JP3456992B2 - 変異型dhfr遺伝子を使用した発現誘導方法 - Google Patents
変異型dhfr遺伝子を使用した発現誘導方法Info
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Description
増大する組み換え法に関する。
の活性に必要とされる転写後の修飾(たとえば、グリコ
シル化)をすることができるので、大きなそして複雑な
哺乳動物タンパク質を製造するために好ましい系であ
る。しかし、真核細胞系は通常、多くの原核細胞には可
能であるタンパク質発現レベルを表さない。それゆえ
に、異種タンパク質の高いレベルを発現する、操作させ
た真核細胞系を作成するための方法が開発されて来た。
的DNAおよび目的タンパク質をコードする遺伝子のコピ
ー数を共増幅する細胞の能力を利用する。この系は、マ
ーカー遺伝子としてジヒドロ葉酸還元酵素(dihydrofol
ate reductase)(DHFR)遺伝子、およびDHFRの活性を
阻害する葉酸アナログとしてメトトレキセート(methot
rexate(MTX)(例えば、米国特許第4,656,134号および
米国特許第4,399,216号を参照)の利用を含む。
媒する酵素であり、生体内の多くの生合成経路における
必須基質である。DHFRが欠損している細胞(DHFR
(−))は,生存および成長のためにその培地に代謝産
物の補給を必要とする。択一的に、DHFR遺伝子はDHFR
(−)宿主にトランスフェクトされることが可能であ
る。DHFRの野生型細胞は、MTXが極めて低濃度で存在し
ている中で培養されても死亡率は高い。MTXは、化学量
論的にDHFRに結合し、阻害することにより細胞を死に至
らしめる。しかしわずかな割合の細胞は、阻害剤の存在
下でも生存する(シムケ等;Schimke et al.(1978)Sci
ence 202:1051−1055)。これらの細胞は、増幅されたD
HFR遺伝子のコピー数を含有し、均等物が細胞内DHFRの
レベルで増加したすることが発見された。漸次的により
高濃度のMTXに繰り返し晒すことにより、初めは50nMのM
TXで死んだ1つの細胞カルチャーが 最終的に500mMのM
TXで生存できる。これらの細胞は、同様に上昇した細胞
内DHFRのレベルを伴い、高いコピー数の統合されたDHFR
遺伝子を含有するであろう(例えば数千コピー)。
ンスフェクションおよび共増幅されることが発見された
(カウフマン等;Kaufman et al.,(1985)Molec Cell B
iol.5:1750−1759)。この側面領域に目的タンパク質
ををコードする遺伝子を含む場合の共増幅も、細胞内レ
ベルで目的タンパク質のさらなる上昇をもたらすであろ
う(アルト:Alt et al.(1978)J.Biol.Chem.253:1357
−1370;米国特許第4,656,134号;および米国特許第4,39
9,216号)。
中で段階的に選択してのみ達成できる。加えて遺伝子増
幅はまれな出来事である。通常は、生存細胞がコロニー
を形成し、2から5倍に増大したMTXの濃度に適応する
までは数週間かかる。細胞系が50nMから500mMのMTXの濃
度に適応することを含む完全な増幅過程には、数カ月を
要し、それは時間のかかる、退屈な工程である。
う。一定の選択により維持された細胞内では、増幅DNA
配列または遺伝子に連続的な変化が進行しており、安定
または不安定に分類できる。不安定な増幅遺伝子は、し
ばしば小さく、double minute染色体と呼ばれる自己複
製染色体外因子である(カウフマン等;Kaufman et al.
