DE69233375T2 - Für ein signalpeptid, ein selektiv wechselwirkendes polypeptid und eine membranankersequenz kodierende rekombinante dns - Google Patents

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Description

  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine rekombinante DNA-Sequenz, die im wesentlichen drei verschiedene DNA-Fragmente umfasst, und auf Expressionsvektoren oder Plasmide, die eine solche Sequenz enthalten, wie auch auf grampositive Bakterienzellen, die eine solche DNA-Sequenz enthalten oder durch einen Vektor oder ein Plasmid wie angegeben transformiert werden. Weiterhin schließt die Erfindung ein Verfahren zur selektiven Isolierung oder Identifikation grampositiver Bakterienzellen ein.
  • Die vorliegende Erfindung umfasst neue nützliche Methoden, die auf einem völlig neuen Konzept basieren, das die Verwendung von Oberflächenrezeptorstrukturen, die auf Bakterienzellen gefunden werden, einschließt. Diese neuen Methoden finden viele interessante Anwendungen, wobei die beiden Hauptaspekte der Erfindung in kurativer oder vorbeugender Immunologie einerseits und praktischen Verfahren zur selektiven Isolierung oder Identifikation grampositiver Bakterienzellen andererseits liegen.
  • In der modernen Impflehre besteht ein großes Interesse an der Entwicklung lebender Systeme zur Freisetzung rekombinanter Immunogene, da lebende Organismen oft eine gesteigerte Immunogenität gegenüber abgetöteten oder aus Untereinheiten bestehenden Impfstoffpräparaten zeigen. Eine Reihe lebender, rekombinanter, abgeschwächter Viren wurden als Träger fremder Epitope geprüft. Hierunter sind Vakkzinevirus (Moss et al., Nature 311, 67–69 (1984)), Adenovirus (Ballay et al., EMBO J. 4, 3861–3865 (1985)), Poliovirus (Evans et al., Nature 339, 385–388 (1989)) und Herpesvirus (Shih et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 5867–5870 (1984)). Auch bakterielle Systeme wurden unter Verwendung von lebenden rekombinanten Bakterien wie Salmonella (Hosieth und Stocker, Nature 291, 238–239 (1981)), Mycobakterien (Jacobs et al., Nature 327, 532–535 (1987)) und E. coli (O'Callaghan et al., Res. Microbiol. 141, 963–969 (1990)) entwickelt, wobei das gesamte Bakterium als Träger des rekombinanten Immunogens verwendet wird.
  • Weiterhin haben es moderne Methoden mit rekombinierter DNA ermöglicht, Antikörpergene direkt aus immunisierten Tieren oder aus in vitro immunisierten Lymphozyten zu isolieren und zu klonieren (Huse et al., Science, 1989, 246, 1275–1280), (Borrebaeck et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 1988, 85, 3995–3999). Genbibliotheken des Antikörpervorrats können in bakteriellen Vektorsystemen etabliert werden, was eine leichte in vitro-Handhabung der isolierten Immunglobulingene ermöglicht.
  • Durch "zufällige" Kombination von Genen, die für die variablen Regionen aus schweren (VH) und leichten (VL) Ketten kodieren, und die nachfolgende Expression in einem bakteriellen Wirt erhält man neue Formationen von VHNL-Paaren, die auf Bindungscharakteristiken geprüft werden können (Huse et al., Science, 1989, 246, 1275–1280). Jedoch erfordert die große Zahl der bei Verwendung dieser Strategie generierten Klone effiziente Prüfungsmethoden, um die Isolierung relevanter Klone in zweckmäßiger Weise zu ermöglichen. In letzter Zeit wurde eine Strategie beschrieben, die Bakteriophagen als Träger von auf der Oberfläche exponierten Immunglobulinfragmenten einsetzt, was die Selektion einzelner Phagenpartikel erlaubt, die Kombinationen aus VH/VL-Domänen tragen, welche an ein gewünschtes Antigen bindungsfähig sind (McCafferty et al., 1990, Nature, 348, 552–554).
  • Die Bedeutung der neuen Methoden für die klonspezifische Isolierung von Wirtsorganismen, die einzigartige, auf der Oberfläche exponierte Strukturen tragen, bezieht sich auch auf Felder wie Hormon-Hormon-Rezeptorerkennung (Bass et al., Proteins: Structure, Function and Genetics, 8, 309–314 (1990)) und Enzym-Substrat-Kompatibilität (Carter et al., Proteins: Structure, Function and Genetics, 6, 240–248 (1989)).
  • Jedoch können strukturelle Einschränkungen für die Eingliederung der Immunglobulinsegmente in das eingesetzte Phagenhüllenprotein zu einer negativen biologischen Selektion und einer nachfolgenden Minderung des theoretischen Vorrats an VH/VL Kombinationen führen. Zudem kann die geringe Zahl (von 1 bis 5 Molekülen) von Immunglobulinmolekülen, die auf jedem Phagenpartikel exponiert sind, wegen der geringen Gesamtaffinität des Phagenpartikels zu unüberwindbaren Problemen im Hinblick auf die Ausbeute von Kombinationen mit mäßigem Bindungspotenzial führen.
  • Es wurden auch Systeme zur Präsentation heterologer Proteine auf der Oberfläche von Escherichia coli beschrieben, wie Fusionen antigener Peptide an das Geißelfilament (Kuwajima et al., 1988, Bio/Technology, 6, 1080–1083) oder das äußere Membranprotein Lam B (O'Callaghan et al., Res. Microbiol. 141, 963–969 (1990)). Hier gibt es wiederum strukturelle Einschränkungen, die ein derartiges Konzept für praktische Anwendungen weniger brauchbar machen.
  • EP 244 221 beschreibt die Expression von hybriden Rezeptoren auf Säugerzellen. Diese Rezeptoren umfassen eine ligandenbindende Domäne und ein heterologes Reporter-Polypeptid und werden für die Ermittlung von Liganden und ihrer Antagonisten und Agonisten verwendet.
