CN102086450B - 一种用于分离纯化高酶活人类DNA聚合酶δ的免疫亲和层析柱及分离纯化方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种免疫亲和层析柱，以及应用该层析柱分离纯化高酶活人类DNA聚合酶δ的方法。所说的免疫亲和层析柱是将抗p125的多克隆抗体与CarboLink^TMCouplingGel耦联而制得。其分离纯化方法是：应用杆状病毒Bac-to-Bac系统，从感染了含各亚基重组病毒的宿主昆虫细胞Sf-9中，应用所制备的免疫亲和层析柱，结合离子交换层析，分离纯化出高纯度的目的产物。本发明可以简单、快速、高效地从杆状病毒表达系统中分离纯化出具高生物活性的重组人DNA聚合酶δ多亚基蛋白复合物；将极大地推动某些重要疾病、特别是癌症疾病研究所涉及到的DNA聚合酶分离纯化研究领域的发展。

Description

一种用于分离纯化高酶活人类DNA聚合酶δ的免疫亲和层析柱及分离纯化方法

技术领域

本发明涉及蛋白质工程和生物技术领域，具体而言，特指：通过制备兔源多克隆抗体耦联的免疫亲和层析柱，利用昆虫细胞－杆状病毒表达系统，简单、快速、高效地分离纯化具高生物活性的重组人DNA聚合酶δ多亚基蛋白复合物。

背景技术

真核生物DNA聚合酶Pol δ (Polymerase δ, Pol δ) 是由四个亚基p125、p50、p68和p12构成的异源四聚体，是染色体DNA复制过程中最主要的复制酶，同时还参与多种形式的DNA损伤修复，在维持细胞周期的正常调节以保证基因组结构的完整性和遗传稳定性、防止遗传变异和癌症疾病发生等方面起着极其重要的作用。它作为第一个具有3’-5’核酸外切酶活性的真核DNA聚合酶，于上个世纪70年代在So A.G..博士实验室被首次发现以来（Byrnes, J.J., et al, Biochemistry, 1976, 15: 2817-2823），全世界科研人员为了获得具有生物活性的高纯度聚合酶Pol δ做出了巨大的努力。

早期从动物组织中分离纯化真核聚合酶Pol δ极度困难，至少需要8个分离柱，耗时数个月，从1公斤小牛胰腺中仅能获得约33微克、只含有p125和p50二亚基组合的蛋白复合物(Lee, M.Y., et al, Biochemistry, 1984, 23: 1906-1913)，天然Pol δ分离纯化的困难是真核聚合酶研究领域进展缓慢的主要原因之一。

1995年，Jiang Y.博士提出一种改进的Pol δ 分离纯化方法（Jiang, Y.，et al, Archives of Biochemistry and Biophysics, 1995, 320: 297-304），通过制备鼠源的抗DNA聚合酶 δ 催化大亚基p125的单克隆抗体，将经过Protein A-Sepharose柱纯化后的150毫克抗体耦联到AvidChrom Hydrazide Gel上而获得一个20毫升的免疫亲和层析柱，结合DEAE-cellulose和 Phenyl-agarose柱，从750克的小牛胰腺中获得1.5毫克的Pol δ，虽然得率比传统的纯化方法提高了近15倍，但纯度还是很不理想。

2000年，Mo J.博士在以上所述的纯化方法基础上，增加了Single-Stranded DNA Cellulose 柱和Heparin-Agarose 柱，在纯化出的蛋白复合物中，通过质谱分析，确定出Pol δ的第3个亚基，即调节亚基p68 (Mo, J., et al, Biochemistry, 2000, 39: 7245-7254)。而Liu L.博士应用传统的分离纯化法（8个分离柱），结合Jiang博士的免疫亲和层析法，确定出Pol δ的第4个亚基，即小亚基p12 (Liu, L., et al, J. Biol. Chem, 275: 18739-18744)。