(1979)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)76:5669−567
3)。なぜならdouble minute染色体はセントロメアを欠
いているので、それらは有糸分裂の際に娘細胞に等しく
分離しない。それゆえに、選択をしないと細胞数は増幅
遺伝子の半分を失い、20細胞倍少ない(シムケ:Schimk
e,(1988)J.Biol.Chem.263:5989−5992)。安定な増幅
遺伝子は、しばしば均一染色領域(homogeneouly stain
ing region)と呼ばれる染色体領域を伴う(ヌンベルグ
等;Numberg et al.(1978)Proc.Natl.Acad.Sci.(US
A)75:5553−5556)。しかし、連続的な選択無しでは、
安定な統合されたの増幅配列でもさまざまに不安定であ
る。例えば安定な細胞系がMTXの非存在中で成長した
時、それらは増幅遺伝子を6から12カ月に渡って失う。
目的タンパク質の発現を増大させる方法を提供すること
である。もう1つの目的は、時間経過にも失われず、遺
伝子増幅に関与しない哺乳動物細胞中におけるタンパク
質発現を増強させる方法を提供することである。さらに
増幅よりもより速く達成できる細胞培養におけるタンパ
ク質発現の誘導方法を提供することを目的とする(例え
ば数カ月のかわりに数週間)。
タンパク質を製造する方法を提供する。該方法は、 (a) 多数のコピーの発現ベクターで細胞をトランス
フェクションし、前記ベクターの各々のコピーは、酵素
的に機能性のジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)をコードす
る発現可能な遺伝子および目的タンパク質をコードする
発現可能な遺伝子を含み、 (b) 前記細胞をメトトレキセート(MTX)の存在下
で培養し、多数のクローンを生成させ、 (c) DHFRおよび前記目的タンパク質を共発現する少
なくとも10コピーのDNAを含有するクローンを選択し、 (d) 前記選択クローンを培養し、そして (e) 培養した前記クローンを、約0.1から100μMの
範囲で連続的に増加させた濃度のMTXで処理する、 ことからなり、 前記遺伝子によってコードされたDHFRは野生型DHFRと比
較して減少したMTX−結合親和性を有する変異タンパク
質であり、かつ前記細胞は野生型DHFR遺伝子を含有する
ことを特徴とする。
方法を提供する。より詳細には、遺伝子増幅をせずに、
種々の遺伝子工学、トランスフェクション、培養および
誘導法を利用してタンパク質発現を増大する方法に関す
るものである。
−または3−倍以上の)な遺伝子増幅なしに、転写の割
合、それに続いて翻訳の速度を増加させることを言う。
“DHFR変異タンパク質”と言う用語は、野生型DHFRの酵
素活性を有するが、メトトレキセートへの減少した(MT
X)−結合親和性を有するジヒドロ葉酸還元酵素の変異
体または構造類似体を言う。“目的のタンパク質”とい
う用語は、タンパク質またはそれらの断片であり、トラ
ンスフェクションされた野生型宿主細胞により発現さ
れ、後の使用のために収穫されたものを言う。
ーと大変高いコピー数を含有するようにトランスフェク
ションすることができる。もしこれらのベクターが生物
工学的にDHFRの変異タンパク質をコードするマーカー遺
伝子を含有するようにした後、初期の高コピー数のクロ
ーンをMTXにさらすと、その結果マーカー遺伝子ととも
に共トランスフェクションされた大変高レベルの目的遺
伝子の発現が誘導されることが発見された。
間である2〜3週間中に段階的に100から1000倍に増大
したMTX濃度に適応するが,それらのコピー数は数倍に
増大する。加えて、MTXの高濃度(例えば5mM)に適応す
る細胞は、低濃度のMTXまたはMTXを含まない培地中でさ
えも成長できる。このような培地では、成長速度および
生存率は実質的に向上するが、この反応は同時に発現レ
ベルの低下をもたらす。このような培地中で培養された
