1989) zusammengefasst ist. Heparin, das aus Rinderlungen
und Schweine-Eingeweiden extrahiert wurde, wurde als eine gerinnungshemmende
Substanz verwendet, seit seine Antithrombose-Eigenschaften von McLean,
Am. J. Physio1.41: 250-257 (1916) entdeckt wurden. Heparin und chemisch
modifizierte Heparine werden fortlaufend im Hinblick auf medizinische
Anwendungen in den Bereichen der Wundheilung und der Behandlung
von Gefäßerkrankungen
untersucht.
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Heparin
abbauende Enzyme, die als Heparinasen oder Heparinlyasen bezeichnet
werden, wurden in mehreren Mikroorganismen identifiziert, einschließlich: Flavobacterium
heparinum, Bacteriodes sp. und Aspergillus nidulans, so wie von
Linhardt et al., Appl. Biochem. Biotechnol. 12: 135-177 (1986) zusammengefasst.
Heparansulfat abbauende Enzyme, die als Heparitinasen oder Heparansulfatlyasen
bezeichnet werden, wurden in Plättchen
(Oldberg et al., Biochemistry 19: 5755-5762 (1980)), Tumorzellen
(Nakajima et al., J. Biol. Chem. 259: 2283-2290 (1984)) und Endothelialzellen
(Gaal et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 161: 604-614 (1989))
entdeckt. Säugetier-Heparanasen
katalysieren die Hydrolyse des Kohlenhydratgrundgerüsts von
Heparansulfat bei der Hexuronsäure
(1 → 4)-Glucosamin-Kopplung
(Nakajima et al., J. Cell. Biochem. 36: 157-167 (1988)) und werden
durch das stark sulfatierte Heparin gehemmt. Genaue biochemische
Charakterisierungen dieser Enzyme wurden bisher jedoch durch den
Mangel eines Verfahrens zum Erhalten homogener Zubereitungen der
Moleküle
verhindert.
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Flavobacterium
heparinum produziert Heparin und Heparansulfat abbauende Enzyme,
die als Heparinase I (E.C. 4.2.2.7), wie durch Yang et al., J. Biol.
Chem. 260 (3): 1849-1857 (1985) beschrieben, Heparinase II, wie
durch Zimmermann und Cooney, U.S.-Patentschrift Nr. 5,169,772 beschrieben,
und Heparinase III (E.C. 4.2.2.8), wie von Lohse und Linhardt, J.
Biol. Chem. 267: 24347-24355 (1992) beschrieben, bezeichnet werden.
Diese Enzyme katalysieren eine eliminierende Spaltung der (α1 → 4) Kohlenhydratbindung
zwischen Glucosamin- und Hexuronsäureresten im Heparin/Heparansulfat-Grundgerüst. Die
drei Enzymvarianten unterscheiden sich in ihrer Wirkung auf spezifische
Kohlenhydratreste. Heparinase I spaltet bei α-D-GlcNp2S6S(1 →4)α-L-IdoAp2S,
Heparinase III bei α-D-GlcNp2Ac(oder2S)6OH(1→4)β-D-GlcAp
und Heparinase II bei einer von den zwei Verbindungen, wie von Desai
et al., Arch. Biochem. Biophys. 306(2):461-468 (1993), beschrieben.
Sekundäre
Spaltstellen für
jedes Enzym wurden ebenfalls von Desai et al. beschrieben.
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Heparinase
I wurde klinisch verwendet, um die gerinnungshemmenden Eigenschaften
von Heparin zu neutralisieren, wie von Baugh und Zimmermann, Perfusion
Rev. 1(2):8-13, 1993, zusammengefasst ist. Bei Heparinase I und
III wurde gezeigt, dass sie Zellwachstumsfaktor-Wechselwirkungen,
wie durch Bashkin et al., J. Cell Physiol. 151:126-137 (1992) gezeigt,
und Zell-Lipoprotein-Wechselwirkungen modulieren, wie von Chappell
et al., J. Biol. Chem. 268(19):14168-14175 (1993), gezeigt. Die
Verfügbarkeit
von Heparin abbauenden Enzymen mit ausreichender Reinheit und Menge
könnte
zur Entwicklung von diagnostisch und therapeutisch wichtigen Formulierungen
führen.
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ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung wird eine isolierte, nicht-glycosylierte Heparinase III
bereitgestellt, welche die Aminosäure-Sequenz einer reifen Heparinase
III, die einen Methioninrest unmittelbar vor der ersten Aminosäure der
reifen Heparinase III besitzt, oder nicht-glycosylierte funktionelle
Derivate davon, die Heparansulfat – aber nicht Heparin – abbauen,
aufweist.
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Vorzugsweise
enthält
die Heparinase III der vorliegenden Erfindung die Aminosäure-Sequenz
gemäß SEQ ID
NO:4, die bei Glutamin in Position 25 beginnt und einen Methioninrest
unmittelbar vor dem Glutamin enthält.
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Die
Erfindung stellt auch einen Antikörper oder ein Fragment davon,
welcher für
eine Heparinase III des ersten Aspektes spezifisch ist, und die
Heparinase III des ersten Aspektes zur therapeutischen oder diagnostischen
Verwendung bereit.
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Vor
der vorliegenden Erfindung waren teilweise gereinigtes Heparinase
II und III verfügbar,
wobei jedoch ihre Aminosäure-Sequenzen
unbekannt waren. Klonieren dieser Enzyme war aufgrund der Toxizität für die Wirtszellen
schwierig. Die gegenwärtigen
Erfinder waren in der Lage, die Gene für Heparinase II und III zu klonieren
und stellen hierin ihre Nukleotid- und Aminosäuresequenzen bereit.
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Es
wird ein Verfahren für
die Isolierung von hoch gereinigten, Heparin- und Heparansulfat
abbauenden Enzymen aus F. heparinum beschrieben. Die Charakterisierung
der Proteine zeigte, dass Heparinase I, II und III Glycoproteine
sind. Alle drei Proteine sind an ihrem N-terminalen Aminosäurerest
modifiziert. Antikörper,
die durch Injizieren von gereinigten Heparinasen in Kaninchen erzeugt
wurden, ergaben Anti-Seren, welche einen hohen Grad an Kreuzreaktivität gegenüber Proteinen
aus F. heparinum aufwiesen. Polyklonale Antikörper wurden durch Affinitätschromatographie in
Fraktionen, welche den Aminosäureanteil
der Proteine binden, und eine Fraktion getrennt, welche die post-translationale
Modifikation bindet, welche die Verwendung dieser Antikörper ermöglicht,
um die nativen und die rekombinanten Formen jedes Heparinaseproteins
deutlich zu unterscheiden.
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Informationen über die
Aminosäure-Sequenz
wurden verwendet, um Oligonukleotide zu synthetisieren, die anschließend in
einer Polymerasekettenreaktion (PCR) verwendet wurden, um einen
Teil der Heparinase-II- und Heparinase-III-Gene zu amplifizieren.
Amplifizierte Regionen wurden beim Versuch verwendet, Klone aus
einer λDASH-II-Gen-Bibliothek
zu identifizieren, welche F. heparinum genomische DNA enthielt.
Es wurde eine natürliche
Auswahl gegen Klone beobachtet, welche die gesamten Heparinase-II-
und Heparinase-III-Gene enthielten. Diese wurde umgangen, indem
Abschnitte des Heparinase-II-Gens getrennt kloniert und Wirtsstämme auf
stabilen Erhalt vollständiger
Heparinase-III-Klone überprüft wurden.
Die Expression von Heparinase II und III wurde durch die Verwendung
eines Vektors erzielt, der eine modifizierte Ribosomen-Bindungsstelle
enthält,
von der nachgewiesen wurde, dass sie die Expression von Heparinase
I auf bedeutende Pegel erhöht.
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Dieses
Patent beschreibt die Gen- und Aminosäure-Sequenzen für Heparinase
III aus F. heparinum, die in Verbindung mit geeigneten Expressionssystemen
verwendet werden können,
um die Enzyme zu produzieren. Ferner wird eine modifizierte Ribosomen-Bindungssequenz
beschrieben, die verwendet wird, um Heparinase I, II und III zu
exprimieren.
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KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
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1 zeigt die Modifikationen
an der tac-Promotor-Ribosomenbindungsregion,
die für
den Expressionspegel von Heparinase I evaluiert wurden. Die ursprüngliche
Sequenz, wie in pBhep gefunden, und die modifizierten Sequenzen,
wie in pGhep und pΔ4hep
gefunden, werden mit unterstrichenen Shine-Dalgarno-Sequenzen (S-D) und unterstrichenem
Heparinase-I-Gen-Startcodon dargestellt. Die Lücke (in Nukleotiden, nt) zwischen
diesen Regionen wird unterhalb jeder Sequenz angezeigt. Die Ribosomen-Bindungsregion
für pGB enthält kein
Startcodon und weist eine BamHI-Stelle (unterstrichen) auf anstelle
der EcoRI-Stelle (GAATTC), die in pGhep gefunden wurde.
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2 zeigt die Konstruktion
von Plasmiden, die verwendet werden, um das Heparinase-II-Gen aus Flavobacterium
heparinum zu sequenzieren. Restriktionsstellen sind: N-NotI, Nc
=NcoI, S =SaII, B = BamHI, P = PstI, E=EcoRi, H = HindIII, C = ClaI
und K = KpnI.
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3 zeigt die Konstruktion
von pGBH2, einem Plasmid, das imstande ist, die Expression von aktiver Heparinase
II in E. coli aus Tandem-Tac-Promotoren (doppelte Pfeilköpfe) zu
leiten. Restriktionsstellen sind: B = BamHI, P = Pst I.
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4 zeigt die Nukleinsäuresequenz
für das
Heparinase-II-Gen aus Flavobacterium heparinum (SEQ ID NO: 1).
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5 zeigt die Aminosäuresequenz
für Heparinase
II aus Flavobacterium heparinum (SEQ ID NO:2). Die Leader-Peptidsequenz
ist unterstrichen. Das reife Protein startet bei Q-26. Die Peptide
2A, 2B bzw. 2C sind an ihren entsprechenden Positionen innerhalb
des Proteins angezeigt.
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6 zeigt die Konstruktion
von Plasmiden, die verwendet werden, um das Heparinase-III-Gen aus Flavobacterium
heparinum zu sequenzieren. Restriktionsstellen sind: S=SaII, B =
BamHI, P = PstI, E = EcoRI, H = HindIII, C = ClaI und K = KpnI.
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7 zeigt die Konstruktion
von pGBH3, einem Plasmid, das imstande ist, die Expression von aktiver Heparinase
III in E. coli aus einem Tandem-Taq-Promotor (Doppelpfeilköpfe) zu
leiten. Restriktionsstellen sind. S = SaII, B = BamHI, P = PstI,
E = EcoRI, H = HindIII, Bs = BspEI, C = ClaI und K = KpnI.
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8 zeigt die Nukleinsäuresequenz
für das
Heparinase-III-Gen aus Flavobacterium heparinum (SEQ ID NO:3).
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9 zeigt die Aminosäuresequenz
für Heparinase
III aus Flavobacterium . heparinum (SEQ ID NO: 4). Die Leader-Peptidsequenz
ist unterstrichen. Das reife Protein beginnt bei Q-25. Die Peptide
3A, 3B und 3C sind an ihren entsprechenden Positionen innerhalb
des Proteins angezeigt.
