JPH04148687A - M―csf活性ポリペプチドの安定的高発現組換えベクター - Google Patents
M―csf活性ポリペプチドの安定的高発現組換えベクターInfo
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/53—Colony-stimulating factor [CSF]
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
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- Toxicology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
本発明は、ヒトM−CSF活性ポリペプチドを安定的、
且つ高効率に発現が可能な安定的高発現組換えベクター
、該組換えベクターを動物細胞に導入し形質転換せしめ
高メトトレキセート耐性株を選択することにより得られ
る安定的高発現形質転換動物細胞、および該形質転換細
胞を用いるMCSF活性ポリペプチドの安定的高発現製
造法に関する。
且つ高効率に発現が可能な安定的高発現組換えベクター
、該組換えベクターを動物細胞に導入し形質転換せしめ
高メトトレキセート耐性株を選択することにより得られ
る安定的高発現形質転換動物細胞、および該形質転換細
胞を用いるMCSF活性ポリペプチドの安定的高発現製
造法に関する。
【従来の技術】
M−CSF活性ポリペプチドは、ヒト骨髄中の単球系前
駆細胞である単球コロニー形成細胞に作用して、単芽球
や前単球を経て、分化成熟せしめる因子である。従来、
M−CSF活性ポリペプチドの発現に関連する遺伝子と
しては、遺伝子クローニングにより、256個のアミノ
61(N末端に32個のアミノ酸からなるシグナルペプ
チドを含む)に対応する遺伝子(Science 23
0. pp、291−296 (1985))と、55
4個のアミノ酸に対応する遺転子(Science 2
35.1504−1508 (1987) )の2つが
知られている。 このうち256個のアミノ酸に対応する遺伝子によって
生産される成熟型のM−CSF活性ポリペプチド(以下
、Ml−CSFという)は、発現の初期の過程において
、32個のアミノ酸からなるシグナルペプチドが切断さ
れ、ホモ2量体を形成し、ゴルジ体内を移動する。さら
に翻訳後切断によりそのC末端が削除され、成熟型とな
ると推測されている。この切断箇所については、C■1
細胞を宿主細胞として発現されたMl−CSFにおいて
同定されており(J、of Biotechnolog
y 。 8 、pp、45−88 (198B) ) 、それ
によれば成熟型であるMl−CSFは、158個のアミ
ノ酸からなるポリペプチドであることがl(1)認され
ている。 また、もう一方の554個のアミノ酸に対応する遺伝子
から生産されるM−CSF活性ポリペプチド(以下、M
2−CSFという)は、ヒト尿中より抽出精製し得るこ
とより、充分な量が確保されるため、研究や臨床的な薬
効評価に既に供されているが、Ml−CSFについては
、後述の通り、種々の生産方法が試されているが、研究
や臨床的な薬効評価に供することができるまでには、安
定的且つ高発現に適する生産方法はなく、また、その他
のM−CSF活性を有するポリペプチドであってMl−
CSFと類似しているMl−CSF類似ポリペプチドの
生産についても全く未検討であった・ 例えば、Ml−CSFの生産に関与する天然型の遺伝子
(以下、Ml−CSF遺伝子と略記することがある)を
、SV40初期遺伝子プロモーターを有する発現ベクタ
ーに挿入して得たプラスミドpccsF17を用い、宿
主細胞であるCV−1細胞を形質転換せしめて得られた
形質転換細胞にてMl−CSFを生産した(J、of
Biotechnol。 gy 、8 、pp、45−88 (198B) )
、 Lかし、この方法においては、M−CSF活性ポ
リペプチドの発現量を高めるため、SV40ウィルスを
用いることがらCV−1細胞が5〜6日後には死滅する
ことになり、しかもその生存期間におけるM−CSF活
性ポリペプチドの発現濃度も10,0OOLI/m1程
度と低いものであった。逆にSV40ウィルスを用いな
いと極めて少量の発現しか認め得す、安定的且つ高発現
の生産は望めなかった。 また、その他の例として、Ml−CSF遺伝子の種々の
位置に終止コドンを挿入して得た改変遺伝子を、Ml−
CSF遺伝子の代わりに用いて、他の操作は前記の組替
えベクターpccsF17と同様の構築方法を行って調
製した組替えベクターを、COS細胞に導入し形質転換
