JPS63185386A - 自己複製配列ｄｎａ及びそのプラスミド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〈産業上の利用分野〉 本発明はプラスミド、ペプチド類の製造法および哺乳動
物細胞の自己複製配列ＤＮＡの取得法、新規なりＮＡ等
に関する。

〈従来の技術〉 遺伝子工学を応用したペプチド類の製造法としては、プ
ラスミドを利用して大腸菌、枯草菌等にペプチド、蛋白
質等を製造させる方法、ウィルスＤＮＡを利用してその
宿主にペプチド、蛋白等を製造させる方法等が知られて
いる。

しかしながら、これらはプラスミドの安定性、使用細胞
種が限られることおよび生産効率等において必ずしも満
足できるものてはない。

本発明者は、マウス細胞由来の自己複製配列（Ａｕｔｏ
ｎｏｍｏｕｓ　Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ　５ｅｑｕｅｎ
ｃｅ、Ａ　ＲＳ　）を含むＤＮＡフラグメントを単離し
、このフラグメントは塩基数が約２５００のＥｃｏＲＩ
及びＢｇｌ　ＩＴ切断断片であることを報告した（文献
１）。

木発明者は、このＡＲＳフラグメントの性質について検
討したところ、ＡＲ３がＣ−ｍｙｃ遺伝子の産物である
ｍｙｃ−蛋白等のＤＮＡ結合性蛋白と特異的親和性を有
すること、およびｃ−ｍｙｃ蛋白はｃ−ｍｙｃ遺伝子自
体に結合してその発現調節をしていることを見出し、こ
れらの知見に基いてｍｙｃ−蛋白等を用いて種々の哺乳
動物細胞よりＡＲ３を分離、取得することを可能にし、
さらにこの哺乳動物細胞の自己複製配列ＤＮＡ（ＡＲ３
）を利用して有用なペプチドや蛋白等を効率よく生産さ
せ得ることを見出して本発明を完成した。

〈発明の構成〉 本発明は、哺乳動物細胞の自己複製配列ＤＮＡの取得法
に関し、また哺乳動物細胞の自己複製配列ＤＮＡ　、プ
ロモーターおよびペプチド類生産用遺伝子（翻訳開始コ
ドンを含む）を含有するプラスミドおよびこのプラスミ
ドで形質転換された哺乳動物細胞に関し、さらにこの哺
乳動物細胞の自己複製配列ＤＮＡ　、プラスミドまたは
形質転換細胞を利用してペプチド類を製造する方法に関
する。

ＡＲ３とは、真核生物の染色体が自己複製する際の複製
起点である。これを取得するには次のようにすればよい
。

すなわち、哺乳動物細胞よりＤＮＡを取り出して適当な
制限酵素（六塩基認識酵素が好ましく、例えば旧ｎｄＴ
ＩＩ　、　ＥｃｏＲｌ、　Ｂａｍ）ＩＩ）で処理して適
当な大きさのＤＮＡフラグメント（通常１０００乃至ｔ
ｏｏｏｏｂｐ）となし、これをＤＮＡ結合性蛋白と混合
処理してＤＮＡ−蛋白結合体を生成させる。

ＤＮＡ結合性蛋白とは、細胞核内に存在してＤＮＡの機
能発現を制御している蛋白てあって、ＤＮＡと親和結合
性を有し、非ヒストン蛋白に分類されているものであり
、例えば、ｃ−ｍｙｃ蛋白　（文献１３参照）、ｖ−ｍ
ｙｃ蛋白　（文献１４参照）　、Ｎ−ｍｙｃ蛋白　（文
献１５参照）、ｃ−ｍｙｂ蛋白　（文献１５参照）、　
ｖ−ｍｙｂ蛋白（文献１５参照）、ｃ−ｆｏｓ蛋白　（
文献１５参照）、ｖ−ｆｏｓ蛋白　（文献１５参照Ｌｐ
５３（文献１５参照）、５Ｖ４Ｑ　Ｔ抗原（文献１６参
照）及びＲＢ遺伝子産物　（文献１７参照）等の、ｍｙ
ｃ蛋白やｍｙｂ蛋白等を挙げることができる。

ＤＮＡ−蛋白結合物を生成させた後は、抗原抗体反応等
の通常の蛋白分離取得手段を応用して目的のＤＮＡを取
得することができる。

すなわち、ＤＮＡ−蛋白結合物がそのままでは分離取得
しにくい場合は、これにＤＮＡ結合性蛋白に対する抗体
を結合させ、更にこの抗体と特異的に結合する物質、例
えばプロティンＡ１を結合させると、分子量の相当大き
な複合体が生成して沈殿しやすく分離取得が容易である
。

