DE3751757T2

DE3751757T2 - Autonom replizierende DNA Fragmente aus Säugerzellen mit Affinität zu DNA bindenden Proteinen

Info

Publication number: DE3751757T2
Application number: DE3751757T
Authority: DE
Inventors: Hiroyoshi Ariga
Original assignee: Daiichi Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Daiichi Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1986-07-24
Filing date: 1987-07-23
Publication date: 1996-11-28
Anticipated expiration: 2007-07-24
Also published as: JPS63185386A; DE3751757D1; EP0254315A2; JP2700458B2; GR3020035T3; EP0254315A3; ES2091179T3; EP0254315B1; ATE136057T1

Description

Erfindungsgebiet

Die Erfindung betrifft aus Säugerzellen gewonnene DNA- Fragmente autonom replizierender Sequenzen, die Affinität zu DNA-bindenden Proteinen besitzen, sowie Plasmide, die diese DNA-Fragmente enthalten, Säugerzellen, die mit solch einem Plasmid transfiziert sind, eine Methode zur Herstellung von Peptiden durch Verwendung dieser transfizierten Zellen und eine Methode zur Gewinnung von aus Säugerzellen erhaltenen DNA-Molekülen autonom replizierender Sequenzen.

Hintergrund der Erfindung

Bekannte Methoden zur Erzeugung von Peptiden durch Verwendung gentechnologischer Verfahren beinhalten, unter anderem, Mikroorganismen, wie Escherichia coli und Bacillus subtilis zu veranlassen, Peptide, Proteine und dergleichen herzustellen, indem man Plasmide verwendet, und Wirte von Viren zu veranlassen, Peptide, Proteine und dergleichen herzustellen, indem man virale DNA verwendet.
Diese bekannten Methoden sind jedoch nicht vollkommen zufriedenstellend im Hinblick auf die Stabilität der Plasmide, die Anzahl der verwendbaren Zellspezies und die Produktionseffizienz.
Vom Erfinder wurde bereits früher erfolgreich ein aus Mauszellen gewonnenes DNA-Fragment isoliert, das eine autonom replizierende Sequenz (ARS) enthält und berichtet, daß dieses Fragment ein EcoRI-BglII Fragment von ungefähr 2,500 Basenpaaren Länge darstellt (Mol. Cell. Biol., 5, 563-568 (1985)).
J.M. Montiel et al stellen in Nucl. Acid Res., Jan. 1984, 12(2), 1049-1068 eine Charakterisierung humaner chromosomaler DNA-Sequenzen bereit, die autonom in Saccharomyces cerevisiae replizieren.
EP 0 240 373, das ein nach Artikel 54(3) EPÜ relevantes Dokument ist, offenbart bestimmte Plasmide, die aus Säugerzellen gewonnene DNA-Fragmente autonom replizierender Sequenzen enthalten.
Die Erfinder haben weitere Untersuchungen der Eigenschaften dieses ARS-Fragmentes durchgeführt und gefunden, daß die ARS Affinität zu dem c-myc-Protein aufweist, das das Produkt des c-myc-Gens ist, und daß das c-myc-Protein an das c-myc-Gen bindet und dessen Expression kontrolliert. Des weiteren hat der Erfinder gefunden, daß nicht nur myc-Protein, sondern auch verschiedene DNA-bindende Proteine Affinität zu der ARS aufweisen. Dieser Befund machte es möglich, durch Verwendung des myc-Proteins und dergleichen die ARS aus verschiedenen Säugerzellen abzutrennen und zu gewinnen. Erfindungsgemäß wurde schließlich des weiteren festgestellt, daß nützliche Peptide, Proteine oder Glycoproteine, unter anderem, effizient durch Verwendung solch einer aus Säugerzellen gewonnenen autonom replizierenden Sequenz (ARS) produziert werden können.

Zusammenfassung der Erfindung

Die Erfindung stellt ein Verfahren zur Gewinnung von aus Säugerzellen erhaltenen DNAS autonom replizierender Sequenzen bereit, das die Bindung eines aus Säugerzellen gewonnenen DNA- Fragmentes an ein DNA-bindendes Protein, die Abtrennung des Bindungsproduktes und die Isolierung der DNA vom Bindungsprodukt umfaßt; sowie Plasmide, die eine aus Säugerzellen gewonnene autonom replizierende Sequenz-DNA, einen Promotor und ein Gen für Peptiderzeugung (einschließlich des Translations-Initiationscodons) enthalten; Säugerzellen, transfiziert mit die sen Plasmiden; und ein Verfahren zur Herstellung von Peptiden, das die Verwendung der aus Säugerzellen gewonnenen DNAS autonom replizierender Sequenzen, der Plasmide oder der transformierten Zellen beinhaltet.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