細胞集団は、MTXを培地に加え戻すことで本来の高レベ
ル発現に戻すことができる。
増大量の生産に関する工程およびそのような物質を生産
するために誘導することのできるトランスフェクトマー
(transfectmas)を提供する。本発明によれば細胞は発
現ベクターの多数のコピーによってトランスフェクショ
ンされ、そのコピーの各々は酵素的に機能的なDHFRをコ
ードする発現可能な遺伝子及び目的タンパク質をコード
する発現可能な遺伝子の双方を含む。トランスフェクト
された細胞はMTX存在下で培養され、多数のクローンを
生産する。その後、DHFR及び目的タンパク質を共発現す
るトランスフェクションベクタの多くーのコピー数を含
有するクローンを選択する。このクローンはその後、MT
Xを少量または含まない培地中で大規模成長のために培
養される。細胞の所望容量および最適細胞密度の時にMT
Xで処理し、目的タンパク質およびDHFRをコードする遺
伝子の実質的な増幅なしに、転写の増大を誘導すること
により、目的タンパク質の発現を増強させる。
したMTX−結合親和力を有し、トランスフェクションさ
れる細胞は、ミエローマのような野生型DHFR遺伝子を含
有する、例えばSp2/0系の1つのようなネズミ起源の細
胞である。
はスフェロプラスト融合であり、これは統合された発現
ベクターの高コピー数を生じる。
び目的タンパク質をコードする遺伝子のそれぞれを含有
する第一及び第二転写単位を有する。マーカー遺伝子
は、好ましくは野生型酵素活性を示し、しかし野生型DH
FRに比較して減少したMTX−結合親和性を示す(例え
ば、3T6−R400;シモンセンおよびレビンソン;Simonsen
and Levinson(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)80:2
495−2499)。この遺伝子は、例えば、SV40初期領域の
ような、転写制御下であろう。
質は、真核細胞中で発現可能な任意のタンパク質であ
る。このようなタンパク質は、条件または欠損を訂正す
るのに有効であり、ペプチドホルモン、インターロイキ
ン、組織プラスミノーゲン活性化因子(tPA),プロー
ウロキナーゼ(pro−UK),ヒトまたはネズミ免疫グロ
ブリンの重鎖または軽鎖、マウス−ヒトキメラ免疫グロ
ブリン、またはそれらの活性構造類似体、誘導体、断片
または融合生成物である。第二転写単位はまた、好まし
くは免疫グロブリンの重鎖由来(ギリス等;Gillis et a
l.(1983)Cell 33:717−728;米国特許第4,663,281号)
のエンハンサー要素およびプロモーターを含みうる。第
二転写単位に有用なプロモーターは、メタロチオネイン
プロモーター、カッパー軽鎖プロモーターまたはSV−40
プロモーターのような強いプロモーターである。プロモ
ーターは、単位時間あたりに開始されるmRNAの数に依存
して強いまたは弱いといわれる。
つの転写単位は、ブロッキング要素として提供される1
片のDNAによって分離される(ギリス等;Gillis et al.
出願中の米国特許出願第837,595号、1986年3月7日
付)、すなわちDHFR変異タンパク質転写単位のエンハン
サーの活性をブロックする効果を持つプロモーターであ
る。g軽鎖プロモーターがこの目的に特に有用である。
ンをMTXの濃度を連続的に、例えば約0.1から100mMの範
囲で増加させて処理する。しかし細胞分裂10周期以下に
おいて目的タンパク質の発現を約4から8倍に増強させ
るものであればどのような濃度範囲のMTXであっても有
効である。
その他の目的、様々な特徴は、以下の説明および図面を
同時に読むことによりより完全に理解されるであろう。
り; 第2図は、トランスフェクションのために使用する、
ネズミSp2/0 ハイブリドーマ細胞のベクター構築を図
式的に表したものであり;目的cDNAはベクターのXho I
部位に挿入されており; 第3図は、3T6−R400変異タンパク質DHFRの塩基配列
および対応するアミノ酸配列、本発明の使用に好ましい
