JPS633793A - Ｉｘ因子の発現を確実にする真核細胞内組込みベクタ−、得られた細胞系、およびこれらの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明はヒトの■因子もしくはこれに類似する分子を組
織的に生産する細胞系を得ることに関するものである。

（従来の技術） 本出願人は先願、特に国際出願Ｗ　Ｏ８５０５３７８号
明細書およびＷ　Ｏ８５０５１２５明細書において、■
因子の生産が可能となるように宿主細胞を形質転換する
方法を記載した。

■因子とは血液凝固サイクル中に介在する蛋白質であり
、血友病Ｂの治療に使用されている。現在、■因子の唯
一の入手源はヒトの血漿である。

血漿からの抽出によって得た■因子の調製物は発熱性の
ものとなることがあり、また特に肝炎ウィルスもしくは
ＡＩＤＳ媒介物のような病原体もしくはウィルスによっ
て汚染される危険性もある。

このため、ヒトもしくは動物の血漿からの抽出を行なわ
ない方法で極めて高純度の■因子を製造することは特に
興味深いことである。

前記明細書は細菌、酵母もしくは動物細胞のような宿主
から■因子を製造する方法を記載しているため、前述の
問題に対する部分的な回答を提供するものとなっている
。

（発明が解決しようとする問題点） 本発明は■因子を生産する安定な細胞系を得ることを可
能にする組込みベクターとなるような、前述のものとは
異なったタイプのベクターを提供することを目的とする
ものである。

（問題点を解決するための手段および作用効果）本発明
は特に真核細胞内組込みベクターを提供するものである
。これらのベクターは前記細胞内における■因子もしく
はこれに類似する蛋白質の発現を確実にするＤＮＡ配列
を含んでおり、少なくとも ■因子もしくはこれに類似する蛋白質のためのコードと
なるＤＮＡ配列、 前記ＤＮＡ配列のマルチコピー形状での組込みを確実に
する要素、および 組込み後に前記細胞内において■因子もしくはこれに類
似する蛋白質のためのコードとなるＤＮＡ配列の発現を
確実にする要素からなることを特徴とするものである。

「組込みベクター」とは、好ましくは哺乳動物細胞であ
る真核細胞のゲノム内に組込まれる１つもしくは複数の
プラスミドを意味する。

本明細書中において「■因子に類似する蛋白質」とは−
般に、■因子と同じタイプの生体内（ｉｎｖｌｖｏ　）
生物学的活性もしくは■因子に類似した活性を有する蛋
白質を意味する。例えば、これはいくつかのアミノ酸に
関して何らかの変化があることを除いて■因子と同一の
構造を有する蛋白質あるいは、場合によっては、完全な
分子の主要な活性を有する■因子フラグメントとするこ
とができる。

■因子のためのコードとなるＤＮＡ配列は前述の先願明
細書に記載されているが、完全な■因子のためのコード
となるＤＮＡ配列はペプチド信号に加えてプレ蛋白質配
列を含んでいることを想起することが好ましい。実施例
において示されるように、■因子のためのコードとなる
ＤＮＡ配列としては全配列すなわち配列信号およびプレ
蛋白質を用いることが好ましい。特に、５′末端のこれ
らの配列は３つのＡＴＧを含んでおり、実施例によれば
、これら３つのＡＴＧは同時に存在させる必要はないが
、これらの存在によって■因子発現は助成されることが
明らかになった。

■因子遺伝子を有するクローンの製造方法はここで詳述
しないが、前述の先願明細書を参照すれば実施すること
ができるであろう。

■因子のためのコードとなるＤＮＡ配列のマルチコピー
形状での組込みを確実にする配列は様々な種類のものと
することができるが、より好ましくはマウス由来のミト
コンドリアＤＮＡ配列、特にｐΔと命名されたプラスミ
ドが有するこのタイプの配列とすることができる。