抗体は、通常の方法で作成すればよく、例えばＮ−ｍｙ
ｃ遺伝子の第三エクソン（Ｎ−ｍｙｃに特異的な部分）
を大腸菌を用いて発現させ、産生された蛋白を精製後通
常の方法でマウスに免疫し、抗血清からＩｇＧ分画を取
り使用する。また市販のもの（例えばオンニー社製抗ｍ
ｙｃ蛋白抗体：α−ｍｙｃ）を利用しても良い。

プロティンＡはスタフィロコッカス・アウレウスの菌体
懸濁液（Ｐ７１５５：シグマ社）や、担体結合物（Ａｇ
ａｒｏｓｅ　ＦＰＡ−１：コスモ・バイオ社、５ｅｐｈ
ａｒｏｓｅＣＬ−４Ｂ：ファルマシア社）も市販されて
いる。

ＤＮＡと蛋白との結合物（例えばＤＮＡ−ｍｙｃ蛋白−
抗体−プロチインＡ結合物）からのＤＮＡの単離も通常
の方法を利用すればよく、例えば２−メルカプトエタノ
ールのような試薬や蛋白を分解する酵素（Ｐｒｏｔｅａ
ｓｅ　Ｋ：シグマ社、Ｐｒｏｔｅｉｓａｓｅ　Ｎｏ、２
４５８８°メルク社）での処理によって蛋白部分を分解
し、それをフェノール抽出で除けばＤＮＡを得ることが
できる（文献１０参照）。

このようにして得るＤＮＡ結合性蛋白と特異的親和性の
あるＤＮＡフラグメントは、ＡＲＳのＤＮＡを含んでい
る。即ち、ＤＮＡ結合性蛋白とＡＲＳは非常に強い親和
性がある、ということは本発明者の見出した極めて重要
な事実である。

ＡＲＳを含んだＤＮＡフラグメントは、必要に応じてＡ
ＲＳのみ、またはＡＲＳを含んだ適当な長さのＤＮＡフ
ラグメントにして利用することがてきる。その操作やこ
のＡＲＳを利用してペプチド等の有用な物質を生産する
ためのＤＮＡ　ＩＡ理やスクリーニング等の技術は、実
施例等を参考にして一般的な技術を利用すればこの分野
の通常の知識を有する者が容易に理解し実施できるであ
ろう。

また、ＡＲＳは由来する細胞の動物の種差により、もし
くは細胞の種差により、または同一の細胞であってもそ
の中の他部位のＡＲＳであることによって、塩基配列が
僅かに異ることは充分に考えられる。従って、ＡＲＳは
上記のようにして単離されたＡＲＳの塩基配列と必ずし
も完全に同じでなければ利用し得ないわけではなく、そ
の一部の塩基を置換または除去、あるいは塩基を付加す
ることも可能であり、目的物の効率的な生産に適するか
否かは、本明細書の説明を参考にした通常の水準の試験
、研究により確めることができる。

本発明に関して、単離あるいは使用可能なＡＲＳとして
は、マウス、ラット、モルチット、牛、馬、羊、山羊、
兎、サル、チンパンジー、ヒト等の哺乳動物細胞由来の
ものがあげられるが、特に細胞培養技術の発達している
マウスまたはヒト細胞由来のものが適当であると言うこ
ともできる。

ＡＲＳを含んだＤＮＡを取得するための原料として使用
する細胞は特に限定されないが、ＤＮＡ結合性蛋白を多
量に産生じている細胞を用いるのが便利である。その例
としは、　ｃ−ｍｙｃ蛋白、　ｖ−ｍｙｃ蛋白、Ｎ−ｍ
ｙｃ蛋白、　ｃ−ｍｙｂ蛋白、　ｖ−ｍｙｂ蛋白、　ｃ
−ｆｏｓ蛋白、　ｖ−ｆｏｓ蛋白、ｐ５３　、ＳＶ４０
　Ｔ抗原、ＲＢ遺伝子産物を産生じている細胞、例えば
ヒトＨＬ−６０細胞、ヒトＩＭＲ細胞、ヒトＲａＪｉ細
胞、マウスＦＭ３八細胞等がある。

ペプチド類の生産に適した、ＡＲＳを含有する本発明の
プラスミドの構築には、通常の遺伝子組換技術を利用す
ればよい（文献７参照）。

また、細胞へのプラスミドの導入、使用する細胞の種類
および細胞の増殖方法等も、一般に知られた哺乳類細胞
や技術を利用することができ、今後改良される方法や培
養細胞、培地等の応用も可能であろう（文献８〜１０参
照）。

