DE60111783T2 - Verfahren zur herstellung und reinigung von sekretierten proteinen und herstellung von protein-arrays - Google Patents

Verfahren zur herstellung und reinigung von sekretierten proteinen und herstellung von protein-arrays Download PDF

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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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Description

  • Technisches Gebiet
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung und Reinigung von interessierenden Proteinen durch Sekretion des interessierenden Proteins von einer Wirtszelle in einem Kompartimentsystem; weiterhin betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Protein-Arrays, ein geeignetes Kompartimentsystem sowie Wirtszellen und Plasmide, die sich zur Herstellung und Sekretion der interessierenden Proteine eignen.
  • Stand der Technik
  • Die derzeitige Technologie zur Erzeugung von Protein- und Proteom-Arrays beruht auf der Klonierung von bestimmte interessierende Proteine codierenden offenen Leserastern (Open Reading Frames, ORFs) in Expressionsvektoren und ihrer Expression durch entsprechende, die jeweiligen Vektoren tragenden Bakterienzellen. Nach einer milden Lyse der Bakterien auf Filtern werden die Bakterientrümmer abgewaschen und die filtergebundenen Proteine für Bindungsstudien verwendet [Büssow et al. (1998) Nucl. Res. 26: 5007–5008; Walter et al. (2000) Curr. Op. Microbiol. 3: 298–302]. Die Nachteile dieses Verfahrens bestehen darin, daß (i) aufgrund der Tatsache, daß alle von diesen Bakterien produzierten Proteine auf dem Filter vorhanden sind, ein hoher Hintergrund an bakteriellen Proteinen besteht, die spezifische Bindungsuntersuchungen stören können, und (ii) die interessierenden Proteine während der Bakterienlyse denaturiert werden können. Das Problem eines hohen Hintergrundniveaus läßt sich durch Reinigen der überexprimierten Proteine lösen, doch ist diese Reinigung sehr arbeitsintensiv.
  • In Emili AQ et al. [Emili AQ et al. (2000) Nature Biotechnology 18: 393] wird in einer Übersicht das Konzept der Protein-Arrays behandelt.
  • Überraschend stellte sich nun heraus, daß sich die Nachteile der derzeitigen Technologie mit einem neuartigen Verfahren vermeiden lassen, bei dem man ein Sekretionssystem verwendet, das die Sekretion eines interessierenden Proteins von einer Wirtszelle in einem Kompartimentsystem, das die Trennung des interessierenden Proteins von seiner synthetisierenden Wirtszelle und deren Bestandteile sowie die Erhaltung des interessierenden Proteins in einer nichtdenaturierten Form gestattet, sicherstellt.
  • Beschreibung der Erfindung
  • Ein erster Erfindungsgegenstand ist daher ein Verfahren zur Herstellung wenigstens eines interessierenden Proteins, indem dieses durch eine Wirtszelle, die ein Sekretionssystem stabil exprimiert und zur heterologen Sezernierung des interessierenden Proteins fähig ist, in ein Kompartimentsystem, das wenigstens ein erstes und ein zweites Kompartiment aufweist, wobei die Wirtszelle im ersten Kompartiment lokalisiert ist und wobei das erste und das zweite Kompartiment durch eine Schranke voneinander getrennt sind, sezerniert wird, wobei die Schranke für das sezernierte interessierende Protein, jedoch nicht für die Wirtszelle durchlässig ist. Das interessierende Protein wird gegebenenfalls im zweiten Kompartiment zurückgehalten und kann dem zweiten Kompartiment entnommen werden. Dieses neuartiges Verfahren stellt die Sekretion des interessierenden Proteins in ein Kompartimentsystem sicher, das deren Trennung von der synthetisierenden Wirtszelle sowie aller Bestandteile der letzteren gestattet und die Proteine in einer nichtdenaturierten Form erhält, da keine Lyse der Wirtszelle notwendig ist. Das neuartige Verfahren gestattet wahlweise zum einen das Zurückhalten des sezernierten Proteins auf einem Träger und/oder die Reinigung durch Verwendung eines Affinitätstag sowie weiterhin ihren Nachweis durch Verwendung eines Epitoptag und zum anderen das Entfernen der Sekretionssignal- und Tag-Sequenzen, die die Funktion des interessierenden Proteins beeinflussen könnten, durch die Einführung geeigneter Proteasespaltstellen.
  • Ein weiterer Erfindungsgegenstand ist ein Verfahren zur Herstellung eines Protein-Arrays. Im Zusammenhang mit der Erfindung bezieht sich der Begriff Protein-Array auf ein geordnetes Arrangement individueller interessierender Proteine, insbesondere auf ein geordnetes Arrangement individueller Proteine, das die Parallelanalyse der Proteine gestattet. Das bevorzugte Organisationsprinzip besteht in einer Aufteilung unter Verwendung entweder von Röhrchen, Höhlungen oder eigenständigen kleinen Flächen oder Punkten auf ebenen Oberflächen [Walter et al. (2000) Curr. Op. Microbiol. 3: 298–302]. Die Erfindung gestattet die Sekretion eines interessierenden Proteins von einer Wirtszelle, die in einem Bestandteil eines Kompartimentsystems wächst, in einen anderen Bestandteil des gleichen Kompartimentsystems. Dabei exprimieren die Wirtszellen ein Sekretionssystem, das ihnen die Sekretion heterologer interessierender Proteine ermöglicht. Das Kompartimentsystem weist wenigstens ein erstes und ein zweites Kompartiment auf, wobei die unterschiedlichen Wirtszellen in dem ersten Kompartiment in einer Array-Form angeordnet sind und wobei das erste und das zweite Kompartiment voneinander durch eine Schranke getrennt sind, wobei die Schranke für die sezernierten interessierenden Proteine, jedoch nicht für die Wirtszelle und deren andere Bestandteile durchlässig ist, und wobei die sezernierten interessierenden Proteine im zweiten Kompartiment in Form eines Arrays aufgenommen werden.
  • Noch ein weiterer Erfindungsgegenstand besteht in einem Protein-Array, das durch ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung erhältlich ist. Ein solches Array enthält lediglich durch die Wirtszellkonstrukte sezernierte Proteine.
  • Interessierendes Protein bezieht sich im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung auf ein beliebiges Protein eines interessierenden Organismus, der viraler, prokaryontischer oder eukaryontischer Natur sein kann, wobei sich das Protein durch ein geeignetes Sekretionssystem sezernieren läßt.
  • Sekretion des interessierenden Proteins von einer Wirtszelle bezieht sich im Zusammenhang mit der Erfindung auf den Transport des interessierenden Proteins von der produzierenden Wirtszelle in den extrazellulären Raum.
  • Sezerniertes Protein bezieht sich im Zusammenhang mit der Erfindung auf ein beliebiges interessierendes Protein, das sich durch ein geeignetes Sekretionssystem sezernieren läßt, insbesondere auf ein als Fusionsprotein mit der C-terminalen Signalsequenz des α-Hämolysinproteins HlyA aus E. coli oder mit der α-Faktor-Signalsequenz aus Saccharomyces cerevisiae sezerniertes interessierendes Protein.
  • Wirtszelle bezieht sich auf eine beliebige Zelle, die in der Lage ist, heterologe interessierende Proteine zu sezernieren, insbesondere auf apathogene gramnegative Bakterien, vorzugsweise auf apathogene E. coli, insbesondere E. coli K-12, oder Pichia pastoris-Hefezellen.
  • Sekretionssystem bezieht sich im Zusammenhang mit der Erfindung auf ein beliebiges prokaryontisches oder eukaryontisches Sekretionssystem, das die Sekretion heterologer interessierender Proteine gestattet, insbesondere auf entweder ein Sekretionssystem aus gramnegativen Bakterien [Sandkvist and Bagdasarian (1996) Curr. Op. Biotechnol. 7: 505–511], vorzugsweise auf das Typ-I-Sekretionssystem gramnegativer Bakterien, vorzugsweise auf das α-Hämolysin-Sekretionssystem aus E. coli, wie es in den folgenden Veröffentlichungen beschrieben ist [Dietrich et al. (1998) Nature Biotechnol. 16: 181–185; Gentschev et al. (1994) Behring Inst. Mitt. 95: 57–66; Gentschev et al. (1996) Mol. Gen. Genet. 252: 266–274; Gentschev et al. (1996) Gene. 179: 133–140; Gentschev et al. (1997) Behring Inst. Mitt. 98: 103–113; Gentschev et al. (1998) Infect. Immun. 66: 2060–2064; Mollenkopf et al. (1996) Bio Techniques. 21: 854–860; Spreng and Gentschev (1998) FEMS Microbiol. Lett. 165: 187–192; Spreng et al. (1999) Mol. Microbiol. 31: 1589–1601], insbesondere auf eine modifizierte Version des α-Hämolysin-Sekretionssystems aus E. coli, oder auf ein Sekretionssystem aus grampositiven Bakterien [Braun et al. (1999) Curr. Op. Biotechnol. 10: 376–381; Ferrari et al. (1993) in A. L. Sonenshein et al. (Hrg.) Bacillus spp. and other Gram-positive bacteria. Am. Soc. Microbiol, Washington, D. C. S. 917–937; Freudl (1992) J. Biotechnol. 23: 231–240; Pozidis et al. (2001) Biotechnol. Bioeng. 72: 611–619; Van Wely et al. (2001) FEMS Microbiol. Rev. 25: 437–454], vorzugsweise Bacillus spp., Staphylococcus spp., Streptomyces spp., oder auf Hefe-Sekretionssysteme, vorzugsweise solchen, die vom α-Faktor aus Saccharomyces cerevisiae oder der Signalsequenz der sauren Phosphatase (PHO1) aus Pichia pastoris vermitteltet werden [Cereghino und Cregg (2000) FEMS Microbiol. Rev. 24: 45–66; diese Hefe-Sekretionssysteme sind auch kommerziell von Invitrogen Corporation erhältlich].
  • Vorzugsweise bezieht sich Sekretionssystem im Zusammenhang mit der Erfindung auf ein beliebiges prokaryontisches oder eukaryontisches Sekretionssystem, das die Sekretion heterologer interessierender Proteine gestattet, insbesondere auf das α-Hämolysin-Sekretionssystem, vorzugsweise auf das α-Hämolysin-Sekretionssystem aus E. coli, insbesondere auf eine modifizierte Version des α-Hämolysin-Sekretionssystems E. coli [Dietrich et al. (1998) Nature Biotechnol. 16: 181–185; Gentschev et al. (1994) Behring Inst. Mitt. 95: 57–66; Gentschev et al. (1996) Mol. Gen. Genet. 252: 266–274; Gentschev et al. (1996) Gene. 179: 133–140; Gentschev et al. (1997) Behring Inst. Mitt. 98: 103–113; Gentschev et al. (1998) Infect. Immun. 66: 2060–2064; Mollenkopf et al. (1996) Bio Techniques. 21: 854–860; Spreng und Gentschev (1998) FEMS Microbiol. Lett. 165: 187–192; Spreng et al. (1999) Mol. Microbiol. 31: 1589–1601; Koronakis V. et al. (1991) Embo Journal 11: 3263], oder auf eine modifizierte Version des von Invitrogen kommerziell erhältlichen Sekretionssystems aus Pichia pastoris.
  • Sekretion eines heterologen Proteins bezieht sich im Zusammenhang mit der Erfindung auf die Sekretion eines Proteins durch eine Wirtszelle, wobei das Protein nicht unbedingt Teil des natürlichen Proteoms der Wirtszelle sein braucht, sondern aufgrund der Tatsache, daß das entsprechende Gen in das Wirtszellgenom eingeführt wurde, von der Wirtszelle synthetisiert wird. Sekretion des jeweiligen heterologen Proteins durch die Wirtszelle bezieht sich im Zusammenhang mit der Erfindung auf dessen Transport von der Wirtszelle in den extrazellulären Raum mittels einer Sekretionsmaschinerie, insbesondere als Fusion zwischen dem heterologen interessierenden Protein und der C-terminalen HlyA-Signalsequenz durch das α-Hämolysin-Sekretionssystem oder den α-Faktor aus Saccharomyces cerevisiae oder die Signalsequenz der sauren Phosphatase (PHO1) aus Pichia pastoris.
  • Ein Sekretionssystem stabil exprimierende und zur heterologen Sekretion des Proteins fähige Wirtszelle bezieht sich im Zusammenhang mit der Erfindung auf eine Wirtszelle, die zur Expression eines Sekretionssystems fähig ist, die die Sekretion eines Proteins induzieren kann, dessen entsprechendes Gen in ihr Genom eingeführt wurde. Insbesondere bezieht sich zur heterologen Sekretion des Proteins fähig, auf die Fähigkeit zur Sekretion eines heterologen Proteins. Die stabile Expression des Sekretionssystems läßt sich dadurch erreichen, daß man die chromosomale Codierung des Sekretionssystems gewährleistet, wobei dies entweder natürlicherweise oder aufgrund gentechnischer Manipulation der Fall sein kann. Ebenso ist bevorzugt, daß für eine stabile Expression des Sekretionssystems Bestandteile des Sekretionssystems auf einem mobilen Vektor, beispielsweise einem Plasmid, der bzw. das auch die zu sezernierenden heterologen interessierenden Proteine codiert, kloniert werden. Ebenso ist bevorzugt, daß zur stabilen Expression des Sekretionssystems das Sekretionssystem sowie das heterologe interessierende Protein auf getrennten, kompatiblen mobilen Vektoren, beispielsweise Plasmiden, kloniert werden.
  • Im folgenden wird ein auf dem α-Hämolysin-Sekretionssystem aus E. coli beruhendes prokaryontisches Sekretionssystem sowie ein auf einem Sekretionssystem aus Pichia pastoris beruhendes eukaryontisches Sekretionssystem beschrieben:
  • Prokaryontisches Sekretionssystem
  • Prokaryontisches Sekretionssystem bezieht sich auf die Verwendung einer prokaryontischen Zelle als Wirtszelle zur Sekretion eines heterologen interessierenden Proteins, insbesondere auf entweder apathogene gramnegative Bakterien, vorzugsweise auf apathogene E. coli, insbesondere E. coli-K-12- oder -B-Stämme, oder apathogene grampositive Bakterien, vorzugsweise Bacillus spp., Staphylococcus spp., Streptomyces spp.
  • Im Zusammenhang mit der Erfindung bezieht sich Sekretion des jeweiligen heterologen Proteins durch eine prokaryontische Wirtszelle auf dessen Transport von der prokaryontischen Wirtszelle in den extrazellulären Raum mittels einer Sekretionsmaschinerie.
