DE2535554C2

DE2535554C2 - Biologisches Verfahren

Info

Publication number: DE2535554C2
Application number: DE2535554A
Authority: DE
Inventors: Christopher Keith Runcorn Cheshire Leach; Thomas Fulton Wilson Mckillop; David Pioli
Original assignee: Imperial Chemical Industries Ltd
Current assignee: Imperial Chemical Industries Ltd
Priority date: 1974-08-08
Filing date: 1975-08-08
Publication date: 1984-04-05
Also published as: SE7508905L; FR2281426A1; GB1521032A; DK360175A; JPS51125782A; DE2535554A1; CH621147A5; FR2281426B3

Description

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Die Erfindung betrifft die genetische Modifizierung von Mikroorganismen gemäß Patentanspruch 1. Die Patentansprüche 2 und 3 nennen Ausgestaltungen der Erfindung.

Mikroorganismen sind allgemein dadurch gekennzeichnet, daß eine Organisation der einzelnen Zellen zu höherem Zellgewebe fehlt; bei der vorgesehenen genetischen Modifizierung wird fremdes genetisches Material auf solche Weise in den Mikroorganismus eingeführt, daß der Mikroorganismus sowohl Polypeptide und/oder Proteine synthetisiert, welche an den Code des fremden genetischen Materials gebunden sind, wie teilweise oder vollständig solche Polypeptide und/oder Proteine synthetisiert, welche an den Code des normalen genetischen Materials des Mikroorganismus gebunden sind.

Im Verlauf dieser Beschreibung und der Ansprüche wird das genetische Material (das ist dasjenige Material, durch das anläßlich der Vermehrung der Organismen die genetischen Eigenschaften von einer Generation zur so nächsten Generation jeweils durch Reproduktion übertragen werden) als DNA bezeichnet, da Desoxyribonukleinsäure das gebräuchlichste und verbreiteste dieser Materialien zu sein scheint. Die vorliegende Erfindung ist jedoch auch auf solche Organismen anwendbar, in denen DNA nicht das tatsächliche genetische Material darstellt, d. h. beispielsweise auf solche Organismen, bei denen RNA das genetische Material darstellt; die »reverse Transcription«, mit der aus RNA eine DNA-Kopie erhalten werden kann, kann &o die Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens auf solche Organismen erleichtern.

Die Erfindung ist durch den Palentanspruch 1 definiert.

Doppelsträngige DNA kann durch gewisse Enzyme, welche üblicherweise als Endonukleasen bezeichnet werden, zerteilt werden; der Mechanismus der Wirkungsweise von einigen dieser Endonukleasen scheint darin zu bestehen, daß diese Enzyme spezifische Nukleotidsequenzen der DNA-Doppelhelix erkennen und zerteilen bzw. abspalten.

Für die Zwecke dieser Beschreibung können die Endonukleasen hinsichtlich der Art von Spaltung klassifiziert werden, welche sie bewirken, nämlich in

1. Endonukleasen, welche bside Stränge der DNA-Doppelhelix an Zentren zerteilen, welche einander direkt gegenüberliegend an der DNA-Doppelhelix

¹ angeordnet sind (F i g. 1 a);

2. Endonukleasen, deren Spaltung der DNA-Doppelhelix zu versetzten Bruchstellen (d. h. die DNA-Doppelhelix wird nicht an direkt gegenüberliegenden Stellen zerteilt) in den beiden komplementären DNA-Strängen führt (F i g. 1 b).

Bei der durch Endonukleasen des Typs 2 bewirkten Spaltung fallen DNA-Fragmente an, welche zwei unterschiedliche, jedoch komplementäre Endabschnitte von Einzelsträngen aufweisen; das bedeutet, aufgrund der Natur der Nukleotid-Wechselwirkung besitzen die einzelsträngigen Endabschnitte eine Affinität zueinander und die Tendenz, sich spezifisch mit ihren komplementären Partnern zu vereinigen (F i g. 2). Daraus ergibt sich, daß bei der nachfolgenden Behandlung der beiden unterschiedlichen DNA-Präparate, welcne nach Spaltung mit Endonuklease der gleichen Klasse 2 angefallen sind, und nach Extraktion aus oder Inaktivierung der Endeonuklease in den DNA-Präparaten beim Vermischen von zwei solcher DNA-Fraktionen willkürliche jedoch komplementäre Paare aus den einsträngigen Endabschnitten der DNA-Fragmente entstehen, und zwar aus den beiden unterschiedlichen Präparaten, ebenso wie erne Paarbildung der Fragmente aus den gleichen Präparaten unter geeigneten Bedingungen eintreten wird. Aufgrund der gegenwärtigen Annahmen wird die Stabilität der Sequenzen solcher Fragmente hauptsächlich abhängen von der Festigkeit der Wasserstoffbindung zwischen den komplementären Basen in den einsträngigen Endabschnitten jedes Fragments. Durch die Wirkung gewisser Enzyme, die als DNA-Ligasen bekannt sind, können die Fragmente jedoch auch kovalent aneinander gebunden werden, woraus eine stärkere Verbindung resultiert.

Zusätzlich zu der DNA, welche das genetische Material im Kern der lebenden Zelle darstellt, gibt es auch eine große Gruppe von extranuklearen DNA-Molekülen, welche üblicherweise als »Plasmide« bezeichnet werden, welche typischerweise zu einer autonomen Selbst-Reproduktion fähig sind. Diese Moleküle liegen jedoch nur dann in einer biologisch aktiven, reproduzierbaren Form vor, wenn sie sich innerhalb eines empfindlichen Gastorganismus oder in einem geeigneten Substitut dafür in einem Invitrosystem befinden, was dann zur Bildung von progenen Plasmid-DNA-Molekülen und der Bildung von denjenigen Polypeptiden und/oder Proteinen führt, welcne an den Code der Plasmid-DNA gebunden sind. Typische Plasmide sind die Bakteriophagen-DNA, die Widerstandsfaktoren und die kolicinogenen Faktoren. Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere die Verwendung von DNA aus Bakteriophagen. Viele Plasmide können eine Anzahl verschiedener Zustände innerhalb der Gastzelle annehmen, beispielsweise kann der Sexfaktor »F« aus E.coli einmal als selbstreproduzierendes DNA-Molekül innerhalb der Gastzelle existieren oder dieses Plasmid kann

in die DNA des Kerns der Gastzeile integriert sein. Die DNA des Bakteriophagen Lambda (λ) kann ebenfalls in der integrierten »lysogenen« Form existieren, solange die meisten Aktivitäten des Phagen ruhen, sie kann jedoch diesen Zustand verändern ^nd eigene selbstreproduzierende Aktivität annehmen, was zur Synthese von Phagenteilchen (DNA + Proteinüberzug) und gegebenenfalls zu einer Lyse des Gastorganismus führt unter Freisetzung des progenen Phagens.