せしめた(特表平1−5(13)283号公報)。しか
し、この方法においては、形質転換細胞は1週間程度で
活性を発現しなくなり、さらにM−CSF活性ポリペプ
チドの発現可能な期間における発現濃度も20000U
/m1程度であり、安定的且つ高発現の生産は望めなか
った。 また、Ml−CSF遺伝子の特定部位を削除した改変遺
伝子を用い、SV40後期遺伝子プロモーターを有する
発現ベクターに挿入して得たプラスミド1)SVL−M
l−de lを用い、宿主細胞であるCO8細胞を形質
転換せしめた形質転換細胞にて生産した(第6回次世代
産業基盤技術シンポジウム予稿集pp、258−259
(1988) ) 、 Lかし、この方法においても
、形質転換細胞は1週間程度で活性を発現しなくなり、
さらにM−CSF活性ポリペプチドの発現可能な期間に
おける発現濃度も2,0OOU/m1程度と低く、同様
に安定的且つ高発現の生産は望めなかった。
駆細胞である単球コロニー形成細胞に作用して、単芽球
や前単球を経て、分化成熟せしめる因子である。従来、
M−CSF活性ポリペプチドの発現に関連する遺伝子と
しては、遺伝子クローニングにより、256個のアミノ
61(N末端に32個のアミノ酸からなるシグナルペプ
チドを含む)に対応する遺伝子(Science 23
0. pp、291−296 (1985))と、55
4個のアミノ酸に対応する遺転子(Science 2
35.1504−1508 (1987) )の2つが
知られている。 このうち256個のアミノ酸に対応する遺伝子によって
生産される成熟型のM−CSF活性ポリペプチド(以下
、Ml−CSFという)は、発現の初期の過程において
、32個のアミノ酸からなるシグナルペプチドが切断さ
れ、ホモ2量体を形成し、ゴルジ体内を移動する。さら
に翻訳後切断によりそのC末端が削除され、成熟型とな
ると推測されている。この切断箇所については、C■1
細胞を宿主細胞として発現されたMl−CSFにおいて
同定されており(J、of Biotechnolog
y 。 8 、pp、45−88 (198B) ) 、それ
によれば成熟型であるMl−CSFは、158個のアミ
ノ酸からなるポリペプチドであることがl(1)認され
ている。 また、もう一方の554個のアミノ酸に対応する遺伝子
から生産されるM−CSF活性ポリペプチド(以下、M
2−CSFという)は、ヒト尿中より抽出精製し得るこ
とより、充分な量が確保されるため、研究や臨床的な薬
効評価に既に供されているが、Ml−CSFについては
、後述の通り、種々の生産方法が試されているが、研究
や臨床的な薬効評価に供することができるまでには、安
定的且つ高発現に適する生産方法はなく、また、その他
のM−CSF活性を有するポリペプチドであってMl−
CSFと類似しているMl−CSF類似ポリペプチドの
生産についても全く未検討であった・ 例えば、Ml−CSFの生産に関与する天然型の遺伝子
(以下、Ml−CSF遺伝子と略記することがある)を
、SV40初期遺伝子プロモーターを有する発現ベクタ
ーに挿入して得たプラスミドpccsF17を用い、宿
主細胞であるCV−1細胞を形質転換せしめて得られた
形質転換細胞にてMl−CSFを生産した(J、of
Biotechnol。 gy 、8 、pp、45−88 (198B) )
、 Lかし、この方法においては、M−CSF活性ポ
リペプチドの発現量を高めるため、SV40ウィルスを
用いることがらCV−1細胞が5〜6日後には死滅する
ことになり、しかもその生存期間におけるM−CSF活
性ポリペプチドの発現濃度も10,0OOLI/m1程
度と低いものであった。逆にSV40ウィルスを用いな
いと極めて少量の発現しか認め得す、安定的且つ高発現
の生産は望めなかった。 また、その他の例として、Ml−CSF遺伝子の種々の
位置に終止コドンを挿入して得た改変遺伝子を、Ml−
CSF遺伝子の代わりに用いて、他の操作は前記の組替
えベクターpccsF17と同様の構築方法を行って調
製した組替えベクターを、COS細胞に導入し形質転換
せしめた(特表平1−5(13)283号公報)。しか
し、この方法においては、形質転換細胞は1週間程度で
活性を発現しなくなり、さらにM−CSF活性ポリペプ
チドの発現可能な期間における発現濃度も20000U
/m1程度であり、安定的且つ高発現の生産は望めなか
った。 また、Ml−CSF遺伝子の特定部位を削除した改変遺
伝子を用い、SV40後期遺伝子プロモーターを有する
発現ベクターに挿入して得たプラスミド1)SVL−M
l−de lを用い、宿主細胞であるCO8細胞を形質
転換せしめた形質転換細胞にて生産した(第6回次世代