  • Prokaryontisches α-Hämolysin-Sekretionssystem aus E. coli
  • Bei α-Hämolysin handelt es sich um einen Pathogenizitätsfaktor, der häufig von extraintestinalen pathogenen E. coli, vorwiegend von uropathogenen E. coli (UPEC), produziert wird. Dabei handelt es sich um ein membranzerstörendes, porenbildendes extrazelluläres Zytotoxin, das zur Rtx-Familie (Repeats In Toxin) von Proteintoxinen gehört. Das HlyA-Protein lysiert eukaryontische Zellen, einschließlich Erythrozyten, weswegen es mit „Hämolysin" bezeichnet wurde, jedoch auch andere Zellen, wie z.B. Granulozyten und Epithelzellen. Rtx-Zytotoxine werden von verschiedenen gramnegativen Bakterien produziert und sind durch einen C-terminalen calciumbindenden Bereich mit einer variablen Anzahl glycinreicher Wiederholungseinheiten, die aus neun Aminosäuren bestehen, kennzeichnet. Die Calciumbindung der freigesetzten Rtx-Toxine im extrazellulären Raum ist für ihre zytotoxischen Aktivitäten wesentlich. Sie werden über den secunabhängigen Typ-I-Sekretionsweg sowohl durch die innere als auch durch die äußere Membran von gramnegativen Bakterien transportiert. Während die hly-Determinanten in der Mehrzahl der hämolytischen pathogenen E. coli chromosomal codiert sind, sind in etwa 5% davon die hly-Gene auf Plasmiden lokalisiert [Ludwig und Goebel (1991) In: Sourcebook of bacterial protein toxins, Hrsg. Alouf, J. E., Freer, J. H., Academic Press, S. 117–125; Mühldorfer und Hacker (1994) Microb. Pathogen. 16: 171–181].
  • Die Synthese und Sekretion des α-Hämolysins aus E. coli wird von einem Operon codiert, das aus vier Genen, nämlich hlyC, hlyA, hlyB und hlyD besteht [Ludwig und Goebel (1991) In: Sourcebook of bacterial protein toxins, Hrsg. Alouf, J. E., Freer, J. H., Academic Press, S. 117–125]. Während hlyA für das zytolytische HlyA-Strukturprotein codiert, wird das cosynthetisierte HlyC-Protein für die Aktivierung von HlyA im Bakteriencytosol benötigt, indem das nichttoxische Prohämolysin (proHlyA) posttranslational in das toxische α-Hämolysin (HlyA) durch Fettsäureacylierung zweier interner Lysinreste umgewandelt wird [Ludwig und Goebel (1991) In: Sourcebook of bacterial protein toxins, Hrsg. Alouf, J. E., Freer, J. H., Academic Press, S. 117–125; Stanley et al. (1998) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62: 309–333; Stanley et al. (1999) Mol. Microbiol. 34: 887–901; Trent et al. (1998) Biochemistry. 37: 4644–4652; Trent et al. (1999) Biochemistry. 38: 9541–9548]. HlyB und HlyD werden für den Transport von HlyA durch die Bakterienmembranen hindurch benötigt [Ludwig und Goebel (1991) In: Sourcebook of bacterial protein toxins, Hrsg. Alouf, J. E., Freer, J. H., Academic Press, S. 117–125]. Außerdem gehört das Protein TolC der äußeren Membran, das chromosomal codiert und nicht Teil des α-Hämolysin-Operons ist, zum α-Hämolysin-Sekretionsapparat [Ludwig und Goebel (1991) In: Sourcebook of bacterial protein toxins, Hrsg. Alouf, J. E., Freer, J. H., Academic Press, S. 117–125; Schlör et al. (1997) Mol. Gen. Genet. 256: 306–319]. Die Signalsequenz innerhalb der 60 C-terminalen Aminosäuren von HlyA, die ein Helix(α1)-Linker-Helix (α2)-Motiv enthält, reicht für die Erkennung durch den Sekretionsapparat aus [Koronakis et al. (1989) EMBO J. 8: 595– 605; Jarchau et al., (1994) Mol. Gen. Genet. 245: 53–60; Hui et al. (2000) J. Biol. Chem. 275: 2713–2720], wobei letzterer aus den Membranproteinen HlyB, HlyD und TolC besteht. Das C-terminale Peptid kann auch allein sezerniert werden [Jarchau et al., (1994) Mol. Gen. Genet. 245: 53–60; Hui et al. (2000) J. Biol. Chem. 275: 2713–2720]. Kürzlich konnte gezeigt werden, daß nur die α1-amphiphile Helix sowie der Linker, jedoch nicht die zweite Helix für den HlyA-Transport wesentlich sind [Hui et al. (2000) J. Biol. Chem. 275: 2713–2720]. HlyB, eine Transport-ATPase der inneren Membran, die den Transport von HlyA mit Energie versorgt, erkennt die C-terminale HlyA-Signalsequenz mit ihren zytoplasmatischen Domänen, initiiert die Translokation von HlyA und bildet in der inneren Membran einen Transmembrankanal, durch den HlyA translokalisiert wird. Es wurde vorgeschlagen, daß HlyD als Linker zwischen der inneren und der äußeren Bakterienmembran dient. Zwar ist es in der inneren Membran eingefügt, doch ist es größtenteils im Periplasma lokalisiert, wo es vermutlich sowohl mit HlyB der inneren Membran und TolC der äußeren Membran wechselwirkt. Durch die Wechselwirkung mit periplasmatischen HlyB-Schleifen bilden HlyD und HlyB einen Kanal durch das Periplasma. Da HlyD ebenso einen zu TolC homologen Anteil aufweist, wird angenommen, daß es zusammen mit TolC an der Bildung eines Transmembrankanals in der äußeren Membran teilnimmt. Folglich wird HlyD dafür benötigt, HlyA durch die Bakterienmembranen zu ziehen und es in den extrazellulären Raum freizusetzen. Im Falle des plasmidcodierten α-Hämolysins wird dessen Synthese und Sekretion in E. coli durch HlyR, einem über eine große Entfernung wirkenden Aktivator, der von dem in einiger Entfernung stromaufwärts vom hlyC-Gen liegenden hlyR-Gen codiert wird, verstärkt [Vogel et al., (1998) Mol. Gen. Genet. 212: 76–84]. Im Gegensatz dazu wurde in chromosomalen hly-Determinanten kein zu hlyR homologes Aktivatorgen gefunden [Ludwig und Goebel (1991) In: Sourcebook of bacterial protein toxins, Hrsg. Alouf, J. E., Freer, J. H., Academic Press, S. 117–125].
  • Es konnte bereits gezeigt werden, daß der Hämolysin-Sekretionsapparat in vielen verschiedenen gramnegativen Bakterien arbeitet [Spreng et al. (1998) FEMS Microbiol. Lett. 165: 187–192] und daß er für die Sekretion heterologer Proteine unterschiedlichen Ursprungs (z.B. Bakterien, Viren, Protozoa) genutzt werden kann [Dietrich et al. (1998) Nature Biotechnol. 16: 181–185; Gentschev et al. (1994) Behring Inst. Mitt. 95: 57–66; Gentschev et al. (1996) Mol. Gen. Genet. 252: 266–274; Gentschev et al. (1996) Gene. 179: 133–140; Gentschev et al. (1997) Behring Inst. Mitt. 98: 103–113; Gentschev et al. (1998) Infect. Immun. 66: 2060–2064; Mollenkopf et al. (1996) BioTechniques. 21: 854–860; Spreng und Gentschev (1998) FEMS Microbiol. Lett. 165: 187–192; Spreng et al. (1999) Mol. Microbiol. 31: 1589–1601]. Dies wurde dadurch erreicht, daß Genfusionen zwischen heterologen Genen und der C-terminalen Signalsequenz von hlyA erzeugt wurden, die für sekretionskompetente Hybridproteine codieren, welche sezerniert werden können, wenn HyB, HlyD und TolC von den jeweiligen Bakterien synthetisiert werden. Somit konnte gezeigt werden, daß es sich hier um ein nützliches Antigenzuführungssystem zur Präsentation sezernierter Antigene durch gramnegative bakterielle Impfstoffträger handelt. Es wurde jedoch deutlich, daß große Unterschiede bei den Ausbeuten der mit unterschiedlichen Proteinen erhaltenen Sekretion heterologer Proteine bestehen. Somit hängt die Wirksamkeit der Sekretion heterologer Proteine über das Hämolysin-Sekretionssystem von der Beschaffenheit des heterologen Proteins ab. So werden beispielsweise Proteine, die eine N-terminale Signalsequenz aufweisen und üblicherweise über den sec-abhängigen Sekretionsweg sezerniert werden, nur ineffizient von dem Hämolysin- Sekretionssystem transportiert [Gentschev et al. (1997) Behring Inst. Mitt. 98: 103–113]. Dieses Problem läßt sich jedoch dadurch umgehen, daß man gegebenenfalls eine ein secA-Mutation enthaltene Wirtszelle verwendet [Gentschev et al. (1997) Behring Inst. Mitt. 98: 103–113], wobei es sich hier um einen bevorzugten Aspekt im Zusammenhang mit der Erfindung handelt. Zudem konnte demonstriert werden, daß die Wirksamkeit der heterologen Proteinsekretion über das Hämolysin-Sekretionssystem mit der Größe des heterologen Gens vor dem HlyAs-Signal korreliert [Spreng und Gentschev (1998) FEMS Microbiol. Lett. 165: 187–192]. Dieses Problem wird, wie unten ausführlicher beschrieben, erfindungsgemäß auch dahingehend angegangen, daß man die interessierenden Proteine gegebenenfalls über ein Affinitätstag auf einem Träger mit einem geeigneten Bindungspartner bindet, bis eine Sättigung erreicht wird.
  • Eukaryontisches Sekretionssystem
  • Eukaryontisches Sekretionssystem bezieht sich auf die Verwendung einer eukaryontischen Zelle als Wirtszelle zur Sekretion eines heterologen interessierenden Proteins, insbesondere auf apathogene Hefen, beispielsweise Saccharomyces cerevisiae oder Pichia pastoris. Sekretion des jeweiligen heterologen Proteins durch eine eukaryontische Wirtszelle bezieht sich im Zusammenhang mit der Erfindung auf dessen Transport von der eukaryontischen Wirtszelle in den extrazellulären Raum mittels einer Sekretionsmaschinerie.
  • Die Hefe Pichia pastoris läßt sich relativ einfach genetisch manipulieren. Da es sich hier um einen eukaryontischen Organismus handelt, kann sie viele posttranslationale Modifikationen, die auch in höheren Eukaryonten stattfinden, durchführen, wie beispielsweise proteolytische Prozessierung, Proteinfaltung, Disulfidbindung und Glycosylierungen. Somit lassen sich viele eukaryontische Proteine, die bei der Expression in Bakterien als inaktive Moleküle in Einschlußkörperchen gespeichert werden, von den Hefezellen als aktive Moleküle mit allen notwendigen posttranslationalen Modifikationen produzieren. Hefezellen bieten im Vergleich mit höheren eukaryontischen Zellen den Vorteil, daß sie schneller wachsen und daß ihre Fermentation einfacher und billiger sowie ihre Ausbeute an rekombinantem heterologen Protein höher ist [Cereghino und Cregg (1999) Curr. Opinion Biotechnol. 10: 422–427; Dominguez et al. (1998) Int. Microbiol. 1: 131–142].
  • Pichia pastoris ist eine methylothrophe Hefe, das heißt sie kann Methanol verstoffwechseln. Im ersten Schritt im Methanolstoffwechsel ist die Oxidation von Methanol zu Formaldehyd beteiligt. Dieser Vorgang wird von dem Enzym „Alkoholoxidase" (AOX) katalysiert. Um die toxische Wirkung von Wasserstoffperoxid (einem Produkt der Enzymreaktion) auf die Hefezelle zu verhindern, findet die Reaktion in einer spezialisierten Organelle, dem sogenannten Peroxisom, statt. Die Expression des AOX1-Gens ist strikt und wird durch große Mengen an Methanol induziert.
  • Die Expressions- und Sekretionssysteme aus P. pastoris sind kommerziell von Invitrogen erhältlich. Diese Systeme verwenden den AOX-Promotor zur Expression heterologer Gene. Die Kultivierung von P. pastoris-Zellen in einem Fermenter in Gegenwart von Methanol ergibt Ausbeuten an rekombinanten Proteinen von bis zu 30% des löslichen Gesamtproteingehalts der Kultur.
  • P. pastoris kann heterologe Proteine entweder intrazellulär produzieren oder diese Proteine in das extrazelluläre Medium sezernieren. Es wird ein Shuttle-Plasmidvektor, der zur Replikation in E. coli und zur Integration in das P. pastoris-Genom fähig ist, bereitgestellt, der sich zur Expression und Sekretion heterologer Proteine verwenden läßt, da er eine die α-Faktor-Signalsequenz aus Saccharomyces cerevisiae codierende Sequenz enthält, die die effiziente Sekretion heterologer Proteine sicherstellt. Da P. pastoris nur sehr wenige endogene Proteine sezerniert und ihr Wachstumsmedium keine Proteine benötigt, bildet das sezernierte heterologe Protein das Hauptsekretionsprodukt einer P. pastoris-Kultur [Bretthauer und Castellino (1999) Biotechnol. Appl. Biochem. 30: 193–200; Buchholz und Gleeson (1991) Bio/Technology 9: 1067–1072; Cereghino und Cregg (1999) Curr. Opinion Biotechnol. 10: 422–427; Cereghino und Cregg (2000) FEMS Microbiol. Rev. 24: 45–66; Cregg et al. (2000) Mol. Biotechnol. 16: 23–52; Dominguez et al. (1998) Int. Microbiol. 1: 131–142; Gleeson et al. (1998) In: Methods in Mol. Biol. 103: Pichia Protocols: 81–94; Stratton et al. (1998) In: Methods in Mol. Biol. 103: Pichia Protocols: 107–120].
  • Das Sekretionssystem aus P. pastoris läßt sich im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung verwenden. Daher lassen sich in Analogie zum oben beschriebenen Hämolysin-Sekretionssystem aus E. coli von den oben erwähnten Pichia pastoris-Vektoren abgeleitete Plasmide konstruieren, die verschiedene interessierende Gene sowie optionale verschiedene Proteasespaltstellen und Tag-Sequenzen enthalten.
  • Das erfindungsgemäße Kompartimentsystem weist wenigstens ein erstes und eines zweites Kompartiment auf, die durch eine Schranke getrennt sind. Kompartimentsystem bezieht sich vorzugsweise auf ein System, das aus zwei Untergruppen mit örtlicher Aufteilung besteht, von denen die erste die wachsende Wirtszelle entweder in flüssigem Wachstumsmedium oder auf einer ebenen Oberfläche enthält und die zweite von der ersten Untergruppe durch eine Schranke getrennt ist, die den Fluß von durch die Wirtszelle produzierten und sezernierten Proteinen von der ersten in die zweite Untergruppe gestattet, jedoch eine Wanderung der Wirtszellen verhindert.