Es ist festgestellt worden, daß sowohl natürlich vorkommende DNA wie abgeleitete Plasmid-DNA-Moleküle die Fähigkeit besitzen, lediglich an einem Zentrum von einer spezifischen Endonuklease gespalten zu werden. Beispielsweise für solche Endonukleasen sind sog. Beschränkungsenzyme, beispielsweise »Eco Rl« und »Hind III«. Die Behandlung von DNA-Molekühn mit nur einem spaltungsfähigen Zentrum durch beispielsweise das Enzym Eco Rl führt 7ir Erzeugung von zwei linearen Rl-kohesiven-Endabschnitten, die erneut verschmolzen werden können, entweder eine miteinander wie zuvor oder mit einem anderen DNA-Fragment, das geeignete komplementäre, kohesive Endabschnitte aufweist, die ebenfalls durch Rl-Behandlung erzeugt worden sind. Die Fig.3 erläutert dieses oben beschriebene Verfahren, bei dem unähnliche DNA-Moleküle, welche beide Rl-Erkennungszentren aufweisen, durch Rl-Behandlung gespalten worden sind, zusammengebracht worden und erneut verschmolzen worden sind, anschließend mit einem DNA-Ligaseenzym behandelt worden sind, was zu einer Bildung von Hybrid-DNA-Molekülen geführt hat. Das Enzym Hind III weist eine ähnliche spezifische Wirkung auf.

Das in Fig.3 dargestellte Schema erläutert die Herstellung von Hybrid-Plasmid/Nichtplasmid-DNA, doch es ist zu beachten, daß auch andere Kombinationen damit erläutert werden können. Insbesondere erläutert das Schema, wie der Aufbau von genetischem Plasmid verändert werden kann durch den Einbau von Nichtplasmid-DNA in das Plasmid-DNA-Molekül. Die Injektion einer Wirtszelle mit der Hybrid-Plasmid-DNA führt zur Bildung von weiterer Hybrid-DNA und den Polypeptiden und/oder Proteinen, welche an den Code der Hybrid-DNA gebunden sind.

Es ist klar, daß das Hybrid-DNA-Gemisch, das durch Rekombination von DNA-Fragmenten erhalten worden ist, weitgehend willkürlich ist; für die Auswahl von besonders vorteilhaften DNA-Molekülen für die Reproduktion und Vermehrung müssen daher geeignete Auswahl- oder Trennverfahren angewandt werden.

Die Isolierung von Plasmid-DNA-Molekülen, welche in ein besonderes fremdes Rl-Fragment eingetreten sind, kann auf der Basis einer Vielzahl von Techniken erfolgen. So können etwa die Rl-geordneten Donor-DNA-Fragmente beispielsweise mittels der Elektrophorese unter Verwendung von Acrylamid- oder Agarosegel abgetrennt werden. Diese Fraktionen können anschließend in getrennten Integrations- und Transfektionsexperimenten verwendet werden. Alternativ dazu kann die CsCl-Dichtezentrifugation benutzt werden, um die Phagenpartikel zu fraktionieren, welche unterschiedliche Mengen von eingefügter fremder DNA enthalten. Diese Fraktionen können anschließend in getrennten Infektionsexperimenten verwendet werden.

Die Auswahl besonders angestrebter DNA-Zusammensetzung erfolgt durch Abtrennung des Produkts nach erfolgter Infektion einer geeigneten Wirtszelle durch die DNA mittels dem als »Immuno-Screening« bekannten Verfahrens. Dieses Verfahren hangt deshalb nicht von der Extraktion und Identifizierung von spezifischem DNA-Material ab, sondern eher von der Identifizierung des gewünschten Produkts von der Hybridisierungstechnik; d.h. wenn der Zweck einer j besonderen Hybridisierung in der Herstellung eines Plasmid-Hybrid-Moleküls liegt, das in einem Bakterium die Synthese eines spezifischen Polypeptids, beispielsweise Insulin verursacht, dann gehört zum angewandten Auswahlverfahren die Feststellung dieses spezifischen i" Polypeptids.

Obwohl die Verwendung eines Konzentrations- oder Trennungsverfahrens (und die hierfür angegebenen Beispiele sind keinesfalls erschöpfend) mit anschließendem Immuno-Screening beschrieben worden ist, wird i) diese Reaktionsfolge lediglich aus Zweckmäßigkeitsgründen angewandt (jede der Vielzahl von Fraktionen wird auf ihre Aktivität untersucht, bevor Verdünnung, Plattierung und Auswah' Jer verdünnten Fraktion deren Aktivität anzeigt) und wenn es bevorzugt wird, kann die ganze Population aus Hybrid-Plasmid ohne ursprüngliche Fraktionierung ausgewählt werden.

Unter Immuno-Screnning wird dabei die Anwendung auf einen Mikroorganismus verstanden, der einem aktiven Metabolismus unterliegt, oder zu deren Lyseprodukten bei spezifischen Artikörpern für einen ausgewählten Metaboliten des Organismus (üblicherweise ein Polypeptid oder Protein) und die Feststellung von zurückgehaltenem Antikörper, was die Anwesenheit des Metaboliten anzeigt.

Das heißt mit anderen Worten, die Erfindung führt zu einem Verfahren, bei dem Rezeptor-DNA-Materia! zerteilt wird, die bei dieser Behandlung anfallenden Fragmente von DNA-Materia! werden mit Donor-DNA-Fragmenten vermischt, welche durch Zerteilung von unterschiedlichem DNA-Material unter Anwendung gleichartiger Maßnahmen zur Zerteilung von DNA angefallen sind, das Gemisch aus diesen DNA-Fragmenten wird willkürlich verschmolzen, um Hybricl-DNA-Moleküle zu erhalten, mit diesen Hybrid-DNA-Molekülen wird eine geeignete empfindliche Wirtszelle infiziert, der Metabolismus der infizierten Wirtszellen wird in Gang gesetzt, ausgewählte Metaboliten werden durch Immuno-Screnning festgestellt und auf diesem Wege festgestellte Wirtszellen und/oder DNA aus diesen Wirtszellen wird reduziert, um die ausgewählten Metaboliten herzustellen.

In den Fällen, in denen eine »aktive« Fraktion festgestellt wird, kann diese durch Refraktionieren und erneute Prüfung gereinigt werden, bis eine reine Kette, beispielsweise ein Phage erhalten wird, der das gewünschte »fremde« hybride genetische Material trägt.

Die Einführung der ausgewählten reinen Fraktion von Hybrid-DNA in die aufnahmebereite Wirtszelle führt somit zu der Herstellung von progener Hybrid-DNA innerhalb der Wirtszelle und derjenigen Polypeptide und/oder Proteine, die an den Code der DNA gebunden sind.

