JP2888518B2 - 改良型の組換え発現 - Google Patents
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Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は、所望のタンパク質の連続的生産を可能とす
る発現可能なベクターを構築する為の組換えDNA法の応
用に関する。さらに、本発明は、所望のタンパク質を連
続的に製造するための、安定な細胞質mRNAを生成しうる
発現ベクターの構築に関する。換言すると、本発明は、
所望のタンパク質をコードしているDNAの５′側に配置
された特異的な安定化配列を有する発現ベクターに関す
る。また、本発明は、このようなベクターで真核生物細
胞を形質転換し、宿主細胞を選択し、そして、該細胞セ
ルラインを用いて所望のタンパク質を連続的に製造する
方法に関する。 先行技術 近年、組換え法が真核生物細胞に応用されるところと
なり、特に、哺乳動物細胞が選択可能な表現型をコード
している異種DNAで形質転換されるようになった「ウィ
グラー等（Wigler,M.,et al.,Cell,11,223−232（197
7））］。また、真核生物細胞を形質転換して、異種DNA
を真核生物細胞核の染色体DNA中に組込んで含有してい
る形質転換体を得ることができることが示された。 成功裏に行なわれた真核生物細胞培養物の形質転換お
よび所望のタンパク質をコードしているDNA配列の発現
が開示されている［たとえば、欧州特許出願公開No.73,
659および73,656］。これらの成功裏に行なわれた形質
転換は、ベクターを用いて相補DNA（cDNA）を発現させ
るものであり、５′コントロールシグナル、たとえばエ
ンハンサー［グルズマンおよびシェンク編（Gluzman,Y
and Shenk,T.,Enhancers and Eukaryoic Gene Expressi
on,Cold Spring Harbor Laboratory（1983））］、プロ
モーター［ハーマー等（Hamer,D.H.,et al.,Cell,21,69
7（1980））］および３′ポリアデニル化部位［プロー
ドフットおよびブラウンリー（Preoudfoot,N.J.and Bro
wnlee,G,G.,Nature,263,211（1976））］だけを必要と
するものであった。 真核生物では、細胞質mRNAがDNAと必ずしも共直線性
であるとは限らないことが1977年に見い出された。タン
パク質をコードしているDNA配列はある長さの非コード
化DNAによって遮断されていることがわかった。遺伝子
のDNA中には、最終的なmRNAには見い出されない長い塩
基配列が存在する。一次mRNA転写体が「スプライス」さ
れ、非コード化配列、すなわちタンパク質をコードして
いない配列が除去されることがわかった。DNA中のこれ
ら非コード化配列は通常イントロンと呼ばれ（以前は介
在配列と呼ばれていた）、一方、コード化配列はエキソ
ンと呼ばれる。RNAポリメラーゼは、完全なDNA、すなわ
ちエキソンとイントロンの両者の、一次転写体を生成す
る。この転写体はプロセッシングされ、イントロンが除
去される一方で同時にすべてのエキソンが正しい順序で
結合される。この結果を生み出す機序は「スプラインシ
ング」と称されている。 分割された、即ち継ぎ合わされた遺伝子が多数発見さ
れている。実際のところ、イントロンはほとんどすべて
の哺乳動物および脊椎動物の遺伝子中に存在し、真核微
生物の遺伝子中にも存在する。イントロンはメッセンジ
ャーのコード化領域に限定されない。たとえば、あるイ
ントロンは、プラスミノーゲン活性化因子mRNAのコード
化配列の前にあるリーダー領域中にも見い出された［こ
の遺伝子の他の位置に存在する多数のスプライス部位に
加えて；フィッシャー等（Fisher,R.et al.,J.Biol.Che
m.,260,1122（1985））］。何故イントロンが生み出さ
れ、真核生物遺伝子に一般的な特徴となっているのかに
ついてはかなり考慮が為されている［クリック（Crick,
F.,Science,204,264（1976））；およびシャープ（Shar
p,P.A.,Cell,23,643−646（1981））］。 イントロンの遍在性が示されたことにより、組換え法
に関連してスプライシングが研究されたのは別に驚くに
はあたらない。たとえば、ウサギβ−グロビンcDNA、転
写の開始および終止に関係している領域、β−グロビン
cDNA配列の５′側に位置する多数の部分からなるリーダ
ー配列からのスプライス部位、およびポリアデニル化配
列を含んでいるSV40ベクターが構築された［ムリガン等
（Mulligan,R.C.et al.,Nature,277,108−114（197
9））］。この組換えゲノムは、サル腎細胞に感染させ
たとき、β−グロビンコード化配列ならびに16Sおよび1
9S後期RNAのためのリーダー領域を含有するハイブリッ
ドmRNAを産生することが示された。このハイブリッドmR
NAは、かなりの量のウサギβ−グロビンポリペプチドを
産生した。ムリガン等は、スプライシング能力を欠く突
然変異体が独立したmRNAを産生しなかった実験について
議論している。 遺伝子発現においてRNAスプライシングが演ずる生理
学的な役割を確かめようとして、ハーマーおよびレーダ
ー［Hamer,D.H.and Leder,P.,Cell,18,1299−1302（197
9）］は、サル細胞にトランスフェクションしたSV40組
換え体中のスプライス部位の存在および／または位置を
操作した。ハーマーおよびレーダーは、所望のタンパク
質をコードしている遺伝子内に位置する１つのスプライ
ス部位を用いるか、または１つが所望のタンパク質をコ
ードしている遺伝子の５′側に、第２のものが該遺伝子
内に位置している２つのスプライス部位配列を用いた。
彼等は、少なくとも１つの機能的なスプライス結合を保
持しているウィルスのすべてがRNAを一時的に産生する
ことを見い出した。そして、スプライシングが、安定な
RNA生成に前もって必要なものであると結論づけた。こ
の結果を裏づけるように、グラス等［Gruss,P.et al.,P
NAS（USA），76,4317−4321（1979）］は、介在配列を
欠くSV40突然変異体を構築してもカプシドタンパク質が
全く検出されないことを見い出した。このグラスの論文
は、スプライス部位配列数個を有する多くの部分からな
るリーダーを利用するものであった。３つの論文は全
て、種々の位置に多数のスプライス部位を有するウィル
ス性ベクターの利用について論じている。これらのウィ
ルス性ベクターは、本発明の非ウィルス性ベクターとい
くつかの点で異なっている。第１に、ウィルス性イント
ロンは、コード化配列それ自身内、ならびに転写ユニッ
トの５′および３′の両方に位置している。本発明にお
いては、安定化配列は、所望のタンパク質をコードして
いる遺伝子の５′側に位置している。ウィルス性ベクタ
ーは、宿主DNAとは別個に複製し続け、組込まれず、そ
して分解性である。最後に、多くのウィルス性ベクター
は、正しいスプライシングが起こるために初期遺伝子機
能を必要としている。 これら２つの論文は、RNAスプライシングが組換えの
環境において重要となるのであろうことを示唆してい
る。しかし、他の研究ではスプライシングを破棄し、
３′ポリアデニル化部位、プロモーター、およびエンハ
ンサーなどの５′コントロールシグナルだけを用いてタ
ンパク質を発現させている。事実、レディー等［Reddy,
U.B.et al.,Transcriptional Control Mechanisms,J.Ce
ll.Biochem.Suppl.,10D,154（1986）］の最近の研究に
より、発現ベクターにイントロンを含有させると発現さ
れる所望のタンパク質量が実際に減少することがわかっ
た。この著者等は、イントロンは所望のタンパク質発現
のためのベクターの必須部分ではないと結論づけてい
る。また、ハル等（Hall et al.）は、イントロンの含
有がタンパク質の発現に有害であることを観察した。受
容配列を欠失させると、スプライスされていない細胞質
ウィルスmRNAが一時的に産生されることがわかった［ト
レイスマン等（Treismann,R.et al.,Nature,292,595−6
00（1981））］。これらの結果は、スプライシングが必
須ではないという考えを支持するものである。 エンハンサー、プロモーターおよび３′ポリアデニル
化部位などの通常の組換えコントロールシグナルを用い
る直接発現は、常に達成可能という訳ではない。スプラ
イス部位を有さないSV40プロモーターが多数のcDNAの直
接発現に用いられていた［β−ガラクトシダーゼ、ハル
等（Hall,C.V.et al.,J.Mol.Applied Genetics,
２，）；ヒト・インターフェロン、グレイ等（Gray,P.
W.et al.,Nature,295,503（1982））；赤血球凝集素、
ゲシング等（Gething,et al.,Nature,293,620（198
1））；ヒト・レシチン−コレステロール・アシルトラ
ンスフェラーゼ、マクリーン等（McLean,J.et al.,PNA
S,33,2335（1986））;DHFR、シモンセン等（Simonsen,
C.C.et al.,PNAS,80,2495（1983））；ヒト・インター
ロイキン−２、レオナルド等（Leonard,W.T.et al.,Nat
ure,311,626（1984））;ras−２、カポン等（Capon,D.
J.et al.,Nature,304,1983）;src、スニダー等（Snyde
r,M.A.et al.,Cell,32,891（1983））；および肝炎Ｂ表
面抗原、クロウリー等（Crowley,C.W.et al.,Mol.Cell
Biol.,３,44−55（1983））］。しかし、因子VIIIをコ
ードしているcDNAにライゲートされたSV40プロモーター
を含有している発現ベクターを用いて種々の細胞中にト
ランスフェクションしても、正しい大きさの独立した因
子VIIIメッセージは全く検出されなかった。このプラス
ミド上に存在する他の遺伝子、たとえばDHFRが転写され
ると、正しいメッセージが産生した。SV40プロモーター
は、ある種のタンパク質用のmRNAを発現しうるが因子VI
IIを発現することができなかったので、この問題は、連
続的な発現を可能にするであろうmRNAの転写／スプライ
シング、または単なる因子VIIIメッセージの蓄積の欠如
のいずれかに関係しているものと認められた。この前者
の問題は、mRNAの「安定性」の問題として本明細書中で
言及する。 転写開始シグナルと因子VIIIをコードしているcDNAの
種々の組み合わせを用いて多数の実験が行なわれた。こ
のようなベクターでトランスフェクションされた細胞
が、ノーザン分析により因子VIIIメッセージについて調
べられた。正しい大きさの独立したメッセージは全く見
い出されなかった。 また、ベクター中に存在するスプライス部位およびイ
ントロンを用いて実験が行なわれた。オカヤマおよびベ
ルグ［Okayama,H.and Berg,P.,Mol.and Cell.Biol.,３
（２）,280−289（1983）］は、SV40初期領域プロモー
ター、１つの供与部位および２つの受容部位を含むSV40
後期領域イントロン、cDNAおよびポリアデニル化シグナ
ルを含有するプラスミドベクター、pcDを用いた。因子V
IIIをコードしているcDNA、および３つのスプライス部
位を有する、３つに分かれたリーダー、およびアデノウ
ィルスの主後期プロモーターを含有しているベクター
が、欧州特許出願公開No.160,457に記載のようにして構
築された。このベクターが調べられ、完全な長さの因子
VIIIの発現が成功したりしなかったりランダムであるこ
とがわかった。このことの、ある部分は、クリプティッ
クな（あいまいな）スプライシングによって説明するこ
とができる。３つに分かれたリーダー領域は多数のコー
ド化領域でスプライスされ、最終的なメッセージが得ら
れる。このスプライシングパターンの複雑さは、４つの
一次転写体が別異にスプライスされて14の別個のメッセ
ージが得られることから明らかである［ネビンズおよび
ウィルソン（Nevins,J.and Wilson,M.,Nature,290,113
（1981））］。コード化配列の下流のスプライス選択の
ためのコントロールは、よくわかっていない。しかし、
適切なポリアデニル化部位の選択および転写終止が最終
的なスプライシングに先行し、これが３′スプライス部
位を選択させているのかもしれない。この理由から、お
よびエキソン−イントロン結合点における塩基配列の情
報内容が比較的少ないことから、スプライシングが時に
は正しくない、すなわちクリプティックであるのは驚く
には当たらない［ハーマー等（Hamer et al.,Cell,21,6
97−708（1980））およびマンソアー等（Mansour et a
l.,Mol.Cell.Biol.,６,2684（1986））］。このクリプ
ティックなスプライシングは、アデノ主後期プロモータ
ーおよび３つに分かれたリーダーを用いる完全長さの因
子VIIIの発現において、その成功がランダムであるのを
説明することができる。 アデノ主後期プロモーターを含有しているベクターの
分析がさらに行なわれた。アデノベクターを用いて他の
タンパク質が発現させられた（しかし、限定された発現
パターンを有しており、これはアデノのコントロール領
域が限定された細胞種において機能しうることを示唆し
ている）［レビン等（Levine,A.S.et al.,Virol.,11,67
2−681（1973））およびグロッドジッカー等（Grodzick
er,T.J.et al.,J.Virol.,９,559−571（1976））］。欧
州特許出願公開No.160,457の記載と同一の５′および
３′コントロール領域を有する、DHFRまたはｔ−PAなど
の他のタンパク質からのcDNAを用いてベクターが構築さ
れた。これらのプラスミドがCos、293、BHKおよびCHO細
胞中にトランスフェクションされ、次いでこのトランス
フェクション体が、免疫ペルオキシダーゼ染色によるｔ
−PA発現、またはメトトレキセイトを用いるDHFR発現の
いずれかについてモニターされた。まとめると、これら
アデノ後期ベクターはいずれも、293またはCos細胞以外
のすべての細胞種において、ｔ−PAまたはDHFRを全く発
現することができないことがわかった。ｔ−PAの一時的
な発現が293およびCos細胞において再現して見られた
が、しかし同じ条件下での因子VIIIの発現はランダムで
あった。これらの結果は、ウィルス性の多数に分かれた
リーダー配列の一部を用いても所望のタンパク質が発現
されなかったという３つの論文で裏づけられた。第１の
論文では、カウフマンおよびシャープ［Kaufman,R.J.an
d Sharp,P.A.,Mol.Cell.Biol.,２（11）,1304（198
2）］は、DHFRのコード化領域および免疫グロブリンの
可変領域遺伝子から単離された２つの３′スプライス部
位受容配列と結合された、アデノウィルスの３つに分か
れたmRNAリーダー配列の５′スプライス供与部位および
最初のリーダーを含む、アデノ主後期プロモーターを含
有するベクターを構築した。DHFR-CHO細胞中にトランス
フェクションされたこのベクターは、極めて低頻度のDH
FR+細胞を産生した。第２の論文で、カウフマンおよび
シャープ［Kaufman,R.J.and Sharp,P.A.,J.Mol.Biol.,1
59,601−621（1982）］は、同じプラスミドを記載し、D
HFRの発現が得られなかったことを示している。ウォン
等［Wong,G.C.et al.,Science,288,810−815（1985）］
は、SV40エンハンサー；アデノウィルスの主後期プロモ
ーターおよび３つに分かれたリーダー配列;3つに分かれ
たリーダーの最初のエキソンからの５′スプライス部位
およびマウス免疫グロブリン遺伝子からの３′スプライ
ス部位からなるハイブリッド（雑種）イントロン；第１
のものが所望のタンパク質、コロニー刺激因子を、第２
のものがDHFRをコードしている２つのcDNA;SV40ポリア
デニル化配列；およびVA遺伝子を有する発現ベクターを
用いた。この多シストロン性ベクターは、一時的にだけ
作動することがわかり（前掲、810頁）、翻訳能を増加
させるためにVA RNAの存在を必要とし（前掲、811
頁）、mRNAの安定性を増加させるために第２のcDNA、す
なわちDHFRのそれを必要とした（前掲、811頁）。従っ
て、アデノウィルスの主後期ベクター（ある種のタンパ
ク質のための、完全な、３つに分かれたリーダーを含有
する）によって、限定された一時的な発現能力が見られ
るが、ある種のタンパク質は、連続的な発現を成功裏に
行うためにはさらに別の要件を必要としている。 サイトメガロウィルスのプロモーターおよびエンハン
サー、因子VIIIをコードしているcDNA、および３′終止
配列を含有し、イントロンまたは構築されたスプライス
部位を含まないベクターが構築された。試験したすべて
の細胞種において、因子VIIIの一時的な、または安定な
発現はいずれも観察されなかった。 イントロンまたは構築されたスプライス部位を欠き、
SV40ポリアデニル部位、因子VIIIをコードしているcDN
A、およびプロモーターおよびエンハンサーを含むSV40
初期転写配列を含有している別のベクターは、一時的
な、または安定な発現をどちらも生じなかった。 SV40プロモーターおよびエンハンサー、完全なアデノ
主後期３分離リーダー（すなわち、適当な供与および受
容部位を有する３つのイントロン）、因子VIIIをコード
しているcDNA、および３′肝炎表面抗原ポリアデニル化
部位を含有するベクターは、COS細胞でだけ因子VIIIを
一時的に発現し、その他の細胞種では発現しなかった。 SV40はエンハンサーおよびプロモーター、アデノ主後
期３分離リーダーの最初のイントロン、免疫グロブリン
（Ig）可変領域受容部位、因子VIIIをコードしているcD
NA、およびSV40ポリアデニル化部位を含有しているベク
ターは、COS細胞において因子VIIIを一時的に発現した
が、その他の細胞種では発現しなかった。 SV40エンハンサーおよびプロモーター、アデノ主３分
離リーダーの最初の供与部位およびイントロン、Ig可変
領域受容配列のコンセンサス配列、因子VIIIをコードし
ているcDNA、および肝炎表面抗原の３′ポリアデニル化
部位を含有しているベクターが構築された。このベクタ
ーは、因子VIIIを一時的または安定に発現しなかった。 SV40エンハンサーおよびプロモーター、因子VIIIをコ
ードしているcDNA、供与および受容配列が備わった、cD
NAの３′側のSV40の小さいｔ−抗原イントロン、および
SV40初期領域ポリアデニル化部位を含有している、さら
に別のベクターが構築された。このベクターは、どの様
なタイプの細胞種においても、因子VIIIを一時的または
安定的に発現することはなかった。 本明細書中に記載した実験により、ある種のタンパク
質の安定な発現には安定化配列、すなわち供与−イント
ロン−受容配列または加工されたスプライス配列のいず
れかが必要であることが確かめられた。さらに、これら
の実験によって、安定化配列の位置が安定かつ連続的な
発現に重要であることが確かめられた。本発明は、発現
させることが困難なある種のタンパク質をコードしてい
るDNAの５′側に配置された特異的な安定化配列を有し
ているベクターを構築し、これを利用することに関す
る。選択した宿主細胞中にトランスフェクションしたと
き、本発明の発現ベクターは、該宿主細胞を、所望のタ
ンパク質（たとえば、因子VIII）を連続的に産生する細
胞に形質転換するであろう。また、本発明は、適切な細
胞セルラインの選択、および該宿主細胞をトランスフェ
クションして所望のタンパク質を連続的に製造するため
のセルラインを確立することに関する。 発明の該要 本発明は、組換え発現ベクターを用いてある種のタン
パク質を連続的に産生させるためには、所望のタンパク
質をコードしているDNAの５′側に配置される、特別に
配置された安定化配列が必要であるという発見に基づい
ている。さらに、本発明は、所望のタンパク質をコード
しているDNAの５′側に配置された安定化配列を用いる
ことによって得られる、安定な細胞質mRNAに関する。換
言すると、本発明は、上記のようにして構築した、所望
の異種タンパク質をコードしている遺伝子を発現する、
発現ベクターに関する。 さらに別の態様では、本発明は、本発明の新規ベクタ
ーでトランスフェクションするのに適した宿主細胞を選
択することに関し、さらに、宿主細胞を形質転換して所
望の異種タンパク質を製造するための安定なセルライン
を確立することに関する。 図面の説明 第１図：因子VIIIを産生するセルラインを樹立するため
に用いられる因子VIII発現ベクター、pF8CISの構築を示
す。 第２図：因子VIIIを産生するセルラインを樹立するため
に用いられる因子VIII発現ベクター、pF8SCISの構築を
示す。 第３図：トランスフェクション後の細胞の免疫ペルオキ
シダーゼ染色を示す。（Ａ）はpF8CISでトランスフェク
ションしたのちの発現を示し、（Ｂ）はpF8SCISでトラ
ンスフェクションしたのちの発現を示す。 第４図：増幅を１回行った、pF8CISでトランスフェクシ
ョンしたCHO細胞の免疫ペルオキシダーゼ染色を示す。 第５図:pF8CISでトランスフェクションし、増幅を３回
行ったCHO細胞の免疫ペルオキシダーゼ染色を示す。 第６図：因子VIIIの変異体を産生するセルラインを樹立
するために用いられる因子VIII変異体発現ベクター、pF
8CIS9080の構築を示す。 第７図：因子VIIIの変異体すなわち融合タンパク質をコ
ードしているベクターpF8CIS9080でトランスフェクショ
ンした細胞の免疫ペルオキシダーゼ染色を示す。 第８図：連続的な増幅を行った、pF8CISでトランスフェ
クションしたCHO細胞の免疫ペルオキシダーゼ染色を示
す。 第９図：活性化タンパク質Ｃによるタンパク質加水分解
的な切断に対して耐性である因子VIIIをコードしている
cDNAを含有している発現ベクター、pF8CIS−336Eの構築
を示す。 第10図：活性化タンパク質Ｃによるタンパク質加水分解
的な切断に対して耐性である因子VIIIの融合タンパク質
をコードしているcDNAを含有している発現ベクター、pF
89080−336Eの構築を示す。 第11図：精製した90kd＋142aa＋80kd融合体のSDS−PAGE
およびウェスタンブロック分析を示す。約８μｇの90kd
＋142aa＋80kd融合体をSDS−PAGEで分けた。次いで、タ
ンパク質を、クーマシーブルーによる染色で検出するか
（Ａ）、またはニトロセルロースに移動させてウェスタ
ンブロット分析にかけた（Ｂ）。血漿由来の因子VIIIに
対して生成したウサギポリクローナル抗体を用いて、ニ
トロセルロースに結合した90kd＋142aa＋80kd融合体を
検出した。 第12図:90kd＋142aa＋80kd融合体のトロンビン活性化を
示す。0.15M NaCl、2.5mM CaCl2および５％グリセリン
を含有する0.05Mトリス（pH7.4）中の、精製した90kd＋
142aa＋80kd融合体約11μｇを、トロンビン55μｇとい
っしょにして37℃で0.1〜60分間インキュベートした。
図に示した時間にその一部を取り出し、0.01％BSAを含
有する0.05Mトリス（pH7.4）中、1/2,000〜1/10,000に
希釈し、凝結分析によって検定した。試料の残りにSDS
緩衝液を加え、これを５分間、90℃に加熱した後、SDS
−PAGEにかけた（挿入図）。 第13図:90kd＋142aa＋80kd融合体のvWFへの結合が示さ
れている。0.05Mトリス（pH7.4）、150nM NaCl2、2.5mM
CaCl2および５％グリセリン中の90kd＋142aa＋80kd融
合体（275単位）をvWF−セファロースカラムにかけ、次
いでこのカラムを３倍カラム容量の上記緩衝液で洗浄し
た。90kd＋142aa＋80kd融合体を0.25M CaCl2で溶離し
た。このvWF−セファロースカラムは、製造元の指定に
従い、純vWFをアフィゲル10（Affigel;Bio Rad）にカッ
プリングさせて調製した。 第14図：プロリラキシンを産生するセルラインを樹立す
るために用いられるプロリラキシン発現ベクター、pCIH
RXの構築を示す。 第15図：プロリラキシンを産生するセルラインを樹立す
るために用いられるプロリラキシン発現ベクター、pCIS
RXの構築を示す。 第16図:t−PAを産生するセルラインを樹立するために用
いられるｔ−PA発現ベクター、pCIHt−PAの構築を示
す。 第17図:pF8CISの配列の一部を示す。この発現ベクター
のDNA配列は、サイトメガロウィルスのエンハンサー、
プロモーター（ヌクレオチド１〜732）、安定化配列、
すなわちスプライス供与イントロン配列、Ig可変領域イ
ントロンおよびスプライス受容配列（ヌクレオチド733
〜900）を含んでいる。 第18図:pF8SCISの一部の配列を示す。この発現ベクター
のDNA配列は、SV40のエンハンサーおよびプロモーター
（ヌクレオチド１〜360）、サイトメガロウィルスの供
与およびイントロン配列、Ig可変領域イントロンおよび
スプライス受容配列を含む安定化配列（ヌクレオチド36
1〜580）を含有している。 第19図:pF8CSSSの配列の一部を示す。この発現ベクター
のDNA配列は、サイトメガロウィルスのエンハンサープ
ロモーターおよびリーダー（ヌクレオチド１〜732）、
加工されたスプライス供与および受容配列を含む安定化
配列（ヌクレオチド733〜736）、残りのリーダーを含有
している。 第20図:t−PAを産生するセルラインを樹立するために用
いられるｔ−PA発現ベクター、pCISt−PAの構築を示
す。 詳細な説明 定義および一般的な方法を以下に記述する。 本明細書中で用いる「ヌクレオチド配列」なる語句
は、５′から３′にリン酸ジエステル結合された一連の
ヌクレオチドからなる核酸を指し、これはRNAあるいはD
NA配列のいずれであってもよい。DNAである場合、この
ヌクレオチド配列は、１本鎖あるいは２本鎖のいずれで
あってもよい。同様に、「DNA配列」なる語句は、１本
鎖および２本鎖の両方を指す。 「所望の異種タンパク質」なる語句は、宿主細胞中で
発現することが望まれているタンパク質を指す（このタ
ンパク質は、該宿主細胞によっては通常産生されない
か、または少量しか産生されず、通常はこの細胞の存在
に必要ではない）。このようなタンパク質には、プレあ
るいは成熟アミノ酸配列を有するすべての分子、および
該所望の異種タンパク質と同等の生物学的活性を示しう
るアミノ酸あるいはグリコシル化変異体（天然のアレル
遺伝子を含む）が含まれる。 「スプライシング」なる語句は、一次転写体のプロセ
ッシング中に、RNAの内部の１またはそれ以上のある長
さ部分が除かれることによって１つの機能的なRNA分子
が生成する機序を指す。スプライシングは、イントロン