2002年，利用 AcMNPV杆状病毒－Bac-to-Bac表达系统，通过制备四个亚基重组病毒共感染Sf-9昆虫细胞, Pol δ各亚基在昆虫细胞中得到表达并成功地装配成不同组合的、具生物活性的蛋白复合物（Xie, B., et al, Biochemistry, 2002, 41: 13133-13142; Podust, V.N., et al., J Biol Chem, 2002, 277: 3894-3901），用Source15 Q、Mono Q和Superose 6三个分离柱（Xie, B., et al, Biochemistry, 2002, 41: 13133-13142），或应用免疫亲和层析，结合离子交换树脂柱（Li, H., et al., J. Biol. Chem., 2006, 281:14748-14755），从感染的Sf-9细胞中纯化出多亚基蛋白复合物。

在聚合酶Pol δ多亚基蛋白复合物分离纯化过程中，不管是从动物组织或培养的动物细胞中提取天然的酶复合物，还是从感染的昆虫细胞中分离纯化重组的蛋白复合物，免疫亲和层析起着主要的作用。由于早期的免疫亲和层析柱是用抗p125的单克隆抗体耦联到AvidChrom Hydrazide Gel上，且分离纯化后获得的蛋白复合物纯度并不理想，无法满足DNA 聚合酶Pol δ领域的深入研究，如：到目前为止，还未获得真核DNA聚合酶Pol δ的蛋白晶体以供酶的功能和结构分析之用；制备免疫亲和柱需大量的单克隆抗体，商业化的单克隆抗体价格昂贵，制备单克隆抗体成本高、周期长，严重制约了免疫亲和层析法在真核DNA聚合酶Pol δ分离纯化过程中的广泛应用。

发明内容

为了解决目前的技术问题，克服现有技术的不足，本发明提出一种快速、方便、高效地纯化高酶活DNA聚合酶Pol δ多亚基蛋白复合物的方法。

CarboLink^TM Coupling Gel是一种特别适合耦联多克隆抗体的支撑载体，由于它是通过多克隆抗体的Fc 蛋白耦联，耦联后抗体上与抗原的结合位点不被阻挡，能够最大限度地与目的蛋白结合。本发明利用多克隆抗体与CarboLink^TM Coupling Gel耦联，制备一种新的免疫亲和层析柱，结合离子交换层析，快速、方便、高效地从杆状病毒表达系统中纯化出高酶活重组真核DNA聚合酶Pol δ多亚基蛋白复合物。

本发明所述的用于分离纯化高酶活人类DNA聚合酶δ的免疫亲和层析柱，是将抗p125的多克隆抗体与CarboLink^TM Coupling Gel耦联而制得。

上述的抗p125的多克隆抗体是通过下述方法制得：利用Bac-to-Bac系统，制备含6个组氨酸标签的DNA聚合酶δ催化大亚基p125作为抗原，在成年新西兰兔中制备抗p125的抗血清，纯化抗血清获得高纯度的多克隆抗体。

上述方案中，利用Bac-to-Bac系统制备抗原所用的供体质粒是pFastBacHTc。

上述方案中抗血清的纯化是指饱和硫酸铵沉淀法和Immobilized Protein A柱纯化法相结合。

本发明还公开了一种高酶活人类DNA聚合酶δ的分离纯化方法，是指Bac-to-Bac系统，制备含人类聚合酶Pol δ四种亚基的重组病毒，共感染宿主细胞Sf-9，使得各亚基在细胞中表达和装配；收集感染的Sf-9细胞，经超声波裂解、高速离心后，收集上清，经过权利要求1所述的免疫亲和层析柱和离子交换层析柱分离纯化出高纯度的目的产物。

本发明所述的DNA聚合酶Pol δ的4个亚基分别为p125、p68、p50和p12，相对应的cDNA分别源自人类DNA聚合酶基因POLD1、POLD3、POLD2和POLD4；所述的杆状病毒是AcMNPV；所述的宿主昆虫细胞为Sf-9；所述的供体质粒是pFastBac，所制备的各亚基重组杆状病毒分别是rAc -pFast-p125、 rAc-pFast-p68、 rAc-pFast-p50 和rAc-pFast-p12。