In den beigefügten Zeichnungen, zeigt jede der Figuren 1-4 ein skizziertes Konstruktionsschema für das jeweilige Plasmid und
jede der Figuren 5-7 zeigt eine mögliche Sekundärstruktur eines bestimmten DNA-Teils, auf das im folgenden Bezug genommen wird.
Figur 8 zeigt einen Vergleich der DNA-Sequenzen von drei Plasmiden.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein aus Säugerzellen gewonnenes DNA-Fragment einer autonom replizierenden Sequenz bereitgestellt, das Affinität zu dem DNA-bindenden Protein c-myc des Menschen aufweist.
Die autonom replizierende Sequenz wird unter den folgenden DNA-Sequenzen ausgewählt:
und den funktionalen Äquivalente davon, die Affinität zu dem oben beschriebenen DNA-bindenden Protein aufweisen.
Eine andere Ausführungsform betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von aus Säugerzellen erhaltenen DNA-Fragmenten autonom replizierender Sequenzen, das beinhaltet, ein aus Säugerzellen erhaltenes DNA-Fragment an das DNA-bindende Protein zu binden, den DNA/DNA-Bindungsprotein-Komplex abzutrennen und die DNA aus dem DNA/DNA-Bindungsprotein-Komplex zu isolieren, worin das DNA-bindende Protein unter myc-Proteinen, c-myb-Protein, v-myb- Protein, c-fos-Protein, v-fos-Protein und p 53 ausgewählt wird, und worin die ARS-DNA aus einer Säugerzellinie stammt, die das DNA-bindende Protein in großer Menge produziert. Vorzugsweise wird ein Kernextrakt der Zellinie als Quelle für DNA-bindendes Protein verwendet.
Diese Methode kann so durchgeführt werden, daß
a) der DNA/DNA-Bindungsprotein-Komplex vor dem Abtrennungsschritt zusätzlich an einen Anti-DNA-Bindungsprotein-Antikörper gebunden wird, um einen DNA/DNA-Bindungsprotein/Anti-DNA-Bindungsprotein-Antikörper-Komplex zu erhalten; und
b) der aus Schritt a) erhaltene Komplex außerdem an eine Substanz gebunden wird, die imstande ist, spezifisch an den Antikörper des Komplexes zu binden.
Vorzugsweise ist die in Schritt b) verwendete Substanz ausgewählt unter Protein A und einem Antikörper gegen den Anti-DNA- Bindungsprotein-Antikörper in dem aus Schritt a) gewonnenen Komplex.
Eine andere Ausführungsform betrifft ein aus Säugerzellen gewonnenes DNA-Fragment einer autonom replizierenden Sequenz, das durch eines der oben beschriebenen Verfahren erhältlich ist.
Erfindungsgemäß werden Plasmide bereitgestellt, die ein aus Säugerzellen gewonnenes DNA-Fragment einer autonom replizierenden Sequenz, das wie oben definiert ist, enthalten sowie einen Promotor und ein Gen für die Peptidproduktion einschließlich des Translations-Initiationscodons.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine Methode zur Herstellung eines Peptids, die beinhaltet, in Zellen ein Plasmid zu vermehren&sub1; das ein aus Säugerzellen gewonnenes DNA-Fragment einer autonom replizierenden Sequenz enthält, das wie oben definiert ist, sowie einen Promotor und ein Gen für die Peptidproduktion einschließlich des Translations-Initiationscodons.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Plasmid bereitgestellt, das ein aus Säugerzellen gewonnenes DNA-Fragment einer autonom replizierenden Sequenz, das wie oben definiert ist, enthält, das durch
a) Behandlung des menschlichen c-myc-Gens mit HindIII und PstI;
b) Abtrennung des stromaufwärts gelegenen HindIII-PstI-Fragmentes; und
c) Subklonierung des Fragmentes in pUC19 an der entsprechenden Stelle
erhältlich ist.
Außerdem werden aus Säugerzellen gewonnene DNA-Fragmente autonom replizierender Sequenzen bereitgestellt, die gewonnen werden können durch:
a) Ausschneiden des HindIII-PstI-Fragmentes mit einer Größe von ungefähr 200 Basenpaaren aus dem gemäß der oben erwähnten Methode gewonnenen Plasmid und
b) Abtrennung des Fragmentes durch Bildung eines Komplexes, der das c-myc-Protein beinhaltet.
Die Erfindung betrifft des weiteren Säuqerzellen, die mit einem wie oben definierten Plasmid transfiziert sind.
Die autonom replizierende Sequenz oder ARS ist der Replikationsursprung in der autonomen Replikation eukaryotischer Chromosomen. Die ARS kann in folgender Weise erhalten werden: DNA wird von Säugerzellen abgetrennt und mit einem oder mehreren geeigneten Restriktionsenzym(en), bevorzugt 6-Basen-Restriktionsenzyme, wie HindIII, EcoRI, BamHI etc. behandelt. Die so erhaltenen DNA-Fragmente, die normalerweise eine Länge im Bereich von 1,000 bis 10,000 Basenpaaren aufweisen, werden mit dem DNA-bindenden Protein vermischt, um dadurch einen DNA- Bindungsprotein-Komplex zu bilden.
In Beschreibung und Ansprüchen ist das DNA-bindende Protein als Protein definiert, das an DNA bindet, im Kern von Säugerzellen existiert und die Replikation oder Expression der DNA in der Zelle kontrolliert und als Nicht-Histon-Protein bezeichnet werden kann. Beispiele für das DNA-bindende Protein umfassen myc-Proteine (wie c-myc-Protein (Science 225, 718-720 (1984), v-myc-Protein (Nature 296, 262-264 (1982)), N-myc-Protein (Annu. Rev. Biochem., 52, 301-310 (1983)), c-myb-Protein, v-myb-Protein, c-fos-Protein, v-fos-Protein, p53 (jeweils beschrieben in Annu. Rev. Biochem. 52 301-310 (1983)), SV40 T Antigen (Cell 13 165 (1978)) und RB-Genprodukt (Science 235 1394-1399 (1987)). Diese Proteine können, wie in den obigen Literaturstellen beschrieben, im Zellkernextrakt verfügbar sein. Das c-myc-Protein ist z. B. im HL-60-Zellkernextrakt verfügbar. Für das Abtrennungsverfahren nach Bildung des DNA-Protein-Komplexes können konventionelle Methoden zur Trennung oder Isolierung von Proteinen, wie das Verfahren für Antigen-Antikörper-Reaktionen, oder dergleichen, verwendet werden.