以下に一般的方法のうちのいくつかの例を挙げて更に説
明する。

使用可能なプロモーターの例としては、チミジンキナー
ゼプロモーター、イムノグロブリンプロ干−ター等の細
胞由来の各種プロモーター、または、ＳＶ４０のＴ抗原
プロモーター、初期プロモーター、ヘルペスウィルスの
チミジンキナーゼプロモーター等の哺乳動物細胞に感染
するウィルスのプロモーター等を挙げることができる。

翻訳開始コドンには通常のＡＴＧを使用することができ
る。

生産すべきペプチド類としては、インシュリン、成長ホ
ルモン、インターフェロン類、腫瘍壊死因子、インター
ロイキン等のリンホカイン、各種酵素等のペプチド、蛋
白、糖蛋白等の医薬として利用可能なものなどを挙げる
ことができる。

ペプチド類生産用遺伝子としては、前記のペプチド類の
アミノ酸配列をコードしたＤＮＡ、該ＤＮＡの３°側下
流に翻訳を終了させる為のポリＡシグナルを配列させた
もの等を挙げることができる。

本発明のプラスミドの製造には、適当な塩基対数を有し
て、通常使用される制限酵素による開裂部位を有するＤ
ＮＡフラグメント、プロモーター、翻訳開始コドンおよ
びペプチド類生産用遺伝子を適宜所望の配列になるよう
にして結合させ、さらにＡＲＳを加えて環状とする。

なお、ＡＲＳの向きおよび位置については特に限定的に
考慮する必要はない。

得られたプラスミドを、リン酸カルシウムを用いたトラ
ンスフェクション、マイクロインジェクション法、リポ
ソーム法、プロトプラスト融合法等を用いて、種々の哺
乳動物細胞に導入して形質転換細胞を作製することがで
きる。培養細胞の例としてはマウスのＮ５−１およびＦ
Ｍ３八、ヒトのＨＬ−６０、Ｕ９３７、［１ａｕｄｉお
よびＲａｊｉ等を挙げることができる。

この形質転換細胞を増殖させることにより目的のペプチ
ド類を製造することができる。

この際、ＡＲＳの由来した細胞とプラスミドを導入する
相手の細胞の種が同じである必要がないことは、本発明
の特徴の一つである。

形質転換細胞の培養には、使用された細胞の通常の培養
法、例えは適当量の修生血清を含有したＤＭＥＭ（Ｄｕ
ｌｂｅｃｃｏ’ｓ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ’ｓ
　ｍｅｄｉｕｍ）を用いて５＊二酸化炭素の存在下３７
℃で培養する方法、あるいは動物腹腔内での増殖等があ
る（文献８〜１０参照）。

生産されたペプチド類は、培地中に遊離している場合に
は通常の分画方法、例えば遠心、ゲルろか等を、細胞中
に蓄積されている場合には細胞を破砕後通常の分画方法
を用いることにより、あるいは腹水から一般的方法によ
り単離することができる。

以下に、本発明を更に実施例により説明するがこれらに
よって限定されるものではない。

実施例１ １）マウスのＡＲＳ及びチミジンキナーゼ遺伝子を有す
るプラスミドの作製（第１図参照）プラスミドｐＭＵ６
５　（文献１）をＥｃｏＲＩ及びＢｇｌ　ＩＩで処理し
、塩基対数約２５００のＤＮＡフラグメントを単離した
。このフラグメントをプラスミドｐＫｓＶ１０（ファル
マシア社製）のＥｃｏＲＩ−Ｂｇｌ　Ｈ領域に挿入しプ
ラスミドｐＡＲ５６５を作製した。

プラスミドｐＡＧｏ　（文献２）をＢａｍＨＩで処理し
てヘルペスウィルス由来のチミジンキナーゼ遺伝子を含
むフラグメントを単離した。このフラグメントを上記プ
ラスミドｐＡＲ５８５のＢａｍＨＩサイトに挿入し、プ
ラスミドｐ８５−ｔｋを製した。このプラスミドを大腸
菌（Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ１２　［６００）中で増殖させた
（徹工研寄託番号ＦＥＲＭ　Ｐ−８８６３）。

プラスミドｐＭＴＩＯＤ　（文献３）を、ＢａｍＨＩお
よびＰｖｕ　ＩＩで処理し、初期プロモーターを有する
ＳＶ４０Ｔ抗原遺伝子を単離した。該遺伝子のＰｖｕ　
ＩＩＩＩトにＢａｍＨＩリンカ−（宝酒造製）を結合さ
せた。