本技术方案所述的制备抗原所用的供体质粒是pFastBacHTc，获得的重组供体质粒是pFastBacHTc-p125，获得的重组杆状病毒是rAc-pFast-His-p125，制备的抗原是His-p125；抗体制备所用的动物是新西兰成年兔，抗体纯化所采用的是硫酸铵沉淀法和Immobilized Protein A柱纯化法，所制备的抗体是指抗人类DNA聚合酶Pol δ催化大亚基p125的多克隆抗体α-p125。

本技术方案所述的免疫亲和层析柱是指制备的耦联了兔源多克隆抗体α-p125的CarboLink^TM Coupling Gel，离子交换层析柱是指FPLC Mono Q。

本发明的突出优点表现为：

制备的兔源多克隆抗体耦联的免疫亲和层析柱功能强大，从感染的500 ml悬浮培养的Sf-9细胞中经纯化后可获得3－8mg高纯度的DNA聚合酶复合物。

简化了人DNA聚合酶Pol δ的多亚基蛋白复合物的纯化步骤，采用本发明的两步法，在24小时之内即可完成整个纯化过程。

纯化出的酶活性高，酶的比活性达到20,000－25,000 Units/mg，PCNA的刺激倍数为6－10倍。

由于避免了单克隆抗体的制备，使得免疫亲和层析柱制备成本大大降低，制备周期缩短，将使得这一方法在DNA聚合酶多亚基蛋白复合物分离纯化领域得到广泛应用。

本发明通过以下附图和实施例作进一步详细阐述。

附图说明

   图1. 制备的重组杆状病毒rAc-pFast-His-p125的Western检测结果。右边的数字代表标准蛋白Marker; 1，2：两个平行的病毒转染实验。

图2. 利用镍柱纯化的His-p125蛋白洗脱图。M：标准蛋白Marker；E1-E4：收集的蛋白馏分。

图3. 经过Immobilized Protein A柱纯化后的抗体在SDS-PAGE胶上的分析结果。M: 标准蛋白Marker；3，6，9，12，15，18，21，24，27，30：为洗脱后所收集的抗体馏分编号。

图4. 经FPLC Mono Q柱纯化浓缩后的四亚基p125/p68/p50/12组合在SDS-PAGE胶上的分析结果。M：标准蛋白Marker；12，13，14，15，16，17：为洗脱后所收集的馏分编号。

图5. 经FPLC Mono Q柱纯化浓缩后的三亚基蛋白复合物的SDS-PAGE电泳结果。1，2：分别为p125/p50/p12和 p125/p68/p50三亚基蛋白复合物；3： p125/p68/p50/12四亚基蛋白复合物作为对照。

具体实施方式

实验材料：

限制性内切酶、连接酶、RNA酶、IPTG、X-Gal、SDS、TEMED、丙烯酰胺及甲叉丙烯酰胺为Promega公司产品；PCR试剂盒、大肠杆菌培养基LB、昆虫细胞培养基Sf 900II、胎牛血清、CELLFECTIN Reagent等化学试剂购自GIBCO BRL公司；人类DNA聚合酶Pol δ 的4个亚基p125、p68、p50和p12 cDNA由美国范德堡大学（Vanderbilt University）Ellen H. Fanning教授惠赠；杆状病毒供体质粒pFastBac和pFastBacHTc购自GIBCO BRL公司；CarboLink^TM Coupling Gel、Immobilized Protein A柱、带组氨酸标签蛋白纯化试剂盒均购自Pierce公司；多克隆抗体制备所需动物和材料由江苏大学实验动物中心提供；大肠杆菌DH5α、DH10Bac和昆虫细胞Sf-9由江苏大学生命科学研究院保存，也可从BD bioscience公司购买。