Dieses Verfahren wird in den folgenden Beispielen näher erläutert.

Beispiel 1 (nachgereicht)

Die Synthese, Feststellung und Isolierung

eines Λ phagen, welcher das Gen für

E.coli trp A-Polypeptid enthält

1. Herstellung des Beschränkungsenzyms Hind I

Zellen von Haemophilus influenza wurden in einer Hirn· Herz-Infusionsbrühe, welche mit 10 μg Hemin/m! und 2 μg N AD/ml versetzt war, bis zu einem E 550-Wert von 0,7 gezogen, durch Zentrifugieren gewonnen, einmal gewaschen und erneut suspendiert bis zu 0,002 Vol. in 0,05 M Tris (pH 7,4), 0,001 M Glutathion. Die Zellen wurden bei 4°C durch Beschallung zerstört und 30 Minuten lang bei 100 000 g zentrifugiert, und die überstehende Flüssigkeit wurde auf einen Gehalt von 1 M NaCI gebracht; dieses Material wurde anschließend auf eine 2,5 · 49 cm große Säule mit Biogel A 0,5 M gegeben, mit 10 VoI 1 M NaCI, 0,02 M Tris HCI (pH 7,4), 0,01 M Mercaptoäthanol vorgewaschen. Die Eluierung wurde mit einer Geschwindigkeit von 1,2 ml/min durchgeführt, wobei dieser Puffer verwendet wurde und D-mi-Fraküuiien gesammelt wurden. Die Traktionen 18 bis 27 wurden miteinander vereinigt und mit 2 VoI 0,02 M Tris, pH 7,4, verdünnt. Langsam wurde Ammoniumsulfat bis zur 5O°/oigen Sättigung zugesetzt und der Niederschlag durch Zentrifugieren entfernt. Die überstehende Flüssigkeit wurde ausgefällt, um einen 50- bis 60%igen Niederschlag zu erhalten und anschließend erneut ausgefällt, um einen 60- bis 7O°/oigen Niederschlag zu erhalten. Die Niederschläge wurden vereinigt und in 0,1 VoI 0,05 M NaCI, 0,02 M Tris HCI (pH 7,4), 0,001 M Mercaptoäthanol gelöst und erschöpfend gegen den gleichen Puffer dialysiert. (Alle Operationen erfolgten bei 4° C.)

Eine 0,5 · 9,5 cm große Säule mit Phosphorcellulose (Whatman P. 11), wurde mit 100 ml 0,01 M Kaliumphosphatpuffer (pH 7,4) äquibrilliert. Die erneut aufgelösten Niederschläge wurden mit 9 VoI dieses Puffers verdünnt und mit einer Fließgeschwindigkeit von 5 ml/h auf die Säule gegeben. Das Protein wurde anschließend schrittweise mit 5 ml Portionen von 0,01 M Kaliumphosphatpuffer (pH 7,4), welcher zunehmende molare Mengen an KCI enthielt, eluiert. Das bei 0,3 M eluierte Protein wurde ausgefällt bei 75%iger Sättigung mit Ammoniumsulfat und anschließend erneut in 10 mM Kaliumphosphat (pH 6,8) gelöst. 6 Einheiten mit einer Absorption bei 280 nm wurden auf eine Säule (1 ■ 10 cm) mit Hydroxy-Apatit gegeben. Die Eluierung erfolgte mit einem linearen Gradienten von 160 ml jeweils von 1OmM und 40OmM Kaliumphosphat (pH 6,8). Die Fraktionen 79 bis 85 (bei angenähert 0.25 M Phosphat) wurden dazu verwendet, um das Beschränkungsenzym Hind III herzustellen.

2. Herstellung des Beschränkungsenzyms Rl

Ein Stamm von E. coli mit einem R-Faktor zur Bestimmung des Rl-Beschränkungsenzyms wurde in 10 1 D(UIlC uib Λϋ einem C jju-rtCn VOn i.'J gCZOgCn. DiC Zellen wurden anschließend durch Zentrifugieren bei 4°C gewonnen, in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei - 20° C aufbewahrt.

100 g gefrorener Zellen wurden durch Beschallung in 200 ml Extraktionspuffer (0,01 M KH₂PO₄. pH 7,0; 0,001 M EDTA; 0,007 M 2-Mercaptoäthanol) insgesamt 12 Minuten lang zerstört (MSE Atomix, bei voller Geschwindigkeit zerplatzen in 45 Sekunden mit 30 Sekünden Kühlung). Die überstehende Flüssigkeit wurde anschließend bei 35 000 rpm (MSE 8 · 50 Rotor) eine Stunde lang bei 4^C C zentrifugiert Zu der überstehenden Flüssigkeit wurden anschließend langsam und mit konstanter Rührgeschwindigkeit 100 ml 5% w/v Streptomycinsulfat in Extraktpuffer hinzugegeben. Nach 15minütigem Rühren wurde der Niederschlag durch Zentrifugieren entfernt und langsam Ammoniumsulfat zugesetzt bis zur Sättigung von 50% in der überstehenden Flüssigkeit. Nachdem 30 Minuten lang gerührt worden war, wurde der Niederschlag durch Zentrifugieren (10 000 Upm; 10 Minuten; 4⁰C) entfernt, in 45 ml Extraktionspuffer gelöst und erschöpfend im 4maligen Wechsel gegen Extraktionspuffer über 48 Stunden dialysiert. Anschließend wurde zu der dialysierten Ammoniumsulfatfraktion 4 M NaCl-Lösung gegeben, bis zu einer abschließenden Konzentration von 0,35 M

ίο NaCl, daraufhin wurde die Lösung (mit einer Fließrate von 40 ml/Stunde) auf eine Säule (15 -3 cm) mit Phosphorcellulose P 11 gegeben, welche durch H ⁺ - und OH--Zyklen gewaschen und mit 0,35 M NaCI in Extraktionspuffer äquibrilliert worden war, und mit

Ii einem linearen Gradienten, (0,35 bis 0,8 M) NaCl im Ex'raktionspuffer eluiert. Es wurden 10 ml Fraktionen gesammelt und aktive Fraktionen bei ungefähr 0,5 M NaCl wurden vereinigt und gegen Extraktionspuffer dialysiert, anschließend (mit einer Fließgeschwindigkeit

2(i von 20 ml/Stunde) auf eine Säule (5 · 1 cm) mit DEAE-Zellulose-DE 52 gegeben, die mit Extraktionspuffer äquibrilliert worden war. Die Säule wurde mit 0,15 M NaCl in Extraktionspuffer gewaschen und mit einem linearen Gradienten (0,15—0,50M) NaCl in Extraktionspuffer (Fließgeschwindigkeit 10 ml/Stunde) eluiert. Es wurden 4 ml Fraktionen gesammelt und die aktiven Fraktionen bei ungefähr 0,3 M NaCl wurden vereinigt und gegen Extraktionspuffer dialysiert. Das Enzym wurde konzentriert durch Absorption in einer

jo kleinen Säule (2 · 1 cm) mit DE 52, das mit Extraktionspuffer äquibriliert worden war, und mit 3 ml 0,5 M NaCl eluiert. Dieses Eluat wurde als das Rl-Enzym-Präparat verwendet.