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DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
DER ERFINDUNG
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Zum
besseren Verständnis
der Beschreibung und der Ansprüche,
einschließlich
des Umfangs der entsprechenden Begriffe, werden folgende Definitionen
bereitgestellt. Gen. Unter dem Begriff „Gen" ist eine DNA-Sequenz zu verstehen,
welche durch ihre Matrizen- oder Boten-RNA eine Sequenz von Aminosäuren codiert,
die für ein
spezifisches Peptid charakteristisch ist. Ferner steht der Begriff
für dazwischenliegende, nicht-codierende
Regionen sowie für
regulatorische Regionen und kann 5'- und 3'-Enden einschließen.
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Gensequenz.
Der Begriff „Gensequenz" bezieht sich im
Allgemeinen auf ein DNA-Molekül,
das eines oder mehrere Gene oder Genfragmente enthält, sowie
auf ein DNA-Molekül,
welches eine nicht-transkribierte oder nicht-translatierte Sequenz
enthält.
Ferner soll der Begriff alle Kombinationen von Genen, Genfragmenten,
nichttranskribierten Sequenzen oder nicht-translatierten Sequenzen
miteinschließen,
welche sich auf demselben DNA-Molekül befinden.
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Die
vorliegenden Sequenzen können
aus einer Reihe von Quellen gewonnen werden, einschließlich DNA,
synthetischer DNA, RNA oder Kombinationen davon. Solche Gensequenzen
können
genomische DNA aufweisen, welche natürlich vorkommende Introne enthalten
kann oder nicht. Außerdem
kann eine solche genomische DNA in Verbindung mit Promotor-Regionen
oder Poly-A-Sequenzen erhalten werden. Die Gen-Sequenzen, genomische
DNA oder cDNA können
auf verschiedene Weise erhalten werden. Genomische DNA kann aus
geeigneten Zellen, wie zum Beispiel aus Hirnzellen, mit Hilfe auf
dem Fachgebiet wohl bekannter Mittel extrahiert und gereinigt werden.
Alternativ dazu kann mRNA aus einer Zelle isoliert und verwendet
werden, um cDNA durch Umkehr-Transkription oder andere Mittel herzustellen.
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Rekombinante
DNA. Unter dem Begriff „rekombinante
DNA" ist ein Molekül zu verstehen,
das durch In-Vitro-Spleißen
von cDNA oder einer genomischen DNA-Sequenz rekombiniert worden ist.
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Klonierungshilfsmittel.
Darunter versteht man eine Plasmid- oder Phagen-DNA oder eine andere DNA-Sequenz,
die imstande ist, in einer Wirtszelle zu replizieren. Das Klonierungshilfsmittel
wird durch eine oder mehrere Endonuklease-Erkennungsstellen, an
denen seine DNA-Sequenzen in einer bestimmbaren Weise ohne Verlust
einer wesentlichen biologischen Funktion der DNA geschnitten werden
können,
charakterisiert, welche einen Marker enthalten können, der zur Verwendung bei
der Identifikation von transformierten Zellen nützlich ist. Zu den Markern
gehören
zum Beispiel Tetracyclinresistenz oder Ampicillinresistenz. Der
Begriff Vektor kann verwendet werden, um ein Klonierungshilfsmittel
zu bezeichnen.
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Expressionskontrollsequenz.
Darunter versteht man eine Nukleotidsequenz, welche die Expression von
strukturellen Genen kontrolliert oder reguliert, wenn sie mit diesen
Genen wirkungsmäßig verbunden
ist. Dazu zählen
lac-System, der trp-System-Hauptoperator
und Promotorregionen des Phagen Lambda, die Kontrollregion von fd-Hüllprotein und andere Sequenzen,
von denen bekannt ist, dass sie die Expression von Genen in prokaryotischen
oder eukaryotischen Zellen steuern.
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Expressionshilfsmittel.
Darunter versteht man ein Hilfsmittel oder einen Vektor, ähnlich einem
Klonierungshilfsmittel, das jedoch in der Lage ist, ein Gen zu exprimieren,
das in das Expressionshilfsmittel nach Transformation in einen Wirt
geklont wurde. Das klonierte Gen wird für gewöhnlich unter die Kontrolle
von (d. h. wirkungsmäßig verbunden
mit) bestimmten Kontrollsequenzen, wie Promotorsequenzen, gegeben.
Die Expressionskontrollsequenzen werden variieren, je nachdem, ob
der Vektor ausgelegt ist, um das wirkungsmäßig verbundene Gen in einem
prokaryotischen oder eukaryotischen Wirt zu exprimieren, und sie
können
zusätzlich transkriptionale
Elemente wie Verstärkerelemente,
Terminationssequenzen, Gewebespezifizitätselemente und/oder translationale
Start- und Terminationsstellen enthalten.
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Promotor.
Der Begriff „Promotor" steht für eine DNA-Sequenz,
die von einer RNA-Polymerase erkannt werden kann. Die Gegenwart
einer solchen Sequenz ermöglicht
es der RNA-Polymerase, zu binden und die Transkription von wirkungsmäßig verbundenen
Gensequenzen zu starten.
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Promotorregion.
Der Begriff „Promotorregion" schließt im weiteren
Sinne sowohl die Promotorsequenz als auch Gensequenzen ein, die
für den
Start der Transkription erforderlich sein können. Die Gegenwart einer Promotorregion
ist daher ausreichend, um die Expression einer wirkungsmäßig verbundenen
Gensequenz auszulösen.
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Wirkunsgmäßig verbunden.
So wie hierin verwendet, bedeutet der Begriff „wirkungsmäßig verbunden", dass der Promotor
den Start der Genexpression steuert. Ein Promotor ist wirkungsmäßig mit
einer Sequenz einer proximalen DNA verbunden, wenn bei Einführung in
eine Wirtszelle der Promotor die Transkription der proximalen DNA-Sequenz
oder -Sequenzen in eine oder mehrere RNA-Arten bestimmt. Ein Promotor
ist mit einer DNA-Sequenz wirkungsmäßig verbunden, wenn der Promotor
in der Lage ist, die Transkription dieser DNA-Sequenz zu starten.
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Prokaryot.
Der Begriff „Prokaryot" steht für alle Organismen
ohne echten Zellkern, einschließlich
Bakterien.
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Wirt.
Der Begriff „Wirt" steht nicht nur
für Prokaryote,
sondern auch für
solche Eukaryote, wie Hefe und faserförmige Pilze, sowie für Pflanzen-
und Tierzellen. Die Begriffe schließen somit Organismen oder Zellen ein,
die Empfänger
eines replizierbaren Expressionshilfsmittels sind.
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Die
vorliegende Erfindung beruht auf dem Klonieren und der Expression
eines zuvor nicht klonierten Enzyms. Obwohl Heparinase III schon
früher
teilweise gereinigt wurde, war keine Aminosäure-Sequenz verfügbar. Die
Erfindung offenbart insbesondere das Klonieren, Sequenzieren und
die Expression von Heparinase III aus Flavobacterium heparinum und
die Verwendung einer modifizierten Ribosomen-Bindungsregion für das Exprimieren dieses Gens.
Zusätzlich
zu den Nukleotidsequenzen wird auch die Aminosäure-Sequenz von Heparinase
III bereitgestellt. Die Erfindung schafft exprimierte Heparinase
III sowie Verfahren zum Exprimieren dieser Enzyme.
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Das
Klonieren erfolgte unter Verwendung von degenerierten und „Guessmer"-Nukleotidprimern, die aus Aminosäure-Sequenzen
von Fragmenten der Heparinasen gewonnen wurden, die wie unten detailliert
beschrieben gereinigt worden sind. Die Aminosäure-Sequenzen waren in der
Vergangenheit nicht verfügbar.
Das Klonieren erwies sich aufgrund des unerwarteten Problems der
F. heparinum-DNA-Toxizität
in E. coli als besonders schwierig. Die Erfinder entdeckten Techniken,
um dieses Problem zu lösen,
so wie unten im Detail beschrieben. Auf der Grundlage dieser Offenbarung
kann ein Fachmann ohne weiteres zusätzliche Heparinasen und andere
Proteine aus F. heparinum oder aus zusätzlichen Quellen unter Anwendung
der hierin beschriebenen neuartigen Verfahren klonieren.
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Die
Expression der Heparinasen wird hierin offenbart. Um Heparinase
I, II und III zu exprimieren, sind transkriptionale und translationale
Signale, die für
einen geeigneten Wirt erkennbar sind, erforderlich. Die klonierte
Heparinase codierenden Sequenzen, die durch die oben beschriebenen
Verfahren vorzugsweise in Doppelstrangform erhalten wurden, können wirkungsmäßig mit
Sequenzen verbunden werden, welche die transkriptionale Expression
in einem Expressionsvektor kontrollieren, und in eine Wirtszelle,
entweder ein Prokyaryot oder Eukaryot, eingeführt werden, um rekombinante
Heparinasen oder ein funktionelles Derivat davon zu erzeugen. In
Abhängigkeit
davon, welcher Strang der Heparinase codierenden Sequenz wirkungsmäßig mit den
Sequenzen verbunden ist, die die transkriptionale Expression kontrollieren,
ist es auch möglich,
Heparinase-Gegensinn-RNA oder ein funktionelles Derivat davon zu
exprimieren.
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Für die Expression
von Heparinase I, II und III in E. coli wurden Vektoren konstruiert,
in denen die Expression durch zwei Wiederholungen der tac-Promotoren
angetrieben wurde. Modifikationen der Ribosomen-Bindungsregion dieses
Promotors wurden durch Einführen
von Mutationen mit der Polymerasekettenreaktion hergestellt. In
einer bevorzugten Modifikation des Expressionsvektors wurde die
Minimal-Konsens-Shine-Dalgarno-Sequenz
verbessert, indem eine einzelne Mutation (AGGAA → AGGAG) eingeführt wurde,
was den weiteren Vorteil hatte, dass die Anzahl an Nukleotiden zwischen
der Shine-Dalgarno-Sequenz und dem ATG-Startcodon verringert wurde.
Es wurden weitere Modifikationen unter Verwendung von PCR hergestellt,
wobei die Lücke
zwischen der Shine-Dalgarno-Sequenz und dem Startcodon weiter reduziert
wurde. Unter Anwendung derselben Techniken können zusätzliche Modifikationen in dieser
Region, einschließlich
Insertionen und Deletionen, erzeugt werden, um zusätzliche
Heparinase-Expressionsvektoren zu erzeugen. Infolgedessen wird ein
Expressionsvektor für
die Expression von Heparinasen bereitgestellt, der eine modifizierte Ribosomen-Bindungsregion
aufweist, welche eine 5-Basenpaar-Shine-Dalgarno-Sequenz, eine 9-Basenpaar-Abstandsregion
zwischen der Shine-Dalgarno-Sequenz
und dem ATG-Startcodon und eine rekombinante Nukleotidsequenzcodierung
enthält.
Ferner werden Modifikationen an diesem Vektor bereitgestellt, welche das Ändern der
Länge und
Sequenz der Shine-Dalgarno-Sequenz und das Reduzieren des Abstands
zwischen der Shine-Dalgarno-Sequenz und dem Startcodon auf 8, 7,
6, 5, 4 oder weniger Nukleotide, aufweisen.
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Die
Expression der Heparinasen in unterschiedlichen Zellen kann zu unterschiedlichen
post-translationalen Modifikationen führen, die die Eigenschaften
der Heparinasen oder eines funktionellen Derivats davon in eukaryotischen
Zellen, und insbesondere Säugetier-,
Insekten- und Hefezellen, verändern
können.
Besonders bevorzugte eukaryotische Wirte sind Säugetierzellen, entweder in
vivo, in Tieren oder in Gewebekultur. Säugtierzellen stellen post-translationale
Modifikationen an rekombinanten Heparinasen bereit, zu denen Falten
und/oder Glycosylierung an Stellen zählen, die ähnlich oder gleich jener Stelle
für die
nativen Heparinasen sind. Die meisten vorzugsweise Säugetier-Wirtszellen
schließen
Hirn- und Neuroblastomazellen ein.