Zum Beispiel ist es zweckmäßig, daß der Komplex an einen Antikörper gegen das DNA-bindende Protein gebunden wird und der resultierende Komplex an eine Substanz gebunden wird, die spezifisch an den Antikörper binden kann, z.B. einen zweiten Antikörper oder Protein A, so daß ein Komplex erzeugt wird, dessen Molekulargewicht groß genug für die Präzipitatbildung ist. Der ausgefällte Komplex kann leicht in konventioneller Weise durch Filtration oder Zentrifugation gewonnen werden.
Der Antikörper gegen das DNA-bindende Protein kann durch eine gängige Methode, wie durch Immunisierung eines Tieres mit dem Protein, erzeugt werden, es ist aber zweckmäßig, ihn von kommerziellen Quellen, wie Oncor Inc., USA etc. zu beziehen. Zum Beispiel wird das dritte Exon des N-myc-Gens (ein spezifischer Rest von N-myc) in E. coli exprimiert, um N-myc-Protein zu erhalten, dann wird eine Maus nach einer gängigen Methode mit dem Protein immunisiert. Aus der Maus wird Antiserum gewonnen und die IGG-Fraktion davon wird als Anti-N-myc-Protein-Antikörper verwendet. (Siehe auch J. Virol. 34 752-763 (1980)).
Der zweite Antikörper kann auch durch eine an sich bekannte Methode hergestellt werden und Protein A wird in Form einer Zellsuspension von Staphylococcus aureus (P-7155 (Sigma)) oder kombiniert mit einem Feststoff (Protein A-Sepharose CL-48 (Pharmacia) oder Protein A-Agarose FPA-1 (Cosmo-Bio Ltd.)) bereitgestellt.
Die Trennung der DNA vom Komplex (z.B. DNA/Bindungsprotein/Antikörper/Protein A) kann in konventioneller Weise durchgeführt werden, z.B. durch Behandlung mit einem Reagens, wie 2- Mercaptoethanol, oder einem proteolytischen Enzym (Mol. Cell. Biol. 3, 1958-1966 (1983)), wie Proteinase K (Proteinase K P0390 (Sigma), Proteinase K Nr. 24568 (Merck)), jedoch ist Mercaptoethanol bevorzugt, da das proteolytische Enzym manchmal die DNA-Kette abbauen kann.
Es ist eine sehr wichtige erfindungsgemäße Feststellung, daß das so isolierte DNA-Fragment, das spezifische Affinität für das DNA-bindende Protein aufweist, ARS-DNA enthält und daß das DNA-bindende Protein und ARS eine sehr starke Affinität zueinander aufweisen.
Das ARS-enthaltende Fragment kann entweder als ARS oder als ein ARS-enthaltendes DNA-Fragment, das eine geeignete Länge hat, wie gewünscht verwendet werden.
Die Größe möglicher ARS-DNA wird auf ungefähr 100 Basenpaare geschätzt, jedoch wird vermutet, daß die ARS-DNA manchmal teilweise mit einer Enhancer-DNA überlappt. So kann eine DNA verwendet werden, die mehrere 100 Basenpaare als ARS-enthaltendes DNA-Fragment aufweist.
Die Techniken zur DNA-Behandlung, Screening usw., zur Herstellung nützlicher Substanzen, wie z.B. Peptide, durch Verwendung der ARS wird für Durchschnittsfachleute offenkundig und leicht verständlich sein, wenn sie die konventionellen oder bekannten Techniken unter Heranziehung der im folgenden angegebenen Beispiele und dergleichen (T. Maniatis et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory (1982), im folgenden Mol. Clon.) verwenden.
Es ist gut möglich, daß die Basensequenz der ARS etwas variieren kann, in Abhängigkeit von der tierischen Spezies, die zur Bereitstellung der Zellen, aus denen die ARS gewonnen wird, verwendet wird, in Abhängigkeit von der Zellart, oder in Abhängigkeit von der Stelle, die als Quelle der ARS dient (wenn Zellen desselben Stammes verwendet werden). Deshalb ist es nicht immer notwendig, daß eine zu verwendende ARS in der Basensequenz mit der ARS, die in der obigen Weise erhalten wurde, vollkommen identisch ist. Im Gegenteil, es ist möglich, partielle Basensubstitutionen, Deletionen sowie Basenadditionen in der ARS durchzuführen. Ob die resultierende ARS für die effiziente Herstellung des gewünschten Produktes geeignet ist, kann durch konventionelle Tests und Studien unter Heranziehung auf die im folgenden gegebenen Beschreibungen festgestellt werden. Erfindungsgemäße Beispiele für eine isolierbare oder verwendbare ARS sind aus Säugerzellen, wie aus Zellen von Maus, Ratte, Meerschweinchen, Rind, Pferd, Schaf, Ziege, Kaninchen, Affe, Schimpanse oder Mensch, gewonnene ARS. Insbesondere kann eine aus Zellen von Maus oder Mensch gewonnene ARS als geeignet gelten, weil fortgeschrittene Zellkulturtechniken für Zellen von Maus und Mensch verfügbar sind.
