JPS63304982A - ドロソフィラ細胞における外来性遺伝子の発現 - Google Patents

ドロソフィラ細胞における外来性遺伝子の発現

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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は、ドロソフィラ細胞における外来性遺伝子の発
現方法に関する。さらに詳しくは、本発明は、ドロソフ
ィラ細胞における組織プラスミノーゲンアクチベーター
（ｔＰＡ）の高水準の発現についての方法および該発現
遺伝子産生物の精製に関する。
発明の背景 ヒトｔＰＡは、約７００００ダルトンの糖タンパク質お
よび５２７アミノ酸である。それは種々のヒト組織によ
り分泌され、通常、血清中に存在する。ｔＰＡは、プラ
スミノーゲンをプラスミンに変換することにより血餅溶
解の作用をする。ｔＰＡはフィブリンに対して親和性を
有し、かつ、フィブリンの存在下により活性である。し
たがって、ｔＰＡは、深静脈血栓、急性心筋梗塞および
肺塞栓症のような血栓形成に関連する疾患の治療に有用
である。通常、レイケンら、バイオヒミカ・工・バイオ
ロジカル Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ）、５８０
．　Ｉ　４０（１９７９）、ベタラインら、ジャーナル
・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｖｅｔｔｅｒ
ｌｅｉｎ　ｅｔ　ａｌ、。
Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）、２５４，５７５（１９７
９）、レイケンら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル
・ケミストリー、２５６．７０３５（１９８１）および
マツオら、ネイチ−？−（Ｍａｔｓｕｏ　ｅｔ　ａｌ、
、Ｎａｔ’ｕｒｅ）。
２９上、５９０（１９８１）参照。
ｔＰＡは、ボウズ（Ｂｏｗｅｓ）メラノーマ細胞株を含
むある種の細胞株により過剰生産される。例えば、ウィ
ルソンら、キャンサー・リサーチ（Ｗｉｌｓｏｎｅｔ　
ａｌ、、Ｃａｎｃ、Ｒｅｓ、）±０，９３３（１９８０
）参照。
コレンら、ヨーロッパ特許出願（Ｅ　Ｐ　−Ａ）第４１
７６６号は、ボウズメラノーマ由来ｔＰＡの精製を開示
している。ウィルソン、ヨーロッパ特許出願（ＥＰ−Ａ
）第１１３３１９号は、血清独立ポウズメラノーマ細胞
株を用いたｔＰＡの産生および精製を開示している。ブ
ルーティーボイエ、バイオ／テクノロジー（Ｂｒｏｕｔ
ｙ−Ｂｏｙｅ、　Ｂｉｏ／Ｔ　ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、
１９８４年１２月、１０５８頁は、ヒト胚肺細胞による
ｔＰＡの産生を報告している。
ジュロイニングら（Ｓｃｈｌｅｕｎｉｎｇ　ｅｔ　ａｌ
、）、スイス国ローザンヌの第６回インターナシュナル
・カンファレシス・オブ・フィブリツリシス　（Ｓ　１
ｘｔｈＩｎｔ’ｌ　Ｃｏｎｆ、　Ｐｉｂｒｉｎｏｌｙｓ
ｉｓ、　Ｌａｕｓａｎｎｅ。
Ｓ　ｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、要約、１９８２年７月２
２〜２３日は、ヒーラ−細胞によるｔＰＡの産生を報告
している。
ｔＰＡは、また、組換え体ＤＮＡ法により調製できる。
ｔＰＡについてのｍＲＮＡの単離は、例えば、オブデナ
ッカーら、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケ
ミストリー（Ｏｐｄｅｎａｋｋｅｒ　ｅｔａｌ、、Ｅｕ
ｒ、Ｊ、ＢｉｏｃｈｅＩｌｌ、）、　１２１．２６９（
１９８２）により開示されている。ｔＰＡの一部につい
てのｃＤＮＡの単離は、ニドランドら、プロシーディン
ゲス、オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイ
エンシーズ・オブ・ニー・ニス・ニー（Ｅｄｌｕｎｄ　
ｅｔ　ａｌ、、　Ｐ　ｒｏｃ、Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、
　Ｓ　ｃｉ、　Ｕ　ＳＡ）、８見、３４９（１９８３）
により開示されている。イー−コリーにおけるｔＰＡに
ついてのｃＤＮＡのクローニングは、ペニカら（Ｐｅｎ
ｎｉｃａ　ｅｔ　ａｌ、）、ネイチャー、Ａ」」工、２
１４（１９８３）により報告されている。通常の組換え
体ＤＮＡ法の適用によるイー・コリおよびチャイニーズ
ハムスター卵巣細胞におけるｔＰＡについてのｃＤＮＡ
のクローニングは、ゲデルら（Ｇｏｅｄｄｅｌ　ｅｔ　
ａｌ、）Ｅ　Ｐ　−Ａ−９３６１９およびレビンソンら
（Ｌｅｖｉｎｓｏｎ　ｅｔａｔ、）、ＥＰ−Ａ−１１７
０５９により開示されている。ゴールドベルブら（Ｇｏ
ｌｄｂｅｒｇ　ｅｔ　ａｌ、）、ＰＣＴ特許出願ＷＯ３
５−０３９４９は、イー・コリにおけるｔＰＡの発現を
開示している。メイハックら（Ｍａｙｈａｃｋ　ｅｔ　
ａｌ、）、ＥＰ−Ａ−１４３０８１は、酵母におけるｔ
ＰＡの発現を開示している。
ロビンソン（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ）、ＷＯ３４−０１７８
