CH621147A5 - Process for obtaining a cell culture which produces a desired polypeptide by genetic modification of microorganisms - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Gewinnung einer Zellkultur, die ein gewünschtes Polypeptid produziert, durch genetische Modifikation von Mikroorganismen. Zum Stande der Technik sei verwiesen auf das Journal of Bacteriology 1969 S. 637-650: «current topics in microbiology and immunology» 1973 S. 61-88: US-Patente 3 853 467 und 3 905 767.

Das erfindungsgemässe Verfahren ist gekennzeichnet durch die folgenden Verfahrensschritte a) Aufspalten von Molekülen eines DNA-Rezeptor-Materials erhalten aus einem Plasmid, das geeignet ist zur Infizierung der Zellen des genannten Mikroorganismus, durch Behandeln des Plasmids-DNA mit einer Endonuklease,

b) Aufspalten eines anderen DNA-Donor enthaltenden genetischen Materials, Kodieren für die Synthese eines gewünschten Polypeptids unter Verwendung einer ähnlichen Endonuklease, wobei DNA-Fragmente erhalten werden, deren Enden verträglich sind mit denen, die gemäss a) erhalten wurden,

c) Mischen der DNA-Fragmente, die aus den verschiedenen Quellen erhalten wurden, wodurch ein dem Zufall über-lassenes Zusammenrücken der DNA-Fragmente unter den

Einfluss einer DNA-Ligase erfolgt, wobei Hybrid DNA-Moleküle erhalten werden, die die vereinigten Fragmente aus beiden DNA-Quellen enthalten,

d) Infizieren der zu modifizierenden Zellen des Mikroorganismus durch Kontaktieren mit den Hybrid DNA-Molekülen,

e) den infizierten Mikroorganismus metabolisieren lassen in Gegenwart eines Substrats, das geeignet ist, um in das gewünschte Polypeptid überführt zu werden, und f) Screening zur Produktion des gewünschten Polypeptids und Herstellung einer Zellkultur, die das Polypeptid produziert.

Die vorliegende Erfindung bezieht sich somit auf die genetische Modifikation eines Mikroorganismus — d.h. ein Organismus, der im allgemeinen dadurch gekennzeichnet ist,

dass die einzelnen Zellen nicht in einem Gewebe organisiert sind — durch die Einführung von fremdem genetischen Material in der Weise, dass der Mikroorganismus Polypeptide und/oder Proteine synthetisiert, die entweder ganz der genetischen Information des fremden genetischen Materials entsprechen oder teilweise der genetischen Information des fremden genetischen Materials und derjenigen des dem Mikroorganismus zugehörigen genetischen Materials entsprechen.

In der vorliegenden Beschreibung soll zur Bezeichnung des genetischen Materials (d.h. das Material bei dessen Replika-tion die genetische Information bei der Fortpflanzung des Organismus von einer Generation auf die nächste übertragen wird) der Ausdruck «DNA» verwendet werden, da Desoxyribonukleinsäure der wichtigste Vertreter der genannten Materialien darstellt. Üblicherweise ist unter DNA, welches das allgemeinere genetische Material darstellt, auch RNA einzu-schliessen. Die vorliegende Erfindung bezieht sich daher auch auf die genetische Modifikation von Organismen, in denen RNA das genetische Material darstellt; Inverse Transkription, zur Erlangung einer DNA-Kopie der RNA kann Anwendung des erfindungsgemässen Verfahrens auf solche Organismen erleichtern.

Die Spaltung von doppelstrangiger DNA kann durch bestimmte Enzyme, die im allgemeinen als Endonukleasen bezeichnet werden, erfolgen; der Wirkungsmechanismus einiger dieser Endonukleasen scheint darin zu bestehen, dass diese spezifische Nukleotid-Sequenzen auf der DNA-Doppelhelix «erkennen und spalten».

Für die vorliegende Beschreibung können diese Endonuklease je nach dem Typ der Spaltung klassifiziert werden in i) Endonukleasen, die beide Stränge der DNA-Doppelhelix an genau gegenüberliegenden Stellen spalten (Fig. 1A),

ii) Endonukleasen, die gestaffelte Spaltungen der beiden komplementären DNA-Stränge bewirken (d.h. auf der Dop-pelhelix einander nicht gegenüberliegende Stellen) (Fig. 1B). Durch die Spaltung mit Hilfe von Endonukleasen der Klasse ii), erhält man DNA-Fragmente mit zwei verschiedenen aber komplementären einzelstrangigen Enden, d.h. entsprechend der Wechselwirkung der Nukleotide untereinander werden solche einzelstrangige Enden eine Affinität zueinander und eine Tendenz zur spezifischen Anlagerung an den entsprechenden komplementären Partner aufweisen (Fig. 2). Bei der Behandlung der beiden verschiedenen DNA-Präparationen (Rezeptor- bzw. Donor-Material) mit derselben Endonuklease der Klasse ii) und nach Extraktion oder Inaktivieren der Endonuklease, erhält man nach Mischen der beiden auf diese Weise erhaltenen DNA-Fraktions-Präparate zufällige, aber komplementäre Anlagerung von entsprechenden einzelstrangigen Enden der DNA-Fragmente entweder aus den beiden verschiedenen Präparaten oder Anlagerungen von Fragmenten desselben Präparats. Entsprechend den heute gültigen Hypothesen ist die Stabilität der auf diese Weise erhaltenen Fragmente primär abhängig von der Stärke der Wasserstoff-

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Bindungen zwischen den komplementären Basen in den Einzelsträngen der beiden Fragmente. Die beiden Fragmente können jedoch auch kovalent durch die Wirkung bestimmter Enzyme, die als DNA-Ligasen bekannt sind aneinander gebunden werden, wodurch eine stärkere Bindung erhalten wird.

Zusätzlich zu der DNA, die das genetische Kern-Material der lebenden Zelle darstellt, findet man auch eine grosse Gruppe von extranuklearen DNA-Molekülen, die im allgemeinen als «Plasmide» bezeichnet werden und die zur autonomen Selbstreplikation befähigt sind. In ihrer biologisch aktiven replizierbaren Form manifestieren sich jedoch diese DNA-Moleküle nur wenn sie sich in einem sensitiven Wirtsorganismus oder einem geeigneten in vitro-System befinden, wobei eine Produktion von Tochter-Plasmid-DNA-Molekülen erfolgt und entsprechende Bildung von Polypeptiden und/ oder Proteinen, entsprechend der genetischen Information der Plasmid-DNA. Typische Plasmide sind Bakteriophagen-DNA, Resistenzfaktoren und colicinogene Faktoren. Das erfindungs-gemässe Verfahren bezieht sich im besonderen auf die Verwendung von Bakteriophagen.