3. Herstellung von λ Phagen-DNA

1,5 1 einer Kultur von sensitiven E.coli-Wirtszellen in L-Brühe bei exponentiell Wachstumsphase (OD 550 = 0,5) wurden mit λ Phagen mehrfach infiziert bei einem (m.o.i)-Wert von 1,0. Durch heftiges Schütteln

4(i bei 37⁰C wurde die Inkubation fortgeführt.

Nachdem die Lyse eingetreten war, wurden die Kulturen mit Chloroform (1 ml Chloroform pro 10 ml Kultur) 10 Minuten lang geschüttelt, anschließend in 500 ml Polypropylenflaschen zum Zentrifugieren verteilt und 20 Minuten lang bei 4^CC und 7000 Upm zentrifugiert. Die Phagen enthaltende überstehende Flüssigkeit wurde abgegossen und 2 Stunden lang in einer präparativen L2-Ultrazentrifuge (Beckman) bei 10°C und 18 000 Upm (Rotor 19) zentrifugiert.

■><> Die überstehende Flüssigkeit wurde weggegossen und die Pellets gesammelt. Zu jeder Zentrifugierungsflaschc wurden 1,5m! 1OmM TrishyHroxymethylaminomethan (Tris)/HCl, 1OmM MgSO₄-Puffer. pH 7.2 hinzugefügt und die Pellets durch leichte Homogenisie-

rung über Nacht bei 4° C in dieser Lösung resuspendiert. Die Flaschen wurden anschließend mit zwei 0,5 ml-Portionen von 10 mM Tris/MgSO4-Puffer gewaschen.

Die Phagensuspension wurde in ein 15-ml-Zentrifugenglas gegossen und 15 Minuten lang bei 1O⁰C und 7000 Upm (Rotor JA20, Beckman J21 Zentrifuge) zentrifugiert, um die noch verbliebenen Bakterienüberreste zu entfernen.

Zu der phagenenthaltenden überstehenden Flüssigkeit wurde Wasser und Kristalle von Cäsiumchlorid (CsCl) gegeben, um insgesamt 12 ml mit einer Brechung von 8° 10' zu erhalten. Die Suspension wurde anschließend auf 3 Zeliulosenitrat-Rohre (1,2 -5 cm) verteilt, und mit 1 ml Paraffinöl bis zur Kerbe an jedem

Rohr bedeckt.

Die CsCl und Phagen enthaltende Suspension wurde 22 Stunden lang bei 1O⁰C und bei 30 000 Upm in einem SW 50 Rotor in der Beckman L2 Ultrazentrifuge zentrifugiert. Anschließend wurden die Rohre am Boden punktiert und das sichtbare Phagenband gesammelt durch tropfenweise Fraktionierung des CsCl-Gradienten. Die Phagen wurden in ein kleines, gegenüber Licht geschütztes Schraubkapsel-Glas überführt und bei 4°C aufbewahrt.

An einer 20^1-Probe von 1 :10 verdünnter Phagensuspension wurden in einer Quarzmikrozelle mit 1 mm Lichtweg die Absorption (OD 260) bestimmt. 20 OD 260-Einheiten (berechnet für die unverdünnte Phagensuspension in 1 cm Lichtweg) der Phagen wurden über Nacht im 3maligen Wechsel gegen 10 mM Kaliumphosphatpuffer (KPD) pH 7,4 bei 4⁰C dialysiert.

Die dialysierte Probe (angenähert 1 ml) wurde in ein 15 ml Corex-Zentrifugierglas überführt, 10 μΐ 25°/oige Natriumdodecylsulfat-Lösung (SDS) zugesetzt und die Lösung 3 Minuten lang auf 60°C erwärmt. Die von den Phagen ausgehende Opaleszenz verschwand und die Lösung klärte sich. Das Glas wurde anschließend in Eiswasser gekühlt. Ein Volumen Phenol, gesättigt mit 0,1 M KPB, vorgekühlt in Eis, wurde zugesetzt und das Glas durch sanftes Umwenden bei Raumtemperatur 1 Minute lang geschüttelt, anschließend wurde 10 Minuten lang bei 5° C und 7500 Upm zentrifugiert.

Die untere Phenolschicht wurde wegpipettiert und verworfen, und die Phenolexiraktion 2mal wiederholt. Die obere wäßrige Schicht wurde anschließend langsam in ein Dialysegefäß überführt. Diese wurde dann anschließend im 3maligen Wechsel gegen 1OmM Tris HCl/10 mM MgCl₂ im Verlauf von 24 Stunden dialysiert. Dieses Produkt wurde anschließend als Phagen-DNA-Präparat verwendet.

Rezeptor-Phagen-DNA

Die als Rezeptor A hergestellte Phagen-DNA war ein Derivat des λ Phagen, in dem Teile des normalen Komplements des A Phagen-chromosoms ausgelöscht worden war (angenähert insgesamt 20%). Zusätzlich besaß die Phagen-DNA nur 1 Zentrum, an dem sie durch das Enzym Hind III gespalten werden konnte (Zentrum 3).

Die wesentlichen Eigenschaften dieses Phagen können wie folgt dargestellt werden:

Donor-Phagen-DN A

Ä», Rl 1 -2 V, Hind III 3+, N²¹ P", nin.

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Das Wirtsbakterium, das zur Herstellung des λ Phagens A verwendet wurde, war E.coli vom Stamm C600.

Die Phagen-DNA, welche als Rezeptor B hergestellt wurde, war ein Derivat des λ Phagens, in dem Teile des normalen Komplements des Genoms ausgelöscht worden waren (angenähert insgesamt 15%). Dieser Phagen besaß zwei Zentren für die Spaltung durch das Eco Rl-Beschränkungsenzym. Die Entfernung des Fragments zwischen den zwei Zentren durch die Rl-Behandlung verstärkt die Kapazität des Rezeptors für die Einführung von DNA.

Die wesentlichen Eigenschaften dieses Phagens können wie folgt dargestellt werden:

M RI1-2 V, Rl 3+, nin. '

Das Wirtsbakterium für die Herstellung des Phagen B war Exoli KY MeI.