が外へ環状化してイントロンの５′末端（供与部と呼ば
れる）がイントロンの３′末端（受容部と呼ばれる）に
並列することから始まると考えられている。イントロン
−エキソン連結部の塩基配列の比較により、各イントロ
ンの５′末端の最初の２塩基がGTであり、３′末端の最
後の２塩基がAGである、コンセンサス配列が明らかにな
っている。 「スプライスされたmRNA」とは、RNAの内部の１また
はそれ以上のある長さ部分を除去することにより産生さ
れるか、または、スプライシングにかけられたがヌクレ
オチド配列が実際上除去されなかったmRNAと同じ性質を
有するmRNAを転写により産生するDNAを構築することに
よって得られるmRNAを指す。 「安定化配列」とは、得られるmRNAが、スプライスさ
れたmRNAと機能的に類似しているように、供与／受容連
結部の適当なヌクレオチドおよび供与および受容配列の
ための完全なコンセンサス配列あるいはその一部を含有
する配列をコードすることによって、またはスプライス
供与−イントロン−受容配列をコードすることによっ
て、スプライスされたmRNAを生成するDNA配列を指す。
この安定化配列は、所望の異種タンパク質をコードして
いる遺伝子のリーダー配列中に配置される。「リーダー
配列」とは、CAP部位とAUG翻訳開始シグナルの間の５′
非翻訳化領域中にあるmRNAの領域を指す。 本明細書中で用いる「コンセンサス配列」とは、エキ
ソン−イントロンの境界部（または供与配列）に現われ
ることがわかっている配列▲C A▼ AG/GT ▲A G▼ AGT、
およびイントロン−エキソンの境界部（または受容配
列）に現われることがわかっている配列（▲T C▼）nN▲
C T▼ AG/Gを指す［マウント（Mount,S.M.,Nucleic Acid
s Research,10（２）,459−472（1982））を参照］。個
々の塩基が特定の位置に現われる頻度を分析すると、供
与および受容配列のコンセンサス配列が得られた。ま
た、イントロンがGTで始まり、AGで終わることが知られ
ている［ブリースナッハ等（Breathnach,R.et al.,PNAS
（USA），75,4853−4857（1978））］。さらに、ある種
の、多数に分かれたリーダー配列（多数のスプライシン
グが起こる）は、適切なプロセッシングが行なわれるた
め、初期遺伝子機能の別の因子を必要とすることもある
ことがわかっている［バビス等（Babiss,L.E.et al.,Mo
l.and Cell.Biol.,５（10）,2552−2558（1985））を参
照］。当分野で通常の知識を有する者は、本発明に従
い、コンセンサス スプライス配列の規則、多数に分か
れたリーダー配列（初期遺伝子機能を必要とし、多数の
スプライシングが起こる）、ならびに供与および受容コ
ンセンサス配列の知識を用いて、所望のタンパク質のた
めの特定の安定化配列を選択することができるであろ
う。 「コントロール領域」とは、転写または翻訳のいずれ
かのコントロールに関与しているであろう、真核生物性
遺伝子の５′および３′末端に位置している特異的な配
列を指す。ほとんどすべての真核生物性遺伝子は、転写
が開始される部位の上流側の約25〜30塩基のところにAT
に富む領域を有している。転写開始部位の上流側70〜80
塩基のところに観察される他の配列は、CXCAAT領域であ
る（Ｘはどんなヌクレオチドであってもよい）。ほとん
どの真核生物性遺伝子の３′末端はAATAAA配列であり、
この配列は、転写されたmRNAの３′末端にポリアデニル
化の尾部が付加するためのシグナルとなっているのであ
ろう。 「プロモーター」とは、RNAの合成を開始するRNAポリ
メラーゼ分子によって認識されるヌクレオチドセグメン
トをいう。哺乳動物宿主細胞中のベクターからの転写を
コントロールするプロモーターは、種々の供給源、たと
えばウィルス［たとえば、ポリオーマ、サルウィルス40
（SV40）、アデノウィルス、レトロウィルス、肝炎−Ｂ
ウィルス、最も好ましくはサイトメガロウィルス］のゲ
ノムまたは異種哺乳動物のプロモーター（たとえば、β
アクチンプロモーター）から得ることができる。SV40ウ
ィルスの初期および後期プロモーターは、SV40ウィルス
の複製起源をも含有するSV40制限フラグメントとして都
合よく得られる［フィアーズ等（Fiers et al.,Nature,
273,113（1978））］。ヒトサイトメガロウィルスの即
時型プロモーターは、Hind III E制限フラグメントとし
て都合よく得られる［グリーンアウェイ等（Greenaway,
P.J.et al.,Gene,18,355−360（1982））］。もちろ
ん、宿主細胞あるいは関連の種からのプロモーターも本
発明に有用である。 「エンハンサー」とは、DNAのシス作用性の要素を指
し、通常約10〜300bpであり、プロモーターに作用して
その転写を増加させる。所望の異種タンパク質をコード
しているDNAの高等真核生物による転写は、エンハンサ
ー配列をベクター中に挿入することによって増加する。
このエンハンサーは、比較的配向および位置に依存せ
ず、転写単位の５′［ライミンズ等（Laimins,L.et a
l.,PNAS,78,993（1981））］および３′［ラスキー等
（Lusky,M.L.et al.,Mol.Cell Bio.,３,1108（198
3））］、イントロン内［バネジル等（Banerji,J.L.et
al.,Cell,33,729（1983））］、ならびにコード化配列
それ自身内［オスボーン等（Osborne,T.F.et al.,Mol.C
ell Bio.,４,1293（1984））］に見い出されていた。現
在では、哺乳動物遺伝子（グロビン、エラスターゼ、ア
ルブミン、α−フェトタンパク質およびインスリン）由
来の多数のエンハンサー配列が知られている。しかし、
通常は真核生物細胞ウィルスからのエンハンサーが用い
られる。これらの例には、複製起源の後期側のSV40エン
ハンサー（bp100〜270）、サイトメガロウィルスの初期
プロモーターエンハンサー、複製起源の後期側のポリオ
ーマエンハンサー、およびアデノウィルスエンハンサー
が含まれる。 また、真核生物宿主細胞（酵母、菌類、昆虫、植物、
動物、ヒト、または他の多細胞系生物からの有核細胞）
中で用いられる発現ベクターは、転写の終止に必要な配
列（mRNAの発現に影響することもある）を含有している
であろう。これらの領域は、所望の異種タンパク質をコ
ードしているmRNAの非翻訳化部分中のポリアデニル化セ
グメントとして転写される。また、この３′非翻訳化領
域は転写終止部位をも含有している。 発現ベクターは、選択遺伝子（選択マーカーとも呼ば
れる）を含有していてもよい。選択遺伝子は、ベクター
で形質転換された宿主細胞の生存または成長に必要なタ
ンパク質（時には、第２のタンパク質と称される）をコ
ードしている。哺乳動物細胞に適する選択マーカーの例
は、ジヒドロ葉酸還元酵素（DHFR）、チミジンキナーゼ
またはネオマイシンである。このような選択マーカーを
哺乳動物宿主細胞中にうまく転移させると、形質転換さ
れた哺乳動物宿主細胞は選択圧下に置かれたときに生存
することができる。広く用いられている選択処方には、
２つの別個のカテゴリーがある。第１のカテゴリーのも
のは、細胞の代謝に基づくものであり、追加培地とは無
関係に成長する能力を欠いている突然変異セルラインを
使用するものである。例を２つ挙げると、これらはCHO
DHFR-細胞およびマウスLTK-細胞である。これらの細胞
は、チミジンあるいはヒポキサンチンなどの栄養素の追
加がないところで成長する能力を欠いている。これらの
細胞は、完全なヌクレオチド合成経路に必要なある種の
遺伝子を欠いているので、失われたヌクレオチドが追加
培地に与えられなければ生存することができない。培地
に追加を行うことの代わりは、無傷のDHFRあるいはTK遺
伝子を、それぞれの遺伝子を欠いている細胞中に導入す
ることであり、こうしてそれらの成長要求を変えること
である。DHFRあるいはTK遺伝子で形質転換されていない
個々の細胞は、追加が為されていない培地中で生存する
ことができないであろう。従って、これらの細胞を直接
選択するためには、追加栄養素のないところで細胞を成
長させることが必要である。 第２のカテゴリーのものは、すべての細胞種で用いら
れる選択法である優性選択であり、突然変異セルライン
の使用を必要としない。この方法は通常薬物を用いて宿
主細胞の成長を抑制する。新規遺伝子を有するこれらの
細胞は、薬物耐性を伝達するタンパク質を発現し、選択
体を生存させるであろう。このような優性選択に用いら
れる薬物の例は、ネオマイシン［サザーンおよびベルグ
（Southern P.and Berg,P.,J.Molec.Appl.Genet.,１,32
7（1982））］、マイコフェノール酸［ムリガンおよび
ベルグ（Mulligan,R.C.Berg,P.,Science,209,1422（198
0））］またはハイグロマイシン［サジェン等（Sugden,
B.et al.,Mol.Cell.Biol.,５,410−413（1985））］で
ある。上に挙げた３つの例は、真核生物性コントロール
下の細菌性遺伝子を用いて、適当な薬物ネオマイシン
［G418あるいはジェネチシン（geneticin）］、xgpt
（マイコフェノール酸）またはハイグロマイシンへの耐
性をそれぞれ伝達するものである。後記の実施例では、
選択剤は、特にCHO DHFR-細胞と記載されているのでな
ければ、G418ジェネチシンを用いることが多い。この場
合、DHFR産生の直接選択を用いた。 「増幅」とは、細胞の染色体DNA内のある隔離した領
域の増加または複製を指す。増幅は、選択剤［たとえ
ば、DHFRを不活性化するメトトレキセイト（MTX）］を
用いて行う。増幅、すなわちTHFR遺伝子の連続コピーの
生成により、MTX量が多くなればなるほどさらに大量のD
HFRが産生されることになる。さらに多量のMTXを培地に
加えることによって、内生DHFRが存在するにもかかわら
ず増幅圧がかけられる。同時組込みが起こりうるよう
に、所望のタンパク質をコードしているDNAおよびDHFR
あるいは増幅遺伝子を有するプラスミドで哺乳動物宿主
細胞を同時トランスフェクションすることによって、所
望の遺伝子の増幅を達成することができる。順次連続的
に高くしていったMTX濃度中で成長することができる細
胞だけを選択することによって、細胞がさらに多量DHFR
を要求するのを確実なものにする（この要求は選択遺伝
子の複製によって満たされる）。所望の異種タンパク質
をコードしている遺伝子が増幅しうる遺伝子と同時組込
みする限り、この遺伝子の複製によって所望のタンパク
質をコードしている遺伝子の複製が得られる。この結
果、所望の異種タンパク質をコードしている遺伝子のコ
ピー数の増加、すなわち遺伝子の増幅により、さらに多
量の所望の異種タンパク質が発現されることになる。 所望の異種タンパク質をコードしている本発明のベク
ターを高等真核生物中で発現させるのに適した宿主細胞
には、SV40で形質転換したサル腎CVIセルライン（COS−
７、ATCC CRL 1651）；ヒト胚腎セルライン［293、グラ
ハム等（Graham,F.L.et al.,J.Gen Virol.36,59（197
7）］；ハムスター新生児腎細胞（BHK、ATCC CCL 1
0）；チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞−DHFR［ウル
ラウブおよびチャージン（Urlaub and Chasin,PNAS（US
A），77,4216（1980））］；マウス・セルトリー細胞
［TM4、マザー（Mather,J.P.,Biol.Reprod.,23,243−25
1（1980））］；サル腎細胞（CVI ATCC CCL 70）；アフ
リカミドリザル腎細胞（VERO−76、ATCC CRL−1587）；
ヒト頚管ガン細胞（HELA、ATCC CCL 2）；イヌ腎細胞
（MDCK、ATCC CCL 34）；バッファロー・ラット肝細胞
（BRL 3A、ATCC CRL 1442）；ヒト肺細胞（W138、ATCC
CCL 75）；ヒト肝細胞（Hep G2、HB8065）；マウス乳腫
瘍（MMT 060562、ATCC CCL 51）；ラット肝腫瘍細胞［H
TC、M1.54、バウマン等（Baumann,H.et al.,J.Cell Bio
l.,85,1−８（1980））］；およびTRI細胞［マザー等
（Mather,J.P.et al.,Annals N.Y.Acad.Sci.,383,44−6
8（1982）］が含まれる。 「形質転換」とは、染色体外成分として、または染色
体に組込むことによって、DNAの複製が可能なように生
物中にDNAを導入することを意味する。他に記載がなけ
れば、本明細書中で用いる、宿主細胞の形質転換法はグ
ラハムおよびイブ［Graham,F.and van der Eb,A.,Virol
ogy,52,456−457（1973）］の方法である。 宿主細胞を、本発明の発現ベクターで形質転換し、プ
ロモーターの誘起、形質転換体の選択、または遺伝子の
増幅に適しているように修飾した通常の栄養培地で培養
することができる。温度、pHなどの培養条件は、発現用
に選択した宿主細胞に以前から用いられてきた条件であ
り、当分野では明白であろう。 「トランスフェクション」とは、コード化配列が実際
に発現されようとされまいと、宿主細胞による発現ベク
ターの取り込みを指す。多数のトランスフェクション
法、たとえばCaPO4法およびエレクトロポレーション（e
lectroporation）法が当分野で知られている。成功裏の
トランスフェクションは、通常、このベクターの作用の
指標が宿主細胞内に現われたときに認定される。しか
し、本発明に関しては、成功裏のトランスフェクション
とは、多世代にわたって宿主培養物が所望の異種タンパ
ク質を安定かつ連続して発現することをいう。 産生宿主細胞の選択は、本発明の方法を用い、一時的
な発現、次いで増幅されていない発現をスクリーニング
することによって行なわれる。ベクターを一時的な発現
についてスクリーニングし、どのベクターを用いて所望
の異種タンパク質を発現させることができるかを決定し
た。一時的な発現は、取り込まれた特定のプラスミドが
機能するかどうか、すなわち転写および翻訳されて所望
のタンパク質を産生するかどうかについての指標を与え
る。この間に、細胞に入ったプラスミドDNAは核に移動
する。このDNAは組込まれていない状態にあり、核内で
遊離している。細胞によって取り込まれたプラスミドの
転写はこの期間中に起こる。次いで、所望の異種タンパ
ク質を一時的に産生しうると同定されたベクターを用い
て安定かつ連続的な産生細胞を樹立した。一時的な発現
とは、トランスフェクション後の短期間（12〜72時間）
のものを指す。トランスフェクション後のこの最初の期
間が過ぎると、プラスミドDNAは細胞分裂によって減少
または希釈される。細胞クロマチン内でランダムな組込
みが起こる。増幅されていない発現の２〜３週間後に細
胞をスクリーニングすると、永久的なセルラインに導く
組換えDNAを保持している細胞が示される。 トランスフェクションされた細胞の免疫ペルオキシダ
ーゼ染色に基づく検定が開発され、所望の異種タンパク
質が発現されたかどうかが素早く評価された［ゴーマン
等（Gorman,C.M.et al.,Cell,42,519−522（198
5））］。所望の異種タンパク質に特異的なモノクロー
ナル抗体がこの検定に用いるためにスクリーニングされ
た。特異的なタンパク質を産生する細胞をスクリーニン
グするため、ベクターを含有する宿主細胞を染色し、親
セルラインと比較した。最小のバックグラウンドで最も
強いシグナルを与えるモノクローナル抗体を選別した。
一時的なトランスフェクションを行って、所望のタンパ
ク質を産生する能力についてベクターを試験した。CaPO
4法を用いて細胞（Cos、293、CHO、BHK、TM4）をトラン
スフェクションした［ゴーマン等（Gorman,C.M.et al.,
Science,221,551−553（1983））の修飾によるグラハム
およびイブ（Graham and van der Eb）］。試験しよう
とする特異的なタンパク質ベクターの沈澱物を10μg/ml
用いた。この沈澱物を細胞上に３〜４時間置いた。次い
で、平均して１分間、細胞をグリセリン ショックにか
けた。トランスフェクションの36時間後に細胞をアセト
ン−メタノール（50:50）で固定し、リン酸緩衝食塩水
（PBS）で洗浄した。希釈されていないモノクローナル
抗体上清または10％ウシ胎児血清を含むPBS中、1:3000
に希釈した精製抗体を用いて染色を行った。この最初の
抗体を２時間細胞上に置いた。この期間中、プレートを
穏やかな振盪器上に置いた。10分間に５回、細胞を洗浄
した。用いた第２の抗体はウサギ抗−マウスIgG［ダコ
パッツ（Dakopatts）］であり、これを、PBS＋ウシ胎児
血清中、1:150に希釈した。２時間インキュベートした
後、一連の洗浄を行った。ペルオキシダーゼ試薬を現像
するためオルソ−ジアンシジンを基質として用いた。エ
タノール飽和したオルソ−ジアンシジンの溶液を、過酸
化水素を1:10,000に希釈したPBS中、1:100に希釈した。
この基質を、室温で２時間または４℃で一晩、細胞上に
置いた。 この方法により、所望のタンパク質をコードしている
多種多様のベクターを、タンパク質の発現能力について
素早くスクリーニングした。 コーテスト（Coatest）因子VIIIをヘレナ・ラボラオ
リーズ［Helena Laboratories ,Beaumont,TX（Cat.No.5
293）］から購入した。５％以下のタンパク質を含有し
ている試料用の「終点法」について製造元が提供してい
る方法を実質的に用いた。 多種多様の細胞中で一時的に機能することが示された
本発明のプラスミドを用いて産生セルラインを樹立し
た。発現ベクターを多数のセルライン中にトランスフェ
クションした。このトランスフェクション用には、合計
10μg DNA/mlの沈澱物を用いた。上記のような選択マー
カーを用いて、これら細胞中での発現の選択を可能にし
た。カルシウムに対して感受性であることがわかったBR
L細胞を除き、改良型CaPO4法を用いてすべての細胞をト
ランスフェクションした。これらの細胞についてエレク
トロポレーションを用いた。既述のようにして適当な宿
主細胞からトランスフェクションされた細胞を選別し
た。 産生細胞セルラインを樹立するために用いたプロトコ
ールは、主として上記の染色法によっている。トランス
フェクション後の２日間、細胞を選択培地中で継代培養
した。選択に必要とされる特定の物質の適切な量につい
て培地を滴定した。細胞をトランスフェクションして産
生細胞セルラインを樹立すると同時に、それぞれの細胞
種の皿を一時的な発現について検定した。 後記実施例を簡略化するため、頻繁に出てくる方法お
よび／または語句のいくつかを以下に説明する。 「プラスミド」は、小文字ｐを前にし、そして／また
は大文字および／または数字をこれに続けて表す。本発
明で用いる出発プラスミドは、市販品あるいは制限され
ていない供給源から一般的に入手可能であるか、または
公表されている方法に従って利用可能なプラスミドから
構築することができる。さらに、本明細書中に記載した
プラスミドの等価物が当分野で知られているが、これら
は当業者には明白であろう。 DNAの「消化」とは、DNA中のある配列（制限部位）に
だけ作用する制限酵素によってDNAを触媒的に切断する
ことを指す。本発明で用いる種々の制限酵素は市販品か
ら入手可能であり、その反応条件、補助因子およびその
他必要なものは、当分野で知られているものを用いた。
分析用には、通常、プラスミドまたはDNAフラグメント
１μｇを、緩衝溶液約20μ中、酵素約２単位とともに
用いる。プラスミド構築用のDNAフラグメントを単離す
るためには、通常、DNA5〜10μｇを、より大きな容量
中、酵素20〜40単位で消化する。特定の制限酵素用の適
切な緩衝液および基質量は製造元によって指定されてい
る。通常、インキュベート時間は37℃で約１時間を用い
たが、これは供給元の指示に従って変えてもよい。消化
の後、反応物を直接ゲルにかけ、所望のフラグメントを
単離する。 「脱ホスホリル化」とは、細菌性アルカリホスファタ
ーゼ（BAP）で処理することによって末端部の５′リン
酸を除去することを指す。この操作によって、制限切断
されたDNAフラグメントの末端２つが「環化」、すなわ
ち制限部位における別のDNAフラグメントの挿入を妨げ
る閉じた環を生成すること、が防止される。脱ホスホリ
ル化のための方法および試薬は通常のものである「マニ
アティス等（Maniatis,T.et al.,Molecular Cloning,13
3−134（1982））］。BAPを用いる反応を50mMトリス
中、68℃で行って、酵素調製物中に存在するであろうす
べてのエキソヌクレアーゼの活性を抑制する。反応は１
時間行う。反応後にDNAフラグメントをゲル精製する。 「オリゴヌクレオチド」とは、既知の方法で化学的に
合成し、次いでポリアクリルアミドゲルで精製した、短
い１本鎖または２本鎖のポリデオキシヌクレオチドを指
す。 「ライゲート」とは、２つの２本鎖核酸フラグメント
の間でホスホジエステル結合が生成する過程をいう（マ
ニアティス等、上記、146頁）。他に記載がなければ、
既知の緩衝液および条件を用い、ほぼ等モル量のライゲ
ートしようとするDNAフラグメント0.5μｇあたりT4 DNA
リガーゼ10単位を用いてライゲートを行う。 「充填」または「平滑化」とは、制限酵素で切断され
た核酸の接着性末端にある１本鎖を２本鎖に変換する過
程をいう。これによって接着性末端が除去され、平滑末
端が生成する。この過程は、１つだけあるいはいくつか
の他の制限酵素によって創製された末端と接着性である
制限切断末端を、平滑に切断するいずれかの制限エンド
ヌクレアーゼによる末端、あるいはその他の充填された
接着性末端と適合しうる末端に変換するための万能の手
段である。通常、標的DNA2〜15μｇを、10mM MgCl2、1m
Mジチオトレイトール、50mM NaCl、10mMトリス（pH7.
5）緩衝液中、DNAポリメラーゼＩのクレノウフラグメン
ト８単位および４種のデオキシヌクレオシド三リン酸そ
れぞれ250μＭの存在下、約37℃でインキュベートする
ことによって平滑化を行う。通常、30分後のフェノール
およびクロロホルム抽出およびエタノール沈澱によって
インキュベートを停止させる。 「ノーザン」ブロットとは、既知の、ラベルしたオリ
ゴヌクレオチドまたはDNAフラグメントとハイブリダイ
ズさせることによって細胞mRNAの存在を確認する方法を
いう。本明細書中では、他の記載がなければ、ノーザン
分析は、マニアティス等（上記、202頁）の記載のよう
にして、変性剤（ホルムアルデヒド７％）の存在下、１
％アガロースでmRNAを電気泳動分離し、ニトロセルロー
スに移し、ラベルしたフラグメントとハイブリダイズさ
せることを意味する。 以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明する
が、これらは本発明の最良の態様を例示するものであっ
て本発明を限定しようとするものではない。 実施例１ 因子VIIIの発現ベクター 1.発現ベクターの構築 ヒト因子VIIIをコードしているcDNAを、トランスフェ
クションされた哺乳動物細胞において因子VIIIタンパク
質を発現するであろうプラスミドの構築に用いた［ウッ
ド等（Wood,W.et al.,Nature（Lond.），312,330−337
（1984））］。これらの形質転換された哺乳動物細胞は
約0.14mU/mlの因子VIIIを分泌した。本方法によって、
かなり大きい収量での因子VIIIの連続製造が得られる。 ａ）pF8CIS サイトメガロウィルスのエンハンサー［ボシャート等
（Boshart,M.et al.,Cell,41,520（1985））］およびプ
ロモーター［トムセン等（Thomsen,D.R.et al.,PNAS,8
1,659−663（1984））］、サイトメガロウィルスのスプ
ライス供与部位およびイントロンの一部［スターンベル
グ等（Sternberg,R.M.et al.,T.of Virol.,49,190−199
（1984））］、Ig可変領域イントロンおよびスプライス
受容部位、因子VIIIをコードしているcDNAおよびSV40ポ
リアデニル化部位を含有するベクターpF8CISを構築し
た。 第１図は、因子VIIIの製造セルラインを樹立するため
に用いる因子VIII発現ベクターを構築するための工程を
示すものである。以下、構築の３つの部分を詳細に記述
する。 １）最終ベクターの複製起源およびアンピシリン耐性マ
ーカーを、出発プラスミドpUC13pML、すなわちプラスミ
ドpMLの変異体から得た［ラスキーおよびボッチェン（L
usky,M.and Botchen,M.,Nature,293,79（1981））］。p
UC13［ベイラおよびメシング（Veira,J.and Messing,
J.,Gene,19,259（1982））］のポリリンカーをpMLのEco
R IおよびHind III部位に移すことによってpUC13pMLを
構築した。第２の出発プラスミドpUC8CMVは、CMVエンハ
ンサー、プロモーターおよびスプライス供与配列の供給
源である。第17図に示されている、CMVエンハンサー、
プロモーターおよびスプライス供与配列のためのヌクレ
オチド１〜732を、pUC8の平滑にしたPst IおよびSph I
部位に挿入することによってpUC8CMVを構築した（ベイ
ラおよびメシング、上記）。合成BamH I−Hind IIIリン
カー［ニュー・イングランド・バイオラブズ（New Engl
and Biolabs）からの市販品を利用できる］を接着性Bam
H I末端にライゲートしてHind III部位を創製した。こ
のライゲートの後、Hind III−Hinc II消化を行った。
この消化によって、CMVエンハンサー、プロモーターお
よびスプライス供与部位を含有する約800bpのフラグメ
ントが得られた。ゲル単離した後、この800bpのフラグ
メントをpUC13pMLの2900bp片にライゲートした。この中
間体プラスミドをSal IおよびHind IIIで消化すること
によってpF8CISの構築に必要なフラグメントを得た。こ
の3123bp片は、アンピシリン耐性マーカー、pUC13pMLか
らの複製起源ならびにエンハンサー、プロモーターおよ
びスプライス供与部位を含むCMVのコントロール配列を
含有していた。 ２）第１図の中央部に示されているような合成オリゴマ
ーを用いて、Ig可変領域イントロンおよびスプライス受
容配列を構築した。IgGイントロンおよびスプライス受
容部位用の以下の配列［ボスウェル等（Bothwell et a
l.,1981）］： を有する99merおよび30merを化学的に合成した。 DNAポリメラーゼＩ（クレノウフラグメント）によっ
てこの合成片を充填し、２本鎖のフラグメントを創製し
た［ワーテルおよびレツニコフ（Wartell,R.M.and W.S.