■因子遺伝子の多数の複製物を含んだ細胞を得るために
は、例えばそれぞれミコフェノール酸およびメトトレキ
セートの一方に対する耐性を付与するＸＧＰＲＴ遺伝子
もしくはＤＨＰＲ遺伝子のような化学物質耐性遺伝子を
組込みベクターに存在させておくことが好ましい。

これらの様々な遺伝子は宿主細胞内に発現するそれらに
固有の要素を含むものとすることができる。この要素は
、例えば２型アデノウィルスの最晩熟プロモーターもし
くはＳＶ４０の早熟プロモーター等、ＳＶ４０もしくは
アデノウィルスのブロモ、−ターのようなウィルス由来
のプロモーターとすることができる。しかしながら、あ
るタイプの組込みにおいては、これらの遺伝子を直接、
染色体プロモーターの支配下に置くことも可能であり、
この場合にはプラスミドベクター内におけるプロモータ
ーの使用を省略することができる。

これらの遺伝子、特に■因子遺伝子はその３′末端がイ
ントロンおよびポリアデニル化位で補完されていること
が好ましく、これらは例えばウサギβ−グロビンのイン
トロン１およびウィルス５ｖ４０のＴ抗原のポリアデニ
ル化信号とすることができる。

ベクター内に導入すべきＤＮＡ配列が非常に大きな寸法
のものである時には組込みベクターを二分割しなければ
ならない場合もある。この場合には組込みベクターは単
一のプラスミドによって構成されるのではなく、少なく
とも化学物質耐性遺伝子を有する一方のプラスミドと■
因子もしくはこれに類似する蛋白質のコードとなる遺伝
子を有する他方のプラスミドからなる、共に組込み要素
を含んだ２つのプラスミドによって構成される。

本発明による組込みベクターの他の実施態様においては
、ベクターはポリシストロニック１ＲＮＡを導くための
ものと考えられており、この場合、ベクターは■因子も
しくはこれに類似する蛋白質のためのコードとなるＤＮ
Ａ配列および該ＤＮＡ配列に続く化学物質耐性遺伝子を
含んでいる。この場合、既に何度も繰返し証明されたよ
うに、リポソームは終結コドンの下流において翻訳を再
開させることができ、この結果、プロモーター、■因子
遺伝子、選択遺伝子、イントロンおよびポリアデニル位
を備えたポリシストロニック選択ブロックを含むプラス
ミドを構成することができる。

また、本発明は■因子もしくはこれに類似する蛋白質を
生産する細胞系を得るための真核細胞の製造方法を提供
する。この方法は本発明の組込みベクターによってこれ
らの細胞のトランスフェクションを行なうことを特徴と
するものであり、この組込みベクターは単一のプラスミ
ドからなるものとしてもよく、また前述のように１対の
プラスミドからなるものとしてもよい。

使用するトランスフェクション方法としては、特に後述
の実施例で用いられたようなリン酸カルシウム共沈法を
挙げる必要がある。

さらに、本発明は本発明の方法によって得られた■因子
を生産する細胞系、特にＣＨＯ系を提供するものであり
、また、これらの細胞を適当な培地で培養し、この培地
から■因子を回収することからなる■因子の製造方法を
提供するものである。

さらに、本発明は前述の方法を用いて得た■因子に関す
るものである。

（実　施　例） 以下、図面を参照して、本発明の他の特性および効果を
実証する実施例につき説明する。

特記しない限り、例えば酵素のような実施例中に用いら
れる様々な手段は供給者が勧める条件で用いた。

ベクター ベクターはプラスミドｐΔ（Ｇ、　　Ｌｕｔｆａｌｌａ
　ｅｔｃｏｌｌ、ｓｏｍａｔｉｃ　　Ｃｅ１ｌ　ａｎｄ
　Ｍｏ１．　Ｇｅｎｅｔ、１１，２２３−２３８．１９
８３）に由来するものであった。このプラスミドはプラ
スミドを哺乳動物細胞のゲノム中に数百側の反復コピー
として組込むことを可能にするマウスミトコンドリアＤ
ＮＡ配列を含んでいる。

