DE3390105C2 - - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft die in den Ansprüchen 1 bis 3 angegebene, rekombinante Deoxyribonucleinsäure, welche für Pro­ tein A oder ein aktives Derivat davon kodiert, wie auch ein Verfahren zu ihrer Herstellung nach Anspruch 4. Die Erfindung betrifft ebenfalls nach den Ansprüchen 5 bis 10 einen transformanten Mikroorganismus, welcher eine derartige rekombinante Deoxyribonucleinsäure einschließt, ein Verfahren zu seiner Herstellung nach Anspruch 11, sowie Protein A oder ein Derivat nach Anspruch 13 und die Herstellung von Protein A oder eines seiner akti­ ven Derivate nach Anspruch 12.

Protein A ist eine Zellwandkomponente des Bakteriums Sta­ phylococcus aureus, welches im folgenden als S. aureus be­ zeichnet wird, und zeichnet sich durch eine spezifische serologische Reaktion mit Säugetierimmunoglobulinen aus. Im Gegensatz zu den normalen Antigen-Antikörper-Reaktionen bindet jedoch Protein A den Fc-Teil aller Subklassen huma­ nen Immunoglobulins Typ G oder IgG, ausgenommen IgG₃, wo­ bei der Fab-Teil davon für Antigen- und Haptenkupplung freigelassen wird. Diese Eigenschaft hat bewirkt, daß Pro­ tein A eine weitverbreitete Verwendung sowohl bei quantita­ tiven als auch bei qualitativen immunchemischen Techniken besitzt. An einen Träger kovalent gebunden, ist Protein A somit ein ausgezeichnetes Immunosorbens für die Isolierung von IgG. Weiterhin hat die Komplexierung von Protein A am IgG gezeigt, daß das Komplementsystem aktiviert wird, und kürzlich wurde Protein A bei der Behandlung von Krebs und Immunkomplexstörungen untersucht, indem man die IgG-Komple­ xe aus dem Blutplasma damit entfernte.

Protein A, dessen genaue Struktur in Abhängigkeit von sei­ nem Ursprung variieren kann, besitzt, wie in der Literatur berichtet wurde, ein Molekulargewicht von etwa 42 000 und eine stark ausgedehnte Form. Die Sequenzanalyse hat zwei funktionelle und strukturell unterschiedliche Regionen des Moleküls angezeigt. Der N-terminale Teil mit einem Moleku­ largewicht von 27 000 besteht aus vier oder fünf aufeinan­ derfolgenden und stark homologen IgG-Bindungseinheiten, wovon jede ein Molekulargewicht von etwa 7000 aufweist. Der C-terminale Teil des Proteins, der ein Molekulargewicht von etwa 15 000 besitzt, ist eine Region, die kovalent an den Peptidoglykanmolekülteil der Zellwand gebunden ist und gar keine Fc-Bindungsfähigkeit hat. Eine vorgeschlagene primäre Struktur für den Fc-Bindungsteil von S.-aureus-Pro­ tein A ist in Sjödahl, J., Eur. J. Biochem. 73, 343-351 (1977) und 78, 471-490 (1977) angegeben.

Die zuletzt genannte Druckschrift betrifft Strukturstudien an den vier repetitiven Fc-Bindungsregionen des Proteins A aus Staphylococcus aureus. Dabei wurden die Primärstrukturen der vier stark homologen Fc-Bindungsregionen in Protein A, d. h. die Regionen D, A, B und C, aufgeklärt. Jedoch ist dieser Druckschrift nicht die vollständige Sequenz des Proteins A zu entnehmen.

Die Biosynthese von Protein A findet während der exponen­ tiellen Wachstumsphase statt. Die Hauptmenge des Proteins ist an die Zellwand gebunden, jedoch gibt es in der statio­ nären Wachstumsphase immer eine gewisse Freisetzung, bedingt durch Autolyse. Das Protein A kann von solchen S.-aureus- Stämmen durch Digestion mit dem Enzym Lysostaphin und an­ schließende Affinitätschromatographie an Agarose mit daran gebundenem IgG freigesetzt werden. Es gibt weiterhin Stäm­ me von S. aureus, die Protein A nicht in die Zellwand ein­ bauen können, wobei alles gebildete Protein A in das Wachstumsmedium ausgeschieden wird. Eine solche extrazellu­ läre Produktion von Protein A bei methicillinresistenten Stämmen ist üblich und erleichtert natürlich die Isolierung des Proteins A.

Die Erzeugung von Protein A aus Stämmen von S. aureus be­ sitzt jedoch zwei Hauptnachteile. Der eine ist die pathoge­ ne Natur der Bakterien, die besondere Sicherheitsvorkehrun­ gen beim Züchtungsverfahren erfordert, und der zweite sind die relativ geringen Mengen an Protein A, die von den der­ zeit verwendeten S.-aureus-Stämmen gebildet werden. Es be­ steht daher ein großer Bedarf an einem Mikroorganismus, der Protein A oder ein aktives Derivat davon erzeugen kann, wo­ bei dieser Mikroorganismus einerseits weniger oder bevor­ zugt nicht pathogen sein soll und andererseits eine erhöhte Produktion von Protein A ergibt. Ein derartiger Mikroorga­ nismus wird durch die vorliegende Erfindung zur Verfügung gestellt.

Die vorliegende Erfindung, die auf dem sogenannten Gebiet der Gentechnologie liegt, betrifft ein rekombinantes DNA- Molekül, welches eine Deoxyribonucleotidsequenz, die die genetische Information für Protein A oder ein aktives Deri­ vat davon enthält, umfaßt, d. h. es ist fähig, mindestens einen IgG-Fc-Teil daran oder Vorstufen daran zu binden. Ein solches rekombinantes DNA-Molekül oder ein sogenannter Hy­ bridvektor kann in irgendeinen geeigneten Wirtmikroorganis­ mus eingeführt werden, der dann unter Bildung des gewünsch­ ten Protein-A-Materials gezüchtet werden kann. Durch geeig­ nete Auswahl des DNA-Transfervektors wie auch des Wirtmikro­ organismus kann ein transformierter Mikroorganismus erhal­ ten werden, der einerseits nichtpathogen ist und anderer­ seits wesentlich größere Mengen an Protein A ergibt als die bis heute verwendeten S.-aureus-Stämme, bedingt durch eine Selbstreplikation der Vektor-DNA in den Wirtzellen, wobei eine vielfache Menge an Genen, die für Protein A kodieren, erzeugt wird.

Die relativ neue rekombinante DNA-Technologie oder Gentech­ nologie, auf die oben Bezug genommen wurde, erlaubt die Ein­ führung einer spezifischen Nucleotidsequenz, die für ein gewünschtes Protein oder Polypeptid kodiert, in eine Bakte­ rien- oder andere geeignete Wirtzelle und verleiht dieser da­ bei die gewünschte Eigenschaft. Die DNA kann durch chemi­ sche Synthese hergestellt werden oder aus einem anderen Bak­ terienstamm oder einem anderen Organismus extrahiert werden. Die Konstruktion solcher transformanten Mikroorganismen kann die folgenden Stufen umfassen: Erzeugung einer doppel­ strangigen DNA-Sequenzkodierung für das gewünschte Protein oder Polypeptid; Bindung der DNA an eine geeignete Stelle in einem geeigneten Klonierungsvehikel oder Vektor unter Bildung der rekombinanten DNA-Moleküle, von denen einige das gewünschte Proteinkodierungsgen enthalten; Transformie­ rung des geeigneten Wirtmikroorganismus mit den rekombinan­ ten DNA-Molekülen; Screening der entstehenden Klone auf die Anwesenheit des Protein- oder Polypeptidkodierungsgens durch geeignete Maßnahmen; und Auswahl und Vervielfältigung von einem oder mehreren positiven Klonen. Gegebenenfalls können eine oder mehrere Subklonierungen durchgeführt wer­ den, welche die Extraktion und Spaltung der Proteinkodie­ rungs-DNA, den Einsatz der gespaltenen Fragmente in ein zweites Klonierungsvehikel oder einen Vektor und das Scree­ ning auf die Anwesenheit des Protein- oder Polypeptidkodie­ rungsgens umfassen.

Es wurden verschiedene Bakterien sowie auch nichtbakteriel­ le Proteine erhalten, unter Anwendung derartiger rekombi­ nanter DNA-Technologie, hauptsächlich in Escherichia coli, gewöhnlich als E. coli bezeichnet, und in der Literatur be­ reits beschrieben. Keines der derzeit bekannten rekombinan­ ten DNA-Verfahren betrifft jedoch die Synthese von Protein A oder Protein-A-artigen Materialien wie die vorliegende Er­ findung. Die Erzeugung von Protein A unter Anwendung der re­ kombinanten DNA-Technologie erfordert zusätzlich, daß eine DNA-Sequenz von mindestens teilweise unbekannter Struktur, d. h. die DNA-Sequenz, die für Protein A in einem geeigneten Wirt kodiert, in einem sehr komplexen Gemisch aus DNA-Se­ quenzen gefunden und daraus abgetrennt wird, wie es im fol­ genden näher erläutert wird. Wenn die DNA-Sequenz einmal identifiziert worden ist, erlaubt die rekombinante DNA-Tech­ nologie die Möglichkeit zur Erzeugung von Mikroorganismen, die nicht nur Protein A sondern ebenfalls modifizierte Pro­ tein-A-Produkte mit Protein-A-Aktivität, wie Fragmente von Protein A und oligomere Formen von Protein A oder ihre ak­ tiven Fragmente oder Kombinationen, ergeben, wie es im fol­ genden näher erläutert werden wird.

Die vorliegende Erfindung betrifft somit einen neuen Mikro­ organismus, der durch rekombinante DNA-Technologie erzeugt worden ist, dieser Mikroorganismus kann Protein A oder ein aktives Derivat davon, wie es im folgenden erläutert wird, bilden. Die Erfindung betrifft weiterhin die Herstellung eines solchen Mikroorganismus durch Transformation eines Wirtorganismus mit einem rekombinanten DNA-Molekül.

Die Erfindung betrifft außerdem ein rekombinantes DNA-Molekül, welches mindestens eine DNA-Sequenz, kodierend für Protein A oder ein Poly­ peptidfragment davon, welches fähig ist, mindestens ein Immunglobulin an seinem Fc-Teil zu binden, enthält, wobei diese Deoxynucleotidsequenz mindestens eine der DNA-Se­ quenzen, die in den Fig. 3A bis D als kodierend für die IgG-Bindungsregionen A, B, C, D und E angegeben sind, um­ faßt und die Fig. 3A bis D Bestandteil dieses Anspruchs sind, und ein Verfahren zu seiner Herstellung.

Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstel­ lung von Protein A oder eines aktiven Derivats davon durch Züchtung des erfindungsgemäßen transformierten Mikroorganis­ mus.

In der vorliegenden Beschreibung und den Ansprüchen bedeu­ tet der Ausdruck "Protein A" irgendein Proteinmakromolekül mit einer analogen oder ähnlichen Struktur und immunologi­ schen und biologischen Aktivitäten der Protein-A-Substanz, die durch Staphylococci, wie die natürlichen Stämme von S. aureus, erzeugt wird, einschließlich irgendwelcher Mutanten davon. Daher können strukturelle Variationen zwischen den verschiedenen Verbindungen auftreten. Der Ausdruck "aktives Derivat" (von Protein A) bedeutet irgendein Polypeptidfrag­ ment von Protein A, welches mindestens ein Immunoglobulin an seinem Fc-Teil binden kann, oder ein freies Fc-Fragment sowie auch oligomere Formen von Protein A oder aktiven Po­ lypeptidfragmenten davon. Solche oligomeren Formen können zwei oder mehrere gebundene Protein-A-Moleküle, aktive Po­ lypeptidfragmente oder Kombinationen davon enthalten, und sie können eine gesteigerte IgG-Bindungsaktivität, vergli­ chen mit dem normalen Protein-A-Molekül, aufweisen. Die Aus­ drücke "Protein A" und "aktives Derivat" sollen weiterhin Protein-A-Moleküle und aktive Protein-A-Derivate, wie oben definiert, umfassen, die eine Nicht-Protein-A-Peptidsequenz daran gebunden aufweisen, beispielsweise bedingt durch Ein­ satz von chemisch synthetisierten Oligonucleotiden beim Bau bzw. bei der Konstruktion des Klonierungsvehikels.