産業基盤技術シンポジウム予稿集pp、258−259
(1988) ) 、 Lかし、この方法においても
、形質転換細胞は1週間程度で活性を発現しなくなり、
さらにM−CSF活性ポリペプチドの発現可能な期間に
おける発現濃度も2,0OOU/m1程度と低く、同様
に安定的且つ高発現の生産は望めなかった。
前述の如く、M−CSF活性ポリペプチドの生産法は、
従来より種々試みられており、例えばMl−CSF遺伝
子の改変遺伝子を使用する方法では、Ml−CSF遺伝
子を使用する方法に比較して若干高い発現量を認めるこ
とができるものの、未だ充分な発現量とはいえず、特に
安定的にM−CSF活性ポリペプチドを生産することは
できないものであった。したがって、今なお、M−CS
F活性ポリペプチドを安定的に、且つ高発現せしめる生
産法は全く確立されておらず、M−CSF活性ポリペプ
チドの大量生産に適する製造法の確立が待たれていた。 [!INを解決するための手段] 本発明者らは、上記問題点を解決するために鋭意研究し
た結果、Ml−CSFのシグナルペプチドを含むポリペ
プチドのN末端から180番のアミノ酸を含むC末端側
のアミノ酸残基の一部または全部が欠損したポリペプチ
ドをコードするDNAであるM−CSF−delete
DNAをdhfrマーカーDNAを有する発現ベクター
のdhfrマーカーDNA部位に置換して導入すると共
に、dhfr?−カーDNAを有し、1亥M−CSF−
d e l e t eDNAと1亥dhfrマーカー
DNAが少なくとも1.5kbp離れているように構築
した組換えベクターを用いると、形質転換の工程と細胞
株選択の工程を行うことにより、簡単にM−CSF活性
ポリペプチドを安定的、且つ高発現に生産することがで
きることを知り、本発明を完成するに至った。 即ち、本発明は、dhfrマーカーDNAを有する発現
ベクターにおいて、そのdhfrマーカーDNA部位に
置換して導入したM−CSF−deleteDNA(但
し、M−CSF−deleteDNAは、Ml−CSF
のシグナルペプチドを含むポリペプチドのN末端から1
80番のアミノ酸を含むC末端側のアミノ酸残基の一部
または全部が欠損したポリペプチドをコードするDNA
を示す)と、dhfrマーカーDNAとを有し、且つ、
該M−CSF−d e l e t eDNAと該dh
frマーカーDNAとが少なくとも1.5kbpHれて
いることを特徴とするM−CSF活性ポリペプチドの安
定的高発現組換えベクター、および該M−CSF活性ポ
リペプチドの安定的高発現組換えベクターを導入し動物
細胞を形質転換せしめたM−CSF活性ポリペプチドの
安定的高発現形質転換動物細胞である。 また本発明は、上記の如く形質転換せしめた形質転換動
物細胞をメトトレキセート含有培地にて培養して高メト
トレキセート耐性株を選択して得られるM−CSF活性
ポリペプチドの安定的高発現形質転換動物細胞を、培地
にて培養することを特徴とするM−CSF活性ポリペプ
チドの安定的高発現製造法である。 本発明において、M−CSF−d e l e t e
DNAとは、Ml−CSFのシグナルペプチドを含むポ
リペプチドのN末端から180番のアミノ酸を含むC末
端側のアミノ酸残基の一部または全部が欠損したポリペ
プチドをコードするDNAを示す、Ml−CSFのシグ
ナルペプチドを含むポリペプチドのアミノ酸配列および
塩基配列については、既に解明されており、32個のア
ミノ酸残基からなるシグナルペプチド部分と、224個
のアミノ酸残基が連なった256個のアミノ酸にコード
する遺伝子として解析されている(Science 2
30、 pp、291−296 (1985)) 、ア
ミノ酸残基の一部または全部が欠損とは、簡便には適当
な制限酵素を用いて、そのアミノ酸配列をコードするD
NAの制限酵素サイトを切断するか、またはこの切断D
NAに小断片の天然又は合成のオリゴヌクレオチドを連
結してもよく、また適当な位置にポイントミューチーシ
ラン法等により終止コドンを創設せしめる等の遺伝子操
作技術を用いて行えばよい。 M−CSF−d e l e t eDNAは、そのC
末端に好ましくは終始コドンを有する。このM−CSF
−d e l e t eDNAの代表的な例示として
は、Ml−CSF遺伝子を制限酵素BamHIt13よ
び3tulで切断しクレノー酵素にて連結した改変遺伝
子(以下、Ml−delと表記することがある)が挙げ
られ、この遺伝子がコードするアミノ酸配列は第2図に
示されるものであり、具体的な塩基配列は第3図に示さ
れるものである。 また本発明において、dhfrマーカーDNAとは、葉
酸還元酵素遺伝子を意味し、簡便に°はマウス由来のd