このプラスミドはさらにＳＶ４０の早熟プロモーターの
支配下にある細菌由来のキサンチンーグアニンフォスフ
ォリボシルトランスフエラーゼ（ＸＧＰＲＴ）遺伝子を
有しており、ミコフェノール酸耐性に関する選択マーカ
ーとして用いることができる。

実施例１ ■因子発現ブロック　によるＸＧＰＲＥ遺伝子の置換 ＳＶ４０の活性化配列および２型アデノウィルスの最晩
熟プロモーターの一部を含むｐｓＶＢＩＡ３４　（Ｒｏ
Ｈｅｎｅｔ、ｃｏｌｌ、ＰＮＡＳ　７９．７Ｌ３２−７
１８６　）のＥｃｏＲＩ−ＢａｉＨＩフラグメントをベ
クターｍ１３　ＴＧ１２７内でＥｃｏＲｌ位およびＢａ
ｌＨＩ位の間においてクローン化し、クローンｍＴＧ３
９４を得た。ｍＴＧ３９４のＤＮＡをＥｃｏＲｌおよび
ＢａｍＨＩによって消化させ、次いでＥｃｏＲｌおよび
ＢｇｌＩＩによって切断されたｐ　Ｔ　Ｇ　１５７内で
クローン化し、この結果、ＴＫプロモーターをハイブリ
ッドプロモーターで置換した（ｐＴＧ３９５）。

次いでｐ　Ｔ　Ｇ　３９５をＥｃｏＲＩおよび５ａｉｌ
によって消化させ、発現ブロック（プロモーター、イン
トロン、ポリアデニル化位）を、予めＥｃｏＲＩおよび
５ａｉｌにより消化させたｐΔ内でクローン化し、この
結果、選択遺伝子ＸＧＰＲＴを除去した（ｐＴＧ３８７
）。■因子のｃＤＮＡは、■因子のｃＤＮＡの全コード
配列とｃＤＮＡの非コード３′配列のｃＤＮＡの２番目
のＸｈｏｌｌ位までの一部分を含んでいるｍＴＧ３１２
をＸｈｏｌｌによって部分的に消化させたものに由来す
るものであり、ｐ　Ｔ　０３８７のＢａｌＨＩ位におい
てクローン化した（ｐＴ０３８Ｂ）。プラスミドｐ　Ｔ
　Ｇ　３８５はｐ”ｒｃ３８７のＢａｌＨＩ位にｍ　Ｔ
　Ｇ　３１５のＢａ５ａｌフラグメントを挿入すること
によって得た。

ｐ　Ｔ　０３８８とｐ　Ｔ　０３８５との間には２つの
相違点が存在する。非コード３′位はｐ　Ｔ　Ｇ　３８
Ｇよりもｐ　Ｔ　Ｇ　Ｓ８５の方が長いが、５′末端は
特に異なっている。すなわち、ｐＴＧ１８５の５′末端
配列ハＧＡＴｃ　　ＡＴＧ　　ＣＡＧ　　ＣＣＣＧＴＧ
　　ＡＡＣＡＴＧＡＴＣＡＴＧ−・・であるのに対し、
ｐＴＧ３８ＢのそれはＧＡＴＣＣＣＴＣＣＴＧ　　ＧＡ
Ａ　　ＣＡＴに　　ＡＴＣＡＴＣである。これらの配列
は■因子のｃ　ＤＮＡの配列：ＡＴＧ　　ＣＡＧ　　Ｃ
ＧＣＧＴＧ　　ＡＡＣＡＴＧＡＴＣＡＴＧ・・・と対照
し得るものである。

第１図はこれらの構成を示す模式図である。

このように、ｐ　Ｔ　Ｇ　３８５は全ｃＤＮＡのための
コードとなるのに対し、ｐＴＧ８８Ｂは２っめのコドン
ＡＴＧからのみ翻訳開始を可能にする。したがって、こ
れら２つの構造体は、■因子を最適に生産するためには
どの翻訳開始コドンを用いるべきかを明らかにし得るも
のである。