  • Als ihre Hauptaufgabe hat die vorliegende Erfindung die Bereitstellung von neuen Methoden, die auf dem Konzept der Verwendung rekombinanter Oberflächenrezeptorstrukturen basieren, für ein breites Spektrum praktischer Anwendungen.
  • Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, grampositive Bakterien als Träger für die Präsentation von Immunogenen zu benutzen, wobei die immunogene Antwort bedeutend verbessert und der Gebrauch konventioneller Adjuvantien weniger entscheidend oder sogar überflüssig ist.
  • Noch eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, Methoden bereitzustellen, die die Identifikation und/oder Isolierung grampositiver Bakterienzellen aus einer heterologen Population solcher Zellen, die unterschiedliche rekombinante Oberflächenrezeptorstrukturen tragen, ermöglichen.
  • Weitere Aufgaben der Erfindung sind die Bereitstellung von rekombinanten DNA-Sequenzen, von Expressionsvektoren oder Plasmiden, die solche Sequenzen enthalten, und von grampositiven Bakterienzellen, die solche Sequenzen beinhalten oder von solch einem Vektor oder Plasmid transformiert werden.
  • Für diese und andere Zwecke, die aus der folgenden Beschreibung hervorgehen werden, stellt die vorliegende Erfindung eine rekombinante DNA-Sequenz bereit, welche ein erstes DNA-Fragment, das für eine erste Aminosäuresequenz, die als ein in einem grampositiven Wirt funktionsfähiges Signalpeptid fungiert, kodiert, umfasst, das funktionsfähig an ein zweites DNA-Fragment gebunden ist, welches für eine zweite Aminosäuresequenz, die natürlicherweise nicht auf der Oberfläche grampositiver Bakterien gefunden wird und zu selektiver Interaktion imstande ist, kodiert, wobei besagtes zweites DNA-Fragment funktionsfähig an ein drittes DNA-Fragment gebunden ist, welches für eine dritte Aminosäuresequenz, die in einem grampositiven Wirt als eine die Zellwand überspannende und in der Membran verankerte Sequenz funktionsfähig ist, kodiert, wobei besagte rekombinante DNA-Sequenz für ein auf der Zelloberfläche verankertes und exponiertes heterologes Protein kodiert, das in seiner verankeren und exponierten Form antigen wirken kann oder eine rekombinante Oberflächenrezeptorstruktur ist.
  • In einer solchen rekombinanten DNA-Sequenz kann besagte zweite Aminosäuresequenz zu antigener Wirkung fähig sein oder kann von einem Antikörper (Immunglobulin) oder einem aktiven Fragment davon gebildet werden.
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die rekombinante DNA-Sequenz dergestalt, dass besagtes drittes DNA-Fragment für die die Zellwand überspannende und in der Membran verankerte Region von Protein A aus Staphylokokken oder Protein G aus Streptokokken kodiert.
  • Gemäß einem bevorzugten Aspekt der Erfindung stammt besagtes erstes DNA-Fragment von einer grampositiven Bakterienzelle, wie ein DNA-Fragment, das für das Signalpeptid von Protein A aus Staphylokokken kodiert.
  • Besagtes drittes DNA-Fragment kodiert vorzugsweise für die die Zellwand überspannende und in der Membran verankerte Region von Protein A aus Staphylokokken. Im Hinblick auf den immunologischen Aspekt der Erfindung ist es bevorzugt, dass besagtes zweites DNA-Fragment für eine Aminosäuresequenz kodiert, die eine Immunantwort hervorrufen kann, welche für Impfzwecke oder die Produktion von Antikörpern nutzbar sein wird.
  • Die Erfindung bezieht auch die Bereitstellung eines Expressionsvektors oder Plasmids ein, der bzw. das eine rekombinante DNA-Sequenz wie oben umrissen enthält. Gemäß der Erfindung ist ein solcher Vektor oder ein solches Plasmid zur Replikation in einem grampositiven bakteriellen Wirt fähig.
  • Weiterhin deckt die Erfindung grampositive Bakterienzellen ab, die eine rekombinante DNA-Sequenz wie oben definiert enthalten oder durch einen Vektor oder ein Plasmid, die eine solche rekombinante DNA-Sequenz enthalten, transformiert sind.
  • Schließlich stellt die Erfindung ein Verfahren zur selektiven Isolierung oder Identifikation von grampositiven Bakterienzellen aus einer heterologen Population solcher Zellen bereit, worin die Zellen verschiedene rekombinante Oberflächenrezeptorstrukturen tragen, obgleich jede individuelle Zelle mehrere Kopien einer spezifischen rekombinanten Oberflächenrezeptorstruktur trägt. Ein solches Verfahren bezieht den Schritt ein, dass man die besagte heterogene Zellpopulation mit einem spezifischen interagierenden Partner wie einem Antigen wechselwirken lässt, was die Identifikation und/oder Isolierung von Zellen, die eine spezifische rekombinante Oberflächenrezeptorstruktur tragen, ermöglicht. Gemäß einem Aspekt eines solchen erfinderischen Verfahrens können besagte Rezeptorstrukturen aus Antikörpern oder aktiven Fragmenten davon gebildet werden.
  • Es ist bevorzugt, dass besagter interagierender Partner in einer immobilisierten Form verwendet wird, wobei Zellen, die eine spezifische Struktur tragen, effektiv isoliert werden können. Eine solche Immobilisierung wird vorzugsweise auf einem festen Träger wie in Form einer Säule vorgenommen.
  • Die vorliegende Erfindung wird in der folgenden Beschreibung von besonderen Ausführungsformen ausführlicher erläutert werden, die in Form von Beispielen wiedergegeben werden. Diese Beispiele nehmen Bezug auf die beigefügten 1 bis 9, deren Inhalte in den untenstehenden Legenden zu den Abbildungen erklärt werden.