Die als Donor-Phagen-DNA hergestellte Phagen-DNA war ein Derivat des λ Phagen, welches die Gene für dieTryptophansynthetisierenden Enzyme (der trp Operon) des E.coli enthielt. Die wesentlichen Eigenschaften sind:

H⁸⁰,i\trp ⁺

Das verwendete Wirtsbakterium für die Herstellung der Donor-Phagen-DNA war E.coli KY MeI.

4. Herstellung von E.coli DNA

Logphasezellen des prototrophen Stammes E.coli W1485 wurden in L-Brühe gezogen, gewonnen und erneut in 100 mM Tris-HCl (pH 8,0), 10 mM EDTA bis zu einer Zellkonzentration von 2 · 10⁹/ml suspendiert. Bis zu einer Konzentration von 100μg/ml wurde Lysozym zugesetzt und die Mischung bei 37°C 5 Minuten lang inkubiert.

Bis zu einem Wert von 0,5% w/v wurde Natriumdodecylsulfat zugesetzt und anschließend bis zu 50 μg/ml Proteinase K zugesetzt und über Nacht bei 37⁰C durch sanftes Schütteln inkubiert. Die Mischung wurde anschließend mit gleichem Volumen kalten Phenol behandelt, mit Puffer gesättigt (500 mM Tris HCl pH 8,0; 10 mM EDTA; 10 mM NaCl;0,5% w/v SDS) und 10 Minuten lang bei Raumtemperatur bei 60 Upm umgewendet. Die Mischung wurde auf 7°C abgekühlt und 10 Minuten lang bei 500 g zentrifugiert. Mit einer weitmundigen Pipette wurde die viskose, wäßrige Phase entfernt und die Phenolbehandlung wiederholt. Die wäßrige Schicht wurde anschließend in ein Dialysegefäß überführt, das 20 Minuten lang in 64%iger Zinkchlorid-Lösung eingeweicht worden war, mit 0,1 M HCl und anschließend mit 5 mM EDTA gewaschen. Dialysiert wurde gegen 50 mM Tris HCl (pH 8,0) 10 mM EDTA, 1OmM NaCl (Puffer C) in einem 1-1-Meßzylinder bei Raumtemperatur, bis die Absorption bei 270 mM außerhalb des Gefäßes unter 0,05 Einheiten lag.

Die Lösung wurde in ein unbehandeltes Gefäß überführt und RNA-ase A (endgültige Konzentration 50 μg/m!) und RNA-ase T (endgültige Konzentration 2 μg/ml) hinzugefügt. Diese Lösung wurde bei 37° C 4 Stunden lang gegen Puffer C dialysiert.

Die DNA-Lösung wurde anschließend in ein anderes unbehandeltes Gefäß überführt und SDS bis zu 0,5% w/v und Proteinase K bis zu 50 μg/ml hinzugefügt; diese Lösung wurde bei 37°C über Nacht gegen Puffer C dialysiert.

Anschließend wurden zwei weitere Phenolextraktionen durchgeführt Die wäßrige Phase wurde schließlich in ein behandeltes Dialysegefäß übergeführt und gegen 10 mM Tris HCl (pH 7,5), 10 mM NaCl eine Stunde lang bei Raumtemperatur und anschließend 4 Tage lang bei 4° C dialysiert.

Die dabei erhaltene Lösung wurde anschließend als Donor-E.coli-DNA-Präparat verwendet

5. DNA-Beschränkung

Die für die Beschränkung vorgesehene DNA und das Beschränkungsenzym wurden im Verhältnis 1 μg DNA zu ΙμΙ Enzympräparat in 1OmM Tris HCl (pH 7,5) 10 mM MgCl₂,10 mM 2-Mercaptoäthanol, 50 mM NaCl gemischt Die Mischung wurde 45 Minuten lang bei 37°C inkubiert, und zum Ende dieser Zeitspanne 10 Minuten lang auf 70⁰C erwärmt

6. DNA-Ligation

5 μΙ T₄-Polynukleotid-Ligase wurden mit 495 μΙ Ligasepuffer vermischt, welcher gleiche Molmengen -von jeweils 616 mM Tris HCl (pH 7,5), 93 mM MgCl₂, 560 mM NaCl, 93 mM Dithiothreitol, 0,933 mM ATP, 9,33 mM EDTA, 0,93 mg/ml Bovinserumalbumin enthielt.

4 μg des beschränkten Rezeptorphagen, der gemäß 5 hergestellt worden war, wurden 10 Minuten lang auf 70⁰C erwärmt, anschließend rasch auf Eis gekühlt. Dieser Phage wurde mit 8 \ig von beschränkter Door-DNA vermischt, welche gemäß 3 oder 4 hergestellt worden war; die Mischung wurde 15 Minuten lang auf 30⁰C erwärmt und anschließend 24 Stunden lang bei 0⁰C aufbewahrt. Anschließend wurde diese Mischung dem Ligasepuffer zugesetzt und 6 Stunden lang bei 10⁰C inkubiert; und anschließend nochmals 6 Tage lang bei O⁰C inkubiert. Nach Ablauf dieser Zeitspanne wurden die Gemische für Transfektions-Experimente verwendet.

7. Transfektion

0,1 ml der über Nacht-L-Brühe der Kultur der Wirtszelle von E.coli wurde auf 10 ml P-Medium eingeimpft und über Nacht wachsen gelassen. 2 ml dieser Über Nacht-Kultur wurde auf 25 ml frisches Medium geimpft und bis zu einem E 550-Wert von 0,6 wachsen gelassen. Die Zellen wurden anschließend 10 Minuten lang auf Eis abgekühlt, durch Zentrifugieren gewonnen und in 0,5 Volumen von 0,1 M CaCb erneut suspendiert. Nach 20 Minuten auf Eis wurden die Zellen erneut geerntet und in 0,1 VoI CaCb suspendiert. Nach weiteren 20 Minuten auf Eis wurden die Zellen für die Transfektion verwendet.

Die für die Transfektion vorgesehene DNA wurde in SSC bis auf 3 μg pro ml verdünnt und mit den Zellen im Verhältnis 1,0 VoI DNA: 2,0 VoI Zellen vermischt. Die Mischung wurde anschließend bei 37°C 30 Sekunden lang einem Wärmeschock ausgesetzt und 2 Stunden lang auf Eis gehalten, bevor sie in 0,6%igem weichen Agar, versetzt mit 10~³M MgSO₄, auf L-Agarplatten plattiert wurde. Die Platten wurden über Nacht bei 37°C inkubiert und die Plaques am folgenden Tag mit

4 ml L-Brühe belegt und über Nacht bei 4⁰C aufbewahrt. Jedes Produkt (Eluat) wurde geerntet, mit

5 ml Chloroform geschüttelt und bei 4° C aufbewahrt.