  • Schranke bezieht sich auf ein Mittel zur Abtrennung zweier Komponenten eines Kompartimentsystems, wobei der Durchfluß bestimmter Objekte von dem ersten in das zweite Kompartiment verhindert wird. Insbesondere bezieht sich Schranke auf ein Mittel zur Abtrennung zweier Kompartimente eines Kompartimentsystems, wobei der Durchfluß von Proteinen gestattet ist, andere Wirtszelltrümmer jedoch zurückgehalten werden, und bezieht sich insbesondere auf eine Membran, vorzugsweise auf ein Filter. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist eine zwei Kompartimente eines Kompartimentsystems trennende Schranke Teil des ersten Kompartiments.
  • Geeignete Kompartimentsysteme sind beispielsweise (i) ein Doppelfiltersystem auf einer Agarplatte zur Bakterienanzucht, wobei die Bakterienkolonien auf dem oberen und sezernierte Proteine auf dem unteren Filter vorhanden sind, wie in 1 gezeigt und im Prinzip für den Nachweis von Shiga-ähnliche Toxine produzierenden E. coli in Stuhlproben beschrieben [Hull et al. (1993) J. Clin. Microbiol. 31: 1167–1172], (ii) ein System, das aus unterschiedlichen, durch Filter getrennten Kompartimenten besteht, wobei ein Kompartiment flüssige Wirtszellkulturen und das andere Kompartiment Lösungen von sezerniertem Protein enthält. Diese beiden Kompartimente sind durch eine Membran getrennt, die die Wanderung von Wirtszellen verhindert, jedoch die Diffusion von Proteinen entlang ihres Konzentrationsgradienten gestattet. Im kleinen Maßstab läßt sich dies beispielsweise in Form eines Systems realisieren, das aus aufeinander gestapelten Mikro vertiefungen besteht, die durch eine Membran getrennt sind, die die Bakterienwanderung verhindert, jedoch die Diffusion von Proteinen entlang ihres Konzentrationsgradienten gestattet, wie in 2 veranschaulicht.
  • Im letzteren Fall können die oberen Vertiefungen Wirtszellkulturen enthalten, die Fusionen zwischen dem interessierenden Protein und einer geeigneten Signalsequenz (z.B. E. coli-HlyAs- oder α-Faktor der Hefe), wie oben beschrieben, sezernieren. Während die Wirtszellen durch das Filter zum Verbleiben in der oberen Vertiefung gezwungen werden, diffundieren die Lösungen mit sezerniertem Protein in die unteren Vertiefungen und lassen sich als Proteinlösungen ernten. Bei der Doppelfiltertechnologie muß das obere Filter einen Porendurchmesser aufweisen, der die Bakterienwanderung vom oberen zum unteren Filter verhindert, jedoch den Fluß der sezernierten Fusionsproteine zum unteren Filter gestattet. Vorzugsweise sollte es eine niedrige Proteinbindungskapazität besitzen. Im Gegensatz dazu muß das untere Filter eine optimale Proteinbindungskapazität aufweisen, und zwar entweder natürlicherweise oder als Folge davon, daß es an gewissen Stellen mit einem Bestandteil (z.B. einzelsträngigen Nukleinsäuren) beschichtet ist, bei der es sich um einen optimalen Bindungspartner für einen Bestandteil (z.B. C-terminale Domäne des A1-Proteins, [Cartegni et al. (1996) J. Mol. Biol. 259: 337–348] der von den auf dem oberen Filter wachsenden Bakterien zu sezernierenden Proteinfusion handelt. Beide Filter müssen den Durchfluß von Nährstoffen und Wachstumsfaktoren von der Agarplatte zur Bakterienanzucht zu den auf dem oberen Filter wachsenden Bakterienkolonien gestatten. Falls bei der Technologie unterschiedliche, durch Filter getrennte Kompartimente verwendet werden, wobei das eine Kompartiment flüssige Bakterienkulturen und das andere Kompartiment Lösungen mit sezerniertem Protein enthält (z.B. aufeinander gestapelte, durch ein Filter getrennte Mikrovertiefungen), muß das Trennfilter einen Porendurchmesser aufweisen, der die Bakterienwanderung verhindert, doch den Fluß der sezernierten Fusionsproteine gestattet.
  • Prokaryontisches System: Konstruktion eines gramnegativen Bakterienstamms für die heterologe Proteinsekretion auf Grundlage des α-Hämolysin-Sekretionssystems aus E. coli
  • Erfindungsgemäß werden die hlyB- und hlyD-Gene in das gramnegative Bakteriengenom, das ein chromosomal codiertes tolC-Gen enthält, eingeführt, um den Bakterien die Expression des vollständigen α-Hämolysin-Sekretionsapparats zu ermöglichen. Erfindungsgemäß werden dabei interessierende Proteine für die Sekretion über das α-Hämolysin-Sekretionssystem kompetent gemacht, indem Genfusionen zwischen den jeweiligen heterologen interessierenden Genen und der C-terminalen Signalsequenz von HlyA (hlyAs) erzeugt werden. Die Genfusionen werden auf geeigneten mobilen Vektoren, wie z.B. Plasmiden oder Cosmiden, kloniert. Anschließend werden sie in einen gramnegativen Bakterienstamm eingeführt, der den gesamten α-Hämolysin-Sekretionsapparat, bestehend aus HlyB, HlyD und TolC, exprimiert. Die stabile Expression des Sekretionssystems läßt sich durch Insertion der hlyB- und hlyD-Gene in das Bakterienchromosom erzielen. Alternativ können die hlyB- und hlyD-Gene auf einen mobilen Vektor, beispielsweise ein Plasmid, kloniert werden, der ebenso die heterologen interessierenden Proteine als Fusion mit der HlyA-Signalsequenz codiert. Als weitere Option lassen sich die hlyB- und hlyD-Gene sowie die Fusion zwischen dem das heterologe interessierende Protein codierenden Gen und hlyAs auf getrennten, kompatiblen Plasmiden klonieren.
  • Die sezernierten Proteine eignen sich zur Produktion von Protein-Arrays, indem sie auf einen Träger, gegebenenfalls über ein Affinitätstag, gebunden werden. Als zusätzliche oder alternative Option kann für den leichten Nachweis des sezernierten interessierenden Proteins eine Epitoptagsequenz enthalten sein. Zudem könnte es gegebenenfalls sinnvoll sein, das HlyA-Sekretionssignal und Tag-Sequenzen durch Proteasebehandlung zu entfernen, um den Verlust der Funktion des interessierenden Proteins zu vermeiden. Daher sollen als Option die entsprechenden Affinitäts- und/oder Epitoptagsequenzen sowie Proteaserestriktionsstellen stromabwärts vom heterologen interessierenden Gen kloniert werden.
  • Erfindungsgemäß besteht die Option, den Hämolysin-Sekretionsapparat in einen gramnegativen Bakterienstamm, der eine secA-Mutation trägt, einzuführen. Dies ist besonders vorteilhaft im Zusammenhang mit der Sekretion von Proteinen, die üblicherweise über den Sec-abhängigen Sekretionsweg sezerniert werden und eine N-terminate Signalsequenz aufweisen und nur ineffizient vom Hämolysin-Sekretionssystem transportiert werden [Gentschev et al. (1997) Behring Inst. Mitt. 98: 103–113].
  • Als Option können die sezernierten Proteine zur Produktion von Protein-Arrays mit punktförmig aufgetragenen einzelnen Proteinen, vorzugsweise mit punktförmig aufgetragenen gleichen Mengen einzelner Proteine verwendet werden, wobei letzteres durch Bindung der interessierenden Proteine auf einen Träger, gegebenenfalls über ein Affinitätstag, das zur Bindung an einen geeigneten Partner, der in gleichen Konzentrationen auf jeden Fleck des Arrays aufgetupft wurde, in der Lage ist, erreicht werden kann. Bei der Doppelfiltertechnologie stellt die gesättigte Bindung des an ein von einer auf dem oberen Filter wachsenden Wirtszelle sezerniertes interessierendes Protein gebundenen Affinitätstags an seinen Bindungspartner auf dem unteren Filter die Bindung gleicher Mengen heterologer Proteine an das untere Filter sicher. Alternativ können, falls ein aus unterschiedlichen, durch Filter getrennten Kompartimenten bestehendes System, wobei ein Kompartiment flüssige Bakterienkulturen und das andere Kompartiment Lösungen mit sezerniertem Protein enthält, verwendet wird, wie beispielsweise in Form einer Technologie mit aufeinander gestapelten Mikrovertiefungen realisierbar, die Konzentrationen der in den unteren Vertiefungen gesammelten sezernierten Proteine quantifiziert werden. Als zusätzliche oder alternative Option kann zum leichten Nachweis des sezernierten interessierenden Proteins eine Epitoptagsequenz enthalten sein. Zudem könnte es gegebenenfalls sinnvoll sein, das HlyA-Sekretionssignal und Tag-Sequenzen durch Proteasebehandlung zu entfernen, um den Verlust der Funktion des interessierenden Proteins zu vermeiden. Daher sollen als Option die entsprechenden Affinitäts- und/oder Epitoptagsequenzen sowie Proteaserestriktionsstellen auf dem das heterologe interessierende Gen codierenden Vektor kloniert werden.
  • a) Konstruktion eines gramnegativen Bakterienstamms mit einem chromosomal codierten Hämolysin-Sekretionsapparat:
  • Ein weiterer Erfindungsgegenstand ist die Konstruktion eines gramnegativen Bakterienstamms, gegebenenfalls eines E. coli-Stamms, der die Hämolysin-Sekretionssystemgene hlyB und hlyD im Bakterienchromosom enthält.
  • Um einen E. coli-Stamm zu erzeugen, der den α-Hämolysin-Sekretionsapparat stabil exprimiert, lassen sich die Gene hlyB und hlyD in das Bakterienchromosom eines E. coli-Stamms, insbesondere in den E. coli-secA- Mutantenstamm KL320, integrieren. Daher kann, wie ausführlicher im experimentellen Teil erläutert wird, das Plasmid pLacHlyBD mit dem folgenden Klonierungsverfahren konstruiert werden: das ⎕-pir-abhängige Suizidplasmid pJRLacZins (Geschenk von Joachim Reidl, Universität Würzburg), das innerhalb eines klonierten lacZ-Gens eine EcoRV-Restriktionsstelle enthält, wird mit dem Restriktionsenzym EcoRV verdaut. Anschließend werden die hlyBD-Gene mittels PCR vom Cosmid pCOS10 amplifiziert und mit dem mit EcoRV-Restriktion behandelten Plasmid pJRLacZins unter der Erzeugung des Plasmids pLacHlyBD ligiert. Das plasmidcodierte lacZ-Gen wird während dieses Klonierungsvorgangs zerstört. Das Plasmid pLacHlyBD gestattet die Integration des hlyBD in das chromosomale lacZ-Gen eines beliebigen E. coli-Stamms oder anderen Bakterienstamms, der ein homologes lacZ-Gen enthält. Das chromosomale lacZ-Gen in E. coli-Stämmen, die kein p-Protein, codiert durch das pir-Gen, besitzen, wird nach der Einführung des Plasmids pLacHlyBD sowie einem Doppel-Crossover-Ereignis zwischen den lacZ-Sequenzen auf dem Plasmid pLacHlyBD und dem chromosomalen lacZ-Gen, infolgedessen die Gene hlyB und hlyD in das chromosomale lacZ-Gen inseriert werden, zerstört.
  • b) Konstruktion eines Plasmids, das eine Genfusion zwischen einem ein interessierendes Protein codierenden Gen und dem die Signalsequenz des HlyA-Proteins codierenden 3'-Ende von hlyA trägt:
  • Noch ein weiterer Erfindungsgegenstand ist ein Plasmid, das eine Genfusion zwischen einem ein interessierendes Protein codierenden Gen und dem die Signalsequenz des HlyA-Proteins codierenden 3'-Ende von hlyA, was den Export des Fusionsproteins gestattet, sowie gegebenenfalls eine Proteasespaltstelle, ein Affinitätstag und/oder Epitoptag trägt.
  • Wie oben erwähnt, können interessierende Proteine für die Sekretion über das α-Hämolysin-Sekretionssystem kompetent gemacht werden, indem Genfusionen zwischen den jeweiligen heterologen Genen, die für die interessierenden Proteine codieren, und der C-terminalen Signalsequenz von hlyA erzeugt werden. Die Genfusionen lassen sich auf geeigneten mobilen Vektoren, einschließlich Plasmiden, klonieren und können anschließend in einen gramnegativen Bakterienstamm eingeführt werden, der den vollständigen α-Hämolysin-Sekretionsapparat stabil exprimiert.
  • Von Spreng und Gentschev (1998) [Spreng und Gentschev (1998) FEMS Microbiol. Lett. 165: 187–192; Spreng et al. (1999) Mol. Microbiol. 31: 1589–1601] konnte gezeigt werden, daß die Wirksamkeit der heterologen Proteinsekretion über das Hämolysin-Sekretionssystem mit der Größe des heterologen Gens vor dem HlyAs-Signal korreliert. Hinsichtlich der vorliegenden Erfindung sollen die das HlyAs-Fusionsprotein sezernierenden Bakterienstämme gegebenenfalls zur Erzeugung von gleichen Mengen an punktförmig aufgetragenen Proteinen enthaltenden Protein-Arrays, als Option zusammen mit der Klonierung des heterologen interessierenden Gens, verwendet werden, wobei die Klonierung eines Affinitätstags (z.B. C-terminale Domäne des hnRNA-Bindungsproteins A1; [Cartegni et al. (1996) J. Mol. 259: 337–348]) vor dem HlyAs-Signal, das zur Bindung an einen geeigneten Partner (z.B. einzelsträngige Nukleinsäuren im Falle von A1), der jeweils in gleichen Konzentrationen auf jeden Fleck des Arrays aufgetupft ist, fähig ist, vorgesehen sein kann. Bei der Doppelfiltertechnologie wird durch die gesättigte Bindung des Affinitätstags an seinen Partner auf dem unteren Filter die gleichzeitige Bindung gleicher Mengen heterologer Proteine sichergestellt. Alternativ können, falls ein aus unterschiedlichen, durch Filter getrennten Kompartimenten bestehendes System, wobei ein Kompartiment flüssige Bakterienkulturen und das andere Kompartiment Lösungen mit sezerniertem Protein enthält, verwendet wird, wie beispielsweise in Form einer Technologie mit aufeinander gestapelten Mikrovertiefungen realisierbar, die Konzentrationen der in den unteren Vertiefungen gesammelten sezernierten Proteine quantifiziert werden. Zudem kann als weitere Option die Klonierung eines Epitoptags (z.B. His-Tag) vorgesehen sein, wodurch der Nachweis des erhaltenen Fusionsproteins erleichtert wird. Als weitere Option sollten geeignete Proteasespaltstellen eingeführt werden, die das Entfernen des Sekretionssignals und von Tag-Sequenzen, die die Funktion des interessierenden Proteins beeinflussen könnten, gestattet.