  • Ausgangsmaterialien
  • Bakterienstämme und Klonierungsvektoren
  • Für die E. coli Expression und die Plasmidkonstruktionen wurde Escherichia coli Stamm RR1ΔM15 (Rüther, U., Nucl. Acids Res. 10, 5765–5772 (1982)) verwendet. Staphylococcus xylosus KL117 (Schleifer und Kloos, Int. J. Syst. Bacteriol. 25, 50–61 (1975)) wurde für die Expression rekombinanter Proteine auf der Zelloberfläche verwendet. pRIT28 (Hultman et al, Nucleos. and Nucleot. 7, 629–637 (1988)) pUC19 (Yanisch-Perron C., Vieira J. und Messing J., Gene 33, 103–119 (1985) pRIT24 (Hammarberg et al, Proc. Natl. Acad. Sci. 86, 4367–4371 (1989)) pHERAT und pLERAT (eine freundliche Gabe von Dr. Greg Winter MRC, Cambridge, Vereinigtes Königreich).
  • Alle Stämme, Vektoren, Oligonukleotide und Antikörper, die in den Beispielen verwendet wurden, sind in der Abteilung für Biochemie und Biotechnologie am Königlichen Institut für Technologie, Stockholm, Schweden, erhältlich.
  • Die Vektoren pSBB-M3-XB und pSBB-ScFv(D1.3)-XM wurden am 10. Mai 1991 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH in Braunschweig, Deutschland, hinterlegt und erhielten in Übereinstimmung mit dem Budapester Abkommen die Hinterlegungsnummern DSM 6516 beziehungsweise DSM 6517.
  • Bouillon
  • Tryptische Sojabouillon (30 g/l) mit Hefeextrakt (5 g/l) wurde von Difco Inc. bezogen und in sterilem Wasser gelöst und autoklaviert, bevor das entsprechende Antibiotikum zugegeben wurde.
  • Puffer
    • TST: Tris/HCl 25 mM pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,05% Tween 20.
    • PBS: 0,05 M Natriumphosphat pH 7,1, 0,15 M NaCl.
  • PCR-Amplifikation
  • PCR-Amplifikationen wurden auf einem Techne Programmable Dri Block PHC-1 vorgenommen.
    10 × PCR Puffer: 100 mM TRIS/HCl, pH 8,3, 500 mM KCl, 20 mM Mg2+, 1% Tween 20, 2 mM dNTPe und Oligonukleotidprimer wie in den Beispielen beschrieben [von jedem 5 pMol]
    DNA Polymerase: 0,5 Einheiten Ampli Taq® [Perkin Elmer Corp.]
    PCR Programm: 97°C, 0,5 Minuten; 65°C 1,0 Minute; 72°C, 1,0 Minute.
  • Figure 00070001
  • Oligonukleotide
    Figure 00080001
  • DNA-Sequenzierung
  • Die Festphasen-DNA-Sequenzierung wurde wie bei Hultman et al [Nucl. Acids Res. 17, 4937–4946 (1989)] beschrieben durchgeführt.
  • Affinitätsreinigung von Proteinen [HSA und HEL]
  • Zellen, die die verschiedenen Konstrukte enthielten, wurden über Nacht in Bouillon, in die 100 mg/l Ampicillin zugegeben waren, gezüchtet. Das Medium wurde zunächst durch Zentrifugation bei 5000 g und anschließend durch eine zweite Zentrifugation bei 9000 g geklärt. Geklärtes Medium wurde direkt auf HSA-Sepharose oder HEL-Sepharose aufgetragen. Nach Waschung mit 1 × TST gefolgt von 0,5 mM NH4Ac, pH 5,0 wurden die Proteine mit 0,5 M HAc, pH 2,8 eluiert. Es wurde die Absorption bei 280 nm gemessen und relevante Fraktionen wurden lyophilisiert.
  • SDS-PAGE
  • Die Proteine wurden gelöst und für 5 Minuten in 2,5% Natriumdodecylsulfat [SDS], 5% Dithiothreitol [DTT] und 0,01% Bromphenolblau [BFB] gekocht, bevor sie für 30 Minuten bei 10 mA entsprechend dem PHASTTM System [Pharmacia-LKB Biotechnology, Schweden] auf ein 10–15% Gradienten-Polyacrylamidgel aufgetragen wurden. Die Gele wurden anschließend mit Coomassie Brilliant Blau gefärbt.
  • Routinemethoden
  • Methoden, die routinemäßig in der Molekularbiologie verwendet werden, wie der Verdau von DNA mit Endonukleasen, Ligation von DNA-Fragmenten etc, sind nicht beschrieben.
  • Präparation und Transformation von Protoplasten
  • Die Präparationen und Transformationen von Protoplasten von S. xylosus wurden wie von Götz et al (J. Bacteriol. 145, 74–81 (1981)) beschrieben durchgeführt.
  • DNA-Präparationen aus Staphylokokken
  • Minipräparationen von Plasmid DNA aus transformierten Staphylokokken wurden unter Verwendung einer modifizierten alkalischen Extraktionsmethode (Birnboim und Doly, Nucl. Acids Res. 7, 1513–1523 (1979)) durchgeführt. Zellen, die die verschiedenen Konstrukte enthielten, wurden über Nacht in 1,5 ml Bouillon, in die 20 mg/l Chloramphenicol zugegeben waren, gezüchtet. Vor dem Standardprotokoll wurden die Zellen eine Stunde lang bei 37°C mit 5 μg Lysostaphin in 100 μl Salzpuffer inkubiert.
  • Antiseren vom Kaninchen
  • Das Kaninchen-Antiserum R120 wurde von einem Kaninchen gewonnen, das zweimal intramuskulär mit 60 μg von präformierten Influenza Membran-Glycoprotein ISCOMs (Morein et al., Nature 308, 457–460 (1984)), die kovalent an eine Mischung der Fusionsproteine ZZ-M3 und ZZ-M5 (Ståhl et al., Gene 89, 187–190 (1990)) gekoppelt waren, immunisiert worden war.