Reznikoff,Gene,９,307（1980））］。次いで、これをP
st IおよびHind IIIで２重消化した。この合成リンカー
をpUC13［ベイラおよびメシング（Veira,J.and Messin
g,J.,Gene,19,259（1982））］のPst IおよびHind III
部位にクローンした。合成オリゴヌクレオチドを含有し
ているクローン（pUCIg.10と命名した）をPst Iで消化
した。Pst I−Cla Iリンカーを用いて、このフラグメン
トにCla I部位を付加した。Hind IIIで消化した後、Ig
可変領域スプライス受容部およびIgイントロンの一部を
含有している118bp片をゲル単離した。 ３）構築工程の第３部で、肝炎表面抗原３′末端をSV40
初期領域の転写終止部位およびポリアデニル化部位に置
き換えた。SV40配列を含有しているベクターpUC.SV40
を、pUC8のBamH I部位［ビエラおよびメシング（上
記）］に挿入した。次いで、pUC.SV40をEcoR IおよびHp
a Iで消化した。この消化物から、SV40のポリアデニル
化部位だけを含有している143bpフラグメントをゲル単
離した。pSVE.8c1Dを消化して２つの付加的なフラグメ
ントをゲル単離した（欧州特許出願公開No.160,457）。
EcoR IおよびCla I消化によって生成した4.8kbフラグメ
ントは、SV40−DHFR転写ユニット、pMLの複製起源およ
びアンピシリン耐性マーカーを含有している。Cla Iお
よびHpa Iで消化した後に得られる7.5kbフラグメントは
因子VIIIのcDNAを含有している。３成分ライゲートによ
りpSVE.8c24Dが得られる。この中間体プラスミドをCla
IおよびSal Iで消化して、SV40ポリアデニル化部位およ
び転写終止部位、これに続くSV40DHFR転写ユニットとと
もに、因子VIIIのcDNAを含有している9611bpのフラグメ
ントを得た。 pF8CISを得るための最終的な３成分ライゲートには次
の成分を用いた:a）複製起源、アンピシリン耐性マーカ
ー、ならびにCMVエンハンサー、プロモーターおよびス
プライス供与部を含有している3123bpのSal I−Hind II
Iフラグメント;b）Igイントロンおよびスプライス受容
部を含有している118bpのHind III−Cla Iフラグメン
ト；およびｃ）因子VIIIのcDNA、SV40のポリアデニル化
部位およびSV40のDHFR転写ユニットを含有している9611
bpのCla I−Sal Iフラグメント。発現ベクターpF8CISの
配列の一部を第17図に示す。 ｂ）pF8CSSS サイトメガロウィルスのエンハンサーおよびプロモー
ター、加工した安定化配列、因子VIIIをコードしている
cDNA、およびSV40のポリアデニル化部位を含有している
ベクターpF8CSSSを構築した。供与および受容配列を含
む完全なイントロン領域を削除し、加工した安定化配列
で置き換えた。この安定化配列は、スプライシング後の
完熟mRNAの配列を有する合成２本鎖オリゴマーである。
この安定化配列をpF8CISの１つしかないSac II−Cla I
部位間に挿入した。この合成オリゴマーの配列を以下に
示す： この合成オリゴマーは、供与および受容コンセンサス
・スプライス配列の適切なヌクレオチドを含有してい
る。スプライス供与配列のスプライス受容配列に対する
対置を下線で示す。このベクターは、イントロン部分の
削除および加工した安定化配列による置換を除くと、上
記pF8CISベクターに類似している。この構築により、現
に転写されたmRNAからの非コード化領域の実際のスプラ
イシングが省かれる。この加工された安定化配列を含有
している発現ベクターpF8CSSSの配列の一部を第19図に
示す。 ｃ）pF8SCIS SV40のエンハンサーおよびプロモーター、サイトメガ
ロウィルスのスプライス供与部位およびイントロンの一
部、Igイントロンおよびスプライス受容部位、因子VIII
をコードしているcDNA、およびSV40ポリアデニル化およ
び転写終止部位を含有するベクターpF8SCISを構築し
た。 第２図にpF8SCISの構築を示す。 このベクターは３成分のライゲートを用いて構築し
た。このライゲートに用いた３種のDNAフラグメントそ
れぞれの調製を以下に述べる。 第１のフラグメントには、プラスミドpMLから得られ
るアンピシリン耐性マーカーの半分およびSV40初期領域
プロモーターおよびエンハンサーを含有させた。３種の
フラグメントの第１のものの出発プラスミドはpAML3P.8
C1である（欧州特許出願公開No.160,457）。このプラス
ミドをSac Iで切断した。全酵素DNAポリメラーゼＩを用
いて、このSac Iで創製された出っ張り部分を平滑にし
た。この反応の後、プラスミドをPvu Iで切断した。所
望の434bpフラグメントをアクリルアミドで単離した。 本構築に用いる第２および第３のフラグメントは、上
記のようにしてプラスミドpF8CISから単離した。 第２のフラグメントは、CMV中間体の初期遺伝子から
のスプライス供与部位およびイントロンの一部を含有さ
せた（イントロンおよびスプライス受容部位は上記のよ
うに合成して調製した）。pF8CISをSac IIで切断し、得
られた３′側の出っ張りをDNAポリメラーゼＩを用いて
平滑にし、次いでCla Iで切断した。pF8CIS中のCla I部
位の周辺配列は、このプラスミドをメチル化陽性株中で
増殖させたときには切断を妨げるので、pF8CISをdam-株
GM48から調製した［マリヌスおよびマリス（Marinus,M.
G.and Maris,N.R.,Bacteriol.,114,1143−1150（197
3））、およびゲイアーおよびマドリッド（Geier,G.E.a
nd Madrid,P.,J.Biol.Chem.,254,1408−1413（197
9））］。このベクター中にSac IIおよびCla Iの両部位
は１つしかないので、231bpのフラグメントはアガロー
スゲルから容易に単離される。 第３のフラグメントは、因子VIIIのcDNA、SV40の初期
領域ポリアデニル化部位、SV40−DHFR転写ユニット、pM
Lの複製起源およびアンピシリン遺伝子の半分を含有し
ている。pF8CIS（dam-）をCla IおよびPvu Iで消化する
ことによって11308bpフラグメントを調製した。 pF8SCISを創製する３成分ライゲートにより、Sac Iお
よびSac II部位が破壊され、Cla I部位が保持され、Pvu
I部位にampr遺伝子が再構築される。この発現ベクター
pF8SCISのヌクレオチド配列の一部を第18図に示す。 実施例２ 発現の分析 1.一時的な発現 トランスフェクションされた細胞の免疫ペルオキシダ
ーゼ染色に基づいて因子VIIIの発現を検定した［ゴーマ
ン等（Gorman et al.,Cell,42,519−526（1985））］。
この検定を用いて因子VIIIの発現ベクターを試験した。
因子VIIIに特異的な12のモノクローナル抗体をこの検定
に用いるためにスクリーニングした。BHK31A3B細胞（欧
州特許出願公開No.160,457）を染色し、親のBHK細胞セ
ルラインと比較して、因子VIIIを産生する細胞をスクリ
ーニングした。モノクローナル抗体BH6は、最小のバッ
クグラウンドを有する最強のシグナルを与えることがわ
かった。トランスフェクションを行い、因子VIIIの一時
的な発現を評価した。CaPO4法を用いて細胞（Cos、29
3、CHO、BHK、TM4）をトランスフェクションした。因子
VIIIのベクター沈澱物を10μg/ml用いた。この沈澱物を
３〜４時間細胞に付与し、次いで平均１分間、細胞にグ
リセリンショックを与えた。トランスフェクションの36
時間後に細胞をアセトン−メタノール（50:50）で固定
し、リン酸緩衝食塩水（PBS）で洗浄した。10％ウシ胎
児血清を含有するPBSで1:3000に希釈した精製BH6抗体ま
たは希釈していないBH6上清のどちらかを用いて細胞を
染色した。この第１の抗体を２時間細胞に付与した。こ
の期間中、プレートを穏やかな振盪器上に置いた。細胞
を10分間で５回洗浄した。第２の抗体であるウサギ抗−
マウスIgG（ダコパッツ）をPBS＋ウシ胎児血清中、1:15
0に希釈した。２時間インキュベートした後、一連の洗
浄を行った。ペルオキシダーゼ試薬を現像するための基
質としてオルソ−ジアンシジン［シグマ（Sigma）］を
用いた。オルソ−ジアンシジンのエタノール飽和溶液
を、過酸化水素を1:10,000希釈したPBSで1:100に希釈し
た。この基質を、室温で２時間または４℃で一晩、細胞
に付与した。 この方法は、因子VIIIを発現させる因子VIIIベクター
のスクリーニング法を与えた。この方法によって一時的
な因子VIIIの発現が測定される。トランスフェクション
の36時間後の染色によって、ベクターが転写され、mRNA
が翻訳されたかどうかの指標が得られる。 pF8CISは、少なくとも５つの異種セルライン（COS、2
93、CHO、TM4およびBHK）において因子VIIIを一時的に
発現させた。CHO細胞でのベクターpF8CISの一時的な発
現を第3A図に示す。 pF8SCISは、pF8CISと同じ効率で因子VIIIを一時的に
発現させることがわかった。CHO細胞でのベクターpF8SC
ISの一時的な発現を第3B図に示すCMVエンハンサーおよ
びプロモーターは類似のSV40エンハンサーおよびプロモ
ーターで完全に置き換えることができるので、因子VIII
の産生は特異的な転写開始シグナルに依存するのではな
く、むしろベクター中の安定化配列部位などのコントロ
ール領域の他の部分に依存している。 細胞をトランスフェクションして産生細胞セルライン
が樹立されたときに、それぞれの細胞種の皿を一時的な
発現について検定した。因子VIIIの一時的な発現のスク
リーニング結果から２種類の細胞群、すなわちトランス
フェクションの36時間後、因子VIIIについて陽性に染色
された細胞種の群（カテゴリー１）、および検出可能な
因子VIIIの一時的発現が認められなかった細胞種の群
（カテゴリー２）、が得られた。それぞれのカテゴリー
を構成している宿主細胞を以下に示す： カテゴリー１ カテゴリー２ CHO MDCK 293 BRL BHK Hela TM4 Vero HTC W138 COS CV1 HepG2 TR1 上に述べたように、Ig可変領域イントロンおよび供与
および受容部位を削除すると（他のコントロール領域を
維持しながら）、因子VIIIの一時的な発現がなくなる。
このデータから、少なくとも１つのスプライス供与−イ
ントロン−受容配列が発現に必要であると思われる。 さらに別の実験は、安定化配列の位置が重要であるこ
とを示している。たとえば、因子VIIIをコードしている
cDNAの３′にイントロンを配置しても因子VIIIは発現さ
れなかった。また、天然の因子VIIIのスプライス部位、
すなわちコード化領域内のスプライス部位を含んで構築
されたベクターもうまく行かないことがわかった。受容
部および合成Ig可変領域イントロンおよびCMV配列を含
有しているキメライントロンおよびCMVスプライス供与
配列を含有しているスプライス供与−受容配列は、因子
VIIIの連続産生を与えるセルラインの樹立に導く安定化
配列の例である。 2.連続産生 安定化配列を含有し、多種多様の細胞中で一時的に機
能することが示されたプラスミドを、多数のセルライン
中にトランスフェクションすることによって産生細胞セ
ルラインを樹立した。これらのトランスフェクション用
に、全量10μgDNA/mlの沈澱物を用いた。CHO DHFR細胞
のトランスフェクションには、４μｇの因子VIIIプラス
ミドを６μｇのサケ精子DNA（これは担体として働く）
に加えた［ウィグラー等（Wigler,M.et al.,）、上
記］。DHFR遺伝子の発現の直接選択がこれらの細胞にお
いて可能であった。他の細胞種のすべては、ネオマイシ
ン遺伝子を発現するプラスミドとの同時トランスフェク
ションを必要とした［ダビエスおよびジェニング（Davi
es,J.and Jenning,A.,Am.J.Trop.Med.Hyg.,29（５）,10
89−92（1980））］。pSVENeoBa16（欧州特許出願公開N
o.160,457）またはpRSVneo［ゴーマンの等（Gorman,et
al.,Science,221,551−553（1983））］のどちらかを用
いた。これらのトランスフェクション用に、因子VIIIプ
ラスミド４μｇ、ネオマイシン含有プラスミド１μｇお
よびサケ精子担体５μｇを用いた。上に記したように、
BRL以外は、改良型CaPO4法を用いてすべての細胞をトラ
ンスフェクションした。トランスフェクションした細胞
には、BKH、COH−DHFR、CV1、Vero、WI38、293、TM4、H
ela、MDCK、HTC、BRL、TR1およびHepG2が含まれる。 産生セルラインを樹立するために用いたプロトコール
は、主として上記の染色法によっていた。トランスフェ
クションに続く２日間、G418含有培地、またはCHO DHFR
細胞についてはグリシン、ヒポキサンチンおよびチミジ
ンを欠く選択培地で細胞を継代培養した。G418のレベル
は、選択に必要とされる適切な量について滴定を行っ
た。 選択開始から３〜４週間後に、因子VIIIの安定な発現
について細胞をスクリーニングした。クローンの皿を染
色して因子VIIIを発現するクローンの割合（％）を測定
した。この測定の後、それぞれの細胞種の12クローンを
染色用に採取した。次いで、安定な発現を示し、この時
点で陽性と評価されたクローンについては、コーテスト
（Coatest）検定による定量検定をも行った。 一時的な発現を示さなかった細胞はこの時点で安定な
発現を示さなかった（たとえば、Vero、HeLa）。因子VI
IIの安定な発現は、２つのカテゴリーの細胞群で観察さ
れた:1）因子VIIIを一時的に発現し、安定な発現のこの
第１回目で陰性と評価された細胞群（たとえば、CHOお
よびBHK細胞は染色するのに十分な高レベルでは安定な
発現を示さなかった）;2）一時的な段階および増幅され
ていない段階の両方で陽性に染色されたセルライン（た
とえば、後に潜在的な産生細胞セルラインと称されるTM
4、HTCおよび293）。 ＋ − TM4 CHO HTC BHK 293 Vero Hela CV1 WI38 BRL CHO細胞での低レベルの因子VIIIをコーテスト法で検
定した。コーテスト検定の結果を以下に示す： 増幅されていない細胞での因子VIIIレベル 宿主細胞 mU/104細胞／日 TM4 1.8 HTC 0.5 293 2.5 CHO ＜0.15 BHK ＜0.15 上記検定の結果は、産生宿主細胞の種類内で因子VIII
の産生レベルが変わることを示している。トランスフェ
クションした細胞を免疫ペルオキシダーゼ染色し（36〜
48時間での一時的な発現について）、次いでその３〜４
週間後に増幅されていない細胞を染色したときの結果
は、特定の細胞種を因子VIIIの産生細胞として用いるこ
とについて、予想を与えるものであった。細胞が陽性に
染色されず、一時的および増幅されていない段階で因子
VIIIが発現されないことを示したときには、この宿主細
胞は因子VIIIの産生セルラインとして働きそうもない。
この結論は、数回の増幅を行った後の因子VIIIの発現に
ついて、CHO、BHK、HTC、TM4および293細胞を染色した
ときの結果によって支持される。 １回目の増幅（MTX:100nM）の後、もう一度、上記の
形質転換細胞種からクローンを単離し、因子VIIIの産生
について分析した。この第１回目の増幅後の因子VIIIの
発現の結果は次のようである： 増幅を１回行った後の因子VIIIレベル 宿主細胞 mU/104細胞／日 TM4 3.0 HTC 2.3 CHO 0.1mU/ml BHK 0.1mU/ml クローンおよび母集団の両者を、さらに増幅を行うた
めに維持した。CHOおよびBHKの両細胞においては因子VI
IIが一時的にモニターされるが、MTX増幅を１回行った
後にはわずかのクローンしか同定されず、さらに継続す
ると低レベルの因子VIIIは消失した。これらのクローン
について不均質性が見られた（第４図）。因子VIIIを産
生するCHO細胞は、倍加時間が45〜52時間と大きく増加
し、倍加時間が28時間である母集団中の非発現細胞が繁
殖した。注意深く検討すると、因子VIIIを連続的に発現
するCHOクローンを樹立するのが困難であることがわか
った。以下に示したデータは、増幅されていない段階お
よび増幅を１回行った後の両者における、DHFR陽性CHO
クローン中の、因子VIIIを発現するクローンの頻度を示
すものである。因子VIIIに対して陽性に染色されたクロ
ーンの数を、トランスフェクションに次いで得られる安
定なクローンの数の割合（％）で表す。 細胞種 ベクター 未増幅 増幅１回 TM4 pF8CIS 18％ 77 ％ pF8SCIS 15％ 90 ％ CHO pF8CIS 0 0.1％ pF8SCIS 0 0.1％ ２回目または３回目の増幅（通常、約１μＭのメトト
レキセイト）を行ったときにも、CHO細胞において因子V
IIIが検出可能であった。この高レベルの増幅時でも、
因子VIIIの活性は低く、63mU/mlであった。連続的な増
幅によってCHOセルラインにおける産生の増加が導かれ
なかった。別個に得られた３つのCHOセルラインを形態
学的に分析すると、因子VIIIについて染色される細胞は
大きくなり、平たくなることがわかる（第５図）。10μ
Ｍまで増幅した形質転換CHO細胞は、200mU/ml産生する
にすぎない。これらの結果は、因子VIIIの産生細胞シス
テムの樹立においては、宿主細胞の選択が重要な工程と
なることを示している。ここでは、TM4、THCおよび293
を用いて、因子VIIIを連続的に産生する永久的な細胞セ
ルラインを樹立し、こうして産生細胞セルラインとみな
した。 実施例３ 因子VIIIの凝結活性 TM4細胞からの活性な因子VIIIの発現および分泌を、
凝結分析によって測定した。pF8CISでトランスフェクシ
ョンしたTM4細胞によって48時間調整を行った血清不含
培地を、因子VIIIについて検定した。第１表に示したよ
うに、TM4培養培地は血友病患者の血漿の凝固時間を短
縮した。この凝結活性の大部分は、TM4培地がヒト因子V
IIIに対するポリクローナル抗体とともに予めインキュ
ベートされたときに中和された。 第１表はTM4細胞からの活性因子VIIIの分泌を示すも
のである。ヒト因子VIIIのポリクローナル抗体10μｇを
添加して、または添加せずに、37℃で30分間、TM4培地
を予めインキュベートした。次いで0.01％BSAを含有す
る0.05Mトリス（pH7.5）でこの培地を1:1に希釈し、凝
結分析で検定した。精製した血漿由来の因子VIII（pd V
III）を同様に処理した。 実施例４ 因子VIII変異体の発現ベクター さらに効率的なタンパク質を得るためのアプローチの
１つは、タンパク質を加工することである。すなわち、
DNAレベルで遺伝子内に変異を導入することによって、
細胞培養物中で変異体を産生させることができ、タンパ
ク質機能の特異的な修飾を行うことができる。３種の変
異体を設計した。天然因子VIIIの１本鎖300,000ダルト
ンのタンパク質を90,000および80,000ダルトンのサブユ
ニットに切断し、次いで50,000、43,000および73,000ダ
ルトンの活性サブユニットに切断する。アミノ酸742か
ら1648の間のＢ領域は定義された機能を有していない
［ベーハー等（Vehar,G.A.et al.,Nature,312,330−337
（1984））。］完全な長さの組換え因子VIIIタンパク質
の発現について記載したのと同じ細胞システムを用いて
突然変異体を発現させた。 pF8CIS9080 因子VIIIの融合タンパク質を発現させるために用いら
れる真核生物性発現ベクターには、ヒトサイトメガロウ
ィルス（CMV）の即時型遺伝子のエンハンサー（ボシャ
ート等、上記）、およびプロモーター（トムセン等、上
記）；この遺伝子の転写開始部位の３′側に配置された
スプライス供与配列（ボシャート等；上記、ステンベル
グ等、上記）；およびマウスの免疫グロブリン可変領域
からの合成スプライス受容部位（ボスウェル等、上記）
を含有させた。新しいコード化領域は、その３′末端
が、SV40初期ポリアデニル化配列および転写終止部位で
区切られている（フィアーズ等、上記）。このベクター
は増幅可能なマーカー、すなわちSV40−DHFR転写ユニッ
トを含んでいる。 因子VIIIの融合タンパク質90kd＋142aa＋80kdをコー
ドしている発現ベクターpF8CIS9080の構築を第６図に示
す。プラスミドpSVE.8cID（欧州特許出願公開No.160,45
7）から始め、Sst IIで切断し、接着性末端をS1で平滑
にし、Hpa Iでさらに切断し、２つの平滑末端を再ライ
ゲートすることによって、３′非翻訳化領域中に短い欠
失を作成し、pSVE.8c9を得た。このプラスミドをCla I
およびSal Iで切断し、10031bpフラグメントをSal I、C
la I中にクローンした。6761ppのプロモーターはpAML3
P.D22（欧州特許出願公開No.160,457）のフラグメント
を含有している。因子VIII遺伝子内の充填Thr111 Iおよ
びBamH I（アミノ酸1563）をライゲートすることによっ
て、因子VIII遺伝子中の融合を作成した。第６図には、
pAML3P.8c1（欧州特許出願公開No.160,457）の2516bpフ
ラグメントとpAML3P.8c9の11991bpフラグメントをライ
ゲートすることによる、融合領域含有のpAML3P.8L19の
構築が示されている。この融合をDNA配列で確認した。
融合領域を含有している4722bpのCla I−Xba Iフラグメ
ントを、CMVプロモーター−エンハンサーを含有してい
るpF8CIS発現ベクターの5828bpのCla I−Xba Iフラグメ
ントにクローンした。メチル化がCla I部位での切断を
妨げないE.coliのdam-株からCMVフラグメントを得た。 実施例５ 発現の結果 実施例２に記載した方法を、ヌクレオチド796から156
2まで欠失した因子VIII変異体、pF8CIS9080の発現に応
用した。90kd＋142aa＋80kdの融合タンパク質は、完全
な長さのタンパク質より高レベルで発現された。しか
し、融合タンパク質の発現能力については細胞種の間で
かなりの変動が見られる。 次のデータは、適切な宿主細胞を選択することによっ
て、所望の融合タンパク質の連続製造（商業的に使用し
うる量で）が得られるであろうことを示している。pF8C
IS9080でトランスフェクションしたTM4細胞は、融合タ
ンパク質の一時的な発現および安定な発現を示した。pF
8CIS9080でトランスフェクションしたTM4細胞は、完全
な長さの因子VIIIと比べると、融合タンパク質のレベル
で５倍の増加を示した。100nMのメトトレキセイトでプ
ールされた融合因子VIIIのクローンは、12mU/104細胞／
日で産生した。HTC細胞は、完全な長さの因子VIIIと比
べて、融合因子VIIIの発現において同等の増強を示し
た。 293細胞での融合タンパク質因子VIIIの発現は、完全
な長さの因子VIIIの発現と比べると相当に高い。融合タ
ンパク質ベクターpF8CIS9080で形質転換された293細胞
においては、通常、増幅されていない母集団レベル85mU
/104細胞／日が常法によって達成される。完全な長さの
因子VIIIの発現レベルは、融合因子VIIIのものより低
く、2.5mU/104細胞／日である。コントロールシグナル
はpF8CISおよびpF8CIS9080で同一であるので、発現レベ
ルでの差異は、完全な長さのメッセージおよび／または
タンパク質を産生する細胞の能力に基づいているにちが
いない。 融合タンパク質は完全な長さのもの（1000nM）より比
較的早い増幅時点（100nM）で検出されるが、第７図に
示したように、これらの細胞は融合タンパク質の発現に
よって負担がかけられる。100nMで90kd＋142aa＋80kdを
発現するCHO細胞は、0.5μU/104細胞／日を産生する。
連続的な増幅は、第８図で観察される混合母集団のゆえ
に困難であった。１μＭのMTXおよび５μＭのMTXで選択
されたクローンは、0.1μＭのMTXでのセルラインより高
いレベルの発現を示さなかった。まとめると、ある種の
宿主細胞は因子VIIIまたはその変異体の発現を特にうま
く行った（たとえば、TM4）。他の宿主細胞は中間の性
質であり、変異体は発現するが、完全な長さの因子VIII
の発現は低レベルであるか、または全く発現されなかっ
た（たとえば、293細胞）。宿主細胞の最後の群は、製
造用の十分な因子VIIIを産生しそうもなかった（たとえ
ば、TRI）。 実施例６ 融合タンパク質の精製および特徴づけ 完全な長さの組換え因子VIIIについて上記した方法を
用いて、90kd＋142aa＋80kd融合体を293培地から精製し
た［イートン等（Eaton,D.E.et al.,Biochemistry,25,5
05−512（1986））。］この精製融合体は4,000〜6,000
ユニット/mgの比活性を有し、これは血漿由来の因子VII
Iの比活性に匹敵する。SDS−PAGEにかけたとき、この融
合体はMrが115,000および80,000の２つの主なバンドに
分かれた。また、Mrが180,000のバンドも観察される
が、これは融合体の１本鎖型を示すのであうろう。この
Mrが180,000、150,000および80,000であるタンパク質は
すべて、ウェスタンブロックにおける因子VIIIポリクロ
ーナル抗体によって検出される（第11図）。 90kd＋142aa＋80kdの融合体の凝結活性は、トロンビ
ンによって10〜20倍に活性化された（第12図）。この活
性化は、Mrが50,000、43,000および73,000のサブユニッ
トの生成と関係していた（同上）。また、因子VIIIは血
漿中を循環してフォン・ビレブランズ因子（von Willeb
rands factor、vWF）と結合するので、90kd＋142aa＋80
kd融合体のvWFへの結合をも試験した。精製した90kd＋1
42aa＋80kd融合体をvWF−セファロースカラムに通す
と、カラムに定量的に結合した（第13図）。次いで、0.