Obwohl alle Säugerzellen als Quelle zur Herstellung der ARS verwendet werden können, ist es zweckmäßig solche Zellen zu verwenden, die viel an DNA-bindendem Protein produzieren, wie c-myc-Protein, beschrieben in Science 225, 718-720 (1984), v- myc-Protein, beschrieben in Nature 296, 262-264 (1982), N-myc- Protein, c-myb-Protein, v-myb-Protein, c-fos-Protein, v-fos- Protein, p53, die beschrieben sind in Annu. Rev. Biochem., 52, 301-310 (1983), SV40 T Antigen, beschrieben in Cell, 13, 165 (1978) und RB-Genprodukt, beschrieben in Science, 235, 1394- 1399 (1987).
Repräsentative Beispiele für solche Säugerzellen, aus denen ARS isoliert werden, umfassen Human-HL-60-Zellen, Human- IMR-32-Zellen, Human-Raji-Zellen, Maus-FM3A-Zellen und dergleichen.
Die erfindungsgemäßen ARS-enthaltenden Plasmide, die für die Peptidproduktion geeignet sind, können durch Verwendung konventioneller Techniken der Genrekombination (vgl. Mol. Clon.) konstruiert werden.
Die Einführung der Plasmide in Zellen, Selektion der zu verwendenden Zellarten, Zelivermehrung und andere notwendige Prozeduren können unter Verwendung der Säugerzellinien oder Stämme und Techniken durchgeführt werden, die der Fachwelt geläufig sind. Es wird auch möglich sein, die Techniken, Zellkulturen, Medien usw. zu verwenden, die zukünftig verbessert oder entwickelt werden können. (vgl. "Manual of Cell Culture", Hrsg. Munemera, Kodansha, Tokyo (1982), K. Habel und N.P. Salzman, Fundamental Technique in Virology, Academic Press, N.Y. (1969), Kruse und Patterson, Tissue Culture, Academic Press, N.Y. (1973) und Virology, 52 456-467 (1973)).
Verschiedene Beispiele für die gängigen Prozeduren werden zur weiteren Erläuterung unten aufgeführt.
Beispiele für verwendbare Promotoren sind aus Zellen gewonnene Promotoren verschiedener Arten, wie der Thymidinkinase- Promotor und Immunoglubolin-Promotor sowie Promotoren aus Viren, die für Säugerzellen infektiös sind, wie der SV40 T-Antigen-Promotor oder "SV40 early promoter", "SV40 late promoter", Adenovirus-Promotoren und der Herpesvirus-Thymidinkinase-Promotor. Ein gewöhnliches ATG kann als Translations-Initiationscodon verwendet werden.
Beispiele für zu produzierende Peptide umfassen unter anderem jene Peptide, Proteine, Glykoproteine und dergleichen, die als Medikamente nützlich sind, wie z.B. Insulin, Wachstumshormon, Interferone, Tumornekrosefaktor, Interleukine, andere Lymphokine und verschiedene Enzyme.
Beispiele für Gene zur Peptidproduktion beinhalten unter anderem DNAS, die für die Aminosäuresequenzen der oben erwähnten Peptide kodieren und Sequenzen, die aus den DNAS und einem Poly(A)signal zur Translationstermination, das an das 3'-stromabwärts gelegene Ende angehängt ist, zusammengesetzt sind.
Die erfindungsgemäßen Plasmide werden durch Verknüpfung eines DNA-Fragmentes, das eine geeignete Zahl von Basenpaaren und eine oder mehrere Stellen, die mit gängigen Restriktionsenzymen geschnitten werden können, aufweist, eines Promotors, des Translations-Initiationscodons und eines Gens für die Peptiderzeugung in geeigneter gewünschter Reihenfolge sowie durch Zugabe einer ARS und Zirkularisierung des Konstruktes erzeugt. Ausrichtung oder Lokalisation der ARS sind nicht als limitierend zu betrachten.
Die so erhaltenen Plasmide werden in verschiedene Säugerzellen eingeführt, z.B. durch Transfektionsmethoden unter Verwendung von Calciumphosphat, die Mikroinjektionsmethode, die Liposomenmethode, die Protoplastenfusionsmethode oder dergleichen, wodurch transformierte Zellen erzeugt werden können. Beispiele für geeignete kultivierte Zellen sind, ohne darauf beschränkt zu sein, Maus-NS-1 und -FM3A und Human-HL-60, -U937, -Daudi und -Raji. Die gewünschten Peptide können durch Aufzucht und Vermehrung dieser transformierten Zellen erzeugt werden.
Eine charakteristische Eigenschaft der Erfindung ist, daß die Zellen, in die die Plasmide eingeführt werden sollen, nicht aus derselben Spezies stammen müssen, aus der die ARS gewonnen wurde. Das heißt, wenn eine ARS-DNA aus einer Mauszelle gewonnen wird, kann die DNA zur Expression in einer anderen Art von Mauszellen und in Humanzellen oder in anderen Säugerzellen ver wendet werden.
Die transformierten Zellen werden durch konventionelle Methoden der Zellkultur aufgezogen und vermehrt, z.B. in DMEM (Dulbecco Modified Eagle's Medium), das eine geeignete Menge fetales Kälberserum enthält, bei 37ºC in Gegenwart von 5% Kohlendioxid oder in der Bauchhöhle eines Tieres (vgl. "Manual of Cell Culture", herausgegeben von Munemera, Kodansha, Tokyo (1982), Fundamental Technique in Virology, Tissue Culture).
Wenn die erzeugten Peptide in das Medium freigesetzt worden sind, können sie durch konventionelle Fraktionierungstechniken isoliert werden, z.B. durch Zentrifugation und/oder Gelfiltration. Wenn sich die Peptide in Zellen ansammeln, können sie durch gewöhnliche Fraktionierung nach Aufschließen der Zellen erhalten werden. Auch wenn sie sich in der Ascitesflüssigkeit befinden, können sie unter Verwendung konventioneller Techniken isoliert werden.
Die folgenden Beispiele werden zur weiteren Erläuterung der vorliegenden Erfindung angeführt, ohne diese zu beschränken. Sofern nicht anders angegeben, sind alle Bruchteils-, Prozent- und Verhältnisangaben auf das Gewicht bezogen.