得られたフラグメントをプラスミドｐＡＲ５８５のＢａ
ｍＨ■サイトに挿入し、プラスミドｐ６５−Ｔを得た。

３）蛋白（チミジンキナーゼ）の発現 リポソーム法（文献４）に従って１）で得たプラスミド
ｐ６５−ｔｋをＦＭ３Ａｔｋ−細胞に形質転換した。

形質転換を行う際には、５０ｍＭ　ＥＤＴＡ含有２０ｍ
Ｍトリスバッファー（ｐＨ７，５）を用い、リポソーム
はフォスファチジルセリンを用いて公知の方法（文献５
）に従い調製した。

形質転換後、細胞を１輪修生血清含有ＤＭＥＭを用い論
二酸化炭素の存在下３７℃で培養した。２日後培地を貼
Ｔ培地に換えた。

形質転換細胞、即ちＦＭ３Ａｔｋ＋約３Ａｔｋ＋間後よ
り出現した。　２週間後に各コロニーを単離し、それぞ
れ細胞数が１０７個程度になるまで１（ＡＴ培地で培養
した。この間約６０倍化回数を経過した。

この方法により１，０００個の細胞について形質転換を
試みたところ、約３００〜４００個の形質転換細胞が得
られた。従）て、ｐ６５−ｔｋがＦＭ３Ａｔｋ−細胞中
で増殖していること及びチミジンキナーゼ遺伝子が発現
していることが確認された。

４）　コピー数の検討 上記の１０７個の細胞より、ハート（Ｈｉｒｔ）法（文
献６）により低分子量ＤＮＡを抽出した。プラスミドが
形質転換細胞中で複製したことを確認するため、得たＤ
ＮＡを制限酵素ＤｐｎＩで処理した。

ＦＭ３Ａｔｋ−細胞に導入されたｐ６５−ｔｋのアデニ
ン部分はメチル化されているが、該細胞中て複製したも
のはメチル化していない。Ｄｐｎｌはメチル化したＤＮ
Ａのみを選択的に切断するので、該細胞中で複製したプ
ラスミドは切断されず、細胞に入ったプラスミドのみを
切断して複数のＤＮＡフラグメントとする。従って、細
胞中で複製したプラスミドを容易に電気泳動法により区
別することができる。

ＤｐｎＩ処理後アガロースゲル電気泳動（文献７）によ
りＤＮＡを分離し、これをサザンブロツテイング（文献
１１）シた。即ち、３２ｐで標識したｐ６５−ｔｋをプ
ローブとしてパイプリダイゼーションを行い次いでＸ線
感光フィルムを用いてオートラジオグラフィーを行い、
プローブとハイブリダイズするバンドを検出したところ
、検討した２０個のクローン全てについてｐ６５−ｔｋ
が染色体外ＤＮＡとして複製していることが確認された
。

細胞当りのコピー数は、感光度から１００〜２００であ
った。このプラスミドは、細胞をＨＡＴ培地から１鴎仔
牛血清を含むＤＭＥＭにかえて培養した場合でも安定に
複製し、ＤＮＡ上での改変は何ら見られなかりた。また
、このプラスミドは１５０倍化回数経過しても安定に細
胞中に存在することが確認された。

５）プラスミドｐＡＲ５−６５の各種細胞における複製 ｐＡＲ５−６５を上記の方法に従いマウスＮ５−１細胞
、ヒトＨＬ−８０細胞およびヒトＵ９３７細胞にそれぞ
れトランスフェクションし、１眞仔牛血清を含んだＲＰ
ＭＩ　１６４０培地を用いて論の二酸化炭素の存在下３
７℃で培養した。４０時間後に、上記４）の方法に従い
染色体外の低分子量ＤＮＡを解析した。その結果Ｎ５−
１細胞に約５００コピー、ＨＬ−７１５５：に約１０，
０００コピー及びＵ９３７細胞に約ｉｏｏコピーのｐＡ
Ｒ５−６５が複製していることが確認された。

従って、ｐＡＲ５−６５はマウス以外の種の細胞でも複
製することが確認され、ｐ６５−ｔｋも該複製能を有す
ることが示唆された。

ヒト１（Ｌ−６０細胞のＤＮＡを５ＤＳ−プロテイネー
スに法（ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　Ｋ）　　（文献７）に
より抽出し、１ｉｎｄ■！ｌで処理した。得られたＤＮ
Ａフラグメントよりｍｙｃ蛋白と親和性を有するＤＮＡ
フラグメントを取り出すため、公知の方法（文献１２）
に従い以下の操作を行った。即ち、前記ＤＮＡフラグメ
ントをＨＬ−６０核抽出液（大量のＩｎｙＣ蛋白が存在
する）と混合し、０℃で３０分間反応させてＤＮＡ−ｍ
ｙｃ蛋白結合物を生成させた。