  • Die Präparation der Influenza ISCOMs und die Ankoppelung der Fusionsproteine wurden wie von Lövgren et al. (J. Immunol. Meth. 98, 137–143 (1987)) beschrieben durchgeführt. Das Antiserum R120 reagierte im ELISA stark mit dem M3 Peptid, war mit der BB Region nicht reagibel und konnte folglich zur Erkennung des M3 Peptids auf der Oberfläche von Staphylokokken verwendet werden. Das Antiserum R102 wurde von einem Kaninchen gewonnen, das zweimal intramuskulär mit dem Fusionsprotein BB-M5 (Ståhl et al., Gene 89, 187–190 (1990)) in Freunds Adjuvans immunisiert worden war. Für die erste Injektion wurde Freunds komplettes Adjuvans verwendet, und Freunds inkomplettes Adjuvans wurde für die zweite Injektion verwendet. Das Antiserum R102 reagierte im ELISA stark mit der BB Region, während mit dem M3 Peptid keine Reaktionsfähigkeit demonstriert werden konnte. Daher war das Antiserum R102 für die Erkennung von BB auf der Oberfläche von Staphylokokken geeignet.
  • Immunassay zur Erkennung von Peptiden auf der Oberfläche von S. xylosus
  • Zellen, die die verschiedenen Konstrukte enthielten, wurden bei 37°C über Nacht in Bouillon, in die Chloramphenicol (20 mg/l) zugegeben war, gezüchtet. Die Zellen wurden zweimal in PBS gewaschen. Multitest-Objektträger mit 15 Probentaschen (Flow laboratories) wurden mit Beschichtungspuffer (15 mM Na2CO3, 35 mM NaHCO3, pH 9,6) für 30 Minuten in einer feuchten Kammer bei Raumtemperatur inkubiert. Der Beschichtungspuffer wurde mit einem Tropfen von Bakterien (107 Bakt./ml) in PBS ersetzt, und die Objektträger wurden in einer feuchten Kammer für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Ungebundene Bakterien wurden mit PBS weggewaschen und die Einzelschicht der Zellen wurde für einige Sekunden mit 1% Glutaraldehyd in PBS fixiert. Schließlich wurden die Objektträger in destilliertem Wasser gewaschen und luftgetrocknet, bevor sie bei –20°C gelagert wurden. Die Antiseren vom Kaninchen wurden 1 : 1000 in PBS verdünnt, ein Tropfen wurde zu jeder Probentasche zugegeben und in einer feuchten Kammer für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Nach viermaliger Waschung mit PBS wurden die Objektträger mit biotinylierten Anti-Kaninchen IgG-Molekülen (15 μg/ml) (Vector, USA) für 30 Minuten inkubiert und nochmals in PBS gewaschen, bevor Avidin-gekoppeltes Fluorescein Isothiocyanat (FITC) (50 μg/ml) (Vector, USA) für eine Inkubation von 30 Minuten zugegeben wurde. Schließlich wurden die Objektträger gewaschen, Ethidiumbromid wurde hinzugegeben, um bakterielle DNA sichtbar zu machen, und unter einem UV-Mikroskop untersucht.
  • Legende zu den Abbildungen
  • 1A Eine schematische Zeichnung des Gens, das für das Protein A aus Staphylokokken mit seinen verschiedenen Regionen kodiert. S ist die Signalsequenz. E, D, A, B und C ko dieren für die hochgradig homologen IgG-bindenden Domänen. X kodiert für die die Zellwand überspannende Region und M für die in der Membran verankerte Region.
  • 1B Eine Illustration des prozessierten Proteins A, das an die äußere Zelloberfläche von Staphylokokken gebunden ist.
  • 2A Die Plasmide pSBBmp18XM und pSBBm3XM, die in Beispiel 1 beschrieben sind. Beachte, dass in diesem Fall die BB-Region die serumalbuminbindende Region, die auf Protein G aus Streptokokken basiert, ist. Abkürzungen: bla, Gen, das für β-Lactamase kodiert; cat, Gen, das für Chloramphenicolacetyltransferase kodiert; OriE, Beginn der Replikation aus E. coli; OriS, Beginn der Replikation aus S. aureus.
  • 2B Eine Illustration der prozessierten und sezernierten Expressionsprodukte, für die von den Plasmiden pSBBmp18XM und pSBBM3XM kodiert wird, und die an die Zelloberfläche von Staphylokokken gebunden sind.
  • 3 Immunfluoreszenz von immobilisierten S. xylosus Zellen, die BB auf der Zelloberfläche exprimieren. Die Reaktionsfähigkeit wird mit BB-spezifischen Antiseren (R120) erreicht. Beachte, dass der innere Teil der Zellen durch die Ethidiumbromidfärbung erhellt ist.
  • 4 Immunfluoreszenz von immobilisierten S. xylosus Zellen, die BBM3 auf der Zelloberfläche exprimieren. Die Reaktionsfähigkeit wird mit M3-spezifischen Antiseren (R102) erreicht. Beachte, dass der innere Teil der Zellen durch die Ethidiumbromidfärbung erhellt ist.
  • 5 Immunfluoreszenz von immobilisierten S. xylosus Zellen, die BBM3 auf der Zelloberfläche exprimieren. Bei Verwendung von Seren, die vor der Immunisierung gewon nen worden waren, konnte keine Reaktionsfähigkeit erreicht werden. Beachte, dass der innere Teil der Zellen durch die Ethidiumbromidfärbung erhellt ist.
  • 6 Schematische Darstellung des Gens, das für das Fragment scFv des Antilysozym-Antikörpers D1.3 von der Maus kodiert. Die Anheftungsstellen für die verschiedenen Oligonukleotide sind mit Pfeilen gekennzeichnet.
  • 7 Schematische Darstellung des pSBB-scFv-XM Plasmids, das für das BB-scFv-XM-Fusionsprotein kodiert. Einige relevante Erkennungsstellen für Restriktionsenzyme sind dargestellt. CAT: Chloramphenicolacetyltransferase.