25M CaCl2（因子VIII−vWFの複合体を解離することが知
られている）用いて、融合体をカラムから溶離した。 上のデータは、293細胞から発現され分泌された90kd
＋142aa＋80kd融合体が血漿由来の因子VIIIと機能的に
同等であることを示した。90kd＋142aa＋80kd融合体は
血友病患者の血漿の凝固時間を短縮し、その活性は因子
VIIIの抗体によって中和された。この融合体は、血漿由
来の因子VIIIと同様、トロンビンによって活性化され、
プロセッシングされた。また、90kd＋142aa＋80kd融合
体はセファロースに固定されたvWFにも結合し、因子VII
I−vWFの複合体を解離することが知られている条件下で
vWFから解離した。 実施例７ 融合タンパク質の凝結活性 pF8CIS9080でトランスフェクションした293細胞によ
って48時間調整した血清不含培地を、凝結分析により、
因子VIIIの凝結活性について検定した。培地を1/50に希
釈した後、検定を行い、120秒から58.9秒まで（5.5ユニ
ット/mlの因子VIIIの凝結活性に対応する）血友病患者
の血漿の凝固時間を短縮することがわかった。この活性
は、血漿由来の因子VIIIに対するポリクローナル抗体に
よって中和された（第２表）。 第２表は293培地における凝結活性を示すものであ
る。 血友病患者の血漿（50μ）を、プラテリン［platel
in;ゼネラル・シアグノスティックス（General Diagnos
tics）］50μとともに、37℃で８分間、インキュベー
トした。次いで、0.01％BSAを含有する0.05Mトリス（pH
7.4）緩衝液で1/50に希釈した培地50μを加え、30秒
間インキュベートした。25mMのCaCl2を50μ加え、凝
固時間を測定した。トランスフェクションされていない
親セルラインから得た培地は希釈しなかった。抗体中和
の実験は、室温で30分間、希釈されていない培地（100
μ）を因子VIIIのポリクローナル抗体10μｇで予めイ
ンキュベートすることによって行った。次いで、培地を
希釈し、検定した。 実施例８ 活性化されたタンパク質Ｃに耐性な因子VIII
変異体の発現ベクター 活性化されたタンパク質Ｃ（APC）、すなわち血漿タ
ンパク質は、限定されたタンパク質加水分解によってヒ
ト因子VIIIを不活性化することがわかっていた。この不
活性化切断が可能な部位の１つは、位置336のアルギニ
ンである。この位置336のアルギニンを他のアミノ酸、
たとえばリジンまたはグルタミン酸に変えることができ
る。２種類のベクター、pF8CIS336FおよびpF8CIS9080−
336Eを構築して、位置336が不活性化の部位であるかど
うかを調べた。インビトロでの突然変異誘発［ノリス等
（Norris,K.et al.,Nucleic Acids Research,11,5103−
5112（1983））］を用いて、位置336のアルギニンをグ
ルタミン酸に変えた（第９図）。突然変異誘発のため
に、pF8CISからの792bpのHind III−Kpn Iフラグメント
を、m13のHind III−Kpn I部位に挿入した。以下に示す
18bpのオリゴマーを用いてこのフラグメントを突然変異
させた： 鎖の延長に次いで、２本鎖の突然変異M13クローンをA
cc IおよびKpn Iで切断した。778bpのフラグメントをゲ
ル精製した。プラスミドpF8CISを、E.coliのdam-株、GM
48中で増殖した。第１図で示されるPst I−Cla Iリンカ
ー配列により、このプラスミドを上記のようなメチル化
陽性の細菌株中で増殖させるときには、pF8CISのCla I
部位は切断されないであろう。dam- pF8CIS DNAから２
種類のフラグメント、10kbのKpn I部分−Cla Iフラグメ
ントおよび1108bpのCla I−Acc Iフラグメントを単離し
た。３成分ライゲートは、天然の因子VIII配列を突然変
異配列に置換することを必要とした（第９図参照）。 pF89080−336Eの構築は、第10図に示したような別の
３成分ライゲートによって行った。pF8CIS9080から単離
した8564bpのBal II−Sac IIフラグメントおよび891bp
のSca II−Spe Iフラグメントにライゲートすることに
よって、336E変異アミノ酸を含有する1115bpのSpe I−B
gl IIフラグメントを移して、別の変異融合タンパク質
を創製した。 これらタンパク質変異体の両者とも293細胞中で発現
した。この突然変異を有する完全な長さの因子VIIIは2.
8mU/104細胞／日で発現し、一方、融合変異体は15mU/10
4細胞／日で発現した。 実施例９ 活性化されたタンパク質Ｃに耐性な因子VIII
の活性 pF8CIS−336Eでトランスフェクションされた293細胞
から得られた培地は、血友病患者の血漿の凝固時間を短
縮した。この活性は、因子VIIIのポリクローナル抗体に
よって中和された（第３表）。しかし、位置336にグル
タミン酸を含有する組換え因子VIIIは、活性化されたタ
ンパク質Ｃによって不活性化されなかった（第３表）。 第３表は、活性化されたタンパク質Ｃに対する完全な
長さの因子VIII/336Eの安定性を示すものである。完全
な長さの因子VIII/336Eを産生する、トランスフェクシ
ョンされた293細胞で48時間調整した血清不含培地（表
中、「293−336E」で表す）を27倍に濃縮した。この培
地100μに、ウサギ脳セファリン10μおよびAPC10.0
ngを加えた。対照群にはAPCを加えなかった。試料を37
℃で40分間インキュベートした。同様に、位置336にア
ルギニンを含有する精製した組変え因子VIII（rVIII）
を、0.05Mトリス（pH7.5）、150mM NaCl、2.5mM CaCl2
で〜１ユニット/mlに希釈し、ウサギ脳セファリンおよ
びAPCとともにインキュベートした。また、完全な長さ
の因子VIII/336E（26λ）を産生する、トランスフェク
ションされた293細胞からの培地を、37℃で40分間、因
子VIIIのポリクローナル抗体（IgG調製物１μ）で予
めインキュベートした。インキュベートの後、凝結分析
によって試料を検定した。 実施例10 プロリラキシンの発現ベクター 1.pCIHRX ベクターpCIHRXに、サイトメガロウィルスのエンハン
サーおよびプロモーター、サイトメガロウィルスのスプ
ライル供与部位、Ig可変領域スプライス受容部位、H2プ
レプロリラキシンをコードしているcDNA、ならびに肝炎
表面抗原のポリアデニル化および転写終止部位を含有さ
せた。第14図にプロリラキシンベクター構築の工程を示
す。Ig可変領域からの、前記と同じイントロンおよびス
プライス受容配列を保持させた。677bpのプレプロリラ
キシンcDNAを、これら５′プロセッシングシグナルに続
けた。この５′コントロールシグナルはpF8CISのものと
同じであるが、ポリアデニル化領域および終止配列シグ
ナルは、SV40の代わりに肝炎表面抗原遺伝子から得た。 始めに、中間体プラスミドpClaRXを構築した。プラス
ミドpSVERX［同時継続の米国特許出願U.S.S.N.06/907,1
97（1986年９月12日出願）を参照］をHind IIIで切断し
て、プレ−プロリラキシンcDNA、続いて肝炎Ｂ表面抗原
（HBsAg）３′ポリアデニル化部位を含有する1700bpの
フラグメントを単離した。Kpn I部位は、このベクター
においてDHFRcDNAの発現のために用いられる、SV40初期
プロモーターの始まりの５′側、かつHBsAgポリアデニ
ル化部位の３′側にある。 プレピロリラキシンDNAは、Hpa IIで完全消化し、続
いてHinf Iで部分消化することによって、ハドソン等
［Hudson,P.et al.,The EMBO Journal,３,2333−2339）
が開示したクローニングベクターから切り出すことがで
きる。配列５′−ATGCCTCGCCTGTTT−３′の１本鎖DNAプ
ライマー（ATGプライマー）を合成し、プレプロリラキ
シンのDNAセグメントと混合し、プレプロリラキシンセ
グメントの鎖を分けるために混合物を煮沸し、そして冷
却してATG−プライマーをプレプロリラキシンのアンチ
センスDNA鎖とアニーリングさせた。 次いで、DNAポリメラーゼＩのクレノウフラグメント
を用いて、ATG−プライマーを、プレプロリラキシンDNA
セグメントの末端近くまで３′方向に延長した。さら
に、クレノウフラグメントの３′→５′エキソヌクレア
ーゼ加水分解的な活性は、プレプロリラキシンのアンチ
センス鎖の３′末端を、ATG−プライマーの５′末端
「Ａ」の対の塩基であるヌクレオチドまで正確に分解
し、こうしてこの末端を平滑末端にした。この新しい２
本鎖プレプロリラキシンセグメントを、プレプロリラキ
シンセグメントの３′非翻訳化領域中のAva II部位のと
ころで消化し、このAva II末端をクレノウフラグメント
酵素で充填してこの末端を平滑末端にした。 次いで、このフラグメントを、EcoR Iで切断してその
末端をクレノウフラグメント酵素で充填しておいたプラ
スミドtrp207−１＊tetxap［グレイ等（Gray,G.L.et a
l.,Gene,39,247−254（1985））］中に平滑末端ライゲ
ートした。グレイ等（上記）が開示したこのプラスミド
は、Ava I−Pvu IIセグメントが削除されており、trpプ
ロモーターの５′側のEcoR I部位が除かれている。正し
い配向でプレプロリラキシンセグメントを含有している
プラスミドを選択した後、このプレプロリラキシンのtr
p207−１＊tetxapプラスミドをCla Iで消化し、その末
端をクレノウで充填した。この直線化したプラスミドを
Xba Iでさらに消化し、プレプロリラキシンのセグメン
トをゲル電気泳動で単離した。 真核生物性発現ベクターp342E［クロウリー等（Crowl
ey,C.W.et al.,Mol.Cell.Biol.,３,44−55（1983））］
をBamH Iで消化し、その末端をクレノウで充填し、この
ベクターをさらにXba Iで消化し、このベクターのフラ
グメントをゲル電気泳動で単離した。パッツァー等［Pa
tzer,E.J.et al,,J.Virol.,51,346−323（1984）］の開
示のようにして、DHFRをコードしているDNAを付加する
ことによってp342Eプラスミドを修飾した。クロウリー
等（上記）が開示したプラスミドは、合成ポリリンカー
［ニュー・イングランド・バイオラブズ（New England
Biolabs）からの市販品を利用することができる］を用
いて、SV40初期プロモーターに続けて付加したXba I部
位を有している。このプラスミドをpSVCV202と命名し
た。次いで、このベクターフラグメントをXba I−Cla I
プレプロリラキシンフラグメントにライゲートし、真核
生物性発現プラスミドpSVプレプロリラキシン157（「pS
VERX」とも称される）を得た。 プラスミドpSVERXをHind III切断して得たフラグメン
トを、Hind III部位で直線化したpML中に挿入した。細
菌性アルカリホスファターゼ（BAP）で処理して再閉環
を最小にした。アンピシリン耐性コロニーをスクリーニ
ングして、プレ−プロリラキシン遺伝子の５′末端がpM
LのCla I部位の次に来るように挿入されたクローンを単
離した。 中間体プラスミドpClARXをCla IおよびKpn Iで切断し
て、プレ−プロリラキシン遺伝子、続いて肝炎表面抗原
３′ポリアデニル化配列を含有している1360bpのフラグ
メントを単離した。このフラグメントを、pF8CIS dam-
をCla IおよびKpn Iで切断することによって創製した51
43bpのフラグメントにライゲートした。 2.pCISRX ポリアデニル化配列の選択をメッセンジャーRNAの
５′プロセッシングに影響することが知られているので
［ウィルソンおよびネビンズ（Wilson ＆ Nevins）、上
記］、pCIHRX中の３′肝炎ポリアデニル化配列をpSV40
ポリアデニル化配列に置き換えた。この構築物をpCISRX
と命名した。この構築のための２種類の出発ベクターは
pCIHRXおよびpF8CISである。後者のベクターはpCIHRXと
同じ５′コントロールを有しているが、因子VIIIのcDNA
およびSV40のポリアデニル化部位を含有している。Sac
IIを用いてこのcDNAの３′を切断した。得られた３′側
の出っ張り部分をT4ポリメラーゼで平滑にした。次い
で、pCIHRXをBamH Iで切断した。この部位は、キメライ
ントロンとリラキシン遺伝子の５′末端を分けている。
861bpのフラグメントをBamH I処理物からゲル単離し
た。SV40のポリアデニル化部位、DHFR、転写ユニット、
細菌性の複製起源およびampr遺伝子、ならびにCMVのエ
ンハンサーおよびプロモーターおよびスプライス供与部
をpF8CISから単離した。これらの成分を２つのフラグメ
ント、すなわち2525bpのSal I−BamH Iフラグメントお
よび3113bpのHpa I−Sal Iフラグメントとして単離し
た。BamH I−Sac II（平滑）フラグメントと、Hpa I−S
al IフラグメントおよびSal I−BamH Iフラグメントと
の３成分ライゲートによってpCISRXを得た。 実施例11 プロリラキシンの発現 ２種類のリラキシン発現ベクターpCIHRXおよびpCISRX
の発現能力を、前記の免疫ペルオキシターゼ法で、数種
の抗−リラキシン抗体を用いて検定した。３種のウサギ
ポリクローナル抗体および３種のマウスモノクローナル
抗体を、pSVERXでトランスフェクションしたCOS細胞に
ついて試験した。モノクローナルRX−Ｉはバックグラウ
ンドのない強い染色を与えることがわかった。 本発明の２つのベクターpCIHRXおよびpCISRXをプロリ
ラキシンの発現について試験し、pSVERXと比較した。pC
IHRXおよびpCISRXベクターはポリアデニル化配列が異な
っている。pCIHRXには肝炎表面抗原のポリアデニル化配
列を含有させたが、pCISRXにはSV40初期領域のポリアデ
ニル化配列を含有させた。 293、TM4およびCHO細胞を、pRSVneo 1μｇ、サケ精子
担体５μｇならびにプラスミドpSVERX、pCIHRXおよびpC
ISRX4μｇを含有する全量10μｇのDNAでトランスフェク
ションした。前記のようにして細胞にグリセリンショッ
クを与えた。トランスフェクションの36時間後に、細胞
を固定し、1H6で染色してプロリラキシンを産生する形
質転換細胞を同定した。pCIHRXおよびpCISRXでトランス
フェクションした293およびTM4細胞において、陽性に染
色される細胞が観察された。CHO、293およびTM4細胞の
複製プレートを分割し、前記の染色プロトコールにかけ
てプロリラキシン産生細胞をスクリーニングした。 発現の結果を次表に示すが、プロリラキシンをコード
しているDNAの５′に安定化配列を含有するベクター
は、対照プラスミドpSVERXよりかなり高レベルでプロリ
ラキシンを産生することがわかる。安定な発現の場合、
プロリラキシンの培地検定は、細胞の全集団で行った。 プロリラキシンの一時的な発現 細胞種 プラスミド タンパク質量（ng/ml） CHO pSVERX 0.4 pCIHRX 0.9 pCISRX 3 TM4 pSVERX 0.4 pCIHRX 2 pCISRX 10 293 pSVERX 0.4 pCIHRX 3 pCISRX 12 プロリラキシンの安定な発現 細胞種 プラスミド タンパク質量（ng/ml） CHO pSVERX 0.6 pCIHRX 0.8 pCISRX 3.9 293 pSVERX 0.41 pCIHRX 3.0 pCISRX 22.0 実施例12 ｔ−PAの発現ベクター 1.pCIHt−PA サイトメガロウィルスのエンハンサーおよびプロモー
ター、サイトメガロウィルスのスプライス供与部位およ
びイントロン、Ig可変領域スプライス受容部位、ｔ−PA
をコードしているcDNA［ペニカ等（Pennica et al.,Nat
ure,301,214（1983））］、ならびに肝炎表面抗原ポリ
アデニル化および転写終止部位を含有するベクターpCIH
t−PAを構築した。 このｔ−PAベクター構築の工程を第16図に示す。 始めに、ｔ−PAのcDNAをpML中にクローンしてこの遺
伝子の５′末端にCla I部位を得た。これを行うため、p
SVpa−DHFR（これ以外に、英国特許2,119,804BではpETP
FRと呼ばれる）からの3238bpのHind IIIフラグメントを
pMLのHind III部位に挿入した。Cla I部位に並列してcD
NAの５′末端を有するクローンについてコロニーをスク
リーニングした。このpCLAt−PAと命名した中間プラス
ミドを第16図に示す。３′側にポリアデニル化領域が続
くｔ−PAのcDNAを、2870bpのCla I−Kpn Iフラグメント
として単離した。このフラグメントをpF8CISの5146bpフ
ラグメントにライゲートした。このCISベクターのCla I
−Kpn Iフラグメントは、５′コントロール領域、SV40
−DHFR転写ユニット、アンピシリン耐性遺伝子およびpM
L由来の起源領域を与えた。pCIHt−PAは、所望の異種遺
伝子をコードしているcDNAを除いて、前述したpCIHRXに
類似している。 CHOおよび293細胞をpSVpaDHFR、pCMVt−PAおよびpCIH
t−PAでトランスフェクションすることによってｔ−PA
の発現レベルを比較した。前２つのベクターは安定化配
列を含有していないので、本発明に従って構築された、
ｔ−PAをコードしているcDNAを含有するベクターpCIHt
−PAの対照として働く。培養した形質転換293細胞をそ
れぞれからの培地を検定し、次の結果を得た:pSVpaDHF
R、30ng/ml;pCMVt−PA、200ng/mlのｔ−PA;およびpCIHt
−PA、420ng/mlのｔ−PA。 2.pCISt−PA サイトメガロウィルスのエンハンサーおよびプロモー
ター、サイトメガロウィルスのスプライス供与部位およ
びイントロン、Ig可変領域スプライス受容部位、ｔ−PA
をコードしているcDNAならびにpSV40ポリアデニル化配
列を含有するベクターpCISt−PAを構築した。 この構築の出発ベクターはpCIHt−PAおよびpF8CISで
ある（第20図参照）。後者ベクターはpCIHt−PAと同じ
５′コントロールを有しているが、因子VIIIのcDNAおよ
びSV40ポリアデニル化部位を含有している。Sac IIを用
いてｔ−PA cDNAの３′を切断した。得られた３′側の
出っ張り部分をT4ポリメラーゼで平滑にした。次いで、
pCIHt−PAをCla Iで切断した。この部位は、キメライン
トロンとｔ−PA遺伝子の５′末端とを分けている。この
Cla I処理物から2870bpのフラグメントをゲル単離し
た。SV40ポリアデニル化部位、DHFR、転写コントロー
ル、細菌性の複製起源およびampr遺伝子、ならびにCMV
エンハンサーおよびプロモーターおよびスプライス供与
部をpF8CISから単離した。これらの成分を、2525bpのSa
l I−Cla Iフラグメントおよび3113bpのHpa I−Sal Iフ
ラグメントとして単離した。Sac II（平滑）−Cla Iフ
ラグメントと、Hpa I−Sal IフラグメントおよびSal I
−Cla I−フラグメントとの３成分ライゲートによってp
CISt−PAを得た。 293およびCHO細胞をpCIHt−PAおよびpCISt−PAでトラ
ンスフェクションすることによってｔ−PAの発現レベル
を比較した。培養した形質転換細胞それぞれからの培地
を検定し、次の結果を得た： 一時的なt−PA（ng/ml） CHO CIS 55 CIH 15 293 CIS 3000 CIH 1300
る発現可能なベクターを構築する為の組換えDNA法の応
用に関する。さらに、本発明は、所望のタンパク質を連
続的に製造するための、安定な細胞質mRNAを生成しうる
発現ベクターの構築に関する。換言すると、本発明は、
所望のタンパク質をコードしているDNAの５′側に配置
された特異的な安定化配列を有する発現ベクターに関す
る。また、本発明は、このようなベクターで真核生物細
胞を形質転換し、宿主細胞を選択し、そして、該細胞セ
ルラインを用いて所望のタンパク質を連続的に製造する
方法に関する。 先行技術 近年、組換え法が真核生物細胞に応用されるところと
なり、特に、哺乳動物細胞が選択可能な表現型をコード
している異種DNAで形質転換されるようになった「ウィ
グラー等（Wigler,M.,et al.,Cell,11,223−232（197
7））］。また、真核生物細胞を形質転換して、異種DNA
を真核生物細胞核の染色体DNA中に組込んで含有してい
る形質転換体を得ることができることが示された。 成功裏に行なわれた真核生物細胞培養物の形質転換お
よび所望のタンパク質をコードしているDNA配列の発現
が開示されている［たとえば、欧州特許出願公開No.73,
659および73,656］。これらの成功裏に行なわれた形質
転換は、ベクターを用いて相補DNA（cDNA）を発現させ
るものであり、５′コントロールシグナル、たとえばエ
ンハンサー［グルズマンおよびシェンク編（Gluzman,Y
and Shenk,T.,Enhancers and Eukaryoic Gene Expressi
on,Cold Spring Harbor Laboratory（1983））］、プロ
モーター［ハーマー等（Hamer,D.H.,et al.,Cell,21,69
7（1980））］および３′ポリアデニル化部位［プロー
ドフットおよびブラウンリー（Preoudfoot,N.J.and Bro
wnlee,G,G.,Nature,263,211（1976））］だけを必要と
するものであった。 真核生物では、細胞質mRNAがDNAと必ずしも共直線性
であるとは限らないことが1977年に見い出された。タン
パク質をコードしているDNA配列はある長さの非コード
化DNAによって遮断されていることがわかった。遺伝子
のDNA中には、最終的なmRNAには見い出されない長い塩
基配列が存在する。一次mRNA転写体が「スプライス」さ
れ、非コード化配列、すなわちタンパク質をコードして
いない配列が除去されることがわかった。DNA中のこれ
ら非コード化配列は通常イントロンと呼ばれ（以前は介
在配列と呼ばれていた）、一方、コード化配列はエキソ
ンと呼ばれる。RNAポリメラーゼは、完全なDNA、すなわ
ちエキソンとイントロンの両者の、一次転写体を生成す
る。この転写体はプロセッシングされ、イントロンが除
去される一方で同時にすべてのエキソンが正しい順序で
結合される。この結果を生み出す機序は「スプラインシ
ング」と称されている。 分割された、即ち継ぎ合わされた遺伝子が多数発見さ
れている。実際のところ、イントロンはほとんどすべて
の哺乳動物および脊椎動物の遺伝子中に存在し、真核微
生物の遺伝子中にも存在する。イントロンはメッセンジ
ャーのコード化領域に限定されない。たとえば、あるイ
ントロンは、プラスミノーゲン活性化因子mRNAのコード
化配列の前にあるリーダー領域中にも見い出された［こ
の遺伝子の他の位置に存在する多数のスプライス部位に
加えて；フィッシャー等（Fisher,R.et al.,J.Biol.Che
m.,260,1122（1985））］。何故イントロンが生み出さ
れ、真核生物遺伝子に一般的な特徴となっているのかに
ついてはかなり考慮が為されている［クリック（Crick,
F.,Science,204,264（1976））；およびシャープ（Shar
p,P.A.,Cell,23,643−646（1981））］。 イントロンの遍在性が示されたことにより、組換え法
に関連してスプライシングが研究されたのは別に驚くに
はあたらない。たとえば、ウサギβ−グロビンcDNA、転
写の開始および終止に関係している領域、β−グロビン
cDNA配列の５′側に位置する多数の部分からなるリーダ
ー配列からのスプライス部位、およびポリアデニル化配
列を含んでいるSV40ベクターが構築された［ムリガン等
（Mulligan,R.C.et al.,Nature,277,108−114（197
9））］。この組換えゲノムは、サル腎細胞に感染させ
たとき、β−グロビンコード化配列ならびに16Sおよび1
9S後期RNAのためのリーダー領域を含有するハイブリッ
ドmRNAを産生することが示された。このハイブリッドmR
NAは、かなりの量のウサギβ−グロビンポリペプチドを
産生した。ムリガン等は、スプライシング能力を欠く突
然変異体が独立したmRNAを産生しなかった実験について
議論している。 遺伝子発現においてRNAスプライシングが演ずる生理
学的な役割を確かめようとして、ハーマーおよびレーダ
ー［Hamer,D.H.and Leder,P.,Cell,18,1299−1302（197
9）］は、サル細胞にトランスフェクションしたSV40組
換え体中のスプライス部位の存在および／または位置を
操作した。ハーマーおよびレーダーは、所望のタンパク
質をコードしている遺伝子内に位置する１つのスプライ
ス部位を用いるか、または１つが所望のタンパク質をコ
ードしている遺伝子の５′側に、第２のものが該遺伝子
内に位置している２つのスプライス部位配列を用いた。
彼等は、少なくとも１つの機能的なスプライス結合を保
持しているウィルスのすべてがRNAを一時的に産生する
ことを見い出した。そして、スプライシングが、安定な
RNA生成に前もって必要なものであると結論づけた。こ
の結果を裏づけるように、グラス等［Gruss,P.et al.,P
NAS（USA），76,4317−4321（1979）］は、介在配列を
欠くSV40突然変異体を構築してもカプシドタンパク質が
全く検出されないことを見い出した。このグラスの論文
は、スプライス部位配列数個を有する多くの部分からな
るリーダーを利用するものであった。３つの論文は全
て、種々の位置に多数のスプライス部位を有するウィル
ス性ベクターの利用について論じている。これらのウィ
ルス性ベクターは、本発明の非ウィルス性ベクターとい
くつかの点で異なっている。第１に、ウィルス性イント
ロンは、コード化配列それ自身内、ならびに転写ユニッ
トの５′および３′の両方に位置している。本発明にお
いては、安定化配列は、所望のタンパク質をコードして
いる遺伝子の５′側に位置している。ウィルス性ベクタ
ーは、宿主DNAとは別個に複製し続け、組込まれず、そ
して分解性である。最後に、多くのウィルス性ベクター
は、正しいスプライシングが起こるために初期遺伝子機
能を必要としている。 これら２つの論文は、RNAスプライシングが組換えの
環境において重要となるのであろうことを示唆してい
る。しかし、他の研究ではスプライシングを破棄し、
３′ポリアデニル化部位、プロモーター、およびエンハ
ンサーなどの５′コントロールシグナルだけを用いてタ
ンパク質を発現させている。事実、レディー等［Reddy,
U.B.et al.,Transcriptional Control Mechanisms,J.Ce
ll.Biochem.Suppl.,10D,154（1986）］の最近の研究に
より、発現ベクターにイントロンを含有させると発現さ
れる所望のタンパク質量が実際に減少することがわかっ
た。この著者等は、イントロンは所望のタンパク質発現
のためのベクターの必須部分ではないと結論づけてい
る。また、ハル等（Hall et al.）は、イントロンの含
有がタンパク質の発現に有害であることを観察した。受
容配列を欠失させると、スプライスされていない細胞質
ウィルスmRNAが一時的に産生されることがわかった［ト
レイスマン等（Treismann,R.et al.,Nature,292,595−6
00（1981））］。これらの結果は、スプライシングが必
須ではないという考えを支持するものである。 エンハンサー、プロモーターおよび３′ポリアデニル
化部位などの通常の組換えコントロールシグナルを用い
る直接発現は、常に達成可能という訳ではない。スプラ
イス部位を有さないSV40プロモーターが多数のcDNAの直
接発現に用いられていた［β−ガラクトシダーゼ、ハル
等（Hall,C.V.et al.,J.Mol.Applied Genetics,
２，）；ヒト・インターフェロン、グレイ等（Gray,P.