Viele Plasmide sind befähigt in einer Wirtszelle die verschiedensten Zustände einzunehmen, z.B. kann der E. coli-Geschlechtsfaktor «F» entweder als selbstreplizierendes DNA-Molekül in der Wirtszelle oder integriert in die Kern-DNA der Wirtszelle vorliegen. Bakteriophagen-(X)-DNA kann auch in integrierter «lysogener» Form vorliegen, wenn die Aktivitäten des Phagen «schlafend» sind, kann jedoch aus diesem Zustand in eine aktive selbstreplizierende Form übergeführt werden, die in der Synthese von Phagenpartikeln (DNA + Proteinhülle) und eventueller Lyse der Wirtszelle und Freisetzen des Tochterphagen resultiert.

Sowohl natürlich vorkommende als auch derivierte Plas-mid-DNA-Moleküle konnten identifiziert werden, die durch die Wirkung einer spezifischen Endonuklease an einer ganz bestimmten Stelle gespalten werden konnten. Beispiele für solche Endonukleasen sind Restriktionsenzyme, z.B. «Eco RI» und «Hind III». Die Behandlung von DNA-Molekülen mit einer spaltbaren Region auf dem Molekül durch z.B. Eco Rl-Enzym, resultiert in der Bildung von zwei linearen Rl-«kohesiven» Enden, die wieder zum ursprünglichen Molekül aneinander gelagert werden können, oder die an ein anderes DNA-Fragment mit entsprechenden komplementären kohesi-ven Enden, das ebenfalls durch Rl-Behandlung gebildet wurde, angelagert werden können. Fig. 3 illustriert die oben beschriebene Operation, in der ungleiche DNA-Moleküle, die beide Rl-Erkennungsregionen aufweisen, durch Rl-Behandlung gespalten werden, zusammengebracht und wieder an-einandergelagert werden, und mit einem DNA-Ligase-En-zym behandelt werden, wodurch eine Bildung von Hybrid--DNA-Molekülen erfolgt. Hind III zeigt eine entsprechende spezifische Wirkung.

Das Schema in Fig. 3 beschreibt die Produktion von hybrider Plasmid/nicht-Plasmid DNA, auf die gleiche Weise können jedoch auch andere Kombinationen Zustandekommen. Im besonderen illustriert das obengenannte Schema wie die genetische Information des Plasmiden durch Einbauen von nicht-plasmider DNA in das Plasmid-DNA-Molekül verändert werden kann. Die Infizierung einer Wirtszelle mit der Hybriden Plasmid-DNA resultiert in der Produktion von weiterer hybrider DNA und von Polypeptiden und/oder Proteinen, entsprechend der genetischen Information der genannten hybriden DNA.

Selbstverständlich wird die auf diese Weise produzierte hybride DNA ganz zufällig zusammengesetzt sein und es ist demzufolge nötig zur Erzielung einer gewünschten DNA-Zusammensetzung, wie sie für Replikation und Fortpflanzung gebraucht wird, ein entsprechendes Screening angewendet werden muss.

Die Isolation von Plasmid-DNA-Molekülen, in denen ein bestimmtes fremdes Rl-Fragment inkorporiert ist, kann auf verschiedene Art und Weise erfolgen. So können die Rl-be-handelten «Donor»-DNA-Fragmente unter Verwendung von z.B. Acrylamid oder Agarose-Gel-Elektrophorese abgetrennt werden. Diese Fraktionen können anschliessend in getrennten Intégrations- und Transfektionsexperimenten verwendet werden. Andererseits kann CsCl-Dichtegradient-Zentrifugation zur Fraktionierung von Phagen-Partikeln, enthaltend verschiedene Anteile von fremder DNA, angewendet werden. Die auf diese Weise erhaltenen Fraktionen können anschliessend in getrennten Infektions-Experimenten verwendet werden.

Zur Erzielung einer besonders bevorzugten DNA-Zusammensetzung, durch Behandlung des durch DNA infizierten geeigneten Wirtes, gelangt für das erfindungsgemässe Verfahren vorzugsweise eine Methode zur Anwendung, die «Immuno screening» genannt wird. Diese Methode basiert nicht auf der Extraktion und Identifizierung eines spezifischen DNA-Materials, sondern auf der Identifizierung des gewünschten Produkts der Hybridisierungstechnik. So ist z.B. wenn durch die Hybridisierung ein bestimmtes Plasmid-Hy-brid-Molekül gewonnen werden soll, das in einem Bakterium die Synthese eines spezifischen Polypeptids, z.B. Insulin, induziert, das genannte Screening auf dieses spezifische Polypeptid bezogen.

Obschon wir die Verwendung einer Konzentrations- oder Separationsmethode (wobei die angegebenen Beispiele natürlich keinen exklusiven Charakter haben) gefolgt von Immuno Screening beschreiben, wird jedoch diese Sequenz nur aus praktischen Erwägungen angewendet (jede einzelne aus einer Anzahl von Fraktionen wird auf Aktivität vor dem Verdünnen getestet, Screening der verdünnten Fraktionen zeigt deren Aktivität) und je nach Wunsch kann die ganze Hybrid-Plas-mid-Population ohne vorgängige Fraktionierung einem Screening unterworfen werden.

Unter Immuno Screening verstehen wir die Anwendung auf Mikroorganismen, die entweder aktiv einen Metabolismus eingehen oder auf deren Spaltprodukte, eines spezifischen Antikörpers für einen bestimmten Metaboliten des Organismus (normalerweise ein Polypeptid oder ein Protein) und die Lokalisierung von zurückgehaltenem Antikörper, der die Gegenwart des Metaboliten anzeigt.

Das erfindungsgemässe Verfahren besteht im besonderen darin, dass in einem ersten Reaktionsschritt ein Rezeptor-DNA-Material gespalten wird, worauf die so erhaltenen Fragmente des DNA-Materials in Mischung mit «Donors>-DNA-Fragmenten, die durch Spaltung eines anderen DNA-Mate-rials in derselben Weise, gebracht werden, wodurch eine zufällige Anlagerung der Einzel-DNA-Fragmente erfolgt, so dass «Hybrid»-DNA-Moleküle erhalten werden, worauf mit den so erhaltenen Hybrid-DNA-Molekülen geeignete sensitive Wirtszellen infiziert werden, wodurch diese infizierten Wirtszellen einen Metabolismus eingehen, und worauf bestimmte Metaboliten durch Immuno Screening festgestellt werden, und worauf durch Replikation der Wirtszellen und/oder der entsprechenden DNA der gewünschte Metabolit hergestellt werden kann.

Wenn eine «aktive» Fraktion festgestellt wird, kann diese durch Refraktionieren und Wiedertesten aufgearbeitet werden, bis ein reiner Stamm z.B. von Phagen, erhalten wird, der das gewünschte «fremde» hybride genetische Material trägt.