hfrマーカーDNAが使用される(Nature v
ol、275. pp617−624 (1978))
、 d h frママ−−を有する細胞は、メトトレ
キセート(MTXと略称することがある)を含有する培
地においても増殖可能であり、薬剤耐性のマーカーとし
て形質転換細胞の選択に適している。 dhfrマーカーDNAを有する発現ベクターとは、d
hfrマーカーDNAを有するものであれば特に限定さ
れないが、遺伝子操作し昌い適当な制限酵素部位を有す
るものが好ましく、具体的には、pSV2−dhf r
が例示される。これらの発現ベクターは、それぞれ適宜
のプロモーターを有し、例えば、SV40初期遺伝子プ
ロモーター、メタロチオネイン遺伝子プロモーター、チ
ミジンオキシナーゼ遺伝子プロモーター等のプロモータ
ーが例示され、特に好ましくはSV40初期遺伝子プロ
モーターが挙げられる。前記のM−CSF−delet
eDNAのdhfrマーカーDNAとの置換工程におい
ては、これらプロモーターの下流域に存在する制限酵素
サイト、例えばHi ndnlおよびBg!IIを利用
して組替えを行えばよい、また、dhfrマーカーDN
Aの創設においては、dhfrマーカーDNAの上流域
に存在するこれらプロモーターを含むような制限酵素サ
イト、例えばEC0RIを利用して組替えを行えばよい
、このようにしてM−CSF−d e l eteDN
AおよびdhfrマーカーDNAは、別個のプロモータ
ーの下流域にそれぞれ存在せしめるとより好ましい。 本発明のM−CSF活性ポリペプチドの安定的高発現組
換えベクターを構築する方法につき、具体的に、pSV
2−dhfrを例にとって説明すると以下の通りである
。また、その概要の説明図が第4図に示される。 即ち、pSV2−dhfrベクターDNAのdhfrマ
ーカーDNAの両端を、適宜の制限酵素により切断し、
dhfrマーカーDNAを削除したベクターDNA断片
を分離精製する。ベクターDNA断片の末端は、制限酵
素の種類により平滑化することもできる。また好ましく
は末端をアルカリフォスファターゼ等により脱リン酸化
するとよい。 dhfrマーカーDNAの両端の切断に用いられる制限
酵素としては、好ましくはH4ndl[l、Bgln等
が挙げられる。また、末端を平滑化するには、dATP
、dTTP、dGTP、dCTPの存在下、フレノウ断
片酵素により切断点を平滑化する方法が挙げられる。 一方、Ml−CSFを生産する細胞(例えば、M I
A −P a Ca細胞、TRC−29R細胞等)から
Ml−CSFの生産に関与するcDNAを採取し、必要
により公知の方法に従って、適宜のベクターに挿入し、
培養増幅して調製したMl−CSF遺伝子のうちのMl
−CSFのシグナルペプチドを含むポリペプチドのN末
端から180番のアミノ酸を含むC末端側のアミノ酸残
基の一部または全部を欠損せしめる工程を行えばよく、
例えば、適宜の制限酵素を用いて切断を行う方法、これ
に小断片のオリゴヌクレオチドを連結する方法、または
終止コドンをポイントミューチージョン法により創製す
る方法等が挙げられ、さらにこれらを適宜に組み合わせ
て行ってもよい。ベクターにMl−CSF遺伝子を挿入
してこれらの工程を行った場合には、適宜の制限酵素に
よりM−CSF−deleteDNA断片を切断して取
り出す。 M−CSF−deleteDNA断片の末端は、制限酵
素の種類により平滑化することもできる。 また好ましくは末端をアルカリフォスファターゼ等によ
り脱リン酸化するとよい。 以上により調製されたdhfrマーカーDNAを削除し
たベクターDNA断片と、M−CSFdeleteDN
A断片とをライゲーションし、宿主微生物に導入し形質
転換せしめ、目的のMCSF−deleteDNAを含
むベクターを保持した形質転換体を採取し培養増幅して
、ベクターDNAを得る0次いで、このM−CSF−d
eleteDNAを含むベクターDNAのM−CSF
−d e l e t eDNA断片に作用しない適宜
の制限酵素にてベクターを断片となす。この工程におい
て用いられる制限酵素は、後記によって調製されるdh
frマーカーDNA断片を挿入し、dhfrマーカーD
NAを創設する箇所であるので、dhfr7−カーDN
A断片を挿入したときに該dhfrマーカーDNAとM
−CSF−dele t e DNAとの距離が、少な
くとも1.5kbp以上となるような制限酵素サイトを
選択すればよく、好ましくは制限酵素Ec oR1サイ
トが例示される。このベクターDNAの末端をアルカリ
フォスファターゼ等により脱リン酸化すると好ましい。 また別に、pSV2−dhfrベクターDNAのdhf