  • c) Konstruktion eines gramnegativen Bakterienstamms, der zur Sekretion eines heterologen interessierenden Proteins fähig ist:
  • Noch ein weiterer Erfindungsgegenstand ist die Konstruktion eines gramnegativen Bakterienstamms, gegebenenfalls eines E. coli-Stamms, der die Hämolysin-Sekretionssystemgene hlyB und hlyD innerhalb des chromosomalen lacZ-Gens, das mit einem Plasmid, das eine Genfusion zwischen einem ein interessierendes Protein codierenden Gen und dem das HlyA-Protein, welches den Export des Fusionsproteins gestattet, codierenden 3'-Ende von hlyA sowie gegebenenfalls eine Proteasespaltstelle, ein Affinitätstag und/oder Epitoptag trägt, transformiert ist, enthält.
  • Nach der Konstruktion des Vektors, der eine Fusion zwischen dem interessierenden Protein und der C-terminalen HlyAs-Sequenz ebenso wie gegebenenfalls auch ein Affinitätstag und/oder Epitoptag und eine Proteasespaltstelle enthält, führt die Transformation des oben beschriebenen, den α-Hämolysin-Sekretionsapparat enthaltenden Wirtsstamms zum endgültigen Bakterienkonstrukt.
  • Eukaryontisches System: Konstruktion von Pichia pastoris-Stämmen zur heterologen Proteinsekretion
  • Das oben beschriebene Sekretionssystem aus P. pastoris läßt sich im Zusammenhang mit der folgenden Erfindung verwenden. Analog zum oben beschriebenen Hämolysin-Sekretionssystem aus E. coli lassen sich von den oben erwähnten Pichia pastoris-Vektoren Plasmide konstruieren, die verschiedene interessierende Gene sowie optionale verschiedene Proteasespaltstellen und Tag-Sequenzen enthalten.
  • Zur Herstellung von Proteom-Arrays, die jedes Protein eines bestimmten Organismus enthalten sollen, soll jedes Protein dieses Organismus sezerniert werden. Daher muß für jedes zu sezernierende Protein, das jeweils entsprechende Gen entweder mit der C-terminalen Signalsequenz von hlyA oder dem α-Faktor-Signal fusioniert und auf einen separaten Vektor (z.B. Plasmid) kloniert werden, der entweder in den den α-Hämolysin-Sekretionsapparat exprimierenden Bakterienstamm oder in einen Pichia pastoris-Stamm zu transformieren ist. D.h. die Gesamtmenge der offenen Leseraster eines bestimmten Organismus, dessen Proteom untersucht werden soll, spiegelt die Menge der zur vollständigen Abdeckung eines Proteoms eines bestimmten Organismus benötigten Bakterienkonstrukte wider.
  • Nutzen
  • Folglich gestattet diese Technologie insbesondere die Produktion von Arrays, die ein Teil- oder ein vollständiges Proteom eines Organismus enthalten, beispielsweise als Array aus einzelnen Flecken, die jeweils mit einem einzelnen Protein, beispielsweise in nichtdenaturierter Form, gesättigt sein können, oder als Alternative die Produktion von Lösungen, die aus spezifischen sezernierten, gefilterten Proteinen bestehen. Derartige Proteine, insbesondere derartige Arrays, lassen sich – direkt ohne weitere Reinigung der Proteine – zur Identifizierung von Proteinbindungspartnern unterschiedlicher chemischer Beschaffenheit, einschließlich anderer Proteine, Nukleinsäuren, Lipide, Kohlenhydrate oder anderer Liganden, verwenden. Im Falle der Produktion arraygebundener Proteine können Untersuchungen mit löslichen Bindungspartnern direkt auf dem jeweiligen Array (z.B. Filter) durchgeführt werden. Im Falle der Produktion von Proteinlösungen können Bindungsstudien entweder mit arraygebundenen Bindungspartnern oder mit löslichen Bindungspartnern durchgeführt werden. Somit ist ein solches Array auf alle denkbaren Bindungsuntersuchungen, einschließlich Antikörperbindungsuntersuchungen und Untersuchungen der Bindung pharmazeutischer Verbindungen mit Arraygebundenen Zielproteinen, anwendbar. Darüber hinaus läßt sich die Wirkung pharmazeutischer Verbindungen auf das Bindungsverhalten anderer Moleküle untersuchen. Zudem können im Falle der Produktion von Proteinlösungen die jeweiligen Proteine für zahlreiche Untersuchungen verwendet werden. So lassen sie sich beispielsweise auf ihre strukturelle Beschaffenheit und biochemische Funktion, beispielsweise in enzymatischen Testsystemen, analysieren oder können als Antigene zur Erzeugung spezifischer Antikörper verwendet werden.
  • Da sich das Array zum Testen pharmazeutischer Kandidatenwirkstoffe auf ihre Proteinbindungskapazitäten sowie ihre Wirkung auf die Bindungs- und enzymatischen Kapazitäten anderer Moleküle eignet, ist die vorliegende Erfindung wertvoll bei der Aufklärung von Wirkmechanismen der jeweiligen pharmazeutischen Verbindungen.
  • Zur Herstellung von Proteom-Arrays, die jedes Protein eines bestimmten Organismus enthalten sollen, soll jedes Protein dieses Organismus sezerniert werden. Daher muß für jedes zu sezernierende Protein jedes der entsprechenden Gene jeweils entweder mit einer geeigneten Signalsequenz, wie oben beschrieben (z.B. E. coli-HlyAs oder Hefe-α-Faktor), fusioniert und auf einen separaten mobilen Vektor (z.B. Plasmid) kloniert werden, der in die das entsprechende Sekretionssystem tragende Wirtszelle zu transformieren ist. D.h. die Gesamtmenge der offenen Leseraster eines bestimmten Organismus, dessen Proteom untersucht werden soll, spiegelt die Menge der zur vollständigen Abdeckung eines Proteoms eines bestimmten Organismus benötigten Bakterienkonstrukte wider. Es ist denkbar, zwei Arten solcher Vektoren für jedes zu untersuchende Proteom zu erzeugen: (i) Vektoren, die ein Affinitätstag zum Zurückhalten des Fusionsproteins auf einem Protein-Array codieren, und (ii) Vektoren, die ein Epitoptag für den erleichterten Nachweis der Fusionsproteine codieren. Somit könnten Untersuchungen zur Wechselwirkung von von einem bestimmten Organismus produzierten Proteinen in der Gestalt durchgeführt werden, daß alle Proteine, die auf einem „Affinitätstag-Vektor" codiert sind, über das Affinitätstag auf einem Array gebunden werden, dieses Array mit einer ein Protein, das auf einem „Epitoptag-Vektor" codiert ist, enthaltenen Lösung überschichtet und die Wechselwirkung zwischen den Array-gebundenen und löslichen Proteinen über das Epitoptag nachgewiesen wird.
  • Experimenteller Teil
  • Material – Medien, Chemikalien, Enzyme und Oligonukleotide
  • Bakterien wurden entweder in flüssigem Luria-Bertani(LB-) Medium oder in M9-Minimalmedium, wobei das letztere mit 1% Casaminosäuren supplementiert war, oder auf LB-Agarplatten oder Agarplatten mit M9 + 1% Casaminosäuren oder entweder auf Columbia-Agarplatten mit Schafsblut oder auf Enterohämolysin-Agarplatten mit Blut, wobei die beiden letzteren von der Firma Oxiod (Wesel, Deutschland) geliefert wurden, angezogen. Rekombinante Plasmide tragende Stämme wurden unter selektiven Antibiotikadruck kultiviert. Die Antibiotikakonzentrationen hingen von der Kopienzahl der jeweiligen Plasmide ab (10 bis 100 μg/ml). In einigen Experimenten wurden dem bakteriellen Wachstumsmedium Saccharose in einer Konzentration von 5% und/oder 10 ml/l 2% X-Gal (5-Brom-4-chlor-indolyl-β-galactosid in Dimethylformamid)-Lösung zugesetzt. Chemikalien wurden, falls nicht anderes angegeben, von Merck (Ismaning, Deutschland), Quiagen (Hilden, Deutschland), Promega (Mannheim, Deutschland) oder Sigma (Deisenhofen, Deutschland) bezogen. Restriktionsenzyme wurden von Amersham-Pharmacia (Freiburg, Deutschland) bezogen. Taq-DNA-Polymerase und weitere für die Polymerasekettenreaktionen (PCR) verwendete Chemikalien wurden von Gibco BRL (Karlsruhe, Deutschland), Boehringer (Ingelheim, Deutschland) oder Eurogentec (Köln, Deutschland) erhalten. Die als Primer für die PCR verwendeten Oligonukleotide werden von Interactiva (Ulm, Deutschland) bezogen.
  • Bakterienstämme, Pichia pastoris-Stämme, Plasmide, Cosmide, Oligonukleotide und Antikörper
  • Die Pichia pastoris-Stämme sind kommerziell von Invitrogen erhältlich. Die als Primer für die PCR verwendeten Oligonukleotide sind in Tabelle 1 aufgeführt und wurden von Interactiva (Ulm, Germany) bezogen. Antikörper wurden von unterschiedlichen Zellen erworben und sind im Ergebnisteil aufgeführt.
  • Filtermaterial und Filtervorrichtungen
  • Die in den Vorversuchen der vorliegenden Erfindung verwendeten Membranfilter wurden von Millipore (Eschborn, Deutschland) oder Sartorius (Göttingen, Deutschland) geliefert. Sie bestanden entweder aus Nitrocellulose, Cellulosemischestern oder Polyvinylidendifluorid. Die für ein bestimmtes Experiment verwendeten Filter sind im Ergebnisteil genannt.
  • Das von Millipore (Eschborn, Deutschland) bereitgestellte „MultiScreen Assay System" wurde für das Nachweisprinzip der „Technologie mit aufeinander gestapelten Mikrovertiefungen" verwendet.
  • Methoden
  • Bestimmung der Hämolysinproduktion verschiedener E. coli-Stämme
  • Die hämolytische Aktivität von E. coli-Stämmen wurde mittels Kultivierung derartiger Stämme auf von Oxoid gelieferten Blutagarplatten getestet. Hämolytische E. coli-Stämme verursachten eine klare hämolytische Zone um die Bakterienkolonien herum (Mühldorfe et al., 1996).
  • Der uropathogene E. coli-Stamm 536, seine isogene Mutante 536-21, der die Pathogenizitätsinseln (Pais) I und II, die jeweils ein Hämolysinoperon tragen, fehlt [Berger et al. (1982) J. Bacteriol. 152: 1241–1247; Blum et al. (1994) Infect. Immun. 62: 606–614; Hacker et al. (1983) J. Bacteriol. 154: 1145–1154], die hlynegative Mutante 536-39-192 [hinterlegt bei Jörg Hacker an der Universität Würzburg, Deutschland, und bei Inge Mühldorfer, Abteilung für Molekularbiologie, Byk Gulden, Konstanz, Deutschland] sowie 15 weitere E. coli-Stämme. (K-12-wt [hinterlegt bei der American Typ Culture collection (ATCC) Nr. 29425], JM109 [hinterlegt bei ATCC Nr. 53323], DH1 [hinterlegt bei ATCC Nr. 33849], LE392 [hinterlegt bei ATCC Nr. 33572], W678 [hinterlegt bei der Deutschen Stammsammlung (DSM) Nr. 6968], 35 [Smith und Linggood (1971) J. Med. Microbiol. 4: 467–485], J53 [Taylor (1983) Microbiol. Rev. 47: 46–83], EN99 [Blum. (1994) Dissertation, Universität Würzburg, Deutschland], WK6 [hinterlegt bei ATCC Nr. 47078], HB101 [hinterlegt bei ATCC Nr. 33694], 5K [hinterlegt beim E. coli-Genetic Stock Center (CGSC) Nr. 5581], CC118 [Manoil und Beckwith (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 8129–8133], C600 [hinterlegt bei ATCC Nr. 23724], MC1029 [Casadaban und Cohen (1980) J. Mol. Biol. 138: 179–207], DH5α [hinterlegt bei CGSC Nr. 7855], allesamt von Jörg Hacker, Universität Würzburg, Deutschland, zur Verfügung gestellt), wurden hinsichtlich ihrer hämolytischen Aktivitäten auf Schafsplattenagarplatten nach Wachstum über Nacht verglichen. Wie in 3 gezeigt, ruft lediglich der Wildtyp UPEC-Stamm 536 eine Erythrozytenhämolyse hervor. In einem weiteren Experiment wurden die E. coli-Stämme 536, 536-21, J53 (pUCHlyCA) und J53 (pUC18) nach Wachstum über Nacht auf Schafsblutagarplatten hinsichtlich ihrer hämolytischen Aktivitäten verglichen. Dabei riefen lediglich E. coli 536 und J53 (pUCHlyCA) eine Erythrozytenhämolyse hervor.
  • DNA-Klonierungstechniken
  • DNA-Isolierung, DNA-Spaltung mit Restriktionsenzymen, Agarosegelelektrophorese, Elution von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen, Transformation von E. coli-Stämmen mit Plasmid-DNA, Erzeugung von DNA-Sonden, Kolonie- und Southern-Hybridisierung sowie PCR werden wie in „Molecular Cloning, A Laboratory Manual" [Sambrook und Russel, Hrsg. (2001) 3. Aufl. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York] und/oder gemäß den von den oben erwähnten Lieferfirmen der entsprechenden Kits, Chemikalien und Enzyme zur Verfügung gestellten Handbüchern durchgeführt.
  • DNA-Sequenzierung
  • Die Sequenzierung von DNA, die gemäß den Quiagen-Protokoll isoliert worden war, wurde von GATC (Konstanz, Deutschland) oder TopLab (München, Deutschland) durchgeführt.
  • Das Cosmid pCOS10 [Knapp et al. (1986) J. Bacteriol. 168: 22–30], freundlicherweise von G. Blum-Oehler, Universität Würzburg, zur Verfügung gestellt, enthält Pai I des uropathogenen E. coli-Stamms (UPEC) 536 [Berger et al. (1982) J. Bacteriol. 152: 1241–1247; Blum et al. (1994) Infect. Immun. 62: 606–614; Hacker et al. (1983) J. Bacteriol. 154: 1145–1154]. Nach seiner Isolierung aus dem E. coli-Stamm HB101 (pCOS10), wurde die Sequenzierung des auf pCOS10 codierten Hämolysinoperons von GATC (Konstanz, Deutschland) durchgeführt.