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Man
sagt von einem Nukleinsäuremolekül, wie einer
DNA, dass es „imstande
ist, ein Polypeptid zu exprimieren", wenn es Expressionskontrollsequenzen
enthält,
die transkriptionale regulatorische Informationen enthalten, und
wenn diese Sequenzen mit der Nukleotidsequenz, welche das Polypeptid
codiert, „wirkungsmäßig verbunden" sind.
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Eine
wirkungsmäßige Verbindung
ist eine Verbindung, bei der eine Sequenz mit einer regulatorischen Sequenz
(oder Sequenzen) auf solche Weise verbunden ist, dass die Expression
der Sequenz unter den Einfluss oder die Kontrolle der regulatorischen
Sequenz gerät.
Zwei DNA-Sequenzen (wie eine Heparinase codierende Sequenz und eine
Promotorregion-Sequenz, die mit dem 5'-Ende der codierenden Sequenz verbunden
sind) gelten dann als wirkungsmäßig verbunden,
wenn das Herbeiführen
der Promotorfunktion zu der Transkription der Heparinase codierenden
Sequenz-mRNA führt
und falls die Art der Verbindung zwischen den beiden DNA-Sequenzen
(1) nicht zum Einführen
einer Rahmenverschiebungsmutation führt, (2) die Fähigkeit der
regulatorischen Expressionssequenzen, die Expression der Heparinasen
zu leiten, nicht beeinträchtigt, oder
(3) die Fähigkeit
der Heparinase-Matrize, von der Promotorregionssequenz transkribiert
zu werden, nicht beeinträchtigt.
Somit wäre
eine Promotorregion mit einer DNA-Sequenz wirkungsmäßig verbunden,
wenn der Promotor imstande wäre,
die Transkription dieser DNA-Sequenz auszuführen.
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Die
genaue Natur der regulatorischen Regionen, die für die Genexpression erforderlich
sind, können zwischen
Spezies- oder Zelltypen variieren, schließt aber im Allgemeinen, nach
Bedarf, 5'-nichttranskribierende
und 5'-nichttranslatierende
(nichtcodierende) Sequenzen ein, die an dem Start der Transkription
bzw. Translation beteiligt sind, wie die TATA-Box, Capping-Sequenz,
CAAT-Sequenz und dergleichen. Vor allem solche 5'-nichttranskribierenden Kontrollsequenzen
werden eine Region einschließen,
welche einen Promotor für transkriptionale
Kontrolle des wirkungsmäßig verbundenen
Gens enthält.
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Falls
gewünscht,
kann ein Fusionsprodukt der Heparinasen konstruiert werden. Zum
Beispiel kann die Sequenzcodierung für Heparinasen an eine Signalsequenz
gebunden werden, welche die Absonderung des Proteins von, oder die
Kompartimentierung des Proteins in einem bestimmten Wirten ermöglicht.
Solche Signalsequenzen können
mit oder ohne spezifische Proteasestellen ausgelegt werden, so dass
die Signalpeptidsequenz für
ein späteres
Entfernen geeignet ist. Alternativ dazu kann die native Signalsequenz
für dieses
Protein verwendet werden.
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Regulatorische
Signale des transkriptionalen Starts können ausgewählt werden, wobei diese eine
Unterdrückung
oder Aktivierung ermöglichen,
so dass die Expression der wirkungsmäßig verbundenen Gene moduliert
werden kann.
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Auf
der Grundlage der vorliegenden Offenbarung kann ein Fachmann ohne
weiteres die Sequenzen der vorliegenden Erfindung in zusätzliche
Expressionsvektoren anordnen und in eine Reihe von Bakterien transformieren,
um rekombinante Heparinase III zu erhalten.
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Sobald
die Vektor- oder DNA-Sequenz, welche das/die Konstrukt(e) enthält, für die Expression
vorbereitet ist, wird/werden das/die DNA-Konstrukte) in eine geeignete
Wirtszelle durch ein beliebiges von einer Reihe von geeigneten Mitteln
eingeführt,
einschließlich
Transfektion. Nach dem Einführen
des Vektors werden Empfängerzellen
in einem selektiven Medium gezüchtet,
welches für
das Wachstum von vektorenthaltenden Zellen auswählt. Die Expression der klonierten
Gensequenzen) führt
zur Erzeugung von Heparinase I, II oder III oder zur Erzeugung eines
Fragmentes von einem dieser Proteine. Diese Expression kann in fortlaufender Weise
in den transformierten Zellen oder in einer kontrollierten Weise
stattfinden, zum Beispiel durch Expression, welche auf die Herbeiführung von
Differenzierung der transformierten Zellen folgt (zum Beispiel durch Verabreichen
von Bromodeoxyuracil an Neuroblastomazellen oder dergleichen).
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Das
exprimierte Protein wird isoliert und gemäß herkömmlichen Bedingungen, wie durch
Extrahieren, Fällung,
Chromatographie, Elektrophorese oder dergleichen, gereinigt. Die
detaillierten Verfahren für
das Isolieren der Heparinasen werden im Detail in den Beispielen
unten besprochen.
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Die
Erfindung stellt außerdem
funktionelle Derivate der Sequenzen von Heparinase III bereit. So
wie hierin verwendet, wird der Begriff „funktionelles Derivat" verwendet, um eine
beliebige DNA-Sequenz zu definieren, die durch die ursprüngliche
DNA-Sequenz gewonnen wird und welche noch immer die biologischen
Aktivitäten
des nativen Elternmoleküls
besitzt. Ein funktionelles Derivat kann eine Insertion, Deletion
oder eine Substitution von einer oder mehreren Basen in der ursprünglichen
DNA-Sequenz sein.
Die Substitutionen können
so sein, dass sie eine native Aminosäure durch eine andere Aminosäure ersetzen,
welche die Funktionsweise des Proteins nicht wesentlich beeinträchtigt.
Fachleute werden erkennen, dass wahrscheinliche Substitutionen die
Funktionsweise des Proteins auf positive Weise einschließen, wie
eine kleine, neutral geladene Aminosäure, welche eine andere kleine,
neutral geladene Aminosäure
ersetzt. Fachleute werden erkennen, dass funktionelle Derivate der
Heparinasen durch Mutagenese der DNA unter Verwendung von einem
auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren hergestellt werden können, wie
durch stellengerichtete Mutagenese. Außerdem kann Zufallsmutagenese
durchgeführt
werden, und Mutanten, welche die Funktion behalten, können durch
entsprechendes Screening erhalten werden.
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Die
Antikörper
der vorliegenden Erfindung schließen monoklonale und polyklonale
Antikörper
sowie Fragmente dieser Antikörper
ein. Fragmente der Antikörper
der vorliegenden Erfindung schließen – ohne darauf beschränkt zu sein – das Fab-,
Fab2- und das Fc-Fragment ein.
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Die
Erfindung stellt auch Hybridoma bereit, die imstande sind, die oben
beschriebenen Antikörper
zu erzeugen. Ein Hybridoma ist eine immortalisierte Zelllinie, die
imstande ist, einen spezifischen monoklonalen Antikörper abzusondern.
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Im
Allgemeinen sind auf dem Fachgebiet Techniken zur Herstellung von
polyklonalen und monoklonalen Antikörpern sowie Hybridoma, die
imstande sind, den gewünschten
Antikörper
zu erzeugen, wohl bekannt (Campbell, A.M., „Monoclonal Antibody Technology:
Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology", Elsevier Science,
Amsterdam, Niederlande (1984); St. Groth et al., J. Immunol. Methods
35:-21 (1980)).
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Jedes
Säugetier,
von dem man weiß,
dass es Antikörper
produziert, kann mit dem Pseudogenpolypeptid immunisiert werden.
Verfahren zur Immunisierung sind auf dem Fachgebiet wohl bekannt.
Solche Verfahren schließen
subkutane oder interperitoneale Injektionen des Polypeptids ein.
Ein Fachmann wird erkennen, dass die Menge an Heparinase, die für die Immunisierung
verwendet wird, in Abhängigkeit
von dem Tier, das immunisiert wird, der Antigenizität des Peptids
und der Stelle der Injektion variieren wird.
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Das
Protein, das als Immunogen verwendet wird, kann modifiziert oder
in einem Adjuvans verabreicht werden, um die Antigenizität des Proteins
zu erhöhen.
Verfahren zur Erhöhung
der Antigenizität
eines Proteins sind auf dem Fachgebiet wohl bekannt und schließen – ohne darauf
beschränkt
zu sein – Koppeln
des Antigens mit einem heterologen Protein (wie Globulin oder β-Galactosidase)
oder den Einschluss eines Adjuvans während der Immunisierung ein.
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Für monoklonale
Antikörper
werden Milzzellen aus den immunisierten Tieren entfernt, mit Myelomazellen,
wie SP2/0-Ag14-Myelomazellen, fusioniert, und es wird ihnen die
Möglichkeit
gegeben, monoklonale Antikörper
produzierende Hybridomazellen zu werden.
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Ein
beliebiges einer Reihe von auf dem Fachgebiet wohl bekannten Verfahren
kann verwendet werden, um die Hybridomazelle zu identifizieren,
welche einen Antikörper
mit den gewünschten
Eigenschaften erzeugt. Dazu zählen
Screening der Hybridomas mit einem ELISA-Test, einer Western-Blot-Analyse
oder einem Radioimmuno-Test (Lutz et al., Exp. Cell Res. 175:109-124
(1988)).
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Hybridoma,
welche die gewünschten
Antikörper
absondern, werden kloniert, und die Klasse und die Unterklasse werden
unter Verwendung von auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren bestimmt
(Campbell, A.M., Monoclonal Antibody Technology: Laboratory Techniques
in Biochemistry and Molecular Biology, Elsevier Science Publishers,
Amsterdam, Niederlande (1984)).
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Für polyklonale
Antikörper
wird ein Antikörper,
der Antisera enthält,
von dem immunisierten Tier getrennt und auf die Gegenwart von Antikörpern mit
der gewünschten
Spezifizität
unter Verwendung eines der oben beschriebenen Verfahren untersucht.
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Die
vorliegende Erfindung stellt ferner die oben beschriebenen Antikörper in
erfassbar markierter Form bereit. Antikörper können erfassbar durch die Verwendung
von Radioisotopen, Affinitätsmarkierungen
(wie Biotin, Avidin usw.), enzymatischen Markierungen (wie Meerrettichperoxidase,
Alkalischer Phosphatase usw.), fluoreszierenden Markierungen (wie
FITC oder Rhodamin usw.), paramagnetischen Atomen, chemo-luminiszenter
Markierungen und dergleichen markiert werden. Verfahren zum Durchführen dieser
Markierung sind auf dem Fachgebiet wohl bekannt; siehe zum Beispiel
Sternberger, L.A. et al., J. Histochem. Cytochem. 18:315 (1970);
Byer, E.A. et al., Meth. Enzym. 62:308 (1979); Engval, E. et al.,
Immunol. 109:129 (1972); Godin, J.W., J. Immunol. Meth. 13:215 (1976).
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Die
vorliegende Erfindung stellt ferner die oben beschriebenen Antikörper immobilisiert
auf einem festen Träger
bereit. Beispiele für
solche festen Träger
schließen
Kunststoffe wie Polycarbonat, komplexe Kohlenhydrate wie Agarose
und Sepharose, Acrylharze wie Polyacrylamid und Latexperlen ein.
Techniken zum Verbinden von Antikörpern mit solchen festen Trägern sind
auf dem Fachgebiet wohl bekannt (Weir et al., Handbook of Experimental
Immunology, 4th Ed., Blackwell Scientific Publications, Oxford,
England (1986)). Die inmobilisierten Antikörper der vorliegenden Erfindung
können
zur Immunoaffinitätsreinigung
von Heparinasen verwendet werden.