说明：以下实施例中未作具体说明的实验操作方法均参照《分子克隆实验指南》（Sambrook等编著，科学出版社，1992年版）、《Antibodies: A Laboratory Manual》 （Ed Harlow and David Lane编著，1988）、试剂盒说明书、及产品说明书进行。

实施例一：多克隆抗体的制备

1. 抗原的制备：

(1). 重组供体质粒pFastBacHTc-p125的制备：化学合成用于PCR扩增反应的两条引物分别为：F: 5’-AGCTACGGATCCGGATGGATGGCAAGCGGCGGCC-3’（ SEQ ID NO：1），  R: 5’-AGCTACGAATTCTCACCAGGCCTCAGGTCCAGGG-3’（SEQ ID NO：2），在引物序列N－端引入BamHI酶切位点，在C-端引入EcoRI酶切位点，均用下划线表示。以人类DNA聚合酶Pol δ的催化大亚基p125的cDNA为模板进行PCR反应，扩增出的DNA片段进行1%琼脂糖凝胶电泳，切割下含目的片段的凝胶，用QIAGEN Gel Extraction试剂盒回收扩增出的DNA片段（Genbank ID：NM_002691.2）；用BamHI和EcoRI对扩增出的DNA片段进行双酶切，同时，对含6个组氨酸标签的供体质粒pFastBacHTc也进行BamHI和EcoRI的双酶切反应，酶切反应产物分别用试剂盒再纯化一次，将酶切后纯化的PCR产物和供体质粒pFastBacHTc用连接试剂盒进行连接反应，14⁰C下过夜；将连接产物于大肠杆菌DH5α感受态细胞中进行转化反应，反应混合物涂于含100 μg/ml氨苄青霉素的LB培养基平板上，37⁰C倒置培养过夜；挑选LB平板上的单个菌落，经LB液体培养基培养，抽提质粒DNA；对质粒DNA用BamHI和EcoRI进行双酶切鉴定，筛选出已插入正确基因片段的重组供体质粒。经序列检测，成功获得含正确序列的重组供体质粒pFastBacHTc-p125。

(2). 重组杆状病毒的制备：将获得的重组供体质粒转化大肠杆菌感受态细胞DH10Bac，在Helper作用下通过Tn7转座子发生转座，经蓝白斑筛选得到重组穿梭载体；提取重组的Bacmid DNA，用特异性引物M13（Forward: M13-47, Reverse: RV-M）进行PCR反应验证；用CELLFECTIN Reagent介导重组的Bacmid DNA转染Sf-9细胞，经两轮病毒的扩增，收集上清，获得重组杆状病毒rAc-pFast-His-p125。裂解转染的细胞，经SDS-PAGE电泳，将胶分离后的蛋白转移到硝酸纤维素膜上，用鼠源抗His的单克隆抗体（购自于Abcam公司）进行免疫反应，带6×His标签的His-p125的Western检测结果如图1所示。

(3). 蛋白的纯化：用重组病毒rAc-pFast-His-p125感染1 L悬浮培养的Sf-9昆虫细胞，MOI = 2, 感染细胞密度为2×10⁶ cells/ml，72小时后收集感染的细胞，在4⁰C下以3000 rpm速度离心10分钟，按照试剂盒说明书，用镍柱纯化带组氨酸标签的p125，洗脱的蛋白如图2所示。

合并洗脱下的各蛋白馏分，再经过一次SDS-PAGE胶纯化，将胶上的His-p125用手术刀小心割下，切碎，置于离心管中，用抽提液将胶上的蛋白洗脱，高速离心，合并经多次抽提的含His-p125的上清，用Centricon 30 filters (30 000 MW cutoff, Millipore)进行浓缩，浓缩后的His-p125经蛋白浓度测定后，用作免疫反应的兔抗原。

2.抗血清的制备：

(1). 预放血：将成年新西兰兔放在特制兔盒中，按压兔子耳根部直至血管突出，用19号针头对兔子耳动脉进行预放血1-5 ml，获得免疫前的血清。4°C放置过夜使血液凝固，将血液转移至塑料离心管中，4°C下10,000 g离心10分钟，收集的上清液在4°C下保存。