Das Zusammenbringen der ausgewählten reinen Fraktion von Hybrid-DNA in eine Wirtszelle wird in der Produktion von Tochter-Hybrid-DNA und den Polypeptiden/Proteinen, entsprechend der genetischen Information dieser DNA, resultieren.

Das erfindungsgemässe Verfahren soll durch die folgende Beispiele näher erläutert werden.

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Beispiel 1

Synthese, Nachweis und Isolierung eines A-Phagen, enthaltend das Gen für E coli trp A Polypeptid.

1. Herstellung von Restriktions-Enzym Hind III.

Hämophilus-Influenzae-Zellen werden in einem Gehirn-

Herz-Nährmedium, angereichert mit 10 |ig Hämin/ml und 2 [ig NAD/ml, auf ein E 550 von 0,7 produziert, durch Zen-trifugation zerkleinert, einmal gewaschen und in 0,002 vol. in 0,05 M Tris (pH 7,4), 0,001 M Glutathion resuspendiert. Die Zellen werden durch Ultraschallbehandlung bei 4°C zertrümmert und während 30 min bei 100,000 g zentrifugiert und das überstehende in 1 M NaCl gegeben; diese Lösung wurde anschliessend auf eine 2,5 x 49 cm Bio-Gel A 0,5 M (200-400 Mesh)-Kolonne gegeben, mit 10 vol. von 1 M NaCl, 0,02 M Tris HCl (pH 7,4), 0,01 M Mercaptoäthanol vorgewaschen. Die Elution erfolgte mit 1,2 ml/min unter Verwendung des genannten Puffers und 6 ml Fraktionen wurden gesammelt. Die Fraktionen 18-27 wurden zusammengegeben und mit 2 vol. von 0,02 M Tris, pH 7,4 verdünnt. Anschliessend erfolgte eine langsame Zugabe von Ammoniumsulfat bis zu 50%-Sättigung und der entstandene Niederschlag wurde ab-zentrifugiert. Die überstehende Lösung wurde einer weiteren Präzipitation unterworfen, wobei ein 50-60%-Präzipitat und anschliessend einer weiteren Präzipitation, wobei ein 60-70%-Präzipitat erhalten wurde. Die Niederschläge wurden zusammen gegeben und in 0,1 vol. von 0,05 M NaCl, 0,02 M Tris HCl (pH 7,4), 0,001 M Mercaptoäthanol gelöst und gegen denselben Puffer dialysiert. (Alle Operationen erfolgten bei 4°C).

Eine Phosphocellulose-Kolonne (Whatman P. 11), 0,5 cm x 9,5 cm wurde mit 100 ml 0,01 H Kaliumphosphatpuffer (pH 7,4) äquilibriert. Die wiederaufgelösten Niederschläge wurden mit 9 vol. des genannten Puffers verdünnt und in einer Rate von 5 ml/h auf die Kolonne gegeben. Das Protein wurde anschliessend schrittweise mit 5 ml-Portionen von 0,01 M Kaliumphosphatpuffer (pH 7,4), enthaltend immer grössere Anteile von KCl, eluiert. Das bei 0,3 M eluierte Protein wurde bei 75 % Sättigung mit Ammoniumsulfat gefällt und in 10 mM Kaliumphosphat (pH 6,8) wiederaufgelöst. 6 Ab-soiptionseinheiten bei 280 nm wurden auf eine Hydroxyl-apatit-KoIonne (1x10 cm) gegeben. Die Elution erfolgte mit einem linearen Gradienten von 160 ml je von 10 mM und 400 mM Kaliumphosphat (pH 6,8). Die Fraktionen 79-85 (bei ca. 0,25 M Phosphat) wurden als Hind III-Restriktions-enzym-Präparat verwendet.

2. Herstellung von Restriktionsenzym R1

Ein Stamm von E coli, enthaltend einen R-Faktor, bestimmend für das Rl-Restriktions-Enzym wurde in 10 L von L-Nährmedium auf ein E 550 von 1,0 gezüchtet. Die Zellen wurden anschliessend durch Zentrifugation bei 4°C zerkleinert, in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei — 20°C aufbewahrt.

100 g der gefrorenen Zellen wurden durch Ultraschall in 200 ml eines Extraktionspuffers (0,01 M KH2P04 pH 7,0; 0,001 M EDTA; 0,007 M 2-Mercaptoäthanol) während total 12 min zerkleinert. (MSE Atomix, volle Leistung in Schüben von 45 sec mit jeweils 30 sec Abkühlen). Die überstehende Lösung wurde anschliessend bei 35.000 rpm (MSE 8 x 50-Rotor) während 1 h bei 4°C zentrifugiert. Zur überstehenden Lösung wurde langsam und unter ständigem Rühren 100 ml von 5 % w/v-Streptomycin-sulfat in Extrakt-Puffer gegeben. Nach 15 min Umrühren wurde der erhaltene Niederschlag durch Zentrifugation abgetrennt und langsam Ammoniumsulfat bis zu 50%-Sättigung zur überstehenden Lösung gegeben. Nach 30 min Rühren wurde der Niederschlag durch Zentrifugation abgetrennt (10.000 rmp; 10 min; 4°C), in 45 ml von Extraktions-Puffer gelöst und gegen 4 Chargen in 48 h von Extraktionspuffer dialysiert. Eine 4 M NaCl-Lösung wurde anschliessend zu der dialysierten Ammoniumsulfat-Fraktion gegeben, wobei eine Endkonzentration von 0,35 M NaCl erhalten wurde, und worauf die Lösung (mit einer Durchflussrate von 40 ml pro h) auf eine Phosphocellulose-Pll-Kolonne (15 cm x 3 cm), die durch H+- und OH--Zyklen ° gewaschen und mit 0,35 M NaCl in Extraktionspuffer äquilibriert wurde, gegeben, worauf mit einem linearen Gradienten (0,35-0,8 M) von NaCl in Extraktionspuffer eluiert wurde. 10 ml/Fraktionen wurden gesammelt und aktive Fraktionen bei ca. 0,5 M NaCl wurden kombiniert und gegen Extraktionspuffer dialysiert, und anschliessend mit einer Durchflussrate von 20 ml/h auf eine DEAE-Cellulose-DE52-Kolonne (5 cm x 1 cm), die mit Extraktionspuffer äquilibriert wurde, gegeben. Die Kolonne wurde mit 0,15 M NaCl in Extrak-tionspuffer gewaschen und mit einem linearen Gradienten (0,15-0,50 M) von NaCl in Extraktionspuffer mit einer Durchflussrate von 10 ml/h eluiert. 4 ml-Fraktionen wurden gesammelt und aktive Fraktionen bei ca. 0,3 M NaCl wurden zusammen gegeben und gegen Extraktionspuffer dialysiert. Das Enzym wurde konzentriert durch Absorption auf einer kleinen DE52-Kolonne (2x1 cm), die mit Extraktionspuffer äquilibriert worden war, und mit 3 ml von 0,5 M NaCl eluiert. Das erhaltene Eluat wurde als Rl-Enzym-Prä-parat verwendet.