rマーカーDNAの両端を、適宜の制限酵素により切断
し、dhfrマーカーDNA断片を調製する。この場合
においては、dhfrマーカーDNAの発現に適当なブ
ライマ一部分を含むように充分に広く切断することが好
ましく、好ましくは制限酵素EcoRIにてdhfrマ
ーカーDNAを含む断片を調製するとよい、この末端に
ついても、アルカリフォスファターゼ等により脱リン酸
化するとより好ましい。 以上にして調製されたM−CSF −d e l e
teDNAを含むベクターDNA断片と、dhfrマー
カーDNAを含む断片とをライゲーションし、宿主微生
物、例えばE、coli等に導入し形質転換せしめ、本
発明のM−CSF活性ポリペプチドの安定的高発現組換
えベクターが構築される。 以上の操作において用いられる制限酵素は、通常、切断
すべきDNAの量に対し当量以上のユニット量を添加す
ればよく、好ましくはDNA1μgに対し、1〜2U程
度使用すればよい、また、その他の酵素においては、反
応系により異なり適宜の量を使用すればよいが、通常1
0〜20U程度用いればよい。 斯くして構築された本発明の安定的高発現組換えベクタ
ーは、該M−CSF−d e l e t eDNAと
該dhfrマーカーDNAが少なくとも1゜5kbp離
れているように構築されている。 本発明において、特に好ましい組替えベクターは第1図
に示されるものであり、図中のM−CSF−delet
eDNAは、好ましくは第2図に表されたアミノ酸配列
をコードするDNAが例示され、さらに具体的に、第3
図に表された塩基配列のDNAが例示される。 本発明のM−CSF活性ポリペプチドの安定的高発現組
換えベクターを動物細胞に導入して形質転換動物細胞を
得る方法は、リン酸カルシウム沈殿法、DEAE−デキ
ストラン法、電気パルス法等の手法により、該組換えベ
クターを動物細胞に導入すればよく、特に好ましくは電
気パルス法が挙げられる。 宿主細胞として用いられる動物細胞は、培養可能なもの
であれば特に限定されないが、dhfrの物性を持つ細
胞が選択し易いことから好ましく、最も好ましい例とし
てはdhfr−の性質を持つCHO細胞(d h f
r −CHO; Proc、Natl。 ^cad、sci、UsA vol、77、pp、42
16−4220 (1980) )が挙げられる。しか
しながら、dhfr−の性質を有さないTRC−29R
細胞(FERM BP−2375)を使用することも
可能である。 次いで、このようにして得た形質転換動物細胞を、MT
X (メトトレキセート)含有培地にて培養して高MT
X耐性株を選択することにより、MCSF活性ポリペプ
チドの安定的高発現形質転換動物細胞が得られる0通常
、MTXの含有量を段階的に増加せしめて培養すること
が好ましく、通常使用されるMTXの含有量は、約0.
1〜10μM程度の量が例示される。斯くして得られた
約10μM以上のMTXに耐性を示す高MTX耐性株は
、好ましい安定的高発現形質転換動物細胞を与える。 この形質転換細胞の好適な例としては、第3図に示され
るMl−del遺伝子を含む安定的高発現組替えベクタ
ーをdhfr−CHO細胞に導入し形質転換せしめMT
Xにより選択したMl−de114−2[微工研菌寄第
11756号(FERM P−11756)Jが挙げ
られる。 本発明において安定的とは、継代培養を行ってもM−C
SF活性ポリペプチドの生産量が低下せず、また通常の
培養においても少なくとも2週間はM−CSF活性ポリ
ペプチドの生産量が低下しないことを意味し、上記Ml
−del 14−2においては、少なくとも約1月間
程度は約600.0OOU/m1程度のM−CSF活性
ポリペプチドを発現できるものであった。 該形質転換細胞を培養することにより、MS−CSF活
性を生産するに際しては、通常の動物細胞の培養方法が
採用でき、例えば、CHO細胞やTRC−29R細胞の
組織培養の培地、例えば、ダルベツコ変法イーグルME
M培地+10%牛脂児血清を用い、培養器、簡単にはシ
ャーレやルー瓶に、形質転換動物細胞を104個/cm
”程度播種して、2〜6日間、30〜37℃にて培養し
た後、その培養上清を回収して目的とするM−CSF活
性ポリペプチドを確認し、さらに適宜公知の蛋白質の回
収、精製手段を利用して、目的とするM−CSF活性ポ
リペプチドを回収すればよい。 さらに大量培養が必要な場合には、マイクロキャリアー
に付着せしめ適宜の撹拌条件、pH条件や酸素供給条件
等にて培養すればよい。 このようにして得られたM−CSF活性ポリペプチド含
有溶液は、例えば減圧濃縮、膜濃縮、硫安や硫酸ナトリ
ウム等を用いた塩析処理、メタノールやエタノール、ア