６は、天然ｔＰＡに存在する炭水化物部の全部または一
部を欠失した修飾ｔＰＡを開示している。
安定、かつ、実験室条件下にて増殖しうるドロソフィラ
細胞培養の開発が報告されている。シュナイダー、ジャ
ーナル・オブ・エンブリオロジー・アンド・エクスベリ
メンタル・モルホロジー（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ、　Ｊ　
、Ｅｍｂｒｙｏｌ、Ｅｘｐ、Ｍｏｒｐｈｏｌ、）、　２
工。
３５３（＋９７２）参照。特定のコーディング配列を含
有する種々のベクター系を、ドロソフィラ熱衝撃プロモ
ーターまたはＣ０ＰＩＡプロモーターの調節下にドロソ
フィラ中に挿入した、ダイノセラら（ＤｉＮｏｃｅｒａ
　ｅｔ　ａｌ、）、プロシーディンゲス・オブ・ザ・ナ
ショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシーズ・オブ・
ニー・ニス・ニー、８０．７０９５（１９８３）。より
最近、該熱衝撃プロモーターをコードするｍＲＮＡが高
い割合でドロソフィラ細胞にて翻訳された。マツクガリ
ーら、セル（ＭｃＧａｒｒｙ　ｅｔ　ａｌ、、Ｃｅ１ｌ
）、４２．９０３（１９８５）。
発明の要約 本発明の１つの態様は、ドロソフィラ細胞に外来性遺伝
子を共導入し、かつ、発現するための選択系の開発に関
する。この方法の使用により、ｔＰＡ遺伝子発現ユニッ
トを用いてトランスフェクションしたドロソフィラ細胞
を培養してｔＰＡを発現し、かつ、分泌し、および分泌
したｔＰＡを収集することによりｔＰＡをドロソフィラ
細胞にて産生しうる。開発した選択系を用いて重要な他
の遺伝子を共導入し、かっ、過剰発現しうる。
本発明のもう１つの態様は、組換え体ドロソフィラ細胞
により産生されたｔＰＡに関する。ｔＰＡについてのＤ
ＮＡコーディング配列またはその活性変異体ならびにド
ロソフィラ細胞内でのｔＰＡコーディング配列の転写お
よびその後の翻訳に必要な調節要素からなることを特徴
とするｔＰＡ遺伝子発現ユニットを記載する。かくして
、ｔＰＡ遺伝子産生物を細胞培地中に分泌し、収集する
。
もう１つの態様において、本発明は、該遺伝子産生物に
ついての遺伝子発現ユニットを含有するベクターおよび
組込みＣＯＰ　Ｉ　Ａ成分からの５゛ＬＴＲおよびハイ
グロマイシンＢホスホトランスフェラーゼまたはメトト
レキセイト耐性選択マーカー含何ベクターにてドロソフ
ィラ細胞を共トランスフェクションし、該遺伝子産生物
が発現するような条件下にトランスフェクションした細
胞を培養し、かつ、該遺伝子産生物を収集することを特
徴とする方法を提供する。
発明の詳説 比変、高水準のｔＰＡ産生がドロソフィラ細胞培養にお
いて得られうろことを見出した。該ドロソフィラ細胞を
、外来性ＤＮＡまたは宿主細胞に悪影響を及ぼすことな
く宿主細胞中に外来性ＤＮＡの導入を許容する標準クロ
ーニング法を用いることによりトランスフェクションす
る。そのように構築した組換え体ドロソフィラ細胞は、
高水準にてｔＰＡを分泌する。
いずれのドロソフィラ細胞も本発明の実施に用いうる。
好ましい細胞株は、Ｓ９株である。ＤＮＡトランスフェ
クション法によるドロソフィラＳ。
細胞中へのｔＰＡｃＤＮＡコーディング配列の導入は、
予期せぬほど大量のｔＰＡを産生する。該Ｓ。
細胞（シュナイダー、ジャーナル・オブ・エンブリオロ
ジー・アンド・エクスペリメンタル・モルホロジー、２
７，３５３（１９７２））は、多培数胚ドロソフィラ細
胞の安定細胞培養である。Ｓ、ドロソフィラ細胞の使用
は、室温にて高密度まで増殖するその能力を含むが、そ
れらに限定されない多くの利点を有する。該選択系の安
定な組込みは、１０００コピーまでのトランスフェクシ
ョンした遺伝子発現ユニットを該細胞染色体中に産生じ
た。
他の入手可能なドロソフィラ細胞株は、Ｓｌ、Ｓ３、Ｋ
Ｏ−０およびハイダイ（ｈｙｄｅｉ）である。
ドロソフィラ細胞は、例えば、Ｍ３培地を含む種々の栄
養培地にて培養しうる。Ｍ３培地は、６゜６のｐＨにお
ける平衡基数および必須アミノ酸の処方からなる。該培
地の調製は、実質的にリントクイスト（Ｌｉｎｄｑｕｉ
ｓｔ）、ＤＩＳ、５８，１６３（１９・８２）に記載さ
れているごとく行なう。
組換え体ＤＮＡ分子であり、かつ、本発明の組換え体ド
ロソフィラ細胞を調製するために用いうるｔＰＡ遺伝子
発現ユニットは、ｔＰＡについてのＤＮＡコーディング
配列またはその活性変異体およびｔＰＡコーディング配
列の転写およびその後の翻訳に必要であるか望ましい調
節領域からなる。
該ｔＰＡコーディング配列はいくつかの源から入手でき
、または、ヒト細胞またはボウズメラノーマ細胞株もし
くはヒーラ−細胞株のような細胞株から得ることができ
る。遺伝子工学の標準的方法を用いて、ヒト細胞のゲノ
ムＤＮＡからｔＰＡコーディング配列を誘導する。その
変異体も標準組換え体ＤＮＡ法により調製できる。その
ような変異体は、血栓崩壊活性に顕著な悪影響を及ぼす
ことなく１個または数個のアミノ酸が置換し、付加しま
たは欠失したｔＰＡ分子からなる。例えば、ロビンソン
、ＷＯ３４−０１７８６、ローザら（Ｒｏｓａｅｔａｌ
、）、ＷＯ−８６−０１５３８、ヘイネッカーら（Ｈｅ
ｙｎｅｋｅｒ　ｅｔ　ａｌ、）、　Ｇ　Ｂ　２１７３８