3. Herstellung von A-Phagen-DNA

1,5 Liter einer Kultur von sensitiven E coli-Wirtszellen in L-Nährmedium und in exponentieller Wachstumphase (OD 550 = 0,5) wurden mit X-Phagen bei einer Infektions-multiplizität (m.o.i) von 1,0 infiziert. Anschliessend erfolgte eine Inkubation bei 37°C unter kräftigem Schütteln.

Nachdem Lyse eingetreten war, wurden die Kulturen mit Chloroform während 10 min geschüttelt (1 ml Chloroform pro 10 ml Kultur), anschliessend in 500 ml Polypropylen in Zentrifugenflaschen verteilt und bei 4°C während 20 min und bei 7000 rpm zentrifugiert. Die die Phagen enthaltende überstehende Lösung wurde abdekantiert und während 2 h in einer präparativen L2-UItrazentrifuge (Beckman) bei 10°C und 18.000 rpm (Rotor 19) zentrifugiert.

Die überstehende Lösung wurde abgegossen und der Rückstand zurückbehalten. Zu jeder der Zentrifugenflaschen wurden 1,5 ml 10 mM Trishydroxymethylaminomethan- (Tris)/ HCl, 10 mM MgS04-Puffer, pH 7,2, gegeben, in denen der Rückstand durch milde Homogenisierung nach Stehen über Nacht bei 4°C resuspendiert wurde. Die Flaschen wurden mit zwei Portionen von je 0,5 ml 10 mM Tris/MgS04-Puffer gewaschen.

Die Phagensuspension wurde in einem 15 ml-Zentrifugen-rohr gesammelt und während 15 min bei 7000 rpm und 10°C zentrifugiert (Rotor JA20, Beckman J21-Zentrifuge) um zurückbleibendes bakterielles Material zu entfernen.

Wasser und Caesiumchlorid-Kristalle wurden zu der die Phagen enthaltenden überstehenden Lösung gegeben um eine totale Menge von 12 ml mit der Refraktivität von 8° 10' zu erhalten. Die Suspension wurde anschliessend in 3 Cellulose-nitrat-Rohre Q4 x 2") gegeben und mit 1 ml Paraffinöl bis zum oberen Rand jedes der drei Rohre bedeckt.

Die Suspension enthaltend Caesiumchlorid und die Phagen wurde bei 30.000 rpm während 22 h bei 10°C in einem SW50-Rotor in der Beckman L2-UItrazentrifuge zentrifugiert. Anschliessend wurden die Zentrifugenrohre an ihrem unteren Ende punktiert und die sichtbare Phagen-Bande wurde durch tropfenweise Fraktionierung des CsCl-Gradienten gesammelt. Die Phagen wurden in ein kleines Gefäss mit Schraubver-schluss gegeben und bei 4°C aufbewahrt. Die Absorption (OD 260) wurde in 20 {il einer 1:10 verdünnten Probe der Phagensuspension in einer 1 mm Quartzmikrozelle gemessen. 20 OD 260-Einheiten (berechnet für unverdünnte Phagen in einem 1 cm Lichtweg) der Phagen wurden über Nacht gegen

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drei Chargen von 10 mM Kaliumphosphat-Puffer (KPB) bei pH 7,4 und bei 4°C dialysiert.

Die dialysierten Proben (ca. 1 ml) wurden in ein 15 ml Corex-Zentrifugenrohr gegeben, 10 [il von 25 % Natrium-dodecylsulfat (SDS) wurden zugegeben und die Lösung während 3 min auf 60°C erhitzt. Die durch die Phagen verursachte Opaleszenz verschwand und die Lösung wurde klar. Das Rohr wurde anschliessend in Eiswasser abgekühlt.

Ein Volumen Phenol, gesättigt mit 0,1 M KPB, vorgekühlt auf Eis, wurden in das Rohr gegeben und dessen Inhalt durch Umstülpen bei Raumtemperatur während 1 min vermischt, und anschliessend während 10 min bei 7.500 rpm und bei 5°C zentrifugiert.

Die untere phenolische Phase wurde abpipettiert und verworfen und die Phenol-Extraktion zweimal wiederholt. Die überstehende wässrige Lösung wurde anschliessend langsam in einen Dialysierschlauch gegeben. Anschliessend erfolgte Dialyse gegenüber drei Chargen von 10 mM Tris HCl/10 mM MgCl, während 24 h. Das erhaltene Produkt wurde als Phagen-DNA-Präparat eingesetzt.

Rezeptor-Phagen-DNA

Die hergestellte Phagen-DNA, die als Rezeptor A verwendet wurde, war diejenige eines Derivates von X-Phagen, in welchen Teile des normalen Komplements der X-Phagen-Chromosomen entfernt worden waren (ca. 20% total). Zusätzlich wies die Phagen-DNA nur eine Region auf, wie sich durch Hind III-Enzym gespalten werden kann (Region 3).

Die essentiellen Eigenschaften des Phagen können wie folgt zusammengefasst werden:

h\ RI 1-2V , Hind III 3+, N21 i21, nin.

Das verwendete Wirtsbakterium zur Herstellung von X-Phagen A war E coli-Stamm C600.

Die zur Verwendung als Rezeptor B hergestellte Phagen-DNA, war diejenige eines Derivats von X-Phagen, in welchen Teile des normalen Komplements des Genoms entfernt worden war (ca. 15 % total). Diese Phagen wiesen zwei Spaltregionen zur Spaltung durch Eco Rl-Restriktions-Enzym auf. Die Entfernung des Fragments zwischen den beiden Spaltungsregionen durch Rl-Behandlung vergrössert die Kapazität des Rezeptors zur Einführung von DNA.

Die essentiellen Eigenschaften dieses Phagen können wie folgt zusammengefasst werden:

h\ RI 1-2V , R13+, nin.

Das für die Herstellung von Phagen B verwendete Wirtsbakterium war E coli KY Mei.

Donor-Phagen-DNA

Die als Donor-Phagen-DNA hergestellte Phagen-DNA, war diejenige eines Derivates von X, enthaltend die Gene für die Tryptophan-synthetisierenden Enzyme (das trp-Operon) von E coli. Essentielle Eigenschaften:

h80, i1, trp+

Als Wirtsbakterium zur Herstellung von Donor-Phagen-DNA wurde E coli KY Mei verwendet.