変異タンパク質を図式的に表したものであり; 第4図は、ウロキナーゼcDNAをプローブとしたサザン
ブロッティングのオートラジオグラムの写真を表し; 第5図は、DHFR cDNAをプローブとしたサザンブロッ
ティングのオートラジオグラムの写真を表し; 第6図は、tPAのコード領域Glu254からIle317に対応
する合成2本鎖DNAをプローブとしたサザンブロッティ
ングのオートラジオグラムの写真を表し; 第7図は、カッパー軽鎖遺伝子のオリゴラベルした1K
b断片をプローブとして使用したノーザンブロッティン
グのオートラジオグラムの写真を表し;そして 第8図は、オリゴラベルしたDHFR cDNAをプローブと
して使用したノーザンブロッティングのオートラジオグ
ラムの写真を表したものである。
ャー内で実質的に遺伝子の増幅無く、高レベルの遺伝子
発現を誘導する方法に関するものである。変異DHFR遺伝
子および目的タンパク質をコードする遺伝子からなるベ
クターの多くのコピーによってトランスフェクションさ
れた細胞から培養された初期クローンは、100nM MTXの
存在下で選択されれば、目的タンパク質を高レベルで生
産し(1−5mg/106細胞/日)、そのようなクローン
は、100から1000倍に増加したMTX濃度に素早く適応(数
週間)し、その間、目的遺伝子の発現は数倍に増加する
ことがわかった。
低濃度MTXまたはMTXが存在しない培地でも成長できる。
そのような培地中では成長速度および生存率は実質的に
向上するが、この反応は発現レベルの低下を伴う。この
培地からの細胞集団は、MTXをその培地に加え戻すこと
で本来の高レベル発現を再び誘導できる。
て所望する任意のタンパク質の優れた発見レベルを有す
る形質転換体のカルチャーを生産するために利用できる
であろう。第1図に描いた様に、この工程は既知の方法
を使用して、2つの転写単位をコードするタイプの発現
ベクターの製造を含む。
モーターおよびDHFR遺伝子をコードする遺伝子から成
り、このDHFR遺伝子は、野生型DHFRの酵素活性特性およ
び減少したMTXへの結合を有する。他の転写単位は、目
的タンパク質をコードし、これは意図する宿主細胞によ
って任意のタンパク質を発現可能である。このベクター
は次に動物細胞宿主中にトランスフェクションされる。
優れた結果は、ネズミノエローマ細胞を宿主として使用
したときに達成されるが、任意の連続動物細胞も使用さ
れ得る(例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞)。
トランスフェクションは、宿主の個々の細胞に統合され
たベクターの数多くのコピーが生じる条件で行われる。
最後に既知の原形質またはセファロプラスト融合技術が
好ましい。
ンパク質を発現しているクローンをスクリーニングす
る。選択したクローンを、タンパク質生産に適した密度
にまで培養する。所望すればこれらの細胞は再びMTXに
晒され、目的タンパク質の発現は繰り返し誘導され得
る。
実施態様の開示は、以下に示される。
解されるであろう。
れぞれ、ボウズ(Bowes)ミエローマ細胞系および上皮
細胞系A431から確立された方法により単離される(例え
ば、マニアチス等:モレキュラークローニング、アクロ
ーニングマニュアル;Maniatis et al.,(1982)Molecul
ar Cloning,A Cloning Manual,Cold Spring Harbor Lab
oratory,pp.197−198参照)。2本鎖cDNAの合成は、ギ
ブラーおよびホフマン(Gubler and Hoffman)(1983)
Gene 25:263−269,により本質的に達成され、この文献
は参照のためここに編入される。リンカーのライゲーシ
ョンに続いてcDNAは、ggt 10中にクローンされる。この
ファージライブラリーは、その後オリゴヌクレオチドプ
ローブでスクリーンされる。シークエンシングによって
決定された完全鎖長cDNAが発現ベクターのXho I部位に