Weitere spezifische Ausdrücke, die in der folgenden Be­ schreibung verwendet werden (wovon einige bereits oben ver­ wendet wurden), werden im folgenden näher erläutert.
Nucleotid:

Eine monomere Einheit von DNA oder RNA, die ei­ nen Zuckermolekülteil (Pentose), ein Phosphat und eine stick­ stoffhaltige heterocyclische Base aufweist. Die Base ist an den Zuckermolekülteil über ein glycosidisches Kohlenstoff­ atom (1′-Kohlenstoff der Pentose) gebunden, und diese Kombi­ nation von Base und Zucker ist ein Nucleosid. Die Base kenn­ zeichnet das Nucleotid. Die vier DNA-Basen sind Adenin ("A"), Guanin ("G"), Cytosin ("C") und Thymin ("T"). Die vier RNA- Basen sind A, G, C und Uracil ("U").
DNA-Sequenz:

Eine lineare Reihe von Nucleotiden, die an­ einander über Phosphodiesterbindungen zwischen den 3′- und 5′-Kohlenstoffatomen benachbarter Pentosen gebunden sind.
Codon:

Eine DNA-Sequenz von drei Nucleotiden (ein Triplet), welche über Messenger-RNA ("mRNA") eine Aminosäure, ein Translationsstartsignal oder ein Translationsterminationssi­ gnal verschlüsselt. Beispielsweise verschlüsseln die Nucleotid­ triplette TTA, TTG, CTT, CTC, CTA und CTG für die Aminosäure Leucin ("Leu"), TAG, TAA und TGA sind Translationsstopsigna­ le, und ATG ist ein Translationsstartsignal.
Plasmid:

Eine nichtchromosomale doppelstrangige DNA-Se­ quenz, welche ein intaktes "Replikon" aufweist, so daß das Plasmid in der Wirtzelle vervielfältigt wird. Wenn das Plas­ mid in einen unizellularen Wirtorganismus gegeben wird, ändern sich die Eigenschaften des Organismus oder werden transformiert als Ergebnis der DNA des Plasmids. Beispiels­ weise transformiert ein Plasmid, welches ein Gen für die Tetracyclinresistenz (Tet) trägt, eine Wirtzelle, die zuvor gegenüber Tetracyclin empfindlich war, in eine, die dagegen resistent ist. Eine Wirtzelle, die durch ein Plasmid trans­ formiert worden ist, wird als "Transformant" bezeichnet.
Phage oder Bacteriophage:

Bakterieller Virus, wovon viele DNA-Sequenzen aufweisen, die in eine Proteinumhüllung oder -schutzüberzug eingekapselt sind.
Klonierungsvehikel bzw. Klonvehikel:

Ein Plasmid, Phage- DNA oder andere DNA-Sequenz, welche sich in einer Wirtzelle vervielfältigen kann und durch eine oder eine kleine Anzahl von Endonucleaserekognitionsstellen oder Restriktionsstel­ len ausgezeichnet ist, wo seine DNA-Sequenz auf bestimmbare Art gespalten bzw. geschnitten werden kann, ohne nennens­ werten Verlust einer wesentlichen biologischen Funktion der DNA, beispielsweise der Replikation, die Produktion von Um­ hüllungs- bzw. Einkapselungsproteinen oder Verlust des Pro­ motors oder der Bindungsstellen, und welche einen Marker aufweist, der für die Verwendung der Identifizierung der transformierten Zellen, beispielsweise der Tetracyclinresi­ stenz oder Ampicillinresistenz, geeignet ist. Ein Klo­ nierungsvehikel ist ebenfalls als Vektor bekannt.
Wirt bzw. Host:

Ein Organismus, der bei der Transformation durch ein Klonierungsvehikel das Klonierungsvehikel befä­ higt, sich zu vervielfältigen und seine anderen biologischen Funktionen auszuüben, beispielsweise die Produktion von Po­ lypeptiden oder Proteinen durch Expression der Gene eines Plasmids.
Klonierung:

Das Verfahren, bei dem man eine Population von Organismen oder DNA-Sequenzen, die sich von solchen Or­ ganismen oder Sequenz ableiten, durch asexuelle Reproduktion erhält.
Expression:

Das Verfahren, das ein Gen unter Bildung ei­ nes Polypeptids oder Proteins durchmacht. Es ist eine Kombi­ nation der Transkription und Translation.
Transkription:

Das Verfahren zur Erzeugung von mRNA aus einem Gen.
Translation:

Das Verfahren zur Erzeugung eines Proteins oder Polypeptids aus mRNA.
Promotor:

Der Bereich von DNA eines Gens, wo sich RNA-Po­ lymerase bindet und die Transkription initiiert. Ein Promo­ tor ist vor der Ribosomenbindungsstelle des Gens lokalisiert.
Ribosomenbindungsstelle:

Der Bereich der DNA eines Gens, der für eine Stelle auf mRNA kodiert, die hilft, das mRNA an das Ribosom zu binden, so daß die Translation beginnen kann. Die Ribosomenbindungsstelle liegt nach dem Promotor und vor dem Translationsstartsignal des Gens.
Gen:

Eine DNA-Sequenz, welche als Templat für mRNA eine Sequenz der Aminosäuren, die für ein spezifisches Polypep­ tid oder Protein charakteristisch ist, verschlüsselt. Ein Gen enthält einen Promotor, eine Ribosomenbindungsstelle, ein Translationsstartsignal und eine strukturelle DNA-Sequenz. Im Falle eines exportierten oder abgeschiedenen Proteins oder Polypeptids enthält das Gen ebenfalls eine Signal-DNA- Sequenz.
Expressionskontrollsequenz:

Eine DNA-Sequenz in einem Klonierungsvehikel, welche die Expression der Gene des Klo­ nierungsvehikels kontrolliert und reguliert, wenn sie ar­ beitsfähig bzw. betriebsfähig an solche Gene gebunden ist.
Signal-DNA-Sequenz:

Eine DNA-Sequenz innerhalb eines Gens für ein Polypeptid oder Protein, welche als Templat für mRNA eine Sequenz von hydrophoben Aminosäuren am Aminoter­ minus des Polypeptids oder Proteins verschlüsselt, d. h. eine "Signalsequenz" oder "hydrophobe Führungssequenz" des Poly­ peptids oder Proteins. Eine Signal-DNA-Sequenz ist in einem Gen für ein Polypeptid oder Protein unmittelbar vor der strukturellen DNA-Sequenz des Gens und nach dem Transla­ tionsstartsignal (ATG) des Gens lokalisiert. Eine Signal- DNA-Sequenz kodiert für die Signalsequenz des Polypeptids oder Proteins, welche (Signalsequenz) charakteristisch für die Vorstufe des Polypeptids oder Proteins ist.
Vorstufe:

Ein Polypeptid oder Protein, wie es innerhalb einer Wirtzelle mit einer Signalsequenz synthetisiert wird.
Stromabwärts und stromaufwärts:

Bei einer Kodierungs-DNA- Sequenz ist stromabwärts die Richtung der Transkription, d. h. in der Richtung von 5′ zu 3′. Stromaufwärts ist die entge­ gengesetzte Richtung.
Rekombinations- bzw. Rekombinanten-DNA-Molekül oder Hybrid-DNA:

Ein Molekül, welches Segmente von DNA von unter­ schiedlichen Genomen enthält, die Ende an Ende außerhalb le­ bender Zellen zusammengefügt bzw. aneinandergebunden wurden und die Fähigkeit haben, einige Wirtzellen zu infizieren, und die darin gehalten werden können.
Strukturelle DNA-Sequenz bzw. Struktur-DNA-Sequenz:

Eine DNA-Sequenz innerhalb eines Gens, welche als Templat für mRNA eine Sequenz von Aminosäuren verschlüsselt, die für ein spezifisches reifes Polypeptid oder Protein cha­ rakteristisch ist, d. h. die aktive Form des Polypeptids oder Proteins.

Die Erfindung betrifft ein rekombinantes DNA-Molekül, wel­ ches eine Deoxynucleotidsequenzkodierung für Protein A, ein aktives Derivat von Protein A oder seine Vorstufen umfaßt. Der Ursprung der Deoxynucleotidsequenz ist bei der vor­ liegenden Erfindung nicht kritisch. Es kann irgendeine Quel­ le verwendet werden, einschließlich natürlicher, syntheti­ scher oder semisynthetischer DNA-Quellen. In der Praxis wird jedoch die Quelle für die DNA-Kodierung für Protein A ein Bakteriendonor, beispielsweise eine Protein-A-produzie­ rende Styphylococcusspezies, wie ein Stamm von S. aureus, sein. Irgendwelche derartige Protein-A-erzeugenden Staphy­ lococcen Donoren können für die Zwecke der vorliegenden Er­ findung verwendet werden. Für die aktiven Polypeptidfrag­ mente von Protein A, und möglicherweise ebenfalls für das gesamte Protein-A-Molekül, können jedoch auch synthetisch erzeugte Moleküle verwendet werden bzw. in Betracht gezogen werden.

Bei der Herstellung eines rekombinanten DNA-Moleküls gemäß der vorliegenden Erfindung kann ein geeignetes Klonierungs­ vehikel oder Vektor mittels eines Restriktionsenzyms ge­ spalten werden und die DNA-Sequenz- oder -Fragmentkodierung für das gewünschte Protein A oder das aktive Protein-A-Deri­ vat oder ihre Vorstufen in die Spaltungsstelle eingesetzt werden, wobei ein rekombinantes DNA-Molekül erzeugt wird. Dieses allgemeine Verfahren ist per se bekannt, und ver­ schiedene Techniken oder Verfahren zur Bindung der DNA-Se­ quenz an das gespaltene Klonierungsvehikel werden in der Literatur beschrieben.

Wenn staphylococce chromosomale DNA als Quelle für die in den ausgewählten Vektor einzusetzende Deoxynucleotidsequenz verwendet wird, kann sie durch Behandlung eines Staphylo­ coccus-Stammes mit dem Enzym Lysostaphin unter Bildung von Protoplasten, welche dann lysiert werden, und wobei dann die DNA unter Bildung einer DNA-Präparation extrahiert und isoliert wird, erhalten werden. Durch teilweise Digestion mit einem geeigneten Restriktionsenzym kann die DNA-Präpara­ tion in Fragmente geeigneter Größe gespalten werden. Nach Behandlung des Vektors mit dem gleichen oder einem anderen Restriktionsenzym werden die Vektorspaltungsprodukte und die oben fragmentierte DNA-Fraktion vermischt und random­ artig unter der Ligationswirkung eines Ligaseenzyms kombi­ niert. Das Screening der der Ligation unterworfenen DNA- Fragmentkombinationen kann durchgeführt werden, indem man sie in einer geeigneten Mikroorganismenzelle, beispielswei­ se einem Bakterium, biologisch aktiv macht. Eine derartige Transformation ist ebenfalls Gegenstand der Erfindung und wird im folgenden näher erläutert. Die transformierten Zel­ len, die entweder einen Vektor oder eine Kombination aus Vektor und staphylococcer DNA enthalten, können auf der Grundlage eines geeigneten Markers, der in dem Vektor vor­ handen ist, ausgewählt werden, beispielsweise auf der Grund­ lage der antibiotischen Resistenz, wie Ampicillinresistenz, welche durch den Einsatz der donorchromosomalen DNA nicht geändert wird. Unter den erhaltenen Klonen können Rekombi­ nanten auf der Grundlage eines zweiten Markers erkannt wer­ den, der in dem Vektor vorhanden ist, beispielsweise Tetra­ cyclinresistenz, welche durch den Einsatz der Donor-DNA be­ einflußt wird und so als Anzeichen für eine transformierte Zelle dient. Auf diese Weise kann eine "Genbank" des S.-au­ reus-Stammes erhalten werden, welche aus einer großen Zahl, beispielsweise mehreren Hundert, von Klonen besteht, welche staphylococce DNA enthalten. Der Klon oder die Klone, die das Protein A erzeugende Gen enthalten, können durch irgend­ einen geeigneten Assay für Protein A, beispielsweise nach einem ELISA-Verfahren (enzymgebundenes Immunosorbens-Assay), nachgewiesen werden. Wie oben erwähnt, können Fragmente der DNA von Protein A produzierenden Klonen in den gleichen oder einen anderen Wirtmikroorganismus subkloniert werden.

Die Klonierungsvehikel oder Vektoren, die gemäß der vorlie­ genden Erfindung verwendet werden können, hängen unter ande­ rem von der Natur der zu transformierenden Wirtzelle ab, d. h. davon, ob sie ein Bakterium, Hefe oder ein anderer Fun­ gi etc. ist. Geeignete Klonierungsvehikel können beispiels­ weise aus Segmenten von chromosomalen, nichtchromosomalen und synthetischen DNA-Sequenzen, wie verschiedenen bekann­ ten Bakterienplasmiden, beispielsweise Plasmiden von E. coli einschließlich pBR322 und ihrer Derivate, Phage-DNA, wie Derivaten von Phage lambda, Vektoren, die sich von Kombina­ tionen von Plasmiden und Phagen-DNA ableiten, Hefeplasmiden, speziell konstruierten zusammengesetzten Plasmiden etc., bestehen. Die besondere Auswahl des Klonierungsvehikels hin­ sichtlich des besonderen Wirtes kann durch den Fachmann er­ folgen. Ebenfalls kann die Stelle für den Einsatz der DNA innerhalb des spezifischen Klonierungsvehikels durch den Fachmann ausgewählt werden, wobei die Spaltungsstellen von dem verwendeten Restriktionsenzym abhängen. Selbstverständ­ lich ist es bei einem Klonierungsvehikel, welches bei der vorliegenden Erfindung nützlich ist, nicht erforderlich, daß es eine Restriktionsstelle für den Einsatz des gewähl­ ten DNA-Fragments aufweist, aber das Klonierungsvehikel kann stattdessen durch alternative Mittel an ein Fragment gebunden werden, welche auf diesem Gebiet gut bekannt sind.

Nützliche Wirte für die Zwecke der vorliegenden Erfindung können Bakterienwirte, wie Stämme von Escherichia, Bacillus und Staphylococcus, zum Beispiel E. coli, Bacillus subtilis und S. xylosus, Hefen und andere Fungi, Pflanzenzellen in Kultur und anderen Wirten sein. Unter den Bakterienwirten sind solche des grampositiven Typs für die Zwecke der vor­ liegenden Erfindung, bedingt durch ihre weniger komplexe Zellwand, welche nur ein Membransystem enthält und somit die Sekretion des gebildeten Protein-A-Materials dadurch erlaubt, wie es im folgenden näher erläutert wird, bevor­ zugt. Wenn ihrer nichtpathogenen Natur sind beispielsweise das Bodenbakterium Bacillus subtilis und Staphylococcus au­ reus besonders nützlich als Endwirt bei der vorliegenden Erfindung. Bei der vorliegenden Erfindung können jedoch auch bereits Protein A erzeugende Stämme, beispielsweise S. aureus, mit dem Protein-A-Kodierungsrekombinationsmole­ kül gemäß der Erfindung transformiert werden, um die Zahl der Protein-A-Kodierungsgene in den S.-aureus-Zellen zu ver­ vielfältigen. Hefe (deren Genetik recht gut bekannt ist) ist ebenfalls ein bevorzugter Endwirt, der in einen Protein A erzeugenden Mikroorganismus gemäß der vorliegenden Erfin­ dung transformiert wird.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Rekombinanten-DNA-Moleküls wird die DNA-Sequenzkodierung für das gewünschte Protein-A-Produkt an einen Leader oder eine Signalsequenz, die für ein Signalpeptid kodiert, ge­ bunden. Ein solches Signalpeptid, welches als Extension für das aminoterminale Ende des gewünschten Proteins oder Poly­ peptids wirkt, ist für die transformierte Mikroorganismus­ zelle erforderlich, um das synthetisierte Produkt durch ih­ re Membran abzuscheiden. Das so innerhalb der Zelle durch Expression des eingesetzten extrachromosomalen Gens synthe­ tisierte Produkt wird dann die Vorstufe für das gewünschte Produkt sein. Während des Sekretionsverfahrens durch die Zellwand wird das Signalpeptid abgespalten, und nur das vollentwickelte Protein A oder sein aktives Derivat wird in das Umgebungsmedium abgeschieden. Ein Mikroorganismus, der mit einer solchen Signalsequenz, die das Gen enthält, transformiert ist, wird somit nicht nur das Protein A oder dessen aktives Derivat synthetisieren, sondern es ebenfalls in das Kulturmedium abscheiden. Dadurch wird die Notwendig­ keit, die Zellen zur Gewinnung des Protein-A-Produkts zu zerstören, vermieden und ihre Isolierung erleichtert, und es ist möglich, ein Produkt mit verbesserter Reinheit leichter zu erhalten. Eine Zahl von Signalpeptiden wie auch die entsprechenden DNA-Sequenzen sowohl für grampositive als auch gramnegative Bakterien wie auch für Hefen sind bekannt und können bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden.