セトン等の親水性有機溶媒での分別沈殿等の手段を適宜
選択し、組み合わせて行い、沈殿せしめ、さらにこのM
−CSF活性ポリペプチド含有沈殿物を、必要に応じて
精製すればよく、例えばこの沈殿物を水または緩衝液に
熔解し、透析膜にて透析して、より低分子量の不純物を
除去してもよく、またイオン交換樹脂、吸着側やゲル濾
過側等によるイオン交換クロマトグラフィー、吸着クロ
マトグラフィー、やゲル濾過により精製してもよく、精
製M−CSF活性ポリペプチドは凍結乾燥して保存すれ
ばよい。
従来より種々試みられており、例えばMl−CSF遺伝
子の改変遺伝子を使用する方法では、Ml−CSF遺伝
子を使用する方法に比較して若干高い発現量を認めるこ
とができるものの、未だ充分な発現量とはいえず、特に
安定的にM−CSF活性ポリペプチドを生産することは
できないものであった。したがって、今なお、M−CS
F活性ポリペプチドを安定的に、且つ高発現せしめる生
産法は全く確立されておらず、M−CSF活性ポリペプ
チドの大量生産に適する製造法の確立が待たれていた。 [!INを解決するための手段] 本発明者らは、上記問題点を解決するために鋭意研究し
た結果、Ml−CSFのシグナルペプチドを含むポリペ
プチドのN末端から180番のアミノ酸を含むC末端側
のアミノ酸残基の一部または全部が欠損したポリペプチ
ドをコードするDNAであるM−CSF−delete
DNAをdhfrマーカーDNAを有する発現ベクター
のdhfrマーカーDNA部位に置換して導入すると共
に、dhfr?−カーDNAを有し、1亥M−CSF−
d e l e t eDNAと1亥dhfrマーカー
DNAが少なくとも1.5kbp離れているように構築
した組換えベクターを用いると、形質転換の工程と細胞
株選択の工程を行うことにより、簡単にM−CSF活性
ポリペプチドを安定的、且つ高発現に生産することがで
きることを知り、本発明を完成するに至った。 即ち、本発明は、dhfrマーカーDNAを有する発現
ベクターにおいて、そのdhfrマーカーDNA部位に
置換して導入したM−CSF−deleteDNA(但
し、M−CSF−deleteDNAは、Ml−CSF
のシグナルペプチドを含むポリペプチドのN末端から1
80番のアミノ酸を含むC末端側のアミノ酸残基の一部
または全部が欠損したポリペプチドをコードするDNA
を示す)と、dhfrマーカーDNAとを有し、且つ、
該M−CSF−d e l e t eDNAと該dh
frマーカーDNAとが少なくとも1.5kbpHれて
いることを特徴とするM−CSF活性ポリペプチドの安
定的高発現組換えベクター、および該M−CSF活性ポ
リペプチドの安定的高発現組換えベクターを導入し動物
細胞を形質転換せしめたM−CSF活性ポリペプチドの
安定的高発現形質転換動物細胞である。 また本発明は、上記の如く形質転換せしめた形質転換動
物細胞をメトトレキセート含有培地にて培養して高メト
トレキセート耐性株を選択して得られるM−CSF活性
ポリペプチドの安定的高発現形質転換動物細胞を、培地
にて培養することを特徴とするM−CSF活性ポリペプ
チドの安定的高発現製造法である。 本発明において、M−CSF−d e l e t e
DNAとは、Ml−CSFのシグナルペプチドを含むポ
リペプチドのN末端から180番のアミノ酸を含むC末
端側のアミノ酸残基の一部または全部が欠損したポリペ
プチドをコードするDNAを示す、Ml−CSFのシグ
ナルペプチドを含むポリペプチドのアミノ酸配列および
塩基配列については、既に解明されており、32個のア
ミノ酸残基からなるシグナルペプチド部分と、224個
のアミノ酸残基が連なった256個のアミノ酸にコード
する遺伝子として解析されている(Science 2
30、 pp、291−296 (1985)) 、ア
ミノ酸残基の一部または全部が欠損とは、簡便には適当
な制限酵素を用いて、そのアミノ酸配列をコードするD
NAの制限酵素サイトを切断するか、またはこの切断D
NAに小断片の天然又は合成のオリゴヌクレオチドを連
結してもよく、また適当な位置にポイントミューチーシ
ラン法等により終止コドンを創設せしめる等の遺伝子操
作技術を用いて行えばよい。 M−CSF−d e l e t eDNAは、そのC
末端に好ましくは終始コドンを有する。このM−CSF
−d e l e t eDNAの代表的な例示として
は、Ml−CSF遺伝子を制限酵素BamHIt13よ
び3tulで切断しクレノー酵素にて連結した改変遺伝
子(以下、Ml−delと表記することがある)が挙げ
られ、この遺伝子がコードするアミノ酸配列は第2図に
示されるものであり、具体的な塩基配列は第3図に示さ