０４Ａ参照。
該調節領域は、代表的には、ＲＮＡポリメラーゼの結合
時およびＲＮＡ転写開始時に機能するプロモーター領域
からなる。該プロモーター領域は、代表的には、該ｔＰ
Ａコーディング配列から上流に見出されている。例えば
、アビアンラウスサルコーマウィルスＬＴＲおよびシミ
アンウィルス（ＳＶ４０初期プロモーター）を含む哺乳
動物細胞発現ベクターに通常用いられるプロモーターは
、トロソフィラ系において不充分な機能および発現しか
示さない。好ましいプロモーターは、ドロソフィラ起源
のものである。ＳＶ４０初期プロモーターは、ドロソフ
ィラメタロチオネインプロモーターより低水準の発現を
示す。他のドロソフィラプロモーターの例としては、例
えば、熱衝撃（Ｈｓｐ７０）およびＣＯＰ　ＩＡＬＴＲ
プロモーターが挙げられる。
該ｔＰＡコーディング配列の後には、ＳＶ４０初期ポリ
Ａ領域のようなｔＰＡ遺伝子発現ユニット内でのポリア
デニル化（ポリＡ）領域が続く。ＲＮＡ転写物のポリア
デニル化の際に機能するポリＡ領域は、転写の安定化に
ある役割を果たすと考えられる。該ポリＡ領域は、天然
に存在する種々の遺伝子から誘導しうる。他の入手可能
なポリＡ領域としては、例えば、成長ホルモンおよびメ
タロチオネイン遺伝子から誘導されるものがあげられる
。そのような領域は、またポリアデニル化および転写物
安定化機能が顕著な悪影響を及ぼさないならば、修飾し
てその配列を変更しうる。
ドロソフィラメタロチオネインプロモーターの使用は、
非常に高いコピー数においてさえ充分な調節を保持する
メタロチオネインベクター系を生じる。これは、該金属
の調節効果がコピー数の増加とともに減少する哺乳動物
メタロチオネインプロモーターを用いた哺乳動物細胞に
おける結果と全く対象的である。この保持した誘導効果
の結果、高いコピー数でドロソフィラ細胞における該遺
伝子産生物の発現が増加する。
いったん、該ｔＰＡ遺伝子発現ユニットを含有するベク
ター構築されたならば、標準トランスフェクション法を
用いてドロソフィラ細胞中にそれをトランスフェクショ
ンしうる。そのような方法としては、例えばリン酸カル
シウム共沈澱、細胞融合、エレクトロポレーション（ｅ
ｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔ　１ｏｎ）微量注入およびウイ
ルストランスフェクシ式ンが挙げられる。
遺伝子クローニングを行なった場合、一般的には、トラ
ンスフェクション前により大きな組換え体ＤＮＡ分子中
に選択した遺伝子を取り込む。そのようなより大きなり
ＮＡ分子は、好ましくは、該ｔＰＡ機能に加えて、少な
くとも、遺伝子選択マーカーからなる。該選択マーカー
は、トランスフェクションした宿主細胞において容易に
検出できる表現型変化を生じるいずれもの遺伝子または
複数遺伝子でありうる。そのような表現型変化は、例え
ば、ハイグロマイシンＢ耐性についての遺伝子のような
薬剤耐性でありうる。
薬剤メトトレキセイトおよび原核生物のジヒドロホレー
トリダクターゼ（ＤＨＦＲ）を用いた選択系をドロソフ
ィラ細胞とともに用いうる。該細胞の内因性真核生物Ｄ
）（Ｆ’Ｒは、メトトレキセイトにより抑制される。し
たがって、メトトレキセイトに対して非感受性である原
核生物ＤＨＦＲ含有プラスミドにて該細胞をトランスフ
ェクションし、かつ、メトトレキセイトにて選択するこ
とにより、該原核生物ＤＨＦＲにてトランスフェクショ
ンし、かっ、該原核生物ＤＨＦＲを発現する細胞のみが
生存する。
形質転換した哺乳動物および細菌細胞のメトトレキセイ
ト選択と異なり、ドロソフィラ系において、メトトレキ
セイトを用いて最初に高コピー数トランスフェクション
物を選択しうる。保護原核生物ＤＨＦＲ遺伝子を取り込
んだ細胞のみが生存する。付随して、これらの細胞は重
要な遺伝子発現ユニットを有する。
本発明において、２つのベクター系を用いてドロソフィ
ラ細胞中に問題の遺伝子産生物についての遺伝子発現ユ
ニットおよび用いる選択系についてのコーディング領域
を共トランスフェクションしうる。例えば、ベクターｐ
ＤＭＩ００およびｐＨＧＣＯからなるｐＤＭ１００発現
系を用いてｔＰＡについての該ＤＮＡコーディング配列
を含有する組換え体Ｓ２細胞を調製しうる。該ベクター
１）ＤＭ１００は、該プロモーターがドロソフィラから
のＨｓｐ７０熱衝撃プロモーターであるｔＰＡ遺伝子発
現ユニットからなる。Ｈｓｐ７０は、ドロソフィラ細胞
において遺伝子発現に対して都合がよいことが判明して
いるドロソフィラ熱衝撃プロモーターである（インボリ
アら、セル（Ｉ　ｎｇｏｌｉａ　ｅｔ　ａｌ、。
Ｃｅｌ　１）、２１，６６９（１９８０））。該ｐＨＧ
ＣＯベクターは、ＤＨＦＲ遺伝子発現ユニットからなり
、ｐＤＭ１００ベクターとともに共トランスフェクショ
ンされ、それにより選択に必要なりＨＰＲ遺伝子を提供
する。本発明のこの具体例のより完全な記載は、実施例
１に見出される。
本発明の第２の代表的態様は、ベクターｐＣＯＨＹＧＲ
ＯおよびｐＤＭｔＰＡからなるｐＣＯＨＹＧＲＯベクタ
ー系を用いるｔＰＡ遺伝子発現ユニットを用いる以外２
ベクター法を用いるｔＰＡの産生である。
ｐＣＯＨＹＧＲＯは、ハイグロマイシンＢ遺伝子発現ユ
ニットからなる。ｐＤＭｔＰＡは、メタロチオネインプ
ロモーターを用いたｔＰＡ遺伝子発現ユニットを含む。