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Nachdem
die Erfindung nun allgemein beschrieben wurde, wird sie nun mit
Hilfe einer Reihe spezifischer Beispiele, die nicht einschränkend sind,
besser verstanden werden.
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BEISPIEL 1 Reinigung von
Heparinasen
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Heparinlyaseenzyme
wurden aus Kulturen von Flavobacterium heparinum gereinigt. F. heparinum wurde
in einem 15 L computergesteuerten Fermenter unter Verwendung einer
Variation des definierten Nährstoffmediums
kultiviert, das von Galliher et al., Appl. Environ. Microbiol. 41(2):360-365
(1981) beschrieben wird. Diese Fermentierung, die dazu ausgelegt
ist, Heparinlyasen zu erzeugen, nehmen halbgereinigtes Heparin (Celsus
Laboratories) in die Medien in einer Konzentration von 1,0 g/L als
Induktor der Heparinasesynthese auf. Die Zellen wurden durch Zentrifugation
geerntet und die gewünschten
Enzyme aus dem periplasmatischen Raum durch eine Variation des osmotischen
Schockverfahrens freigesetzt, das von Zimmermann und Cooney in der
US-Patentschrift Nr. 5,262,325, die hiermit durch Bezugnahme aufgenommen
wird, beschrieben ist.
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Eine
halbgereinigte Zubereitung der Heparinaseenzyme wurde durch eine
Modifikation des Verfahrens, das von Zimmermann et al., US-Patentschrift
Nr. 5,262,325 beschrieben ist, erzielt. Proteine aus dem Rohosmolat
wurden auf Kationenaustauscherharz (CBX, J.T. Baker) mit einer Leitfähigkeit
von 1 – 7 µmho absorbiert.
Ungebundene Proteine aus dem Extrakt wurden verworfen und das Harz
in eine Chromatographiesäule
(5,0 cm i.d. x 100 cm) gepackt. Die gebundenen Proteine eluierten
mit einer linearen Fließgeschwindigkeit
von 3,75 cm·min–1 mit
Stufengradienten von 0,01 M Phosphat, 0,01 M Phosphat/0,1 M Natriumchlorid,
0,01 M Phosphat/0,25 M Natriumchlorid und 0,01 M Phosphat/1,0 M
Natriumchlorid, alle mit einem pH-Wert von 7,0 +/- 0,1. Heparinase
II eluiert in der 0,1 M NaCl-Fraktion, während Heparinase I und III
in der 0,25 M-Fraktion eluieren.
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Alternativ
dazu wurde der 0,1 M Natriumchlorid-Schritt eliminiert und die drei
Heparinasen mit 0,25 M Natriumchlorid co-eluiert. Die Heparinase-Fraktionen
wurden direkt auf eine Säule
geladen, die Cellufinsulfat (5,0 cm i.d. x 30 cm, Amicon) enthielt,
und eluierten mit einer linearen Fließgeschwindigkeit von 2,50 cm·min–1 mit
Stufengradienten von 0,01 M Phosphat, 0,01 M Phosphat/0,2 M Natriumchlorid,
0,01 M Phosphat/0,4 M Natriumchlorid und 0,01 M Phosphat/1,0 M Natriumchlorid,
alle mit einem pH-Wert von 7,0 +/- 0,1. Heparinase II und III eluieren
in der 0,2 M Natriumchlorid-Fraktion, während Heparinase I in der 0,4
M-Fraktion eluiert.
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Die
0,2 M Natriumchlorid-Fraktion von der Cellufinsulfat-Säule wurde
mit 0,01 M Natriumphosphat verdünnt,
um eine Leitfähigkeit
von weniger als 5 µmhos
zu ergeben. Die Lösung
wurde weiter gereinigt, indem das Material auf eine Hydroxylapatit-Säule (2,6
cm i.d. x 20 cm) geladen und das gebundene Protein mit einer linearen
Fließgeschwindigkeit
von 1,0 cm·min1 mit Stufengradienten von 0,01 M Phosphat,
0,01 M Phosphat/0,35 M Natriumchlorid, 0,01 M Phosphat/0,45 M Natriumchlorid,
0,01 M Phosphat/0,65 M Natriumchlorid und 0,01 M Phosphat/1,0 M
Natriumchlorid eluiert wird, alle mit einem pH-Wert von 7,0 +/-
0,1. Heparinase III eluiert in einer einzelnen Proteinspitze in
der 0,45 M Natriumchlorid-Fraktion, während Heparinase III in einer einzelnen
Proteinspitze in der 0,65 M Natriumchlorid-Fraktion eluiert.
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Heparinase
I wurde weiter gereinigt, indem Material aus der Cellufinsulfat-Säule, verdünnt auf eine Leitfähigkeit
von weniger als 5 µmhos,
auf eine Hydroxylapatitsäule
(2,6 cm i.d. x 20 cm) geladen und das gebundene Protein mit einer
linearen Fließgeschwindigkeit
von 1,0 cm·min–1 mit
einem linearen Gradienten von Phosphat (0,01 bis 0,25 M) und Natriumchlorid
(0,0 bis 0,5 M) eluiert wurde. Heparinase I eluiert in einer einzelnen
Proteinspitze ungefähr
auf halbem Weg durch den Gradienten.
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Die
durch dieses Verfahren erhaltenen Heparinase-Enzyme wurden durch
SDS-PAGE unter Verwendung
der Technik von Laemmli, Nature 227:680-685 (1970) analysiert und
die Gels durch ein Scanningdensitometer (Bio-Rad, Modell GS-670)
quantifiziert. Heparinase I, II und III wiesen Molekulargewichte
von 42.500 +/- 2.000, 84.000 +/- 4.200 bzw. 73.000 +/- 3.500 Dalton
auf. Alle Proteine wiesen Reinheiten von mehr als 99 % auf. Reinigungsergebnisse
für die
Heparinaseenzyme sind in Tabelle 1 angeführt.
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Die
Heparinase-Aktivitäten
wurden durch den spektrophotometrischen Test bestimmt, der von Yang
et al. beschrieben wird. Eine Modifikation dieses Tests mit einem
Reaktionspuffer, der 0,018 M Tris, 0,044 M Natriumchlorid und 1,5
g/L Heparansulfat bei einem pH-Wert von 7,5 aufwies, wurde verwendet,
um die Heparansulfatabbauaktivität
zu messen.
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Rekombinante
Heparinase I bildet intrazellulare Einschlusskörper, welche Denaturierung
und Proteinrückfaltung
erfordern, um aktive Heparinase zu erhalten. Zwei Lösungsmittel,
Harnstoff und Guanidinhydrochlorid, wurden als löslich machende Mittel getestet.
Von diesen war nur Guanidin HCl, bei 6 M, in der Lage, die Heparinase-I-Einschlusskörper aufzulösen. Der
höchste
Reinheitsgrad wurde jedoch durch sequentielles Waschen der Einschlusskörper in
3 M Harnstoff und 6 M Guanidin-HCl
erreicht. Der Harnstoff-Waschschritt diente dazu, kontaminierende
E. coli-Proteine und Zelltrümmer
vor dem Aufschließen
der aggregierten Heparinase I durch Guanidin-HCl zu entfernen.
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Rekombinante
Heparinase I wurde durch Züchten
von E. coli Y1090(pGHepl), einem Strang, der ein Plasmid enthält, das
das Heparinase-I-Gen enthält,
das aus den Tandem-tac-Promotoren exprimiert wurde, in Luriabrühe mit 0,1
M IPTG hergestellt. Die Zellen wurden durch Zentrifugation konzentriert
und in 1/10 Volumenpuffer, enthaltend 0,01 M Natriumphosphat und
0,2 M Natriumchlorid, bei einem pH-Wert von 7,0 resuspendiert. Die
Zellen wurden durch Beschallung, 5 Minuten lang mit intermittierenden
30-Sekunden-Zyklen, Leistungseinstellung #3, zerrissen und die Einschlusskörper wurden
durch Zentrifugation, 7.000 x g, 5 Minuten lang konzentriert.
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Die
Pellets wurden zweimal 2 Stunden lang bei einem pH-Wert von 7,0
mit kaltem 3 M Harnstoff gewaschen, und das unlösliche Material wurde durch
Zentrifugation gewonnen. Heparinase I wurde in 6 M Guanidin-HCl,
das 50 mM DTT enthielt, entfaltet und durch Dialyse in 0,1 M Ammoniumsulfat
rückgefaltet.
Zusätzliche
kontaminierende Proteine setzten sich in dem 0,1 M Ammoniumsulfat
ab und konnten durch Zentrifugation entfernt werden. Heparinase
I, das auf diese Weise gereinigt wurde, wies eine spezifische Aktivität von 42,21
IU/mg auf und war gemäß SDS-PAGE/Scanning-Densitometrieanalyse
zu 90 % rein. Das Enzym kann durch Kationenaustauschchromatographie
weiter gereinigt werden, wie oben beschrieben, wobei eine Heparinase-I-Zubereitung
erhalten wird, die gemäß SDS-PAGE/Scanning-Densitometrieanalyse
zu mehr als 99 % rein ist.
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BEISPIEL 2: Charakterisierung
von Heparinasen
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Über das
Molekulargewicht und die kinetischen Eigenschaften der drei Heparinase-Enzyme
wurde im Detail von Lohse und Linhardt, J. Biol. Chem. 267:24347-24355
(1992) berichtet. Eine genaue Charakterisierung der posttranslationalen
Modifikationen der Proteine wurde jedoch nicht durchgeführt. Heparinase
I, II und III, die so wie hierin beschrieben gereinigt wurden, wurden
im Hinblick auf die Gegenwart von Kohlenhydrat-Hälften untersucht. Lösungen,
die 2 ug Heparinase I, II und III und rekombinante Heparinase I
enthielten, wurden durch Zugabe von 0,2 M Natriumacetat auf einen
pH-Wert von 5,7 gebracht. Diese Proteinproben wurden einer Kohlenhydratbiotinylierung
gemäß Protokoll
2a unterzogen, das im G1ycoTrack-Kit (Oxford Glycosysteme) beschrieben
ist. 30 µl
jeder biotinylierten Proteinlösung
wurden SDS-PAGE (10 % Gel) unterzogen und durch Elektroblotting
bei 170 mA konstantem Strom auf eine Nitrozellulosemembran transferiert.
Das Erfassen des biotinylierten Kohlenhydrats erfolgte durch Alkalische
Phosphatase-spezifische Farbreaktion nach Anheften eines Streptavadin-Alkalische
Phosphatase-Konjugats an die Biotingruppen. Diese Analysen ergaben,
dass Heparinase I und II glycosyliert und Heparinase III und die
rekombinante Heparinase I nicht glycosyliert sind.
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Polyklonale
Antikörper,
die in Kaninchen erzeugt wurden, die mit Wildtyp-Heparinase-I injiziert wurden, konnten
in zwei Populationen fraktioniert werden, wie unten beschrieben.
Es scheint, als ob eine dieser Fraktionen eine post-translationale Hälfte erkennt,
die Proteinen, die F. heparinum hergestellt werden, gemein ist, während die
andere Fraktion insbesondere Aminosäure-Sequenzen erkennt, die
in Heparinase I enthalten sind. Alle in F. heparinum erzeugten Heparinaseenzyme
wurden durch die „nicht-spezifischen" Antikörper erkannt,
nicht jedoch Heparinase, die in E. coli erzeugt wurde. Der wahrscheinlichste
Kandidat für
den Nicht-Protein-Antigendeterminanten aus Heparinase I ist die
Kohlenhydratkomponente; somit zeigt das Western-Blot-Experiment an, dass
alle Lyasen, die in F. heparinum durchgeführt wurden, glycosyliert sind.