Beispiel 1

(1) Konstruktion eines Plasmids, das Maus-ARS und das Thymidinkinasegen enthält (vgl. Fig. 1)

Das Plasmid pMU85 (Mol. Cell. Biol., 5 563-568 (1985)) wurden mit EcoRI und BglII behandelt und ein ungefähr 2500 Basenpaare langes Fragment wurde aus dem Plasmid isoliert. Das Fragment wurde in das Plasmid pKSV10 (kommerziell erhältlich von Pharmacia) in dessen EcoRI-BglII-Region insertiert, wodurch ein Plasmid pARS65 konstruiert wurde.
Das Plasmid pAGO (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 3755 (1979)) wurde mit BamHI behandelt und ein DNA-Fragment wurde isoliert, daß das aus Herpesvirus gewonnene Thymidinkinasegen enthielt. Das DNA-Fragment wurde in das oben erwähnte Plasmid pARS6S an dessen BamHI-Stelle insertiert. Das so konstruierte Plasmid p65-tk wurde in E. coli vermehrt (die die das Plasmid enthaltende Transformante, E. coli K12 C600 ARS-1, ist beim Fermentation Research Institute unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-1443 hinterlegt worden).

(2) Konstruktion eines Plasmids. das Maus-ARS und das SV40-T- Antigen-Gen (vgl. Fig. 2) enthält

Das Plasmid pMTIOD (J. Virology, 48, 481-491 (1981)) wurde mit BamHI und pVUII behandelt und das SV40-T-Antigen-Gen mit dem "early promoter" isoliert. Der BamHI-Linker (Takara Shuzo, Japan) wurde mit der pVUII-Stelle dieses Gens vereinigt. Das dadurch erhaltene Fragment wurde in das Plasmid pARS6S an dessen BamHI-Stelle insertiert, wobei man das Plasmid p65-T erhielt.

(3) Expression des Proteins (Thymidinkinase)

Das oben durch Prozeß (1) gewonnene Plasmid p65-tk wurde verwendet, um FM3Atk--Zellen durch die Liposomenfusionsmethode zu transfizieren. Das Plasmid p65-tk wurde in große unilamellare Vesikel (LUVS) eingeschlossen, die durch die Phosphatidylserin Calcium-induzierte Fusions-Methode hergestellt wurden. Zur Durchführung der Transformation wurde 20 mM Tris-Puffer (pH 7,5), der 50 mM EDTA enthielt, verwendet (vgl. Science 215, 166 (1982)) und Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 115, 4194 (1978).
Nach der Transformation wurden die Zellen in DMEM, das 10% fötales Kälberserum enthielt, bei 37ºC in Gegenwart von 5% Kohlendioxid gezogen. Nach zwei Tagen wurde das Medium durch HAT- Medium ersetzt.
Transformierte Zellen, nämlich FM3Atk+-Zellen, wurden in ungefähr einer Woche beobachtet. Nach zweiwöchiger Kultivierung wurde jede Kolonie isoliert und in HAT-Medium überführt. Die Kultivierung jeder Kolonie in HAT-Medium wurde fortgeführt, bis die Zahl der Zellen ungefähr 10&sup7; pro Kolonie betrug. Die Zahl der Verdopplungen während dieser Kultivierungsperiode betrug ungefähr 60.
1000 Zellen wurden der Transformation durch die obige Methode unterzogen, wodurch ungefähr 300 bis 400 transformierte Zellen erhalten wurden. Es wurde dadurch bestätigt, daß sich p65-tk in FM3Atk--Zellen vermehrt hatte und daß das Thymidinkinasegen exprimiert worden war.

(4) Überprüfung der Kopienanzahl

Die oben erwähnten 10&sup7; Zellen wurden extrahiert und eine DNA-Fraktion mit niedrigem Molekulargewicht wurde durch die Hirt-Methode gewonnen (J. Mol. Biol., 26, 365-369 (1967)). Zur Bestätigung der Plasmidreplikation in den Transformanten wurde die DNA-Fraktion mit niedrigem Molekulargewicht mit dem Restriktionsenzym DpnI behandelt.
Während das in FM3Atk&supmin;-Zellen eingeführte p65-tk einen methylierten Adeninrest enthält, enthielt das Replikationsprodukt, das in diesen Zellen erzeugt wurde, keine methylierte Adeningruppe. Da DpnI selektiv methylierte DNA spaltet, spaltet es ausschließlich das in die Zellen eingeführte Plasmid in eine Vielzahl von DNA-Fragmenten, während die in den Zellen replizierten Plasmidkopien ungespalten bleiben. Folglich können die in den Zellen replizierten Plasmidkopien leicht durch Elektrophorese erkannt werden.
Nach DpnI-Verdauung wurden die DNAS durch Agarose-Gelelektrophorese (Mol. Clon.) aufgetrennt und durch Southern Blotting getestet (J. Mol. Biol., 98, 503-517 (1975)). Die Hybridisierung wurde unter Verwendung von ³²P-markiertem p65-tk als Sonde durchgeführt, gefolgt von Röntgen-Autoradiographie. Der Nachweis von an die Sonde hybridisierten Banden bestätigte, daß p65-tk als extrachromosomale DNA in allen der 20 untersuchten Klone repliziert worden war.
Die aus der Intensität der Banden abgeschätzte Zahl der Kopien pro Zelle betrug 100 bis 200. Das Plasmid war dauerhaft replizierbar, auch wenn die obigen Zellen in DMEM gezogen wurden, das 10% fetales Kalbserum enthielt, was anstatt von HAT- Medium verwendet wurde. Es war keine Veränderung des DNA-Gehalts festzustellen. Es wurde ebenfalls bestätigt, daß das Plasmid sogar nach 150 Verdopplungen in den Zellen dauerhaft verblieb.

(5) Replikation des Plasmids pARS-65 in verschiedenen Zellinien

pARS-65 wurde in Maus-NS-1-Zellen bzw. in Human-HL-60-Zellen und Human-U937-Zellen unter Verwendung der oben beschriebenen Methoden transfiziert. Die Zellen wurden dann in RPMI 1640- Medium bei 37ºC in Gegenwart von 5% Kohlendioxid gezogen, das 10% fetales Kälberserum enthielt. Nach 40 Stunden wurde die extrachromosomale DNA mit niedrigem Molekulargewicht durch die oben in (4) erwähnten Methoden analysiert. Als ein Resultat wurde bestätigt, daß ungefähr 500 Kopien von pARS-65 in jeder NS-1-Zelle repliziert worden waren, ungefähr 10,000 Kopien in jeder HL-60-Zelle und ungefähr 100 Kopien in jeder U937-Zelle.
Es wurde somit bestätigt, daß pARS-65 auch in Zellen anderer Spezies, als Maus, replizierbar ist. Gleichzeitig legen die Ergebnisse nahe, daß p65-tk solche Replikabilität aufweisen könnte.