4. Herstellung von E coli-DNA

Zellen des prototrophen Stammes W1485 von E coli, gezüchtet in L-Nährmedium, wurden zertrümmert und in 100 mM Tris-HCl (pH 8,0), 10 mM EDTA wieder suspendiert bis zu einer Zellkonzentration von 2 x 199/ml. Lysozym wurde zugegeben bis zu einer Konzentration von 100 (ig/ml und die Mischung bei 37°C während 5 min inkubiert.

Natriumdodecylsulfat wurde bis zu 0,5% w/v gefolgt von Proteinase K von 50 |xg/ml wurden zugegeben und das ganze unter milden Umschütteln bei 37°C über Nacht inkubiert. Das Gemisch wurde anschliessend mit einem gleichen Volumen von kaltem Phenol behandelt, gesättigt mit Puffer (500 mM Tris HCl pH 8,0; 10 mM EDTA; 10 mM NaCl; 0,5% w/v SDS) und während 10 min bei Raumtemperatur mit 60 rpm gerollt. Das Gemisch wurde anschliessend auf 7°C

abgekühlt und während 10 min bei 500 g zentrifugiert. Die viskose wässrige Phase wurde mit einer Pipette abgetrennt und die Phenol-Behandlung wiederholt. Die wässrige Phase wurde anschliessend in einen Dialysierschlauch gegeben, der vorgängig während 20 min in 64% ZnCl2 getaucht und anschliessend in 0,1 M HCl, und in 5 mM EDTA gewaschen worden war. Die Dialyse erfolgte gegen 50 mM Tris HCl (pH 8,0) 10 mM EDTA, 10 mM NaCl (Puffer C) in einem 1 Liter Messzylinder bei Raumtemperatur, bis die Absorption bei 270 nm ausserhalb des Dialysierschlauches weniger als 0,05 Einheiten betrug.

Die Lösung wurde anschliessend in einen unbehandelten Dialysierschlauch gegeben und RNA-Ase A (Endkonzentration 50 ng/ml) und RNA-Ase T (Endkonzentration 2 (ig/ml) wurden zugegeben. Dieses Gemisch wurde während 4 h bei 37°C gegen Puffer C dialysiert.

Die DNA-Lösung wurde in einen weiteren unbehandelten Dialysierschlauch gegeben und SDS bis zu 0,5 % w/v und Proteinase K bis zu 50 [ig/ml wurden zugegeben; diese Mischung wurde bei 37°C gegen Puffer C über Nacht dialysiert.

Anschliessend erfolgten zwei weitere Phenol-Extraktio-nen. Die wässrige Phase wurde schliesslich in einen vorbehandelten Dialysierschlauch gegeben und gegen 10 mM Tris HCl (pH 7,5), 10 mM NaCl während 1 h bei Raumtemperatur und anschliessend bei 4°C während 4 Tagen dialysiert.

Dieses Produkt wurde anschliessend als Donor-E coli-DNA-Präparat verwendet.

5. DNA-Restriktion

DNA für die Restriktion und das Restriktions-Enzym wurden in dem Verhältnis 1 [ig DNA: 1 [il Enzym in 10 mM Tris HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl2,10 mM 2-Mercaptoätha-nol, 50 mM NaCl, gemischt. Das Gemisch wurde während 45 min bei 37°C inkubiert, worauf während 10 min auf 70°C erhitzt wurde.

6. DNA-Ligation

5 ]J,1 T4 Polynukleotid-Ligase (Miles Laboratories) wurden mit 495 [il Ligase-Puffer gemischt, der gleiche Volumenanteile von 616 mM Tris HCl (pH 7,5), 93 mM MgCl2, 560 mM NaCl, 93 mM Dithiothreitol, 0,933 mM ATP, 9,33 mM EDTA, 0,93 mg/ml Rinderserumalbumin enthielt.

4 [ig Restriktions-Rezeptor-Phagen, hergestellt wie in 5. beschrieben wurden während 10 min auf 70°C erhitzt und anschliessend rasch auf Eis gekühlt. Das Produkt wurde mit 8 [ig Restriktions-Donor-DNA, hergestellt wie in 3. oder 4. beschrieben gemischt, das Gemisch während 15 min auf 30°C erhitzt und während 24 h bei 0°C aufbewahrt. Anschliessend wurde das Gemisch zu Ligase-Puffer gegeben und bei 10°C während 6 h inkubiert und anschliessend bei 0°C während 6 Tagen stehen gelassen. Nach dieser Zeit wurden die Gemische in den Transfektions-Experimenten verwendet.

7. Transfektion

0,1 ml einer eintägigen Kultur von E coli-Wirtszellen auf L-Nährmedium wurden in 10 ml P-Medium inokuliert und über Nacht gezüchtet. 2 ml dieser Kultur wurden zu 25 ml frischem Medium gegeben und bis zu einem E 550 von 0,6 gezüchtet. Die Zellen wurden anschliessend auf Eis während 10 min abgekühlt, durch Zentrifugation zertrümmert und in 0,5 Volumenteilen von 0,1 M CaCl2 wiedersuspendiert. Nach 20 min auf Eis wurden die Zellen ein zweites Mal zertrümmert und in 0,1 Volumenteilen von CaCl2 wiedersuspendiert. Nach weiteren 20 min auf Eis wurden die Zellen zur Transfektion verwendet.

Die DNA zur Transfektion wurde in SSC verdünnt auf 3 (ig pro ml und mit den Zellen in einem Verhältnis von 1,0 Volumenteilen DNA: 2,0 Volumenteilen Zellen gemischt. Das Gemisch wurde bei 37°C während 30 sec durch Hitze schockbehandelt und während weiteren 2 h auf Eis gehalten, bevor es auf 0,6% weichen Agar, enthaltend 10~3M MgS04

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in L-Agar-Schalen geschichtet wurde. Die Schalen wurden über Nacht bei 37°C inkubiert und am folgenden Tag durch Überschichten mit 4 ml von L-Nährmedium und Stehenlassen bei 4°C über Nacht, eluiert. Die Eluate wurden zerkleinert, mit 0,5 ml Chloroform geschüttelt und bei 4°C aufbewahrt.

P Medium

25 ml P-Medium-Puffer; 0,02 M Kaliumphosphat (pH 7,0), 0,015 M(NH4)2S04 0,25 ml 0,1 M MgS04 0,43 ml IO-* M Feso4 0,125 ml 20% Glukose 0,1 ml 20% Säure hydrolysiertes Casein + L-Tryptophan, 50 [ig/ml Endkonzentration.