Bei der vorliegenden Erfindung ist es besonders zweckdien­ lich, mindestens was die Bakterienwirte betrifft, eine Si­ gnal-DNA-Sequenz des Protein-A-Gens zu verwenden, die von einem staphylococcen Stamm, wie S. aureus, erhalten wurde, welcher als Donor-DNA-Sequenz verwendet wird. In diesem Fall wird die DNA-Sequenzkodierung für die entsprechende Protein-A-Produkt-Vorstufe, d. h. das gewünschte Protein-A- Produkt, an das Signalpeptid fusioniert und in ein Klonierungsvehikel unter Herstellung des erfin­ dungsgemäßen rekombinanten DNA-Moleküls eingesetzt. Wenn es jedoch bevorzugt ist, eine andere Signalsequenz, welche in einem besonderen Wirt funktioneller ist, zu verwenden, kann eine derartige Signalsequenz in das Klonierungsvehikel, wel­ ches gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet wird, nach an sich gut bekannten Verfahren, welche im folgenden näher erläutert werden, eingesetzt werden.

Bevorzugt wird ebenfalls die Promotorsequenz des donorsta­ phylococcen Stammes verwendet und in das Klonierungsvehikel zusammen mit der Signalsequenz und der Protein-A-Kodierungs­ sequenz eingesetzt, was beispielsweise der Fall sein wird, wenn das gesamte Protein-A-Kodierungsgen von dem Promotor bis zu dem Stopcodon des staphylococcen Stammes in das Klo­ nierungsvehikel eingesetzt wird. Andere Promotoren können natürlich ebenfalls verwendet werden, wie der Promotor des natürlich vorkommenden Vektors oder eines Vektors, der durch Einsatz eines starken externen Promotors modifiziert worden ist.

DNA, welche für ein aktives Polypeptidfragment von Protein A kodiert, wie sie oben definiert wurde, kann erhalten wer­ den, indem man eine DNA-Sequenz, die ein geeignetes Stopco­ don enthält, in das Protein-A-Kodierungsgen nach per se gut bekannten Verfahren einführt. Das Stopcodon kann beispiels­ weise so eingesetzt werden, daß nur der Teil des Gens, der für die IgG-Bindungsaktivität kodiert, translatiert wird. Die Expression des Gens wird dann ein Polypeptid ergeben, welches dem IgG-aktiven Teil des Protein-A-Moleküls ent­ spricht.

Die DNA-Kodierung für oligomere Formen von Protein A oder IgG-aktive Polypeptidfragmente des Protein-A-Moleküls kann erhalten werden, indem man die DNA-Fragmente, die für Pro­ tein A oder die IgG-Bindungsaktivität kodieren, in ein kombiniertes Gen, das für ein Dimeres, Trimeres etc. ko­ diert, kombiniert. Die Expression des entstehenden Gens wird so ein Protein-A-Oligomeres mit erhöhter IgG-Bindungs­ aktivität, verglichen mit dem normalen Protein-A-Molekül, ergeben. Verfahren zur Durchführung derartiger Kombinatio­ nen aus DNA-Fragmenten sind per se bekannt und werden hier nicht näher beschrieben.

Das Protein A oder das Polypeptidprodukt, das erfindungsge­ mäß hergestellt worden ist, kann nach an sich bekannten Verfahren isoliert werden. Wenn zum Beispiel das Produkt durch die Zellmembran abgeschieden wird, was einer be­ vorzugten Ausführungsform entspricht, kann die Produktiso­ lierung nach an sich bekannten Immunosorbensverfahren erfol­ gen. Wenn das Produkt in dem periplasmischen Raum zwischen zwei Zellmembranen eingeschlossen wird, wie bei gramnegati­ ven Bakterien, kann ein osmotisches Schockverfahren ange­ wendet werden, um das Produkt in das Wachstumsmedium frei­ zusetzen, woraus es wie oben beschrieben isoliert werden kann. Wenn schließlich das Protein- oder Polypeptidprodukt innerhalb der Zelle zurückgehalten wird, wie es der Fall ist, wenn ein Signalpeptid für das Produkt synthetisiert wird, muß die Zelle zerstört werden, bevor beispielsweise die Immunosorbensisolierung durchgeführt werden kann. Eine derartige Zerstörung der Zellwände kann beispielsweise durch Pressen bzw. Anwendung von Druck, Ultrabeschallung, Homogenisierung, Schütteln mit Glasperlen etc. erfolgen.

Die Erfindung wird nun anhand der folgenden nichtbeschrän­ kenden Beispiele erläutert, in denen die Klonierung in E.- coli- und unterschiedlichen Staphylococcus-Stämmen des Pro­ tein-A-Gens von einem staphylococcen Stamm mit Zellwand- assoziiertem Protein erläutert. Auf die Zeichnungen wird Bezug genommen.

In den Zeichnungen:

Fig. 1 ist eine schematische Erläuterung einer zirkulären Restriktionskarte einer Plasmid-DNA (pSPA1)-Kodierung für Protein A. Die Größe der Karte wird in Kilobasen, ausgehend von der Eco-RI-Restriktionsstelle bei 12 Uhr angegeben, welche eine Restriktionsstelle innerhalb des Vektors pBR322 ist. Die Stellungen der Eco-RI-, Eco-RV-, Hind-III-, Pst-I- und Bam-HI-Restriktionsstellen sind an­ gegeben. Die Verbindungen bzw. Junktionen zwischen dem Vektor und der eingesetzten DNA sind mit Pfeilen angege­ ben.

Fig. 2A ist eine schematische Darstellung des Protein-A- Kodierungsgens und zeigt dessen verschiedene Regionen. Die dunklere Linie stellt die DNA des Vektors pBR322 dar. S ist eine Signalsequenz, A-D sind IgG-Bindungsregionen, die zuvor identifiziert wurden, E ist eine Region homolog zu A-D, und X ist der C-terminale Teil des Proteins A, der keine IgG-Bindungsaktivität hat.

Fig. 2B ist eine detaillierte Restriktionskarte der DNA- Sequenz entsprechend Fig. 2A und zeigt die Restriktions­ stellen für Taq I, Hind III, Eco RV, Pst I, Bcl I und Sau 3A. Die Größe ist in Kilobasen angegeben, ausgehend von der gleichen Eco-RI-Restriktionsstelle wie in Fig. 1 angegeben. Die Verbindungsstelle zwischen dem Vektor pBR322 und dem eingesetzten DNA-Fragment ist mit einem Pfeil angegeben. Die Restriktionsstellen für Taq I (zwei) und Rsa I (eine) innerhalb der Vektorsequenzen wurden weggelassen.

In den Fig. 3A bis D ist die Basensequenz für das strukturelle Protein-A-Gen angegeben. Zwei mögliche Pro­ motoren (-35 und -10) und eine mögliche Shin-Dalgarno- Sequenz (angezeigt durch "=") sind angegeben. Die Amino­ säuresequenz, wie sie sich von der DNA-Sequenz ableitet, ist ebenfalls aufgeführt (die IUPAC-Aminosäureabkürzun­ gen werden verwendet; J. Biol. Chem. 241, 527 und 2491 (1966)). Die fünf Aminosäuren (Reste 99, 101, 120, 199 und 273), die sich, verglichen mit der Aminosäuresequenz, die von Sjödahl oben angegeben wurde, unterscheiden, sind angegeben wie auch die acht Reste (von 50) im Be­ reich E, die sich von der entsprechenden Aminosäure des Bereichs D unterscheiden. Die Startreste der Bereiche S, E, D, A, B, C und X sind durch Pfeile angegeben.

Fig. 4 ist eine Autoradiographie eines Nucleotidsequenzgels, wo die Verbin­ dungsstelle zwischen den Bereichen D und E der Fig. 3 dargestellt sind. Die Sequenzierung (entsprechend Maxam u. a., P.N.A.S. 74, 560 bis 564 (1977)) erfolgte auf ei­ nem DNA-Fragment, welches an der Bcl-I-Stelle in der Po­ sition 0,9 kb in Fig. 2 markiert war. Die teilweise chemisch abgebauten Produkte wurden in einem 8%igen Po­ lyacrylamidsequenzgel (Maizel u. a., Methods in Vir. 5, 179 bis 246 (1970)) aufgelöst bzw. aufgespalten.

Fig. 5 zeigt die SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese von IgG-Sepharose®-gereinigten Zellextrakten. pBR322 und pSPA1 stellen Extrakte von E.-coli-Zellen dar, die das entsprechende Plasmid tragen. SPA ist ein im Han­ del erhältliches Protein A von S. aureus. Adeno-2 (AD 2)-Proteine werden als Grö­ ßenmarker verwendet.

Fig. 6 ist eine schematische Kartendarstellung von Plas­ mid pSPA15, AMP und CML und erläutert Gene, die für Am­ picillin- und Chloramphenicolresistenz kodieren, wobei Ori Replikationsursprünge sind und SPA das strukturelle Protein-A-Gen bezeichnet.

Fig. 7 ist eine schematische Darstellung der Konstruk­ tion der Plasmide, welche das gesamte Protein-A-Gen oder Teile davon enthalten. Einige Restriktionsstellen werden dargestellt. Kästen bzw. Rechtecke bedeuten Strukturge­ ne, und die Pfeile zeigen die Orientierung (vom Startco­ don in Richtung zum Stopcodon). Der Replikationsursprung wird ebenfalls durch Ori angegeben. AMP und TET sind die Gene, die für die Ampicillin- bzw. Tetracyclinresistenz kodieren. PROT A ist das Gen, das für Protein A kodiert und lac Z′ ist das Gen, das für den N-terminalen Teil von β-Galactosidase kodiert. (Rüther u. a., Nucl. Acids Res. 9, 4087 bis 4098 (1981)).

Fig. 8 ist eine schematische Erläuterung der Konstruktion des Plasmids pSPA16. Die verwendeten Abkürzungen sind die gleichen wie in Fig. 6. S, E, D und B besitzen die gleiche Bedeutung wie in Fig. 2, und A′ und C′ sind Tei­ le der entsprechenden IgG-Bindungsregionen A und C des Protein-A-Kodierungsgens.

Fig. 9 ist eine Präsentation der Nucleotidsequenz und der entsprechenden deduzierten Aminosäuresequenz um das 3′-Ende des Protein-A-Gens im Plasmid pSPA16. xxx bedeu­ tet das neue Stopcodon.

Fig. 10A bis C sind eine kombinierte Darstellung, ähn­ lich wie Fig. 2, der Plasmide pSPA15 (B) und pSPA16 (C) zusammen mit der entsprechenden Restriktionskarte (A), die daran angefügt ist. Die dunkle Linie bedeutet das Protein-A-Strukturgen.

Fig. 11 ist eine schematische Darstellung der Sequenz­ strategie (C), die für die Sequenzierung des 1,8 kb Taq- I-Eco-RV-DNA-Fragments (B) verwendet wurde, die das Pro­ tein-A-Kodierungsgen (A) enthält, wobei man die in Fig. 3 dargestellte Sequenz erhält.

In den Beispielen wurden die folgenden Ausgangsmaterialien, Puffer, Zellmedien und Routineverfahren verwendet.

Ausgangsmaterialien Bakterienwirte

Vier Stämme von E. coli K12 wurden in den Beispielen verwendet: HB101, beschrieben von Boyer u. a., J. Mol. Biol. 41, 459-472 (1969); 259, beschrieben von Jacob, F. und Wollman, E. C. Ann. Inst. Pasteur 91, 486-510 (1956); GM161, beschrieben von Marinus, M. G., Molec. gen. Genet. 127, 47-55 (1973); RRI del M15 (Langey u. a., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 72, 1254-1257 (1975)). (Die Stämme sind beim Department of Microbiology (N), Bio­ medical Centre, Uppsala, Schweden erhältlich.)

Weiterhin wurden die folgenden vier Staphylococcus-Stämme verwendet: S. epidermidis 247, beschrieben von Rosendorf u. a., J. Bacteriol. 120: 679-686 (1974); erhalten von Inst. of Medical Microbiology, Universität von Zürich, Schweiz; S. xylosus KL117, beschrieben von Schleifer u. a., Int. J. Syst. Bacteriol. 25: 50-61 (1975) und Schleifer u. a., Arch. Microbiol. 122: 93-101 (1979); erhalten von Inst. für Mikrobio­ logie, Technische Universität München, Bundesrepublik Deutschland; S. aureus SA113, beschrieben von Iordanescu u. a., (J. Gen. Microbiol. 96: 277-281, (1976)); S. aureus 320, eine Protein-A-negative Mutante des Stammes S. aureus 113, isoliert beim Department of Microbiology, Biomedical Centre, Uppsala, Schweden und beschrieben von Jonsson u. a., Curr. Microbiol. 8: . . . (1983).

Klonierungsvehikel

Die in den Beispielen verwendeten Klo­ nierungsvehikel waren pBR322, wie von Bolivar u. a., Gene 2, 95-113 (1977) konstruiert und beschrieben; pBR328, wie von Soberon, X. u. a., Gene 9, 287-305 (1980) konstruiert und beschrieben; pTR262, wie von Roberts, T. M. u. a., Gene 12, 123-127 (1980) konstruiert und beschrieben; pHV14, wie von Ehrlich, S. D., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 70, 3240-3244 (1978) konstruiert und beschrieben, und pHV33, wie von Primrose, S. B. und Ehrlich, S. D., Plasmid 6, 193-201 (1981) konstruiert und beschrieben; pUR222, wie von Rüther u. a., Nucl. Acids Res. 9, 4087-4098 (1981) konstruiert und be­ schrieben.