次いで、これらのプラスミドをＣＩＯ細胞内に移した。

そして、ｌＯμ９のｐＴＧ３８５　　（もしくはｐＴＧ
３８８）を０．１μ９のプラスミドｐΔと混合し、次い
でカルシウム共沈の古典的方法を用いて共沈させた。こ
れらの実験においては共沈をＤＮＡ担体の不在下で行な
い、細胞内への移動４８時間後、細胞をトリプシン処理
し、新しい容器に移して１１５に希釈した。ここから選
択培地を使用した。

この選択培地はヒポキサンチン（１５１Ｆｊ９／ｌ）　
、チミ’；　ン（１０＃Ｉ９／　ｉ）　、キ”ｊ−ン＋
＞　（２５０１１９／　ｌ）、アミノプテリン（２０Ｉ
ｎｇ／免）　、ミコフェノール酸（２５１１Ｉｇ／９Ｊ
）および１０％の透析ウシ胎児血清を加えたα２゜ｏ０
培地である。

次いで、分離された各クローンについて１０”個の細胞
が２４時間内に生産する■因子（ｎｇ）を測定した。

その結果を下表に示す。

生産された■因子の量　　０　０−１０１０−２０２０
−３０３０−４０４４０−５０（ｒｉ／１０１ｉ細胞／
２４ｈ） ■因子を生産する クローンの数 ｐＴＧ８８６　　　　　　４　０　　３　　１　　０　
　０ｐＴＧ３８５　　　　　　５０　　２　　０　　０
　　１生産された■因子の量　５０−６０８０−７０７
０＝８０８０−９０９０−１００１００−１１０クロー
ンの数 ｐＴＧ３８８　　　　　０　　０　　０　　０　　０　
　　０ｐＴＧ３８５　　　　　０　　１　　０　　０　
　０　　　２以下の２つの結論を引き出すことができる
。

１）ｐΔ由来のベクターによれば直ちにｌｏｏｎｇ／１
０’細胞７２４時間の発現レベルを得ることができる。

２）最初のＡＴＧイニシエーターを削除するよりも■因
子のｃＤＮＡの全配列を使用することが好ましい。

実施例２ リポソームが終結コドンの下流における翻訳の再開を可
能にさせるということは何度も繰返し実証された。この
特性はプロモーター、■因子遺伝子１選択遺伝子、イン
トロンおよびポリアデニル部位からなるポリシストロニ
ック選択ブロックを含むプラスミドを構成するのに用い
ることができる。ここでは、２つの選択遺伝子すなわち
ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＰＲ）のためのコード
となるマウス遺伝子および細菌由来のＸＧＰＲＴ遺伝子
を用いた。

ａ）　　ＩＸ因子およびＤＨＰＲをコードする配列を構
成するポリシストロニツタメッセンジャーのためのコー
ドとなるプラスミド マウス　ＤＨＰＲのｃＤＮＡを含むＨｉｎｄ　ｍ−Ｂｇ
！■フラグメントをｐＭＴＶｄｈｆｒ　（Ｌｅｅ　ｅｔ
　ｃｏｉｌ、　Ｎａｔｕｒｅ　　２９４．２２８−２８
２．１９８１）から分離し、次いでｐＴ　Ｇ　３８Ｂの
対応する部位間においてクローン化した。得られた組換
え体をｐＴＧＤＨ３８Ｂと命名したが、これは２型アデ
ノウィルスの最晩熟プロモーターに連結されたウィルス
ＳＶ４０の活性化配列、■因子のｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ　ｒ　
マウスＤＨＦＲのｃＤＮＡ。