P-Medium:

25 ml P-Medium Puffer; 0,02 M Kaliumphosphat

(pH 7,0),0,015 M (NH₄J₂SO₄

0.25 ml 0.1 MMeSO₄

0,43 ml 10-⁴M FeSO₄

0,125 ml 20%ige Glukose

0,1 ml 20%iges säure-hydrolisiertes Kasein

+ L-Tryptophan, 50 μg/ml endgültige

Konzentration
SSC:

8,76 g/l NaCI

4,41 g/l Tri-Natriumcitrat (pH 7,0)
L-Brühe:

Pro Liter:

Difco Bacto Trypton, 10 g;

Difco Bacto Hefeextrakt, 5 g;

NaCl, 5 g;

Glukose 1 g.
pH-Wertbei7,2
L-Agar:

L-Brühe + Difco Bacto Agar bis 15 g/l

Weicher Agar:

L-Brühe + Difco Bacto Agar bis 6,5 g/l

Wirtsbakterium:

Die für das Transfektionsexperiment verwendete Wirtszelle E.coli war ein Derivat des E.coli-Stammes W3U0 der aufgrund genetischer Auslöschung den funktionalen Tryptophanoperon verloren hatte, und dem ferner ein funktionales Tryptophan-Regulatorgen fehlte; dieser Stamm kann mit:

TrpR-,TrpA-EV
beschrieben werden.

In anderen Experimenten wurden Trp--Derivate von E.coli-Stämmen KY MeI und C600 als Wirtszellen für die Transfektion verwendet.

8. Herstellung von Agarschichten

100 ml des Phageneluats von jeder Transfektionsplatte wurden mit 100 ul von geeigneten Indikatorbakterien (E.coli W3110, TrpR-, TrpA-E V ) vermischt. Zu jeder Mischung wurden 4 ml weicher Agar bei 46°C hinzugefügt und die Bestandteile unmittelbar darauf in eine Petrischale (7,5 cm Durchmesser) gegossen. Durch sanftes Schütteln der Schale wurde der Boden der Petrischale vollständig mit dem Agargemisch bedeckt. Nachdem sich der Agar in allen Platten gesetzt hatte, wurden die Platten über Nacht bei 37°C inkubiert.

Im Anschluß an die Inkubation wurden die Platten überprüft und die angenäherte Anzahl von Plaques jeweils notiert. Die Zahlen variieren in Abhängigkeit von der jeweiligen Transfektionsmischung von einigen wenigen bis zu unzählbar vielen. Die Kante der

Agarmischungen in den Schalen wurden sanft von dem Umfang der Schale weg zum Zentrum der Schale gedruckt, wozu ein kleiner Spaten verwendet wurde. Ein Filterpapier, das exakt in die Petrischale paßte, wurde auf dem Agar aufgelegt und sorgfältig nach unten

gedruckt, um Luftblasen zu entfernen. In den Fällen, in denen die Filterpapiere nicht vollständig durch Flüssigkeit aus der Agarschicht befeuchtet wurden, wurden einige Tropfen destilliertes Wasser hinzugegeben. Die Filterpapiere mit anhaftender Agarschicht wurden anschließend sorgfältig aus den Petrischalen herausgeschält und herausgenommen. Die Agsrschicht wurde auf den flachen Glasboden einer Glasschale von 10 cm Durchmesser aufgelegt, wobei sorgfältig darauf geachtet wurde, daß keine Luftblasen eingefangen wurden. Die Glasschalen wurden anschließend in einen auf 60⁰C gehaltenen Ofen gebracht, bis die Agarschichten mit dem anhaftenden Panier trocken waren.

Nachdem sich die Schalen auf Raumtemperatur abgekühlt hatten, wurden die Filterpapiere mit einigen Tropfen destilliertem Wassers angefeuchtet und die Papiere abgezogen, wobei eine feste Agarschicht auf der Glasoberfläche zurückblieb. Überschüssiges Wasser wurde entfernt und der Agar mit Äthanol (10 ml) 20 Minuten lang bei Raumtemperatur fixiert. Das Äthanol wurde weggegossen und der Agar mit destilliertem Wasser (10 ml) für einige Sekunden gewaschen. Der Agar wurde anschließend unter einem Strom warmer Luft aus einem Haartrockner getrocknet. Die Bereiche des Agars, welche das gebildete Antigen (Trp A) enthielten, wurden durch Verwendung einer doppelten Antikörper-Fluoreszenztechnik festgestellt (obwohl hierzu auch andere Verfahren zum Auszählen von Antikörpern brauchbar sind, beispielsweise radio-

aktive Verfahren mit beispielsweise Jod 125, mit Enzymen, beispielsweise Peroxydase, durch Bestimmung der Elektronendichte, beispielsweise mit Ferritin, entweder mit einem ausgezählten Antikörper oder mit zwei Antikörpern, wobei der zweite ausgezählt wird. Bei dem doppelten Antikörper-Bestimmungsverfahren ist der erste (nicht ausgezählte) Antikörper spezifisch für das Antigen und wird in einer tierischen Spezies gebildet, während der zweite (ausgezählte) Antikörper in einer unterschiedlichen Spezies gebildet wird und spezifisch ist für solche Antikörper, die aufgrund der ersten Spezies gebildet werden.

Herstellung von Trp A

Die Herstellung von reinem Trp A für die Verwendung als Immunogen bei der Herstellung von Antikörpern gegen Trp A erfolgte wie folgt. 10 ml einer über Nacht-Kultur von E.coli W3110 (Trp R-, trp A am⁸⁸, Sup III) in L-Brühe wurden zusammen mit 10 ml, 0,1 M MgSO4 einem Liter L-Brühe zugesetzt und die Mischung unter aeroben Bedingungen bei 37° C gehalten, bis ein E 550-Wert von 0,6 erreicht war. Anschließend wurden 1 · 10¹² Phagen trp Am 1 (trp A — E+, sus Q, N V, nin) zugesetzt und die Mischung weiterhin 4 Stunden lang inkubiert. Die zelluläre Masse und die Phagenprodukte wurden durch Zentrifugieren (30 Minuten. 4⁰C, 8000 g) geerntet und erneut in kaltem (4°C) 0,1 M Kaliumphosphatpuffer pH 7,0 (1,3 ml/g Naßgewicht) suspendiert. Die Zellen wurden durch Beschallung mit Ultraschall (4 bis 6 μ, 5 · 20 Sekunden mit Intervallen von 1 Minute) zerstört, wobei die Temperatur durch Eintauchen in Eis bei 4⁰C gehalten wurde. Anschließend wurden 100 μΐ Mercaptoäthanol und 800 μΐ 1 M MnCl₂ zugesetzt und die Lösungen vermischt Die zellulären Überreste wurden durch Zentrifugieren bei 4⁰C im Verlauf von 1 Stunden ausgefällt Der Kuchen wurde verworfen und zu der überstehenden Flüssigkeit 0,2 mg Dinatrium-EDTA zugesetzt, anschließend 10 Minuten lang gerührt (auf Eis). Der pH-Wert der Mischung wurde anschließend mit kalter 1 M Nairiumacetat-Lösung (pH 3,8) auf einen Wert von 4,5 eingestellt, und die Mischung für weitere 15 Minuten bei 4°C gerührt. Die Mischung wurde anschließend 25 Minuten lang bei 4° C und 40 000 g zentrifugiert, der Kuchen verworfen und zu der überstehenden Flüssigkeit festes Ammoniumsulfat zugesetzt, bis zu einer Konzentration von 33 g/100 ml. Anschließend wurde die Mischung 20 Minuten lang bei 4° C gerührt. Die Mischung wurde 20 Minuten lang bei 4° C und 40 000 g zentrifugiert die überstehende Flüssigkeit verworfen und der Kuchen erneut suspendiert und in einem minimalen Volumen von kaltem 0,1 M Kaliumphosphatpuffer pH 7,0 gelöst Die Lösung wurde im Verlauf von 2 Stunden bei 4° C gegen 0,05 M Kaliumphosphatpuffer, pH 7,0 dialysiert Ein möglicher Niederschlag, der sich im Verlauf der Dialyse bildet, wurde durch Zentrifugieren (40 000 g, 4° C, 20 Minuten) entfernt