次にｍｙｃ蛋白に対する抗体（αｍｙｃ、オンニー社製
）を加え、ＤＮＡ−ｍｙｃ蛋白−αｍｙｃ複合体を形成
させた。更に、αｍｙｃと特異的に結合するプロティン
八を含むスタフィロコッカス　アウレウス菌の水溶液を
加え、ＤＮＡ−ｍｙｃ蛋白−αｍｙｃ−プロティンＡ複
合体を形成させた。

該複合体は沈殿するのてこれを分離し、０．１！ｋｓＤ
ｓ及び０．１Ｍ塩化ナトリウムを含、ントリスバッファ
−（ｐＨ７，５）で洗浄した後、１９６ＳＤＳを含む７
ｍＭ　２−メルカプトエタノール水溶液を加えて３０℃
て３０分間反応させ、ＤＮＡを遊離させた。反応混合物
を１５．０００　ｘ　ｇて５分間遠心し、上澄を単離し
た。これをフェノールで抽出し、目的とするＤＮＡフラ
グメントな得た後ｐＵｃ１９　（ファルマシア社製）の
旧ｎ　ｄ　Ｉ１１サイトに挿入した。また、得られたＤ
ＮＡフラグメントの塩基対数をアガロースゲル電気泳動
法て検討したところ、約２００であった。

得られたプラスミドをＥ、ｃｏｌｉ　Ｋ１２　Ｃ６００
中で増殖させた（微工研寄託番号ＦＥＲＭ　Ｐ−８８６
４）。

尚、上記のＨＬ−６０核抽出液は以下のように調製した
。即ち、）ＩＬ−６０細胞の培養液（５Ｘ１０５７ｍｌ
）　１　ｐを遠心して細胞を集め、リン酸バッファー生
理食塩水で洗浄した。これを更に低張水溶液（２０ｍＭ
　ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７，５，５ｍＭ塩化カリウム、０．
５ｍＭ塩化マグネシウム、０．５ｍＭジチオスレイトー
ル、０．２ｍＭショｍ）で洗浄した。これを５ｍｌの低
張水溶液（上記水溶液よりショ糖を除いたもの）に懸濁
して１０分間静置した。これをダウンスホモジナイザー
で４０回上下させ、次いで３０００　Ｘ　ｇで１０分間
遠心し、沈殿物を得た。

この沈殿物が核なので、これを２．５ｍｌの水溶液（５
ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、ｐ）１７．５．１０＊シヨ＊）に溶
かし、液体窒素中に一時保管した。これを０℃でゆっく
り溶かし、５Ｍ塩化ナトリウム水溶液を最終濃度０．１
Ｍになるように加えて０℃で５分間処理した。これを１
５．０００　Ｘ　ｇで２０分間遠心し、上澄を杉油出液
として得た。

上記Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ１２　Ｃ６００中で増殖したプラ
スミドを単離しく文献７　）　、Ｈｉｎｄｌｌ＋で処理
したところ該プラスミドは旧ｎ　ｄ　ＩＩＩで切断され
ないことから、菌によるプラスミドの再編成が起こって
いると考えられ、本プラスミドをｐＨＬ　ｍｙｃと命名
した。

プラスミドｐＬＩｃ１９は、旧ｎｄ　ＩＩＩ以外にＢａ
ｍＨＩ及びＮａｒＩ等の制限酵素切断部位を有している
ので、上記プラスミドをＢａｍＨＩ及びＮａｒＩで処理
し、生成した二つのフラグメンのうち小さい分子量を有
するＤＮＡフラグメントなＪ＃離した。

このフラグメントを鋳型として３２ｐでラベルしたプロ
ーブを作製し、ＨＬ−６０細胞のＤＮＡとサザンハイプ
リダイゼーション（文献１１）を検討したところ、該プ
ローブがＨＬ−６０細胞ＤＮＡとパイプリダイズするこ
とからＮａｒＩサイト及びＢａｍ旧サイトを両端に有す
るフラグメント（Ｎａｒｌ−ＢａｍＨＩフラグメント）
はＨＬ−６０細胞由来のＤＮＡを含んでいることが確認
された。

ＮａｒＩ−Ｂａｍ旧フラグメントの塩基対数をアガロー
スゲル電気泳動法で検討したところ、約２００〜３００
であった。

ｐＵｃ１９の旧ｎ　ｄ　ＨＩサイトとＮａｒｌサイトは
１３１塩基対離れ、Ｈｉ　ｎ　ｄ　ＩＨサイトとＢａｍ
旧サイトは３５塩基対離れ、更にＰｓｔＩサイトとＢａ
ｍ１（Ｉサイトは２５塩基対離れている。更にプラスミ
ドｐ）ｌＬｍｙｃではＰｓｔ１部位は保持されていた。