  • PAGE und Western-Blot-Analyse
  • Der Proteinnachweis wird mittels Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE) und anschließender Western-Blot-Analyse unter Verwendung spezifischer primärer Antikörper und des Alkalische-Phosphatase-Systems Promega Proto Blot geführt [Sambrook und Russel, Hrsg. (2001) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3. Aufl. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York; Promega-Handbuch].
  • Konstruktion eines E. coli-Stamms mit einem chromosomal codierten Hämolysin-Sekretionsapparat
  • Zur Erzeugung eines E. coli-Stamms, der den α-Hämolysin-Sekretionsapparat stabil exprimiert, wurde ein die Gene hlyB und hlyD codierendes 3,6 kb DNA-Fragment in das Bakterienchromosom verschiedener apathogener E. coli-Stämme, einschließlich K12-Wildtyp, E. coli BL21 und J53, integriert.
  • Es wurde das folgende Klonierungsverfahren durchgeführt: das Plasmid pJRLacZins (ein großzügiges Geschenk von Joachim Reidl, Universität Würzburg) wurde als Vektorplasmid verwendet. Dabei handelt es sich um ein auf dem Plasmid pCVD442 beruhendes λ-pir-abhängiges Suizidplasmid, das aufgrund des Vorhandenseins des bla-Gens Ampicillinresistenz sowie aufgrund des Vorhandenseins des sacB-Gens Sensitivität gegenüber Wachstum in Gegenwart von 5% Saccharose bei einer Wachstumstemperatur von 30°C verleiht. Folglich können das Plasmid pCVD442 und seine Derivate nur in das Pir-Protein enthaltenden Bakterien, wie z.B. in E. coli-K-12-Stämmen Sy327 und Sm10λpir, replizieren. Das Plasmid pJRLacZins, das eine EcoRV-Restriktionsstelle in einem klonierten lacZ-Gen enthält, wurde mit dem Restriktionsenzym EcoRV verdaut. Anschließend wurden die hlyBD-Gene mittels PCR von dem Cosmid pCOS10 unter Verwendung der Primer StuHlyB1 und HlyD2Stu amplifiziert und nach Restriktion des PCR-Produkts mit StuI mit dem mit einer EcoRV-Restriktion behandelten Plasmid pJRLacZins unter Erzeugung des Plasmids pLacHlyBD ligiert. Das plasmidcodierte lacZ-Gen wurde während dieses Klonierungsverfahrens zerstört.
  • Das Plasmid pLacHlyBD gestattet die Integration der hlyBD-Gene in das chromosomale lacZ-Gen eines beliebigen E. coli-Stamms oder anderen Bakterienstamms, der ein homologes lacZ-Gen trägt, wie anhand der E. coli-Stämme K-12-Wildtyp BL21 und J53 beispielhaft dargestellt wurde. Das chromosomale lacZ-Gen in E. coli-Stämmen, die kein p-Protein, codiert durch das pir-Gen, besitzen, wird nach der Einführung des Plasmids pLacHlyBD sowie einem Doppel-Crossover-Ereignis zwischen den lacZ-Sequenzen auf dem Plasmid pLacHlyBD und dem chromosomalen lacZ-Gen, infolge dessen die Gene hlyB und hlyD in das chromosomale lacZ-Gen inseriert werden, zerstört. Ein phänotypisches Screening nach LacZ-negativen Mutanten wurde durchgeführt, indem die erhaltenen Stämme auf Wachstum als weiße Kolonien auf mit 5% Saccharose und X-Gal supplementiertes Luria-Bertani-Medium enthaltenden Agarplatten bei 30°C sowie den Verlust der Ampicillinresistenz getestet wurden. Genotypisch wurden die Mutanten mittels PCR-Analyse unter der Verwendung der Primer lacZEV-up und lacZEV-down getestet. Die aus den Mutanten erhaltenen PCR-Produkte unterschieden sich von denen der lac-Z-positiven Wildtyp-Stämme hinsichtlich ihrer Größe, was auf die Integration der hlyB-, hlyD-Sequenzen zurückzuführen war. Zudem läßt sich die chromosomale DNA der putativen Mutanten einer Restriktion mit einem Restriktionsenzym, das nicht innerhalb der lacZ- und integrierten hlyBD-Sequenzen schneidet, und danach einer Southern-Blot-Analyse unter Verwendung einer lacZ-Sonde unterziehen. Die Mutanten unterscheiden sich von den lacZ-positiven Wildtyp-Stämmen durch eine DNA-Bandenverschiebung, die von der Integration der hlyBD-Sequenzen herrührt.
  • Konstruktion eines eine Fusion zwischen Genen, die für ein Protein X-HlyAs-Fusionsprotein codieren, enthaltenden Plasmids
  • Um das in der vorliegenden Erfindung beanspruchte Verfahren zur Herstellung von Proteinen experimentell zu bestätigen, wurde das Plasmid pUCHlyCA konstruiert, das die Gene hlyC und hlyA enthielt, die mittels PCR unter Verwendung der Primer StuHlyC4 und HlyA3Stu und des Cosmids pCOS10 als Matrize amplifiziert und nach Restriktion des PCR-Produkts mit StuI mit dem mit SmaI verdauten Plasmidvektor pUC18 ligiert wurden.
  • Zudem wurde das Plasmid pTOPOMycHisHlyAs konstruiert. Die für Thrombin, das Myc-Epitop und das His-Tag codierenden Gene wurden mittels PCR unter Verwendung des Invitrogen-Plasmidvektors pBAD/Myc-HisA als Matrize und des Primers ThromMycBAD, der die 18 Bp große Thrombingensequenz enthält, als Vorwärtsprimer sowie des Primers HispBAD als Rückwärtsprimer amplifiziert. Die Klonierung des erhaltenen 89 Bp großen PCR-Produkts in das lacZ-Gen des Invitrogen-Vektors pCR2.1.-TOPO führte zum Plasmid pTOPO-Thr-Myc-His. Anschließend wurde hlyAs-spezifische Sequenzen von pCOS10 unter Verwendung entweder der Primerpaare XbaHlyAs-up and XbaHlyAs-down oder XbaHlyAs-up und XbaHlyAs-Linker, wodurch hlyAs-spezifische PCR-Produkte mit entweder 183 oder 99 hlyAs-spezifischen Bp und zusätzlichen XbaI-Stellen führte, die dann in die XbaI-Stelle des oben beschriebenen Plasmids pTOPO-Thr-Myc-His kloniert wurden. Die fertigen Plasmidkonstrukte wurden mit pTOPOMycHisHlyAsA bzw. -B bezeichnet und enthielten die 183 bzw. 99 hlyAs-spezifischen Bp.
  • Konstruktion eines gramnegativen Bakterienstamms, der zur Sekretion eins heterologen interessierenden Proteins fähig ist
  • Um das Verfahren zur Herstellung erfindungsgemäßer Proteine experimentell zu bestätigen, wurde das Plasmid pUCHlyCA in die oben beschriebenen hlyBD+ -E. coli-Konstrukte durch Transformation eingeführt. Die erhaltenen E. coli-Stämme enthalten ein chromosomal codiertes Hämolysin-Sekretionssystem sowie ein plasmidcodiertes Zytotoxin, das α-Hämolysin HlyA, und den Toxinaktivator HlyC. Die Sekretion des HlyA-Zytotoxins konnte anhand der hämolytischen Aktivität des (mit 0,45-μm-Filtern) sterilfiltrierten Kulturüberstands auf Schafsblutagarplatten beobachtet werden.
  • Konstruktion von auf α-Hämolysin beruhenden E. coli-Sekretionssystemen
  • Wie oben beschrieben wurden die Gene hlyB und hlyD in das gramnegative Bakteriengenom, das ein chromosomal codiertes tolC-Gen enthielt, eingeführt, um den Bakterien die Expression des vollständigen α-Hämolysin-Sekretionsapparats zu ermöglichen. Dabei wurden interessierende Proteine für die Sekretion über das α-Hämolysin-Sekretionssystem kompetent gemacht, in dem Genfusionen zwischen den jeweiligen heterologen interessierenden Genen und der C-terminalen Signalsequenz von HlyA (hlyAs) erzeugt wurden. Die Genfusionen wurden auf geeigneten mobilen Vektoren, wie z.B. Plasmiden oder Cosmiden, kloniert. Anschließend wurden sie in einen gramnegativen Bakterienstamm eingeführt, der den gesamten α-Hämolysin-Sekretionsapparat, bestehend aus HlyB, HlyD und TolC, exprimiert. Die stabile Expression des Sekretionssystems ließ sich durch Insertion der hlyB- und hlyD-Gene in das Bakterienchromosom erzielen. Alternativ können die hlyB- und hlyD-Gene auf einen mobilen Vektor, beispielsweise ein Plasmid, kloniert werden, der ebenso die heterologen interessierenden Proteine als Fusion mit der HlyA-Signalsequenz codiert, oder ließen sich die hlyB- und hlyD-Gene sowie die Fusion zwischen dem das heterologe interessierende Protein codierenden Gen und hlyAs auf getrennten, kompatiblen Plasmiden klonieren.
  • Zur Erzeugung eines E. coli-Stamms, der den α-Hämolysin-Sekretionsapparat stabil exprimiert, wurde ein 3,6 kb großes, für die Gene hlyB und hylD codierendes DNA-Fragment in eines der chromosomalen E. coli-Gene IacZ- oder recA-Gen mittels der folgenden Klonierungsverfahren integriert:
  • Integration von hlyB und hlyD in das chromosomale lacZ-Gen des E. coli-Stamms J53
  • Das 9,5 kb große Plasmid pJRLacZins (ein großzügiges Geschenk von Joachim Reidl, Universität Würzburg) wurde als Vektorplasmid verwendet. Dabei handelt es sich um ein λ-pir-abhängiges Suizidplasmid auf Grundlage des 6,3 kb großen Plasmids pCVD442, wodurch aufgrund des Vorhandenseins des bla-Gens eine Ampicillinresistenz sowie aufgrund des Vorhandenseins des sacB-Gens eine Sensitivität gegenüber Wachstum in Gegenwart von 5% Saccharose bei einer Wachstumstemperatur von 30°C verliehen wird. Demzufolge kann das Plasmid pCVD442, dessen DNA-Sequenz von der Firma GATC, Konstanz, Deutschland, zur Verfügung gestellt wurde, und seine Derivate nur in Bakterien, die das λ-Protein enthalten, wie beispielsweise in den E. coli-K-12-Stämmen Sy327 und Sm10λpir, replizieren. Das Plasmid pJRLacZins, das eine EcoRV-Restriktionsstelle innerhalb der lacZ-Sequenz enthält, wurde mit dem Restriktionsenzym EcoRV verdaut. Anschließend wurde ein die Gene hlyB und hlyD enthaltendes 3,6 kb großes DNA-Fragment mittels PCR von dem Cosmid pCOS10 unter Verwendung des mit Stu-HlyB1 bezeichneten Vorwärtsprimers 5'-AAAAGCCCTTTTATGGATTCTTGTCATAAAATTGATTATGGG (konstruiert nach der hämolysinspezifischen Sequenz mit der Zugangsnr. M14107) und des mit HlyD2Stu bezeichneten Rückwärtsprimers 5'-AAAAGGCCTTTTTTAACGCTCACGTAAACTTTCTGT (konstruiert nach der hämolysinspezifischen Sequenz mit der Zugangsnr. M14107) amplifiziert und nach Restriktion des PCR-Produkts mit StuI mit dem mit einer EcoRV-Restriktion behandelten Plasmid pJRLacZins unter Erzeugung des 13,1 kb großen Plasmids pLacHylBD ligiert. Dabei wurde das plasmidcodierte lacZ-Gen während dieses Klonierungsvorgangs zerstört. Das Plasmid pLacHlyBD gestattet die Integration der hlyBD-Gene in das chromosomale lacZ-Gens eines beliebigen E. coli-Stamms oder anderen Bakterienstamms, der ein homologes lacZ-Gen enthält. Das chromosomale lacZ-Gen in E. coli-Stämmen, die kein p-Protein, codiert durch das pir-Gen, besitzen, wurde nach der Einführung des Plasmids pLacHlyBD sowie einem Doppel-Crossover-Ereignis zwischen den lacZ-Sequenzen auf dem Plasmid pLacHlyBD und dem chromosomalen lacZ-Gen, infolge dessen die Gene hlyB und hlyD in das chromosomale lacZ-Gen inseriert wurden, zerstört. LacZ-negative Mutanten wurden einem phänotypischen Screening unterzogen, in dem die erhaltenen Stämme auf Wachstum als weiße Kolonien auf mit 5% Saccharose und X-Gal supplementiertes Luria-Bertani-Medium enthaltenen Agarplatten bei 30°C sowie auf den Verlust der Ampicillinresistenz getestet wurden. Genotypisch wurden die Mutanten mittels PCR-Analyse unter Verwendung des E. coli-lacZ-spezifischen (Zugangsnr. V00296) Vorwärtsprimers lacZEV-up (5'-CTGCTGCTGCTGAACGGAAG) und Rückwärtsprimers lacZEV-down (5'-TCATTGGCACCATGCCGTGGG) getestet. Die aus den Mutanten erhaltenen PCR-Produkte unterschieden sich von denen der lacZ-positiven Wildtyp-Stämme hinsichtlich der Größe, was von der Integration der hlyB- und hlyD-Sequenzen herrührte. Zudem wurde die Insertion der hlyB- und hlyD-Sequenzen in das chromosomale lacZ-Gen durch DNA-Sequenzierung bestätigt.
  • Integration von hlyB und hlyD in das chromosomale recA-Gen des E. coli-K-12-Stamms J53
  • Ein die Gene hlyB und hlyD enthaltendes 3,6 kb großes DNA-Fragment wurde mittels PCR unter Verwendung des Cosmids pCOS10 als Matrize sowie des Vorwärtsprimers Mibi-151 (5'-ATGGATTCTTGTCATAAAATTGATTATGGG) und des Rückwärtsprimers (5'-TTAACGCTCACGTAAACTTTCTGT), konstruiert nach der hämolysinspezifischen Sequenz des Cosmids pCOS10, die von Firma GATC, Konstanz, Deutschland bestimmt wurde, bzw. der Zugangsnr. M14107, amplifiziert. Das erhaltene 3,6 kb große PCR-Produkt wurde mit dem mit einer EcoRV-Restriktion behandelten 3,5 kb großen Plasmidvektor pETBlue-1 [http://www.novagen.com], der von der Firma Novagen Calbiochem-Novabiochem, Bad Soden, Deutschland, kommerziell erhältlich ist, ligiert, wobei das 7,1 kb große Plasmid pETBlue1-hlyBD erhalten wurde. Als Folge davon stand die Expression der Gene hlyB und hlyD unter der Kontrolle des mit IPTG induzierbaren T7-Promotors.