Die überstehende Flüssigkeit wurde über eine Säule (2 · 50 cm) mit Sephadex GlOO in 0,05 m Kaliumphosphatpuffer pH 7,0 bei 4° C gereinigt und in 50 · 4-ml-Fraktionen aufgefangen. Durch Prüfung von je 50-μΙ-Ar.teilen der von der Säule abgenommenen Fraktionen wurde das trp A lokalisiert Die 50-μ1-ΑηΙβϋε wurden mit 950 μΐ der folgenden Prüfmischung vermischt und 20 Minuten lang bei 37° C inkubierr. Die Prüfmischung bestand aus L-Serin (21 mg/ml, 3 ml), Pyridoxal-Phosphat (100 μg/l ml), 1 M Trishydrochlorid pH 7,8 (1 ml), gesättigter Natriumchloridlösung (300 μΙ), Indol (0,5μΓηο1Λη1, 800 μΐ), Wasser (2,4 ml) und »trp B-Lösung« (0,5 ml). Die »trp B-Lösung« wurde aus 2 I über Nacht-Kultur (37°C unter aeroben Bedingungen) von E.coli W3110 (trp R-, trp A V) in L-Brühe isoliert. Durch Zentrifugieren bei 8000 g für 30 Minuten bei 4°C wurden die Zellen geerntet, erneut in 600 ml 0,1 M Kaliumphosphatpuffer pH 7,0 suspendiert und erneut bei 8000 g für 30 Minuten bei 4°C zentrifugiert. Die ίο Zellen wurden in 40 ml 0,1 M Kaliumsphosphatpuffer pH 7, der Pyridoxalphosphat (8 μg/ml) enthielt, bei 4°C suspendiert und beschallt (4—6 μ für 6 ■ 15 Sekunden mit Intervallen von 1 Minute) und auf Eis gekühlt. Durch Zentrifugieren bei 3000 g für 30 Minuten bei 4°C wurden die Zellrückstände entfernt. Die überstehende Flüssigkeit wurde als »trp B-Lösung« verwendet.

Nach Inkubation mit der Prüfmischung wurde 1 ml Indol-Reagenz (9 g 4-Dimethylamino-benzaldehyd gelöst in 200 ml Äthanol und vermischt mit 45 ml konzentrierter Salzsäure) zugesetzt und die Mischung für 20 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen. Hierbei zeigte eine gelbe Färbung die Anwesenheit von trp A an und eine rote Färbung dessen A-bwesenheit.

Die den hauptsächlichen Anteil an trp A enthaltenden Fraktionen wurden zusammengegeben und 43 g Ammoniumsulfat pro 100 ml zugesetzt. Die Mischung wurde 20 Minuten lang bei 4°C gerührt und anschließend 45 Minuten lang bei 4°C und 40 000 g zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde verworfen und der Kuchen erneut in einem minimalen Volumen von 0,5 M Kaliumphosphatpuffer pH 7,0 bei 4⁰C suspendiert. Die Lösung wurde über Nacht gegen 0,01 M Kaliumphosphatpuffer pH 7,0 bei 4⁰C dialysiert.

Die abschließende Reinigung erfolgte über eine Säule (2 · 100 cm) mit DEAE-Zellulose in 0,01 M Phosphatpuffer pH 7,0 bei 4° C. Das Dialysat wurde mit 50 ml des gleichen Puffers auf die Säule gegeben und das Eluieren erfolgte mit einem linearen Gradienten, bestehend aus 600 ml 0,01 M und 600 ml 0,3 M Phosphatpuffer pH 7,0 bei 4°C. Die das trp Α-Protein enthaltenden Fraktionen wurden auf die gleiche Weise wie vor der Reinigung über die erste Kolonne lokalisiert und zusammengegeben. Es wurden 44 g Ammoniumsulfat pro 100 ml hinzugefügt und die Mischung 15 Minuten lang gerührt. Durch Zentrifugieren (40 000 g, 45 Minuten, 4° C) wurde das trp A abgetrennt und der Kuchen erneut in 0,05 M Phosphatpuffer pH 7,0 bei 4° C gelöst. Die Lösung wurde über Nacht gegen den gleichen Puffer dialysiert. Mittels der Folinreaktion wurde die Proteinkonzentration der Lösung bestimmt und durch Verdünnen mit dem gleichen Puffer auf 1 mg/m! eingestellt. Diese Lösung wurde zur Immunisierung von Kaninchen für die Herstellung von Antisera gegen trp A verwendet.

Anti-trp A

Das Immunisierungsverfahren umfaßt das Emulsieren von 500 μΐ trp Α-Lösung mit 1 ml Freud'scher Hilfslösung und die subkutane Injizierung der Mischung in ein Kaninchen an mehreren Stellen (wenigstens 5). Die Injektionen wurden in Intervallen von 1 Monat wiederholt und den Tieren wurde jeweils 10 bis 14 Tagen nach jeder Injektion Blut abgenommen. Das Serum wurde gesammelt und hinsichtlich der Niederschlagsbildung in einem Immuno-Diffusions-System (in 1% Agar) bei verschiedenen Verdünnungen gegen trp Α-Lösungen geprüft Die Antisera wurden beim Immuno-Screening als ¹Ao derjenigen Verdünnung verwendet, welche eine sichtbare Niederschlags-Linie

ergaben.