  • 8 Polaroidbild eines mit Ethidiumbromid gefärbten und UV-Licht [254 nm] ausgesetzten Gels, welches die verschiedenen DNA-Fragmente des Plasmids pSBB-scFv-XM enthält, die nach Verdau mit den angegebenen Restriktionsenzymen entstehen. Feld A: Aus S. xylosus Zellen präpariertes Plasmid; Feld B: Aus E. coli Zellen präpariertes Plasmid. Fragmentlängen von Marker-DNA sind angegeben [links].
  • 9 Schematische Darstellung der erwarteten Orientierung des Fusionsproteins BB-scFv-XM, für welches das Plasmid pSBB-scFv-XM kodiert, in der Zellwand des Wirtes S. xylosus.
  • 10 Schematische Darstellung des Plasmids pSBBG3XM, welches in S. xylosus Zellen enthalten ist und für die orale Applikation bei Mäusen verwendet wurde. S, Signalpeptid, welches von Protein A [SPA] aus Staphylokokken stammt; BB, Region, welche Serumalbumin bindet und von Protein G aus Streptokokken stammt; G3, das RSV-Epitop mit drei Kopien; XM, die in der Zellwand verankerte Region aus SPA; bla, Beta-Lactamase; OriE, Beginn der Replikation für E. coli; OriS, Beginn der Replikation für S. xylosus; CAT: Chloramphenicolacetyltransferase; Pspa, Promotor aus dem spa-Operon.
  • 11 Balkendiagramm-Darstellung der Ergebnisse aus dem ELISA-Test zum Nachweis von Anti-BBG3-Antikörpern, welche im Blut der immunisierten Mäuse zu verschiedenen Zeitpunkten nach der ersten oralen Gabe vorhanden sind.
  • BEISPIEL I
  • Durch Verdau des E. coli-Staphylokokken-Shuttlevektors pRIT16 (Abrahmsen et al., Nucl. Acids Res. 14, 7487–7500 (1986)) mit NotI-NdeI wurde das Gen für Protein A aus Staphylokokken (SPA) durch ein NotI-NdeI Genfragment ersetzt, welches aus dem Plasmid pEZZ318T (Nygren et al., J. Molec. Recogn. 1, 69–74 (1988)) herausgeschnitten worden war, für eine synthetische, divalente, IgG-bindende Domäne, ZZ, kodierte, und dem die Transkriptions-, Translations- und Sekretionssignale von SPA vorangestellt waren. Das resultierende Plasmid pSZZmp18T umfasste jeweils den Beginn der Replikation sowohl für E. coli als auch für Staphylococcus aureus. Ein Genfragment, das für die IgG-bindenden Regionen A, B und C sowie für die die Zellwand überspannende Region X und für die in der Membran verankerte Region M (1) von SPA kodiert, wurde unter Verwendung von HindIII und EcoRV aus dem Plasmid pSpA8 (Uhlen et al., J. Biol. Chem. 259, 1695–1702 (1984)) herausgeschnitten und stromabwärts von der Multiklonierungsstelle mp18 (Yanisch-Perron et al., Gene 33 103–119 (1985)) in Plasmid pSZZmp18T, das zuvor mit den gleichen Enzymen geschnitten worden war, eingefügt. Der resultierende Vektor wurde als pSZZmp18ABCXM bezeichnet. Das Plasmid wurde mit HindIII und PstI geschnitten und somit ein Genfragment, welches für die Regionen A, B, C und X sowie für die Hälfte der Region M aus SPA kodierte, entfernt. Die vollständige Sequenz der Regionen X und M konnte durch Anwendung einer Polymerasekettenreaktions-(PCR-)Strategie wiederhergestellt werden. Eine PCR-Amplifikation wurde unter Verwendung von STST34 als Stromaufwärts-Primer, STST33 als Stromabwärts-Primer und Plasmid pSpA8 als DNA-Matrize durchgeführt. Der Stromaufwärts-Primer erzeugte durch seine nicht bindende 5'-Sequenz eine Erkennungsstelle für HindIII, und der Stromabwärts-Primer überlappte eine vorgegebene Erkennungssequenz für PstI in der Region M von SPA. Das PCR-amplifizierte Fragment konnte somit mit HindIII und PstI gespalten und in Plasmid pRIT28 (Hultman et al., Nucleos. and Nucleot. 7, 629–638 (1988)), welches zuvor mit den gleichen Enzymen geschnitten worden war, subkloniert werden, was das Plasmid pRIT28XM hervorbrachte. Die Nukleotidsequenz des PCR-subklonierten Fragments wurde durch Festphasen-DNA-Sequenzierung (Hultman et al., Nucl. Acids Res. 17, 4937–4946 (1989)) bestätigt. Durch Verdau mit HindIII-PstI von pRIT28XM konnte das für die Region X und für die Hälfte der Region M von SPA kodierende Genfragment isoliert und an das mit HindIII-PstI geschnittene Plasmid pSZZmp18ABCXM (oben beschrieben) fusioniert werden, was im Plasmid pSZZmp18XM resultierte, mit kompletten und im Raster befindlichen Regionen X und M stromabwärts von der Multiklonierungsstelle mp18. Durch Verdau mit NotI-EcoRI von Plasmid pSZZmp18XM konnte das für ZZ kodierende Genfragment durch ein NotI-EcoRI – Fragment ersetzt werden, welches aus dem Plasmid pB1 B2mp18 (Ståhl et al., J. Immunol. Meth. 124., 43–52 (1989)) herausgeschnitten worden war, für eine serumalbuminbindende Region, als BB bezeichnet, von Protein G aus Streptokokken kodiert, und dem die Transkriptions-, Translations- und Sekretionssignale von SPA vorangestellt waren. Der resultierende Vektor pSBBmp18XM (2A) umfasste jeweils den Beginn der Replikation sowohl für E. coli als auch für Staphylococcus aureus. Die Multiklonierungsstelle mp18 im allgemeinen Expressionsvektor pSBBmp18XM wurde durch Verdau mit EcoRI-HindIII entfernt. Ein für ein hochgradig repetitives Peptid M3 kodierendes Genfragment (Ståhl et al., Gene 89, 187–193 (1990)) wurde aus dem Plasmid pRIT28M3 (Ståhl et al., Gene 89, 187–193 (1990)) herausgeschnitten, wobei das die Sequenz M3 beendende Stopcodon zuerst durch ortsgerichtete in-vitro-Festphasen-Mutagenese (Hultman et al., Nucl. Acids Res. 18, 5107–5112 (1990)) entfernt wurde. Das für M3 kodierende und mit EcoRI-HindIII geschnittene Genfragment wurde an das in ähnlicher Weise verdaute pSBBmp18XM ligiert, was das Plasmid pSBBM3XM (2A) hervorbrachte. Das Polypeptid M3 stammt vom hochgradig immunogenen C-terminalen Teil des Malaria-Blutstadium-Antigens Pf155/RESA (Berzins et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 1065–1069 (1986)).