  • Eine PCR mit dem Plasmid pETBlue1-hlyBD als Matrize und dem Vorwärtsprimer Mibi-169 (5'-CTAACCTGACCTAAAATTGTGAGCGCTCACAATTCTCGTGA), konstruiert nach der pETBlue-1-hlyBD-Sequenz, sowie dem oben beschriebenen Rückwärtsprimer HlyD2 führte zu einem 3,9 kb großen PCR-Produkt mit der Bezeichnung „Stop-lacO/T7 promoter-hlyBD", der die Gene hlyB und hlyD ebenso wie Stop-Codons und lacO/T7-Promotorsequenzen stromaufwärts von hlyB enthielt.
  • Eine PCR mit dem E. coli-K-12-Stamm C600 als Matrize und dem ygaD-spezifischen Vorwärtsprimer Mibi-167 (5'-ATGACTGACAGTGAACTGATGCAG) sowie dem oraA-spezifischen Rückwärtsprimer Mibi-168 (5'-TCAGTCGGCAAAATTTCGCCAAATCTCC), jeweils konstruiert nach der Zugangsnr. AE000354, führte zur Amplifikation eines 2,2 kb großen DNA-Fragments, das das stromaufwärts von ygaD und stromabwärts von oraA-Sequenzen flankierte recA-Gen enthielt. Die Insertion des erhaltenen 2,2 kb großen PCR-Produkts in die Position 295 des 3,9 kb großen Plasmidvektors pCR2.1-TOPO, der von der Firma Invitrogen Corporation kommerziell erhältlich ist, führte zum 6,1 kb großen Plasmid pCR2.1-TOPO-ygaD-recA-oraA. Das Plasmid pCR2.1-TOPO-ygaD-recA-oraA wurde durch Verdauung mit dem Restriktionsenzym AccI, das an Position 994 des 2,2 kb großen ygaD-recA-oraA-Insertion im recA-Gen schneidet, linerarisiert und durch Behandlung mit Klenow-Fragment stumpfendig gemacht.
  • Die Ligation des oben beschriebenen 3,9 kb großen PCR-Produkts „Stop-lacO/T7 promoter-hlyBD" mit dem oben beschriebenen, mit einer AccI-Restriktion behandelten 6,1 kb großen Plasmid „pCR2.1-TOPO-ygD-recA-oraA ergab das 10 kb große Plasmid „pCR2.1-ygaD-recA'-Stop-PT7-hlyBD-recA'' -oraA", das anschließend mit den Restriktionsenzymen SacI und SphI verdaut wurde, wobei ein 6,2 kb großes DNA-Fragment, das das stromaufwärts von ygaD- und recA-spezifischen Sequenzen und stromaufwärts von recA- und oraA-spezifischen Sequenzen flankierte 3,9 kb große „Stop-lacO/T7 promoter-hlyBD"-Fragment enthielt, erhalten wurde. Anschließend wurde dieses 6,2 kb große DNA-Fragment mit dem oben beschriebenen, mit einer SacI- und SphI-Restriktion behandelten 6,3 kb großen Suizidvektorplasmid pCVD442 ligiert, wobei das 12,5 kb große Plasmid pCVD442-PT7-hlyBD erhalten wurde.
  • Das Plasmid pCVD442-PT7-hlyBD gestattete die Integration der hlyBD-Gene unter der Kontrolle des T7-Promotors in das chromosomale recA-Gen von recA+-E. coli-Stämmen. Das chromosomale recA-Gen wurde in E. coli-Stämmen, die kein vom pir-Gen codiertes p-Protein besitzen, nach Einführung des Plasmids pCVD442-PT7-hlyBD sowie einem Doppel-Crossover-Ereignis zwischen den recA-Sequenzen auf dem Plasmid pCVD442-PT7-hlyBD und dem chromosomalen recA-Gen, das die Insertion der Gene hlyB und hlyD in das chromosomale recA-Gen zu Folge hatte, zerstört. Ein phänotypisches Screening auf RecA-negative Mutanten wurde durchgeführt, indem die erhaltenen Stämme auf ihr Wachstum auf mit 5% Saccharose und X-Gal supplementiertes Luria-Bertani-Medium enthaltenen Agarplatten bei 30°C, auf den Verlust der Ampicillinresistenz ebenso wie auf die Empfindlichkeit gegenüber UV-Licht, Mitomycin C und Methylmethanthiosulfonat getestet wurden [Mühldorfer et al. (1996) Infect. Immun. 64: 495–502]. Genotypisch wurden die Mutanten mittels PCR-Analyse unter Verwendung des E. coli-recA-spezifischen (Zugangsnr. AE000354) Vorwärtsprimers Mibi-224 (5'-CGCTGACGCTGCAGGTGATCGCCG) bzw. Rückwärtsprimers Mibi-225 (5'-TCCGGGTTACCGAACATCACACCA), die stromauf- bzw. stromabwärts von der AccI-Stelle im recA-Gen binden, getestet. Die aus den Mutanten erhaltenen PCR-Produkte unterscheiden sich von denen der recA-positiven Wildtyp-Stämme hinsichtlich der Größe, was von der Integration der hlyB- und hlyD-Sequenzen herrührt. Zudem wurde die Insertion der hlyB- und hlyD-Sequenzen in das chromosomale recA-Gen durch DNA-Sequenzierung bestätigt.
  • Konstruktion von Fusionen zwischen für ein interessierendes Protein und für hlyAs codierenden Genen enthaltenden Plasmiden
  • Wie oben erwähnt, wurden interessierende Proteine für die Sekretion über das α-Hämolysin-Sekretionssystem kompetent gemacht, indem Genfusionen zwischen den jeweiligen heterologen interessierenden Genen und der C-terminalen Signalsequenz von HlyA (hlyAs) erzeugt wurden. Die Genfusionen wurden auf geeigneten mobilen Vektoren, wie beispielsweise Plasmiden oder Cosmiden, kloniert. Anschließend wurden sie in einen gramnegativen Bakterienstamm eingeführt, der den vollständigen α-Hämolysin-Sekretionsapparat exprimiert, welcher aus HlyB, HlyD und TolC besteht. Zusätzlich zur Fusion zwischen dem interessierenden Gen und hlyAs können gegebenenfalls für ein Affinitätstag und/oder Epitoptag und/oder eine Proteasespaltstelle codierende Sequenzen, wie oben beschrieben, enthalten sein. Die stabile Expression des Sekretionssystems ließ sich durch Insertion der Gene hlyB und hlyD in das Bakterienchromosom erreichen. Alternativ können die hlyB- und hlyD-Gene auf einen mobilen Vektor, beispielsweise ein Plasmid, kloniert werden, der ebenso die heterologen interessierenden Proteine als Fusion mit der HlyA-Signalsequenz codiert. Als weitere Option lassen sich die hlyB- und hlyD-Gene sowie die Fusion zwischen dem das heterologe interessierende Protein codierenden Gen und hlyAs auf getrennten, kompatiblen Plasmiden klonieren.
  • Es wurden Plasmide konstruiert, die Fusionen zwischen hlyAs und verschiedenen heterologen interessierenden Genen enthalten und die anschließend in E. coli-Stämme, die entweder chromosomales oder plasmidlokalisiertes hlyBD ebenso wie ein chromosomales tolC-Gen enthalten, transformiert werden. Beispiele hierfür sind die Plasmidkonstrukte pUCHlyCA, pETBlue-1-HlyCA, pETBlue-1-PhoA-HlyAs und pETBlue-1-LacZ-HlyAs, die wie folgt erzeugt wurden:
  • Ein 3,6 kb großes DNA-Fragment wurde mittels PCR unter Verwendung des Vorwärtsprimers StuHlyC4 (5'-AAAAGGCCTTTTATGAATATAAACAAACCATTAGAG) und des Rückwärtsprimers HlyA3Stu (5'-AAAAGCCTTTTTTATGCTGATGTGGTCAGGGTTATTGAG), konstruiert nach hämolysinspezifischen Sequenzen mit der Zugangsnr. M14107 und mit StuI verdaubaren Sequenzen, sowie des Cosmids pCOS10 als Matrize amplifiziert. Das erhaltene PCR-Produkt wurde mit dem Restriktionsenzym StuI verdaut und anschließend mit dem mit SmaI verdauten Plasmidvektor pUC18 unter Erzeugung des 6,3 kb großen Plasmids pUCHlyCA, das die Gene hlyC und hlyA enthält, ligiert.
  • Ein 3,6 kb großes DNA-Fragment wurde mittels PCR unter Verwendung des Vorwärtsprimers Mibi-142 (5'-ATGAACAGAAACAATCCATTAGAGGTTCTT) und des Rückwärtsprimers Mibi-143 (5'-TTATGCTGATGCGGTCAAAGTTATTGAGTTCCG), konstruiert nach der hämolysinspezifischen Sequenz des Cosmids pCOS10, die von der Firma GATC, Konstanz, Deutschland bestimmt wurde, amplifiziert). Das erhaltene PCR-Produkt wurde mit dem mit EcoRV verdauten 3,5 kb großen Plasmidvektor pETBlue-1 unter Erzeugung des 7,1 kb großen Plasmids pETBlue-1-HlyCA, das die Gene hlyC und hlyA unter Kontrolle des T7-Promotors enthält, ligiert.
  • Ein 1,5 kb großes DNA-Fragment wurde in einer 3-Schritt-Crossover-PCR unter Verwendung von E. coli als Matrize und dem phoA-spezifischen Vorwärtsprimer Mibi-148 (5'-ATGCGGACACCAGAAATGCCTGTTCTGGAA) sowie dem phoA-spezifischen Rückwärtsprimer Mibi-226 (5'-TTTCAGCCCCAGAGCGGCTTTCAT) in der ersten PCR, pCOS10 als Matrize und dem phoA/hlyAs-spezifischen Vorwärtsprimer Mibi-149 (5'-AAAGCCGCTCTGGGGCTGAAATCAACTTATGCAGACCTGGAT) und dem Rückwärtsprimer Mibi-145 (5'-TTATGCTGATGCGGTCAAAGTTATTGAGTT) in der zweiten PCR sowie den erhaltenen PCR-Produkten aus der ersten und der zweiten PCR als Matrizen und den Primern Mibi-148 und Mibi-145 in der 3.PCR amplifiziert. Die jeweiligen Primer wurden nach E. coli phoA (Zugangsnr. M29666 J04079) und hämolysinspezifischen Sequenzen des Cosmids pCOS10, das von der Firma GATC, Konstanz, Deutschland, etabliert wurde, konstruiert). Das erhaltene 1,5 kb große PCR-Produkt aus der dritten PCR wurde mit dem mit EcoRV verdauten 3,5 kb großen Plasmidvektor pETBlue-1 unter Erzeugung des 5 kb großen Plasmids pETBlue-1-PhoA-HlyAs, das die phoA-hlyAs-Fusion unter der Kontrolle des T7-Promotors enthält, ligiert.
  • Ein 3,2 kb großes DNA-Fragment wurde in einer 3-Schritt-Crossover-PCR unter Verwendung von E. coli als Matrize und dem lacZ-spezifischen Vorwärtsprimer Mibi-144 (5'-ATGACTATGATTACAGATTCACTGGCCGTC) sowie dem lacZ-spezifischen Rückwärtsprimer Mibi-227 (TTTTTGACACCAGACCAACTGGTA) in der ersten PCR, pCOS10 als Matrize und dem lacZ/hlyAs-spezifischen Vorwärtsprimer Mibi-146 (5'-CAGTTGGTCTGGTGTCAAAAATCAACTTATGCAGACCTGGAT) und dem Rückwärtsprimer Mibi-145 (5'-TTATGCTGATGCGGTCAAAGTTATTGAGTT) in der zweiten PCR sowie den erhaltenen PCR-Produkten aus der ersten und der zweiten PCR als Matrizen und den Primern Mibi-144 und Mibi-145 in der 3.PCR amplifiziert. Die jeweiligen Primer wurden nach E. coli-lacZ- (Zugangsnr. V00296) und hämolysinspezifischen Sequenzen des Cosmids pCOS10, das von der Firma GATC, Konstanz, Deutschland, etabliert wurde, konstruiert). Das erhaltene 3,2 kb große PCR-Produkt aus der dritten PCR wurde mit dem mit EcoRV verdauten 3,5 kb großen Plasmidvektor pETBlue-1 unter Erzeugung des 6,7 kb großen Plasmids pETBlue-1-LacZ-HlyAs, das die lacZ-hlyAs-Fusion unter der Kontrolle des T7-Promotors enthält, ligiert.
  • Das 4,2 kb große Plasmid pTOPO-Thr-Myc-His-HlyAs wurde wie folgt konstruiert: die für Thrombin, das Myc-Epitop und das His-Tag codierenden Gene wurden mittels PCR unter Verwendung des Invitrogen-Plasmidvektors pBAD/Myc-HisA als Matrize sowie des Primers ThromMycBAD (5'-CTGGTTCCGCGTGGATCTGGGCCCGAACAAAAACTCATCTCA), der die 18 Bp große Thrombin-Gensequenz enthält, als Vorwärtsprimer und dem Primer HispBAD (5'-TCAATGATGATGATGATGATGGTCGACGGC) als Rückwärtsprimer amplifiziert. Die Klonierung des erhaltenen 89 Bp großen PCR-Produkts in das lacZ-Gen des Invitrogenvektors pCR2.1.-TOPO ergibt das 4,0 kb große Plasmid pTOPO-Thr-Myc-His. Anschließend wurde ein 213 Bp großes, von einer NsiI-Restriktion zugänglichen Sequenzen flankiertes hlyAs enthaltenes DNA-Fragment unter Verwendung der Primer Mibi-108 (5'-CCAATGCATTGGTTCTGCAGTTGTCAACTTATGCAGACCTGG) und Mibi-109 (5'-CCAATGCATTGGTTCTGCAGTTGTTATGCTGATGCGGTCAAA) sowie dem Cosmid pCOS10 als Matrize amplifiziert. Die Ligation des erhaltenen, mit einer NsiI-Restriktion behandelten PCR-Produkts mit dem mit einer NsiI-Restriktion behandelten Vektor pTOPO-Thr-Myc-His ergab das endgültige 4,2 kb große Plasmidkonstrukt pTOPO-Thr-Myc-His-Hly-As, das für Thrombin, Myc-Epitop, His-Tag codierende Sequenzen stromaufwärts von hlyAs sowie stromaufwärts von nur einmal vorkommenden KpnI- und BamHI-Klonierungsstellen, die als Integrationsstellen für verschiedene interessierende Gene, z.B. hlyCA, lacZ, phoA, verwendet wurden, enthielt.