従って、プラスミドｐＨＬｍｙｃにおける）ＩＬ−６０
細胞由来のＤＮＡの塩基対数は約１２０であると推定さ
れた。

この塩基配列を解明したところ、ポリリンカーのＨｉ　
ｎ　ｄ　ＩＩＩサイトの中に９９塩基が確認された。そ
の配列を次に示す。

ＧＴＡＴＧＡＴＡＣＡＧＡＴＣＧＴＧＡＧＡＡＴＡＣＧ
ＴＡＧＣＣＴＣＧＴＣＡＣＣＡＴＴＧＡＧＣＡＧＴＡ（
１：ＧＴＴＧＴＡＣＴＧＧＡＡＧＡＧＡＣＣＡＴＧＣＴ
ＣＴＧＡＣＡＣＴＧＣＡＣＧＡＣＧＴＧＡＣＡＧＣＡＴ
にの配列についてインバーテツド・リピート（ｉｎｖｅ
ｒｔｅｄ　ｒｅｐｅａｔ）を検索したところ、第５図お
よび第６図に示すようなヘアピン構造をとる可能性が示
唆された。これに基けば、上記の９９塩基の１２から５
９または１７から７４が最も重要な自己複製配列（ＡＲ
３）の塩基配列であると考えられる。

２）プラスミドｐＨＬｍｙｃがＡＲ３を有することの確
膨エ リポソーム法を用いてｐＨＬｍｙｃでＨＬ−６０細胞を
形質転換し、次いで上記の方法に従ってコピー数を検討
したところ、細胞当り約１０，０００であった。

プラスミドｐｍｙｃ　（オンニー社製、ｍｙｃの構造遺
転子およびＲｏｕｓ　ｓａｒｃｏｍａ　ｖｉｒｕｓのロ
ングターミナルリピートプロモーター（ＬＴＲ）を含む
）をＢａｍ１（ｒ、Ｈｉ　ｎ　ｄ　ＩＩＩおよびＥｃｏ
ＲＩて処理しｍｙｃの構造遺伝子およびＬＴＲをＸＬ離
した。このものをｐＨＬｍｙｃのＥｃｏＲＩ−Ｂａｍｌ
（Ｉ領域に挿入しプラスミドｐＡＲ５ｍｙｃを作製した
。このプラスミドでヒトＵ９３７細胞をリポソーム法に
よって形質転換し、１吐仔牛血清を含むＲＰＭＩ１６４
０培地を用いて５６６二酸化炭素の存在下３７℃で培養
した。

３日後ノーザンハイプリダイゼーション法（文献７）を
用いて細胞中のｍｙｃ遺伝子の１ｎＲＮＡ量を検討し、
ｐＡＲ５を有しないＵ９３７細胞のｍＲＮＡ遺伝子の量
と比較したところ、約１００倍であった。従って、プラ
スミドｐＡＲ５ｍｙｃのｌｌ１ｙＣ遺伝子よりｍＲＮＡ
が転写されていると考えられた。

実施例３ １）　ヒトｃ−ｍｙｃ遺伝子のサブクローニングヒトｃ
−ｍｙｃ遺伝子（Ｍｏ１．Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、、　５
　４１４〜４１８　（１９８５））の上流領域にある旧
ｎｄｌｌｌ　−Ｋｐｎ　Ｉ領域（約１２００ｂｐ）およ
び旧ｎｄｌｌｌ−Ｐｓｔｌ領域（約２００ｂｐ）をそれ
ぞれｐＵｃ１８およびｐＵｃ１９にサブクローニングし
た。そのクローンのプラスミドを、各々ｐｍｙｃ（Ｈ−
Ｋ）、ｐｍｙｃ　（Ｈ−Ｐ）と名付けた。

２）　　Ｈｉｎｄｌｌｌ−ＫｐｎＩフラグメントおよび
ＨｉｎｄｌｌＩ−Ｐｓｔ■フラグメントとｃ−ｍｙｃ蛋
白との結合ＤＮＡと蛋白との結合を調べる方法として近
年さかんに使われている方法として、ゲルシフトアッセ
イがある。これは、アイソトープ標識したＤＮＡを蛋白
と結合させ、単にポリアクリルアミドゲルに流すといっ
た簡単なもので、ＤＮＡ−蛋白複合体はＯＮへのり動が
ゲル中で遅れるということを利用したものである（文献
１８参照）。