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Gereinigte
Heparinase II und III wurden durch die Edman-Technik analysiert,
um den N-terminalen Aminosäurerest
des reifen Proteins zu bestimmen. Die Edman-Chemie war jedoch nicht in der Lage,
eine Aminosäure
freizusetzen, was darauf hindeutet, dass eine post-translationale
Modifikation an der N-terminalen Aminosäure beider Heparinasen eingetreten
war. Ein nmol Proben von Heparinase II und III wurden zum Deblockieren
mit Pyroglutamataminopeptidase verwendet. Kontrollproben wurden
durch Mock-Deblockieren von 1 nmol Proteinproben ohne Zugabe von
Pyroglutamataminopeptidase erzeugt. Alle Proben wurden in 10 mM NH4CO3, pH-Wert 7,5
und 10 mM DTT (100 µl
Endvolumen) eingebracht. Zu nicht-Kontroll-Proben wurden 1 mU Pyroglutamataminopeptidase
hinzugefügt,
und alle Proben wurden 8 Stunden lang bei 37 ° C inkubiert. Nach dem Inkubieren
wurden zusätzliche
0,5 mU Pyroglutamataminopeptidase zu den Nicht-Kontroll-Proben hinzugefügt, und
alle Proben wurden zusätzliche
16 Stunden bei 37 °C
inkubiert.
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Deblockierungspuffer
wurden gegen 35 % Ameisensäure
unter Verwendung einer 10.000 Dalton Cut-Off-Centricon-Einheit ausgetauscht,
und die Probe wurde unter Vakuum getrocknet. Die Proben wurden einer
Aminosäure-Sequenzanalyse
gemäß des Edman-Verfahrens
unterzogen.
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Die
Eigenschaften der drei Heparinase-Proteine aus Flavobacterium heparinum
sind in Tabelle 2 aufgelistet.
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Heparinase
II und III wurden mit Cyanbromid aufgeschlossen, um Peptidfragmente
zur Isolierung zu erzeugen. Die Proteinlösungen (1 – 10 mg/ml Proteinkonzentration)
wurden auf eine DTT-Konzentration von 0,1 M gebracht und zwei Stunden
lang bei 40 °C
inkubiert. Die Proben wurden gefroren und unter Vakuum gefriergetrocknet.
Das Pellet wurde erneut in 70 % Ameisensäure suspendiert, und Stickstoffgase
wurden durch die Lösung
gesprudelt, um Sauerstoff auszuschließen. Eine Stammlösung CNBr
wurde in 70 % Ameisensäure hergestellt,
und die Stammlösung
wurde mit Stickstoffgas aufgesprudelt und im Dunklen über kurze
Zeiträume gelagert.
Für die
Zugabe von CNBr wurde ein 500 bis 1000 facher Molarüberschuss
von CNBr gegenüber
Methioninresten im Protein verwendet. Der CNBr-Stamm wurde den Proteinlösungen hinzugefügt, mit
Stickstoffgas aufgesprudelt, und das Röhrchen wurde versiegelt. Das
Reaktionsröhrchen
wurde 20 Stunden lang bei 24 °C
im Dunkeln inkubiert.
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Die
Proben wurden unter Vakuum teilweise getrocknet, Wasser wurde der
Probe hinzugefügt
und teilweises Gefriertrocknen wurde wiederholt. Dieses Waschverfahren
wurde so lange wiederholt, bis die Probenpellets weiß waren.
Die Peptidmischungen wurden in Ameisensäure aufgeschlossen und bei
einer Vydac C18 Umkehrphasen-HPLC-Säule (4,6
mm i.d. x 30 cm) angewendet, und einzelne Peptidfragmente wurden
mit einer linearen Fließgeschwindigkeit
von 6,0 cm·min–1 mit
einem linearen Gradienten von 10 bis 90 % Acetonitril in 1 % Trifluoressigsäure eluiert.
Fragmente, die aus diesen Reaktionen gewonnen wurden, wurden einer
Aminosäurensequenzbestimmung
unter Verwendung eines Applied Biosystems 745 A Proteinsequenzers
unterzogen. Drei von Heparinase II isolierte Peptide ergaben die
Sequenzen EFPEMYNLAAGR (SEQ ID NO:5), KPADIPEVKDGR (SEQ ID NO:6)
und LAGDFVTGKILAQGFGPDNQTPDYTYL (SEQ ID NO:7) und wurden als Peptide
2A, 2B bzw. 2C bezeichnet. Drei Peptide aus Heparinase III ergaben
die Sequenzen LIKNEVRWQLHRVK (SEQ ID NO:8), VLKASPPGEFHAQPDNGTFELFI
(SEQ ID NO:9) und KALVHWFWPHKGYGYFDYGKDIN (SEQ ID NO:10) und wurden
als Peptide 3A, 3B bzw. 3C bezeichnet.
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BEISPIEL 3: Antikörper gegenüber den
Heparinaseproteinen
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Heparinase
I, II und III sowie rekombinante Heparinase I, die wie hierin beschrieben
gereinigt wurden, wurden verwendet, um in Kaninchen polyklonale
Antikörper
zu erzeugen. Jede der Heparinase I, II und III wurde dem folgenden
standardmäßigen Immunisierungsverfahren
unterzogen: Die Primärinjektion
bestand aus 0,5 – 1,0
mg gereinigtem Protein, aufgelöst
in 1 ml steriler phosphatgepufferter Salzlösung, die mit 1 ml Freund'schem Adjuvans (Cedarlane
Laboratories Ltd) homogenisiert wurde. Diese Protein-Adjuvans-Emulsion wurde
verwendet, um weibliche New Zealand White Kaninchen zu injizieren;
1 ml pro Kaninchen, 0,5 ml pro Hinterpfote, i.m., in den Oberschenkelmuskel
nahe der Hüfte.
Nach zwei bis drei Wochen erhielten die Kaninchen eine Auffrischungsinjektion,
die aus 0,5 bis 1,0 mg gereinigtem Protein, aufgelöst in steriler
phosphatgepufferter Salzlösung,
homogenisiert mit 1 ml unvollständigem
Freund'schen Adjuvans
(Cedarlane Laboratories, Ltd.), bestand. Nach weiteren zwei bis
drei Wochen erhielten die Kaninchen eine dritte, identische Auffrischungsinjektion.
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Ungefähr 10 Tage
nach der letzten Auffrischungsinjektion wurde jedem Tier aus der
Zentralarterie des Ohres eine Blutprobe entnommen. Ein Serum wurde
hergestellt, indem der Probe ermöglicht
wurde, zwei Stunden lang bei 22 °C
zu gerinnen, gefolgt von einer Inkubation über Nacht bei 4 °C und Klärung durch
Zentrifugation bei 5.000 Umdrehungen/Minute über einen Zeitraum von zehn
Minuten. Die Antisera wurden 1:100.000 in Tris-gepufferter Salzlösung (pH-Wert
7,5) verdünnt
und einer Western-Blot-Analyse
unterzogen, um jene Sera zu identifizieren, die Anti-Heparinase
I, II oder III-Antikörper
enthielten.
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Antikörper, die
gegen Wildtyp-Heparinase I, aber nicht rekombinante Heparinase I,
erzeugt wurden, wiesen einen hohen Grad an Kreuzreaktivität gegenüber anderen
F. heparinum-Proteinen auf. Dies war wahrscheinlich auf die Gegenwart
einer antigenen post-translationalen Modifikation, die F. heparinum-Proteinen
gemein ist, aber nicht auf Proteinen zu finden ist, die in E. coli
synthetisiert wurden, zurückzuführen. Um
dies weiter zu untersuchen, wurde rekombinante Heparinase I auf
Sepharoseperlen immobilisiert und in eine Chromatographiesäule gepackt.
Gereinigte Anti-Heparinase-I-(Wildtyp)-Antikörper wurden auf die Säule geladen
und die ungebundene Fraktion gesammelt. Gebundene Antikörper wurden
in 0,1 M Glycin, pH-Wert
2,0 eluiert. IgG wurde sowohl in den ungebundenen als auch den gebundenen
Fraktionen gefunden und in der Folge in Western-Blot-Experimenten
verwendet. Der Antikörper,
der aus der ungebundenen Fraktion isoliert wurde, erkannte auf nichtspezifische
Weise F. heparinum-Proteine, aber erfasste keine rekombinante Heparinase
I (E. coli) mehr, während
der Antikörper,
der aus der gebundenen Fraktion isoliert wurde, nur Heparinase I
erkannte, egal ob in F. heparinum oder E. coli synthetisiert. Dieses
Ergebnis deutete darauf hin, dass, wie vermutet, zwei Populationen
von Antikörpern
durch das Exponieren gegenüber
dem Wildtyp-Heparinase-I-Antigen gebildet werden: eine, die für das Proteingrundgerüst spezifisch
ist und eine andere, die eine post-translational modifizierte Hälfte erkennt,
die F. heparinum-Proteinen gemein ist.
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Diese
Erkenntnis stellt sowohl ein Mittel zum Reinigen spezifischer Anti-Heparinase-Antikörper als auch
ein Werkzeug zum Charakterisieren des Wildtyp-Heparinase-I-Proteins bereit.
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BEISPIEL 4: Konstruktion
einer F. heparinum-Genbibliothek
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Eine
Flavobacterium heparinum chromosomale DNA-Bibliothek wurde im Lambda-Phagen
DASHII konstruiert. 0,4 ug F. heparinum chromosomale DNA wurden
teilweise mit dem Restriktionsenzym Sau3A aufgeschlossen, um eine
Mehrheit an Fragmenten mit ungefähr
20 kb Größe zu erzeugen,
wie in Maniatis, et al., Molecular Cloning Manual, Cold Spring Harbor
(1982) beschrieben. Diese DNA wurde phenol/chloroform-extrahiert,
ethanol-gefällt,
mit λDASHII-Armen
verbunden und mit Packungsextrakten aus einem λDASHIIBamHI-Cloning-Kit (Stratagene,
La Jolla, CA) gepackt. Die Bibliothek wurde nach dem Packen mit
ungefähr
10–5 pfu/ml
getitert, auf 10–8 pfu/ml durch das Plattenlyseverfahren
amplifiziert und bei – 70 °C gelagert,
wie von Silhavy, T.J., et al. in Experiments in Molecular Genetics,
Cold Spring Harbor Laboratory, 1992, beschrieben.
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Die
F. heparinum chromosomale Bibliothek wurde auf ungefähr 300 pfu/Platte
getitert, über
einen Rasen von E. coli gelegt, wobei ihr ermöglicht wurde, die Zellen über Nacht
bei 37 °C
zu transfizieren und dadurch Plaques zu bilden. Die Phageplaques
wurden auf Nitrozellulosepapier übertragen
und die Phagen-DNA an die Filter gebunden, wie in Maniatis et al.,
ibid, beschrieben.