ｐＣＯＨＹＧＲＯベクター系を用いるｔＰＡ遺伝子発現
ユニットは、選択のためのハイグロマイシンＢ耐性の利
点を最大限に活用することによりＳ、ドロソフイラ細胞
においてｔＰＡを産生ずる。この系と共に、抗生物質ノ
ｚ４グロマイシンＢを用いて、トランスフェクションし
たベクターを含有するそれらの細胞を選択しうる。
ウィグラーら（Ｗｉｇｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ、）、セル、
■、７７７（１９７９）により記載されているごとき方
法を用いて、該２ベクターをＳ、ドロソフイラ細胞中に
共トランスフェクションする。該ベクターを、所望の特
定のコピー数により、種々の割合にて共トランスフェク
ションする。ついで、該トランスフェクション細胞を例
えば、血清およびノ１イグロマイシンＢまたはメトトレ
キセイトのような適当な選択剤を含有するＭ３培地にお
いて選択する。
用いうる他の公知のドロソフイラ細胞培養系は、例えば
、血清不含細胞株であるに、Ｃ−０ドロソフイラ・メラ
ノガスタ−（Ｄ　ｒｏｓｏｐｈｉｌａ　ｉ＋ｅｌａｎｏ
ｇａｓｔｅｒ）細胞株である（シュルツら（Ｓ　ｃｈｕ
ｌｚ、ｅｔ　ａｌ、）、プロシーディンゲス・オブ・ザ
・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシーズ・オ
ブ・ニー・ニス・ニー・８３．９４２８（１９８６））
。該ＫＣ−０株を用いた予備的研究は、Ｓ、細胞を用い
るよりもトランスフェクションが困難であるということ
を示唆している。用いたもう１つの細胞株は、ドロソフ
ィラ・ハイディからの細胞株である。タンパク質発現は
、該ハイディ細胞株を用いて得ることができるが、この
細胞株中へのトランスフェクションは非常に低い効率で
しか発現しないトランスフェクションＤＮＡを生じうる
（シンクレアら。
モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Ｓ　
１ｎｃｌａｉｒ、ｅｔ　ａｌ、　、Ｍｏ１．　Ｃｅ１１
．　Ｂ　ｉｏｌ、）、　５　、３２０８（１９８５））
。
いったん適当なベクター系を構築し、該Ｓｔ細胞株中に
トランスフェクションしたならば、ｔｐＡの発現は、メ
タロチオネインプロモーターの場合にはカドミウムまた
はＨｓｐ７０プロモーターの場合には熱のような適当な
誘導剤の添加により誘導される。誘導後の該ｔＰＡコー
ディング配列の転写モニターしうる。
サザンプロット分析（マニアナイスら、モレキュラー・
クローニング、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボ
ラトリ−、コールド・スプリング・ハーバ−、ニューヨ
ーク（Ｍａｎｉａｔｉｓ、ｅｔ　ａｌ、、Ｍｏ１ｅｃｕ
ｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈ
ａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｇｏｌｄ　Ｓｐｒ
ｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ、Ｙ、）、　１９８２）を用
いて該ｔＰＡ遺伝子のコピー数を測定できる。
ノザンプロット分析（アニアティス、前記２０２頁）は
、該転写遺伝子配列の大きさに関する知見を提供する。
転写水準も定量しうる。約２　、４　ｋｂの特定のｔＰ
ＡｍＲＮＡを測定しうる。さらに組換え体細胞における
ｔＰＡの発現は、得られたタンパク質についてのウェス
タンプロット分析および活性試験により証明しうる。
本発明のＳ、細胞は、特に、タンパク質高収率産生に適
している。該細胞を室温（２４±１℃）にて懸濁培養中
に維持しうる。培地は、５〜ｌＯ％（ｖ／ｖ）熱不活性
化胎児ウシ血清にて補足したＭ。
である。本発明の好ましい実施態様において、培地は、
５％胎児ウシ血清を含有する。誘導後、該細胞を血清不
含培地にて培養する。ｐＣＯＨＹＧＲＯベクター系を用
いる場合、該培地を、また、３００μｇ／ｍＱハイグロ
マイシンＢにて補足する、この培地において、該Ｓ、細
胞を、５０〜６０ｒｐｍに攪拌しながら、例えば、２５
０ｍ１２〜２０００ｍＱ。
スピナー（ｓｐｉｎｎｅｒ）フラスコ中、懸濁培養にて
増殖しうる。細胞密度を、代表的には、１ｍｆ２当り１
０６〜１０７細胞に維持する。本発明の１つの実施態様
において、該細胞を、５％血清含有培地にて１５００ｍ
（２スピナーフラスコ中誘導前に増殖する。
細胞培養後、ｔＰＡを、モノクローナル抗体アフィニテ
ィカラムの使用などにより経時培地から単離しうる。他
の公知のタンパク質精製工程、例えば、金属キレート、
種々のアフィニティクロマトグラフィ一工程または吸着
クロマトグラフィーを用いて該培地からのｔＰＡを精製
できる。遺伝子産生物を直接培地中に分泌する細胞株Ｓ
、の使用は、本発明の重要な特徴である。培地中への直
接分泌は、効率的な１工程精製法の利用を可能にする。
ｔＰＡに向かうモノクローナル抗体カラムを用いる場合
、経時培地を直接該カラムに加えて、リン酸塩緩衝生理
食塩水中の１．５ＭＫＳＣＮを用いてｔＰＡを溶出しう
る。
該ドロソフィラ細胞系を用いて完全一本鎖ｔＰＡを作製
した。該アミノ末端の長形に対する短形の割合は、哺乳