  • Plasmid pSBBmp18XM kodiert für ein dreiteiliges Fusionsprotein, das das Signalpeptid von SPA, den serumbindenden Teil BB, der von Protein G von Streptokokken stammt, und die an die Zellwand bindenden XM Regionen von SPA umfasst. Nach Sekretion durch die Zellmembran wird das Signalpeptid abgeschnitten. Plasmid pSBBM3XM kodiert für ein vierteiliges Fusionsprotein, worin das Malaria-Antigenpeptid M3 zwischen den BB und XM Regionen angeordnet ist (2B).
  • Die Plasmide pSBBmp18XM und pSBBM3XM werden in Protoplasten, die aus Staphylococcus xylosus aufbereitet worden sind, transformiert (Details siehe unter "Ausgangsmaterialien"). Wie in Tabelle 1 dargestellt zeigte ein Immunassay, der jeweils für BB oder M3 spezifische polyklonale Antiseren vom Kaninchen verwandte, dass S. xylosus Zellen, die Plasmid pSBBmp18XM enthielten, BB auf der Zelloberfläche exprimierten (3), wohingegen Zellen, die pSBBM3XM enthielten, sowohl BB als auch M3 auf der Zelloberfläche exprimierten (4), was darauf hindeutet, dass sowohl die Sekretionssignale als auch die an die Zellwand bindende Komponente XM bei der Expression von rekombinanten Fusionsproteinen auf diese Weise funktionsfähig sind. S. xylosus Zellen ohne Plasmid waren jeweils sowohl bei Antiseren, die für BB spezifisch waren, als auch bei Antiseren, die für M3 spezifisch waren, negativ, und Seren, die vor der Immunisierung gewonnen worden waren, waren in allen Fällen negativ.
  • TABELLE 1
    Figure 00150001
  • BEISPIEL II
  • Durch PCR-Amplifikation unter Verwendung der Oligonukleotid-Primerpaare KS1/2 beziehungsweise KS3/4 bei den Plasmid-Vorlagen pHERAT und pLERAT, die die variablen Domänen der schweren [pHERAT] und leichten [pLERAT] Ketten des Antilysozym-Antikörpers D1.3 [McCafferty et al., 1990, Nature, 348, 552–554] beinhalten, konnten die für die beiden variablen Domänen kodierenden Genfragmente isoliert werden. Durch Verwendung der in die Primer integrierten geeigneten Erkennungsstellen der Restriktionsenzyme Eco RI und Bam HI wurden die Fragmente in pRIT28 inseriert, geeignet zur Festphasensequenzierung.
  • Nach Bestätigung der korrekten Sequenzen wurden die resultierenden Plasmide pRIT28-VH und pRIT28-VL getrennt als Matrizen in einer folgenden PCR-Amplifikation unter Verwendung der Oligonukleotid-Primerpaare KS6/2 [pRIT28-VH] beziehungsweise KS3/5 (pRIT28-VL] verwandt. Jeweils annähernd fünf [5] Nanogramm der resultierenden PCR-Produkte wurden anschließend gemischt, auf 85°C erhitzt und danach auf Raumtemperatur abkühlen gelassen. Nach Zugabe von 0,5 Einheiten Taq Polymerase [Perkin Elmer corp.] und PCR Puffer wurden zwei Standard-PCR-Zyklen ausgeführt, um doppelsträngige DNA zu erhalten. Dieses Verfahren resultiert wegen der überlappenden Sequenzen, die während der zweiten PCR durch die Oligonukleotide KS5 und KS6 eingegliedert worden sind, in der Verbindung der beiden für Immunglobulin kodierenden Genfragmente. Die verbindende DNA-Sequenz kodiert für ein hochgradig flexibles Brückenpeptid von 15 Aminosäuren zwischen den beiden Immunglobulin-Domänen. Das resultierende Genfragment von 730 Basenpaaren kodiert somit für ein aus einer einzigen Kette bestehendes Fragment Fv [scFv] des Antilysozym-Antikörpers D1.3 [6] wie durch die schematische Darstellung NH2-VL-Linker-VH-cooCOOH beschrieben. Um für weitere Klonierung ausreichende Mengen des für scFv kodierenden Fragments zu erhalten, wurden 20 zusätzliche PCR-Zyklen unter Einsatz der äußeren Primer KS3 und KS2 ausgeführt. Das resultierende PCR-Produkt wurde mit den Restriktionsenzymen Eco RI und Bam HI geschnitten und anschließend in den Klonierungsvektor pUC19 ligiert. Nach Bestätigung der Sequenz wurde ein Klon, der das korrekt zusammengesetzte Genfragment scFv enthielt, mit Eco RI und Bam HI gespalten, und das Fragment von 730 Basenpaaren wurde in die Eco RI- und Bam HI-Stellen des E. coli Expressionsvektors pRIT24 [Hammerberg et al., Proc. Natl. Acad. Sciences, USA, 86, 4367–4371] inseriert. Somit kodiert das resultierende Konstrukt pRIT24-scFv für die dreiteilige Verbindung ZZ-scFv-BB. Mit pRIT24-scFv transformierte E. coli Zellen wurden über Nacht bei 30°C in tryptischer Sojabouillon + Hefeextrakt, in die Ampicillin [100 mg/l] zugegeben war, gezüchtet.