れるものである。 また本発明において、dhfrマーカーDNAとは、葉
酸還元酵素遺伝子を意味し、簡便に°はマウス由来のd
hfrマーカーDNAが使用される(Nature v
ol、275. pp617−624 (1978))
、 d h frママ−−を有する細胞は、メトトレ
キセート(MTXと略称することがある)を含有する培
地においても増殖可能であり、薬剤耐性のマーカーとし
て形質転換細胞の選択に適している。 dhfrマーカーDNAを有する発現ベクターとは、d
hfrマーカーDNAを有するものであれば特に限定さ
れないが、遺伝子操作し昌い適当な制限酵素部位を有す
るものが好ましく、具体的には、pSV2−dhf r
が例示される。これらの発現ベクターは、それぞれ適宜
のプロモーターを有し、例えば、SV40初期遺伝子プ
ロモーター、メタロチオネイン遺伝子プロモーター、チ
ミジンオキシナーゼ遺伝子プロモーター等のプロモータ
ーが例示され、特に好ましくはSV40初期遺伝子プロ
モーターが挙げられる。前記のM−CSF−delet
eDNAのdhfrマーカーDNAとの置換工程におい
ては、これらプロモーターの下流域に存在する制限酵素
サイト、例えばHi ndnlおよびBg!IIを利用
して組替えを行えばよい、また、dhfrマーカーDN
Aの創設においては、dhfrマーカーDNAの上流域
に存在するこれらプロモーターを含むような制限酵素サ
イト、例えばEC0RIを利用して組替えを行えばよい
、このようにしてM−CSF−d e l eteDN
AおよびdhfrマーカーDNAは、別個のプロモータ
ーの下流域にそれぞれ存在せしめるとより好ましい。 本発明のM−CSF活性ポリペプチドの安定的高発現組
換えベクターを構築する方法につき、具体的に、pSV
2−dhfrを例にとって説明すると以下の通りである
。また、その概要の説明図が第4図に示される。 即ち、pSV2−dhfrベクターDNAのdhfrマ
ーカーDNAの両端を、適宜の制限酵素により切断し、
dhfrマーカーDNAを削除したベクターDNA断片
を分離精製する。ベクターDNA断片の末端は、制限酵
素の種類により平滑化することもできる。また好ましく
は末端をアルカリフォスファターゼ等により脱リン酸化
するとよい。 dhfrマーカーDNAの両端の切断に用いられる制限
酵素としては、好ましくはH4ndl[l、Bgln等
が挙げられる。また、末端を平滑化するには、dATP
、dTTP、dGTP、dCTPの存在下、フレノウ断
片酵素により切断点を平滑化する方法が挙げられる。 一方、Ml−CSFを生産する細胞(例えば、M I
A −P a Ca細胞、TRC−29R細胞等)から
Ml−CSFの生産に関与するcDNAを採取し、必要
により公知の方法に従って、適宜のベクターに挿入し、
培養増幅して調製したMl−CSF遺伝子のうちのMl
−CSFのシグナルペプチドを含むポリペプチドのN末
端から180番のアミノ酸を含むC末端側のアミノ酸残
基の一部または全部を欠損せしめる工程を行えばよく、
例えば、適宜の制限酵素を用いて切断を行う方法、これ
に小断片のオリゴヌクレオチドを連結する方法、または
終止コドンをポイントミューチージョン法により創製す
る方法等が挙げられ、さらにこれらを適宜に組み合わせ
て行ってもよい。ベクターにMl−CSF遺伝子を挿入
してこれらの工程を行った場合には、適宜の制限酵素に
よりM−CSF−deleteDNA断片を切断して取
り出す。 M−CSF−deleteDNA断片の末端は、制限酵
素の種類により平滑化することもできる。 また好ましくは末端をアルカリフォスファターゼ等によ
り脱リン酸化するとよい。 以上により調製されたdhfrマーカーDNAを削除し
たベクターDNA断片と、M−CSFdeleteDN
A断片とをライゲーションし、宿主微生物に導入し形質
転換せしめ、目的のMCSF−deleteDNAを含
むベクターを保持した形質転換体を採取し培養増幅して
、ベクターDNAを得る0次いで、このM−CSF−d
eleteDNAを含むベクターDNAのM−CSF
−d e l e t eDNA断片に作用しない適宜
の制限酵素にてベクターを断片となす。この工程におい
て用いられる制限酵素は、後記によって調製されるdh
frマーカーDNA断片を挿入し、dhfrマーカーD
NAを創設する箇所であるので、dhfr7−カーDN
A断片を挿入したときに該dhfrマーカーDNAとM
−CSF−dele t e DNAとの距離が、少な
くとも1.5kbp以上となるような制限酵素サイトを
選択すればよく、好ましくは制限酵素Ec oR1サイ
トが例示される。このベクターDNAの末端をアルカリ