Beispiel 2

(1) Isolierung von aus Human-Zellen gewonnenen ARS (vgl. Fig. 3)

DNA aus Human-HL-60-Zellen wurde unter Verwendung der SDS- Proteinase K-Methode (Mol. Clon.) extrahiert und mit HindIII behandelt. Ein DNA-Fragment, das Affinität für das myc-Protein aufweist, wurde aus dem so erhaltenen Gemisch von DNA-Fragmenten durch Verwendung einer konventionellen Methode (Mol. Cell. Biol., 3, 1958-1966 (1983)) wie folgt gewonnen:
Das obige Fragmentgemisch wurde mit einem HL-60-Kernextrakt (reich an myc-Protein) vermischt und man ließ die Reaktion bei 0ºC 30 Minuten lang ablaufen, wobei man einen DNA-myc- Protein-Komplex erhielt.
Dann wurde ein Anti-myc-Protein-Antikörper (α-myc, kommerziell erhältlich von Oncor Inc., USA) zugegeben, wodurch ein DNA-myc-Protein-α-myc-Komplex gebildet wurde. Des weiteren wurde eine wäßrige Lösung von Staphylococcus aureus, die Protein A enthielt, das spezifisch an α-myc bindet, zugegeben, um einen DNA-myc-Protein-α-myc-Protein-A-Komplex zu bilden.
Der Komplex, der als Präzipität auftrat, wurde durch Zentrifugation gewonnen, mit Tris-Puffer gewaschen (pH 7,5), der 0,1% SDS und 0,1 M Natriumchlorid enthielt, und die DNA wurde dann freigesetzt, indem man eine 7 mM wäßrige Mercaptoethanol- Lösung hinzufügte, die 1% SDS enthielt, und man die Reaktion 30 Minuten lang bei 30ºC ablaufen ließ. Das Reaktionsgemisch wurde bei 15,000 g 5 Minuten lang zentrifugiert. Der dadurch abgetrennte Überstand wurde mit Phenol extrahiert, um Proteine zu entfernen. Das dadurch erhaltene gewünschte DNA-Fragment wurde in pUC19 (kommerziell erhältlich von Pharmacia) an dessen Hindih-Stelle insertiert. Die Zahl der Basenpaare in dem obigen DNA-Fragment wurde durch Agarose-Gelelektrophorese auf ungefähr 200 geschätzt. Das erhaltene Plasmid wurde in E. coli multipliziert (die Plasmid-enthaltende Transformante E. coli K12 C600 ARS-2 ist beim Fermentation Research Institute unter der Hintelegungsnummer FERM BP-1444 hinterlegt worden).
Der oben beschriebene HL-60-Kernextrakt wurde in folgender Weise hergestellt. 1 Liter HL-60-Zellkulturflüssigkeit (5 x 10&sup5; Zellen/ml) wurde zentrifugiert und die geernteten Zellen wurden mit Phosphat-gepufferter physiologischer Kochsalzlösung gewaschen. Die Zellen wurden ferner mit einer hypotonischen wäßrigen Lösung (20 mM HEPES, pH 7,5, 5 mM Kaliumchlorid, 0,05 mM Magnesiumchlorid, 0,5 mM Dithiothreitol, 0,2 mM Sucrose) gewaschen und dann in einer hypotonischen wäßrigen Lösung suspendiert (die vorherige Lösung ohne Sucrose) und die Suspension wurde 10 Minuten in Ruhe belassen. Nach Homogenisierung durch 40 Stöße in einem Dounce-Homogenisator wurde das Homogenisat bei 3000 g 10 Minuten zentrifugiert, um ein Präzipitat zu erhalten.
Das Zellkerne beinhaltende Präzipitat wurde in 2,5 ml einer wäßrigen Lösung (5 mM HEPES, pH 7,5, 10% Sucrose) aufgelöst und vorübergehend in flüssigem Stickstoff gelagert. Nach graduellem Auftauen bei 0ºC wurde 5 M wäßriges Natriumchlorid bis zu einer Endkonzentration von 0,1 M zugegeben und, nach 5-minütiger Behandlung bei 0ºC wurde das Gemisch bei 15,000 g 20 Minuten zentrifugiert, um den Kernextrakt als Überstand zu erhal ten. Das oben erwähnte Plasmid, wie in E. coli K12 C600 vervielfältigt, wurde isoliert (Mol. Clon.). Behandlung mit HindIII spaltete das Plasmid nicht. Folglich wurde in Betracht gezogen, daß ein bakterielles Rearrangement des Plasmids erfolgt war. Dieses Plasmid wurde als pHLmyc bezeichnet.
Das Plasmid pUC19 hat andere Restriktionsenzymschnittstellen (z.B. BamHI und NarI-Stellen) als die HindIII-Stelle. Deshalb wurde das obige Plasmid mit BamHI und NarI behandelt und das an Molekulargewicht kleinere der beiden so gebildeten DNA- Fragmente wurde isoliert.
Eine ³²P-markierte Sonde wurde unter Verwendung dieses kleineren Fragmentes als Template hergestellt und zur Southern Hybridisierung (J. Mol. Biol., 98, 503-517 (1975)) an die HL- 60-Zell-DNA benutzt. Die Sonde hybridisierte mit der HL-60- Zell-DNA und es wurde dadurch bestätigt, daß das Fragment, das eine NarI-Stelle an einem Ende und eine BamHI-Stelle am anderen Ende (Nari-BamHI-Fragment) aufwies, eine aus HL-60-Zellen gewonnene DNA enthielt.
Die Länge des Nari-BamHI-Fragmentes wurde durch Agarose- Gelelektrophorese auf ungefähr 200 bis 300 Basenpaare geschätzt.
In pUC19 ist die HindIII-Stelle 131 Basenpaare von der NarI-Stelle und 35 Basenpaare von der BamHI-Stelle entfernt und eine PstI-Stelle befindet sich 25 Basenpaare entfernt von der BamHI-Stelle. Im Plasmid pHLmyc blieb die PstI-Stelle erhalten. Darum wurde die Zahl der Basenpaare in der aus HL-60-Zellen gewonnenen DNA, die in dem Plasmid pHLmyc enthalten ist, auf ungefähr 120 geschätzt.
Die Basensequenz wurde bestimmt und 99 Basen wurden an der HindIII-Stelle innerhalb der Polylinker-Region identifiziert. Die Sequenz davon ist unten gezeigt:
Die Untersuchung der Sequenz auf Palindrome legte die Möglichkeit nahe, daß sie Haarnadeistrukturen, wie in den Figuren 5 und 6 gezeigt, aufweisen könnte. Auf dieser Grundlage wurde angenommen, daß von den obigen 99 Basen die Basen 12 bis 59 oder die Basen 17 bis 74 den wichtigsten Teil der autonom replizierenden Sequenz (ARS) bildeten.