  • Um die Stabilität und die biologische Aktivität des rekombinanten Fusionsproteins ZZ-scFv-BB zu untersuchen, wurde Kulturmedium aus der Übernacht-Fermentation über Human-Serum-Albumin- [HSA] beziehungsweise Hühnereiweiss-Lysozym-[HEL]Sepharosesäulen geschickt. Proteine, die mit 0,5 M HAc/NH4Ac pH 2,8 aus den Säulen eluiert worden waren, wurden lyophilisiert und durch SDS-PAGE analysiert. Sowohl für das HSA- als auch für das HEL-affinitätsgereinigte Material wurde die Hauptbande mit voller Länge gefunden. Die erfolgreiche Affinitätsreinigung des Fusionsproteins ZZ-scFv-BB unter Verwendung von HEL deutet darauf hin, dass das Immunglobulinfragment scFv in der Lage ist, sich zu einer nativen, biologisch aktiven Struktur zu falten, obwohl es von den beiden Affinitätsenden ZZ und BB flankiert wird.
  • In Beispiel I ist die Konstruktion des Shuttlevektors pSBBmp18XM beschrieben, der sowohl in E. coli- als auch in Staphylokokken-Zellen zur Replikation fähig ist. Um diesen Vektor für die Insertion des Fragments scFv anzupassen, wurde der Linker mp18 mit dem kürzeren Linker mp8, der aus M13mp8 [Messing et al., 1982, Gene 19, 269–276] stammt, ersetzt, um pSBBmp8XM hervorzubringen. Das für scFv kodierende Genfragment wurde durch Verdau mit Eco RI- und Bam HI aus dem Plasmid pUC19-scFv freigesetzt und anschließend in den Vektor pSBBmp8XM ligiert.
  • S. xylosus Zellen wurden mit dem resultierenden Konstrukt pSBB-scFv-XM [7] transformiert, und brauchbare Kolonien wurden über Nacht bei 37°C in TSB, in die Chloramphenicol [20 mg/l] zugegeben war, zur Plasmidpräparation gezüchtet. Die Restriktionsenyzmkartierung des aus den transformierten Staphylokokken-Zellen präparierten Konstrukts pSBB-scFv-XM stimmte mit dem erwarteten Ergebnis [8] überein. Dies zeigt, dass das Konstrukt pSBB-scFv-XM im Wirt Staphylokokkus genetisch stabil ist. Dieses Konstrukt kodiert für das Fusionsprotein BB-scFv-XM, das dazu vorgesehen ist, in die Zellwand des Wirtes eingebettet zu werden [9].
  • BEISPIEL III
  • Entwicklung spezifischer Antikörper in Mäusen nach oraler Verabreichung
  • Ein Gen, welches für ein Peptid, G3, das drei [3] Kopien der C-terminalen Wiederholungssequenzen, VSICSNNPTCWAISKN, des Glycoprotein-G-Epitops [Trudel et al. (1991), Virology 185: 749–757] aus dem Respiratorischem Syncytial-Virus [RSV] umfasst, kodiert, wurde unter Verwendung der Oligonukleotide:
    TH5: 5'- ATGTATCTATCTGCTCTAACAACCCGACTTGTTGGGCTATCTCCAAAA-3' und
    TH6: 5'- ACATTTTTGGAGATAGCCCAACAAGTCGGGTTGTTAGAGCAGATAGAT-3'
    gemäß dem Polymerisationskonzept, welches in Beispiel I für die Konstruktion des Peptids M3 beschrieben wurde, konstruiert und in pRIT28E inseriert, was pRIT28EG3 hervorbrachte. Die Nukleotidsequenz des für G3 kodierenden Gens wurde durch Festphasen-DNA-Sequenzierung [Hultman et al. (1989) Nucl. Acids Res. 17: 4937–4946] verifiziert. Das Genfragment G3 wurde mit EcoRI und HindIII aus pRIT28EG3 herausgeschnitten und in den in ähnlicher Weise gespaltenen Vektor pBB2mp18 [Ståhl et al. (1989), J. Imm. Meth. 124: 43–52] ligiert. Der resultierende Vektor pBBG3 [5153 bp] kodiert für ein als BBG3 [30,9 kDa] bezeichnetes Fusionsprotein, das aus der serumalbuminbindenden Region von Protein G aus Streptokokken [SPG] und der dreifachen Peptidwiederholung besteht. E. coli Zellen, die das Plasmid pBBG3 enthielten, wurden über Nacht in 500 ml tryptischer Sojabouillon [30 g/l], in die Ampicillin [100 mg/l] zugegeben war, gezüchtet. Die Fusionsproteine wurden durch Affinitätschromatographie auf HSA-Sepharose nach Nygren et al [J. Mol. Recognit. 1: 69–74] aus dem Medium und dem periplasmatischen Raum gereinigt.
  • Das für G3 kodierende Genfragment wurde aus dem Plasmid pRIT28EG3, das mit EcoRI und HindIII gespalten worden war, nach Entfernung des die Sequenz G3 abschließenden Stopcodons durch ortsgerichtete Festphasen-Mutagenese wie für das Gen M3 in Beispiel I beschrieben wiedergewonnen. Das herausgeschnittene Fragment wurde in das in ähnlicher Weise gespaltene pSBBmp18XM ligiert, was das Plasmid pSBBG3XM (10) hervorbrachte. Plasmid pSBBG3XM kodiert für ein Fusionsprotein aus vier Peptiden und umfasst das Signalpeptid aus SPA, die aus SPG stammende serumalbuminbindende Region BB, das antigene RSV-Peptid G3 und die an die Zellwand bindenden Regionen XM aus SPA.