ｃ−ｍｙｃ蛋白を大量に産生しているＨＬ−６０細胞よ
り杉油出液をとり、これをｃ−ｍｙｃ蛋白源とした。

上記ｃ−ｍｙｃ遺伝子のＨｉｎｄｌｌｌ　−Ｋｐｎ　Ｉ
フラグメントおよびＨｉｎｄｌｌｌ−Ｐｓｔ　Ｉフラグ
メントを杉油出液と混合し、３０℃１５分保温後、５＊
ポリアクリルアミドゲルに流した。

一方、上記抽出液を先にｃ−ｍｙｃ抗体と反応させたも
のを同様に各フラグメントと処理した。結果として、両
フラグメントは蛋白と結合したが、予めＣ−ｍｙｃ抗体
処理したものでは阻害された。

これから、Ｂｉｎｄｌｌｌ　−Ｐｓｔ　Ｉフラグメント
（約２００ヌクレオチド）内にｃ−ｍｙｃ蛋白結合部位
のあることがわかった。

ｐｍｙｃ　（Ｈ−Ｋ）を旧ｎ　ｄ　ＩＩＩおよびＫｐｎ
　Ｉで、ｐｍｙｃ　（Ｈ−Ｐ）を旧ｎ　ｄ　ＩＨおよび
ＰｓｔＩてそれぞれ処理してＤＮＡフラグメントとなし
、これらを実施例２と同様に、ｃ−ｍｙｃ蛋白と混合処
理、抗体との処理、プロティンＡとの処理および蛋白分
解と除蛋白処理をしてＨｊｎｄｌｌｌ　−Ｋｐｎ　Ｉフ
ラグメントおよびＨｉｎｄｌｌｌ　−Ｐｓｔ　Ｉフラグ
メントを得た。

この旧ｎｄｌｌＩ　−１’ｓｔ　Ｉフラグメントの塩基
配列をダイデオキシ法で決定した。これを次に示す。

ＴＡＧＧＧＴＴＴＧＴ　　ＴＧＧＡＡＴＴＴＴＴＴＴＴ
ＴＣＣＧＴＣＴ　　ＧＴＧＴＡＣＴＴＣＧＴＣＧＡＡＴ
ＴＡＴＴ　　ＴＣＡＣＧＴＴＧＣＣＡＴＴＡＣＣＧＧＴ
Ｔ　　ＣＴＣＣＡＴＡＧＧＧＴＧＡＴＧＴＴＣＡＴ　　
ＴＡＧＣＡＧＴＴＧＧＡＴＧＡＴＡＧＧＴＴ　　ＡＴＴ
ＣＡＣＡＴＣＴＣＴＴＡＴＧＧＣＧＧ　　　ＴＧＡＡＴ
ＡＧＴＣＡＣＣＴＣＴＴＧＡＡＣＣＡＣＴＴＴＴＴＣＣ
ＴＣＣＡＧＴＡＡＣＴ　　　ＣＣＴＣＴＴＴＣＴＴＣＧ
ＧＡＣＣＴＴＣＴ　　　ＧＣＡＧ この配列の推定二次構造式を第７図に示す。また、マウ
スＡ　ＲＳ　（ｐＡＲ５６５）およびヒトＡ　ＲＳ　（
ｐＨＬｍｙｃ）と相補性のある部分とその近辺を第８図
に示す。星印は一致している部分であり、アンダーライ
ンした部分はＡＲＳに必須と考えられるステムループ構
造のステム（軸）部分にあたると考えられて重要なりＮ
Ａ配列であり、特に、ＧＴＧＡＡＴＡＧＴは極めて重要
な配列と考えられる。

これらの結果から、特許請求の範囲に示す種々のＤＮＡ
配列は有用であると考えられる。

衷旌狙１ 実施例２と同様にして各種細胞核ＤＮＡ、蛋白および抗
体を用いて各種プラスミドを得た。

プラスミド塩とその原料の関係を表に示す。

ｐｍｙｃ　（Ｈ−Ｋ）　、　ｐｍｙｃ　（Ｈ−Ｐ）　、
　ｐ　ＩＭＲ−ＮおよびｐＲＪ−５３を各々実施例１の
３）以下と同様にリポソーム法で細胞に導入しコピー数
の検討をした。プラスミド塩、使用細胞およびコピー数
を表に示す。

〈発明の効果〉 本発明によれば、種々の哺乳動物細胞中でＡＲ３の働き
によりプラスミドが効率よく複製され、即ちプラスミド
の細胞当りのコピー数が多いことから遺伝子産物の生産
効率が優れており、本発明は遺伝子工学的に優れたペプ
チド類の生産方法である。