クローンされる。
p1.0由来である。pEMp1.0の構築は、本質的にギリスの1
987年6月25日付け出願中の特許出願第066,727号に掲載
ように達成され、これは参照により編入される。キサン
チン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(XG
TPRT)遺伝子は、pDEMP1.0中のマーカー遺伝子としてDH
FR cDNAに置き換えられる。このDHFRマーカー遺伝子
は、MTXに対する減少した結合親和性を持つ改変マウスD
HFRをコードする。この完全なDNA配列(および対応する
アミノ酸配列)を第3図に示す。マウスDHFR cDNAの−
9の位置にあるFnu4H1部位は、リンカーライゲーション
を通してHind III部位に転換される。このHind III部位
は、SV−40エンハンサーおよびプロモーターの制御下に
DHFR遺伝子を配置するために使用される(第2図)。SV
−40初期領域のポリアデニレーションシグナルが使用さ
れる。これは、SV−40のBcl I−Bam H1制限断片をDHFR
cDNAの3'非翻訳部位にあるBgl II部位に連結して達成さ
れる。BamH I部位は、代わりにEcoR I部位にリンカーラ
イゲーションを通じて転換される。このpDEMp1.0ベクタ
ーは、pEMp1.0のHind III−Pst Iベクター断片、pBR322
のPst1−EcoR I断片(アンピシリン耐性遺伝子の部分を
含む)、およびHind III−EcoR I断片(DHFR cDNAおよ
び初期SV−40ポリアデニレーションシグナルを含む)を
含む。
含有し、これはpDEMp1.0中のメタロチオネインプロモー
ターと交換する。合成カッパープロモーターは、Afl II
−Xho I断片として、免疫グロブリン遺伝子のカッパー
プロモーターの両鎖をコードする合成オリゴヌクレオチ
ドを連結することにより構築される。
される。転写単位は、免疫グロブリンの重鎖エンハンサ
ー、メタロチオネイン/カッパープロモーターおよび免
疫グロブリンのカッパー鎖のポリアデニレーションシグ
ナルから成る。目的遺伝子の転写方向は、DHFRマーカー
遺伝子の方向とは反対であり、2つの転写単位は、gプ
ロモーターによってブロッキング要素として分離されて
いる。このブロッキング要素に関してさらに詳細には、
ここに参照として編入される出願中の1987年6月25日付
特許出願第066,727号を参照にされたい。
(FCS)を含有するダルベッコの改良イーグル培地中で
成長させる。プラスミドを、プロトプラストを作成する
ために使用するE.Coli C600R-中で増殖させる。Sp2/0細
胞を、ギリス等(Gillis et al.(1983)Cell 33:717−
728)によって述べられたようなサンドリーゴルディン
(Sandri−Goldein:(1983)Mol.Cell Biol.1:743−75
2)のプロトプラスト融合法の改良法によってトランス
フェクションする。トランスフェクションの後、細胞を
104細胞/ウェルで96−ウェルのマイクロタイタープレ
ートに撒く。選択培地(100nM MTX含有)を24時間後に
加える。細胞に選択培地を3日の間隔で2回以上与え
る。トランスフェクションの10−14日後にコロニーが現
れる。それらは、ELISAまたはアッセイにより96−ウェ
ル上でスクリーンされ、増殖したクローンが選択され
る。
こに参照として編入される出願中の1987年6月25日付特
許出願第066,727号に記載されているtPA ELISAによって
直接アッセイする。
のウシ胎児血清を含有する1mLの培地中、24−ウェルプ
レート内でインキュベートする。24時間後、培地を活性
測定のために採取する。活性はIu/106細胞/日(Iu/m
L)で表す。
米国特許出願第151,707号に記載された間接アッセイで
監視(monitore)する。この過程中で、フィブリンの存
在下でtPAによりプラスミノーゲンはプラスミンに触媒