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BEISPIEL 5: Eine modifizierte
Ribosomen-Bindungsregion für
die Expression von Flavobacterium heparinum Glycosaminoglycanlyasen
-
Das
Gen für
das reife Heparinase-I-Protein wurde in die EcoRI-Stelle des
-
Vektors
pB9 kloniert, wo seine Expression durch zwei Wiederholungen des
tacPromotors (aus Expressionsvektor pKK223-3, Brosius und Holy,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6929-6933 (1984)) getrieben wurde. In
diesem Vektor pBhep wird das erste Codon, ATG, für Heparinase I durch 10 Nukleotide
aus einer minimalen Shine-Dalgarno-Sequenz
AGGA (Shine und Dalgarno, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 71:1342- 1346 (1974)), 1, getrennt. Dieses Konstrukt
wurde in den E. coli Strang JM109 transformiert, bei 37 °C gezüchtet und mit
1 mM IPTG zwei Stunden lang vor dem Ernten induziert. Die Zellen
wurden durch Beschallung lysiert, die Zellmembranfraktion wurde
pelletiert und die Überstandsflüssigkeit
aufbewahrt. Die Membranfraktion wurde in 6 M Guanidin-HCl resuspendiert,
um Einschlusskörper
aufzuschließen,
welche das Enzym der rekombinanten Heparinase I enthielten. Die
lösliche
Heparinase I wurde durch Verdünnung
in 20 mM Phosphatpuffer rückgefaltet.
Die Enzymaktivität
wurde in der rückgefalteten
Pelletfraktion und in der Überstandsflüssigkeitsfraktion bestimmt.
Geringe Aktivitätspegel
wurden in der Überstandsflüssigkeits-
und der Pelletfraktion entdeckt. Eine Analyse der Fraktionen durch
SDS-PAGE ergab, dass beide Fraktionen geringe Banden enthalten können, die der
rekombinanten Heparinase I entsprechen.
-
Beim
Versuch, die Expressionspegel von pBhep zu erhöhen, wurden zwei Mutationen
eingeführt,
wie in 1 angezeigt.
Die Mutationen wurden erzeugt, um den Translationspegel der Heparinase-I-mRNA
durch Vergrößern der
Länge der
Shine-Dalgarno-Sequenz
und durch Verringern des Abstandes zwischen der Shine-Dalagarno-Sequenz und der ATG-Startstelle
zu verbessern. Unter Verwendung einer PCR hat eine Einzelbasen-Mutation,
welche ein A zu einem G konvertiert, die Shine-Dalgarno-Sequenz von einer
minimalen AGGA-Sequenz zu einer AGGAG-Sequenz verbessert, während der
Abstand zwischen der Shine-Dalgarno-Sequenz und der Translationsstartstelle
von 10 auf 9 Basenpaare reduziert wurde. Dieses Konstrukt wurde als
pGhep bezeichnet. Im zweiten Konstrukt, pΔ4hep, wurden 4 Nukleotide (AACA)
unter Verwendung der PCR gelöscht,
um die Shine-Dalgarno-Sequenz auf AGGAG zu verlängern und um sie auf innerhalb
5 Basenpaare der ATG-Startstelle zu bewegen.
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Die
unterschiedlichen Konstrukte wurden wie oben beschrieben analysiert.
Rückgefaltete
Pellets aus mit pGhep transformiertem E.Coli wiesen ungefähr eine
7X Steigerung der Heparinase-I-Aktivität im Vergleich zu rückgefalteten
Pellets aus E. coli auf, das pBhep enthielt. Andererseits wies E.
coli, das pΔ4hep
enthielt, zwei bis dreimal weniger Aktivität als das pBhep-enthaltende
E. coli auf. Die Pegel der Heparinase-I-Aktivität in den Überstandsflüssigkeiten waren ähnlich.
-
Das
Plasmid pBhep wurde mit EcoRI aufgeschlossen und mit S1-Nuklease
behandelt, um DNA mit einem stumpfen Ende zu bilden. Die Plasmid-DNA
wurde dann mit BamHI aufgeschlossen, und die Einzelstrang-Enden
wurden durch Auffüllen
mit Klenow-Fragment doppelstrangig gemacht. Die DNA mit stumpfem Ende
wurde verbunden und in E. coli Strang FTB 1 transformiert. Ein Plasmid,
welches eine einzigartige BamHI-Stelle und keine Heparinase-I-Gen-DNA
enthielt, wurde aus einer Kanamycin-resistenten Kolonie gereinigt und
als Plasmid pGB bezeichnet. Eine DNA-Sequenzanalyse ergab, dass das Plasmid
pGB die modifizierte Ribosomenbindungsstelle, die in 1 gezeigt wird, enthielt.
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VERGLEICHENDES BEISPIEL
1: Nukleinsäure,
welche Heparinase II codiert
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Vier „Guessmer"-Oligonukleotide
wurden unter Verwendung von Informationen aus zwei Peptidsequenzen
2A und 2B und mit Hilfe der Konsenscodone für Flavobacterium, wie in Tabelle
3 gezeigt, konstruiert. Diese waren:
die als
2-1, 2-2, 2-3 bzw. 2-4 bezeichnet wurden. Die Olignukleotide wurden
mit einem Bio/CAN (Mississauga, Ontario) Peptidsynthesizer synthetisiert.
Paare dieser Oligonukleotide wurden als Primer in PCR-Reaktionen verwendet.
F. heparinum chromosomale DNA wurde mit Restriktionsendonukleasen
SaII, XbaI oder NotI aufgeschlossen und die fragmentierte DNA zur
Verwendung als Matrizen-DNA kombiniert. Polymerasekettenreaktionsmischungen
wurden unter Verwendung des DNA Amplification Reagent Kit (Perkin
Elmer Cetus, Norwalk, CT) erzeugt. Die PCR-Amplifikationen wurden in 100 µl Reaktionsvolumen
durchgeführt,
das 50 niM KCl, 10 mM Tris HCl, pH-Wert 9, 0,1 % Triton X-100, 1,5
mM MgCl
2, 0,2 mM von jedem der vier Deoxyribosenukleotidtriphosphate
(dNTPs), 100 pmol jedes Primers, 10 ng der fragmentierten F. heparinum
genomischen DNA und 2,5 Einheiten von Taq-Polymerase (Bio/CAN Scientific
Inc., Mississauga, Ontario) enthielt. Die Proben wurden auf einem
automatisierten Heizblock (DNA Thermal-Cycler, Barnstead/Thermolyne
Corporation, Dubuque, IA) angeordnet, der für folgende Schrittzyklen programmiert
war: Denaturierungstemperatur 92 °C (1
Minute), Annealingtemperatur von 37 °C, 42 °C oder 45 °C (1 Minute) und Extensionstemperatur
72 °C (2 Minuten).
Diese Zyklen wurden 35 Mal wiederholt. Die resultierenden PCR-Produkte
wurden auf einem 1,0 % Agarosegel analysiert, das 0,6 ug/ml Ethidiumbromid
enthielt, wie von Maniatis, et al., ibid, beschrieben. DNA-Fragmente
wurden durch Oligonukleotide 2-2 und 2-3 erzeugt. Die Fragmente,
mit einer Größe von 250 bp
und 350 bp, wurden zuerst auf 1 % Agarose-Gelelektrophorese getrennt,
und die DNA wurde mit Hilfe des GENECLEAN I kit (Bio/CAN Scientific,
Mississauga, Ontario) extrahiert. Gereinigte Fragmente wurden in pTZ/PC
(Tessier und Thomas, unveröffentlicht)
verbunden, das zuvor mit NotI,
2,
aufgeschlossen wurde, und die Verbindungsmischung wurde verwendet,
um E. coli FTB 1 zu transformieren, wie in Maniatis et al., ibid, beschrieben.
Alle Restriktionsenzyme und die T4-DNA-Ligase wurden bei New England
Biolabs (Mississauga, Ontario) gekauft.
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Stamm
FTB1 wurde in unserem Labor hergestellt. Das F'-Episom aus dem XL-1 Blue E. coli Stamm (Stragene,
La Jolla, CA), welche das lac Iq Repressor-Gen
trägt und
10 Mal mehr lac-Repressor als Wildtyp-E.coli produziert, wurde,
wie von J. Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring
Harbor Laboratory (1972) beschrieben, in den TB 1 E.coli Stamm,
beschrieben von Baker, T.A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 81:6779-6783
(1984), verschoben. Der FTB1-Hintergrund ermöglicht eine stringentere Repression
von Transkription aus Plasmiden, welche Promotoren mit einem lac-Promotor
(d. h. lac und Taq-Promotoren) tragen. Kolonien, die aus der Transformation
von FTB 1 resultieren, wurden auf LB-Agar enthaltendem Ampicillin
ausgewählt
und unter Verwendung des Blau/Weiß-Screens, bereitgestellt von
X-gal und IPTG, die im Agar-Medium eingeschlossen sind, untersucht,
wie von Maniatis et al., ibid, beschrieben. Transformanten wurden
durch Kolonie-Cracking analysiert, und Mini-Zubereitungen von DNA
wurden für
Enzymrestriktionsanalyse unter Verwendung des RPM-Kit (Bio/CAN Scientific
Inc., Mississauga, Ontario) hergestellt. Zehn Plasmide enthielten Inserts
der korrekten Größe, welche
bei Aufschließen
mit EcoRI und HindIII freigesetzt wurden.
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Eine
DNA-Sequenzierung ergab, dass eines der Plasmide, pCE14, ein 350
bp PCR-Fragment der erwarteten DNA-Sequenz enthielt, wie aus dem
Peptid 2C gewonnen. DNA-Sequenzen wurden durch das Dideoxy-Kettenterminationsverfahren
von Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 74:5463-5467 (1978), bestimmt.
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Sequenzierungsreaktionen
wurden mit dem Sequenase-Kit (U.S. Biochemical Corp., Cleveland,
Ohio) und 35S-dATP (Amersham Canada Ltd.,
Oakville, Ontario, Canada) gemäß den Herstellerangaben
durchgeführt.
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Das
Heparinase-II-Gen wurde aus einer F. heparinum chromosomalen DNA-Bibliothek, 2, kloniert, die wie oben
beschrieben konstruiert worden ist. Zehn Plaque-enthaltende Filter
wurden mit der DNA-Sonde hybridisiert, die aus dem gelgereinigten
Insert von pCE14 hergestellt wurde, das unter Verwendung eines Random
tabeling Kit [Zufallsmarkierungs-Kit] (Boehringer Mannheim Canada,
Laval, Quebec) markiert wurde. Plaquehybridisierung wurde, wie in
Maniatis et al., ibid, beschrieben, 16 Stunden lang bei 65 °C in einem
Tek-Star-Hybridisierungsofen durchgeführt (Bio/CAN Scientific, Mississauga,
Ontario). Nachfolgende Waschungen wurden bei 65 °C durchgeführt: zweimal 15 Minuten lang
in 2X SSC, einmal in 2X SSC/0,1 % SDS 30 Minuten lang und einmal
in 0,5 X SSC/0,1 % SDS 15 Minuten lang. Positive Plaques wurden
unter Verwendung von Plastikmikropipettenspitzen geerntet und durch
Dot-Blot-Analyse bestätigt,
wie von Maniatis et al., ibid, beschrieben. Sechs der Phagen, die
starke Hybridisierungssignale von sich gaben, wurden für eine Southern-Hybridisierungsanalyse
verwendet, wie von Southern, E.M., J. Mol. Biol. 98:503-517 (1975)
beschrieben. Diese Analyse zeigt, dass ein Phage, HIIS, ein 5,5
kb XbaI-DNA-Fragment enthielt, das mit der Sonde hybridisierte.