参照文献 文献Ｉ　　Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、、５．５６３
−５８８　（１９８５）文献２　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、
Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＬＩＳ八、７８．３７５５　（１９
７９）文献３　Ｊ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、４８，４８１−
４９１　（１９８１）文献４５ｃｉｅｎｃｅ、２１５，
１６６　（１９８２）文献５　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａ
ｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、７５．４１９４　（１９７８
）文献６　Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、、９３．５０３−５
１７　（１９７５）文献７　Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅ
ｔ　ａｌ、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ。

Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ　　（１９８２）文献８　宗村編　細胞培養マニ
ュアル　講談社文献９　Ｋ、Ｈａｂｅｌ　ｅｔ　ａｌ、
、Ｆｏｕｎｄａｍｅｎｔａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｉｎ
　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、
Ｎ、Ｙ、（１９６９）文献１０　Ｋｒｕｓｅ　＆　Ｐａ
ｔｔｅｒｓｏｎ　、Ｔｉ５ｓｕｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ。

Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、Ｎ、Ｙ、（１９７３）
文献１１　Ｊ、Ｍｏ１．８ｉｏ１．．２６，３６５−３
６９　（１９６７）文献１２　Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉ
ｏｌ、、３．１９５８−１９８６　（１９８３）文献１
３５ｃｉｅｎｃｅ　　２２５．７１８−７２０　（１９
８４）文献１４　Ｎａｔｕｒｅ　２９６，２６２−２６
４　（１９８２）文献１５　Ａｎｎｕ、　Ｒｅｖ、Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ、５２，３０１−３１０　（１９８３）文献
１δＣｅ１ｌ　１３，１６５（１９７８）文献１７５ｃ
ｉｅｎｃｅ　２３５．１３９４−１３９９　（１９８７
）文献１８　Ｎｕｃｌｅｉｃ　八ｃｉｄ　Ｒｅｓ、、９
３０４７〜３０６０（１９８１）

【図面の簡単な説明】

第１図乃至第４図はプラスミドの構築概略図であり第５
図乃至第７図は推定二次構造である。 第８図はＤＮＡ配列の比較図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）哺乳動物細胞の自己複製配列ＤＮＡ、プロモータ
   ーおよびペプチド類生産用遺伝子（翻訳開始コドンを含
   む）を含有するプラスミド （２）哺乳動物細胞の自己複製配列ＤＮＡ、プロモータ
   ーおよびペプチド類生産用遺伝子（翻訳開始コドンを含
   む）を含有するプラスミドを細胞中で増殖させることを
   特徴とするペプチド類の製造法（３）哺乳動物細胞の自
   己複製配列ＤＮＡ、プロモーターおよびペプチド類生産
   用遺伝子（翻訳開始コドンを含む）を含有するプラスミ
   ドで形質転換された哺乳動物細胞 （４）ＤＮＡ結合性蛋白と親和性を有する哺乳動物細胞
   由来自己複製配列ＤＮＡフラグメント （５）ＤＮＡ結合性蛋白がｍｙｃ蛋白、ｃ−ｍｙｂ蛋白
   、ｖ−ｍｙｂ蛋白、ＳＶ４０Ｔ抗原、ｐ５３、ｃ−ｆｏ
   ｓ蛋白、ｖ−ｆｏｓ蛋白、またはＲＢ遺伝子産物である
   特許請求の範囲第４項の哺乳動物細胞由来自己複製配列
   ＤＮＡフラグメント（６）哺乳動物細胞由来ＤＮＡフラ
   グメントをＤＮＡ結合性蛋白と結合させ、ついでこの結
   合物からＤＮＡを単離することを特徴とする哺乳動物細
   胞の自己複製配列ＤＮＡの取得法 （７）ＤＮＡ結合性蛋白がｍｙｃ蛋白、ｃ−ｍｙｂ蛋白
   、ｖ−ｍｙｂ蛋白、ＳＶ４０Ｔ抗原、ｐ５３、ｃ−ｆｏ
   ｓ蛋白、ｖ−ｆｏｓ蛋白、またはＲＢ遺伝子産物である
   特許請求の範囲第６項の哺乳動物細胞の自己複製配列Ｄ
   ＮＡの取得法（８）次の群からなる塩基配列を有するＤ
   ＮＡおよびそれと同等の機能を有する自己複製配列 【遺伝子配列があります】 および 【遺伝子配列があります】 および 【遺伝子配列があります】 （９）次の群からなる塩基配列を有するＤＮＡおよびそ
   れと同等の機能を有する自己複製配列 【遺伝子配列があります】 および 【遺伝子配列があります】 および 【遺伝子配列があります】 および 【遺伝子配列があります】 および 【遺伝子配列があります】 および 【遺伝子配列があります】 および 【遺伝子配列があります】