SSC 8,76 g/1 NaCl

4,41 g/I tri Na-Citrat (pH 7,0)

L-Medium Pro Liter: Difco Bacto Trypton, 10 g;

Difco Bacto Hefe Extrakt, 5 g;

NaCl, 5 g;

Glucose 1 g.

pH auf 7,2

L-Agar L-Medium + Difco Bacto Agar auf 15 g/1

Weicher Agar L-Medium + Difco Bacto Agar auf 6,5 g/1.

Wirtsbakterium

Das im Transfektions-Experiment verwendete Wirtsbakterium E coli war ein Derivat von E coli Stamm W3110, bei dem ein funktionelles Tryptophan-Operon fehlte und das auch kein funktionelles Tryptophan-Regulationsgen aufwies, der folgenden Zusammensetzung:

trp R-, trp A-EV

In anderen Experimenten wurden trp_-Derivate von E coli Stämme KY Mei und C600 als Wirtszellen für die Transfektion verwendet.

8. Herstellung der Agar-Schichten

100 Iii des Phagen-Eluats jeder Transfektions-Schicht und 100 [il eines geeigneten Indikator-Bakteriums (E coli W3110, trp R-, trp A-EV ) wurden gemischt. Zu jedem Gemisch wurden 4 ml Weichter Agar bei 46°C zugegeben und die Inhalte sofort in Petrischalen (7,5 cm Durchmesser) gegossen. Durch leichtes Bewegen der Schale wurde erreicht, dass die ganze Fläche durch das Agar bedeckt war. Anschliessend wurden die Schalen über Nacht bei 37°C inkubiert.

Anschliessend an die Inkubation wurden die Schichten beobachtet und die ungefähre Anzahl von infizierten Stellen darauf festgehalten. Diese Anzahl variierte entsprechend dem Transfektions-Gemisch von einigen bis zu unzählbar vielen. Unter Verwendung eines kleinen Spatels wurden die Ränder des Agar-Gemisches vorsichtig vom Rand der Schale gelöst, ein Filterpapier, dessen Grösse dem Durchmesser der Petrischalen entsprach daraufgelegt und vorsichtig niedergedrückt, um Luftblasen zu entfernen. Falls das Filterpapier nicht vollständig durch die Agarschicht benetzt worden war, wurden einige wenige Tropfen destillierten Wassers zugegeben. Das Filtrierpapier mit der daran haftenden Agarschicht wurde anschliessend vorsichtig aus der Petrischale entfernt. Die Agarschicht wurde anschliessend auf die flache Glasoberfläche einer Scheibe von 10 cm Durchmesser gegeben, wobei darauf geachtet wurde, dass keine Luftblasen entstehen konnten. Die Glasscheiben wurden anschliessend in einem Ofen auf 60°C erhitzt, bis die mit dem Filterpapier versehenen Agar-Schichten getrocknet waren.

Nach Abkühlen der Scheiben auf Raumtemperatur wurden die Filterpapiere mit einigen wenigen Tropfen von destilliertem Wasser benetzt und die Filterpapiere abgeschält, wobei die Agar-Schicht, auf der Glasplatte festgeklebt zurückblieb. Jeder Wasserüberschuss wurde entfernt und das Agar anschliessend in 10 ml Äthanol während 20 min bei Raumtemperatur fixiert. Das Äthanol wurde abgegossen und der Agar mit 10 ml destilliertem Wasser während einiger Sekunden gewaschen. Anschliessend wurde der Agar in einem warmen Luftstrom getrocknet.

Die Stellen auf dem Agar, die das produzierte Antigen (trp A) enthielten wurden unter Verwendung einer doppelten Antikörper-Fluoreszenz-Methode festgestellt [obschon andere Antikörper-Bezeichnungsmethoden geeignet gewesen wären [z.B. Radioaktivität (z.B. I125), Enzym (z.B. Peroxid-ase), Elektronendichte (z.B. Ferritin)], entweder mit einem bezeichneten Antikörper oder mit zwei Antikörpern, wurde der zweite bezeichnet. In der doppelten Antikörper-Methode ist der erste Antikörper (unbezeichnet) spezifisch für das Antigen und ist erhöht in einer Species, während der zweite Antikörper (bezeichnet) in einer weiteren Species erhöht ist und spezifisch ist für den erhöhten Antikörper in der ersten Species].

Herstellung von trp A

Die Herstellung von reinem trp A, zur Verwendung als Immunogen in der Herstellung von Antikörpern gegen trp A erfolgte wie im folgenden beschrieben. 10 ml einer eintägigen Kultur von E coli W3110 (trp R~, trp A am88, Sup III) in L-Nährmedium, wurden zu 1 Liter L-Nährmedium, zusammen mit 10 ml 0,1 M MgS04, gegeben und das Gemisch bei 37°C unter Luftzutritt inkübiert, bis ein E 550 von 0,6 beobachtet werden konnte. 1 x 1012 Phagen-trp Am 1 (trp A-E+, sus Q, NV , nin) wurden anschliessend zugefügt und das Gemisch während weiterer 4 h inkubiert. Die zellulären Abschnitte von Phagen-Produkt wurden durch Zentrifugation zerkleinert (30 min, 4°C, 8000 g) und in kaltem (4°C) 0,1 M Kaliumphosphatpuffer pH 7,0 resuspendiert (1,3 ml/g Feuchtgewicht). Die Zellen wurden durch Ultraschall zerkleinert (4-6 fi, 5 x 20 sec bei 1 min-Intervallen), wobei die Temperatur auf 4°C durch Immersion in Eis gehalten wurde. 100 jil Mercaptoäthanol und 800 {il von IM. MnCl2 wurden zugegeben und die Lösungen gemischt. Die cellulären Rückstände wurden durch Zentrifugation während 1 h bei 4°C entfernt. Der Rückstand wurde verworfen und 0,2 mg Di-natrium-EDTA wurden zu der überstehenden Lösung gegeben, die während 10 min in Eis gerührt wurde. Das pH des Gemisches wurde anschliessend auf 4,5 mit kaltem lMNa-triumacetat (pH 3,8) eingestellt und das Gemisch während weiteren 15 min bei 4°C gerührt. Das Gemisch wurde bei 4000 g während 25 min bei 4°C zentrifugiert, der Rückstand verworfen und festes Ammoniumsulfat zum überstehenden gegeben, bis eine Konzentration von 33 g/100 ml erreicht wurde. Das Gemisch wurde anschliessend während weiterer 20 min bei 4°C gerührt. Anschliessend erfolgte Zentrifugation bei 40.000 g während 20 min bei 4°C, das überstehende wurde verworfen und der Niederschlag resuspendiert und in einem minimalen Volumen von kaltem 0,1 M Kaliumphosphatpuffer pH 7,0 gelöst. Die Lösung wurde gegen 0,05 M Kaliumphosphatpuffer, pH 7,0 bei 4°C während 2 h dialysiert. Der während der Dialyse gebildete Niederschlag wurde durch Zentrifugation (40,000 g, 4°C, 20 min) entfernt.