ウサギβ−グロビン遺伝子のイントロンおよびウィルス
ＳＶ４０のＴ抗原のポリアデニル化信号から構成された
転写ユニットが含まれている。リン酸カルシウムを用い
たＤＮＡ共沈法によって組換え体ｐＴＧＤＨ３８ＧをＣ
ＨＯ細胞（Ｄ　ＨＦ　Ｒ’″）内に移した。直径１０口
のペトリ皿に５μびのｐＴＧＤＨ３８８を使用したが、
この中には５Ｘ１０５個の細胞が含まれていた。これら
の細胞にＤＮＡ沈殿物をよ接触させてから２４時間後に
培地を吸引し、ＰＢＳで細胞を洗浄し、１０％の透析胎
児血清を加えたα２゜ｏ０選択培地を細胞に添加した。

選別の１か列後に、２５個のクローンを再採取し、ＥＬ
ＩＳＡ試験により■因子生産量をｎＪ定した。

下表に、１０６個の細胞によって２４時間内に培地内に
分泌された■因子の量をｎｇで表わした結果を要約した
。

生産された■因子の量　　０　０−２０２０−４０４０
−６０８０−８０８０−１００■因子を生産する クローンの数 生産された■因子の量は組換え体ｐ　Ｔ　Ｇ　３８１お
よびｐ　Ｔ　Ｇ　３８２で得られた結果から予想される
ものよりも少なかった。これは、より強いＸＣＰＲＴ選
択圧力によって、シコフェノール酸耐性を得るためによ
り多くのプラスミドの見込みコピーが必要とされるため
と考えられることができる。ＤＨＦＲ（ｐＴＧＤＨ３８
６）の場合、ゲノムに組込まれるコピーの量はより少な
いものであってもクローンに選択培地での生育能力を付
与するためには十分であろう。第２の説明は■因子のｃ
ＤＮＡ翻訳のイニシエーターと仮定された最初のＡＴＧ
を含む配列の損失に基づくものである（１）ＴＧ３８５
およびｐ　Ｔ　Ｇ　３８８参照）。これらの配列の損失
はｐＴＧ　Ｄ　Ｈ３８６由来のポリシスト口ニックメッ
センジャーの翻訳の一般的なレベルをかなりの影響を及
ぼすものと考えられる。実際、前述のｐ　Ｔ　Ｇ　３８
５およびｐ　Ｔ　Ｇ　３８Ｂによる結果をみると、これ
ら２つの組換え体の違いは■因子の一般的な発現レベル
において認められる。選択培地で生育可能であり、■因
子の完全なｃＤＮＡとこれに続＜　ＤＨＦＩ？のｃＤＮ
Ａとによって構成されたポリシストロニックメツセンジ
ャーを含むＣＨＯクローンの獲得によって、■因子のｃ
ＤＮＡの５′位に位置するイニシエーター配列の役割に
対応する要素を得ることができる。

ｂ）　ポリシストロニックプラスミド■因子−ＸＧＰＲ
Ｔまず、前述のようにｐΔのＸＧＰＲＴ遺伝子プロモー
ターを２型アデノウィルスのそれで置換した。

そして、ｐΔを酵素Ｈ１ｎｄｕおよびＮ　ｒｕ　Ｉに消
化させ、プロモーターブロックを含むｐ　Ｔ　Ｇ　３９
５のＰｖｕＩＩ−Ｈｉｎｄ　ｍフラグメントと連結した
（ｐＴＧ３８４　）　、次いで、Ｂａａ＋ＨＩによって
ｐ　Ｔ　Ｇ　３８４を部分的に消化させ、アガロースゲ
ル上で大きな線状フラグメントを精製し、これにｍ　Ｔ
　Ｇ　３１５のＢａｍＨＩフラグメントを連結した（プ
ラスミドｐＴＧ３８２を得た）。