Puffer und Medien

Triton-Gemisch:
0,1% Triton X-100, 0,125 M EDTA und 20 mM Tris (pH 8,0)
Tris-EDTA-Puffer ("TE"):
0,001 M EDTA und 0,01 M Tris (pH 7,8)
CY-Brühe (Nährmedium):
Difco-Casein-Hydrolysat 1%, Difco- Hefeextrakt 1% und Glucose 0,5%; 4 ml 1,5 M Glycerinphosphat wird bis 100 ml CY-Nährmedium zugegeben
Beschichtungs- bzw. Coating-Puffer (Carbonat - Bicarbonat - pH 9,6):
1,59 Na₂CO₃, 2,93 g NaHCO₃ und 0,2 g NaN₃, mit destilliertem H₂O auf 1 Liter aufgefüllt
PBS-TWEEN (phosphatgepufferte Salzlösung plus 0,05% TWEEN®):
8,0 g NaCl, 0,2 g KH₂PO₄, 2,9 g Na₂HPO₄ · 12 H₂O, 0,2 g KCl, 0,5 ml TWEEN® 20 und 0,2 g NaN₃, mit destilliertem Wasser auf 1 Liter aufgefüllt; pH 7,4
Diethanolaminpuffer 1096:
97 ml Diethanolamin, 800 ml destillier­ tes H₂O, 0,2 g NaN₃ und 100 mg MgCl₂ · 6 H₂O; pH mit 1 M HCl auf 9,8 einge­ stellt; mit destilliertem H₂O auf 1 Li­ ter aufgefüllt
Luria-Kulturmedium ("LB"):
10 g Difco-Trypton, 5 g Difco-Hefeex­ trakt, 0,5 g NaCl, 2 ml 1 M NaOH; mit 1 M NaOH auf pH 7,0 eingestellt; 10 ml 20%ige Glucose nach Behandlung im Auto­ klaven zugegeben
LA-Medium:
Luria-Kulturmedium mit 1% Difco-Agar supplementiert
TEB-Puffer:
0,09 M Trisborat, 0,09 M Borsäure und 0,002 M EDTA

Routineverfahren

Bestimmte Verfahren wurden in den Beispielen wiederholt durchgeführt. Sofern nicht anders angegeben, wurden sie je­ desmal genau wie folgt durchgeführt.
Transformationen:

Transformation von E. coli K12 mit Plas­ mid-DNA erfolgte genau, wie durch Morrison, D. A., Methods in Enzymology, Academic Press 68, 326-331 (1979) beschrie­ ben. Die transformierten Zellen wurden in an sich bekannter Weise auf Platten selektiert, indem man die einzelnen Kolo­ nien auf LA-Platten, die geeignete Antibiotika, beispiels­ weise 35 µg/ml Ampicillin oder 25 µg/ml Chloramphenicol, enthalten, aufbrachte.
Isolierung der Plasmide:

Die Präparation der Plasmide in großem Maßstab erfolgte genau, wie von Tanaka, T. und Weis­ blum, B. in J. Bacteriol. 121, 354-362 (1975) beschrieben. Zum Nachweis einer großen Zahl von Klonen für Plasmide wur­ de das "Mini-Alkaliverfahren" genau, wie von Birnboim, H. C. und Doly, J. in Nucl. Acids Res. 7, 1513-1523 (1979) be­ schrieben, angewendet.
Restriktionsenzymdigestion von DNA:

DNA wurde mit bekannten Restriktionsenzymen gespalten. Die Restriktionsenzyme wurden zu DNA bei üblichen Konzentrationen und Temperaturen und mit Puffern, wie von New England Bio Labs empfohlen, zugegeben.
Abbindung bzw. Ligation der DNA-Fragmente:

Alle DNA-Fragmente wurden bei 14°C über Nacht mit T4-DNA-Ligase in einem vom Hersteller empfohlenen Puffer abgetrennt bzw. abgebunden.
Agarosegelelektrophorese:

0,7%-Agarosegelelektrophorese für die Abtrennung der geschnittenen Plasmidfragmente, der supercoiled Plasmide und der DNA-Fragmente mit einer Länge von 1000 bis 10 000 Nucleotiden erfolgte genau, wie von Hel­ ling u. a., J. Vir. 14, 1235-1244 (1974) beschrieben.
Polyacrylamidgelelektrophorese:

5%-Polyacrylamidgelelektro­ phorese für die Abtrennung der DNA-Fragmente mit einer Län­ ge von 100 bis 4000 Nucleotiden erfolgte genau, wie von Ma­ xam u. a. in P.N.A.S. 74, 560-564 (1977) beschrieben. Die 13%-Polyacrylamidgelelektrophorese für die Abtrennung von Proteinen mit Molekulargewichten von 5000 bis 120 000 er­ folgte genau, wie von Maizel u. a. in Methods in Vir. 5, 179- 246 (1970) beschrieben.
Geleluierung:

Die DNA-Fragmente wurden entweder von Poly­ acrylamid- oder Agarosegelstücken genau, wie von Maxam u. a. in P.N.A.S. 74, 560-564 (1970) beschrieben, eluiert.
DNA-Sequenzierung:

DNA-Fragmente wurden am 5′-Ende markiert, und ihre DNA-Sequenzen wurden genau, wie von Maxam u. a., oben, beschrieben, bestimmt. Das 5′-Ende von aus Endonuclea­ se erzeugten DNA-Fragmenten wurde mit (γ-³²P)-ATP 2700 Ci/mmol unter Verwendung von T4- Polynucleotidkinase markiert.
Herstellung von Zellysat für den Nachweis von Protein A:

E.-coli-Klone wurden über Nacht bei 37°C in 50 ml Luria-Nährme­ dium (LB) mit bei 35 µg/ml zugegebenem Ampicillin gezüchtet. Nach dem Zentrifugieren wurden die Zellen in 5 ml Tris-EDTA (0,05 M, pH 8,5, 0,05 M) erneut suspendiert und zentrifu­ giert. Die Zellen wurden in 5 ml des gleichen Puffers er­ neut suspendiert, und Lysozym wurde bis zu einer Endkonzen­ tration von 2 mg/ml zugegeben. Nach 1 Stunde bei 37°C wurde das Lysat in einem Sorvall-SS-34-Rotor bei 15 000 UpM wäh­ rend 15 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde gesam­ melt und das Protein A analysiert.
Nachweis und quantitative Bestimmung des Proteins A aus E.-coli-Klonen:

Ein ELISA-Test (Enzym Linked Immunosorbent Assay) (enzymgebundener Immunsorbenz-Assay) wurde für den Nachweis und die quantitative Bestimmung von hergestelltem Protein A angewendet. Bei dem Test wird eine spezielle Mi­ krotiterplatte ohne Netto­ ladung (neutral) verwendet, deren Vertiefungen mit huma­ nem IgG beschichtet sind. Testproben werden dann zugegeben, damit das Protein A an die Fc-Teile der IgG- Moleküle gebunden werden kann. Die Menge an verbleibenden freien Fc-Stellen wird dann durch Zugabe von alkalischer Phosphatase, die an Protein A gebunden ist, titriert. Nach dem Waschen der Vertiefungen wird p-Nitrophenylphosphat als Substrat für die alkalische Phosphatase zugegeben.
Assay:

Die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte wurden mit 50 µl einer Lösung von humanem IgG bei 500 µg/ml in einem Beschichtungspuffer gefüllt, und die Platte wurde bei Raumtemperatur 1 Stunde inkubiert. Die Ver­ tiefungen wurden dann dreimal mit PBS + 0,05% TWEEN® 20 ge­ waschen, was in allen Waschvorgängen in dem Assay verwen­ det wurde, und 50 µl des zu untersuchenden Lysats wurden zugegeben. Die quantitativen Bestimmungen der zweifachen Reihenverdünnungen der Lysate in PBS + 0,05% TWEEN® 20 wur­ den durchgeführt. 10 µl PBS + 0,1% TWEEN® 20 wurden dann zu­ gegeben, und die Inkubation konnte während 1 Stunde bei Raumtemperatur ablaufen. Die Vertiefungen wurden erneut dreimal gewaschen, und 50 µl Konjugat von Protein A und al­ kalischer Phosphatase (hergestellt genau, wie in Immunoche­ mistry, Pergamon Press 1969, Band 6, Seiten 43-52 beschrie­ ben) wurden zugegeben. Nach 1 Stunde Inkubation bei Raum­ temperatur wurden die Vertiefungen erneut dreimal gewaschen, und 100 µl Substrat aus alkalischer Phosphatase (Sigma 104 = p-Nitrophenylphosphat mit 1 mg/ml) wurden zugegeben. Die Enzymreaktion wurde nach 30 Minuten durch Zugabe von 10 µl 3 M NaOH unterbrochen. Das Ergebnis wurde visuell bestimmt. Ein positives Ergebnis, d. h. die Anwesenheit von Protein A, ist ein farbloses Reaktionsgemisch, da keine freien Fc- Stellen von IgG verfügbar sind, um das Konjugat zu binden.

Ein negatives Ergebnis, d. h. kein Protein A, wird durch ei­ ne gelbe Farbe festgestellt, die auf die Aktivität der al­ kalischen Phosphatase des gebundenen Konjugats zu­ rückzuführen ist. Quantitative Bestimmungen von Protein A erfolgten durch Durchführung von reihenweisen Zweifachver­ dünnungen einer Protein-A-Standardlösung bekannter Konzen­ tration parallel zu den Testproben.

Beispiel I Klonierung von Protein A in E. coli A. Herstellung staphylococcer chromosomaler Donor-DNA

S. aureus Stamm 8325-4 (⌀ 1 l) mec-4916, str-4916, nov-142 (beschrieben von Sjöström, J.-E. u. a. in J. Bacteriol. 123, 905-915 (1975) und erhältlich vom Department of Microbiolo­ gy (N), Biomedical Centre, Uppsala, Schweden) wurde bis OD₅₄₀=0,2 in CY-Nährmedium gezüchtet. Ein Liter der Zell­ kultur wurde durch Zentrifugieren bei 5000 Upm in einem Sorvall-GSA-Rotor aufgearbeitet, erneut in 100 ml 0,9%iger NaCl und 10 mM Tris, pH 7,2, suspendiert und bei 5000 UpM in einem Sorvall-GSA-Rotor zentrifugiert. Das Zellpellet wurde schließlich in 10 ml 25%iger Saccharose, 50 mM Tris, pH 7,2 resuspendiert, und Protoplasten wurden hergestellt durch Lysostaphinbehandlung (15 µg/ml) bei 37°C während 20 min. Die Protoplasten wurden durch Zugabe von 10 ml Triton- Gemisch und 5 ml H₂O lysiert. Das Gemisch wurde auf Eis stehen gelassen und gelegentlich leicht geschüttelt, bis die Lyse vervollständigt war. Die DNA wurde mit Proteinase K (0,1 mg/ml) und SDS (Natriumdodecylsulfat) (0,5%) während 1 h bei 37°C behandelt, und danach erfolgten fünf Phenolex­ traktionen mit gleichen Volumina von Phenol und schließlich zwei Chloroformextraktionen. Natriumacetat, pH 7,0, wurde bis zu 0,3 M zugegeben, und die DNA wurde mit zwei Volumen kaltem Ethanol präzipitiert. Das Präzipitat wurde stufen­ weise mit 70, 80, 90 und 99% kaltem Ethanol gewaschen. Das Präzipitat wurde in TE-Puffer durch sanftes Mischen bei 37°C gelöst. Schließlich wurde die DNA gegen TE-Puffer dialysiert.

B. Partielle Digestion von chromosomaler DNA und Isolie­ rung von Donorfragmenten

Gereinigte staphylococcale DNA aus Stufe A wurde mit ver­ schiedenen Konzentrationen des Restriktionsenzyms Mbo I di­ geriert. Jede Reaktion erfolgte in 50 µl Volumen mit 1 µg DNA, und die Reaktion wurde durch Wärmeinaktivierung bei 65°C während 10 min beendet. Das Ausmaß der Digerierung wurde durch Agarosegelelektrophorese bestimmt. Die Konzen­ tration von Mbo I, die ein großes partielles Spaltungspro­ dukt von 5 bis 20 Kilobasen ergibt, wurde für eine präpara­ tive Digerierung von 100 µg von staphylococcaler DNA in 5 ml gewählt. Dieses digerierte Material wurde durch Hitze inak­ tiviert, mit Ethanol präzipitiert, in 100 µl TE gelöst und durch einen 10- bis 30%igen Saccharosegradienten in TE-Puf­ fer sedimentiert. Ein Beckmann-Sw40-Rotor wurde bei 5°C, 35 UpM während 20 h verwendet. Der Gradient wurde in 0,5-ml- Fraktionen fraktioniert, wovon jede mittels Agarosegelelek­ trophorese analysiert wurde. Die Fraktionen mit 8 bis 10 kb Fragmenten wurden gesammelt, mit 2 Volumen Ethanol präzipi­ tiert und in TE-Puffer gelöst.

C. Digestion und Behandlung mit alkalischer Phosphatase des Vektors pBR322

1 µg pBR322 wurde mit Bam HI während 2 h bei 37°C digeriert, und das Enzym wurde bei 65°C während 10 Minuten inaktiviert. Die DNA wurde mit alkalischer Phosphatase zur Entfernung des 5′-Phosphats behandelt. Durch diese Behandlung wurde die Möglichkeit der Religation des Vektors ausgeschlossen. Die Reaktion erfolgte in 50 mM Tris, pH 7,9, 5% DMSO und 1 Einheit intestinaler alkalischer Kalbsphosphatase bei 37°C während 30 Minuten in 1 ml. 0,5% SDS wurde zugegeben, und die DNA wurde zweimal mit Phenol extrahiert. Spuren von Phenol wurden mit Ether entfernt, und die DNA wurde mit zwei Volumen Ethanol präzipitiert.

D. Insertion bzw. Einsatz von staphylococcaler DNA in pBR322, Transformation von E. coli und negative Selektion für die Rekombinanten

Der Vektor pBR322, der für die ursprüngliche Klonierung von staphylococcer DNA verwendet wurde, kodiert für Tetracyclin- (tet) und Ampicillin (amp) -Resistenz. Wenn pBR322 durch Digestion mit Bam HI wie in Stufe C oben geöffnet wird und ein DNA-Fragment eingesetzt wird, wird das Gen für die Te­ tracyclinresistenz inaktiviert. Durch Prüfung der Transfor­ manten für die Sensitivität gegenüber Tetracyclin können die Re­ kombinanten festgestellt werden - sogenannte negative Selek­ tion. 0,5 µg von pBR322, behandelt entsprechend Stufe C, und 2 µg staphylococce DNA, behandelt entsprechend Stufe B, wurden vermischt und in einem Gesamtvolumen von 25 µl über Nacht bei 14°C der Ligation unterworfen. Das Gemisch wurde verwendet, um E. coli 259 mit Selektion für Ampicillinresi­ stenz (35 µg/ml) zu transformieren. Die Transformanten wur­ den herausgenommen und auf Platten, welche 10 µg/ml Tetra­ cyclin bzw. 35 µg/ml Ampicillin enthielten, aufgestrichen. Transformanten, welche auf Ampicillin, aber nicht auf Tetra­ cyclin wuchsen, wurden als Rekombinanten angesehen.