W.et al.,Nature,295,503（1982））；赤血球凝集素、
ゲシング等（Gething,et al.,Nature,293,620（198
1））；ヒト・レシチン−コレステロール・アシルトラ
ンスフェラーゼ、マクリーン等（McLean,J.et al.,PNA
S,33,2335（1986））;DHFR、シモンセン等（Simonsen,
C.C.et al.,PNAS,80,2495（1983））；ヒト・インター
ロイキン−２、レオナルド等（Leonard,W.T.et al.,Nat
ure,311,626（1984））;ras−２、カポン等（Capon,D.
J.et al.,Nature,304,1983）;src、スニダー等（Snyde
r,M.A.et al.,Cell,32,891（1983））；および肝炎Ｂ表
面抗原、クロウリー等（Crowley,C.W.et al.,Mol.Cell
Biol.,３,44−55（1983））］。しかし、因子VIIIをコ
ードしているcDNAにライゲートされたSV40プロモーター
を含有している発現ベクターを用いて種々の細胞中にト
ランスフェクションしても、正しい大きさの独立した因
子VIIIメッセージは全く検出されなかった。このプラス
ミド上に存在する他の遺伝子、たとえばDHFRが転写され
ると、正しいメッセージが産生した。SV40プロモーター
は、ある種のタンパク質用のmRNAを発現しうるが因子VI
IIを発現することができなかったので、この問題は、連
続的な発現を可能にするであろうmRNAの転写／スプライ
シング、または単なる因子VIIIメッセージの蓄積の欠如
のいずれかに関係しているものと認められた。この前者
の問題は、mRNAの「安定性」の問題として本明細書中で
言及する。 転写開始シグナルと因子VIIIをコードしているcDNAの
種々の組み合わせを用いて多数の実験が行なわれた。こ
のようなベクターでトランスフェクションされた細胞
が、ノーザン分析により因子VIIIメッセージについて調
べられた。正しい大きさの独立したメッセージは全く見
い出されなかった。 また、ベクター中に存在するスプライス部位およびイ
ントロンを用いて実験が行なわれた。オカヤマおよびベ
ルグ［Okayama,H.and Berg,P.,Mol.and Cell.Biol.,３
（２）,280−289（1983）］は、SV40初期領域プロモー
ター、１つの供与部位および２つの受容部位を含むSV40
後期領域イントロン、cDNAおよびポリアデニル化シグナ
ルを含有するプラスミドベクター、pcDを用いた。因子V
IIIをコードしているcDNA、および３つのスプライス部
位を有する、３つに分かれたリーダー、およびアデノウ
ィルスの主後期プロモーターを含有しているベクター
が、欧州特許出願公開No.160,457に記載のようにして構
築された。このベクターが調べられ、完全な長さの因子
VIIIの発現が成功したりしなかったりランダムであるこ
とがわかった。このことの、ある部分は、クリプティッ
クな（あいまいな）スプライシングによって説明するこ
とができる。３つに分かれたリーダー領域は多数のコー
ド化領域でスプライスされ、最終的なメッセージが得ら
れる。このスプライシングパターンの複雑さは、４つの
一次転写体が別異にスプライスされて14の別個のメッセ
ージが得られることから明らかである［ネビンズおよび
ウィルソン（Nevins,J.and Wilson,M.,Nature,290,113
（1981））］。コード化配列の下流のスプライス選択の
ためのコントロールは、よくわかっていない。しかし、
適切なポリアデニル化部位の選択および転写終止が最終
的なスプライシングに先行し、これが３′スプライス部
位を選択させているのかもしれない。この理由から、お
よびエキソン−イントロン結合点における塩基配列の情
報内容が比較的少ないことから、スプライシングが時に
は正しくない、すなわちクリプティックであるのは驚く
には当たらない［ハーマー等（Hamer et al.,Cell,21,6
97−708（1980））およびマンソアー等（Mansour et a
l.,Mol.Cell.Biol.,６,2684（1986））］。このクリプ
ティックなスプライシングは、アデノ主後期プロモータ
ーおよび３つに分かれたリーダーを用いる完全長さの因
子VIIIの発現において、その成功がランダムであるのを
説明することができる。 アデノ主後期プロモーターを含有しているベクターの
分析がさらに行なわれた。アデノベクターを用いて他の
タンパク質が発現させられた（しかし、限定された発現
パターンを有しており、これはアデノのコントロール領
域が限定された細胞種において機能しうることを示唆し
ている）［レビン等（Levine,A.S.et al.,Virol.,11,67
2−681（1973））およびグロッドジッカー等（Grodzick
er,T.J.et al.,J.Virol.,９,559−571（1976））］。欧
州特許出願公開No.160,457の記載と同一の５′および
３′コントロール領域を有する、DHFRまたはｔ−PAなど
の他のタンパク質からのcDNAを用いてベクターが構築さ
れた。これらのプラスミドがCos、293、BHKおよびCHO細
胞中にトランスフェクションされ、次いでこのトランス
フェクション体が、免疫ペルオキシダーゼ染色によるｔ
−PA発現、またはメトトレキセイトを用いるDHFR発現の
いずれかについてモニターされた。まとめると、これら
アデノ後期ベクターはいずれも、293またはCos細胞以外
のすべての細胞種において、ｔ−PAまたはDHFRを全く発
現することができないことがわかった。ｔ−PAの一時的
な発現が293およびCos細胞において再現して見られた
が、しかし同じ条件下での因子VIIIの発現はランダムで
あった。これらの結果は、ウィルス性の多数に分かれた
リーダー配列の一部を用いても所望のタンパク質が発現
されなかったという３つの論文で裏づけられた。第１の
論文では、カウフマンおよびシャープ［Kaufman,R.J.an
d Sharp,P.A.,Mol.Cell.Biol.,２（11）,1304（198
2）］は、DHFRのコード化領域および免疫グロブリンの
可変領域遺伝子から単離された２つの３′スプライス部
位受容配列と結合された、アデノウィルスの３つに分か
れたmRNAリーダー配列の５′スプライス供与部位および
最初のリーダーを含む、アデノ主後期プロモーターを含
有するベクターを構築した。DHFR-CHO細胞中にトランス
フェクションされたこのベクターは、極めて低頻度のDH
FR+細胞を産生した。第２の論文で、カウフマンおよび
シャープ［Kaufman,R.J.and Sharp,P.A.,J.Mol.Biol.,1
59,601−621（1982）］は、同じプラスミドを記載し、D
HFRの発現が得られなかったことを示している。ウォン
等［Wong,G.C.et al.,Science,288,810−815（1985）］
は、SV40エンハンサー；アデノウィルスの主後期プロモ
ーターおよび３つに分かれたリーダー配列;3つに分かれ
たリーダーの最初のエキソンからの５′スプライス部位
およびマウス免疫グロブリン遺伝子からの３′スプライ
ス部位からなるハイブリッド（雑種）イントロン；第１
のものが所望のタンパク質、コロニー刺激因子を、第２
のものがDHFRをコードしている２つのcDNA;SV40ポリア
デニル化配列；およびVA遺伝子を有する発現ベクターを
用いた。この多シストロン性ベクターは、一時的にだけ
作動することがわかり（前掲、810頁）、翻訳能を増加
させるためにVA RNAの存在を必要とし（前掲、811
頁）、mRNAの安定性を増加させるために第２のcDNA、す
なわちDHFRのそれを必要とした（前掲、811頁）。従っ
て、アデノウィルスの主後期ベクター（ある種のタンパ
ク質のための、完全な、３つに分かれたリーダーを含有
する）によって、限定された一時的な発現能力が見られ
るが、ある種のタンパク質は、連続的な発現を成功裏に
行うためにはさらに別の要件を必要としている。 サイトメガロウィルスのプロモーターおよびエンハン
サー、因子VIIIをコードしているcDNA、および３′終止
配列を含有し、イントロンまたは構築されたスプライス
部位を含まないベクターが構築された。試験したすべて
の細胞種において、因子VIIIの一時的な、または安定な
発現はいずれも観察されなかった。 イントロンまたは構築されたスプライス部位を欠き、
SV40ポリアデニル部位、因子VIIIをコードしているcDN
A、およびプロモーターおよびエンハンサーを含むSV40
初期転写配列を含有している別のベクターは、一時的
な、または安定な発現をどちらも生じなかった。 SV40プロモーターおよびエンハンサー、完全なアデノ
主後期３分離リーダー（すなわち、適当な供与および受
容部位を有する３つのイントロン）、因子VIIIをコード
しているcDNA、および３′肝炎表面抗原ポリアデニル化
部位を含有するベクターは、COS細胞でだけ因子VIIIを
一時的に発現し、その他の細胞種では発現しなかった。 SV40はエンハンサーおよびプロモーター、アデノ主後
期３分離リーダーの最初のイントロン、免疫グロブリン
（Ig）可変領域受容部位、因子VIIIをコードしているcD
NA、およびSV40ポリアデニル化部位を含有しているベク
ターは、COS細胞において因子VIIIを一時的に発現した
が、その他の細胞種では発現しなかった。 SV40エンハンサーおよびプロモーター、アデノ主３分
離リーダーの最初の供与部位およびイントロン、Ig可変
領域受容配列のコンセンサス配列、因子VIIIをコードし
ているcDNA、および肝炎表面抗原の３′ポリアデニル化
部位を含有しているベクターが構築された。このベクタ
ーは、因子VIIIを一時的または安定に発現しなかった。 SV40エンハンサーおよびプロモーター、因子VIIIをコ
ードしているcDNA、供与および受容配列が備わった、cD
NAの３′側のSV40の小さいｔ−抗原イントロン、および
SV40初期領域ポリアデニル化部位を含有している、さら
に別のベクターが構築された。このベクターは、どの様
なタイプの細胞種においても、因子VIIIを一時的または
安定的に発現することはなかった。 本明細書中に記載した実験により、ある種のタンパク
質の安定な発現には安定化配列、すなわち供与−イント
ロン−受容配列または加工されたスプライス配列のいず
れかが必要であることが確かめられた。さらに、これら
の実験によって、安定化配列の位置が安定かつ連続的な
発現に重要であることが確かめられた。本発明は、発現
させることが困難なある種のタンパク質をコードしてい
るDNAの５′側に配置された特異的な安定化配列を有し
ているベクターを構築し、これを利用することに関す
る。選択した宿主細胞中にトランスフェクションしたと
き、本発明の発現ベクターは、該宿主細胞を、所望のタ
ンパク質（たとえば、因子VIII）を連続的に産生する細
胞に形質転換するであろう。また、本発明は、適切な細
胞セルラインの選択、および該宿主細胞をトランスフェ
クションして所望のタンパク質を連続的に製造するため
のセルラインを確立することに関する。 発明の該要 本発明は、組換え発現ベクターを用いてある種のタン
パク質を連続的に産生させるためには、所望のタンパク
質をコードしているDNAの５′側に配置される、特別に
配置された安定化配列が必要であるという発見に基づい
ている。さらに、本発明は、所望のタンパク質をコード
しているDNAの５′側に配置された安定化配列を用いる
ことによって得られる、安定な細胞質mRNAに関する。換
言すると、本発明は、上記のようにして構築した、所望
の異種タンパク質をコードしている遺伝子を発現する、
発現ベクターに関する。 さらに別の態様では、本発明は、本発明の新規ベクタ
ーでトランスフェクションするのに適した宿主細胞を選
択することに関し、さらに、宿主細胞を形質転換して所
望の異種タンパク質を製造するための安定なセルライン
を確立することに関する。 図面の説明 第１図：因子VIIIを産生するセルラインを樹立するため
に用いられる因子VIII発現ベクター、pF8CISの構築を示
す。 第２図：因子VIIIを産生するセルラインを樹立するため
に用いられる因子VIII発現ベクター、pF8SCISの構築を
示す。 第３図：トランスフェクション後の細胞の免疫ペルオキ
シダーゼ染色を示す。（Ａ）はpF8CISでトランスフェク
ションしたのちの発現を示し、（Ｂ）はpF8SCISでトラ
ンスフェクションしたのちの発現を示す。 第４図：増幅を１回行った、pF8CISでトランスフェクシ
ョンしたCHO細胞の免疫ペルオキシダーゼ染色を示す。 第５図:pF8CISでトランスフェクションし、増幅を３回
行ったCHO細胞の免疫ペルオキシダーゼ染色を示す。 第６図：因子VIIIの変異体を産生するセルラインを樹立
するために用いられる因子VIII変異体発現ベクター、pF
8CIS9080の構築を示す。 第７図：因子VIIIの変異体すなわち融合タンパク質をコ
ードしているベクターpF8CIS9080でトランスフェクショ
ンした細胞の免疫ペルオキシダーゼ染色を示す。 第８図：連続的な増幅を行った、pF8CISでトランスフェ
クションしたCHO細胞の免疫ペルオキシダーゼ染色を示
す。 第９図：活性化タンパク質Ｃによるタンパク質加水分解
的な切断に対して耐性である因子VIIIをコードしている
cDNAを含有している発現ベクター、pF8CIS−336Eの構築
を示す。 第10図：活性化タンパク質Ｃによるタンパク質加水分解
的な切断に対して耐性である因子VIIIの融合タンパク質
をコードしているcDNAを含有している発現ベクター、pF
89080−336Eの構築を示す。 第11図：精製した90kd＋142aa＋80kd融合体のSDS−PAGE
およびウェスタンブロック分析を示す。約８μｇの90kd
＋142aa＋80kd融合体をSDS−PAGEで分けた。次いで、タ
ンパク質を、クーマシーブルーによる染色で検出するか
（Ａ）、またはニトロセルロースに移動させてウェスタ
ンブロット分析にかけた（Ｂ）。血漿由来の因子VIIIに
対して生成したウサギポリクローナル抗体を用いて、ニ
トロセルロースに結合した90kd＋142aa＋80kd融合体を
検出した。 第12図:90kd＋142aa＋80kd融合体のトロンビン活性化を
示す。0.15M NaCl、2.5mM CaCl2および５％グリセリン
を含有する0.05Mトリス（pH7.4）中の、精製した90kd＋
142aa＋80kd融合体約11μｇを、トロンビン55μｇとい
っしょにして37℃で0.1〜60分間インキュベートした。
図に示した時間にその一部を取り出し、0.01％BSAを含
有する0.05Mトリス（pH7.4）中、1/2,000〜1/10,000に
希釈し、凝結分析によって検定した。試料の残りにSDS
緩衝液を加え、これを５分間、90℃に加熱した後、SDS
−PAGEにかけた（挿入図）。 第13図:90kd＋142aa＋80kd融合体のvWFへの結合が示さ
れている。0.05Mトリス（pH7.4）、150nM NaCl2、2.5mM
CaCl2および５％グリセリン中の90kd＋142aa＋80kd融
合体（275単位）をvWF−セファロースカラムにかけ、次
いでこのカラムを３倍カラム容量の上記緩衝液で洗浄し
た。90kd＋142aa＋80kd融合体を0.25M CaCl2で溶離し
た。このvWF−セファロースカラムは、製造元の指定に
従い、純vWFをアフィゲル10（Affigel;Bio Rad）にカッ
プリングさせて調製した。 第14図：プロリラキシンを産生するセルラインを樹立す
るために用いられるプロリラキシン発現ベクター、pCIH
RXの構築を示す。 第15図：プロリラキシンを産生するセルラインを樹立す
るために用いられるプロリラキシン発現ベクター、pCIS
RXの構築を示す。 第16図:t−PAを産生するセルラインを樹立するために用
いられるｔ−PA発現ベクター、pCIHt−PAの構築を示
す。 第17図:pF8CISの配列の一部を示す。この発現ベクター
のDNA配列は、サイトメガロウィルスのエンハンサー、
プロモーター（ヌクレオチド１〜732）、安定化配列、
すなわちスプライス供与イントロン配列、Ig可変領域イ
ントロンおよびスプライス受容配列（ヌクレオチド733
〜900）を含んでいる。 第18図:pF8SCISの一部の配列を示す。この発現ベクター
のDNA配列は、SV40のエンハンサーおよびプロモーター
（ヌクレオチド１〜360）、サイトメガロウィルスの供
与およびイントロン配列、Ig可変領域イントロンおよび
スプライス受容配列を含む安定化配列（ヌクレオチド36
1〜580）を含有している。 第19図:pF8CSSSの配列の一部を示す。この発現ベクター
のDNA配列は、サイトメガロウィルスのエンハンサープ
ロモーターおよびリーダー（ヌクレオチド１〜732）、
加工されたスプライス供与および受容配列を含む安定化
配列（ヌクレオチド733〜736）、残りのリーダーを含有
している。 第20図:t−PAを産生するセルラインを樹立するために用
いられるｔ−PA発現ベクター、pCISt−PAの構築を示
す。 詳細な説明 定義および一般的な方法を以下に記述する。 本明細書中で用いる「ヌクレオチド配列」なる語句
は、５′から３′にリン酸ジエステル結合された一連の
ヌクレオチドからなる核酸を指し、これはRNAあるいはD
NA配列のいずれであってもよい。DNAである場合、この
ヌクレオチド配列は、１本鎖あるいは２本鎖のいずれで
あってもよい。同様に、「DNA配列」なる語句は、１本
鎖および２本鎖の両方を指す。 「所望の異種タンパク質」なる語句は、宿主細胞中で
発現することが望まれているタンパク質を指す（このタ
ンパク質は、該宿主細胞によっては通常産生されない
か、または少量しか産生されず、通常はこの細胞の存在
に必要ではない）。このようなタンパク質には、プレあ
るいは成熟アミノ酸配列を有するすべての分子、および
該所望の異種タンパク質と同等の生物学的活性を示しう
るアミノ酸あるいはグリコシル化変異体（天然のアレル
遺伝子を含む）が含まれる。 「スプライシング」なる語句は、一次転写体のプロセ
ッシング中に、RNAの内部の１またはそれ以上のある長
さ部分が除かれることによって１つの機能的なRNA分子
が生成する機序を指す。スプライシングは、イントロン
が外へ環状化してイントロンの５′末端（供与部と呼ば
れる）がイントロンの３′末端（受容部と呼ばれる）に
並列することから始まると考えられている。イントロン
−エキソン連結部の塩基配列の比較により、各イントロ
ンの５′末端の最初の２塩基がGTであり、３′末端の最
後の２塩基がAGである、コンセンサス配列が明らかにな
っている。 「スプライスされたmRNA」とは、RNAの内部の１また
はそれ以上のある長さ部分を除去することにより産生さ
れるか、または、スプライシングにかけられたがヌクレ
オチド配列が実際上除去されなかったmRNAと同じ性質を
有するmRNAを転写により産生するDNAを構築することに
よって得られるmRNAを指す。 「安定化配列」とは、得られるmRNAが、スプライスさ
れたmRNAと機能的に類似しているように、供与／受容連
結部の適当なヌクレオチドおよび供与および受容配列の
ための完全なコンセンサス配列あるいはその一部を含有
する配列をコードすることによって、またはスプライス
供与−イントロン−受容配列をコードすることによっ
て、スプライスされたmRNAを生成するDNA配列を指す。
この安定化配列は、所望の異種タンパク質をコードして
いる遺伝子のリーダー配列中に配置される。「リーダー
配列」とは、CAP部位とAUG翻訳開始シグナルの間の５′
非翻訳化領域中にあるmRNAの領域を指す。 本明細書中で用いる「コンセンサス配列」とは、エキ
ソン−イントロンの境界部（または供与配列）に現われ
ることがわかっている配列▲C A▼ AG/GT ▲A G▼ AGT、
およびイントロン−エキソンの境界部（または受容配
列）に現われることがわかっている配列（▲T C▼）nN▲
C T▼ AG/Gを指す［マウント（Mount,S.M.,Nucleic Acid
s Research,10（２）,459−472（1982））を参照］。個
々の塩基が特定の位置に現われる頻度を分析すると、供
与および受容配列のコンセンサス配列が得られた。ま
た、イントロンがGTで始まり、AGで終わることが知られ
ている［ブリースナッハ等（Breathnach,R.et al.,PNAS
（USA），75,4853−4857（1978））］。さらに、ある種
の、多数に分かれたリーダー配列（多数のスプライシン
グが起こる）は、適切なプロセッシングが行なわれるた
め、初期遺伝子機能の別の因子を必要とすることもある
ことがわかっている［バビス等（Babiss,L.E.et al.,Mo
l.and Cell.Biol.,５（10）,2552−2558（1985））を参
照］。当分野で通常の知識を有する者は、本発明に従
い、コンセンサス スプライス配列の規則、多数に分か
れたリーダー配列（初期遺伝子機能を必要とし、多数の
スプライシングが起こる）、ならびに供与および受容コ
ンセンサス配列の知識を用いて、所望のタンパク質のた
めの特定の安定化配列を選択することができるであろ
う。 「コントロール領域」とは、転写または翻訳のいずれ
かのコントロールに関与しているであろう、真核生物性
遺伝子の５′および３′末端に位置している特異的な配
列を指す。ほとんどすべての真核生物性遺伝子は、転写
が開始される部位の上流側の約25〜30塩基のところにAT
に富む領域を有している。転写開始部位の上流側70〜80
塩基のところに観察される他の配列は、CXCAAT領域であ
る（Ｘはどんなヌクレオチドであってもよい）。ほとん
どの真核生物性遺伝子の３′末端はAATAAA配列であり、
この配列は、転写されたmRNAの３′末端にポリアデニル
化の尾部が付加するためのシグナルとなっているのであ
ろう。 「プロモーター」とは、RNAの合成を開始するRNAポリ
メラーゼ分子によって認識されるヌクレオチドセグメン
トをいう。哺乳動物宿主細胞中のベクターからの転写を
コントロールするプロモーターは、種々の供給源、たと
えばウィルス［たとえば、ポリオーマ、サルウィルス40
（SV40）、アデノウィルス、レトロウィルス、肝炎−Ｂ
ウィルス、最も好ましくはサイトメガロウィルス］のゲ
ノムまたは異種哺乳動物のプロモーター（たとえば、β
アクチンプロモーター）から得ることができる。SV40ウ
ィルスの初期および後期プロモーターは、SV40ウィルス
の複製起源をも含有するSV40制限フラグメントとして都
合よく得られる［フィアーズ等（Fiers et al.,Nature,
273,113（1978））］。ヒトサイトメガロウィルスの即
時型プロモーターは、Hind III E制限フラグメントとし
て都合よく得られる［グリーンアウェイ等（Greenaway,
P.J.et al.,Gene,18,355−360（1982））］。もちろ
ん、宿主細胞あるいは関連の種からのプロモーターも本
発明に有用である。 「エンハンサー」とは、DNAのシス作用性の要素を指
し、通常約10〜300bpであり、プロモーターに作用して
その転写を増加させる。所望の異種タンパク質をコード
しているDNAの高等真核生物による転写は、エンハンサ
ー配列をベクター中に挿入することによって増加する。
このエンハンサーは、比較的配向および位置に依存せ
ず、転写単位の５′［ライミンズ等（Laimins,L.et a
l.,PNAS,78,993（1981））］および３′［ラスキー等
（Lusky,M.L.et al.,Mol.Cell Bio.,３,1108（198
3））］、イントロン内［バネジル等（Banerji,J.L.et
al.,Cell,33,729（1983））］、ならびにコード化配列
それ自身内［オスボーン等（Osborne,T.F.et al.,Mol.C
ell Bio.,４,1293（1984））］に見い出されていた。現
在では、哺乳動物遺伝子（グロビン、エラスターゼ、ア
ルブミン、α−フェトタンパク質およびインスリン）由
来の多数のエンハンサー配列が知られている。しかし、
通常は真核生物細胞ウィルスからのエンハンサーが用い
られる。これらの例には、複製起源の後期側のSV40エン
ハンサー（bp100〜270）、サイトメガロウィルスの初期
プロモーターエンハンサー、複製起源の後期側のポリオ
ーマエンハンサー、およびアデノウィルスエンハンサー
が含まれる。 また、真核生物宿主細胞（酵母、菌類、昆虫、植物、
動物、ヒト、または他の多細胞系生物からの有核細胞）
中で用いられる発現ベクターは、転写の終止に必要な配
列（mRNAの発現に影響することもある）を含有している
であろう。これらの領域は、所望の異種タンパク質をコ
ードしているmRNAの非翻訳化部分中のポリアデニル化セ
グメントとして転写される。また、この３′非翻訳化領
域は転写終止部位をも含有している。 発現ベクターは、選択遺伝子（選択マーカーとも呼ば
れる）を含有していてもよい。選択遺伝子は、ベクター
で形質転換された宿主細胞の生存または成長に必要なタ
ンパク質（時には、第２のタンパク質と称される）をコ
ードしている。哺乳動物細胞に適する選択マーカーの例
は、ジヒドロ葉酸還元酵素（DHFR）、チミジンキナーゼ
またはネオマイシンである。このような選択マーカーを
哺乳動物宿主細胞中にうまく転移させると、形質転換さ
れた哺乳動物宿主細胞は選択圧下に置かれたときに生存
することができる。広く用いられている選択処方には、
２つの別個のカテゴリーがある。第１のカテゴリーのも