  • Die Plasmide pSBBmp18XM und pSBBG3XM wurden in aus Staphylococcus xylosus präparierte Protoplasten transformiert [Details siehe unter "Ausgangs-materialien"], und die Zellen wurden über Nacht gezüchtet. Vier weiblichen OFI-Mäusen [IFFA CREDO, Frankreich], die beim Beginn der Experimente sechs Wochen alt waren, wurden während einer dreiwöchigen Periode jeden Dienstag, Mittwoch, Donnerstag und Freitag jeweils 1010 S. xylosus Bakterien [mikroskopisch unter Verwendung einer verbesserten Zählkammer nach Neubauer gezählt] aus den Übernacht-Kulturen, die das Plasmid pSBBG3XM enthielten, oral verabreicht, gefolgt von einer zweiten dreiwöchigen Periode nach Tag 43. An den Tagen 21, 28, 35 und 63 wurde voneinander unabhängig Blut abgenommen und unter Verwendung von gereinigtem Protein BBG3 als Beschichtungs-Antigen in einem ELISA-Test auf die Anwesenheit von Anti-BBG3-Antikörpern untersucht: Mikrotiterplatten wurden über Nacht mit einer auf 1,25 μg/ml konzentrierten Lösung von BBG3 beschichtet, gefolgt von einer zwei Stunden dauernden Sättigung mit 1% entrahmter Milch in PBS. Die Blutproben der immunisierten Mäuse wurden anschließend aufgetragen, und nach Inkubation und nachfolgender ausführlicher Spülung wurden die gebundenen Antikörper unter Verwendung von Anti-Maus IgG-alkalische Phosphatase Konjugat [Sigma Inc. Reagens No. A1902] zusammen mit chromogenem Substrat für alkalische Phosphatase, welches Monitoring bei 405 nm ermöglichte, erfasst. Tests wurden in dreifacher Ausführung vorgenommen, mit Serum, welches am Tag Null entnommen worden war, zur Verwendung als negative Kontrolle, und ein polyklonales anti-BBG3 Serum vom Kaninchen wurde als positive Kontrolle verwendet. Die in 11 dargestellten Ergebnisse zeigen die Entwicklung von BBG3-spezifischen Immunantworten in allen vier Tieren während der 63-tägigen Behandlung.

Claims (12)

  1. Rekombinante DNA-Sequenz umfassend ein erstes DNA-Fragment, welches für eine erste Aminosäuresequenz, die als ein in einem grampositiven Wirt funktionsfähiges Signalpeptid fungiert, kodiert, wobei besagtes erstes DNA-Fragment funktionsfähig an ein zweites DNA-Fragment gebunden ist, welches für eine zweite Aminosäuresequenz, die natürlicherweise nicht auf der Oberfläche grampositiver Bakterien gefunden wird und zu selektiver Interaktion imstande ist, kodiert, wobei besagtes zweites DNA-Fragment funktionsfähig an ein drittes DNA-Fragment gebunden ist, welches für eine dritte Aminosäuresequenz, die in einem grampositiven Wirt als eine die Zellwand überspannende und in der Membran verankerte Sequenz funktionsfähig ist, kodiert, wobei besagte rekombinante DNA-Sequenz für ein auf der Zelloberfläche verankertes und exponiertes heterologes Protein kodiert, das in seiner verankerten und exponierten Form antigen wirken kann oder eine rekombinante Oberflächenrezeptorstruktur ist.
  2. Rekombinante DNA-Sequenz nach Anspruch 1, die für ein heterologes Protein kodiert, welches eine für Impfzwecke oder für die Produktion von Antikörpern nutzbare Immunreaktion hervorrufen kann.
  3. Rekombinante DNA-Sequenz nach Anspruch 1 oder 2, worin besagtes drittes DNA-Fragment für die die Zellwand überspannende und in der Membran verankerte Region von Protein A aus Staphylokokken oder Protein G aus Streptokokken kodiert.
  4. Rekombinante DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin besagtes erstes DNA-Fragment von einer grampositiven Bakterienzelle stammt.
  5. Rekombinante DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin besagtes drittes DNA-Fragment für die die Zellwand überspannende und in der Membran verankerte Region von Protein A aus Staphylokokken kodiert.
  6. Rekombinante DNA-Sequenz nach Anspruch 5, worin besagtes erstes DNA-Fragment für das Signalpeptid von Protein A aus Staphylokokken kodiert.
  7. Expressionsvektor oder Plasmid mit einer rekombinanten DNA-Sequenz nach einem der vorangehenden Ansprüche und der Fähigkeit zur Replikation und zur Expression in einem grampositiven bakteriellen Wirt, um ein auf der Zelloberfläche verankertes heterologes Protein zu erzeugen, welches in seiner verankerten und exponierten Form antigen wirken kann oder eine rekombinante Oberflächenrezeptorstruktur ist.
  8. Grampositive Bakterienzelle, die eine rekombinante DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 6 enthält oder durch einen Vektor oder ein Plasmid nach Anspruch 7 transformiert ist.
  9. Verfahren zur selektiven Isolierung oder Identifikation grampositiver Bakterienzellen nach Anspruch 8 aus einer heterologen Population solcher Zellen, die unterschiedliche rekombinante Oberflächenrezeptorstrukturen tragen, umfassend den Schritt, dass man die besagte heterologe Zellpopulation mit einem spezifischen interagierenden Partner wechselwirken lässt, der die Identifikation und/oder Isolierung von Zellen, die eine spezifische rekombinante Oberflächenrezeptorstruktur tragen, ermöglicht.
  10. Verfahren nach Anspruch 9, worin besagte Rezeptorstrukturen von Antikörpern oder aktiven Fragmenten davon gebildet werden.
  11. Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, worin besagter interagierender Partner in einer immobilisierten Form zur Isolierung von Zellen, die besagte spezifische Struktur tragen, benutzt wird.
  12. Verfahren nach Anspruch 11, worin besagter interagierender Partner auf einem festen Träger immobilisiert ist.
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