E. Nachweis von Protein-A-positiven E.-coli-Klonen

Fünfhundert tetracyclinempfindliche Klone aus Stufe D wur­ den als getrennte Kolonien auf LA-Platten (hergestellt von LA-Medium), welche Ampicillin (35 µg/ml) enthielten, ge­ züchtet. Gruppen von 25 Kolonien wurden gesammelt und in 50 ml LB-Brühe mit 35 µg Ampicillin inokuliert und über Nacht gezüchtet. Die Zellextrakte wurden durch Lysozym + EDTA- Behandlung (wie bei Routineverfahren beschrieben) herge­ stellt und nach dem ELISA-Test, der bei den Routineverfahren beschrieben wurde, auf Protein A untersucht. Eine dieser Gruppen von Klo­ nen war positiv, und diese positive Gruppe wurde weiter in 5 Gruppen von je 5 Klonen unterteilt und wie oben gezüchtet und behandelt. Schließlich wurde in einer letzten Versuchs­ reihe ein Protein A produzierender Klon, E. coli SPA 11, enthaltend das Plasmid pSPA1, festgestellt. Kulturen dieses Klons wurden bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen (DSM), Grisebachstraße 8, 3400 Göttingen, Bundesrepublik Deutschland, am 12. Juli 1982 unter der Hinterlegungsnummer DSM 2434 hinterlegt.

F. Restriktionskarte bzw. -mappe von pSPA1

Um Informationen für die Subklonierung und Sequenzierung der Genkodierung für Protein A zu erhalten, wurde eine Re­ striktionskarte von pSPA1, erhalten in Stufe E, gemacht. Dies erfolgte mit einfachen, doppelten und/oder dreifachen Digerierungen mit den in den Fig. 1 und 2 angegebenen Enzymen. In Fig. 2 ist eine genauere Karte in der Fläche, die für Protein A kodiert, dargestellt. Addiert man die Größen der verschiedenen Restriktionsfragmente, so erhält man die Gesamtgröße von 12 kb für pSPA1, und somit beträgt das sta­ phylococce Donorfragment ungefähr 7,6 kb.

G. Subklonierung des Protein-A-Kodierungsgens von pSPA1 in Plasmide pBR328 und pHV14

Zur Lokalisierung der Position des Gens wurden verschiedene Subklone konstruiert und auf Protein-A-Aktivität untersucht. 2 µg Plasmid pSPA1 von Stufe E und 1 µg pBR328 wurden mit dem Restriktionsenzym Eco RV geschnitten bzw. gespalten, vermischt, mit T4-Ligase behandelt und zur Transformierung von E. coli HB101 verwendet. Spaltung, Ligation und Trans­ formation wurden, wie oben bei den Routineverfahren beschrie­ ben, durchgeführt. Kolonien, welche Rekombinanten enthiel­ ten, wurden als chloramphenicolresistent und tetracyclinempfind­ lich auf analoge Weise, wie in Stufe D beschrieben, ausgewählt. Es wurde festgestellt, daß 8 Kolonien von 48 dieser Rekombinanten Protein-A-positiv unter Verwendung des ELISA-Verfahrens, das bei den Routineverfahren beschrie­ ben wurde, sind. Die Restriktionsanalyse, entsprechend Stu­ fe F, zeigte, daß alle 8 Klone pBR328 mit einem 2,15-kb-Eco- RV-Einsatz, der sich von dem Fragment, entsprechend 0,2 kb bis 2,35 kb der pSPA1-Restriktionskarte von Fig. 1, ablei­ tet, enthielten. Alle Klone enthielten den Einsatz bzw. das Insert in der gleichen Orientierung und ergaben einen funk­ tionellen tet-Promotor, ablesend in dem eingesetzten Gen.

Ein Klon, der dieses Plasmid, bezeichnet als pSPA3, ent­ hielt, wurde für weitere Untersuchungen ausgewählt. Um zu bestimmen, ob das Protein-A-Gen aus einem eigenen Promotor transkribiert werden konnte, wurde das Plasmid pSPA3 als Quelle verwendet, um es in das Plasmid pHV14 zu reklonie­ ren. Dieses Plasmid, welches sich von pBR322 ableitet, be­ sitzt einen 2,8-kb-Einsatz in der Hind-III-Restriktions­ stelle, wodurch der tet-Promotor inaktiviert wird. Irgend­ ein Einsatz in der Eco-RV-Restriktionsstelle dieses Plas­ mids muß daher einen eigenen funktionellen Promotor besit­ zen, damit es durch E. coli-RNA-Polymerase transkribiert werden kann. 1 µg pSPA3 und 1 µg pHV14 werden mit Eco RV geschnitten bzw. gespalten, vermischt, mit T4-Ligase behan­ delt und zur Transformierung von E. coli HB101 verwendet. Spaltung, Ligation und Transformation erfolgten, wie oben beschrieben. Kolonien wurden gesammelt, die ampicillinresi­ stent und tetracyclinempfindlich waren, wie in Stufe D be­ schrieben.

Plasmide von 52 dieser Kolonien wurden nach dem "Mini-Alkali- Verfahren", welches unter Routineverfahren erläutert wurde, isoliert und geprüft, indem man eine 0,7%-Agarose­ gelelektrophorese durchführte. Eine dieser Kolonien war eine Rekombinante von pHV14 mit dem oben erwähnten 2,15-kb-Eco-RV- Einsatz von pSPA3. Der Klon, der dieses Plasmid, bezeichnet als pSPA5, enthielt, war Protein-A-empfindlich, als er un­ ter Anwendung des ELISA-Verfahrens geprüft wurde. Man schloß daraus, daß der Einsatz eines staphylococcen Promotors, ab­ lesbar in das Protein-A-Gen, welches ebenfalls in E. coli HB101 funktionell ist, enthalten muß.

Analyse der DNA-Sequenz des Protein-A-Gens

Die Ergebnisse der Subklonierung zeigten an, daß die DNA- Sequenzbildung an der Hind-III-Stelle bei der Kartenposi­ tion 1,4 kb beginnen sollte und im Gegenuhrzeigersinn ab­ läuft (Fig. 1). Die DNA-Quelle für die Sequenzierungsana­ lyse war gereinigtes pSPA3. Durch Vergleich der teilweise bekannten Aminosäuresequenz von Protein A (wie oben von Sjödahl beschrieben) mit der erhaltenen DNA-Sequenz konnte die Position der Hind-III-Stelle in dem Gen lokalisiert werden. Wie aus den Fig. 2 und 3 folgt, liegt die Re­ striktionsstelle innerhalb der Region A des Proteins A. Durch weitere Analyse entsprechend Stufe F wurden die Re­ striktionsstellen für die Enzyme Taq 1, Rsa I, Bcl I, Sau 3A und Pst I bestimmt (Fig. 2). Diese Stellen wurden für die Sequenzierung in einer oder beiden Richtungen verwendet, die in den meisten Fällen Nucleotidsequenzen von beiden Strängen bzw. strands ergaben. Die für die Sequenzbildung angewandte Strategie ist in Fig. 11 erläutert. Da Bcl I DNA, gereinigt von E. coli HB101, nicht spaltet, wurde pSPA3 in den Stamm E. coli GM161 transformiert, dem das Enzym D-Alaninmethylase fehlt. pSPA3, welches aus diesem Stamm wieder gereinigt wurde, wurde mit Bcl I für die Se­ quenzbildung gespalten.

In Fig. 3 ist die DNA-Sequenz des gesamten staphylococcen Protein-A-Gens dargestellt. Die Aminosäuresequenz, die sich von den DNA-Sequenzen ableitet, ist ebenfalls angegeben, zu­ sammen mit den unterschiedlichen Aminosäuren, verglichen mit der Sequenz, die von Sjödahl, oben vorgeschlagen wurde, welche auf einem anderen Stamm von S. aureus (Cowan I) be­ stimmt wurde.

Die DNA-Sequenz, die in Fig. 3 dargestellt ist, zeigt ei­ nen N-terminalen Bereich, der mit E bezeichnet wird, ähn­ lich den sich wiederholenden Regionen D-A-B-C, über die Sjödahl, oben berichtet. Diese Region von 50 Aminosäuren besitzt 42 Aminosäuren, die mit der Region D identisch sind.

Vor der Region E ist eine Führungssequenz mit den Charakte­ ristiken eines Signalpeptids angebracht, welches eine basi­ sche Region von 11 Aminosäuren, gefolgt von einem hydropho­ ben Stretch (dehnbare Kette) von 23 Aminosäuren, enthält. Die genaue Spaltungsstelle ist nicht bekannt, aber mögliche Stellen sind bei den Alaninresten 36, 37 oder 42, vermut­ lich bei 36. Wenn dies so ist, gehört die Aminosäuresequenz 37-42 zu der Region E des Protein-A-Moleküls. Der Initiie­ rungscodon für die Translation ist TTG, ähnlich einigen an­ deren beschriebenen Initiierungscodons von grampositiven Bakterien. Sechs Nucleotide stromaufwärts von TTG, wird ei­ ne Shine-Dalgarno-Sequenz festgestellt (definiert in Shine, J. und Dalgarno, L., Nature (London) 254, 34-38 (1975)), die viele Merkmale mit anderen grampositiven Ribosomenbin­ dungsstellen gemeinsam hat. Weiter stromaufwärts werden zwei mögliche Promotoren bei -35 und -10 (Fig. 3) festgestellt.

Durch Berechnung der Anzahl von Basen, die für die Kodie­ rung des gesamten Proteins erforderlich sind, scheint es, daß sowohl pSPA1 als auch pSPA3 das gesamte Protein-A-Struk­ turgen enthalten.

Analyse des Genprodukts von E. coli, enthaltend pSPA1

E.-coli-Zellen, welche pSPA1 tragen, wurden über Nacht in 400 ml LB mit 35 µg/ml zugefügtem Ampicillin gezüchtet. Die Zellkultur wurde bei 6000 Upm mit einem Sorvall-GSA-Rotor während 10 min zentrifugiert, und die Zellpellets wurden in 20 ml TE (0,05 M, pH 8,5, 0,05 M EDTA) gewaschen und erneut wie oben zentrifugiert. Diesmal wurden die Zellpellets in 15 ml eines Proteaseinhibitorpuffers (0,02 M Kaliumphosphat, pH 7,5, 0,1 M NaCl, 0,5% Natriumdeoxycholat, 1% Triton X-100, 0,1% Natriumdodecylsulfat (SDS), und 1 mM Phenylmethylsulfo­ nylfluorid (PMSF)) resuspendiert. Die Zellen wurden dann in einem MSE-Sonicator während 4 · 40 sec auf einem Eisbad be­ schallt und bei 15 000 Upm (Sorvall-SS-34-Rotor) 10 min lang zentrifugiert. Der Überstand wurde gesammelt und durch eine IgG-Sepharose®-4B-Säule (Hjelm u. a., FEBS Lett. 28, 73-76 (1972)) geleitet, welche mit einem Natriumacetatpuffer (0,1 M Natriumacetat, 2% NaCl, pH 5,5) equilibriert worden war. Die Säule wurde dann mit dem gleichen Puffer wie oben gewaschen, und das adsorbierte Protein A wurde mit einem Glycinpuffer (0,1 M Glycin, 2% NaCl, pH 3,0) eluiert. Zu den eluierten Fraktionen gab man 1/9 Volumen 100%ige Trichloressigsäure (TCA) hinzu.

Die Proben wurden 6 Stunden bei +4°C präzipitiert und bei 12 000 UpM in einer Eppendorf-Zentrifuge während 15 min zen­ trifugiert. Die Pellets wurden einmal in 1 ml kaltem Aceton gewaschen und dann wie oben zentrifugiert. Die verbleiben­ den Pellets wurden getrocknet, in TE gelöst und gesammelt, wodurch man ein Gesamtvolumen von 400 µl erhielt.

Die Proteinkonzentration wurde bestimmt, und 20 µg wurden auf einem 13%-SDS-Polyacrylamidgel bei 100 V während 12 h analysiert. Das Gel wurde mit Amidoblack (0,1%, 45% Metha­ nol, 10% Essigsäure) angefärbt. Ein Extrakt von Zellen, wel­ che pBR322 tragen, wurde parallel hergestellt, und das glei­ che Volumen wie oben wurde auf dem Gel analysiert. Die Er­ gebnisse der Gelelektrophorese sind in Fig. 5 dargestellt, die anzeigt, daß das Protein A, welches in E. coli, welches pSPA1 trägt, erzeugt wurde, eng an dem reinen Protein A von S. aureus (von Pharmacia, Uppsala, Schweden) migriert. Der Extrakt von Zellen, die das pBR322-Plasmid trugen, besaß kein entsprechendes Protein.

Analyse der Lokalisierung von Protein A in E. coli

Enzyme, die in grampositiven Bakterien extrazellular sind, sind in gramnegativen Bakterien oft zwischen der inneren und äußeren Membran im sogenannten Periplasma oder peri­ plasmischen Raum gelagert. Da Protein A in der Zellwand und somit außerhalb der Zellmembran in S. aureus lokalisiert ist, wurde die Lokalisierung des Proteins in den transformierten E.-coli-Zellen, welche pSPA1 enthielten, bestimmt. Zu diesem Zweck wurde das osmotische Schockverfahren, wie von Heppel, L. A., Science 158, 1451-1455 (1967) beschrieben, angewandt. In diesem Verfahren werden Proteine aus dem periplasmischen Raum, aber nicht intrazellulare Enzyme freigegeben. Alkali­ sche Phosphatase wurde als Beispiel für ein Protein, wel­ ches in dem periplasmischen Raum nachgewiesen wurde, und Phenylalanin-tRNA-Synthetase als Beispiel für ein intrazel­ luläres Protein verwendet.