のは、細胞の代謝に基づくものであり、追加培地とは無
関係に成長する能力を欠いている突然変異セルラインを
使用するものである。例を２つ挙げると、これらはCHO
DHFR-細胞およびマウスLTK-細胞である。これらの細胞
は、チミジンあるいはヒポキサンチンなどの栄養素の追
加がないところで成長する能力を欠いている。これらの
細胞は、完全なヌクレオチド合成経路に必要なある種の
遺伝子を欠いているので、失われたヌクレオチドが追加
培地に与えられなければ生存することができない。培地
に追加を行うことの代わりは、無傷のDHFRあるいはTK遺
伝子を、それぞれの遺伝子を欠いている細胞中に導入す
ることであり、こうしてそれらの成長要求を変えること
である。DHFRあるいはTK遺伝子で形質転換されていない
個々の細胞は、追加が為されていない培地中で生存する
ことができないであろう。従って、これらの細胞を直接
選択するためには、追加栄養素のないところで細胞を成
長させることが必要である。 第２のカテゴリーのものは、すべての細胞種で用いら
れる選択法である優性選択であり、突然変異セルライン
の使用を必要としない。この方法は通常薬物を用いて宿
主細胞の成長を抑制する。新規遺伝子を有するこれらの
細胞は、薬物耐性を伝達するタンパク質を発現し、選択
体を生存させるであろう。このような優性選択に用いら
れる薬物の例は、ネオマイシン［サザーンおよびベルグ
（Southern P.and Berg,P.,J.Molec.Appl.Genet.,１,32
7（1982））］、マイコフェノール酸［ムリガンおよび
ベルグ（Mulligan,R.C.Berg,P.,Science,209,1422（198
0））］またはハイグロマイシン［サジェン等（Sugden,
B.et al.,Mol.Cell.Biol.,５,410−413（1985））］で
ある。上に挙げた３つの例は、真核生物性コントロール
下の細菌性遺伝子を用いて、適当な薬物ネオマイシン
［G418あるいはジェネチシン（geneticin）］、xgpt
（マイコフェノール酸）またはハイグロマイシンへの耐
性をそれぞれ伝達するものである。後記の実施例では、
選択剤は、特にCHO DHFR-細胞と記載されているのでな
ければ、G418ジェネチシンを用いることが多い。この場
合、DHFR産生の直接選択を用いた。 「増幅」とは、細胞の染色体DNA内のある隔離した領
域の増加または複製を指す。増幅は、選択剤［たとえ
ば、DHFRを不活性化するメトトレキセイト（MTX）］を
用いて行う。増幅、すなわちTHFR遺伝子の連続コピーの
生成により、MTX量が多くなればなるほどさらに大量のD
HFRが産生されることになる。さらに多量のMTXを培地に
加えることによって、内生DHFRが存在するにもかかわら
ず増幅圧がかけられる。同時組込みが起こりうるよう
に、所望のタンパク質をコードしているDNAおよびDHFR
あるいは増幅遺伝子を有するプラスミドで哺乳動物宿主
細胞を同時トランスフェクションすることによって、所
望の遺伝子の増幅を達成することができる。順次連続的
に高くしていったMTX濃度中で成長することができる細
胞だけを選択することによって、細胞がさらに多量DHFR
を要求するのを確実なものにする（この要求は選択遺伝
子の複製によって満たされる）。所望の異種タンパク質
をコードしている遺伝子が増幅しうる遺伝子と同時組込
みする限り、この遺伝子の複製によって所望のタンパク
質をコードしている遺伝子の複製が得られる。この結
果、所望の異種タンパク質をコードしている遺伝子のコ
ピー数の増加、すなわち遺伝子の増幅により、さらに多
量の所望の異種タンパク質が発現されることになる。 所望の異種タンパク質をコードしている本発明のベク
ターを高等真核生物中で発現させるのに適した宿主細胞
には、SV40で形質転換したサル腎CVIセルライン（COS−
７、ATCC CRL 1651）；ヒト胚腎セルライン［293、グラ
ハム等（Graham,F.L.et al.,J.Gen Virol.36,59（197
7）］；ハムスター新生児腎細胞（BHK、ATCC CCL 1
0）；チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞−DHFR［ウル
ラウブおよびチャージン（Urlaub and Chasin,PNAS（US
A），77,4216（1980））］；マウス・セルトリー細胞
［TM4、マザー（Mather,J.P.,Biol.Reprod.,23,243−25
1（1980））］；サル腎細胞（CVI ATCC CCL 70）；アフ
リカミドリザル腎細胞（VERO−76、ATCC CRL−1587）；
ヒト頚管ガン細胞（HELA、ATCC CCL 2）；イヌ腎細胞
（MDCK、ATCC CCL 34）；バッファロー・ラット肝細胞
（BRL 3A、ATCC CRL 1442）；ヒト肺細胞（W138、ATCC
CCL 75）；ヒト肝細胞（Hep G2、HB8065）；マウス乳腫
瘍（MMT 060562、ATCC CCL 51）；ラット肝腫瘍細胞［H
TC、M1.54、バウマン等（Baumann,H.et al.,J.Cell Bio
l.,85,1−８（1980））］；およびTRI細胞［マザー等
（Mather,J.P.et al.,Annals N.Y.Acad.Sci.,383,44−6
8（1982）］が含まれる。 「形質転換」とは、染色体外成分として、または染色
体に組込むことによって、DNAの複製が可能なように生
物中にDNAを導入することを意味する。他に記載がなけ
れば、本明細書中で用いる、宿主細胞の形質転換法はグ
ラハムおよびイブ［Graham,F.and van der Eb,A.,Virol
ogy,52,456−457（1973）］の方法である。 宿主細胞を、本発明の発現ベクターで形質転換し、プ
ロモーターの誘起、形質転換体の選択、または遺伝子の
増幅に適しているように修飾した通常の栄養培地で培養
することができる。温度、pHなどの培養条件は、発現用
に選択した宿主細胞に以前から用いられてきた条件であ
り、当分野では明白であろう。 「トランスフェクション」とは、コード化配列が実際
に発現されようとされまいと、宿主細胞による発現ベク
ターの取り込みを指す。多数のトランスフェクション
法、たとえばCaPO4法およびエレクトロポレーション（e
lectroporation）法が当分野で知られている。成功裏の
トランスフェクションは、通常、このベクターの作用の
指標が宿主細胞内に現われたときに認定される。しか
し、本発明に関しては、成功裏のトランスフェクション
とは、多世代にわたって宿主培養物が所望の異種タンパ
ク質を安定かつ連続して発現することをいう。 産生宿主細胞の選択は、本発明の方法を用い、一時的
な発現、次いで増幅されていない発現をスクリーニング
することによって行なわれる。ベクターを一時的な発現
についてスクリーニングし、どのベクターを用いて所望
の異種タンパク質を発現させることができるかを決定し
た。一時的な発現は、取り込まれた特定のプラスミドが
機能するかどうか、すなわち転写および翻訳されて所望
のタンパク質を産生するかどうかについての指標を与え
る。この間に、細胞に入ったプラスミドDNAは核に移動
する。このDNAは組込まれていない状態にあり、核内で
遊離している。細胞によって取り込まれたプラスミドの
転写はこの期間中に起こる。次いで、所望の異種タンパ
ク質を一時的に産生しうると同定されたベクターを用い
て安定かつ連続的な産生細胞を樹立した。一時的な発現
とは、トランスフェクション後の短期間（12〜72時間）
のものを指す。トランスフェクション後のこの最初の期
間が過ぎると、プラスミドDNAは細胞分裂によって減少
または希釈される。細胞クロマチン内でランダムな組込
みが起こる。増幅されていない発現の２〜３週間後に細
胞をスクリーニングすると、永久的なセルラインに導く
組換えDNAを保持している細胞が示される。 トランスフェクションされた細胞の免疫ペルオキシダ
ーゼ染色に基づく検定が開発され、所望の異種タンパク
質が発現されたかどうかが素早く評価された［ゴーマン
等（Gorman,C.M.et al.,Cell,42,519−522（198
5））］。所望の異種タンパク質に特異的なモノクロー
ナル抗体がこの検定に用いるためにスクリーニングされ
た。特異的なタンパク質を産生する細胞をスクリーニン
グするため、ベクターを含有する宿主細胞を染色し、親
セルラインと比較した。最小のバックグラウンドで最も
強いシグナルを与えるモノクローナル抗体を選別した。
一時的なトランスフェクションを行って、所望のタンパ
ク質を産生する能力についてベクターを試験した。CaPO
4法を用いて細胞（Cos、293、CHO、BHK、TM4）をトラン
スフェクションした［ゴーマン等（Gorman,C.M.et al.,
Science,221,551−553（1983））の修飾によるグラハム
およびイブ（Graham and van der Eb）］。試験しよう
とする特異的なタンパク質ベクターの沈澱物を10μg/ml
用いた。この沈澱物を細胞上に３〜４時間置いた。次い
で、平均して１分間、細胞をグリセリン ショックにか
けた。トランスフェクションの36時間後に細胞をアセト
ン−メタノール（50:50）で固定し、リン酸緩衝食塩水
（PBS）で洗浄した。希釈されていないモノクローナル
抗体上清または10％ウシ胎児血清を含むPBS中、1:3000
に希釈した精製抗体を用いて染色を行った。この最初の
抗体を２時間細胞上に置いた。この期間中、プレートを
穏やかな振盪器上に置いた。10分間に５回、細胞を洗浄
した。用いた第２の抗体はウサギ抗−マウスIgG［ダコ
パッツ（Dakopatts）］であり、これを、PBS＋ウシ胎児
血清中、1:150に希釈した。２時間インキュベートした
後、一連の洗浄を行った。ペルオキシダーゼ試薬を現像
するためオルソ−ジアンシジンを基質として用いた。エ
タノール飽和したオルソ−ジアンシジンの溶液を、過酸
化水素を1:10,000に希釈したPBS中、1:100に希釈した。
この基質を、室温で２時間または４℃で一晩、細胞上に
置いた。 この方法により、所望のタンパク質をコードしている
多種多様のベクターを、タンパク質の発現能力について
素早くスクリーニングした。 コーテスト（Coatest）因子VIIIをヘレナ・ラボラオ
リーズ［Helena Laboratories ,Beaumont,TX（Cat.No.5
293）］から購入した。５％以下のタンパク質を含有し
ている試料用の「終点法」について製造元が提供してい
る方法を実質的に用いた。 多種多様の細胞中で一時的に機能することが示された
本発明のプラスミドを用いて産生セルラインを樹立し
た。発現ベクターを多数のセルライン中にトランスフェ
クションした。このトランスフェクション用には、合計
10μg DNA/mlの沈澱物を用いた。上記のような選択マー
カーを用いて、これら細胞中での発現の選択を可能にし
た。カルシウムに対して感受性であることがわかったBR
L細胞を除き、改良型CaPO4法を用いてすべての細胞をト
ランスフェクションした。これらの細胞についてエレク
トロポレーションを用いた。既述のようにして適当な宿
主細胞からトランスフェクションされた細胞を選別し
た。 産生細胞セルラインを樹立するために用いたプロトコ
ールは、主として上記の染色法によっている。トランス
フェクション後の２日間、細胞を選択培地中で継代培養
した。選択に必要とされる特定の物質の適切な量につい
て培地を滴定した。細胞をトランスフェクションして産
生細胞セルラインを樹立すると同時に、それぞれの細胞
種の皿を一時的な発現について検定した。 後記実施例を簡略化するため、頻繁に出てくる方法お
よび／または語句のいくつかを以下に説明する。 「プラスミド」は、小文字ｐを前にし、そして／また
は大文字および／または数字をこれに続けて表す。本発
明で用いる出発プラスミドは、市販品あるいは制限され
ていない供給源から一般的に入手可能であるか、または
公表されている方法に従って利用可能なプラスミドから
構築することができる。さらに、本明細書中に記載した
プラスミドの等価物が当分野で知られているが、これら
は当業者には明白であろう。 DNAの「消化」とは、DNA中のある配列（制限部位）に
だけ作用する制限酵素によってDNAを触媒的に切断する
ことを指す。本発明で用いる種々の制限酵素は市販品か
ら入手可能であり、その反応条件、補助因子およびその
他必要なものは、当分野で知られているものを用いた。
分析用には、通常、プラスミドまたはDNAフラグメント
１μｇを、緩衝溶液約20μ中、酵素約２単位とともに
用いる。プラスミド構築用のDNAフラグメントを単離す
るためには、通常、DNA5〜10μｇを、より大きな容量
中、酵素20〜40単位で消化する。特定の制限酵素用の適
切な緩衝液および基質量は製造元によって指定されてい
る。通常、インキュベート時間は37℃で約１時間を用い
たが、これは供給元の指示に従って変えてもよい。消化
の後、反応物を直接ゲルにかけ、所望のフラグメントを
単離する。 「脱ホスホリル化」とは、細菌性アルカリホスファタ
ーゼ（BAP）で処理することによって末端部の５′リン
酸を除去することを指す。この操作によって、制限切断
されたDNAフラグメントの末端２つが「環化」、すなわ
ち制限部位における別のDNAフラグメントの挿入を妨げ
る閉じた環を生成すること、が防止される。脱ホスホリ
ル化のための方法および試薬は通常のものである「マニ
アティス等（Maniatis,T.et al.,Molecular Cloning,13
3−134（1982））］。BAPを用いる反応を50mMトリス
中、68℃で行って、酵素調製物中に存在するであろうす
べてのエキソヌクレアーゼの活性を抑制する。反応は１
時間行う。反応後にDNAフラグメントをゲル精製する。 「オリゴヌクレオチド」とは、既知の方法で化学的に
合成し、次いでポリアクリルアミドゲルで精製した、短
い１本鎖または２本鎖のポリデオキシヌクレオチドを指
す。 「ライゲート」とは、２つの２本鎖核酸フラグメント
の間でホスホジエステル結合が生成する過程をいう（マ
ニアティス等、上記、146頁）。他に記載がなければ、
既知の緩衝液および条件を用い、ほぼ等モル量のライゲ
ートしようとするDNAフラグメント0.5μｇあたりT4 DNA
リガーゼ10単位を用いてライゲートを行う。 「充填」または「平滑化」とは、制限酵素で切断され
た核酸の接着性末端にある１本鎖を２本鎖に変換する過
程をいう。これによって接着性末端が除去され、平滑末
端が生成する。この過程は、１つだけあるいはいくつか
の他の制限酵素によって創製された末端と接着性である
制限切断末端を、平滑に切断するいずれかの制限エンド
ヌクレアーゼによる末端、あるいはその他の充填された
接着性末端と適合しうる末端に変換するための万能の手
段である。通常、標的DNA2〜15μｇを、10mM MgCl2、1m
Mジチオトレイトール、50mM NaCl、10mMトリス（pH7.
5）緩衝液中、DNAポリメラーゼＩのクレノウフラグメン
ト８単位および４種のデオキシヌクレオシド三リン酸そ
れぞれ250μＭの存在下、約37℃でインキュベートする
ことによって平滑化を行う。通常、30分後のフェノール
およびクロロホルム抽出およびエタノール沈澱によって
インキュベートを停止させる。 「ノーザン」ブロットとは、既知の、ラベルしたオリ
ゴヌクレオチドまたはDNAフラグメントとハイブリダイ
ズさせることによって細胞mRNAの存在を確認する方法を
いう。本明細書中では、他の記載がなければ、ノーザン
分析は、マニアティス等（上記、202頁）の記載のよう
にして、変性剤（ホルムアルデヒド７％）の存在下、１
％アガロースでmRNAを電気泳動分離し、ニトロセルロー
スに移し、ラベルしたフラグメントとハイブリダイズさ
せることを意味する。 以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明する
が、これらは本発明の最良の態様を例示するものであっ
て本発明を限定しようとするものではない。 実施例１ 因子VIIIの発現ベクター 1.発現ベクターの構築 ヒト因子VIIIをコードしているcDNAを、トランスフェ
クションされた哺乳動物細胞において因子VIIIタンパク
質を発現するであろうプラスミドの構築に用いた［ウッ
ド等（Wood,W.et al.,Nature（Lond.），312,330−337
（1984））］。これらの形質転換された哺乳動物細胞は
約0.14mU/mlの因子VIIIを分泌した。本方法によって、
かなり大きい収量での因子VIIIの連続製造が得られる。 ａ）pF8CIS サイトメガロウィルスのエンハンサー［ボシャート等
（Boshart,M.et al.,Cell,41,520（1985））］およびプ
ロモーター［トムセン等（Thomsen,D.R.et al.,PNAS,8
1,659−663（1984））］、サイトメガロウィルスのスプ
ライス供与部位およびイントロンの一部［スターンベル
グ等（Sternberg,R.M.et al.,T.of Virol.,49,190−199
（1984））］、Ig可変領域イントロンおよびスプライス
受容部位、因子VIIIをコードしているcDNAおよびSV40ポ
リアデニル化部位を含有するベクターpF8CISを構築し
た。 第１図は、因子VIIIの製造セルラインを樹立するため
に用いる因子VIII発現ベクターを構築するための工程を
示すものである。以下、構築の３つの部分を詳細に記述
する。 １）最終ベクターの複製起源およびアンピシリン耐性マ
ーカーを、出発プラスミドpUC13pML、すなわちプラスミ
ドpMLの変異体から得た［ラスキーおよびボッチェン（L
usky,M.and Botchen,M.,Nature,293,79（1981））］。p
UC13［ベイラおよびメシング（Veira,J.and Messing,
J.,Gene,19,259（1982））］のポリリンカーをpMLのEco
R IおよびHind III部位に移すことによってpUC13pMLを
構築した。第２の出発プラスミドpUC8CMVは、CMVエンハ
ンサー、プロモーターおよびスプライス供与配列の供給
源である。第17図に示されている、CMVエンハンサー、
プロモーターおよびスプライス供与配列のためのヌクレ
オチド１〜732を、pUC8の平滑にしたPst IおよびSph I
部位に挿入することによってpUC8CMVを構築した（ベイ
ラおよびメシング、上記）。合成BamH I−Hind IIIリン
カー［ニュー・イングランド・バイオラブズ（New Engl
and Biolabs）からの市販品を利用できる］を接着性Bam
H I末端にライゲートしてHind III部位を創製した。こ
のライゲートの後、Hind III−Hinc II消化を行った。
この消化によって、CMVエンハンサー、プロモーターお
よびスプライス供与部位を含有する約800bpのフラグメ
ントが得られた。ゲル単離した後、この800bpのフラグ
メントをpUC13pMLの2900bp片にライゲートした。この中
間体プラスミドをSal IおよびHind IIIで消化すること
によってpF8CISの構築に必要なフラグメントを得た。こ
の3123bp片は、アンピシリン耐性マーカー、pUC13pMLか
らの複製起源ならびにエンハンサー、プロモーターおよ
びスプライス供与部位を含むCMVのコントロール配列を
含有していた。 ２）第１図の中央部に示されているような合成オリゴマ
ーを用いて、Ig可変領域イントロンおよびスプライス受
容配列を構築した。IgGイントロンおよびスプライス受
容部位用の以下の配列［ボスウェル等（Bothwell et a
l.,1981）］： を有する99merおよび30merを化学的に合成した。 DNAポリメラーゼＩ（クレノウフラグメント）によっ
てこの合成片を充填し、２本鎖のフラグメントを創製し
た［ワーテルおよびレツニコフ（Wartell,R.M.and W.S.
Reznikoff,Gene,９,307（1980））］。次いで、これをP
st IおよびHind IIIで２重消化した。この合成リンカー
をpUC13［ベイラおよびメシング（Veira,J.and Messin
g,J.,Gene,19,259（1982））］のPst IおよびHind III
部位にクローンした。合成オリゴヌクレオチドを含有し
ているクローン（pUCIg.10と命名した）をPst Iで消化
した。Pst I−Cla Iリンカーを用いて、このフラグメン
トにCla I部位を付加した。Hind IIIで消化した後、Ig
可変領域スプライス受容部およびIgイントロンの一部を
含有している118bp片をゲル単離した。 ３）構築工程の第３部で、肝炎表面抗原３′末端をSV40
初期領域の転写終止部位およびポリアデニル化部位に置
き換えた。SV40配列を含有しているベクターpUC.SV40
を、pUC8のBamH I部位［ビエラおよびメシング（上
記）］に挿入した。次いで、pUC.SV40をEcoR IおよびHp
a Iで消化した。この消化物から、SV40のポリアデニル
化部位だけを含有している143bpフラグメントをゲル単
離した。pSVE.8c1Dを消化して２つの付加的なフラグメ
ントをゲル単離した（欧州特許出願公開No.160,457）。
EcoR IおよびCla I消化によって生成した4.8kbフラグメ
ントは、SV40−DHFR転写ユニット、pMLの複製起源およ
びアンピシリン耐性マーカーを含有している。Cla Iお
よびHpa Iで消化した後に得られる7.5kbフラグメントは
因子VIIIのcDNAを含有している。３成分ライゲートによ
りpSVE.8c24Dが得られる。この中間体プラスミドをCla
IおよびSal Iで消化して、SV40ポリアデニル化部位およ
び転写終止部位、これに続くSV40DHFR転写ユニットとと
もに、因子VIIIのcDNAを含有している9611bpのフラグメ
ントを得た。 pF8CISを得るための最終的な３成分ライゲートには次
の成分を用いた:a）複製起源、アンピシリン耐性マーカ
ー、ならびにCMVエンハンサー、プロモーターおよびス
プライス供与部を含有している3123bpのSal I−Hind II
Iフラグメント;b）Igイントロンおよびスプライス受容
部を含有している118bpのHind III−Cla Iフラグメン
ト；およびｃ）因子VIIIのcDNA、SV40のポリアデニル化
部位およびSV40のDHFR転写ユニットを含有している9611
bpのCla I−Sal Iフラグメント。発現ベクターpF8CISの
配列の一部を第17図に示す。 ｂ）pF8CSSS サイトメガロウィルスのエンハンサーおよびプロモー
ター、加工した安定化配列、因子VIIIをコードしている
cDNA、およびSV40のポリアデニル化部位を含有している
ベクターpF8CSSSを構築した。供与および受容配列を含
む完全なイントロン領域を削除し、加工した安定化配列
で置き換えた。この安定化配列は、スプライシング後の
完熟mRNAの配列を有する合成２本鎖オリゴマーである。
この安定化配列をpF8CISの１つしかないSac II−Cla I
部位間に挿入した。この合成オリゴマーの配列を以下に
示す： この合成オリゴマーは、供与および受容コンセンサス
・スプライス配列の適切なヌクレオチドを含有してい
る。スプライス供与配列のスプライス受容配列に対する
対置を下線で示す。このベクターは、イントロン部分の
削除および加工した安定化配列による置換を除くと、上
記pF8CISベクターに類似している。この構築により、現
に転写されたmRNAからの非コード化領域の実際のスプラ
イシングが省かれる。この加工された安定化配列を含有
している発現ベクターpF8CSSSの配列の一部を第19図に
示す。 ｃ）pF8SCIS SV40のエンハンサーおよびプロモーター、サイトメガ
ロウィルスのスプライス供与部位およびイントロンの一
部、Igイントロンおよびスプライス受容部位、因子VIII
をコードしているcDNA、およびSV40ポリアデニル化およ
び転写終止部位を含有するベクターpF8SCISを構築し
た。 第２図にpF8SCISの構築を示す。 このベクターは３成分のライゲートを用いて構築し
た。このライゲートに用いた３種のDNAフラグメントそ
れぞれの調製を以下に述べる。 第１のフラグメントには、プラスミドpMLから得られ
るアンピシリン耐性マーカーの半分およびSV40初期領域
プロモーターおよびエンハンサーを含有させた。３種の
フラグメントの第１のものの出発プラスミドはpAML3P.8
C1である（欧州特許出願公開No.160,457）。このプラス
ミドをSac Iで切断した。全酵素DNAポリメラーゼＩを用
いて、このSac Iで創製された出っ張り部分を平滑にし
た。この反応の後、プラスミドをPvu Iで切断した。所
望の434bpフラグメントをアクリルアミドで単離した。 本構築に用いる第２および第３のフラグメントは、上
記のようにしてプラスミドpF8CISから単離した。 第２のフラグメントは、CMV中間体の初期遺伝子から
のスプライス供与部位およびイントロンの一部を含有さ
せた（イントロンおよびスプライス受容部位は上記のよ
うに合成して調製した）。pF8CISをSac IIで切断し、得
られた３′側の出っ張りをDNAポリメラーゼＩを用いて
平滑にし、次いでCla Iで切断した。pF8CIS中のCla I部
位の周辺配列は、このプラスミドをメチル化陽性株中で
増殖させたときには切断を妨げるので、pF8CISをdam-株
GM48から調製した［マリヌスおよびマリス（Marinus,M.