動物系において見出されたそれと正反対であることが判
明した。予備ゲル移動試験は、ドロソフィラｔＰＡが、
また、グリコジル化において異なることを示している。
該ヒトｔＰＡは昆虫系において産生されているため、該
ｔＰＡは、ヒト、ハムスターまたはマウス汚染物質完全
不含である。さらに、ドロソフィラにて産生じたヒトｔ
ＰＡは、哺乳動物レトロウィルス不含である。
医薬等級ｔＰＡを得るためのそれ以上の精製法に付した
後、該ｔＰＡを、それぞれの投与単位が非毒性、すなわ
ち、顕著な有害副作用を示さず、かつ、動物、特に、ヒ
トに投与後血栓崩壊を生じるに有効な量のｔＰＡからな
るように医薬組成物中に処方する（ヨーロッパ特許出願
第０２１１５９２号）。代表的な心筋梗塞の治療用のそ
のような医薬組成物は、静脈内注射または点滴に適した
形態であり、医薬上許容される希釈剤または担体中の０
．１〜１０１ｇ／ａ＋１２のｔＰＡからなる。好適な希
釈剤および担体は、医薬組成物の調製法と同様、当業者
によく知られている。
先の記載および以下の実施例は、主に、ドロソフィラに
おけるｔＰＡの発現に関するが、本明細書において記載
した発現ベクターおよび２ベクタ一発現系は、ドロソフ
ィラにおいて他の遺伝子およびコーディング配列をクロ
ーニングし、かつ、発現するために用いることができる
。例えば、成長ホルモン、リンホカイン、ウロキナーゼ
、抗原または重要な他の遺伝子産生物についてのコーデ
ィング配列を遺伝子発現ユニットの範囲内でｐＤＭ１０
０またはｐＤＭｔＰＡのようなベクター中に挿入し、か
つ、１）ＨＧＣＯまたはｐＣＯＨＹＧＲＯ＋７）ような
ベクターと共にトランスフェクションしうる。ついで、
トランスフェクションした細胞を前記のように選択しう
る。
実施例 次に実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが、
これらに限定されるものではない。
実施例Ｉ Ｈｓｐ７０ベクターおよびＤＨＦＲ選択系を用いるｔＰ
Ａの発現 ベクターの構築； ｐＤＭＫΔ１１ Ｆロソフィラにおける遺伝子発現用の基本ベクターとし
て、β−ガラクタマーゼを含有するスモールｐ　ＢＲ３
２２ベクターであるＩ）ＭＬ２を用いた（メロンら（Ｍ
ｅｌｌｏｎ　ｅｔ　ａｔ、）、セル（ｃｅｌｌ）、２７
＋　２９７．　（１９８２））。このベクターを、該プ
ラスミドにおいて唯一の切断を形成するＳａｌ　ｒで消
化した。この部位に、ＳＶ４０初期プロモーター、つづ
いてガラクトキナーゼ遺伝子およびＳＶ４０初期ポリア
ゾニレ−ジョン部位を含有するＳａｌ　１カセツトを挿
入した。
該Ｓａｔ　ｒカセットは、ｐＤｓＰ［から得た（ブファ
ーら（Ｐｆａｒｒ　ｅｔ　ａｌ、）　、ディ”エヌーエ
イ　（ＤＮＡ）、４　：　４６１　（１９８５））。挿
入方向は、旧ｎｄｌおよびＢａｍＨＩを用いる精密制限
分析によって測定した。新規構築物ｐＤＭＫは、対向方
向に向かうガラクトキナーゼおよびβ−ラクタマーゼ遺
伝子用の転写単位を有する。ｐＤＭＫΔＨは、ＳＶ４０
初期プロモーターに対する５゛のｐ　ＢＲ３２２におけ
る旧ｎｄ［Ｉ［部位の欠失によって作製した。ｐＤＭＫ
をＨｉｎｄｌｌＩで消化し、該部位を末端補充しくマニ
アナイス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）、前記文献、１１３頁）
、該ベクターを再連結した。この場合１）ＤＭＫΔＨは
、ＳＶ４０初期プロモーターおよびガラクトキナーゼ遺
伝子の間に位置する唯一の旧ｎｄｌｌＩ部位を有する。
と賭則針 ｐ　ＤＭＫΔＨを、ＳＶ４０初期プロモーターを切断す
るＳｍａ　ｒおよび旧ｎｄＩＩＩで消化した。Ｈｉｎｄ
ＩＩＩ部位を末端補充し、ドロソフィラＨＳＰ７０プロ
モーターフラグメントをこのベクターに挿入した。
使用フラグメントは、ｐＤＭ３０１のＸｂａ　Ｉおよび
ＸｍｎＩ消化によって得られる４６０ｂｐフラグメント
であった（マツクガリーら（ＭｃＧａｔｔｙ　ｅｔ　ａ
ｔ、）　、セル、４２　：　　９０３　（１９８５））
。このフラグメントは熱誘導に対する調節配列であると
考えられるものを含有している。該フラグメントを末端
補充し、Ｓｍａ　Ｉ　。
ＨｉｎｄＩ［［切断ベクターに連結した。
連結ＤＮＡをＥ、ｃｏｌｉ中に形質転換し、所望プラス
ミドを含有するコロニーを、ＨｉｎｄＩ［ＩおよびＸｈ
ｏ　ＩでのＤＮＡのミニ調製の精密制限により同定した
。
餅鮭用 ｐ　ＤＭＫＨＳＰをＸｂａ　Ｉで切断し、ついで末端補
充し、最後に旧ｎｄｎｌで切断した。これはガラクトキ
ナーゼ遺伝子を切除する。ｔＰＡコーディング配列を、
ｔＰＡのプレプロペプチド（ｐｒｅｐｒｏｐｅｐｔ　１
ｄｅ）および全コーディング配列を有する旧ｎｄｎＩ−
Ｂａｌｌフラグメント上のジュロイニングら（Ｓｃｈｌ
ｅｕｎｉｎｇ　ｅｔａｌ、）の前記文献から得られるｃ
ＤＮ＾ＤＮＡンから単離した。このフラグメントを切断
ｐ　ＤＭＫＨ８Ｐベクターに挿入した。連結ＤＮＡをＥ
、ｃｏｌｉ中に変質転換し、酵素ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｂａ
ｍＨＩおよびＸｂａ　Ｉでの制限によって正確なプラス
ミドを同定した。すべての制限に関する条件は、製造業
者にューイングランド・バイオラプス（Ｎｅｗ　Ｅｎｇ
ｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）によって推奨されているご
とくである。
ドロソフィラＳ、細胞へのトランスフェクションｐＤＭ
１００を、Ｃ０ＰＩＡ　５−ＬＴＲによって駆動される
Ｅ。
ｃｏｌｉ由来原核生物ＤＨＦＩｉ遺伝子を含有するプラ
スミドであるｐＨＧＣＯと一緒に、Ｓ、ドロソフィラ細
胞に共トランスフェクションした（ボウロウイスら（Ｂ
ｏｕｒｏｕｉｓ　ｅｔ　ａｌ、）、ＥＭＢＯ１２：　１
１０４、　（１９８３））。該トランスフェクション方
法は、実質上、ウィグラーら（Ｗｉｇｌｅｒ　ｅｔ　ａ
ｌ、）、セル、１６：７７７、（１９７９）によって記
載されている。２０μｇのプラスミドＤＮＡｐＤＭ１０
０およびｐＨＧＣＯを、３Ｘ１０＠細胞に必要なコピー
数に依存して種々の割合にて共トランスフェクションし
、沈澱物を１８時間細胞上に放置した。ついで該細胞を
洗浄し、４８時間増殖させ、ＤＨＦＲの発現を行った。
細胞をスピンダウンし、２ＸｌＯ−７Ｍのメトトレキセ
イトを含有する培地中に懸濁させ、ＤＨＦＲ遺伝子を発
現する形質転換体を選択した。６週間選択後、安定な形
質転換体か得られた。
耐性細胞を、血清不含Ｍ、培地中、５Ｘ１０’細胞／ｒ
ａＱの密度で接種した。培地を集め、ｔＰＡ蛋白質の存
在について検定する前に、該細胞を３日間ｔＰＡ発現さ
せた。実質的に、ピットナーら（Ｂｉｔｔｎｅｒ、ｅｔ
　ａｌ、）、アン・バイオケム（Ａｎｎ、Ｂｉｏ−ｃｈ
ｅｍ、）、１０２　：　５４９、（１９８０）によって
記載されているようなウェスタン分析は、高分子量のｔ
ＰＡ蛋白質の存在、すなわち、該蛋白質が一本鎖ｔＰＡ
について予想分子遣（約７０ｋｄ）を有することを示し
た。ｔＰＡ蛋白質が発現され、かつ活性であるというこ
とを、５２２５１活性検定、ランビーら（Ｒａｎｂｙ、
ｅｔ　ａｌ、）、トロンボシス・リサーチ（Ｔｈｒｏｍ
ｂ。
Ｒｅｓ、）、２７　：　７４３　（１９８２）を用いて
確認した。
ｔＰＡ産生ポリクローナル細胞のサザーン分析は、それ
らが１細胞当たりｔｏｏｏコピーまでのｔＰＡ遺伝子発
現ユニットを含有し、ｔＰＡ遺伝子発現ユニットが増幅
し、頭−尾パターンの宿主染色体に組み込まれることを
示した。
実施例２ ハイグロマイシンＢ選択系を用いるｔＰＡの発ベクター
の構築： ｐＵｃＯＰＩＡ ドロソフィラにおける遺伝子発現用の基本クローニング
ベクターとして、ＢａｍＨＩおよびＳｍｚ　Ｉ　ｆＸ位
を有するｐＵｃｌｇを用いた。組込みＣ０ＰＩＡ成分か
らの５−　ＬＴＲ（３５７塩基対）を、ベクターｐＵｃ
１８のＢＡＭ旧部位にクローニングし、ｐＵｃＯＰＩＡ
と称するベクターを得た。Ｃ０ＰＩＡは、ドロソフィラ
ゲノム中に散在していることが判明している分散中位反
復配列の代表的構成員である（ルピンら（Ｒｕｂｉｎ、
　ｅｔＢｌ、）、コールド・スプリング・ハーバ−・ン
ンブ・キュアント・バイオ口（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ
　Ｈａｒｂｏｒ　Ｓｙｍｐ。
Ｑｕａｎｔ、Ｂｉｏｌ、）　４５　：　　６１９　　（
１９８０））。
ｐｃＯＨＹＧＲ。
ベクターｐＵｃＯＰＩＡをＳｍａ　Ｉ部位で切断し、ハ
イグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（ハイグロ
マイシンＢカセット）に関するＥ、ｃｏｌｉ遺伝子コー
ディングを、標準的クローニング法を用い、ｐＵｃＯＰ
ＩＡ中にクローンした。ハイグロマインンＢカセットを
、ベクターＤＳＰ−ハイグロからの１４８１塩基対の旧
ｎｄＩ［［−ＢａｍＨＩ上で単離した（ゲルツら（Ｇｅ
ｒｔｚ、ｅｔ　ａｌ、）、ゲネ（Ｇｅｎｅ）、２５　：
　１７９　（１９８３））。ハイグロマイシンＢカセッ
トは、ハイグロマインンＢホスホトランスフェラーゼ遺
伝子およびＳＶ４０初期ポリＡ部位についてコードする
配列を有する。ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨ１部位を
、’ｒ　、ＤＮＡポリメラーゼを用いて充足し、該ハイ
グロマイシンＢカセットをベクターｐＵｃＯＰＩＡのＳ
ｍａ　Ｉ部位に連結した。
ｐＤＭｔＰＡ β−ガラクタマーゼ遺伝子を含有するプラスミドｐＢＲ
３２２を、基本ベクターをして用いた。ラストフスキー
−ぺり−ら（Ｌａｓｔｏｗｓｋｉ−Ｐｅｒｒｙ、ｅｔ　
ａｔ、）、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミス
トリイ（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）、２６０　＋　１
５２７　（１９８５）のメタロチオネインプロモーター
を、ＥｃｏＲＩＳｔｕ　Ｉフラグメント上で単離し、該
プレペプチドを含有する全ｔＰＡ遺伝子の館のｐＢＲ３
２２に挿入した。ＳＶ４０初期ポリＡ部位が該ｔＰＡ遺
伝子に続く。
ドロソフィラＳ、細胞へのトランスフエクショと ｐＣＯＨＹＧＲＯを、ドロソフィラメタロチオネインプ
ロモーターの調節下、ｔＰＡ遺伝子を保持するｐＤＭｔ
ＰＡと一緒にＳ、ドロソフィラ細胞中に共トランスフェ
クションした。該トランスフェクション細胞を、３００
μｇ／ｍ（ｌのハイグロマイシンＢを有する血清含有Ｍ
３培地において選択した。同一条件下にて２〜３日後、