非翻訳５′配列を有する異なったｃＤＮＡを用いてもう
１つの構造体を形成した。この構造体を成形するために
は、ｐ　Ｔ　Ｇ　３９７内に含まれた■因子のｃＤＮＡ
のＦｕｎＤＩＩ−ＰｓｔＩフラグメントを分離し、次い
でベクターｍ　１３７　Ｇ　１２０内において下記のよ
うにＳ　ａｔ　Ｉ　　Ｆ　ｎｕＤ　ｎアダプターを用い
てＰｓｔＩ位と５ａｉ１位の間でクローン化し、Ｔ　　
ＣＧＡＣＣＡＴＧ　　ＣＡＧ　　ＣＯＧ　　ＧＴＡＣＧ
ＴＣＧに の結果、■因子のｃＤＮＡの全コード配列を修復した（
ｍＴＧ３９０　）　、そして、■因子のｃＤＮＡをｍ　
Ｔ　Ｇ　３９０から約ｔｓｏｏｂｐの部分的なりａｉ＋
ＨＩ／Ｘｈｏｎフラグメント形状として分離し、ｐＴ０
１８６のＢａｗＨＩ位内でクローン化した（ｐＴＧ３９
１）。そして、■因子のｃＤＮＡをｐ　Ｔ　Ｇ　３９１
からＢａｍＨＩフラグメント形状として抽出し、次いで
ＢａｍＨＩで部分的に切断したｐ　Ｔ　０３８６内でク
ローン化した。このようにして■因子−ＸＧＰｌ？Ｔポ
リシストロニックＲＮＡのためのコードとなり得るクロ
ーンを分離することができた（ｐＴＧ３８１）。構造体
ｐＴＧ３８１は非コード５′位をＭ、コザックの発表し
た規則によりよく適合するようにするために形成した（
Ｍ、　Ｋｏｚａｋ、　Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓＲｃｓ、１
２．８５７−８７２．１９８４）。

次いで５０％集密ＣＩＯ細胞層を含む直径１０３の各ベ
トリ皿に５μ９の割合でプラスミドを用い、古典的なリ
ン酸カルシウム共沈法によって２つのプラスミドｐ　Ｔ
　Ｇ　３８１およびｐ　Ｔ　Ｇ　３８２をＣＨＯ細胞内
に移した。

次いで、実施例１に記載した方法を用いてクローンを選
別した。

約３６個のクローンを選択し、分析した（２３個はｐｒ
ｃｓｇ＋系列、１３個はｐ　Ｔ　Ｇ　３ｇ２系列）。こ
れらのうちの約２５％は２４時間内に細胞１０６個あた
り１ｇ３以上の生産を示した。５７１　　（ｐＴＧ３８
１でトランスフェクトしたＣＨＯ）および７４２　　（
ｐＴＧ３８２でトランスフェクトしたＣＨＯ）という２
つのクローンの上澄中の■因子をＥＬＩＳＡ試験および
活性試験によって検定した。これらの検定のためには、
不活性胎児血清を添加したα２゜。。培地内で７５％集
密細胞層を３０分間５５℃に維持し、水酸化アルミナに
吸着させた。１５時間後、培地を採取して検定し、細胞
をトリプシン処理して計数した。

結果は、５７１が２４時間内に細胞１０６個あたり１４
％の活性を有する３、８４μ９の■因子を生産したのに
対し、７４１は２４時間内に細胞１０６個あたり１３％
の活性を有する１、４μ３の■因子を生産したというも
のであった。

結局のところ、これらのベクターは向上した発現レベル
を有するクローンを得ることを可能にするものである。

ＣＨＯ細胞は■因子の活性のために必須の少なくとも部
分的な翻訳後修飾を行なうことができる。生産された■
因子の１３％が活性を有しているということはヒトの■
因子の活性の１３％に相当するということである。ｐ　
Ｔ　Ｇ　３８１およびｐ　Ｔ　Ｇ　３ｇ２を用いたトラ
ンスフェクションの結果によれば、■因子のためのコー
ドとなるｍＲＮＡの翻訳開始を改善するように最初のＡ
ＴＧの近傍の非コード５′領域を改良することが好まし
いと認められる。