的に転換される。プラスミンによる染色体遺伝子基質S2
251(ヘレナ ラボ、ビューモント テキサス;Helena L
abs Beaumont Texas)の開裂を測定する。
国特許出願第205,437号に記載された直接S−2444アッ
セイで活性測定する。このアッセイで、プラスミンによ
りプロ−UKは定量的にUKに転換される。UKのアミドリテ
ィック(amidolytic)活性を染色体遺伝子基質S−2444
(ヘレナ#5281:Helena)の開裂により間接的に監視(m
onitore)する。精製UK(カルビオケム.#672081:Calb
iochem)を標準として使用する。
pp280−281)に記載されたように調製する。5mgのDNAを
各々の制限酵素で完全に消化し、TANバッファー(50mM
Tris、20mM酢酸ナトリウム、2mM Na2EDTA、pH8.2)中
で、1%アガロースゲル電気泳動を行う。サザンブロッ
トトランスファーをサザン(Southern:(1975)J.Mol.B
iol.98:503)に記載されたように行う。第4図に示され
たそれぞれのクローンからのDNAを、Xho Iで消化し、電
気泳動、ブロッティングし、その後UK cDNAを含むオリ
ゴラベルしたXho I断片とハイブリダイズした。第5図
に示されたそれぞれのクローンからのDNAを、EcoR Iお
よびSal Iで消化し、電気泳動、ブロッティングし、そ
の後DHFR cDNAを含むオリゴラベルしたEcoR I−Sal I断
片とハイブリダイズした。第6図に示されたそれぞれの
クローンからのDNAを、Xho Iで消化し、電気泳動、ブロ
ッティングし、その後オリゴラベルした合成2本鎖のtP
A cDNAとハイブリダイズした。親のSp2/0ミエローマ由
来のDNAを対照として使用する。それぞれのサザンブロ
ッティングにおいて、消化したプラスミドDNAを、20,5
0,100および200コピー相当量泳動し、コピー数マーカー
とした。分子量標準は、キロベース(Kb)で示す。
88提出)によって記載されたように調製する。RNAをホ
ルムアミドで変性し、ホルムアルデヒドバッファー中で
1.2%アガロースゲル電気泳動、ニトロセルロース膜へ
のトランスファー、(トーマス(Tomas)(1980)Proc.
Natil.Acad.Sci.77:5201)を行う。第7および8図にお
いて、約0.5mgのRNAをノーザンブロッティングの1レー
ン当たりに添加する。示したように核内RNAを含む2つ
のレーンを除き、残りのレーンすべては、細胞性RNAで
ある。第7図において、各々のレーンに添加した細胞性
RNAの量は、同量のカッパーメッセージ(message)(太
矢印)を含有するように標準化されており、これは親Sp
2/0が作る。UKメッセージ(細矢印)およびtPAメッセー
ジ(破線矢印)は両方ともカッパー軽鎖の3'−非翻訳領
域を含有しており、故にプローブとハイブリダイズす
る。このプローブは、3'−非翻訳領域を含有するオリゴ
ラベルされたカッパー軽鎖の1Kb断片である。第8図に
おいては、ノーザンブロッティングをオリゴラベルした
DHFR cDNAでプローブする。
(MF)のサブクローンのRNA(および第4−6図のDNA)
をサブクローンがコロニーを確立した後6−7週間後に
調製した。RNAを調製した時の、SDU 4.1−5MFの活性は
それぞれ、MTX−無しの培地において100Iu/mL、5mM MTX
では2300Iu/mL、SDTK 5.16MFの活性はそれぞれ、MTX−
無しの培地において450Iu/mL、10mM MTXで6000Iu/mLで
あった。
クターpDEMp1.0−tPAを使用して研究する。選択に100nM
MTXを使用する時、トランスフェクション頻度は、約1
−2×10-5細胞:コロニー中のtPA生産細胞系の割合は9
0%に近かった。マイクロタイター中のクローンの上清
は、200−900Iu/mLの活性を有する。同様な結果がpDEMp
1.0−UKで得られる。表1(下記)は、pDEMp1.0−tPAお