非トランスフェクション細胞は分割を停止し、死滅し始
める。トランスフェクション培養中、安定した増殖ハイ
グロマイシンＢ耐性細胞を得るための選択期間は約２な
いし３週間である。種々のコピー数のｔＰＡ遺伝子をそ
の染色体に組み込ませた培養を得るために、２種のベク
ターの割合を、第１表に示すようにトランスフェクショ
ンにて変えた。
第１表 ｐＤＭｔＰＡ　　ｐｃＯｌ（ＹＧＲＯ単離ポリ　　およ
そのコピー数りローナ　ハイグロマイ　ｔＰＡ ル培養　　ンンＢ遺伝子　（区五 １０ｍｇ　　１０ｍｇ　　　　Ａ　　　　５０〜１００
　　３０〜４０１８ｍｇ　　　２ｍｇ　　　　Ｂ　　　
　５０〜１００　　　１５０２０ｍｇ　　０．２ｍｇ　
　　　０　　　　５０〜１００　　２０００ＩＯμＭの
カドミウムでメタロチオネインプロモーターを誘導した
後、ｔＰＡの発現を確認した。
ノーザンプロット分叶により、約２．４ｋｂの特異的ｔ
ＰＡ　ｍＲＮＡを検出した。同時に、誘導細胞培養から
の時間の経過した上清のウェスタンプロット分析は、約
７０ｋｄにて単−ｔＰＡ帯を示した。
細胞上清におけるｔＰＡ濃度を、５２２５１活性試験を
用いて測定した。５ＸｌＯ”細胞を、血清不含Ｍ３培地
１ｍＱに接種し、３ないし４日間誘導した。上清におい
て測定したｔＰＡ濃度を第２表に示す。
１」 ポリクロ−非誘導細胞　　　誘導細胞 九に隻策−ｘ那／皇ひ−島ＶｊＯ Ａ　　　　　　１６０　　　　　５００Ｂ　　　　　　
　９９　　　　１５００Ｇ　　　　　　　８５　　　　
１３０’０対照ｐＣＯＨＹＧＲＯ　　　　　０　　　　
　　　０標準的軟質寒天クローニング法を用いたポリク
ローナル培養Ｂから誘導した２種の単一クローン培養と
共にポリクローナル培養Ｂのスケールアップは、第３表
に示すようにｔＰＡ産生において有意な増加をもたらし
た。
第３表 細胞培養　　　コピー数　　　ｇ／ｎ＋２（３日後）ポ
リクロ−１００〜　　　１４〜２０ ナル培１Ｂ　　　　　１５０ 単一クローンＴ　　　３０　　　　３〜１２単一クロー
ンＩ　　　１５０　　　２２〜３７２５０ｄ〜２０００
ｍ１２のスピナーフラスコにおいて、細胞を懸濁培養と
して維持した。培地は、３００μＭのハイグロマイシン
Ｂを補足したＭ３を用いた。培養は２４±１℃にてイン
キュベートし、５０〜６０　ｒｐｍで撹拌した。細胞密
度は、一般的に、１ｍ１２当たり１０＠および１０７間
の細胞を維持した。
誘導については、細胞を、低速遠心分離によって収穫し
、ハイグロマイシンＢを補足したＭ３培地において、１
ｍ１２当たり５Ｘ１０＠細胞の密度で再懸濁させた。塩
化カドミウムをｌＯμＭの最終濃度まで添加し、該培養
を、ｔＰＡを収穫する前に血清不含培地において、３な
いし４日間増殖させた。
実施例３ 調節細胞培地からのｔＰＡの精製 ＰＡＭ−２セファＣ７−ス（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｘア
メリカン・ダイアグツステイカ、グリーンウィッチ、コ
ネチカフト州（ＡＩｌｌｅｒｉｃａｎ　Ｄｉａｇｎｏｓ
ｔｉｃａ、　Ｇｒｅｅｎｗｉａｈ、　Ｃｔ、）は、セフ
ァ０−ス４Ｂに結合したｔＰＡモノクローナル抗体であ
る。Ｐ　ＡＭ−２セファロース５ｍρ（１カラム容量当
たり約１０ｍｇのモノクローナルｔＰＡ抗体）を、ｌＸ
６ｃｍカラムに移し、２Ｍ　ＫＳＣＮを用いて５−７時
間の速度にて一夜洗浄し、ゆるく結合したモノクローナ
ル抗体を除去した。洗浄後、リン酸塩緩衝セライン（Ｐ
Ｉ３Ｓ）５０ｍｆ２を、該カラムに通し、該ゲルを平衡
にした。
誘導ドロソフィラ細胞（１リツトル）からの滅菌濾過し
た調節培地を、０　、８　ｍ１２／　ｍｉｎの速度にて
ゆっくりと該カラムに通した。ついで、該カラムを、０
　、８　ｍＮ／ｎ＋ｉｎの速度にてＰＢＳ３０ｍｉ７．
つづいてＰＢＳの０．５Ｍ　ＫＳＣＮ３０ｍ１２で洗浄
した。該ｔＰＡを１．５Ｍ　ＫＳＣＮつづいて２．０Ｍ
　ＫＳＣＮ３０ｍ１２を用い、０．８ｍＱ／ｍｉｎの流
速で溶出した。９０％以上のｔＰＡが、１．５Ｍ　ＫＳ
ＣＮで一本のピークにて溶出した。しっかりと結合して
いるいずれの残ｔＰＡをも溶出するために２．０ＭＫＳ
ＣＮで溶出した後、該カラムをＰＢＳ３０ｍｅで洗浄し
、ついでＰＢＳの０．０１％ナトリウムアジド中に貯蔵
した。
ドロソフィラ細胞において産生したｔＰＡの分析は、誘
導期間での細胞密度と産生じたｔＰＡ量の間に直接相関
関係を示した。密度５Ｘ１０’におけ企細胞誘導が、培
地中に分泌されるｔＰＡの濃度を大いに増加させること
が判明した。
権鼠 ｔＰＡ１度は、ＨＰＬＣ１Ｓ２２５１検定、製造業者（
バンデックス研究所、インコーホレイテッド、マンプラ
イン、イリノイ州（Ｐａｎｄｅｘ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｉｅｇ、　　Ｉｎｃ、　Ｍｕｎｄｅｌｅｉｎ、　　ｌ１
ｌ）によって提供されるプロトコルに従って行う粒子蛍
光イムノアッセイ（ＰＣＦＩＡ）、および実質的に製造
業者（アメリカン・ダイアグノステヵ）によって提供さ
れるプロトコルにおける記載のように実施する酵素イム
ノアッセイ（Ｅ　Ｉ　Ａ）を包含する種々の標準検定を
用いて測定した。
５２２５１検定を用いた場合、精製ｔＰＡの活性は、少
なくとも哺乳動物細胞における発現で報告されている最