以下の株が１９８６年６月６日にパスツール研究所の国
立微生物収集館（Ｉａ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　Ｎａｔ
ｉｏｎａｌｅｄｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅｓ　ｄｅ　Ｍｉｃｒ
ｏｏｒｇａｎｉｓｉｅｓ　ｄｅ　Ｉ　’　Ｉｎａｔｉｔ
ｕｔ　Ｐａ５ｔｅｕｒ、２８　ｒｕｅ　ｄｅ　Ｄｏｃｔ
ｅｕｒ−Ｒｏｕｘ、７５７２４　Ｐａｒｌｓ　Ｃｏｄｅ
ｘ　１５）に寄託された。

Ｅ、コリ（Ｅ、ｃｏｌ　１）ＢＪ５１８３／ｐＴＧ３８
５．寄託番号！　−５６３号Ｅ、コリ（Ｅ、ｃｏｌ　１
）ＢＪ５１８３／ｐＴＧ３８１．寄託番号１−５６４号

【図面の簡単な説明】

第１図はｐ　Ｔ　Ｇ　３９５の構成を示す模式図、第２
図はｐ　Ｔ　０３８５の構成を示す模式図、第３図はｐ
ＴＧＤＨ３８Ｂの構成を示す模式図、第４図はｐ　Ｔ　
Ｇ　３８４の構成を示す模式図、第５図はｐ　Ｔ　Ｇ　
３８１の構成を示す模式図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）少なくとも、 IX因子もしくはこれに類似する蛋白質のためのコードと
   なるＤＮＡ配列、 前記ＤＮＡ配列のマルチコピー形状での組込みを確実に
   する要素、および 組込み後に真核細胞内においてIX因子もしくはこれに類
   似する蛋白質のためのコードとなるＤＮＡ配列の発現を
   確実にする要素からなることを特徴とする、真核細胞内
   においてIX因子もしくはこれに類似する蛋白質の発現を
   確実にする真核細胞内組込みベクター。 ２）少なくとも、 IX因子もしくはこれに類似する蛋白質のためのコードと
   なるＤＮＡ配列、 前記ＤＮＡ配列のマルチコピー形状での組込みを確実に
   する配列、および 前記細胞内における前記ＤＮＡ配列の発現要素からなる
   ことを特徴とする特許請求の範囲第１項記載のベクター
   。 ３）信号配列を含む前記ＤＮＡ配列が完全プレ蛋白質配
   列であることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の
   ベクター。 ４）前記ＤＮＡ配列のマルチコピー形状での組込みを確
   実にする要素がマウスミトコンドリアＤＮＡ配列である
   ことを特徴とする特許請求の範囲第２項もしくは第３項
   記載のベクター。 ５）前記マウスミトコンドリアＤＮＡ配列がｐΔのもの
   であることを特徴とする特許請求の範囲第４項記載のベ
   クター。 ６）化学物質耐性遺伝子と、形質転換された細胞内にお
   ける該遺伝子の発現を確実にする要素とを含んでいるこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第１項〜第５項のいずれ
   か１項に記載のベクター。 ７）IX因子もしくはこれに類似する蛋白質のためのコー
   ドとなるＤＮＡ配列および該ＤＮＡ配列に続く化学物質
   耐性遺伝子を含むポリシストロニックＲＮＡのためのコ
   ードとなることを特徴とする特許請求の範囲第１項〜第
   ６項のいずれか１項に記載のベクター。 ８）前記化学物質耐性遺伝子がＸＧＰＲＴおよびＤＨＦ
   Ｒのためのコードとなる遺伝子から選ばれたものである
   ことを特徴とする特許請求の範囲第６項もしくは第７項
   に記載のベクター。 ９）前記ＤＮＡ配列もしくは遺伝子の発現を確実にする
   要素がＳＶ４０および２型アデノウィルスのプロモータ
   ーの中から選ばれたものであることを特徴とする特許請
   求の範囲第１項〜第８項のいずれか１項に記載のベクタ
   ー。 １０）IX因子遺伝子に続いてイントロンおよびポリアデ
   ニル化位が存在することを特徴とする特許請求の範囲第