(2) Bestätigung, daß Plasmid pHLmyc ARS enthält

HL-60-Zellen wurden durch die Liposomenmethode mit pHLmyc transfiziert und die Zahl der Kopien wurde durch die oben beschriebene Methode auf 10,000 pro Zelle geschützt.

(3) Konstruktion eines Plasmids, das Human-ARS und c-myc enthält und Expression davon (vgl. Fig.4)

Das Plasmid pmyc (kommerziell erhältlich von Oncor Inc. USA; enthält das myc-Strukturgen und den aus Rous-Sarcoma- Virus gewonnenen "Long Terminal Repeat Promoter" (LTR)) wurde mit BamHI, HindIII und EcoRI behandelt und das myc-Strukturgen und LTR wurden isoliert und in die EcoRI-BamHI-Region von pHLmyc insertiert. Das so konstruierte Plasmid pARSmyc wurde in Human-U937-Zellen durch die Liposomenmethode transfiziert und die Zellen wurden in RPMI-1640-Medium, das 10% fetales Kälberserum enthielt, bei 37ºC in Gegenwart von 5% Kohlendioxid gezogen.
Nach 3-tägiger Inkubation wurde die Menge von mRNA, entsprechend dem Vorkommen des myc-Gens in den Zellen, durch die Northern-Hybridisierungsmethode (Mol. Clon.) bestimmt und im Vergleich mit der Menge an MRNA in pARS-freien U937-Zellen als 100 mal größer befunden. Daraus wurde geschlossen, daß MRNA Transkription des myc-Gens im Plasmid pARSmyc stattgefunden hatte.

Beispiel 3

(1) Subklonierung des Human-c-myc-Gens

Das Human-c-myc-Gen (Mol. Cell Biol., 5, 414-418 (1985)) wurde mit HindIII und KpnI verdaut und die stromaufwärts gele gene HindIII-KpnI-Region (ungefähr 1200 Basenpaare) wurde abgetrennt. In ähnlicher Weise wurde das stromaufwärts gelegene HindIII-PstI-Fragment durch Behandlung des Gens mit HindIII und PstI erhalten. Die Fragmente wurden in pUC18 und pUC18 an der jeweils entsprechenden Stelle subkloniert und die resultierenden Plasmide des Klons wurden als pmyc (H-K) und pmyc (H-P) bezeichnet.

(2) Bindung des HindIII-KpnI-Fragmentes und HindIII-PstI-Fragmentes an c-mvc-Protein

Die "Gel-Shift Assay"-Methode ist kürzlich verwendet worden, um die Bindung von DNA an ein Protein zu untersuchen (Nucleic Acid Res., 9, 3047-3060) (1981)). Bei dieser Methode wird eine Isotopen-markierte DNA mit einem zu bindenden Protein behandelt und auf ein Polyacrylamidgel aufgetragen, so daß sich der DNA-Protein-Komplex langsam auf dem Gel bewegt.
Der Kernextrakt von HL-60-Zellen, die viel c-myc-Protein produzierten, wurde als c-myc-Protein-Quelle verwendet. Die oben beschriebenen HindIII-KpnI- und HindIII-PstI-Fragmente wurden mit dem Kernextrakt vermischt und 15 Minuten bei 30ºC erwärmt. Das resultierende Gemisch wurde auf ein Polyacrylamidgel aufgetragen. Andererseits wurde der Kernextrakt mit Anti- myc-Protein-Antikörpern (Oncor Inc. USA) vorbehandelt und dann in der gleichen Weise behandelt, wie oben die obigen Fragmente.
Alle Fragmente wurden an Protein gebunden, jedoch wurde mit Antikörpern vorbehandeltes Protein nicht an das Fragment gebunden. Daraus wurde geschlossen, daß in dem HindIII-PstI- Fragment (ungefähr 200 Basenpaare) eine Bindungsstelle für das c-myc-Protein existiert.
(3) Das Plasmid pmyc (H-K) wurde mit HindIII und KpnI verdaut, während pmyc (H-P) mit HindIII und PstI verdaut wurde, um DNA- Fragmente zu erzeugen. Jedes Fragment wurde ähnlich wie in Beispiel 2 der Reihe nach mit c-myc-Protein, Antikörpern und Protein A behandelt und die Komplexe wurden mit 2-Mercaptoethanol behandelt, um Proteinabbau zu bewirken und resultierende Proteine zu entfernen.
So wurden das HindIII-KpnI-Fragment und das HindIII-PstI- Fragment erhalten und die DNA-Sequenz des HindIII-PstI-Fragments, die unten gezeigt ist, wurde durch die Dideoxy-Kettenabbruchmethode erhalten.
Eine mögliche Sekundärstruktur der Sequenz wurde durch computerunterstützte Sequenzanalyse abgeschätzt und ist in Figur 7 gezeigt. Figur 8 zeigt einen Sequenzvergleich zwischen dem Fragment von pHLmyc und pmyc (H-P) und zwischen dem Fragment von pARS65 und pmyc (H-P). Sterne deuten passende Sequen zen an und Sequenzen mit Strichen bilden vermutlich Stämme von Haarnadelschleifen. Die DNA-Sequenz, die den Stamm bildet, insbesondere die 9 Basenpaare von GTGAATAGT, wird als besonders wichtig erachtet.