Klonieren des 5,5 kb XbaI-Fragmentes in die XbaI-Stelle von einem
der folgenden Vektoren: pTZ/PC, pBluescript (Stratagene, La Jolla,
CA), pUC18 (beschrieben in Yanisch-Perron et al., Gene 33:103-119
(1985)) und pOK12 (beschrieben in Vierra und Messing, Gene 100:189-194
(1991)) war nicht erfolgreich, obwohl FTB1-Hintergrund verwendet
wurde, um eine Plasmid promotor-abgeleitete Transkription zu unterdrücken. Vektor
pOK12, ein Plasmid mit niedriger Kopienzahl, abgeleitet von pACYC184
(ungefähr
10 Kopien/Zelle, Chang, A.C.Y. und Cohen, S.N., J. Bact. 134:1141-1156
(1978)), wurde beim Versuch verwendet, die toxischen Wirkungen eines
fremden DNA-Fragmentes in E. coli durch Minimierung der Anzahl der
Kopien des toxischen fremden Fragmentes zu umgehen. Außerdem schlug
die Insertion des gesamten NotI chromosomalen DNA-Inserts des HIIS-Phage
in Plasmid-pOK12-Plasmid fehl. Daraus wurde geschlossen, dass diese Region
von F. heparinum-Chromosom eine negativ-selektive Auswirkung auf
E. coli Zellen, in denen sie enthalten ist, ausübt. Diese toxische Wirkung
wurde zuvor bei anderen F. heparinum chromosomalen DNA-Fragmenten
nicht festgestellt.
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Eine
zweite Strategie, die angewendet wurde, um das unerwartete Problem
von F. heparinum DNA Toxizität
in E. coli zu umgehen, bestand darin, das chromosomale DNA-Fragment
mit einer Restriktionsendonuklease aufzuschließen, welche das Fragment, und
falls möglich
das Heparinase-II-Gen in zwei Teile aufteilen würde, 2. Diese Fragmente könnten einzeln kloniert werden.
DNA-Sequenzanalyse des PCR-Inserts in
Plasmid pCE14 zeigte, dass BamHI- und EcoRI-Stellen im Insert vorhanden
waren. Hybridisierungsexperimente zeigten ebenfalls, dass die BamHI
aufgeschlossene F. heparinum DNA in Phage HIIS zwei Bänder mit Größen von
1,8 und 5,5 kb produzierte. Eine Analyse der Hybridisierungsdaten
ergab, dass die 1,8 kb Bande das 5'-Ende und die 5,5 kb Bande das 3'-Ende des Gens enthält. Ferner
hybridisierte ein 5 kb EcoRI F. heparinum chromosomales DNA-Fragment
mit der PCR-Sonde. Die 1,8, 5 und 5,5 kb Fragmente, welche die Heparinase-II-Gensequenzen
enthielten, wurden in pBluescript eingefügt, wie oben beschrieben. Zwei
Klone, pBSIB6-7 und pBSIB6-21, welche das 5,5 kb BamHI-Insert in
verschiedenen Ausrichtungen enthalten, wurden isoliert, und ein
Plasmid, pBSIB213, welches das 1,8 kb BamHI-Fragment enthielt, wurde
isoliert. Es wurden keine Klone, die das 5 kb EcoRI-Fragment enthielten,
isoliert, obwohl umfangreiches Screening möglicher Klone durchgeführt wurde.
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Das
Molekulargewicht des Heparinase-II-Proteins liegt bei ungefähr 84 kD,
so dass die Größe des entsprechenden
Gens bei ungefähr
2,4 kb liegen würde.
Die 1,8 und 5,5 kb BamHI chromosomalen DNA-Fragmente könnten das
gesamte Heparinase-II-Gen
enthalten. Die Plasmide pBSIB6-7, pBSIB6-21 und pBSIB2-13, 2, wurden verwendet, um
verschachtelte Deletionen mit dem Erase-a-Base-System (Promega Biotec,
Madison Wis.) zu erzeugen. Diese Plasmide wurden als Matrizen für die DNA-Sequenzanalyse unter
Verwendung von Universal- und Umkehrprimern und Oligonukleotidprimern
verwendet, die aus bekannter Heparinase-II-Sequenz gewonnen wurden.
Da Teile des Gens relativ reich an G-C waren und zahlreiche starke,
sekundäre
Strukturen enthielten, wurde die Sequenzanalyse manchmal unter Verwendung
von Reaktionen durchgeführt,
bei denen dGTP durch dITP ersetzt wurde. Die Analyse der DNA-Sequenz, 4, zeigte, dass es einen
einzelnen, kontinuierlichen offenen Leserahmen gab, der Codone für 772 Aminosäurereste
enthielt, 5. Die Suche
nach einer möglichen
Signalpeptidsequenz unter Verwendung von Geneworks (Intelligenetics,
Mountain View, CA) deutete darauf hin, dass es zwei mögliche Stellen
für die
Bearbeitung des Proteins in eine reife Form gibt: Q-26 (Glutamin)
und D-30 (Aspartat). N-terminales Aminosäuresequenzieren von deblockierter,
verarbeiteter Heparinase II zeigte, dass das reife Protein mit Q-26
beginnt und 747 Aminosäuren
mit einem berechneten Molekulargewicht von 84,545 Dalton enthält, 5.
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VERGLEICHENDES BEISPIEL
2: Expression von Heparinase II in E. Coli
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Der
Vektor pGB wurde für
die Heparinase-II-Expression in E. coli, 3, verwendet. pGB enthält die modifizierte
Ribosomenbindungsregion von pGhep, 1,
und eine einzigartige BamHI-Stelle, wobei die Expression eines DNA-Fragmentes,
das in diese Stelle eingefügt
ist, durch einen doppelten tac-Promotor getrieben wird. Der Vektor
schließt
auch ein Kanamycinresistenzgen und das lac Iq Gen
ein, um die Induktion von Transkription mit IPTG zu ermöglichen.
Anfangs wurde ein gelgereinigtes 5,5 kb BamHI-Fragment aus pBSIB6-21
mit BamHI-aufgeschlossenem pGB verbunden und in FTB 1 transformiert,
das auf LB-Agar mit Kanamycin ausgewählt wurde. Sechs der resultierenden
Kolonien enthielten Plasmide mit Inserts in der korrekten Ausrichtung
für die
Expression des offenen Leserahmens. Die PstI-Aufschließung und Wiederverbindung eines
der Plasmide, welche pGBIID bilden, löschte 3,5 kb des 5,5 kb BamHI-Fragmentes
und entfernte eine BamHI-Stelle, wodurch nur eine BAMHI-Stelle unmittelbar
nach der Shine-Dalgarno-Sequenz übrig
blieb. Schließlich
wurden zwei synthetische Oligonukleotide konstruiert: 5'-TGAGGATTCATGCAAACCAAGGCCGATGTGGTTTGGAA-3' (SEQ ID NO:15) und
5'-GGAGGATAACCACATTCGAGCATT-3'-(SEQ ID NO:16) zur
Verwendung in einer PCR, um ein Fragment zu erzeugen, das eine BamHI-Stelle
und ein ATG-Startcodon stromaufwärts von
der Sequenz, die das reife Protein codiert, und eine stromabwärts gelegene
BamHI-Stelle, 3, enthält. Lambda-Klon
HII-I, isoliert zur selben Zeit wie Lambda-Klon HIIS, wurde als
Matrizen-DNA verwendet.
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Das
Klonieren des PCR-Produktes mit stumpfem Ende in pTZ/PC schlug fehl,
wobei FTB 1 als Wirt verwendet wurde. Das Klonieren des BamHI-aufgeschlossenen
PCR-Produktes in die BamHI-Stelle von pBluescript, wieder unter
Verwendung von FTB 1 als Wirt, führte
zur Isolierung von 2 Plasmiden, welche das PCR-Fragment enthalten,
nach Screening von 150 möglichen
Klonen. Eines von diesen, pBSQTK-9, das mit Umkehrprimern und Universalprimern
sequenziert wurde, enthielt eine genaue Reproduktion der DNA-Sequenz
aus dem Heparinase-II-Gen. Das BamHIaufgeschlossene PCR-Fragment
aus pBSQTK-9 wurde in die BamHI-Stelle von pGBIID in solcher Ausrichtung
eingefügt,
dass sich die ATG-Stelle stromabwärts der Shine-Dalgarno-Sequenz
befand. Dieses Konstrukt, pGBH2, platzierte das reife Heparinase-II-Gen
unter die Kontrolle der tac-Promotoren in pGB, 3. Stamm E. coli FTB 1 (pGBH2) wurde
in LB-Medium, das 50 ug/ml Kanamycin enthielt, bei 37 °C drei Stunden
lang gezüchtet.
Die Induktion des tac-Promotors erfolgte durch Zugabe von 1 mmol
IPTG, und die Kultur wurde entweder unter Raumtemperatur oder 30 °C gehalten.
Heparin- und Heparansulfatabbauaktivität wurde in den Kulturen nach
vierstündigem
Züchten
unter Verwendung des von Yang et al., ibid, beschriebenen Verfahrens
gemessen. Heparinabbauaktivitäten
von 0,36 und 0,24 IU/mg Protein und Heparansulfatabbauaktivitäten von
0,49 und 0,44 IU/mg Protein wurden bei Raumtemperatur bzw. 30 °C beobachtet.
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BEISPIEL 6: Nukleinsäure, welche
Heparinase III codiert
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Die
Aminosäuresequenzinformationen,
die aus den Peptiden, die von Heparinase III, 9, abgeleitet wurden, gereinigt so wie
hierin beschrieben, haben sich in hoch degenerative Oligonukleotide
zurück
translatiert. Daher erforderte eine Klonierungsstrategie, die auf
der Polymerasekettenreaktionamplifikation eines Abschnitts des Heparinase-III-Gens
unter Verwendung von Oligonukleotiden beruht, die auf der Grundlage
von Aminosäuresequenzinformationen
synthetisiert werden, das Eliminieren von einigen der DNA-Sequenzmöglichkeiten.
Eine angenommene Codonverwendung wurde auf der Grundlage bekannter
DNA-Sequenzen für Gene
aus anderen Flavobacterium-Spezies berechnet. Sequenzen für 17 Gene
wurden analysiert, und eine Codonverwendungstabelle wurde erstellt – Tabelle
3.
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Vier
Oligonukleotide wurden konstruiert, indem jedes Codon gemäß der Codonverwendungstabelle ausgewählt wurde.
Diese waren: 5'-GAATTCCATCAGTTTCAGCCGCATAAA-3' (SEQ ID NO:17), 5'-GAATTCTTTATGCGGCTGAAACTGATG-3' (SEQ ID NO:18),
5'-GAATTCCCGCCGGGCGAATTTCATGC-3' (SEQ ID NO:19) und
5'-GAATTCGCATGAAATTCGCCCGGCGG-3' (SEQ ID NO:20) und
wurden als Oligonukleotide 3-1, 3-2, 3-3 bzw. 3-4 bezeichnet. Diese
Oligonukleotide wurden in allen möglichen Kombinationen in einem
Versuch verwendet, einen Abschnitt des Heparinase-III-Gens unter
Verwendung der Polymerasekettenreaktion zu amplifizieren. Die PCR-Amplifikationen
wurden wie oben beschrieben durchgeführt. Zyklen von: Denaturierungstemperatur
92 °C (1
Minute), Annealingtemperaturen von 37 °C bis 55 °C (1 Minute) und Extensionstemperatur
72 °C (2
Minuten) wurden 35 Mal wiederholt. Eine Analyse der oben beschriebenen
PCR-Reaktionen ergab, dass durch diese Experimente keine DNA-Fragmente
erzeugt wurden.
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Ein
zweiter Satz Oligonukleotide wurde synthetisiert und umfasste 32
Basen-Sequenzen,
in welchen die Codonverwendungstabelle verwendet wurde, um die dritte
Position von nur der Hälfte
der Codone zu erraten. Die Nukleotide innerhalb der Klammern zeigen
Degenerationen von zwei oder vier Basen an einer einzigen Stelle.