(2). 免疫反应：固定两只成年新西兰兔，将1ml抗原溶液（200 μg兔抗原溶入1ml磷酸缓冲溶液中）与1ml加入分枝杆菌的福氏完全佐剂混和，剧烈震荡使之充分乳化，用3ml注射器抽取该乳化液，接上25G针头，在兔子的4个不同部位皮下各注射1/4抗原溶液（两处在后背，两处在大腿处）；注射结束后，将针在注射处放置几秒钟后再轻轻拔出，并用70%乙醇在注射处消毒，用相同方法给另一只家兔注射抗原。第2星期，通过注射混合200 μg抗原的完全弗氏佐剂进行一次加强免疫；在第4、第6星期，分别再注射混合100 μg抗原的不完全弗氏佐剂进行加强免疫。最后一次注射抗原后的第7天按照步骤 (1) 收集血液，将收集的血液与注射前收集的血液用Western Blotting鉴定比较，发现已经有大量的抗体产生。

(3). 收集抗血清：将兔子轻轻放入固定架上，用刀片在耳部血管的上中部切出切口，使血液自由的流出，收集大约30-40 ml/兔滴出的血液，将血液在37°C恒温箱中放置30分钟，再在4°C放置过夜，将血液转移至塑料离心管中，在4°C下10,000g离心10分钟，收集上清液，获得抗血清。

3.   抗体的纯化：

               将预先配置好的100%硫酸铵饱和溶液在磁力搅拌下缓慢滴加到抗血清中，使硫酸铵的终浓度达到20%，在4°C下静置过夜。于4°C下10,000g离心30分钟以去除细胞碎片和杂蛋白，再在磁力搅拌下缓慢滴加100%硫酸铵饱和溶液到收集的离心上清中，使硫酸铵的终浓度达到50%，4°C下静置过夜；10,000g离心30分钟，弃上清，保留沉淀；将沉淀溶于少量PBS中，溶解后的沉淀放入透析袋对含0.2 g /L 叠氮钠的PBS于4°C下透析 24 小时，每隔 6 小时换透析缓冲液一次，以彻底除去硫酸氨，透析液经高速离心后，收集上清，测定蛋白质含量，然后按照Pierce产品说明书，对经初步纯化后的抗体用Immobilized Protein A柱进行再纯化，收集洗脱的各馏分，测定蛋白浓度，Western Blotting进行免疫反应鉴定。成功地获得大约600 mg高纯度的抗体α-p125，其纯化后产物在SDS-PAGE胶上的分析结果如图3所示。

实施例二：免疫亲和层析柱的制备

               按照Pierce公司产品说明书 (产品号：20391 )，将300 mg纯化好的多克隆抗体α-p125和50 ml 的CarboLink^TM Coupling Gel进行耦联反应，制备成多克隆抗体耦联的免疫亲和层析柱。大约有225 mg的IgG被耦联到胶上，耦联效率达到75%，即平均每毫升的胶耦联4.5毫克抗体。

实施例三：各亚基不同组合重组病毒在Sf-9细胞中的表达和装配

               将由本实验室制备并保存的含各亚基基因的重组AcMNPV杆状病毒rAc-pFast-p125、rAc-pFast-p68、rAc-pFast-p50和rAc-pFast-p12，以不同的亚基组合，分别共感染500ml悬浮培养的Sf-9昆虫细胞，各病毒滴度的比例为1：1，MOI = 2, 感染细胞密度为2×10⁶ cells/ml，72小时后收集感染的细胞。