Immuno-Screening

500 μΐ verdünnter Anti-trp Α-Lösung wurden auf eine Schicht von trockenem Agar gegeben und darauf gleichmäßig ausgebreitet Die Mischung wurde 30 Mi-■ nuten lang bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend mit Phosphatpuffer-Salzlösung (0,1 M, pH 7',2, 9 g/L Natriumchlorid) gewaschen (10 ml, 3 · 1 Minute) und ferner 1 Minute lang mit Wasser gewaschen. Der Agar wurde anschließend mit warmer Luft getrocknet

500 μΐ des zweiten Antikörpers (mit Fluoreszin ausgezähltes Anit-Kaninchen-Immunoglobulin, gezogen aus einem Schaf; bei einer Verdünnung von ungefähr V20, bestimmt in ähnlichen Experimenten unter Verwendung von Anti-λ Phagen als erstes Antiserum) wurden anschließend zugesetzt, gleichmäßig über die gesamte Platte ausgebreitet und 30 Minuten lang inkubiert. Überschüssiges Antiserum wurde wie oben angegeben weggewaschen und die Platte getrocknet.

Vor der mikroskopischen Untersuchung wurde der Agar mit ImI eines weiteren Mediums (3,16 g Na₂CO₃ + 0,6 g NaHCO₃ in 100 ml Wasser mit 43 ml Glycerol) bedeckt. Das Mikroskop war mit einer Quarzhalogenlampe, einem primären Interferenzfilter (Zeiss HP-500) und einem blaßgelben Grenzfilter ausgestattet. Zur Beobachtung der Proben wurde ein Kondensator mil dunklem Feld verwendet

Plaques mit positiver Reaktion fluoreszierten grün gegenüber einem rot-schwarzen Hintergrund und Plaques ohne Reaktion waren schwarz. Mit einer Häufigkeit von ungefähr 1% wurden anfänglich positive Reaktionen festgestellt.

Isolierung von trp A-Phagen

Die Rezeptorphagen A und B, welche trp A-Gene enthielten, wurden auf zwei Wegen isoliert. Zuerst wurden die Phageneluate von den Transfektionsplatten plattiert um angenähert 200 Plaques pro Platte zu ergeben, wobei die Plaques einzeln aufgenommen wurden, in 1 ml L-Brühe behandelt, wobei ein aliquoter Anteil davon beim Plattieren jeweils angenähert 200 Plaques ergab. Jede Platte wurde untersucht unter Verwendung der oben angegebenen Antikörper-Technik und die isolierten Eluate ergaben Plaques mit positiven Reaktionen.

Das zweite Verfahren zur Isolierung verlief im wesentlichen ähnlich, jedoch wurde hier die anfängliche Reinigung durch ein Verdünnungsverfahren erreicht. Aliquote Anteile der Eluate aus den Plaquen der Transfektion wurden plattiert und ergaben angenähert

10 Plaques pro Platte. Hier wurde jede Platte mit 3 ml L-Brühe behandelt Aliquote Anteile dieser Eluate wurden anschließend plattiert und ergaben angenähert 200 Plaques pro Platte, und diese Platten wurden untersucht unter Verwendung der Antikörpertechr.ik. Auf einigen Platten wurden positive Reaktionen mit einer Häufigkeit von ungefähr 10% festgestellt Mittels dem zuerst angegebenen Isolierungsverfahren wurden aus den Eluaten mit der größeren Häufigkeit an positiven Reaktionen die Phagen, welche trp A-Gene enthielten, isoliert

Schließlich wurden die Phagen, welche beim Antikörper-Screening positive Reaktionen ergaben, auf die Anwesenheit von trp Α-Genen untersucht, wobei ihre Fähigkeit geprüft wurde, geeignete E.coli trp A^--AuXO-trophe zu überführen, ferner wurde die Anwesenheit von trp A (durch das oben beschriebene Prüfverfahren für trp A) in der überstehenden Flüssigkeit als Folge einer Lyse geeigneter E.coli tro A--Mutanten geprüft.

Beispiele 2 und 3 (nachgereicht)

Es wurde das Verfahren des Beispiels 1 wiederholt, wobei die E.».j!i-Stämme KYMeI und C600 als Wirtszellen für die Transfektion verwendet wurden.

Wesentliche Erfordernisse sind, daß das Plasmid zur Reproduktion und zur Beeinflussung des Wirtsorganismus fähig ist; die Plasmid-DNA muß in die Wirtszelle in deren biologisch aktiver Form einführbar sein; bevorzugt weist die Plasmid-DNA nicht mehr als 3 und besonders bevorzugt lediglich nur 1 spaltungsfähiges Zentrum gegenüber einem Beschränkungsenzym des Typs 2 auf; das hier interessierende Gen weist kein Spaltungszentrum für die verwendete Endonuklease auf, oder ein solches Zentrum kann spezifisch geschützt werden; der Einbau in das Plasmid- oder Bakteriengenom schließt die Wirkung des besonders interessierenden Gens nicht aus und das von dem fremden Gen, das in das Plasmid eingebaut werden soll, produzierte Polypeptid kann bereits bei sehr niedrigem Konzentrationsniveau durch das verwendete Screeningverfahren bestimmt werden. Diese Erfordernisse sind einem Fachmann durchaus geläufig.

Zu den Anwendungsbeispielen der Erfindung gehört die Herstellung von Polypeptiden und Proteinen, die in Säugetieren vorkommen, ferner die Herstellung »fremder« Enzyme durch Bakterien, weiterhin die Herstellung sekundärer Metaboliten, beispielsweise vcn Glukoseisomerase, und ferner die Herstellung von Verbindungen wie etwa Zitronensäure und Cephalosporin über modifizierte Pilzgewebe.

Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur genetischen Modifizierung von Mikroorganismen mit fremdem genetischen Material, dadurch gekennzeichnet, daß Rezeptor-DNA-Material zerteilt wird, die bei dieser Behandlung anfallenden DNA-Fragmente mit Donor-DNA-Fragmenten vermischt werden, welche durch Zerteilung von unterschiedlichem DNA-Material unter Anwendung gleichartiger Maßnahmen zur Zerteilung von DNA angefallen sind, das Gemisch dieser DNA-Fragmente willkürlich zu Hybrid-DNA-Moiekülen verschmolzen wird, und geeignete sensitive Mikroorganismuszellen mit diesen Hybrid-DNA-Molekülen infiziert werden, daß die infizierten Mikroorganismuczellen ihrem Metabolismus unterworfen werden, die dabe< resultierenden Kulturen in Fraktionen zerlegt werden, und spezifische Metaboliten durch Immuno-Screening festgestellt werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Rezeptor-DNA Bakteriophagen-DNA verwendet wird.

3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Donor-DNA Säugetier-DNA verwendet wird.