Diese waren:
(SEQ ID NO:24) und wurden
als Oligonukleotide 3-5, 3-6, 3-7 und 3-8 bezeichnet. Diese Oligonukleotide
wurden beim Versuch verwendet, einen Abschnitt des Heparinase-III-Gens
unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion zu amplifizieren,
und die Kombination aus 3-6 und 3-7 ergab ein spezifisches 983 bp
PCR-Produkt. Es wurde ein Versuch unternommen, dieses Fragment durch
Ligation mit stumpfem Ende in den E. coli Vektor pBluescript zu
klonen, sowie in zwei spezifisch konstruierte Vektoren für das Klonieren
von PCR-Produkten, pTZ/PC und pCRII von dem TA Cloning
TM Kit
(InVitrogen Corporation, San Diego, CA). Alle diese Konstrukte wurden
in den FTB1 E. coli Stamm transformiert. Die Transformanten wurden
zuerst durch Kolonie-Aufbrechen analysiert, und anschließend wurden
Minizubereitungen von DNA zur Enzymrestriktionsanalyse hergestellt. Keine
Klone, die dieses PCR-Fragment enthielten, wurden isoliert.
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Ein
dritter Satz an Oligonukleotiden wurde synthetisiert, indem BamHI-Endonukleasesequenzen
an den Enden der 3-6 und 3-7 Oligonukleotidsequenzen aufgenommen
wurden. Eine 999-Basenpaar-DNA-Sequenz wurde unter Verwendung der
Polymerasekettenreaktion mit F. heparinum chromosomaler DNA als
Ziel erhalten. Es wurden Versuche unternommen, die amplifizierte
DNA in die BamH1-Stelle des Plasmids pBluescript mit hoher Kopieanzahl
und der Plasmide pBR322 und pACYC 184 mit niedriger Kopieanzahl
zu klonieren. Alle diese Konstrukte wurden wiederum in den FTB 1
E. coli Stamm transformiert. Mehr als 500 Kandidaten wurden untersucht,
dennoch wurden keine Transformanten, die ein Plasmid enthalten,
das die F. heparinum DNA enthält,
erhalten. Wiederum wurde daraus geschlossen, dass diese Region von
F. heparinum Chromosom eine negativ-selektive Wirkung auf E. coli
Zellen hat, in denen sie enthalten ist.
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Wie
im Fall der Isolierung des Heparinase-II-Gens wurde das PCR-Fragment
aufgeteilt, um das Problem der fremden DNA-Toxizität zu vermeiden.
Das Aufschließen
des 981 bp BamHI-aufgeschlossenen Heparinase-III-PCR-Fragmentes
mit Restriktionsendonuklease ClaI erzeugte zwei Fragmente mit 394
und 587 bp. Die amplifizierte F. heparinum-Region wurde mit ClaI
behandelt, und die zwei Fragmente wurden durch Agarose-Gelelektrophorese
getrennt. Die 587- und 394-Basenpaar-Fragmente wurden getrennt in Plasmid-pBluescript
gebunden, das mit Restriktionsendonukleasen BamHI und ClaI behandelt
worden war. Außerdem
wurde das gesamte 981-bp-PCR-Fragment gereinigt und in BamHI-geschnittenes
pBluescript gebunden. Die gebundenen Plasmide wurden in XL-1 Blue
E. coli eingefügt.
Transformanten, welche Plasmide mit Inserts enthielten, wurden auf
der Grundlage ihrer Fähigkeit,
weiße
Kolonien auf LB-Agarplatten mit X-gal, IPTG und 50 ug/ml Ampicillin
zu bilden, ausgewählt,
wie von Maniatis beschrieben. Plasmid pFB 1, welches das 587 bp F.
heparinum-DNA-Fragment enthält,
und Plasmid pFB2, welches das gesamte 981 Basenpaar-Fragment enthält, wurden
durch dieses Verfahren isoliert. Der XL-1 Blue-Stamm, der – wie Stamm
FTB 1, das lac Iq Repressor-Gen auf einem
F'-Episom enthält, ermöglichte
ein stabiles Aufrechterhalten des kompletten BamHI-PCR- Fragmentes, im Gegensatz
zu FTB 1. Der Grund für
diese Diskrepanz ist aus den Genotypen der zwei Stränge (d.
h. beide sind rec A usw.) nicht ersichtlich.
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Die
DNA-Sequenzanalyse der F heparinum-DNA in Plasmid pFB 1 zeigte,
dass sie eine Sequenz enthielt, welche Peptid Hep3-B codiert, während das
F heparinum-Insert
in Plasmid pFB2 eine DNA-Sequenz enthielt, welche die Peptide Hep3-D
und Hep3-B, 9, codiert.
Diese Analyse bestätigte,
dass diese Inserts Teil des Gens waren, das Heparinase III codiert.
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Das
PCR-Fragmentinsert in Plasmid pFB 1 wurde mit 32P-ATP
unter Verwendung eines Random Primed DNA Labeling Kit (Boehringer
Mannheim, Laval, Quebec) markiert und wurde verwendet, um die F.
heparinum-λDASHII-Bibliothek, 6, zu untersuchen, die wie
hierin beschrieben konstruiert wurde. Die Lambda-Bibliothek wurde plattiert, um ungefähr 1.500
Plaques zu erhalten, welche auf Nitrocellulosefilter (Schleicher & Schuel, Keene,
NH) transferiert wurden. Die PCR-Sonde
wurde durch Ethanolfällung
gereinigt. Plaquehybridisierung wurde unter Anwendung der oben beschriebenen
Bedingungen ausgeführt.
Acht positive Lambda-Plaques
wurden identifiziert. Lambda-DNA wurde aus lysierten bakteriellen
Kulturen isoliert, wie in Maniatis beschrieben, und weiter durch
Restriktionsanalyse und durch Southern-Blotting unter Verwendung
einer Hybond-N Nylonmembran (Amersham Corporation, Arlington Heights,
IL) gemäß des in
Maniatis beschriebenen Protokolls analysiert. Ein 2,7 Kilobasen-HindIII-Fragment
aus Lambda-Plaque #3, welches stark an der PCR-Sonde hybridisierte,
wurde isoliert und in pBluescript im XL-1 Blue E. coli Hintergrund
kloniert, um Plasmid pHindIIIBD, 6,
zu ergeben. Dieser Klon wurde weiter durch DNA-Sequenzierung analysiert.
Die Sequenzdaten wurden unter Verwendung aufeinanderfolgender verschachtelter
Deletionen von pHindIIIBd erhalten, erzeugt mit dem Erase-a-Base
System (Promega Corporation, Madison, WI) oder sequenziert unter
Verwendung von synthetischen Oligonukleotidprimern.
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Die
Sequenzanalyse ergab einen einzelnen kontinuierlichen offenen Leserahmen,
ohne ein translationales Terminationscodon, von 1929 Basenpaaren,
entsprechend 643 Aminosäuren.
Weiteres Screening der Lambda-Bibliothek führte zur Identifizierung eines
673 bp KpnI-Fragmentes, das auf ähnliche
Weise in die KpnI-Stelle
von pBluescript kloniert wurde, wodurch Plasmid pFB4 geschaffen
wurde. Das Terminationscodon wurde innerhalb des KpnI-Fragmentes
gefunden, indem zusätzliche 51
Basenpaare zum Heparinase-III-Gen und zusätzliche 16 Aminosäuren zum
Heparinase-III-Protein hinzugefügt
wurden. Das vollständige
Heparinase-III-Gen wurde später
innerhalb eines 3,2 kb PstI-Fragmentes aus Lambda-Plaque #118 gefunden.
Das vollständige
Heparinase-III-Gen aus Flavobacterium ist somit 1980 Basenpaare
lang, 8, und codiert
ein 659 Aminosäurenprotein, 9. N-terminales Aminosäuresequenzieren
von deblockierter, verarbeiteter Heparinase III zeigte, dass das
reife Protein bei Q-25 beginnt und 635 Aminosäuren mit einem berechneten
Molekulargewicht von 73.135 Dalton, 9,
enthält.
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BEISPIEL
7: Expression von Heparinase III in E. coli PCR wurde verwendet,
um ein reifes, gestutztes Heparinase-III-Gen zu erzeugen, das 16
Aminosäuren
aus dem Carboxy-Terminus des Proteins als gelöscht aufwies. Ein Oligonukleotid,
bestehend aus 5'-CGCGGATCCATGCAAAGCTCTTCCATT-3' (SEQ ID NO:25) wurde
entwickelt, um eine ATG-Startstelle unmittelbar vor dem Codon für die erste
Aminosäure
(Q-25) der reifen Heparinase III einzufügen, während ein Oligonukleotid, bestehend
aus 5'-CGCGGATCCTCAAAGCTTGCCTTTCTC-3' (SEQ ID NO:26) entwickelt
wurde, um ein Terminationscodon nach der letzten Aminosäure des Heparinase-III-Gens
auf dem 2,7 kb HindIII-Fragment einzufügen. Beide Oligonukleotide
enthielten auch eine BamHI-Stelle. Plasmid pHindIIIBD wurde als
Matrize in einer PCR-Reaktion mit einer Glühtemperatur von 50 °C verwendet.
Ein spezifisches Fragment der erwarteten Größe, 1857 Basenpaare, wurde
erhalten. Dieses Fragment codiert ein Protein mit 620 Aminosäuren mit
einem berechneten Molekulargewicht von 71.535 Dalton. Es wurde isoliert
und in die BamHI-Stelle des Expressionsvektors pGB eingefügt. Dieses
Konstrukt wurde als pGB-H3Δ3', 7, bezeichnet.
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Um
die fehlende 3'-Region
von Heparinase III einzufügen,
wurde das BspEI/SaII-Restriktionsfragment aus pGB-H3Δ3' entfernt und durch
das BspEI/SaII-Fragment
aus pFBS ersetzt. Das Konstrukt, welches das vollständige Heparinase-III-Gen enthielt, wurde
als pGBH3, 7, bezeichnet.
Rekombinante Heparinase III ist ein Protein mit 636 Aminosäuren mit
einem berechneten Molekulargewicht von 73.266 Dalton. E. coli Stamm
XL-1 Blue(pGBH3) wurde bei 37 °C
in LB-Medium, das 75 ug/ml Kanamycin enthielt, auf OD600 von
0,5 gezüchtet,
wobei an diesem Punkt der tac-Promotor
aus pGB durch die Zugabe von 1 mM IPTG induziert wurde. Die Kulturen wurden
weitere 2 bis 5 Stunden entweder bei 23 °C, 30 °C oder 37 °C gezüchtet. Die Zellen wurden auf
Eis gekühlt,
durch Zentrifugation konzentriert und in kalter PBS bei 1/10 des
ursprünglichen
Kulturvolumens resuspendiert. Die Zellen wurden durch Beschallung
lysiert und Zelltrümmer
durch Zentrifugation bei 10.000 x g über einen Zeitraum von fünf Minuten
entfernt. Die Pellet- und die Überstandsflüssigkeitsfraktion wurden
auf Heparansulfat abbauende (Heparinase III) Aktivität untersucht.
Heparansulfat abbauende Aktivitäten
von 1,29, 5,27 und 3,29 IU/ml wurden bei Kulturen beobachtet, die
bei 23 °C,
30 °C bzw.
37 °C gezüchtet wurden.
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Die
vorliegende Erfindung beschreibt ein Verfahren zum Erhalten hoch
gereinigter Heparin- und Heparansulfat abbauender Proteine durch
Exprimieren der Gene für
diese Proteine in einem geeigneten Expressionssystem und Anwenden
der Schritte der Zellaufbrechung, der Kationenaustauschchromatographie,
Affinitätschromatographie
und Hydroxylapatitchromatographie. Variationen dieser Verfahren
sind für
Fachleute aus der vorhergehenden detaillierten Beschreibung der
Erfindung offensichtlich. Solche Modifikationen liegen innerhalb
des Schutzumfanges derangeschlossenen Ansprüche.
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SEQUENZPROTOKOLL
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