实施例四：聚合酶Pol δ四亚基组合蛋白复合物的分离纯化

               实施例三中感染72小时后的Sf-9细胞，在4⁰C下以3000 rpm速度离心10分钟，收集的感染细胞在裂解缓冲液(20 mM Tris-HCl, pH 7.8, 10% glycerol, 0.5mM EGTA, 1mM EDTA, 1mM MgCl₂, 50mM NaCl，0.1%NP40, 1mM PMSF and proteinase inhibitor)中经超声波裂解、高速离心后，收集上清，以0.5 ml/min速度通过制备的免疫亲和层析柱，用10倍柱床体积的含0.1M NaCl的TGEE缓冲液 (40 mM Tris-HCl pH 7.8, 10% glycerol, 0.5mM EDTA, 0.1 mM EGTA) 漂洗，随后用5倍柱床体积的洗脱液（TGEE /0.4M NaCl/30% Ethylene glycol）洗脱，收集各馏分，经SDS-PAGE胶分析后，合并蛋白峰馏分，用TGEE缓冲液透析，或用TGEE缓冲液将NaCl浓度调整在50-100 mM之间，通过离子交换层析FPLC Mono Q柱进一步的纯化和浓缩，获得高纯度的四亚基组合的蛋白复合物。典型的四亚基p125/p68/p50/12组合在SDS-PAGE胶上的分析结果如图4所示。

多次实验表明，应用本发明的方法，在24小时之内，可以从500 ml 悬浮培养的Sf-9细胞中，平均获得大约3-8 mg高纯度的聚合酶Pol δ四亚基蛋白复合物，以Poly(dA)/oligo(dT) 为引物/模板的初步分析结果表明，其比活性约为20,000-25,000 Units/mg，PCNA的刺激倍数接近6-10倍。

实施例五：聚合酶Pol δ三亚基组合蛋白复合物的分离纯化

               以实施例三中分别用重组杆状病毒rAc-pFast-p125、rAc -pFast-p50、rAc -pFast-p12或rAc-pFast-p125、rAc -pFast-p68、rAc -pFast-p50共感染Sf-9细胞，获得的p125/p50/p12和p125/p68/p50三亚基组合的蛋白复合物，分别应用实施例四中相同的分离纯化方法，成功地获得高纯度的三亚基组合蛋白复合物，其SDS-PAGE胶的分析结果如图5所示。 

Claims (5)

1.一种高酶活人类DNA聚合酶δ的分离纯化方法，其特征在于：利用Bac-to-Bac系统，以pFastBac为供体质粒，分别插入源自人类DNA聚合酶基因POLD1、POLD3、POLD2和POLD4；再转染杆状病毒是AcMNPV；分别制备得到含人类聚合酶Pol δ四种亚基p125、p68、p50和p12的重组杆状病毒rAc -pFast-p125、 rAc-pFast-p68、 rAc-pFast-p50 和rAc-pFast-p12，然后分别共感染宿主细胞Sf-9，使得各亚基在细胞中表达和装配；收集感染的Sf-9细胞，经超声波裂解、高速离心后，收集上清，经过免疫亲和层析柱和离子交换层析柱分离纯化出高纯度的目的产物；所述的免疫亲和层析柱是将抗p125的多克隆抗体与CarboLink^TM Coupling Gel耦联而制得。

2.如权利要求1所述的一种高酶活人类DNA聚合酶δ的分离纯化方法，其特征在于，其中所述的抗p125的多克隆抗体是通过下法方法制得：利用Bac-to-Bac系统，制备含6个组氨酸标签的DNA聚合酶δ催化大亚基p125作为抗原，在成年新西兰兔中制备抗p125的抗血清，纯化抗血清获得高纯度的多克隆抗体。

3.按照权利要求2所述的一种高酶活人类DNA聚合酶δ的分离纯化方法，其特征在于：利用Bac-to-Bac系统制备抗原所用的供体质粒是pFastBacHTc。

4.按照权利要求2所述的一种高酶活人类DNA聚合酶δ的分离纯化方法，其特征在于：抗血清的纯化是指饱和硫酸铵沉淀法和Immobilized Protein A柱纯化法相结合。

5.按照权利要求1所述一种高酶活人类DNA聚合酶δ的分离纯化方法，其特征在于：所述的离子交换层析柱是指FPLC Mono Q。

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