  • Zudem wurden Plasmide konstruiert, die Fusionen zwischen hlyAs und verschiedenen heterologen interessierenden Genen ebenso wie die Gene hlyB und hlyD enthielten und die anschließend in lediglich das chromosomale tolC enthaltene E. coli-Stämme transformiert wurden. Beispiele hierfür sind die Plasmidkonstrukte pUCHlyCABD, pETBlue-1-PhoA-HlyAsBD und pETBlue-1-lacZ-HlyAsBD. Als Kontrollvektor wurde ebenso pETBlue-1-HlyAsBD konstruiert.
  • Das Plasmid pUCHlyCABD wurde wie folgt konstruiert: ein 7,2 kb großes DNA-Fragment wurde mittels PCR unter Verwendung des Vorwärtsprimers (5'-ATGAACAGAAACAATCCATTAGAGGTTCTT) und Rückwärtsprimers HlyD2 (5'-TTAACGCTCACGTAAACTTTCTGT), konstruiert nach der hämolysinspezifischen Sequenz des Cosmids pCOS10, das von der Firma GATC, Konstanz, Deutschland, etabliert wurde, amplifiziert). Das erhaltene PCR-Produkt wurde mit dem mit EcoRV verdauten 3,5 kb großen Plasmidvektor pETBlue-1 unter Erzeugung des 10,7 kb großen Plasmids pETBlue-1-HlyCABD, daß das hlyCABD-Operon unter der Kontrolle des T7-Promotors enthält, ligiert.
  • Das Plasmid pETBlue-1-PhoA-HlyAsBD wurde wie folgt konstruiert: ein 5,2 kb großes DNA-Fragment wurde in einer 3-Schritt-Crossover-PCR unter Verwendung von E. coli als Matrize sowie dem phoA-spezifischen Vorwärtsprimer Mibi-148 (5'-ATGCGGACACCAGAAATGCCTGTTCTGGAA) und dem phoA-spezifischen Rückwärtsprimer Mibi-226 (5'-TTTCAGCCCCAGAGCGGCTTTCAT) in der ersten PCR, pCOS10 als Matrize und dem phoAlhlyAs-spezifischen Vorwärtsprimer Mibi-149 (5'-AAAGCCGCTCTGGGGCTGAAATCAACTTATGCAGACCTGGAT) und dem Rückwärtsprimer HlyD2 (5'-TTAACGCTCACGTAAACTTTCTGT) in der zweiten PCR sowie den erhaltenen PCR-Produkten aus der ersten und der zweiten PCR als Matrizen und den Primern Mibi-148 und HlyD2 in der 3.PCR amplifiziert. Die jeweiligen Primer wurden nach E. coli-phoA (Zugangsnr. M29666 J04079) und hämolysinspezifischen Sequenzen des Cosmids pCOS10, das von der Firma GATC, Konstanz, Deutschland, etabliert wurde, konstruiert). Das erhaltene 5,2 kb große PCR-Produkt aus der dritten PCR wurde mit dem mit EcoRV verdauten 3,5 kb großen Plasmidvektor pETBlue-1 unter Erzeugung des 8,7 kb großen Plasmids pETBlue-1-PhhoA-HlyAsBD, das die phoA-hlyAsBD-Fusion unter der Kontrolle des T7-Promotors enthält, ligiert.
  • Das Plasmid pETBlue-1-LacZ-HlyAsBD wurde wie folgt konstruiert: ein 6,9 kb großes DNA-Fragment wurde in 3-Schritt-Crossover-PCR unter Verwendung von E. coli als Matrize sowie dem lacZ-spezifischen Vorwärtsprimer Mibi-144 (5'-ATGACTATGATTACAGATTCACTGGCCGTC) und dem lacZ-spezifischen Rückwärtsprimer Mibi-227 (5'-TTTTTGACACCAGACCAACTGGTA) in der ersten PCR, pCOS10 als Matrize und dem lacZlhlyAs-spezifischen Vorwärtsprimer Mibi-146 (5'-CAGTTGGTCTGGTGTCAAAAATCAACTTATGCAGACCTGGAT) und dem Rückwärtsprimer HlyD2 (5'-TTAACGCTCACGTAAACTTTCTGT) in der zweiten PCR sowie den erhaltenen PCR-Produkten aus der ersten und der zweiten PCR als Matrizen und den Primern Mibi-144 und HlyD2 in der 3.PCR amplifiziert. Die jeweiligen Primer wurden nach E. coli-lacZ-(Zugangsnr. V00296) und hämolysinspezifischen Sequenzen des Cosmids pCOS10, das von der Firma GATC, Konstanz, Deutschland, etabliert wurde, konstruiert). Das erhaltene 6,9 kb große PCR-Produkt aus der dritten PCR wurde mit dem mit EcoRV verdauten 3,5 kb großen Plasmidvektor pETBlue-1 unter Erzeugung des 10,4 kb großen Plasmids pETBlue-1-LacZ-HlyAsBD, das die lachlyAsBD-Fusion unter der Kontrolle des T7-Promotors enthält, ligiert.
  • Das Plasmid pETBlue-1-HlyAsBD wurde wie folgt konstruiert: ein 3,8 kb großes DNA-Fragment wurde mittels PCR unter Verwendung des Vorwärtsprimers Mibi-228 (5'-TCAACTTATGCAGACCTGGATAAT) und des Rückwärtsprimers HlyD2 (5'-TTAACGCTCACGTAAACTTTCTGT), konstruiert nach der hämolysinspezifischen Sequenz des Cosmids pCOS10, das von der Firma GATC, Konstanz, Deutschland, etabliert wurde, amplifiziert). Das erhaltene PCR-Produkt wurde mit dem mit EcoRV verdauten 3,5 kb großen Plasmidvektor pETBlue-1 unter Erzeugung des 7,3 kb großen Plasmids pETBlue-1-HlyAsBD, das hlyAsBD unter der Kontrolle des T7-Promotors enthält, ligiert.
  • Konstruktion von Sekretionssystemen auf Grundlage des α-Faktors aus Pichia pastoris
  • Das oben beschriebene Sekretionssystem aus P. pastoris wird in einer modifizierten Version für FunProTec verwendet. Analog zum oben beschriebenen E. coli-Hämolysin-Sekretionssystem werden von den oben erwähnten Pichia pastoris-Vektoren von Invitrogen abgeleitete Plasmide konstruiert, die verschiedene interessierende Gene sowie optionale verschiedene Proteasespaltstellen und Tag-Sequenzen enthalten. Fusionen zwischen der α-Faktor-Signalsequenz und verschiedenen heterologen interessierenden Genen enthaltende Plasmide werden unter Verwendung der Invitrogen-Plasmidvektoren pPICZalpha konstruiert.
  • Das Plasmid pPICZalpha-A-LacZ wird wie folgt konstruiert: ein 3,1 kb großes DNA-Fragment wird mittels PCR unter Verwendung von E. coli als Matrize und dem lacZ-spezifischen (Zugangsnr. 002655) Vorwärtsprimer Mibi-159 (5'-ATATATGGGGTACCACTATGATTACAGATTCACTGG), dem das am Anfang vorhandene Startcodon fehlt, der jedoch eine mit KpnI spaltbare Sequenz enthält, und dem lacZ-spezifischen Rückwärtsprimer Mibi-162 (5'-ATATATGCTCTAGATTTTTGACACCAGACCAACTG), dem das Stopcodon fehlt, der jedoch eine mit XbaI spaltbare Sequenz enthält, amplifiziert. Das mit einer KpnI- und XbaI-Restriktion behandelte 3,1 kb große PCR-Produkt wird mit dem mit einer KpnI- und XbaI-Restriktion behandelten 3,6 kb großen Invitrogen-Plasmid pPICZalphaA ligiert, wobei das 6,7 kb große Plasmid pPICZalpha-A-LacZ erhalten wird. Nach der Propagation dieses Shuttle-Plasmids in E. coli Top10 F' wird die α-Faktor-Signalsequenz-lacZ-Fusion nach Transformation des Plasmids pPICZalpha-A-LacZ in P. pastoris sowie einem Crossover-Ereignis zwischen den AOX1-Sequenzen auf dem Plasmid pPICZalpha-A-LacZ und dem chromosomalen AOX1-Sequenzen in das P. pastoris-Genom integriert.
  • Etablierung eines Kompartimentsystems zur Konservierung sezernierter Proteine
  • Doppelfiltertechnik
  • Wie in 1 veranschaulicht, werden zwei Filter mit einer geeigneten Porengröße auf einer Agarplatte zur Anzucht von Bakterien übereinander gelegt. Dabei weist das obere Filter einen Porendurchmesser auf, der die Bakterienwanderung vom oberen zum unteren Filter verhindert, jedoch den Fluß der sezernierten Fusionsproteine zum unteren Filter gestattet. Es besitzt eine geringe Proteinbindungskapazität. Im Gegensatz dazu weist das untere Filter eine optimale Proteinbindungskapazität auf, und zwar entweder natürlicherweise oder als Folge davon, daß es an bestimmten Stellen mit einer Komponente, bei der es sich um einen optimalen Bindungspartner für einen Bestandteil der von den auf dem oberen Filter wachsenden Bakterien zu sezernierenden Proteinfusion handelt, beschichtet wurde. Beide Filter gestatten den Durchfluß von Nährstoffen und Wachstumsfaktoren aus der Agarplatte zur Bakterienanzucht zu den auf dem oberen Filter wachsenden Bakterienkolonien. Die einen Hämolysin-Sekretionsapparat exprimierenden Bakterienkolonien sezernieren HlyAs-Proteinfusionen, die auf das untere Filter diffundieren, an das sie binden.
  • Die oben beschriebenen E. coli-Stämme 536, seine isogenen Mutanten 536-21 und 536-39-192, E. coli K-12 wt, JM109, DH1, LE392, W678, 35, J53, EN99, WK6, HB101, 5K, CC118, C600, MC1029, DH5α werden der Doppelfiltertechnologie ausgesetzt: Zwei Millipore-Filter werden auf einer Agarplatte zur Bakterienanzucht aufeinander gelegt. Das obere Filter (hydrophiles Durapore-Membranfilter mit einer geringen Proteinbindungskapazität, hergestellt von Millipore, Eschborn, Deutschland, Bestell-Nr. HVLP09050) weist einen Porendurchmesser von 0,45 μm auf, wodurch die Bakterienwanderung vom oberen zum unteren Filter verhindert wird, jedoch der Fluß von den sezernierten Fusionsproteinen zum unteren Filter gestattet wird. Das Millipore-MF-Membranfilter (Bestell-Nr. VCWP09025), das aus einem Mischester aus Celluloseacetat und Cellulosenitrat besteht und aufgrund seiner chemischen Beschaffenheit eine optimale Proteinbindungskapazität aufweist, wird als unteres Filter gewählt. Beide Filter gestatten den Durchfluß von Nährstoffen und Wachstumsfaktoren von der Agarplatte zur Bakterienanzucht zu den auf dem oberen Filter wachsenden Bakterienkolonien. Die Bakterien werden auf das obere Filter aufgetragen und dann 3 Stunden bei 37°C wachsengelassen. Anschließend werden die sezernierten Proteine, die an das untere Filter binden, mittels PonceauS-Anfärbung sichtbar gemacht. Mit diesem Verfahren ist lediglich von E. coli 536 sezerniertes Protein nachweisbar. In einem weiteren Experiment wird das untere Filter auf eine Schafsblutagarplatte gelegt. Nach einer Übernachtinkubation bei Raumtemperatur ist eine Lyse an Stellen erkennbar, die unterhalb des von E. coli 536 sezernierten Proteintoxins lagen (3). In einem weiteren Experiment werden die E, coli-Stämme 536, 536-21, J53 (pUCHlyCA) und J53 (pUC18) dem Doppelfiltersystem unterzogen, wobei das untere Filter in Folge nach 3-stündigem Bakterienwachstum bei 37°C entfernt und auf eine Schafsblutagarplatte gelegt wird. Nach einer Übernachtinkubation bei Raumtemperatur ist eine Lyse an den Stellen erkennbar, die unterhalb der von E. coli 536 und J53 (pUCHlyCA) stammenden Stellen mit Protein lagen.
  • Technik mit aufeinandergestapelten Mikrovertiefungen
  • Wie in 2 beschrieben, werden aufeinandergestapelte Platten mit Mikrovertiefungen verwendet, wobei Mikrovertiefungen übereinander angeordnet und durch eine Filtermembran mit einem Porendurchmesser, der die Bakterienwanderung verhindert, jedoch den Fluß der sezernierten Fusionsproteine von der oberen Vertiefung zur unteren Vertiefung gestattet, getrennt sind. Dabei wachsen flüssige Bakterienkulturen in der oberen Platte mit Mikrovertiefungen. Von diesen Bakterien sezernierte Proteine diffundieren in die untere Vertiefung, von der sie dann in Form einer Proteinlösung geerntet werden können. Dabei ist insbesondere bevorzugt, daß eine Flüssigkultur eines einen Hämolysin-Sekretionsapparat exprimierenden Bakteriums HlyAs-Proteinfusionen sezerniert, die in die untere Vertiefung diffundieren, von der sie dann als Proteinlösung geerntet werden kann.
  • In Vorversuchen werden als untere Ernteplatten, das von Millipore (Eschborn, Deutschland) gelieferte „MultiScreen Assay System" und die Millipore MultiScreen-Filtrationsplatten MAHVS4510 mit 0,45-μm-Durapore-PVDF-Membranen sowie die Polypropylen-Microplatten 651201 von Greiner verwendet. Die oben beschriebenen E. coli-Stämme 536, dessen isogene Mutanten 536-21 und 536-39-192, E. coli K-12 wt, JM109, DH1, LE392, W678, 35, J53, EN99, WK6, HB101, 5K, CC118, C600, MC1029, DH5α) werden der Doppelfiltertechnologie ausgesetzt. Dabei werden jeweils 20 μl der aus den unteren Platten geernteten Proteinlösungen auf Oxoid-Schafsblutagarplatten aufgetragen. Nur das von E. coli 536 sezernierte Protein ruft eine Hämolyse hervor.
  • Bestimmung der Proteinsekretion von E. coli- und Pichia pastoris-Stämmen
  • Die Proteinsekretion von E. coli- und Pichia pastoris-Stämmen läßt sich nach Anwendung der oben beschriebenen Doppelfiltertechnik testen: nach Bindung an das untere Filter in diesem System können die sezernierten Protein anschließend Standardverfahren zum Proteinnachweis, einschließlich Tinten-, PonceauS-, Coomassie- oder Silverfärbungen, ausgesetzt werden.
  • Im Falle des Zytotoxins HlyA läßt sich dessen Sekretion über seine hämolytische Aktivität des (mit 0,45 μm-Filtern) sterilfiltrierten Kulturüberstands auf Schafsblutagarplatten verfolgen.