Die überstehende Lösung wurde auf einer Sephadex G100-Kolonne (2 x 50 cm) mit 0,05 m Kaliumphosphatpuffer pH 7,0 bei 4°C gereinigt und 50 4ml-Fraktionen wurden gesammelt. Das trp A wurde durch Analyse von 50 [il Portionen der Einzelfraktionen ermittelt. Die 50 [il-Portion wurde mit 950 (il des in folgenden genannten Versuchsgemisches gemischt und während 20 min bei 37°C inkubiert. Das Testgemisch bestand aus L-Serin (21 mg/ml, 3 ml) Pyridoxalphos-phat (100 [ig/1 ml), 1 M Tris-hydrochlorid pH 7,8 (1 ml), gesättigtem Natriumchlorid (300 [il), Indol (0,5 [iMole/ml,

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800 ni), Wasser 2,4 ml und «trp B-Lösung» (0,5 ml). Die «trp B-Lösung» wurde hergestellt aus einer eintätigen 2L-Kul-tur (37°C, Luftzufuhr) von E coli W3110 (trp R~, trp Av ) in L-Medium. Die Zellen wurden durch Zentrifugation bei 8000 g während 30 min bei 4°C zertrümmert in 600 ml 0,1 M Kaliumphosphatpuffer pH 7,0 resuspendiert u. mit 8000 g während 30 min bei 4°C wiederzentrifugiert. Die Zellen wurden in 40 ml 0,1 M Kaliumphosphatpuffer pH 7,0, enthaltend Pyridoxalphosphat (8 (ig/ml) (bei 4°C) suspendiert und bei 4-6 |i während 6 x 15 sec mit 1 min-Intervallen mit Ultraschall unter gleichzeitigem Kühlen in Eis behandelt. Die Zellrückstände wurden durch Zentrifugation bei 30.000 g während 30 min bei 4°C entfernt und die überstehende Lösung wurde als «trp B-Lösung» verwendet.

Nach der Inkubation mit dem Testgemisch wurde 1 ml Indol-Reagens (9 g 4-Dimethylamino-benzaldehyd, gelöst in 200 ml Äthanol und gemischt mit 45 ml konzentrierter Salzsäure) zugegeben und das Gemisch bei Raumtemperatur während 20 min stehen gelassen. Eine gelbe Färbung zeigte die Gegenwart von trp A an und eine Rotfärbung die Abwesenheit des genannten.

Die trp A enthaltenden Fraktionen wurden zusammengegeben und 43 g Ammoniumsulfat pro 100 ml zugegeben. Das Gemisch wurde während 20 min bei 4°C gerührt und anschliessend bei 40,000 g während 45 min und bei 4°C zentrifugiert. Die überstehende Lösung wurde verworfen und der Niederschlag in einem kleinen Volumen von 0,5 M Kaliumphosphatpuffer pH 7,0 bei 4°C wiedersuspendiert. Die Lösung wurde über Nacht gegen 0,01 M Kaliumphosphatpuffer pH 7,0 bei 4°C dialysiert.

Der endgültige Reinigungsschritt erfolgte auf einer Säule beschickt mit DEAE-Cellulose (2 x 100 cm), angesetzt in 0,01 M Phosphatpuffer pH 7,0 bei 4°C. Das Dialysat wurde mit 50 ml desselben Puffers auf die Säule gegeben und die Elution erfolgte unter Verwendung eines linearen Gradienten, bestehend aus 600 ml 0,01 M und 600 ml 0,3 M Phosphatpuffer pH 7,0 bei 4°C. Die Fraktionen, die das trp A-Protein enthielten, wurden in derselben Weise wie für die erste Säule ermittelt und zusammen gegeben. Anschliessend erfolgte die Zugabe von 44 g Ammoniumsulfat pro 100 ml und das Gemisch wurde während 15 min gerührt. Das trp A wurde durch Zentrifugation (40,000 g, 45 min, 4°C) gesammelt und der erhaltene Niederschlag in 0,05 M Phosphatpuffer pH 7,0 bei 4°C wiederaufgelöst. Die Lösung wurde über Nacht gegen denselben Puffer dialysiert. Die Proteinkonzentration der Lösung wurde durch die Folin-Reaktion ermittelt und durch Verdünnen mit demselben Puffer auf 1 mg/ml eingestellt. Diese Lösung wurde verwendet zur Immunisierung von Kaninchen zur Produktion von Antiserum gegen trp A.

Anti-trp A

Die Immunisierungs-Methode erfolgte durch Emulgieren von 500 jil der trp A-Lösung mit 1 ml Freud's complete Adjuvant, und subkutane Injektion des Gemisches bei einem Kaninchen an verschiedenen Stellen (mindestens 5). Die Injektionen wurden mit monatlichen Intervallen wiederholt und eine Blutentnahme bei den Tieren erfolgte 10-14 Tage nach jeder Injektion. Das Serum wurde gesammelt und auf Ausfällungszonen untersucht in einem Immuno-Diffusions-System (in 1 % Agar) bei verschiedenen Verdünnungen gegen trp A-Lösungen. Das Antiserum wurde beim Immuno Screening in 1/10 der Verdünnung verwendet, die eine sichtbare Ausfällungszone ergab.

Immuno Screening

500 (il des verdünnten Anti-trp A wurden zu der getrockneten Agar-Schicht gegeben und darauf gleichmässig verteilt. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur während 30 min inkubiert und anschliessend mit Phosphatpuffer-Salzlösung

(0,1 M, pH 7,2, 9 g/L Natriumchlorid) (10 ml, 3x1 min) und Wasser (1 min) gewaschen. Der Agar wurde anschliessend mit Warmluft getrocknet.

500 (il des zweiten Antikörpers (Fluorescein bezeichnetes 5 Anti-Kaninchen-Immunglobulin, stammend vom Schaf, von Wellcome Reagents Limited) [in einer Verdünnung (ca. 1/20) ermittelt in gleichen Experimenten und unter Verwendung von Anti-A-Phagen als ersten Antiserum) wurden anschlies-seng zugegeben, gleichmässig über die Schicht verteilt, und io während 30 min inkubiert. Überschüssiges Antiserum wurde wie vorgängig beschrieben weggewaschen und die Schichten getrocknet.