   １項〜第９項のいずれか１項に記載のベクター。 １１）ＤＮＡの全配列を有する単一のプラスミドから構
   成されることを特徴とする特許請求の範囲第１項〜第１
   ０項のいずれか１項に記載のベクター。 １２）少なくとも前記因子IXもしくはこれに類似する蛋
   白質のためのコードとなるＤＮＡ配列を含む一方のプラ
   スミドと少なくも１つの選択遺伝子を含む他方のプラス
   ミドとからなる、前記組込みを確実にする要素を含む１
   対のプラスミドから構成されることを特徴とする特許請
   求の範囲第１項〜第１０項のいずれか１項に記載のベク
   ター。 １３）少なくとも、 IX因子もしくはこれに類似する蛋白質のためのコードと
   なるＤＮＡ配列、 前記ＤＮＡ配列のマルチコピー形状での組込みを確実に
   する要素、および 組込み後に真核細胞内においてIX因子もしくはこれに類
   似する蛋白質のためのコードとなるＤＮＡ配列の発現を
   確実にする要素からなる、真核細胞内においてIX因子も
   しくはこれに類似する蛋白質の発現を確実にする真核細
   胞内組込みベクターによって真核細胞のトランスフェク
   ションを行ない、IX因子もしくはこれに類似する蛋白質
   を発現する細胞を選択することを特徴とする、IX因子も
   しくはこれに類似する蛋白質を生産する細胞系を得るた
   めの真核細胞の製造方法。 １４）前記トランスフェクションがリン酸カルシウム共
   沈法によって行なわれることを特徴とする特許請求の範
   囲第１３項記載の方法。 １５）少なくとも、 IX因子もしくはこれに類似する蛋白質のためのコードと
   なるＤＮＡ配列、 前記ＤＮＡ配列のマルチコピー形状での組込みを確実に
   する要素、および 組込み後に真核細胞内においてIX因子もしくはこれに類
   似する蛋白質のためのコードとなるＤＮＡ配列の発現を
   確実にする要素からなる、真核細胞内においてIX因子も
   しくはこれに類似する蛋白質の発現を確実にする真核細
   胞内組込みベクターによって真核細胞のトランスフェク
   ションを行ない、IX因子もしくはこれに類似する蛋白質
   を生産する細胞を選択して得たことを特徴とする細胞系
   。 １６）ＣＨＯ系であることを特徴とする特許請求の範囲
   第１５項記載の細胞系。 １７）少なくとも、 IX因子もしくはこれに類似する蛋白質のためのコードと
   なるＤＮＡ配列、 前記ＤＮＡ配列のマルチコピー形状での組込みを確実に
   する要素、および 組込み後に真核細胞内においてIX因子もしくはこれに類
   似する蛋白質のためのコードとなるＤＮＡ配列の発現を
   確実にする要素からなる、真核細胞内においてIX因子も
   しくはこれに類似する蛋白質の発現を確実にする真核細
   胞内組込みベクターによって真核細胞のトランスフェク
   ションを行ない、IX因子もしくはこれに類似する蛋白質
   を生産する細胞を選択して得た細胞系を適当な培地で培
   養し、この培地からIX因子もしくはこれに類似する蛋白
   質を回収することを特徴とするIX因子もしくはこれに類
   似する蛋白質の製造方法。 １８）少なくとも、 IX因子もしくはこれに類似する蛋白質のためのコードと
   なるＤＮＡ配列、 前記ＤＮＡ配列のマルチコピー形状での組込みを確実に
   する要素、および 組込み後に真核細胞内においてIX因子もしくはこれに類
   似する蛋白質のためのコードとなるＤＮＡ配列の発現を
   確実にする要素からなる、真核細胞内においてIX因子も
   しくはこれに類似する蛋白質の発現を確実にする真核細
   胞内組込みベクターによって真核細胞のトランスフェク
   ションを行ない、IX因子もしくはこれに類似する蛋白質
   を生産する細胞を選択して得た細胞系を適当な培地で培
   養し、この培地から回収して得たこを特徴とするIX因子
   。