E. coli, enthaltend pSPA1, wurde in einem niedrigen Phos­ phatmedium (genau wie von Neu, H. G. und Heppel, L. A., J. Biol. Chem. 240, 3685-3692 (1965) beschrieben) zur Derepres­ sion der Synthese alkalischer Phosphatase gezüchtet. Ein Li­ ter einer Übernachtkultur (etwa 7,5 · 10⁸ CFU/ml) wurde in zwei Teile geteilt. Ein Teil wurde dreimal mit kaltem 0,01 M Tris-HCl-Puffer, pH 8,1 gewaschen, und die Zellen wurden erneut in 20 ml 20%iger Saccharose-0,03-M-Tris-HCl, pH 8,1, 1 mM EDTA suspendiert. Nach 10 min auf einer Rotations­ schüttelvorrichtung bei Raumtemperatur wurde das Gemisch 10 min bei 13 000x g in einer Sorvall-Zentrifuge zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt, und die gut abgetropften Pel­ lets wurden schnell mit 20 ml kalter 5 · 10⁻⁴ M MgCl₂-Lösung vermischt. Die Suspension wurde in einem Eisbad auf einer Rotationsschüttelvorrichtung 10 min vermischt und zentrifu­ giert. Der Überstand, welcher als "osmotische Schockwasch­ lösung" bezeichnet wird, wurde für die weitere Prüfung ge­ sammelt. Zum Vergleich wurde der andere Teil von Zellen zen­ trifugiert, gewaschen und in 5 ml Polymix-Puffer (I) (genau wie von Jelenc, P. C., Anal. Biochem. 105, 369-374 (1980) be­ schrieben) wieder suspendiert. Die Zellen wurden in einer X- Presse, wie vom Hersteller empfohlen, desintegriert. Die Zelldebris wurden durch Zen­ trifugieren bei 13 000 Upm während 15 min in einer Sorvall- SS-34-Rotorzentrifuge entfernt, und der Überstand wurde für die weitere Prüfung gesammelt.

Die zwei erhaltenen Extrakte, welche periplasmisches und Gesamtzellenprotein enthielten, wurden jeweils mit den unten angegebenen enzymatischen Versuchen auf die alkalische Phos­ phatase und Phenylalanin-tRNA-Synthetase und auf Protein A, wie oben unter den Routineverfahren beschrieben, analysiert.

Enzymatische Assays

Alkalische Phosphatase wurde in einem Tris-Puffer, 0,05 M, pH 8,0 unter Verwendung von p-Nitrophenylphosphat (4 · 10⁻⁴ M) als Substrat untersucht. Die Hydrolyse von p-Nitrophenylphosphat wurde in einem Spektrophotometer bei 410 mµ gemessen. Eine Einheit der Aktivität stellte eine Änderung der Absorption bei 410 mµ von 1,0 pro Minute dar. (Heppel, L. A., Harkness, D. R. und Hilmoe, R. J., J. Biol. Chem. 237, 841-846 (1962)).

Phenylalanin-tRNA-Synthetase

Die Analyse erfolgte in einem Gemisch, welches in einem Ge­ samtvolumen von 100 µl enthielt: 5 mM Mg(OAc)₂, 0,5 mM CaCl₂, 95 mM KCl, 5 mM NH₄Cl, 8 mM Putrescin, 1 mM Spermidin, 5 mM K-Phosphat, pH 7,5, 1 mM Dithioerythrit, 1 mM ATP, 6 mM Phosphoenolpyruvat, 1 µg Pyruvatkinase (Sigma, St. Louis, USA), 1 Einheit Myokinase (Sigma), 100 µM (¹⁴C)-Phenylala­ nin (4 cpm/pmol), 300 µg Gesamt-E.-coli-tRNA.

Der X-gepreßte Zellextrakt und die osmotische Schockwasch­ lösung wurden durch Zugabe von 10 µl geeigneter Verdünnun­ gen geprüft. Die Enzymanalysen wurden während 15 min bei 37°C durchgeführt. Kaltes 10%iges TCA wurde zur Unterbre­ chung der Reaktion und zur Präzipitation von Phenylalanin- tRNA zugegeben. Das Präzipitat wurde auf Glasfaserfiltern gesammelt, mit 10%igem kaltem TCA und kaltem 70%igen Ethanol gewaschen, und die Radioaktivität wurde be­ stimmt. Eine Aktivitätseinheit wird als die Bildung von 1 pmol Phe-tRNA pro Minute definiert. (Wagner, E. G. H., Jelenc, P. C., Ehrenberg, M. und Kurland, C. G. Eur. J. Biochem. 122, 193-197 (1982)).

Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 1 angegeben. Alle Zahlen in der Tabelle sind pro 500 ml Zellkultur (ca. 7,5 · 10⁸ CFU/ml) berechnet.

Tabelle 1

Enzymaktivitäten und Protein-A-Gehalt von E.-coli-Zellen, welche pSPA1 enthalten

Aus Tabelle 1 folgt, daß Protein A und alkalische Phosphata­ se freigegeben wurden, wenn die Zellen osmotischem Schock unterworfen wurden, wohingegen keine Aktivität des intra­ zellularen Enzyms Phenylalanin-tRNA-Synthetase in der osmo­ tischen Schockwaschlösung nachgewiesen wurde. Dieses Ergeb­ nis zeigt an, daß die S.-aureus-Signalsequenz, welche ent­ sprechend den Sequenzwerten (Fig. 3) in der klonierten DNA vorhanden ist, in E. coli ausgedrückt bzw. erzeugt wird und daß das Signalpeptid von der Membran erkannt wird. In einem grampositiven Bakterium, dem die Außenmembran fehlt, wie Bacillus subtilis, hätte das Signalpeptid höchstwahr­ scheinlich die Sekretion des Proteins A in das Wachstumsme­ dium bewirkt.

Die Mengen an Protein A, die durch die pSPA1 tragenden E.- coli-Zellen erzeugt wurden, betragen etwa 1 bis 2 mg/Liter Medium.

Beispiel II Klonierung von Protein A in verschiedenen staphylococcen Stämmen I. Konstruktion des Shuttle-Vektors, welcher das Protein- A-Gen enthält

Zwei Shuttle-Vektoren, welche das Protein-A-Gen enthielten, wurden erzeugt, um eine Replikation sowohl in E. coli, S. aureus als auch coagulasenegativen Staphylococcen zu ermög­ lichen. Der Plasmid-Vektor pHV33 auf der Grundlage des staphylococcen Plasmids pC194 wurde verwendet, um Ampicil­ lin- und Tetracyclinresistenz in E. coli und Chloramphenicol­ resistenz in Staphylococcen auszudrücken.

A. Konstruktion des Shuttle-Vektor-Plasmids pSPA15 (Fig. 6)

Der erste Shuttle-Vektor wird durch Klonierung des 2,1 kb- EcoRV-Fragments, enthaltend das Protein-A-Gen, wie in Bei­ spiel I, Stufe G beschrieben, in die EcoRV-Stelle von Plas­ mid pHV33 aufgebaut bzw. konstruiert. 2 µg des Plasmids pSPA3 aus Stufe G von Beispiel I und 1 µg pHV33 wurden mit Eco RV geschnitten bzw. gespalten, vermischt, mit T4-Ligase behandelt und zur Transformierung von E. coli HB101 verwen­ det. Spaltung, Ligation und Transformation wurden, wie oben unter Routineverfahren beschrieben, durchgeführt. Kolonien, welche Rekombinanten enthielten, wurden als ampicillinresi­ stent und tetracyclin- und chloramphenicolempfindlich auf analoge Weise, wie in Stufe D von Beispiel I beschrieben, ausgewählt. Die Restriktionsanalyse entsprechend der Stufe F in Beispiel I zeigte, daß von 8 geprüften Klonen alle das in Fig. 6 schematisch dargestellte Plasmid enthalten. Alle Klone besaßen den Einsatz in gleicher Orientierung wie im Plasmid pSPA3 (vgl. Stufe G, Beispiel I). Ein Klon, der dieses Plasmid enthielt, bezeichnet als pSPA15, wurde für weitere Untersuchungen ausgewählt. Es wurde festgestellt, daß dieses Plasmid das gesamte Strukturgen von Protein A, Kodierung für ein vollentwickeltes Protein von 447 Aminosäu­ ren, enthielt und ein vorhergesagtes Molekulargewicht von 49 604 hatte.

B. Konstruktion bzw. Aufbau des Shuttle-Vektor-Plasmids pSPA16 (Fig. 8) B1 Subklonierung des 5′-Endes des Protein-A-Gens von pSPA1 in das Plasmid pTR262 unter Bildung des Plasmids pSPA2 (Fig. 7)

1 µg Plasmid pSPA1 (siehe Fig. 1) von Stufe E von Beispiel I und 1 µg Plasmid pTR262 wurden mit den Restriktionsenzy­ men Hind III und Pst I geschnitten bzw. gespalten, gemischt, mit T4-Ligase behandelt und zur Transformierung von E. coli HB101 verwendet. Spaltung, Ligation und Transformation er­ folgten wie oben unter Routineverfahren beschrieben.

Plasmid pTR262 enthält ein Lambda-Repressorgen, welches bei der Expression das Gen für die Tetracyclinresistenz inak­ tiviert. Das Lambda-Repressorgen besitzt eine Hind-III-Stel­ le, und daher inaktiviert der Einsatz einer DNA-Sequenz in die letztere das Lambda-Repressorgen und aktiviert das Te­ tracyclinresistenzgen. Plasmid pTR262 erlaubt somit die po­ sitive Selektion für tetracyclinresistente Rekombinanten.

Kolonien, die Rekombinanten enthielten, wurden somit als tetracyclinresistent ausgewählt. Es wurde gefunden, daß ei­ ne Kolonie dieser 20 Rekombinanten Protein-A-positiv war, wenn man das ELISA-Verfahren anwendet, welches zuvor unter den Routineverfahren beschrieben wurde. Die Restriktionsana­ lyse zeigte, daß es das Vektorplasmid pTR262 mit einem 2,1- kb-Protein-A-Gen-Einsatz, der sich von dem Fragment, welches 0,0 bis 2,1 kb der pSPA1-Restriktionskarte der Fig. 1 und 2B entspricht, ableitet, enthielt. Dieses Plasmid wurde als pSPA2 bezeichnet und ist schematisch in Fig. 7 darge­ stellt. Es besitzt eine einzigartige Pst-I-Restriktionsstel­ le am 3′-Ende des Protein-A-Gen-Fragments, welches bei der folgenden Stufe B5 verwendet wird.

B2 Herstellung eines DNA-Fragments, enthaltend das Pro­ tein-A-Gen

100 µg des Plasmids pSPA5 aus Stufe G von Beispiel I wurden mit dem Restriktionsenzym Eco RI während 1 h bei 37°C ge­ schnitten bzw. gespalten. Dabei erhielt man zwei DNA-Frag­ mente, nämlich das eingesetzte DNA-Fragment, welches das Protein-A-Gen (2,1 kb) enthielt, zwischen den Positionen 0,2 kb und 2,3 kb in Fig. 2B, und den Vektor pHV14 (7,2 kb). Dieses digerierte Material wurde in der Hitze inaktiviert, mit Ethanol präzipitiert, in 100 µl TE gelöst und mittels eines 10- bis 30%igen Saccharosegradienten in TE-Puffer se­ dimentiert. Ein Beckman-SW40-Rotor wurde bei 5°C, 35 000 Upm während 20 h verwendet. Der Gradient wurde in 0,5-ml- Fraktionen fraktioniert, wovon jede mittels Agarosegelelek­ trophorese analysiert wurde. Die Fraktionen, welche das 2,1- kb-Fragment enthielten, wurden gesammelt, mit 2 Volumen Ethanol präzipitiert und in TE-Puffer gelöst. Aus den Fig. 2A und B folgt, daß das Fragment zusätzlich zu dem ge­ samten Protein-A-Gen eine E.-coli-Sequenz, die sich von Plas­ mid pBR322 ableitet, und einen staphylococcen Genrest ent­ hält.

B3 Herstellung eines DNA-Fragments, welches einen Teil des Protein-A-Gens enthält

5 µg des gereinigten 2,1-kb-Fragments aus Stufe B2 wurden mit Restriktionsenzym Sau 3A während 1 h bei 37°C geschnit­ ten bzw. gespalten. Das digerierte Material wurde einer prä­ parativen Gelelektrophorese an 8%igem Polyacrylamid in TEB- Puffer unterworfen. Das Gel wurde mit Ethidiumbromid (1 µg/ ml) angefärbt, und ein DNA-Fragment von ungefähr 600 Basen­ paaren wurde herausgeschnitten. Dieses Fragment entspricht dem Teil des Gens zwischen den Positionen 1,15 und 1,8 kb in Fig. 2B. Die DNA wurde über Nacht bei 37°C in 5 ml TE + 0,3 M NaCl eluiert. Das Eluat wurde über eine Säule gelei­ tet, welche ungefähr 300 µl sedimentiertes DE-52, equilibriert mit 5 ml TE, enthielt. Nach dem Wa­ schen mit 2 ml TE + 0,3 M NaCl wurde die DNA mit zwei Volu­ men von jeweils 0,5 ml TE + 0,6 M NaCl eluiert. Das Eluat, welches das DNA-Fragment enthielt, wurde mit einem Volumen TE verdünnt, mit Ethanol präzipitiert und in TEB-Puffer ge­ löst. Das entstehende gereinigte Protein-A-Gen-Fragment be­ sitzt kohäsive Enden, die einer Sau-3A-Restriktionsstelle und einer Zwischen-Hind-III-Stelle entsprechen.

B4 Herstellung von Vektorplasmid pUR222

Das Plasmid pUR222 ist ein im Handel erhältlicher Vektor, welcher die Genkodierung für das Enzym β-Galactosidase (lac Z) enthält. Das Gen enthält einen Multilinker mit ver­ schiedenen Restriktionsstellen, wie Pst I, Bam H1 und Eco RI. Da β-Galactosidase durch enzymatische Analysen leicht nachweisbar ist, können Rekombinanten mit einem DNA-Frag­ ment, welches in eine der Restriktionsstellen eingesetzt ist, unter Verwendung geeigneter Wirtstämme leicht nachge­ wiesen werden. Oft werden Xgal-Platten verwendet (Xgal ist ein chromogenes Substrat, 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-ga­ lactosid, welches ein blaues Indolylderivat freisetzt, wenn es mit β-Galactosidase gespalten wird), auf denen β-Galacto­ sidase-negative Rekombinanten als weiße Kolonien im Gegen­ satz zur blaugrünen Farbe der Kolonien, welche Plasmids oh­ ne Einsatz enthalten, erscheinen.