高値と同じ強度であることが判明した。
前記記載および実施例は、その好ましい具体例を含め、
本発明を十分に開示している。記載方法の変形は分子遺
伝学および関連分野における当業者にとっては明らかで
あり、前記本発明の範囲内にある。
特許出願人　スミスクライン・ベックマン・コーポレイ
ション

Claims (20)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）ｔＰＡ遺伝子発現ユニットにてトランスフェクシ
    ョンしたドロソフィラ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞を
    培養してｔＰＡを発現し、かつ、分泌し、および該分泌
    ｔＰＡを収集することを特徴とするドロソフィラ細胞に
    おけるｔＰＡの産生方法。
  2. （２）該ｔＰＡ遺伝子発現ユニットを組込み、かつ、１
    細胞当り１０〜１０００コピーにて該ドロソフィラ細胞
    中に存在する前記第（１）項の方法。
  3. （３）２ベクター系を用い、そのうちの一方のベクター
    が原核生物ＤＨＦＲについてのコーディング配列を挿入
    し、もう一方のベクターがｔＰＡ遺伝子発現ユニットに
    ついてのコーディング配列を挿入している前記第（１）
    または（２）項の方法。
  4. （４）該ドロソフィラ細胞を該ｔＰＡ遺伝子発現ユニッ
    ト含有ベクターｐＤＭ１００およびベクターｐＨＧＣＯ
    にて共トランスフェクションした前記第（３）項の方法
    。
  5. （５）２ベクター系を用い、そのうちの一方のベクター
    がハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼについ
    てのコーディング配列を挿入し、もう一方のベクターが
    ｔＰＡ遺伝子発現ユニットについてのコーディング配列
    を挿入している前記第（１）または（２）項の方法。
  6. （６）該ドロソフィラ細胞を該ｔＰＡ遺伝子発現ユニッ
    ト含有ベクターｐＤＭｔＰＡおよびベクターｐＣＯＨＹ
    ＧＲＯにて共トランスフェクションした前記第（５）項
    の方法。
  7. （７）該ドロソフィラ細胞がＳ＿２細胞である前記第（
    １）、（４）または（６）項の方法。
  8. （８）ｔＰＡを少なくとも６μｇ／ｍｌの濃度にて該経
    時（ｓｐｅｎｔ）細胞培地中に分泌する前記第（１）項
    の方法。
  9. （９）該遺伝子産生物についての遺伝子発現ユニットを
    含有するベクターおよび組込んだＣＯＰＩＡ成分からの
    ５′ＬＴＲおよびハイグロマイシンＢホスホトランスフ
    ェラーゼまたはメトトレキセイト耐性選択マーカー含有
    ベクターにてドロソフィラ細胞を共トランスフェクショ
    ンし、該遺伝子産生物が発現するような条件下にトラン
    スフェクションした細胞を培養し、および該遺伝子産生
    物を収集することを特徴とするドロソフィラにおける異
    種遺伝子産生物の発現方法。
  10. （１０）該ベクターを該遺伝子発現ユニット中のメタロ
    チオネイン調節領域およびＤＨＦＲについてのコーディ
    ング配列にて構築した前記第（９）項の方法。
  11. （１１）該ベクターを該遺伝子発現ユニット中のメタロ
    チオネイン調節領域およびハイグロマイシンＢホスホト
    ランスフェラーゼについてのコーディング配列にて構築
    した前記第（９）項の方法。
  12. （１２）ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ
    耐性を用いた選択系が、該遺伝子産生物を発現する細胞
    の共選択を許容する前記第（９）項の方法。
  13. （１３）ドロソフィラ細胞中に共トランスフェクション
    したベクターがｔＰＡ遺伝子発現ユニットを含有してい
    る前記第（１２）項の方法。
  14. （１４）該ベクターがｐＣＯＨＹＧＲＯおよびｐＤＭｔ
    ＰＡである前記第（１３）項の方法。
  15. （１５）メトトレキセイト耐性を用いたＤＨＦＲ選択系
    が該遺伝子産生物を発現する細胞の共選択を許容する前
    記第（９）項の方法。
  16. （１６）ドロソフィラ細胞中に共トランスフェクション
    したベクターがｔＰＡ遺伝子発現ユニットを含有する前
    記第（１５）項の方法。
  17. （１７）該ベクターがｐＤＭ１００およびｐＨＧＣＯで
    ある前記第（１６）項の方法。
  18. （１８）ｔＰＡについてのＤＮＡコーディング配列また
    はその活性変異体ならびにドロソフィラ細胞内でのｔＰ
    Ａコーディング配列についての転写およびその後の翻訳
    に必要な調節要素からなることを特徴とするｔＰＡ遺伝
    子発現ユニット。
  19. （１９）組換え体ドロソフィラ細胞により産生されたｔ
    ＰＡ。
  20. （２０）非毒性有効量の前記第（１９）項のｔＰＡおよ
    び医薬担体からなることを特徴とするヒト患者の血栓崩
    壊に有効な医薬組成物。
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