よび1.0−UKベクターを使用した原形質融合由来クロー
ンの第1組の初期発現レベルを表す。
質発現 MTX−耐性のトランスフェクトマー(transfectomas)
を、段階的にMTXの濃度を増加させた培養培地中で成長
させる。初めに、100nM MTXで選択した細胞を0.5mM MT
X,それから1mM MTXへと供した時、細胞は生存率に有意
な低下はなく、1週間の内に高濃度の薬剤に適応する。
MTXの濃度を1.0mMから2.5mM,そして5mM,10mM,20mM等の
段階的に上昇させた時、細胞の生存率は、40−70%低下
する。一般的に、細胞が5倍のMTX濃度増加に適応する
のに2週間はかからない。さまざまなMTX濃度での細胞
のtPAまたはUK生産量をアッセイする。一般的に大量生
産系では、培地中のMTX濃度が10倍増加すると、発現レ
ベルは2倍増加する。しかし、MTXの濃度が20mM以上に
なると、発現レベルが弱まる傾向にある(下記第1図参
照)。
ーン 発現ベクターpDEK1.0−tPAおよびpDEKp1.0−UKを使用
したトランスフェクションの頻度は、pDEM1.0−tPAおよ
びpDEMp1.0−UKを使用した場合の約10から20%にすぎな
いが、tPAおよびUK生産クローンは、高いままである
(すなわち約80%)。pDEKp1.0ベクターは、pDEKp1.0で
得られるよりも有意に高レベルのtPA/UKを生産するトラ
ンスフェクタント(transfectant)の上昇を与える。カ
ッパークローンをMYXの濃度が上昇した中で増殖させる
時、tPAおよびUKの高い発現レベルをもたらす。
胞系の活性結果を表す。pDEKp1.0発現ベクターで得られ
たクローンには、クローン番号の前に“K"を付し、残り
はpDEKp1.0で得られたクローンである。
験して発現レベルの上昇が増幅によるものか、誘導によ
るものかを決定する。
100nM MTXですでに約100コピーのプラスミドDNAを含有
していた。しかし、SDU−4は、0.1μMから100μM MTX
(第4および第5図)からの挿入DHFR遺伝子およびUK遺
伝子のいずれの増幅も示さないが、活性測定で決定され
たようにUKの発現において8倍の上昇がある。核及び細
胞性RNA(UKおよびDHFR)の両方のレベルの上昇は、第
7,8図に示すノーザンブロットから明らかである。tPAの
発現が4倍に増強するにもかかわらず、同様に遺伝子増
幅の無いことが、100nMから10mM MTXからのSDT−1クロ
ーンにも見らる。
現レベルは第1週目に、本来のレベルの50%以下に落ち
る。この生存サブクローン中の目的遺伝子が失われたの
かどうかを決定するために、1mM MTXで生育するSDTK−
5および5mM MTXで生育するSDU4.1(UKを3,000Iu/mLで
発現するSDU4のサブクローン)をMTX無しの培地でサブ
クローニングする。MTX−無しのいくつかのサブクロー
ンをスクリーニングし、最高のもの:SDTK−16MF(MF=M
TX−無しサブクローン);SDU4.1−5MF;およびSDU4.1−1
8MF、を選択する。それらの発現レベルは、表2に表す
ように親クローンの発現より極めて低い。
の培地で約1,000Iu/mlで発現するSDTK5−16MFを1mM MTX
中で約2週間増殖させる。発現レベルは、1mM MTX中で3
060Iu/ml,および10mM MTX中で6480Iu/mlである。
レベルを短期間の内に誘導できるかどうかを決定するた
めに、SDU 4.1−5MFおよびSDU 4.1−18MFを1mMおよび5m
M MTXを含有する成長培地で14時間、24時間および10日
間培養する。誘導期間の最後に、106細胞を取り出し、
遠心沈降させ、1%ウシ胎児血清(FCS)を含有する1ml
の正常成長培地中に加える。24時間後の上清をアッセイ
のために収穫する。表2に示すように、少なくとも14時
間において、細胞は再び誘導され、発現レベルを数倍増
加でき、これは細胞の倍加時間より短い。
には、短かすぎる。それゆえ、発現レベルにおける増加