Zur Spaltung des Plasmids pUR222 im β-Galactosidase-Kodie­ rungsgen unter Bildung kohäsiver Enden, die komplementär zu den kohäsiven Enden des Protein-A-Fragments der Stufe B3 für den Einsatz davon in das Plasmid sind, wurde die Bam- H1-Restriktionsstelle verwendet. 1 µg pUR222, erhalten von Boehringer-Mannheim, Deutschland, wurde mit dem Restrik­ tionsenzym Bam H1 während 1 h bei 37°C digeriert. Darauf wird das Enzym bei 65°C während 10 Minuten inaktiviert. Die­ se Spaltungspräparation wurde bei der folgenden Stufe B5 für die Ligation mit dem Protein-A-Fragment verwendet.

B5 Konstruktion eines pSPA2 und pTR262 enthaltenden Hy­ bridplasmids pSPA10 (Fig. 7)

200 ng pUR222, digeriert mit Bam H1, wie in Stufe B4 be­ schrieben, und 200 ng eluiertes Protein-A-Fragment, wie in Stufe B2 beschrieben, wurden vermischt und in einem Gesamt­ volumen von 20 µl über Nacht bei +14°C der Ligation unter­ worfen. Das Enzym wurde bei 65°C 10 Minuten lang inaktiviert, mit Ethanol präzipitiert und in TE-Puffer gelöst. Das gesam­ te DNA-Gemisch, welches u. a. rekombinante Plasmide mit dem Protein-A-Einsatz in dem β-Galactosidasegen enthielt, wurde mit den Restriktionsenzymen Hind III und Pst I während 1 h bei 37°C in dem für Hind III empfohlenen Puffer gespalten bzw. geschnitten. Dabei wird das rekombinante Plasmid in das β-Galactosidasegen (Pst I) und in das Protein-A-Gen (Hind III) gespalten, wobei zwei Fragmente erzeugt werden, nämlich ein kleines Fragment, welches aus einer kleineren β-Galactosidase-DNA-Sequenz, gebunden an den Teil des Pro­ tein-A-Gen-Fragments von der Sau-3A-Stelle an der Position 1,15 kb an die Hind-III-Stelle in Fig. 2B, besteht, und aus einem großen Fragment, welches aus dem Rest des rekom­ binanten Plasmids besteht, das den größeren Teil des β-Ga­ lactosidasegens enthält, welcher an das Protein-A-Gen-Frag­ ment von der Hind-III-Stelle an die Sau-3A-Stelle in Posi­ tion 1,8 kb in Fig. 2B gebunden ist. Wie aus Fig. 7 folgt, besitzt das β-Galactosidasefragment eine Eco-RI-Restriktions­ stelle nahe an der Stelle der Verschmelzung mit dem Protein- A-Fragment (die Bam-H1-Stelle).

200 ng Plasmid pSPA2 von Stufe B1 wurden mit den Restrik­ tionsenzymen Hind III und Pst I auf gleiche Weise wie oben geschnitten bzw. gespalten, um das Plasmid in drei Fragmen­ ten zu spalten (siehe Fig. 7), nämlich ein Fragment, welches sich von der Hind-III-Stelle zwischen dem Tet-Gen und dem 5′-Ende des Protein-A-Gens zu der Hind-III-Stelle innerhalb des Protein-A-Gens erstreckt, ein Protein-A-Gen-Fragment, welches sich von der letzteren Hind-III-Stelle zur der Pst-I- Stelle am 3′-Ende des Protein-A-Gens erstreckt, und ein grö­ ßeres Fragment vom pTR262-Ursprung, welches den Rest des Plasmids enthält.

Die beiden oben hergestellten Digests wurden bei 65°C wäh­ rend 10 Minuten inaktiviert, vermischt und mit Ethanol prä­ zipitiert. Die DNA wurde in Ligationspuffer gelöst und mit T4-Ligase behandelt. Das gewünschte rekombinante Plasmid enthält das oben erwähnte große Fragment, welches bei der Spaltung der pUR222-Rekombinante, eingesetzt in pSPA2 zwi­ schen der Hind-III-Stelle innerhalb des Protein-A-Gens und der Pst-I-Stelle, erhalten wird und das 5′-Ende des Protein- A-Gens enthält. Ein Teil davon leitet sich somit von pSPA2 ab, und der andere stammt aus der pUR222-Rekombinante. Wei­ ter ist das Plasmid ampicillin- und tetracyclinresistent und sollte auf Xga-Platten, wie im folgenden erläutert wird, eine blaue Farbe ergeben.

Das der Ligation unterworfene DNA-Gemisch wurde daher zur Transformierung von E. coli RRI del M15 verwendet. Spaltung, Ligation und Transformation wurden, wie oben beschrieben, durchgeführt. Die Rekombinanten wurden auf Xgal-Platten, welche Ampicillin und Tetracyclin enthielten, aufgebracht. Einer dieser Klone erschien als hellblau, und die Restrik­ tionsanalyse wurde auf seinem Plasmid durchgeführt. Man er­ hielt ein Plasmid, welches als pSPA10 (Fig. 7) bezeichnet wurde, das aus Teilen von Plasmid pUR222, Plasmid pTR262 und dem Protein-A-Gen, welches aus Plasmid pSPA1 stammt, besteht und eine einzigartige Eco-RI-Stelle am stromabwär­ tigen Ende des Gens aufweist.

Obgleich das Plasmid pSPA10 nicht die gesamte lac-Z-Gen-Ko­ dierung für β-Galactosidase, sondern nur die Genkodierung für das α-Fragment davon (lac Z′) enthält, ist es bei der Spaltung des Xgal-Substrats aktiv und erzeugt bei den oben angewandten Bedingungen eine blaue Farbe. Dies ist auf ei­ ne Komplementation zwischen dem α-Fragment, kodiert mit dem Plasmid, und einem chromosomalen Genprodukt zurückzuführen, welches das carboxyterminale Fragment von β-Galactosidase enthält, das ein aktives Enzym ergibt. Der E.-coli-RRI-del- M15-Wirtstamm, wie er oben verwendet wurde, besitzt so ein chromosomales Genmaterial und komplementiert das α-Fragment, das von dem pSPA10-Plasmid gebildet wurde, zu einem aktiven β-Galactosidasemolekül.

B6 Subklonierung des Protein-A-Kodierungsgens in das Plas­ mit pBR322 zur Konstruktion des Plasmids psPA8 (Fig. 7)

1 µg des gereinigten 2,1-kb-Protein-A-Fragments von der Stu­ fe B2 wurde mit dem Restriktionsenzym Taq I während 1 h bei 60°C gespalten, um es innerhalb der DNA des Staphylococcen­ ursprungs zu spalten. Das Enzym wurde durch Extraktion mit einem gleichen Volumen Phenol inaktiviert, darauf folgte ei­ ne mehrfache Etherextraktion, und schließlich wurde die DNA mit Ethanol präzipitiert und in TE-Puffer gelöst. 1 µg des Plasmids pBR322 wurde mit den Restriktionsenzymen Cla I und Eco RV (welche auf gleiche Weise spalten und somit komple­ mentäre kohäsive Enden ergeben) während 1 h bei 37°C in Bam- H1-Puffer gespalten und dann während 10 Minuten bei 65°C in der Hitze inaktiviert. Die DNA-Proben wurden vermischt, der Ligation unterworfen und zur Transformierung von E. coli HB101, wie oben bei den Routineverfahren beschrieben, ver­ wendet. Transformante wurden auf Ampicillin (35 µg/ml) aus­ gestrichen. Die Kolonien wurden auf Platten, welche 10 µg/ml Tetracyclin bzw. 35 µg/ml Ampicillin enthielten, gegeben. Die Transformanten, die auf Ampicillin, jedoch nicht auf Tetracyclin wuchsen, wurden als Rekombinanten angesehen. Es wurde gefunden, daß 4 Kolonien von diesen 12 Rekombinanten Protein-A-positiv waren bei Anwendung des ELISA-Verfahrens, beschrieben unter den Routineverfahren. Die Restriktionsana­ lyse, bei der gereinigtes Plasmid mit einem, zwei oder drei Restriktionsenzymen gespalten wurde, wurde mit einem dieser Klone durchgeführt. Die entstehende Restriktionskarte die­ ses Plasmids, welches als pSPA8 bezeichnet wird, ist in Fig. 7 dargestellt. Das so konstruierte Plasmid besitzt kei­ nen E.-coli-Promotor stromaufwärts vom Protein-A-Gen, vor dem Protein-A-Gen-Fragment ist nur der eigene staphylococce Promotor vorhanden.

B7 Konstruktion des Plasmids pSPA16 (Fig. 8)

Ein zweiter Shuttle-Vektor wurde konstruiert, welcher für das abgestumpfte Protein A kodiert (d. h. dem der X-Bereich fehlt). Die Konstruktion ist schematisch in Fig. 8 dargestellt. 5 µg Plasmid pSPA10 von Stufe B5 wurden mit Eco RI und Hind III gespalten, und ein 0,4-kb-Fragment wur­ de aus einem 5%-Polyacrylamidgel nach der Elektrophorese herausgeschnitten. Das Fragment wurde wie oben bei den Rou­ tineverfahren beschrieben eluiert und gereinigt. 5 µg Plas­ mid pSPA8 aus Stufe B6 wurden auf gleiche Weise behandelt, und ein 0,7-kb-Fragment wurde isoliert und gereinigt. Schließlich wurden 2 µg Plasmid pHV33 mit Eco RI digeriert, mit alkalischer Phosphatase behandelt und mit den beiden ge­ reinigten DNA-Fragmenten vermischt. Nach der Behandlung mit T4-Ligase wurde die DNA zur Transformierung von E. coli HB101 verwendet. Spaltung, alkalische Phosphatase-Behandlung, Ligation und Transformation erfolgten, wie oben bei den Rou­ tineverfahren beschrieben. Die Restriktionsanalyse von 12 ampicillinresistenten Klonen zeigte einen Klon an, welcher Plasmid pHV33 mit einem 1,1-kb-Einsatz in der Eco-RI-Stelle enthielt. Das als pSPA16 bezeichnete Plasmid ist in Fig. 8 schematisch dargestellt. In Fig. 9 sind die Nucleotidse­ quenz und die deduzierten Aminosäuren, die dem Stopcodon dieses abgestumpften Protein-A-Gens vorhergehen, dargestellt. Das vollentwickelte Protein, dem der Bereich X fehlt, das so gebildet wurde, enthält 274 Aminosäuren, was ein voraus­ gesagtes Molekulargewicht von 30 938 ergibt. Dieses abge­ stumpfte Protein-A-Molekül, welches schematisch in Fig. 10 dargestellt ist, enthält alle IgG-Bindungsteile von Protein A in intakter Form, ausgenommen dem C-terminalen Teil des Bereichs C.

II. Retransformation der Shuttle-Vektoren pSPA15 und pSPA16 in E. coli

Die Shuttle-Vektoren pSPA15 und pSPA16, die im Abschnitt I oben konstruiert wurden, wurden in E. coli HB101 retransfor­ miert mit der Selektion für Ampicillin (amp)-resistenz (50 µg/ ml) wie in Abschnitt I. Die Transformanten wurden auf ihre Protein-A-Produktion nach dem ELISA-Test, wie oben bei den Routineverfahren beschrieben, geprüft. Plasmid-DNA wur­ de aus Protein-A-positiven Klonen, welche die entsprechen­ den Plasmide enthielten, ebenfalls, wie oben bei den Routi­ neverfahren beschrieben wurde, isoliert.

III. Transformation von Stämmen von S. aureus, S. xylosus und S. epidermidis A. Herstellung und Transformation von Protoplasten von S. aureus SA113

Unterschiedliche Spezies und gleiche Stämme von Staphylococ­ cen enthalten unterschiedliche Restriktions- und Modifika­ tionssysteme, und die meisten Stämme tragen mehrere davon (vgl. Stobberingh, E. E. und K. Winkler, J. Gen. Microbiol. 99: 359-367 (1977) und Sjöström, J.-E. u. a., J. Bacteriol. 133: 1144-1149 (1978)).

Dies verursacht Schwierigkeiten, wenn das Plasmid-DNA, wel­ ches aus E. coli isoliert wurde, in Staphylococcen durch Transformation eingeführt werden soll.

Zur Beseitigung des Restriktionsproblems wurde eine restrik­ tionsarme Mutante von S. aureus 8325, bezeichnet als SA113, ursprünglich von Iordanescu u. a. (J. Gen. Microbiol. 96: 277-281 (1976)) isoliert, daher verwendet, um die primären Transformationen in S. aureus der Plasmid-DNA, isoliert aus E. coli HB101, durchzuführen. Der ursprüngliche Stamm SA113 ist lysogen für Prophagen ⌀11, ⌀12 und ⌀13 und wurde wei­ terhin mit der Phage 83A lysogeniert. Der Stamm besitzt den folgenden Phagentyp: 29/47/75/85/. Zur weiteren Abnahme der Restriktion wurden die Protoplasten auf 56°C während 30 Se­ kunden unmittelbar vor der Zugabe von DNA erhitzt (vgl. Ashe­ shov u. a., J. Gen. Microbiol. 31: 97-107 (1963), und Sjö­ ström, J.-E. u. a., Plasmid 2: 529-535 (1979)).

Verfahren und Medien für die Herstellung der Protoplasten wa­ ren hauptsächlich diejenigen, die für Bacillus subtilis von Wyrick und Rogers in J. Bacteriol. 116: 456-465 (1973) be­ schrieben und von Chang und Cohen, Mol. Gen. Genet. 168: 111-115 (1979) modifiziert wurden. Es wurden jedoch einige Modifizierungen für Staphylococci durchgeführt, wie von Lindberg in J. Jeljaczewicz: Staphylococci and Staphylococ­ cal Infections, Zbl. Bakt. Suppl. 10: 535-541; Gustav Fi­ scher Verlag, Stuttgart-New York (1981) und Götz u. a. in J. Bacteriol. 145: 74-81 (1981) beschrieben.