G.and Maris,N.R.,Bacteriol.,114,1143−1150（197
3））、およびゲイアーおよびマドリッド（Geier,G.E.a
nd Madrid,P.,J.Biol.Chem.,254,1408−1413（197
9））］。このベクター中にSac IIおよびCla Iの両部位
は１つしかないので、231bpのフラグメントはアガロー
スゲルから容易に単離される。 第３のフラグメントは、因子VIIIのcDNA、SV40の初期
領域ポリアデニル化部位、SV40−DHFR転写ユニット、pM
Lの複製起源およびアンピシリン遺伝子の半分を含有し
ている。pF8CIS（dam-）をCla IおよびPvu Iで消化する
ことによって11308bpフラグメントを調製した。 pF8SCISを創製する３成分ライゲートにより、Sac Iお
よびSac II部位が破壊され、Cla I部位が保持され、Pvu
I部位にampr遺伝子が再構築される。この発現ベクター
pF8SCISのヌクレオチド配列の一部を第18図に示す。 実施例２ 発現の分析 1.一時的な発現 トランスフェクションされた細胞の免疫ペルオキシダ
ーゼ染色に基づいて因子VIIIの発現を検定した［ゴーマ
ン等（Gorman et al.,Cell,42,519−526（1985））］。
この検定を用いて因子VIIIの発現ベクターを試験した。
因子VIIIに特異的な12のモノクローナル抗体をこの検定
に用いるためにスクリーニングした。BHK31A3B細胞（欧
州特許出願公開No.160,457）を染色し、親のBHK細胞セ
ルラインと比較して、因子VIIIを産生する細胞をスクリ
ーニングした。モノクローナル抗体BH6は、最小のバッ
クグラウンドを有する最強のシグナルを与えることがわ
かった。トランスフェクションを行い、因子VIIIの一時
的な発現を評価した。CaPO4法を用いて細胞（Cos、29
3、CHO、BHK、TM4）をトランスフェクションした。因子
VIIIのベクター沈澱物を10μg/ml用いた。この沈澱物を
３〜４時間細胞に付与し、次いで平均１分間、細胞にグ
リセリンショックを与えた。トランスフェクションの36
時間後に細胞をアセトン−メタノール（50:50）で固定
し、リン酸緩衝食塩水（PBS）で洗浄した。10％ウシ胎
児血清を含有するPBSで1:3000に希釈した精製BH6抗体ま
たは希釈していないBH6上清のどちらかを用いて細胞を
染色した。この第１の抗体を２時間細胞に付与した。こ
の期間中、プレートを穏やかな振盪器上に置いた。細胞
を10分間で５回洗浄した。第２の抗体であるウサギ抗−
マウスIgG（ダコパッツ）をPBS＋ウシ胎児血清中、1:15
0に希釈した。２時間インキュベートした後、一連の洗
浄を行った。ペルオキシダーゼ試薬を現像するための基
質としてオルソ−ジアンシジン［シグマ（Sigma）］を
用いた。オルソ−ジアンシジンのエタノール飽和溶液
を、過酸化水素を1:10,000希釈したPBSで1:100に希釈し
た。この基質を、室温で２時間または４℃で一晩、細胞
に付与した。 この方法は、因子VIIIを発現させる因子VIIIベクター
のスクリーニング法を与えた。この方法によって一時的
な因子VIIIの発現が測定される。トランスフェクション
の36時間後の染色によって、ベクターが転写され、mRNA
が翻訳されたかどうかの指標が得られる。 pF8CISは、少なくとも５つの異種セルライン（COS、2
93、CHO、TM4およびBHK）において因子VIIIを一時的に
発現させた。CHO細胞でのベクターpF8CISの一時的な発
現を第3A図に示す。 pF8SCISは、pF8CISと同じ効率で因子VIIIを一時的に
発現させることがわかった。CHO細胞でのベクターpF8SC
ISの一時的な発現を第3B図に示すCMVエンハンサーおよ
びプロモーターは類似のSV40エンハンサーおよびプロモ
ーターで完全に置き換えることができるので、因子VIII
の産生は特異的な転写開始シグナルに依存するのではな
く、むしろベクター中の安定化配列部位などのコントロ
ール領域の他の部分に依存している。 細胞をトランスフェクションして産生細胞セルライン
が樹立されたときに、それぞれの細胞種の皿を一時的な
発現について検定した。因子VIIIの一時的な発現のスク
リーニング結果から２種類の細胞群、すなわちトランス
フェクションの36時間後、因子VIIIについて陽性に染色
された細胞種の群（カテゴリー１）、および検出可能な
因子VIIIの一時的発現が認められなかった細胞種の群
（カテゴリー２）、が得られた。それぞれのカテゴリー
を構成している宿主細胞を以下に示す： カテゴリー１ カテゴリー２ CHO MDCK 293 BRL BHK Hela TM4 Vero HTC W138 COS CV1 HepG2 TR1 上に述べたように、Ig可変領域イントロンおよび供与
および受容部位を削除すると（他のコントロール領域を
維持しながら）、因子VIIIの一時的な発現がなくなる。
このデータから、少なくとも１つのスプライス供与−イ
ントロン−受容配列が発現に必要であると思われる。 さらに別の実験は、安定化配列の位置が重要であるこ
とを示している。たとえば、因子VIIIをコードしている
cDNAの３′にイントロンを配置しても因子VIIIは発現さ
れなかった。また、天然の因子VIIIのスプライス部位、
すなわちコード化領域内のスプライス部位を含んで構築
されたベクターもうまく行かないことがわかった。受容
部および合成Ig可変領域イントロンおよびCMV配列を含
有しているキメライントロンおよびCMVスプライス供与
配列を含有しているスプライス供与−受容配列は、因子
VIIIの連続産生を与えるセルラインの樹立に導く安定化
配列の例である。 2.連続産生 安定化配列を含有し、多種多様の細胞中で一時的に機
能することが示されたプラスミドを、多数のセルライン
中にトランスフェクションすることによって産生細胞セ
ルラインを樹立した。これらのトランスフェクション用
に、全量10μgDNA/mlの沈澱物を用いた。CHO DHFR細胞
のトランスフェクションには、４μｇの因子VIIIプラス
ミドを６μｇのサケ精子DNA（これは担体として働く）
に加えた［ウィグラー等（Wigler,M.et al.,）、上
記］。DHFR遺伝子の発現の直接選択がこれらの細胞にお
いて可能であった。他の細胞種のすべては、ネオマイシ
ン遺伝子を発現するプラスミドとの同時トランスフェク
ションを必要とした［ダビエスおよびジェニング（Davi
es,J.and Jenning,A.,Am.J.Trop.Med.Hyg.,29（５）,10
89−92（1980））］。pSVENeoBa16（欧州特許出願公開N
o.160,457）またはpRSVneo［ゴーマンの等（Gorman,et
al.,Science,221,551−553（1983））］のどちらかを用
いた。これらのトランスフェクション用に、因子VIIIプ
ラスミド４μｇ、ネオマイシン含有プラスミド１μｇお
よびサケ精子担体５μｇを用いた。上に記したように、
BRL以外は、改良型CaPO4法を用いてすべての細胞をトラ
ンスフェクションした。トランスフェクションした細胞
には、BKH、COH−DHFR、CV1、Vero、WI38、293、TM4、H
ela、MDCK、HTC、BRL、TR1およびHepG2が含まれる。 産生セルラインを樹立するために用いたプロトコール
は、主として上記の染色法によっていた。トランスフェ
クションに続く２日間、G418含有培地、またはCHO DHFR
細胞についてはグリシン、ヒポキサンチンおよびチミジ
ンを欠く選択培地で細胞を継代培養した。G418のレベル
は、選択に必要とされる適切な量について滴定を行っ
た。 選択開始から３〜４週間後に、因子VIIIの安定な発現
について細胞をスクリーニングした。クローンの皿を染
色して因子VIIIを発現するクローンの割合（％）を測定
した。この測定の後、それぞれの細胞種の12クローンを
染色用に採取した。次いで、安定な発現を示し、この時
点で陽性と評価されたクローンについては、コーテスト
（Coatest）検定による定量検定をも行った。 一時的な発現を示さなかった細胞はこの時点で安定な
発現を示さなかった（たとえば、Vero、HeLa）。因子VI
IIの安定な発現は、２つのカテゴリーの細胞群で観察さ
れた:1）因子VIIIを一時的に発現し、安定な発現のこの
第１回目で陰性と評価された細胞群（たとえば、CHOお
よびBHK細胞は染色するのに十分な高レベルでは安定な
発現を示さなかった）;2）一時的な段階および増幅され
ていない段階の両方で陽性に染色されたセルライン（た
とえば、後に潜在的な産生細胞セルラインと称されるTM
4、HTCおよび293）。 ＋ − TM4 CHO HTC BHK 293 Vero Hela CV1 WI38 BRL CHO細胞での低レベルの因子VIIIをコーテスト法で検
定した。コーテスト検定の結果を以下に示す： 増幅されていない細胞での因子VIIIレベル 宿主細胞 mU/104細胞／日 TM4 1.8 HTC 0.5 293 2.5 CHO ＜0.15 BHK ＜0.15 上記検定の結果は、産生宿主細胞の種類内で因子VIII
の産生レベルが変わることを示している。トランスフェ
クションした細胞を免疫ペルオキシダーゼ染色し（36〜
48時間での一時的な発現について）、次いでその３〜４
週間後に増幅されていない細胞を染色したときの結果
は、特定の細胞種を因子VIIIの産生細胞として用いるこ
とについて、予想を与えるものであった。細胞が陽性に
染色されず、一時的および増幅されていない段階で因子
VIIIが発現されないことを示したときには、この宿主細
胞は因子VIIIの産生セルラインとして働きそうもない。
この結論は、数回の増幅を行った後の因子VIIIの発現に
ついて、CHO、BHK、HTC、TM4および293細胞を染色した
ときの結果によって支持される。 １回目の増幅（MTX:100nM）の後、もう一度、上記の
形質転換細胞種からクローンを単離し、因子VIIIの産生
について分析した。この第１回目の増幅後の因子VIIIの
発現の結果は次のようである： 増幅を１回行った後の因子VIIIレベル 宿主細胞 mU/104細胞／日 TM4 3.0 HTC 2.3 CHO 0.1mU/ml BHK 0.1mU/ml クローンおよび母集団の両者を、さらに増幅を行うた
めに維持した。CHOおよびBHKの両細胞においては因子VI
IIが一時的にモニターされるが、MTX増幅を１回行った
後にはわずかのクローンしか同定されず、さらに継続す
ると低レベルの因子VIIIは消失した。これらのクローン
について不均質性が見られた（第４図）。因子VIIIを産
生するCHO細胞は、倍加時間が45〜52時間と大きく増加
し、倍加時間が28時間である母集団中の非発現細胞が繁
殖した。注意深く検討すると、因子VIIIを連続的に発現
するCHOクローンを樹立するのが困難であることがわか
った。以下に示したデータは、増幅されていない段階お
よび増幅を１回行った後の両者における、DHFR陽性CHO
クローン中の、因子VIIIを発現するクローンの頻度を示
すものである。因子VIIIに対して陽性に染色されたクロ
ーンの数を、トランスフェクションに次いで得られる安
定なクローンの数の割合（％）で表す。 細胞種 ベクター 未増幅 増幅１回 TM4 pF8CIS 18％ 77 ％ pF8SCIS 15％ 90 ％ CHO pF8CIS 0 0.1％ pF8SCIS 0 0.1％ ２回目または３回目の増幅（通常、約１μＭのメトト
レキセイト）を行ったときにも、CHO細胞において因子V
IIIが検出可能であった。この高レベルの増幅時でも、
因子VIIIの活性は低く、63mU/mlであった。連続的な増
幅によってCHOセルラインにおける産生の増加が導かれ
なかった。別個に得られた３つのCHOセルラインを形態
学的に分析すると、因子VIIIについて染色される細胞は
大きくなり、平たくなることがわかる（第５図）。10μ
Ｍまで増幅した形質転換CHO細胞は、200mU/ml産生する
にすぎない。これらの結果は、因子VIIIの産生細胞シス
テムの樹立においては、宿主細胞の選択が重要な工程と
なることを示している。ここでは、TM4、THCおよび293
を用いて、因子VIIIを連続的に産生する永久的な細胞セ
ルラインを樹立し、こうして産生細胞セルラインとみな
した。 実施例３ 因子VIIIの凝結活性 TM4細胞からの活性な因子VIIIの発現および分泌を、
凝結分析によって測定した。pF8CISでトランスフェクシ
ョンしたTM4細胞によって48時間調整を行った血清不含
培地を、因子VIIIについて検定した。第１表に示したよ
うに、TM4培養培地は血友病患者の血漿の凝固時間を短
縮した。この凝結活性の大部分は、TM4培地がヒト因子V
IIIに対するポリクローナル抗体とともに予めインキュ
ベートされたときに中和された。 第１表はTM4細胞からの活性因子VIIIの分泌を示すも
のである。ヒト因子VIIIのポリクローナル抗体10μｇを
添加して、または添加せずに、37℃で30分間、TM4培地
を予めインキュベートした。次いで0.01％BSAを含有す
る0.05Mトリス（pH7.5）でこの培地を1:1に希釈し、凝
結分析で検定した。精製した血漿由来の因子VIII（pd V
III）を同様に処理した。 実施例４ 因子VIII変異体の発現ベクター さらに効率的なタンパク質を得るためのアプローチの
１つは、タンパク質を加工することである。すなわち、
DNAレベルで遺伝子内に変異を導入することによって、
細胞培養物中で変異体を産生させることができ、タンパ
ク質機能の特異的な修飾を行うことができる。３種の変
異体を設計した。天然因子VIIIの１本鎖300,000ダルト
ンのタンパク質を90,000および80,000ダルトンのサブユ
ニットに切断し、次いで50,000、43,000および73,000ダ
ルトンの活性サブユニットに切断する。アミノ酸742か
ら1648の間のＢ領域は定義された機能を有していない
［ベーハー等（Vehar,G.A.et al.,Nature,312,330−337
（1984））。］完全な長さの組換え因子VIIIタンパク質
の発現について記載したのと同じ細胞システムを用いて
突然変異体を発現させた。 pF8CIS9080 因子VIIIの融合タンパク質を発現させるために用いら
れる真核生物性発現ベクターには、ヒトサイトメガロウ
ィルス（CMV）の即時型遺伝子のエンハンサー（ボシャ
ート等、上記）、およびプロモーター（トムセン等、上
記）；この遺伝子の転写開始部位の３′側に配置された
スプライス供与配列（ボシャート等；上記、ステンベル
グ等、上記）；およびマウスの免疫グロブリン可変領域
からの合成スプライス受容部位（ボスウェル等、上記）
を含有させた。新しいコード化領域は、その３′末端
が、SV40初期ポリアデニル化配列および転写終止部位で
区切られている（フィアーズ等、上記）。このベクター
は増幅可能なマーカー、すなわちSV40−DHFR転写ユニッ
トを含んでいる。 因子VIIIの融合タンパク質90kd＋142aa＋80kdをコー
ドしている発現ベクターpF8CIS9080の構築を第６図に示
す。プラスミドpSVE.8cID（欧州特許出願公開No.160,45
7）から始め、Sst IIで切断し、接着性末端をS1で平滑
にし、Hpa Iでさらに切断し、２つの平滑末端を再ライ
ゲートすることによって、３′非翻訳化領域中に短い欠
失を作成し、pSVE.8c9を得た。このプラスミドをCla I
およびSal Iで切断し、10031bpフラグメントをSal I、C
la I中にクローンした。6761ppのプロモーターはpAML3
P.D22（欧州特許出願公開No.160,457）のフラグメント
を含有している。因子VIII遺伝子内の充填Thr111 Iおよ
びBamH I（アミノ酸1563）をライゲートすることによっ
て、因子VIII遺伝子中の融合を作成した。第６図には、
pAML3P.8c1（欧州特許出願公開No.160,457）の2516bpフ
ラグメントとpAML3P.8c9の11991bpフラグメントをライ
ゲートすることによる、融合領域含有のpAML3P.8L19の
構築が示されている。この融合をDNA配列で確認した。
融合領域を含有している4722bpのCla I−Xba Iフラグメ
ントを、CMVプロモーター−エンハンサーを含有してい
るpF8CIS発現ベクターの5828bpのCla I−Xba Iフラグメ
ントにクローンした。メチル化がCla I部位での切断を
妨げないE.coliのdam-株からCMVフラグメントを得た。 実施例５ 発現の結果 実施例２に記載した方法を、ヌクレオチド796から156
2まで欠失した因子VIII変異体、pF8CIS9080の発現に応
用した。90kd＋142aa＋80kdの融合タンパク質は、完全
な長さのタンパク質より高レベルで発現された。しか
し、融合タンパク質の発現能力については細胞種の間で
かなりの変動が見られる。 次のデータは、適切な宿主細胞を選択することによっ
て、所望の融合タンパク質の連続製造（商業的に使用し
うる量で）が得られるであろうことを示している。pF8C
IS9080でトランスフェクションしたTM4細胞は、融合タ
ンパク質の一時的な発現および安定な発現を示した。pF
8CIS9080でトランスフェクションしたTM4細胞は、完全
な長さの因子VIIIと比べると、融合タンパク質のレベル
で５倍の増加を示した。100nMのメトトレキセイトでプ
ールされた融合因子VIIIのクローンは、12mU/104細胞／
日で産生した。HTC細胞は、完全な長さの因子VIIIと比
べて、融合因子VIIIの発現において同等の増強を示し
た。 293細胞での融合タンパク質因子VIIIの発現は、完全
な長さの因子VIIIの発現と比べると相当に高い。融合タ
ンパク質ベクターpF8CIS9080で形質転換された293細胞
においては、通常、増幅されていない母集団レベル85mU
/104細胞／日が常法によって達成される。完全な長さの
因子VIIIの発現レベルは、融合因子VIIIのものより低
く、2.5mU/104細胞／日である。コントロールシグナル
はpF8CISおよびpF8CIS9080で同一であるので、発現レベ
ルでの差異は、完全な長さのメッセージおよび／または
タンパク質を産生する細胞の能力に基づいているにちが
いない。 融合タンパク質は完全な長さのもの（1000nM）より比
較的早い増幅時点（100nM）で検出されるが、第７図に
示したように、これらの細胞は融合タンパク質の発現に
よって負担がかけられる。100nMで90kd＋142aa＋80kdを
発現するCHO細胞は、0.5μU/104細胞／日を産生する。
連続的な増幅は、第８図で観察される混合母集団のゆえ
に困難であった。１μＭのMTXおよび５μＭのMTXで選択
されたクローンは、0.1μＭのMTXでのセルラインより高
いレベルの発現を示さなかった。まとめると、ある種の
宿主細胞は因子VIIIまたはその変異体の発現を特にうま
く行った（たとえば、TM4）。他の宿主細胞は中間の性
質であり、変異体は発現するが、完全な長さの因子VIII
の発現は低レベルであるか、または全く発現されなかっ
た（たとえば、293細胞）。宿主細胞の最後の群は、製
造用の十分な因子VIIIを産生しそうもなかった（たとえ
ば、TRI）。 実施例６ 融合タンパク質の精製および特徴づけ 完全な長さの組換え因子VIIIについて上記した方法を
用いて、90kd＋142aa＋80kd融合体を293培地から精製し
た［イートン等（Eaton,D.E.et al.,Biochemistry,25,5
05−512（1986））。］この精製融合体は4,000〜6,000
ユニット/mgの比活性を有し、これは血漿由来の因子VII
Iの比活性に匹敵する。SDS−PAGEにかけたとき、この融
合体はMrが115,000および80,000の２つの主なバンドに
分かれた。また、Mrが180,000のバンドも観察される
が、これは融合体の１本鎖型を示すのであうろう。この
Mrが180,000、150,000および80,000であるタンパク質は
すべて、ウェスタンブロックにおける因子VIIIポリクロ
ーナル抗体によって検出される（第11図）。 90kd＋142aa＋80kdの融合体の凝結活性は、トロンビ
ンによって10〜20倍に活性化された（第12図）。この活
性化は、Mrが50,000、43,000および73,000のサブユニッ
トの生成と関係していた（同上）。また、因子VIIIは血
漿中を循環してフォン・ビレブランズ因子（von Willeb
rands factor、vWF）と結合するので、90kd＋142aa＋80
kd融合体のvWFへの結合をも試験した。精製した90kd＋1
42aa＋80kd融合体をvWF−セファロースカラムに通す
と、カラムに定量的に結合した（第13図）。次いで、0.
25M CaCl2（因子VIII−vWFの複合体を解離することが知
られている）用いて、融合体をカラムから溶離した。 上のデータは、293細胞から発現され分泌された90kd
＋142aa＋80kd融合体が血漿由来の因子VIIIと機能的に
同等であることを示した。90kd＋142aa＋80kd融合体は
血友病患者の血漿の凝固時間を短縮し、その活性は因子
VIIIの抗体によって中和された。この融合体は、血漿由
来の因子VIIIと同様、トロンビンによって活性化され、
プロセッシングされた。また、90kd＋142aa＋80kd融合
体はセファロースに固定されたvWFにも結合し、因子VII
I−vWFの複合体を解離することが知られている条件下で
vWFから解離した。 実施例７ 融合タンパク質の凝結活性 pF8CIS9080でトランスフェクションした293細胞によ
って48時間調整した血清不含培地を、凝結分析により、
因子VIIIの凝結活性について検定した。培地を1/50に希
釈した後、検定を行い、120秒から58.9秒まで（5.5ユニ
ット/mlの因子VIIIの凝結活性に対応する）血友病患者
の血漿の凝固時間を短縮することがわかった。この活性
は、血漿由来の因子VIIIに対するポリクローナル抗体に
よって中和された（第２表）。 第２表は293培地における凝結活性を示すものであ
る。 血友病患者の血漿（50μ）を、プラテリン［platel
in;ゼネラル・シアグノスティックス（General Diagnos
tics）］50μとともに、37℃で８分間、インキュベー
トした。次いで、0.01％BSAを含有する0.05Mトリス（pH
7.4）緩衝液で1/50に希釈した培地50μを加え、30秒
間インキュベートした。25mMのCaCl2を50μ加え、凝
固時間を測定した。トランスフェクションされていない
親セルラインから得た培地は希釈しなかった。抗体中和
の実験は、室温で30分間、希釈されていない培地（100
μ）を因子VIIIのポリクローナル抗体10μｇで予めイ
ンキュベートすることによって行った。次いで、培地を
希釈し、検定した。 実施例８ 活性化されたタンパク質Ｃに耐性な因子VIII
変異体の発現ベクター 活性化されたタンパク質Ｃ（APC）、すなわち血漿タ
ンパク質は、限定されたタンパク質加水分解によってヒ
ト因子VIIIを不活性化することがわかっていた。この不
活性化切断が可能な部位の１つは、位置336のアルギニ
ンである。この位置336のアルギニンを他のアミノ酸、
たとえばリジンまたはグルタミン酸に変えることができ
る。２種類のベクター、pF8CIS336FおよびpF8CIS9080−
336Eを構築して、位置336が不活性化の部位であるかど
うかを調べた。インビトロでの突然変異誘発［ノリス等
（Norris,K.et al.,Nucleic Acids Research,11,5103−
5112（1983））］を用いて、位置336のアルギニンをグ
ルタミン酸に変えた（第９図）。突然変異誘発のため
に、pF8CISからの792bpのHind III−Kpn Iフラグメント
を、m13のHind III−Kpn I部位に挿入した。以下に示す
18bpのオリゴマーを用いてこのフラグメントを突然変異
させた： 鎖の延長に次いで、２本鎖の突然変異M13クローンをA
cc IおよびKpn Iで切断した。778bpのフラグメントをゲ
ル精製した。プラスミドpF8CISを、E.coliのdam-株、GM
48中で増殖した。第１図で示されるPst I−Cla Iリンカ
ー配列により、このプラスミドを上記のようなメチル化
陽性の細菌株中で増殖させるときには、pF8CISのCla I
部位は切断されないであろう。dam- pF8CIS DNAから２
種類のフラグメント、10kbのKpn I部分−Cla Iフラグメ
ントおよび1108bpのCla I−Acc Iフラグメントを単離し
た。３成分ライゲートは、天然の因子VIII配列を突然変
異配列に置換することを必要とした（第９図参照）。 pF89080−336Eの構築は、第10図に示したような別の
３成分ライゲートによって行った。pF8CIS9080から単離
した8564bpのBal II−Sac IIフラグメントおよび891bp
のSca II−Spe Iフラグメントにライゲートすることに
よって、336E変異アミノ酸を含有する1115bpのSpe I−B
gl IIフラグメントを移して、別の変異融合タンパク質
を創製した。 これらタンパク質変異体の両者とも293細胞中で発現
した。この突然変異を有する完全な長さの因子VIIIは2.