Beispiel 4

Ähnlich der Prozedur in Beispiel 2 wurden mehrere Plasmide mit Hilfe verschiedener Zellkern-DNAS, Proteine und Antikörper erhalten. Die Namen der Plasmide und die eingesetzten Materialien werden in der folgenden Tabelle gezeigt. Plasmid DNA/Enzyme Kernextrakt von (Protein) Antikörper Zellen Raji-Zellen

Identifikation der ARS

Die Plasmide pmyc (H-K), pmyc (H-P), pIMR-N und pRJ-53 wurden in ähnlicher Weise in Zellen eingeführt, wie in Beispiel 1 (3) und die Anzahl der Kopien wurde untersucht. Die Ergebnisse sind unten gezeigt. Plasmid Zelle Anzahl der Kopien Raji
Wie oben im Detail beschrieben, können die erfindungsgemäßen Plasmide mit guter Effizienz in verschiedenen Säugerzellen aufgrund der Wirkung der ARS repliziert werden; die Kopienanzahl der Plasmide pro Zelle ist groß und die Effizienz der Produktion des Genproduktes ist hoch. Darum stellt die vorliegende Erfindung auch eine Peptidproduktionsmethode bereit, die vom Standpunkt der Gentechnik hervorragend ist.
Obwohl die Erfindung im Detail und unter Hinweis auf bestimmte Ausführungsformen beschrieben worden ist, ist es für einen Fachmann offensichtlich, daß verschiedene Änderungen und Modifikationen darin durchgeführt werden können, ohne den Schutzbereich zu verlassen.

Claims

1. Verfahren zur Gewinnung eines von Säugerzellen abgeleiteten Autonom Replizierende Sequenz (ARS)-DNA- Fragmentes, wobei man ein von Säugerzellen abgeleitetes DNA-Fragment an ein DNA-Bindungsprotein bindet, den DNA/DNA-Bindungsprotein-Komplex abtrennt und die DNA aus dem DNA/DNA-Bindungsprotein-Komplex isoliert, wobei das DNA-Bindungsprotein ausgewählt ist unter myc- Proteinen, c-myb-Protein, v-myb-Protein, c-fos-Protein, v-fos-Protein und p 53 und wobei die ARS-DNA aus einer Säugerzellinie stammt, welche das erwähnte DNA- Bindungsprotein in erhöhter Menge produziert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei

a) der DNA/DNA-Bindungsprotein-Komplex vor dem Trennungsschritt an einen Anti-DNA-Bindungsprotein- Antikörper gebunden wird, um einen DNA/DNA- Bindungsprotein/Anti-DNA-B indungsprote in-Antikörper- Komplex zu erhalten; und

b) der in Stufe a) erhaltene Komplex an eine Substanz gebunden wird, die in der Lage ist, spezifisch an den Antikörper des Komplexes zu binden.

3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die gemäß Stufe b) eingesetzte Substanz ausgewählt ist unter Protein A und einem Antikörper, der gegen den Anti-DNA-Bindungsprotein- Antikörper in dem in Stufe a) erhaltenen Komplex gerichtet ist.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei ein Kernextrakt einer Zellinie als Quelle für das DNA- Bindungsprotein verwendet wird.

5. Von Humanzellen abgeleitetes Autonom Replizierende Sequenz-DNA-Fragment mit Affinität gegenüber dem menschlichen DNA-Bindungsprotein c-myc, welches unter folgenden Sequenzen:

und deren funktionellen Äquivalenten ausgewählt ist.

6. Plasmid, welches ein von Säugerzellen abgeleitetes Autonom Replizierende Sequenz-DNA-Fragment gemäß Anspruch 5, einen Promoter und ein Gen zur Peptidproduktion, einschließlich des Translationsinitiationskodons, enthält.

7. Verfahren zur Herstellung eines Peptids, wobei man in Zellen ein Plasmid propagiert, das ein von Säugerzellen abgeleitetes Autonom Replizierende Sequenz-DNA-Fragment gemäß Anspruch 5, einen Promoter und ein Gen zur Peptid produktion, einschließlich des Translationsinitiationskodons, enthält.

8. Säugerzelle, die mit einem Plasmid transfiziert ist, welches ein von Säugerzellen abgeleitetes Autonom Replizierende Sequenz-DNA-Fragment gemäß Anspruch 5, einen Promoter und ein Gen zur Peptidproduktion, einschließlich des Translationsinitiationskodons, enthält.

9. Plasmid, welches ein von Säugerzellen abgeleitetes Autonom Replizierende Sequenz-DNA-Fragment enthält und welches erhältlich ist durch:

a) Behandlung des menschlichen c-myc-Gens mit HindIII und PstI;

b) Abtrennung des stromaufwärts gelegenen HindIII-PstI- Fragmentes; und

c) Subklonierung des Fragmentes in pUC19 an der entsprechenden Stelle.

10. Von Säugerzellen abgeleitetes Autonom Replizierende Sequenz-DNA-Fragment, erhältlich durch:

a) Ausschneiden des HindIII-PstI-Fragmentes mit einer Größe von etwa 200 bp aus dem nach Anspruch 9 erhältlichen Plasmid; und

b) Abtrennung des Fragmentes durch Bildung eines Komplexes, der das c-myc-Protein umfaßt.

11. ARS-DNA-Fragment gemäß Anspruch 5 oder 10, gekennzeichnet durch die Sequenz GTGAATAGT.

12. Verfahren zur Herstellung eines Peptids, welches die Propagierung eines Plasmids gemäß Anspruch 9 in Zellen umfaßt.

13. Säugerzelle, die mit einem Plasmid gemäß Anspruch 9 transfiziert ist.