が誘導現象であることを確認するために、これらMTX−
無しでのサブクローンのプラスミドDNAのコピー数をサ
ザン分析で試験した。約6週間、MTX−無し培地および5
mM MTX中で成長したSDU 4.1−5MFの間には、有意な遺伝
子増幅を欠いている(第4図)。ノーザンブロット分析
(第7及び8図)で決定したUKおよびDHFRのRNAのレベ
ルは、関連する遺伝子コピー数では説明できない5mM MT
Xでの細胞成長の劇的な増加を表す。同様に、MTX−無し
の培地におけるSDT K5−16MFおよび10mM MTX中で成長す
るSDT K5−16MFは約同数のプラスミドDNA(第6図)を
持つが、細胞は10mM MTX中で成長する時、tPAのmRNAレ
ベルにおいては、10倍以上の増加がある。
ローニングの過程でコロニーを確立した後、約4週間後
に行われた。MTX−無し培地のこれらのサブクローンに
ついては、選択圧が無いのでそれらはクローンの均一性
を失う傾向にあり、ゆえにそれらの発現レベルは、時間
の延長期間以上である。
く、他の特定の形で具体化されるであろう。ゆえに本発
明の実施例は、すべて説明であり限定的なものではな
く、本発明の観点は前述の記載よりも添付の請求の範囲
に示されると考えられ、ゆえに請求の範囲と均等な意味
および範囲にあるすべての変更は、これらに内包される
ことを意図する。
Claims (9)
- 【請求項1】哺乳類細胞内において増加した量の目的タ
ンパク質を生産する方法であって、工程: a)酵素として機能するジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)
をコードする発現可能な遺伝子及び目的タンパク質をコ
ードする発現可能な遺伝子を含む、少なくとも100コピ
ーのベクターで、哺乳類細胞をトランスフェクトするこ
とにより、上記哺乳類細胞のトランスフェクト体を生産
し; b)選択剤として少なくとも約100nMのメトトレキセー
ト(MTX)の存在下で上記トランスフェクト体を選択培
地に供することにより、トランスフェクトされなかった
哺乳類細胞を本質的に含まない単離されたトランスフェ
クト体のクローンを生産し; c)MTX不在下で上記クローンを培養し;そして d)培養されたクローンを100nMから100μMの範囲にお
いて連続的に増加する濃度のMTXで処理することによ
り、培養クローンの細胞倍加時間より短い時間で上記目
的タンパク質及び上記DHFRをコードする遺伝子の実質上
の増幅なしにDHFRをコードする遺伝子及び目的タンパク
質をコードする遺伝子の同時転写の増加を誘導すること からなる、上記方法。 - 【請求項2】前記の酵素として機能するDHFRが3T6−R40
0 DHFRである、請求項1記載の方法。 - 【請求項3】前記細胞がミエローマからなる、請求項1
記載の方法。 - 【請求項4】目的タンパク質をコードする遺伝子が、ペ
プチドホルモン、インターロイキン、組織プラスミノー
ゲン活性化因子、プロウロキナーゼ、および、ヒト軽
鎖、ヒト重鎖、ネズミ軽鎖、ネズミ重鎖、ネズミ−ヒト
キメラ軽鎖およびネズミ−ヒトキメラ重鎖からなる群よ
り選択される免疫グロブリン、ならびにそれらの活性ア
ナログ、断片、誘導体および融合生成物からなる群より
選択されるタンパク質をコードする、請求項1記載の方
法。 - 【請求項5】連続的に濃度を増加させたMTXの存在下に
おいて工程(b)の選択培地にトランスフェクト体を供
する、請求項1記載の方法。 - 【請求項6】MTX濃度を2週間未満の間隔で5倍増加さ
せる、請求項5記載の方法。 - 【請求項7】MTX濃度を約100nMから少なくとも1μMま
で連続的に増加させる、請求項5記載の方法。 - 【請求項8】MTX濃度を少なくとも5μMまで連続的に
増加させる、請求項7記載の方法。 - 【請求項9】MTX濃度を少なくとも20μMに連続的に増
加させる、請求項8記載の方法。
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