  • Allgemein können bei Proteinen bei einer bekannten Funktion die filtersterilisierten Kulturüberstände der jeweiligen Bakterien in funktionellen Assays untersucht werden.
  • Beispiele für mit der Erfindung erhaltene Ergebnisse
  • DNA-Sequenz des Hämolysin-Operons, das auf der Pathogenitätsinsel I (Pai I) des E. coli-Stamms 536 lokalisiert ist
  • Das Cosmid pCOS10 [Knapp et al. (1986) J. Bateriol. 168: 22–30], freundlicherweise von G. Blum-Oehler, Universität Würzburg zur Verfügung gestellt, enthält Pai I des uropathogenen E. coli-Stamms (UPEC) [Berger et al. (1982) J. Bacteriol. 152: 1241–1247; Blum et al. (1994) Infect. Immun. 62: 606–614; Hacker et al. (1983) J. Bacteriol. 154: 1145–1154]). Nach seiner Isolierung aus dem E. coli-Stamm HB101 (pCOS10) nach dem Quiagen-Protokoll wurde dieses Cosmid als Matrize in PCR-Reaktionen mit unterschiedlichen Primersätzen zur Amplifikation überlappender Fragmente des auf pCOS10 lokalisierten Hämolysinoperons verwendet. Die Sequenzen der Primer wurden aus der DNA-Sequenz des vom E. coli-Plasmid pHly152 codierten Hämolysinoperons, die von Hess et al., 1986, mit der Zugangsnr. M14107 veröffentlicht wurde, gewählt.
  • Hämolytische Aktivitäten verschiedener E. coli-Stämme
  • Der uropathogene E. coli-Stamm 536, seine isogene Mutante 536-21, der die Pathogenitätsinseln (Pais) I und II, die jeweils ein Hämolysinoperon tragen, fehlt [Berger et al. (1982) J. Bacteriol. 152: 1241–1247; Blum et al. (1994) Infect. Immun. 62: 606–614; Hacker et al. (1983) J. Bacteriol. 154: 1145–1154], E. coli KL320-HlyBD (pUCHlyCA) sowie verschiedene E. coli-K-12-Stämme wurden hinsichtlich ihrer hämolytischen Aktivitäten nach Übernachtwachstum auf Schafsblutagarplatten verglichen. Lediglich der Wildtyp-UPEC-Stamm 536 sowie der E. coli-Stamm KL320-HlyBD (pUCHlyCA), jedoch nicht die UPEC-Mutante 536-21 oder einer der anderen E. coli-K-12-Stämme, riefen eine Erythrozytenhämolyse hervor.
  • Doppelfiltertechnologie auf einer Blutagarplatte
  • Der UPEC-Stamm 536, seine Mutante 536-21 ebenso wie 15 E. coli-K-12-Stämme und E. coli KL320-HlyBD (pUCHlyCA) wurden der oben beschriebenen Doppelfiltertechnologie ausgesetzt. Dabei zeigte das obere Filter alle die unterschiedlichen E, coli-Kolonien, wobei das mit PonceauS behandelte untere Filter nur gefärbte Punkte unterhalb der Filterstellen mit dem E. coli-Stamm 536 und E. coli KL320-HlyBD (pUCHlyCA) zeigte. Der Schafsblutagar unterhalb des Doppelfiltersystems zeigte ebenso nur hämolytische Zonen an Stellen, die unterhalb des Filters mit dem E. coli-Stamm 536 und E. coli KL320-HlyBD (pUCHlyCA) lokalisiert waren.
  • In einem weiteren Experiment wurde das untere Filter nach 3-stündigem Bakterienwachstum bei 37°C entfernt und auf eine weitere Schafsblutagarplatte gelegt. Nach Übernachtinkubation bei Raumtemperatur wurde die Lyse wiederum an den Stellen sichtbar, die unterhalb des von E. coli 536 und E. coli KL320-HlyBD (pUCHlyCA) sezernierten Proteintoxins lagen.
  • Kurze Beschreibung der Figuren
  • 1: Doppelfiltertechnik. Zwei Filter (1, 2) werden übereinander auf eine Agarplatte zur Bakterienanzucht (3) unter Bildung eines Kompartimentsystems (28) gelegt. Interessierende Proteine (5) sezernierende Zellen wachsen auf dem oberen Filter (1) in Form von Einzelkolonien (4), wodurch von den wachsenden Zellen auf dem oberen Filter (1) ein erstes Kompartiment (29) gebildet wird. Ein unteres Filter (2) sowie die Agarplatte zur Bakterienanzucht (3) bilden ein zweites Kompartiment (30). Das obere Filter (1), das Teil des ersten Kompartiments ist, dient als Schranke, wobei diese Schranke einen Porendurchmesser aufweist, der die Bakterienwanderung vom oberen Filter (1) zum unteren Filter (2) verhindert, jedoch den Fluß der sezernierten interessierenden Proteine (5) zum unteren Filter (2) gestattet, wobei das letztere Teil des zweiten Kompartiments (30) ist und eine optimale Proteinbindungskapazität aufweist. Beide Filter (1, 2) gestatten den Durchfluß von Nährstoffen und Wachstumsfaktoren von der Agarplatte zur Bakterienanzucht (3) zu den auf dem oberen Filter (1) wachsenden Bakterienkolonien (4). Im ersten Kompartiment (29) weisen wachsende Bakterienzellkolonien (4) eine diskrete Anordnung auf. Folglich wandern sezernierte interessierende Proteine (5) durch das obere Filter (1) auf das untere Filter (2) des zweiten Kompartiments (30), wobei ein Array aus diskreten Proteinflecken aufgebaut wird.
  • 2: Technik mit aufeinander gestapelten Mikrovertiefungen. Zwei Mikrotiterplatten (6, 7) werden übereinander gelegt und durch eine Filtermembran (8) unter Bildung eines Kompartimentsystems (28) getrennt. Dabei bilden eine Flüssigkultur von Zellen (9), die in den Vertiefungen der oberen Mikrotiterplatte (6) wachsen, und die Membran (8) das erste Kompartiment (29) des Kompartimentsystems (28). Das zweite Kompartiment (30) setzt sich aus Vertiefungen der unteren Mikrotiterplatte (7) zusammen, in denen interessierende Proteine (5) sezerniert werden. Die Filtermembran (8) weist einen Porendurchmesser auf, der die Bakterienwanderung verhindert, jedoch den Fluß der interessierenden Proteine (5) von Vertiefungen der oberen Mikrotiterplatte (6) zu den Vertiefungen der unteren Mikrotiterplatte (7) gestattet. Eine Flüssigkultur (9) von Zellen, die in den Vertiefungen der oberen Mikrotiterplatte (6) wachsen, sezerniert interessierende Proteine (5), die in Vertiefungen der unteren Mikrotiterplatte (7) hineindiffundieren, aus denen sie dann geerntet werden.
  • 3: Doppelfiltersystem. Die E. coli-Stämme 536 (10), 536-21 (11), 536-39-192 (12), K-12 wt (13), JM109 (14), DH1 (15), LE392 (16), W678 (17), 35 (18), J53 (19), EN99 (20), WK6 (21) HB101 (22), 5K (23), CC118 (24), C600 (25), MC1029 (26) und DH5α (27) werden dem Doppelfiltersystem ausgesetzt:
  • Zwei Millipore-Filter (1, 2) werden auf einer Agarplatte zur Bakterienanzucht (3) übereinander gelegt. Das obere Filter (1) (hydrophiles Durapore-Membranfilter mit einer niedrigen Proteinbindungskapazität, geliefert von Millipore, Eschborn, Deutschland, Bestell-Nr. HVLP09050) weist einen Porendurchmesser von 0,45 μm auf, wodurch die Bakterienwanderung vom oberen zum unteren Filter (2) verhindert wird, jedoch der Fluß der sezernierten Fusionsproteine zum unteren Filter (2) gestattet wird. Das Millipore-MF-Membranfilter (Bestell-Nr. VCWP09025), das aus einem Mischester aus Celluloseacetat und Cellulosenitrat besteht und aufgrund seiner chemischen Beschaffenheit eine optimale Proteinbindungskapazität aufweist, wird als unteres Filter (2) verwendet. Beide Filter (1, 2) gestatten den Durchfluß von Nährstoffen und Wachstumsfaktoren von der Agarplatte zur Bakterienanzucht (3) zu den auf dem oberen Filter (1) wachsenden Bakterienkolonien. Die Bakterien werden auf das obere Filter übertragen und dann 3 Stunden bei 37°C wachsen gelassen. Anschließend wird nach 3-stündigem Wachstum der Bakterien bei 37°C das untere Filter (2) entfernt und auf eine Schafsblutagarplatte gelegt. Nach Übernachtinkubation bei Raumtemperatur ist eine Lyse an Stellen sichtbar, die unterhalb des von E. coli 536 sezernierten Proteintoxins lagen. Tabellen Tabelle 1. In der vorliegenden Anmeldung verwendete Oligonukleotide
    Figure 00530001
    • *1: Die Ziffern beziehen sich auf die Nukleotidpositionen der 8216 Bp großen Nukleotidsequenz der vom E. coli-Plasmid pHly152 codierten und von Hess et al., 1986, unter der Zugangsnr. M14107 veröffentlichten Hämolsyindeterminante. Die Hämolysingene hlyC, hlyA, hlyB und hlyD in dieser Sequenz sind an den Nukleotidpositionen 796 bis 1308, 1320 bis 4394, 4466 bis 6589 bzw. 6608 bis 8044 lokalisiert.
  • 1042WOORD01 Sequence Listing 2002-08-07.ST25.txt SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 00550001
  • Figure 00560001
  • Figure 00570001
  • Figure 00580001
  • Figure 00590001
  • Figure 00600001
  • Figure 00610001
  • Figure 00620001
  • Figure 00630001
  • Figure 00640001
  • Figure 00650001
  • Figure 00660001
  • Figure 00670001
  • Figure 00680001
  • Figure 00690001

Claims (16)

  1. Verfahren zur Herstellung wenigstens eines interessierenden Proteins, indem dieses von einer Wirtszelle, die ein Sekretionssystem stabil exprimiert und zur heterologen Sezernierung des interessierenden Proteins fähig ist, in einem Kompartimentsystem, das wenigstens ein erstes und ein zweites Kompartiment aufweist, wobei die Wirtszelle im ersten Kompartiment lokalisiert ist und wobei das erste und das zweite Kompartiment durch eine Schranke voneinander getrennt sind, sezerniert wird, wobei die Schranke für das sezernierte interessierende Protein, jedoch nicht für die Wirtszelle durchlässig ist.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Wirtszelle ein auf einem beweglichen Vektor codiertes Sekretionssystem exprimiert.
  3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei es sich bei dem beweglichen Vektor entweder um ein Plasmid oder ein Cosmid handelt.
  4. Verfahren nach Ansprüchen 1 und 2, wobei die Schranke Teil des ersten Kompartiments des Kompartimentsystems ist.
  5. Verfahren nach Ansprüchen 1 und 2, wobei es sich bei der Schranke um eine Membran handelt, wobei das Membranfilter einen Porendurchmesser aufweist, der eine Wanderung der Wirtszelle verhindert und die Diffusion des sezernierten interessierenden Proteins durch die Membran gestattet.
  6. Verfahren nach Ansprüchen 1 und 2, wobei das erste Kompartiment horizontal oberhalb des zweiten Kompar timents lokalisiert ist und das sezernierte interessierende Protein mittels Schwerkraft vom ersten Kompartiment durch die Schranke in das zweite Kompartiment diffundiert.
  7. Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Wirtszelle auf der Oberfläche des Filters lokalisiert ist und es sich bei dem zweiten Kompartiment um eine auf der gegenüberliegenden Oberfläche des Filters angebrachte Festphase handelt, die das sezernierte Protein nach Diffusion durch das Filter zurückhalten kann.
  8. Verfahren nach Ansprüchen 1 und 2, wobei es sich bei der Wirtszelle entweder um E. coli oder um Pichia pastoris handelt.
  9. Verfahren nach Ansprüchen 1 und 2, wobei die Sekretion des interessierenden Proteins durch das Wachstum der Wirtszelle bewirkt wird.
  10. Verfahren nach Anspruch 5, wobei es sich bei dem ersten und dem zweiten Kompartiment um aufeinander gestapelte Mikrovertiefungen handelt, die durch das Filter getrennt sind.
  11. Verfahren nach Ansprüchen 1 und 2, wobei das interessierende Protein als Fleck im zweiten Kompartiment erhalten wird oder wobei das interessierende Protein im zweiten Kompartiment in Lösung erhalten wird.
  12. Verfahren nach Ansprüchen 1 und 2, wobei das sezernierte interessierende Protein ein Affinitätstag, ein Epitoptag und/oder eine zur Abtrennung der Sekretionssignal- und/oder der Tag-Sequenzen geeignete Proteasespaltstelle trägt.
  13. Verfahren nach Ansprüchen 1 und 2 zur Herstellung mehrerer unterschiedlicher interessierender Proteine, wobei die ein jeweiliges interessierendes Protein sezernierende Wirtszelle jeweils in einem definierten Bereich des ersten Kompartiments lokalisiert ist und die sezernierten interessierenden Proteine jeweils zu einem definierten Bereich des zweiten Kompartiments wandern oder wobei die ein jeweiliges interessierendes Protein sezernierende Wirtszelle jeweils in unterschiedlichen ersten Kompartimenten lokalisiert ist und die sezernierten interessierenden Proteine jeweils zu unterschiedlichen zweiten Kompartimenten wandern.
  14. Verfahren zur Herstellung eines Arrays von mehreren unterschiedlichen interessierenden Proteinen, indem die interessierenden Proteine von entsprechenden Wirtszellen, die ein Sekretionssystem, das den Wirtszellen die heterologe Sezernierung des jeweiligen interessierenden Proteins ermöglicht, stabil exprimieren, in einem Kompartimentsystem, das wenigstens ein erstes und ein zweites Kompartiment aufweist, wobei die unterschiedlichen Wirtszellen in Form eines Arrays im ersten Kompartiment angeordnet sind und wobei das erste und das zweite Kompartiment durch eine Schranke voneinander getrennt sind, sezerniert werden, wobei die Schranke für die sezernierten interessierenden Proteine, jedoch nicht für die Wirtszelle durchlässig ist und wobei die sezernierten interessierenden Proteine im zweiten Kompartiment in Form eines Arrays aufgenommen werden.
  15. Verfahren nach Anspruch 14, wobei die Schranke Teil des ersten Kompartiments des Kompartimentsystems ist.
  16. Verfahren nach Anspruch 14, wobei das Array von Proteinen dem Proteom eines interessierenden Organismus entspricht.
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