Vorgängig einer mikroskopischen Untersuchung des Agar wurde dieses mit 1 ml eines Anhebungsmittels (3,16 g Na2C03 15 + 0,6 g NaHC03 in 100 ml Wasser + 43 ml Glycerin) bedeckt. Das Mikroskop war ausgerüstet mit einer Quarz-Halo-gen-Lampe, einem primären Interferenzfilter (Zeiss HP-500) und einem schwach gelben Filter. Die Proben wurden unter Verwendung eines Dunkelfeldkondensators beobachtet. 20 Proben mit positiver Reaktion zeigten eine fluoreszierende grüne Farbe vor einem rot/schwarzen Hintergrund und Proben ohne Reaktion waren schwarz. Positive Reaktionen wurden anfangs beobachtet mit einer Frequenz von ca. 1%.

Isolierung von trp A-Phagen 25 Rezeptor-Phagen A und B enthaltend das trp A-Gen wurden durch zwei Methoden isoliert. Zuerst wurden die Pha-geneluate aus den Transfektionsschichten so verteilt, dass ca. 200 infizierte Stellen pro Schicht erzielt wurden, die infizierten Stellen wurden anschliessend einzeln entnommen und 30 in 1 ml L-Nährmedium eluiert und ein aliquoter Teil jedes einzelnen wurde in eine Schicht gebracht, wobei ca. 200 infizierte Stellen erzielt wurden. Jede Schicht wurde untersucht unter Verwendung der Antikörpertechnik wie oben beschrieben und Eluate mit positiven Reaktionen wurden isoliert. Die 35 zweite Methode der Isolation war im wesentlichen dieselbe, jedoch eine anfängliche Reinigung erfolgte durch eine Verdünnungsmethode. Aliquote Teile der Eluate aus den Trans-fektionen wurden so in Schichten verteilt, dass ca. 10 infizierte Stellen pro Schicht erzielt wurden und jede Schicht 40 wurde anschliessend mit 3 ml L-Nährmedium eluiert. Aliquote Teile dieser Eluate wurden anschliessend in Schichten gebracht, wobei ca. 200 infizierte Stellen pro Schicht erzielt wurden, und diese Schichten wurden anschliessend unter Verwendung der Antikörpermethode untersucht. Positive Reaktio-45 nen wurden auf einigen Schichten mit einer Frequenz von ca. 10% beobachtet. Die Phagen, enthaltend das trp A-Gen wurden anschliessend aus denjenigen Eluaten isoliert, bei denen eine höhere Frequenz von positiven Reaktionen durch die erste Isolierungsmethode beobachtet werden konnte, so Schliesslich wurden die Phagen mit positiver Reaktion im Antikörpertest auf die Gegenwart von trp A-Gen in der Weise untersucht, dass ihre Eigenschaft zur Transduktion von geeigneten E coli trp A~ Auxotrophen und in Gegenwart von trp A (durch den trp A-Test wie oben beschrieben) in der 55 überstehenden Lösung nach der Lyse von geeigneten E coli trp A~-Mutanten, beobachtet wurde.

Beispiele 2 und 3 Das Vorgehen wie im Beispiel 1 beschrieben wurde wiederholt unter Verwendung von E coli-Stämmen KY Mei und C600 als Wirtszellen für die Transfektion.

Selbstverständlich können die Bedingungen in den obengenannten Beispielen in weiten Bereichen variiert werden, ohne jedoch das prinzipielle Vorgehen zur Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens zu verändern. Essentielle Erfordernisse sind, dass das Plasmid zur Replikation im Wirtsorganismus befähigt ist und dass die Plasmid-DNA in ihrer

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biologisch aktiven Form in den Wirtsorganismus eingeführt werden kann, dass ferner die Plasmid-DNA nicht mehr als 3 und vorzugsweise nur 1 zur Spaltung bezeigte Region durch ein Restriktionsenzym vom Typ 2 aufweist, dass das interessierte Gen keine zur Spaltung durch die verwendete Endonuklease geeignete Region aufweist oder diese Region sei spezifisch geschützt; dass die Integration in den Plasmiden oder in das bakterielle Genom keine Manifestation des speziellen Gens, das von Interesse ist aufweist und dass das Poly-peptid-Produkt des fremden Gens, das in den Plasmiden eingeführt wird bei sehr kleinen Konzentrationen durch das beschriebene Screening festgestellt werden kann. Alle diese Erfordernisse sind für den mit der Materie vertrauten mehr oder weniger selbstverständlich.

5 Spezifische Anwendung des erfindungsgemässen Verfahrens sind die Produktion von Säugetier-Polypeptiden und Proteinen, die Produktion von Bakterien durch «fremde» Enzyme und sekundären Metaboliten, z.B. Glucoseisomerase, und die Produktion von Verbindungen wie Zitronensäure und io Cephalosporin durch modifiziertes Gewebe.

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1 Blatt Zeichnungen

Claims (5)

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1. Verfahren zur Gewinnung einer Zellkultur, die ein gewünschtes Polypeptid produziert, durch Modifikation von Mikroorganismen, gekennzeichnet durch die folgenden Verfahrensschritte a) Aufspalten von Molekülen eines DNA-Rezeptor-Materials erhalten aus einem Plasmid, das geeignet ist zur Infizierung der Zellen des genannten Mikroorganismus, durch Behandeln des Plasmids-DNA mit einer Endonuklease,

b) Aufspalten eines anderen DNA-Donor enthaltenden genetischen Materials, Kodieren für die Synthese eines gewünschten Polypeptids unter Verwendung einer ähnlichen Endonuklease, wobei DNA-Fragmente erhalten werden, deren Enden verträglich sind mit denen, die gemäss a) erhalten wurden,

c) Mischen der DNA-Fragmente, die aus den verschiedenen Quellen erhalten wurden, wodurch ein dem Zufall über-lassenes Zusammenrücken der DNA-Fragmente unter den Einfluss einer DNA-Ligase erfolgt, wobei Hybrid DNA-Moleküle erhalten werden, die die vereinigten Fragmente aus beiden DNA-Quellen enthalten,

d) Infizieren der zu modifizierenden Zellen des Mikroorganismus durch Kontaktieren mit den Hybrid DNA-Molekülen,

e) den infizierten Mikroorganismus metabolisieren lassen in Gegenwart eines Substrats, das geeignet ist, um in das gewünschte Polypeptid überführt zu werden, und f) Screening zur Produktion des gewünschten Polypeptids und Herstellung einer Zellkultur, die das Polypeptid produziert.

2. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Rezeptor-DNA eine Bakteriophagen-DNA ist.

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PATENTANSPRÜCHE

3. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die die Donor-DNA vom Menschen oder von Säugetieren stammt.

4. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der genannte infizierte Mikroorganismus metaboli-siert wird, worauf die erhaltene Zellkultur in Fraktionen aufgeteilt wird, in denen spezifische Metaboliten durch Immuno-screening nachgewiesen werden.

5. Verfahren gemäss Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass dem genannten Immunoscreening-Schritt eine Re-fraktionierung und ein weiteres Screening folgt.