8mU/104細胞／日で発現し、一方、融合変異体は15mU/10
4細胞／日で発現した。 実施例９ 活性化されたタンパク質Ｃに耐性な因子VIII
の活性 pF8CIS−336Eでトランスフェクションされた293細胞
から得られた培地は、血友病患者の血漿の凝固時間を短
縮した。この活性は、因子VIIIのポリクローナル抗体に
よって中和された（第３表）。しかし、位置336にグル
タミン酸を含有する組換え因子VIIIは、活性化されたタ
ンパク質Ｃによって不活性化されなかった（第３表）。 第３表は、活性化されたタンパク質Ｃに対する完全な
長さの因子VIII/336Eの安定性を示すものである。完全
な長さの因子VIII/336Eを産生する、トランスフェクシ
ョンされた293細胞で48時間調整した血清不含培地（表
中、「293−336E」で表す）を27倍に濃縮した。この培
地100μに、ウサギ脳セファリン10μおよびAPC10.0
ngを加えた。対照群にはAPCを加えなかった。試料を37
℃で40分間インキュベートした。同様に、位置336にア
ルギニンを含有する精製した組変え因子VIII（rVIII）
を、0.05Mトリス（pH7.5）、150mM NaCl、2.5mM CaCl2
で〜１ユニット/mlに希釈し、ウサギ脳セファリンおよ
びAPCとともにインキュベートした。また、完全な長さ
の因子VIII/336E（26λ）を産生する、トランスフェク
ションされた293細胞からの培地を、37℃で40分間、因
子VIIIのポリクローナル抗体（IgG調製物１μ）で予
めインキュベートした。インキュベートの後、凝結分析
によって試料を検定した。 実施例10 プロリラキシンの発現ベクター 1.pCIHRX ベクターpCIHRXに、サイトメガロウィルスのエンハン
サーおよびプロモーター、サイトメガロウィルスのスプ
ライル供与部位、Ig可変領域スプライス受容部位、H2プ
レプロリラキシンをコードしているcDNA、ならびに肝炎
表面抗原のポリアデニル化および転写終止部位を含有さ
せた。第14図にプロリラキシンベクター構築の工程を示
す。Ig可変領域からの、前記と同じイントロンおよびス
プライス受容配列を保持させた。677bpのプレプロリラ
キシンcDNAを、これら５′プロセッシングシグナルに続
けた。この５′コントロールシグナルはpF8CISのものと
同じであるが、ポリアデニル化領域および終止配列シグ
ナルは、SV40の代わりに肝炎表面抗原遺伝子から得た。 始めに、中間体プラスミドpClaRXを構築した。プラス
ミドpSVERX［同時継続の米国特許出願U.S.S.N.06/907,1
97（1986年９月12日出願）を参照］をHind IIIで切断し
て、プレ−プロリラキシンcDNA、続いて肝炎Ｂ表面抗原
（HBsAg）３′ポリアデニル化部位を含有する1700bpの
フラグメントを単離した。Kpn I部位は、このベクター
においてDHFRcDNAの発現のために用いられる、SV40初期
プロモーターの始まりの５′側、かつHBsAgポリアデニ
ル化部位の３′側にある。 プレピロリラキシンDNAは、Hpa IIで完全消化し、続
いてHinf Iで部分消化することによって、ハドソン等
［Hudson,P.et al.,The EMBO Journal,３,2333−2339）
が開示したクローニングベクターから切り出すことがで
きる。配列５′−ATGCCTCGCCTGTTT−３′の１本鎖DNAプ
ライマー（ATGプライマー）を合成し、プレプロリラキ
シンのDNAセグメントと混合し、プレプロリラキシンセ
グメントの鎖を分けるために混合物を煮沸し、そして冷
却してATG−プライマーをプレプロリラキシンのアンチ
センスDNA鎖とアニーリングさせた。 次いで、DNAポリメラーゼＩのクレノウフラグメント
を用いて、ATG−プライマーを、プレプロリラキシンDNA
セグメントの末端近くまで３′方向に延長した。さら
に、クレノウフラグメントの３′→５′エキソヌクレア
ーゼ加水分解的な活性は、プレプロリラキシンのアンチ
センス鎖の３′末端を、ATG−プライマーの５′末端
「Ａ」の対の塩基であるヌクレオチドまで正確に分解
し、こうしてこの末端を平滑末端にした。この新しい２
本鎖プレプロリラキシンセグメントを、プレプロリラキ
シンセグメントの３′非翻訳化領域中のAva II部位のと
ころで消化し、このAva II末端をクレノウフラグメント
酵素で充填してこの末端を平滑末端にした。 次いで、このフラグメントを、EcoR Iで切断してその
末端をクレノウフラグメント酵素で充填しておいたプラ
スミドtrp207−１＊tetxap［グレイ等（Gray,G.L.et a
l.,Gene,39,247−254（1985））］中に平滑末端ライゲ
ートした。グレイ等（上記）が開示したこのプラスミド
は、Ava I−Pvu IIセグメントが削除されており、trpプ
ロモーターの５′側のEcoR I部位が除かれている。正し
い配向でプレプロリラキシンセグメントを含有している
プラスミドを選択した後、このプレプロリラキシンのtr
p207−１＊tetxapプラスミドをCla Iで消化し、その末
端をクレノウで充填した。この直線化したプラスミドを
Xba Iでさらに消化し、プレプロリラキシンのセグメン
トをゲル電気泳動で単離した。 真核生物性発現ベクターp342E［クロウリー等（Crowl
ey,C.W.et al.,Mol.Cell.Biol.,３,44−55（1983））］
をBamH Iで消化し、その末端をクレノウで充填し、この
ベクターをさらにXba Iで消化し、このベクターのフラ
グメントをゲル電気泳動で単離した。パッツァー等［Pa
tzer,E.J.et al,,J.Virol.,51,346−323（1984）］の開
示のようにして、DHFRをコードしているDNAを付加する
ことによってp342Eプラスミドを修飾した。クロウリー
等（上記）が開示したプラスミドは、合成ポリリンカー
［ニュー・イングランド・バイオラブズ（New England
Biolabs）からの市販品を利用することができる］を用
いて、SV40初期プロモーターに続けて付加したXba I部
位を有している。このプラスミドをpSVCV202と命名し
た。次いで、このベクターフラグメントをXba I−Cla I
プレプロリラキシンフラグメントにライゲートし、真核
生物性発現プラスミドpSVプレプロリラキシン157（「pS
VERX」とも称される）を得た。 プラスミドpSVERXをHind III切断して得たフラグメン
トを、Hind III部位で直線化したpML中に挿入した。細
菌性アルカリホスファターゼ（BAP）で処理して再閉環
を最小にした。アンピシリン耐性コロニーをスクリーニ
ングして、プレ−プロリラキシン遺伝子の５′末端がpM
LのCla I部位の次に来るように挿入されたクローンを単
離した。 中間体プラスミドpClARXをCla IおよびKpn Iで切断し
て、プレ−プロリラキシン遺伝子、続いて肝炎表面抗原
３′ポリアデニル化配列を含有している1360bpのフラグ
メントを単離した。このフラグメントを、pF8CIS dam-
をCla IおよびKpn Iで切断することによって創製した51
43bpのフラグメントにライゲートした。 2.pCISRX ポリアデニル化配列の選択をメッセンジャーRNAの
５′プロセッシングに影響することが知られているので
［ウィルソンおよびネビンズ（Wilson ＆ Nevins）、上
記］、pCIHRX中の３′肝炎ポリアデニル化配列をpSV40
ポリアデニル化配列に置き換えた。この構築物をpCISRX
と命名した。この構築のための２種類の出発ベクターは
pCIHRXおよびpF8CISである。後者のベクターはpCIHRXと
同じ５′コントロールを有しているが、因子VIIIのcDNA
およびSV40のポリアデニル化部位を含有している。Sac
IIを用いてこのcDNAの３′を切断した。得られた３′側
の出っ張り部分をT4ポリメラーゼで平滑にした。次い
で、pCIHRXをBamH Iで切断した。この部位は、キメライ
ントロンとリラキシン遺伝子の５′末端を分けている。
861bpのフラグメントをBamH I処理物からゲル単離し
た。SV40のポリアデニル化部位、DHFR、転写ユニット、
細菌性の複製起源およびampr遺伝子、ならびにCMVのエ
ンハンサーおよびプロモーターおよびスプライス供与部
をpF8CISから単離した。これらの成分を２つのフラグメ
ント、すなわち2525bpのSal I−BamH Iフラグメントお
よび3113bpのHpa I−Sal Iフラグメントとして単離し
た。BamH I−Sac II（平滑）フラグメントと、Hpa I−S
al IフラグメントおよびSal I−BamH Iフラグメントと
の３成分ライゲートによってpCISRXを得た。 実施例11 プロリラキシンの発現 ２種類のリラキシン発現ベクターpCIHRXおよびpCISRX
の発現能力を、前記の免疫ペルオキシターゼ法で、数種
の抗−リラキシン抗体を用いて検定した。３種のウサギ
ポリクローナル抗体および３種のマウスモノクローナル
抗体を、pSVERXでトランスフェクションしたCOS細胞に
ついて試験した。モノクローナルRX−Ｉはバックグラウ
ンドのない強い染色を与えることがわかった。 本発明の２つのベクターpCIHRXおよびpCISRXをプロリ
ラキシンの発現について試験し、pSVERXと比較した。pC
IHRXおよびpCISRXベクターはポリアデニル化配列が異な
っている。pCIHRXには肝炎表面抗原のポリアデニル化配
列を含有させたが、pCISRXにはSV40初期領域のポリアデ
ニル化配列を含有させた。 293、TM4およびCHO細胞を、pRSVneo 1μｇ、サケ精子
担体５μｇならびにプラスミドpSVERX、pCIHRXおよびpC
ISRX4μｇを含有する全量10μｇのDNAでトランスフェク
ションした。前記のようにして細胞にグリセリンショッ
クを与えた。トランスフェクションの36時間後に、細胞
を固定し、1H6で染色してプロリラキシンを産生する形
質転換細胞を同定した。pCIHRXおよびpCISRXでトランス
フェクションした293およびTM4細胞において、陽性に染
色される細胞が観察された。CHO、293およびTM4細胞の
複製プレートを分割し、前記の染色プロトコールにかけ
てプロリラキシン産生細胞をスクリーニングした。 発現の結果を次表に示すが、プロリラキシンをコード
しているDNAの５′に安定化配列を含有するベクター
は、対照プラスミドpSVERXよりかなり高レベルでプロリ
ラキシンを産生することがわかる。安定な発現の場合、
プロリラキシンの培地検定は、細胞の全集団で行った。 プロリラキシンの一時的な発現 細胞種 プラスミド タンパク質量（ng/ml） CHO pSVERX 0.4 pCIHRX 0.9 pCISRX 3 TM4 pSVERX 0.4 pCIHRX 2 pCISRX 10 293 pSVERX 0.4 pCIHRX 3 pCISRX 12 プロリラキシンの安定な発現 細胞種 プラスミド タンパク質量（ng/ml） CHO pSVERX 0.6 pCIHRX 0.8 pCISRX 3.9 293 pSVERX 0.41 pCIHRX 3.0 pCISRX 22.0 実施例12 ｔ−PAの発現ベクター 1.pCIHt−PA サイトメガロウィルスのエンハンサーおよびプロモー
ター、サイトメガロウィルスのスプライス供与部位およ
びイントロン、Ig可変領域スプライス受容部位、ｔ−PA
をコードしているcDNA［ペニカ等（Pennica et al.,Nat
ure,301,214（1983））］、ならびに肝炎表面抗原ポリ
アデニル化および転写終止部位を含有するベクターpCIH
t−PAを構築した。 このｔ−PAベクター構築の工程を第16図に示す。 始めに、ｔ−PAのcDNAをpML中にクローンしてこの遺
伝子の５′末端にCla I部位を得た。これを行うため、p
SVpa−DHFR（これ以外に、英国特許2,119,804BではpETP
FRと呼ばれる）からの3238bpのHind IIIフラグメントを
pMLのHind III部位に挿入した。Cla I部位に並列してcD
NAの５′末端を有するクローンについてコロニーをスク
リーニングした。このpCLAt−PAと命名した中間プラス
ミドを第16図に示す。３′側にポリアデニル化領域が続
くｔ−PAのcDNAを、2870bpのCla I−Kpn Iフラグメント
として単離した。このフラグメントをpF8CISの5146bpフ
ラグメントにライゲートした。このCISベクターのCla I
−Kpn Iフラグメントは、５′コントロール領域、SV40
−DHFR転写ユニット、アンピシリン耐性遺伝子およびpM
L由来の起源領域を与えた。pCIHt−PAは、所望の異種遺
伝子をコードしているcDNAを除いて、前述したpCIHRXに
類似している。 CHOおよび293細胞をpSVpaDHFR、pCMVt−PAおよびpCIH
t−PAでトランスフェクションすることによってｔ−PA
の発現レベルを比較した。前２つのベクターは安定化配
列を含有していないので、本発明に従って構築された、
ｔ−PAをコードしているcDNAを含有するベクターpCIHt
−PAの対照として働く。培養した形質転換293細胞をそ
れぞれからの培地を検定し、次の結果を得た:pSVpaDHF
R、30ng/ml;pCMVt−PA、200ng/mlのｔ−PA;およびpCIHt
−PA、420ng/mlのｔ−PA。 2.pCISt−PA サイトメガロウィルスのエンハンサーおよびプロモー
ター、サイトメガロウィルスのスプライス供与部位およ
びイントロン、Ig可変領域スプライス受容部位、ｔ−PA
をコードしているcDNAならびにpSV40ポリアデニル化配
列を含有するベクターpCISt−PAを構築した。 この構築の出発ベクターはpCIHt−PAおよびpF8CISで
ある（第20図参照）。後者ベクターはpCIHt−PAと同じ
５′コントロールを有しているが、因子VIIIのcDNAおよ
びSV40ポリアデニル化部位を含有している。Sac IIを用
いてｔ−PA cDNAの３′を切断した。得られた３′側の
出っ張り部分をT4ポリメラーゼで平滑にした。次いで、
pCIHt−PAをCla Iで切断した。この部位は、キメライン
トロンとｔ−PA遺伝子の５′末端とを分けている。この
Cla I処理物から2870bpのフラグメントをゲル単離し
た。SV40ポリアデニル化部位、DHFR、転写コントロー
ル、細菌性の複製起源およびampr遺伝子、ならびにCMV
エンハンサーおよびプロモーターおよびスプライス供与
部をpF8CISから単離した。これらの成分を、2525bpのSa
l I−Cla Iフラグメントおよび3113bpのHpa I−Sal Iフ
ラグメントとして単離した。Sac II（平滑）−Cla Iフ
ラグメントと、Hpa I−Sal IフラグメントおよびSal I
−Cla I−フラグメントとの３成分ライゲートによってp
CISt−PAを得た。 293およびCHO細胞をpCIHt−PAおよびpCISt−PAでトラ
ンスフェクションすることによってｔ−PAの発現レベル
を比較した。培養した形質転換細胞それぞれからの培地
を検定し、次の結果を得た： 一時的なt−PA（ng/ml） CHO CIS 55 CIH 15 293 CIS 3000 CIH 1300
【図面の簡単な説明】
第１図は、因子VIII発現ベクターpF8CISの構築を示す工
程図であり、第２図は、因子VIII発現ベクターpF8SCIS
の構築を示す工程図であり、第３図は、pF8CIS（Ａ）お
よびpF8SCIS（Ｂ）でトランスフェクションした細胞を
免疫ペルオキシダーゼ染色したときの結果を示す写真の
模写図であり、第４図は、pF8CISでトランスフェクショ
ンし、増幅を１回行ったCHO細胞を免疫ペルオキシダー
ゼ染色したときの結果を示す写真の模写図であり、第５
図は、pF8CISでトランスフェクションし、増幅を３回行
ったCHO細胞を免疫ペルオキシダーゼ染色したときの結
果を示す写真の模写図であり、第６図は、因子VIII変異
体の発現ベクターpF8CIS9080の構築を示す工程図であ
り、第７図は、ベクターpF8CIS9080でトランスフェクシ
ョンした細胞を免疫ペルオキシダーゼ染色したときの結
果を示す写真の模写図であり、第８図は、pF8CISでトラ
ンスフェクションし、連続的な増幅を行ったCHO細胞を
免疫ペルオキシダーゼ染色したときの結果を示す写真の
模写図であり、第９図は、発現ベクターpF8CIS−336Eの
構築を示す工程図であり、第10図は、発現ベクターpF89
080−336Eの構築を示す工程図であり、第11図は、精製
した90kd＋142aa＋80kd融合体をSSD−PAGEで分け、クー
マシーブルー染色（Ａ）およびウェスタンブロット分析
（Ｂ）にかけたときの結果を示す写真の複写図であり、
第12図は、90kd＋142aa＋80kd融合体のトロンビン活性
化を示すグラフ、およびSDS−PAGEにかけたときの結果
を示す写真の複写図（挿入図）であり、第13図は、90kd
＋142aa＋80kd融合体のvWFへの結合を示すグラフであ
り、第14図は、プロリラキシン発現ベクターpCIHRXの構
築を示す工程図であり、第15図は、プロリラキシン発現
ベクターpCISRXの構築を示す工程図であり、第16図は、
ｔ−PA発現ベクターpCIHt−PAの構築を示す工程図であ
り、第17図は、発現ベクターpF8CISのDNA配列の一部を
示す配列図であり、第18図は、発現ベクターpF8SCISのD
NA配列の一部を示す配列図であり、第19図は、発現ベク
ターpF8CSSSのDNA配列の一部を示す配列図であり、第20
図は、ｔ−PA発現ベクターpCISt−PAの構築を示す工程
図である。
程図であり、第２図は、因子VIII発現ベクターpF8SCIS
の構築を示す工程図であり、第３図は、pF8CIS（Ａ）お
よびpF8SCIS（Ｂ）でトランスフェクションした細胞を
免疫ペルオキシダーゼ染色したときの結果を示す写真の
模写図であり、第４図は、pF8CISでトランスフェクショ
ンし、増幅を１回行ったCHO細胞を免疫ペルオキシダー
ゼ染色したときの結果を示す写真の模写図であり、第５
図は、pF8CISでトランスフェクションし、増幅を３回行
ったCHO細胞を免疫ペルオキシダーゼ染色したときの結
果を示す写真の模写図であり、第６図は、因子VIII変異
体の発現ベクターpF8CIS9080の構築を示す工程図であ
り、第７図は、ベクターpF8CIS9080でトランスフェクシ
ョンした細胞を免疫ペルオキシダーゼ染色したときの結
果を示す写真の模写図であり、第８図は、pF8CISでトラ
ンスフェクションし、連続的な増幅を行ったCHO細胞を
免疫ペルオキシダーゼ染色したときの結果を示す写真の
模写図であり、第９図は、発現ベクターpF8CIS−336Eの
構築を示す工程図であり、第10図は、発現ベクターpF89
080−336Eの構築を示す工程図であり、第11図は、精製
した90kd＋142aa＋80kd融合体をSSD−PAGEで分け、クー
マシーブルー染色（Ａ）およびウェスタンブロット分析
（Ｂ）にかけたときの結果を示す写真の複写図であり、
第12図は、90kd＋142aa＋80kd融合体のトロンビン活性
化を示すグラフ、およびSDS−PAGEにかけたときの結果
を示す写真の複写図（挿入図）であり、第13図は、90kd
＋142aa＋80kd融合体のvWFへの結合を示すグラフであ
り、第14図は、プロリラキシン発現ベクターpCIHRXの構
築を示す工程図であり、第15図は、プロリラキシン発現
ベクターpCISRXの構築を示す工程図であり、第16図は、
ｔ−PA発現ベクターpCIHt−PAの構築を示す工程図であ
り、第17図は、発現ベクターpF8CISのDNA配列の一部を
示す配列図であり、第18図は、発現ベクターpF8SCISのD
NA配列の一部を示す配列図であり、第19図は、発現ベク
ターpF8CSSSのDNA配列の一部を示す配列図であり、第20
図は、ｔ−PA発現ベクターpCISt−PAの構築を示す工程
図である。
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 １．所望の異種タンパク質を真核宿主細胞中で連続的に
製造するための方法であって、 （ａ）以下に挙げる要素： １）プロモーターの下流にあり、所望の異種タンパク質
のアミノ酸配列をコードしているDNAの上流にある、所
望の該タンパク質を安定に発現させるための安定化配列
であって、 （ｉ）スプライス供与−イントロン−受容配列、または （ii）供与／受容連結部のヌクレオチドを有する、供与
および受容配列のためのコンセンサス配列を含む配列で
あって、生成するmRNAがスプライスされたmRNAと同じ機
能を有する配列 を含んでなる配列； ２）該安定化配列の下流にある、所望の異種タンパク質
のアミノ酸配列をコードしているDNA;および ３）下流側が転写終止部位となっているポリアデニル化
配列をコードしているDNA; を含有する２本鎖DNA配列を有する発現ベクターを構築
し、 （ｂ）トランスフェクションを行い、次いで該発現ベク
ターを有する真核宿主細胞を選択し、そして （ｃ）このトランスフェクションされた真核宿主細胞
を、所望のタンパク質の連続的な製造に適した条件下で
培養すること からなる方法。 ２．プロモーターがヒト・サイトメガロウィルスの即時
型遺伝子からのものである第（１）項記載の方法。 ３．プロモーターがサルウィルス40（SV40）からのもの
である第（１）項記載の方法。 ４．安定化配列が、少なくとも１つの、２つを越えない
スプライス供与−イントロン−受容配列からなる第
（１）項記載の方法。 ５．安定化配列が、供与／受容連結部のヌクレオチドを
有する、供与および受容配列のためのコンセンサス配列
を含む配列であって、生成するmRNAがスプライスされた
mRNAと同じ機能を有する配列である第（１）項記載の方
法。 ６．スプライス供与−イントロン−受容配列のスプライ
ス供与配列がヒト・サイトメガロウィルスの即時型遺伝
子からのものである第（４）項記載の方法。 ７．スプライス供与−イントロン−受容配列のイントロ
ンがヒト・サイトメガロウィルスおよび免疫グロブリン
可変領域からのものである第（４）項記載の方法。 ８．スプライス供与−イントロン−受容配列のスプライ
ス受容配列が免疫グロブリン受容配列に対応している第
（４）項記載の方法。 ９．異種タンパク質のアミノ酸配列をコードしているDN
Aが因子VIIIをコードするものである第（１）項記載の
方法。 １０．異種タンパク質のアミノ酸配列をコードしている
DNAがｔ−PAをコードするものである第（１）項記載の
方法。 １１．異種タンパク質のアミノ酸配列をコードしている
DNAがプロリラキシンをコードするものである第（１）
項記載の方法。 １２．異種タンパク質のアミノ酸配列をコードしている
DNAが因子VIIIの変異体をコードするものである第
（１）項記載の方法。 １３．ポリアデニル化配列をコードしているDNAがサル
ウィルス40（SV40）からのものである第（１）項記載の
方法。 １４．宿主細胞がマウスのセルトリー細胞（TM4）であ
る第（１）項記載の方法。 １５．宿主細胞が肝腫瘍細胞（HTC）である第（１）項
記載の方法。 １６．宿主細胞がヒト胚腎細胞（293）である第（１）
項記載の方法。 １７．異種タンパク質のアミノ酸配列をコードしている
遺伝子が、活性化タンパク質Ｃによる切断に対して耐性
な因子VIIIをコードするものである第（１）項記載の方
法。 １８．発現ベクターがエンハンサーを含んでいる第
（１）項記載の方法。 １９．エンハンサーがプロモーターの上流に配置されて
いる第（16）項記載の方法。
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|---|---|---|---|
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