10-ml-Proben von S. aureus SA113, gezüchtet in Trypticase- Soja-Kulturmedium (BBL), zu der stationären Phase (ca. 2 · 10⁹ koloniebildende Einheiten pro ml) wurden isoliert und auf das gleiche Volumen in ei­ nem hypertonischen gepufferten Medium (HBM), welches aus 0,7 M Saccharose, 0,02 M Na-Maleat und 0,02 M MgCl₂ bestand und dessen pH-Wert mit NaOH auf 6,5 eingestellt wurde, plus 43 g Difco-Penassy-Medienpulver pro Liter suspendiert. Lysostaphin und Lysozym wurden bei 20 und 2000 µg/ml Endkonzentra­ tion zugegeben, und die Zellsuspensionen wurden bei 37°C unter leichtem Schütteln inkubiert. Zur Entfernung der Zell­ wand ist Lysozym nicht erforderlich, es hilft jedoch bei der Abtrennung der Protoplasten, die, wie intakte Zellen von Staphylococci, die Tendenz besitzen, sich zusammenzu­ ballen. Diese Inkubation wurde weitergeführt, bis die Ab­ sorption bei 540 nm konstant wurde, was normalerweise inner­ halb von 3 Stunden geschah. Die verbleibenden intakten Bak­ terien und Zellendebris wurden durch Zentrifugieren bei 2500x g während 10 min pelletisiert. Die Überstände wur­ den gesammelt und erneut bei 16 000x g während 10 min zen­ trifugiert. Die pelletisierten Protoplasten wurden erneut in HBM auf 1/10 des Volumens der Ausgangskultur suspendiert. 0,4-ml-Suspensionen der hergestellten SA113-Protoplasten in HBM (ca. 2 · 10⁷ Zellwandregenerierungsprotoplasmen pro ml) wurden mit E.-coli-Plasmid-DNA aus Stufe II oben wie folgt transformiert.

10 bis 20 µg Protein-A-positive Plasmid-DNA wurden in einem Maximalvolumen von 20 µl unter leichtem Mischen zugegeben. 2 ml 40% PEG 6000 (Stock-Lösung von Polyethylenglykol (PEG), hergestellt durch Auflösung von 40 g PEG mit einem Moleku­ largewicht von 6000 (PEG 6000) in 100 ml hypertonischem Puffer (HB): 0,7 M Saccharose, 0,02 M Na-Maleat und 0,01 M MgCl₂, pH mit NaOH auf 6,5 eingestellt) wurden unmittelbar zugegeben, und 2 Minuten später wurden 8 ml HBM zugegeben. Die Suspension wurde bei 48 200x g während 15 min zentri­ fugiert. Die pelletisierten Protoplasmen wurden dann erneut in 1 ml HBM suspendiert, und nach geeigneten Verdünnungen in HBM-Proben wurden sie für die Regenerierung der Zellwand plattiert bzw. auf Platten aufgetragen. Das Regenerations­ medium war DM3, ein Casaminosäuren-Hefeextrakt-Rinderserum­ albumin-Medium, welches 0,5 M Natriumsuccinat und 8 g Agar pro Liter entsprechend Chang und Cohen, Mol. Gen. Genet. 168: 111-115 (1979) enthielt. Zur Selektion der chloramphe­ nicolresistenten Transformanten wurde CY-Medium (Novick, R. P., J. Gen. Microbiol. 33: 121-136 (1963)) mit 0,5 M Na­ triumsuccinat, 0,02 M MgCl₂, 0,08% Rinderserumalbumin und 4 g Agar pro Liter als weiche Agarüberschicht mit Chlor­ amphenicol verwendet, so daß man eine Endkonzentration von 10 µg/ml in dem Gesamtagarmedium erhielt. Die phenotypische Expression konnte bei 37°C während 3 Stunden vor der Zugabe von weichem Agar mit Chloramphenicol ablaufen. Die Platten wurden bei 37°C während 3 Tagen inkubiert. Chloramphenicol­ resistente Transformanten wurden auf TSA-Platten (Tryptica­ se Soy Agar) mit Chloramphenicol (10 µg/ml) wieder ausge­ strichen.

B. Nachweis von Protein A

Ein qualitativer Test von Protein A wurde durchgeführt, in­ dem man Transformanten auf Brain-Heart-Infusions- (BHI)-Agar (Gehirn-Herz-Infusions-Agar) -Platten mit 1% Hundeserum ausstrich. Die Protein-A- Produktion wurde als Halo des präzipitierten IgG-Protein-A- Komplexes um die Kolonien (Kronvall, G. u. a., J. Immunol. 104: 140 (1970)) nachgewiesen. Der Rezipientenstamm S. au­ reus SA113 erzeugte sehr geringe Mengen an Protein A, fast ohne nachweisbaren Halo um die Kolonien.

C. Herstellung von Plasmid-DNA

Das Plasmid-DNA wurde aus dem Protein A hergestellt, wel­ ches SA113-Transformanten erzeugt, die in Stufe A erhalten wurden, indem man ein Schnellkochverfahren, wie es von Hol­ mes u. a. (Anal. Biochem. 114: 193 (1981)) beschrieben wird, anwandte, ausgenommen, daß Lysozym durch Lysostaphin bei einer Endkonzentration von 50 µg/ml ersetzt wurde.

D. Transformation von Staphylococci

Die folgenden staphylococcen Stämme wurden mit Plasmiden pSPA15 und pSPA16, wie oben in Stufe A für S. aureus SA113 beschrieben, transformiert:
Staphylococcus aureus U320, eine Protein-A-negative Mutan­ te des Stammes S. aureus SA113, isoliert beim Department of Microbiology, The Biomedical Centre, Uppsala, Schweden; Staphylococcus epidermidis 247, ein coagulasenegativer Sta­ phylococcus, der Protein A nicht erzeugt; Staphylococcus xylosus KL117, ein coagulasenegativer Staphy­ lococcus, der Protein A nicht erzeugt.

IV. Herstellung von Protein A, kodiert mit den Plasmiden pSPA15 und pSPA16

Transformanten, die bei den Stufen III A bis D oben erhal­ ten wurden, wurden in Trypticase-Soy-Medium, angereichert mit Thiamin (1 mg/Liter), Nicotinsäure (1,5 mg/Liter) und Ca-Pantothenat (1,5 mg/Liter), gezüchtet, und die Produk­ tion von extrazellularem wie auch an die Zellwand gebunde­ nem Protein A wurde bestimmt. Das an die Zellwand gebundene Protein A ist die Menge an Protein A, die nach der Gesamt­ lyse von 1 ml gewaschener Zellen in der stationären Wachs­ tumsphase (ca. 8 · 10⁹ CFU/ml) freigesetzt wird, und das extrazellulare Protein A ist die Menge an Protein A in dem Wachstumsmedium.

Das mit der Zellwand assoziierte Protein A wurde quantitativ bestimmt, indem man die Bindung von ¹²⁵J-markiertem Human- IgG an die Zellen mißt (Kronvall, G., J. of Immunol. 104: 273-278 (1970)) oder indem man den ELISA-Test anwendet, wie er unter den Routineverfahren beschrieben worden ist, nach Beendigung der Lyse der Zellen mit Lysostaphin.

Das extrazellulare Protein A wurde unter Anwendung des ELI­ SA-Tests gemessen.

S.-aureus-Stämme Cowan I und A676 wurden als Referenzstämme für die Produktion von an die Zellwand gebundenem und extra­ zellularem Protein A verwendet.

Der Stamm Cowan I ist der Typ von Stamm für Untersuchungen der Zellwand, an welche Protein A gebunden ist (Nordström, K., Acta Universitatis Upsaliensis. Abstracts of Uppsala Dissertations from the Faculty of Medicine 271 (1977)). Ge­ ringe Mengen an Protein, d. h. extrazellulares Protein A, wurden in dem Wachstumsmedium nachgewiesen, vermutlich be­ dingt durch Autolyse.

Der Stamm A676 ergibt nur extrazellulares Protein A (Lind­ mark u. a., Eur. J. Biochem. 74: 623-628 (1977)) und wird von Pharmacia AB zur industriellen Produktion von Protein A verwendet.

Die Ergebnisse sind in den folgenden Tabellen 2 und 3 aufge­ führt. Alle Werte in den Tabellen sind für die Zelldichten korrigiert und somit direkt vergleichbar.

Tabelle 2

Produktion von an die Zellwand gebundenem Protein A in unterschiedlichen staphylococcen Spezies, kodiert durch Plasmid pSPA15

In Tabelle 2 wird die Menge an Protein A, welches an die Zellwand gebunden ist, beim Stamm Cowan I als 100% angenom­ men, entsprechend einer Verdünnung von 1/256 beim ELISA- Test, gleich 120 mg Protein A/Liter mit Lysostaphin behan­ delter Kultur. Alle anderen Zahlen in der Tabelle sind auf diese Zahl bezogen.

Tabelle 3

Produktion von extrazellularem Protein A in unterschiedlichen staphylococcen Spezien, kodiert durch Plasmid pSPA16

In der Tabelle 3 wird die Menge an Protein A in dem Wachs­ tumsmedium (d. h. das extrazellulare Protein A) als 100% an­ genommen, entsprechend einer Verdünnung von 1/256 im ELISA- Test und entsprechend zu 90 mg Protein A/Liter Medium. Alle anderen Zahlen beziehen sich auf diese Zahl.

Aus den Tabellen 2 und 3 oben folgt, daß das Protein A, wel­ ches durch das Plasmid pSPA15 kodiert ist, im wesentlichen an die Zellwand gebunden ist, wohingegen das ganze abge­ stumpfte Protein A, welches mit dem Plasmid pSPA16 kodiert ist, dem der Bereich X fehlt, in das Wachstumsmedium abge­ schieden bzw. abgegeben wird.

Staphylococcus xylosus wird als Starterkultur für die Her­ stellung von "Rohwurst" (Liepe, H.-U., Forum Mikrobiologie 5; 10-15 (1982), Fisher u. a., Fleischwirtschaft 60: 1046- 1051 (1980)) verwendet und kann somit als apathogene sta­ phylococce Spezies angesehen werden. Aus diesem Grund ist S. xylosus, welcher kloniertes Protein-A-Gen enthält, eine Alternative zu S. aureus für die industrielle Erzeugung von Protein A.

Ein Protein A erzeugender Klon von Staphylococcus xylosus KL117, welcher das Plasmid pSPA16 enthält, wurde bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen (DSM), Grisebach­ straße 8, 3400 Göttingen, Bundesrepublik Deutschland, am 15. August 1983 hinterlegt und erhielt die Hinterlegungs­ nummer DSM 2706.

Die Menge an Protein A, die bei den obigen Beispielen er­ halten worden ist, ist keine maximale Ausbeute. Der Fach­ mann kann innerhalb seiner Fachkenntnisse die Ausbeute er­ höhen, beispielsweise durch geeignete Wahl des Nährmediums etc.

Die oben erläuterten Ausführungsformen der vorliegenden Er­ findung bewirken nicht, daß die vorliegende Erfindung dar­ auf beschränkt ist. Es können viele Variationen und Modifi­ zierungen der Verfahren und der rekombinanten Materialien gemäß der Erfindung durchgeführt werden, die alle unter den Rahmen der vorliegenden Erfindung fallen, wie er durch die nachfolgenden Ansprüche definiert wird.

Die Erfindung umfaßt somit beispielsweise ebenfalls Klonie­ rungsvehikel, die mehr als eine getrennte Deoxynucleotidse­ quenzkodierung für das gewünschte Protein oder Polypeptid enthalten. Die Erfindung umfaßt weiterhin ebenfalls rekom­ binante DNA-Moleküle, die Deoxynucleotidsequenzen enthalten und von irgendeiner beliebigen Quelle stammen, einschließ­ lich natürlicher, synthetischer oder semisynthetischer Quel­ len, die den Deoxynucleotidsequenzkodierungen für das Pro­ tein A oder ein aktives Fragment davon, wie oben definiert, verwandt sind, durch Mutation einschließlich einzelner oder mehrfacher Basensubstitutionen, Weglassungen, Einsätzen und Inversionen.

Claims (13)

1. Ein rekombinantes DNA-Molekül, dadurch ge­ kennzeichnet, daß es mindestens eine Deoxy­ nucleotidsequenz, kodierend für Protein A oder ein Poly­ peptidfragment davon, welches fähig ist, mindestens ein Immunglobulin an seinem Fc-Teil zu binden, enthält, wobei diese Deoxynucleotidsequenz mindestens eine der DNA-Se­ quenzen, die in den Fig. 3A bis D als kodierend für die IgG-Bindungsregionen A, B, C, D und E angegeben sind, um­ faßt und die Fig. 3A bis D Bestandteil dieses Anspruchs sind.

2. Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es ein rekombinantes Plasmid ist.

3. Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das DNA-Frag­ ment die genetische Information für die Expression eines Po­ lypeptidfragments von Protein-A besitzt, welches dem IgG-ak­ tiven Teil des Protein-A-Moleküls entspricht.

4. Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten DNA- Moleküls nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch ge­ kennzeichnet, daß man das DNA-Molekül nach Anspruch 1 in ein Klonierungsvehikel einsetzt.

5. Mikroorganismus, dadurch gekennzeich­ net, daß er durch das rekombinante DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 3 transformiert worden ist.

6. Mikroorganismus nach Anspruch 5, dadurch ge­ kennzeichnet, daß er ein Bakterium, bevorzugt ein grampositives Bakterium, ist.

7. Mikroorganismus nach Anspruch 5, dadurch ge­ kennzeichnet, daß er ein Bacillus- oder Staphylococcus-Stamm ist.

8. Mikroorganismus nach Anspruch 7, dadurch ge­ kennzeichnet, daß er ein Stamm von Bacillus subtilis ist.

9. Mikroorganismus nach Anspruch 7, dadurch ge­ kennzeichnet, daß er ein Stamm von Staphylococcus xylosus ist.

10. Mikroorganismus nach Anspruch 5, dadurch ge­ kennzeichnet, daß er eine Hefe ist.

11. Verfahren zur Herstellung des transformierten Mikroorganismus nach einem der Ansprüche 5 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß in einen Wirtsorganismus das rekombinante DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 3 eingeführt wird.

12. Verfahren zur Herstellung von Protein A oder eines Derivats davon, welches mindestens ein Immunglobulin an seinem Fc-Teil binden kann, dadurch gekenn­ zeichnet, daß man den transformierten Mikro­ organismus nach einem der Ansprüche 5 bis 10 in einem ge­ eigneten Nährmedium züchtet und das gewünschte Produkt daraus isoliert.

13. Protein A oder ein Derivat davon, welches mindestens ein Immunglobulin an seinem Fc-Teil binden kann, dadurch gekennzeichnet, daß es mindestens eine der Prote­ insequenzen, die in den Fig. 3A bis D als IgG-Bindungs­ regionen A, B, C, D und E angegeben sind, umfaßt, wobei die Fig. 3A bis D Bestandteil dieses Anspruchs sind.