フォスファターゼ等により脱リン酸化すると好ましい。 また別に、pSV2−dhfrベクターDNAのdhf
rマーカーDNAの両端を、適宜の制限酵素により切断
し、dhfrマーカーDNA断片を調製する。この場合
においては、dhfrマーカーDNAの発現に適当なブ
ライマ一部分を含むように充分に広く切断することが好
ましく、好ましくは制限酵素EcoRIにてdhfrマ
ーカーDNAを含む断片を調製するとよい、この末端に
ついても、アルカリフォスファターゼ等により脱リン酸
化するとより好ましい。 以上にして調製されたM−CSF −d e l e
teDNAを含むベクターDNA断片と、dhfrマー
カーDNAを含む断片とをライゲーションし、宿主微生
物、例えばE、coli等に導入し形質転換せしめ、本
発明のM−CSF活性ポリペプチドの安定的高発現組換
えベクターが構築される。 以上の操作において用いられる制限酵素は、通常、切断
すべきDNAの量に対し当量以上のユニット量を添加す
ればよく、好ましくはDNA1μgに対し、1〜2U程
度使用すればよい、また、その他の酵素においては、反
応系により異なり適宜の量を使用すればよいが、通常1
0〜20U程度用いればよい。 斯くして構築された本発明の安定的高発現組換えベクタ
ーは、該M−CSF−d e l e t eDNAと
該dhfrマーカーDNAが少なくとも1゜5kbp離
れているように構築されている。 本発明において、特に好ましい組替えベクターは第1図
に示されるものであり、図中のM−CSF−delet
eDNAは、好ましくは第2図に表されたアミノ酸配列
をコードするDNAが例示され、さらに具体的に、第3
図に表された塩基配列のDNAが例示される。 本発明のM−CSF活性ポリペプチドの安定的高発現組
換えベクターを動物細胞に導入して形質転換動物細胞を
得る方法は、リン酸カルシウム沈殿法、DEAE−デキ
ストラン法、電気パルス法等の手法により、該組換えベ
クターを動物細胞に導入すればよく、特に好ましくは電
気パルス法が挙げられる。 宿主細胞として用いられる動物細胞は、培養可能なもの
であれば特に限定されないが、dhfrの物性を持つ細
胞が選択し易いことから好ましく、最も好ましい例とし
てはdhfr−の性質を持つCHO細胞(d h f
r −CHO; Proc、Natl。 ^cad、sci、UsA vol、77、pp、42
16−4220 (1980) )が挙げられる。しか
しながら、dhfr−の性質を有さないTRC−29R
細胞(FERM BP−2375)を使用することも
可能である。 次いで、このようにして得た形質転換動物細胞を、MT
X (メトトレキセート)含有培地にて培養して高MT
X耐性株を選択することにより、MCSF活性ポリペプ
チドの安定的高発現形質転換動物細胞が得られる0通常
、MTXの含有量を段階的に増加せしめて培養すること
が好ましく、通常使用されるMTXの含有量は、約0.
1〜10μM程度の量が例示される。斯くして得られた
約10μM以上のMTXに耐性を示す高MTX耐性株は
、好ましい安定的高発現形質転換動物細胞を与える。 この形質転換細胞の好適な例としては、第3図に示され
るMl−del遺伝子を含む安定的高発現組替えベクタ
ーをdhfr−CHO細胞に導入し形質転換せしめMT
Xにより選択したMl−de114−2[微工研菌寄第
11756号(FERM P−11756)Jが挙げ
られる。 本発明において安定的とは、継代培養を行ってもM−C
SF活性ポリペプチドの生産量が低下せず、また通常の
培養においても少なくとも2週間はM−CSF活性ポリ
ペプチドの生産量が低下しないことを意味し、上記Ml
−del 14−2においては、少なくとも約1月間
程度は約600.0OOU/m1程度のM−CSF活性
ポリペプチドを発現できるものであった。 該形質転換細胞を培養することにより、MS−CSF活
性を生産するに際しては、通常の動物細胞の培養方法が
採用でき、例えば、CHO細胞やTRC−29R細胞の
組織培養の培地、例えば、ダルベツコ変法イーグルME
M培地+10%牛脂児血清を用い、培養器、簡単にはシ
ャーレやルー瓶に、形質転換動物細胞を104個/cm
”程度播種して、2〜6日間、30〜37℃にて培養し
た後、その培養上清を回収して目的とするM−CSF活
性ポリペプチドを確認し、さらに適宜公知の蛋白質の回
収、精製手段を利用して、目的とするM−CSF活性ポ
リペプチドを回収すればよい。 さらに大量培養が必要な場合には、マイクロキャリアー
に付着せしめ適宜の撹拌条件、pH条件や酸素供給条件
等にて培養すればよい。 このようにして得られたM−CSF活性ポリペプチド含
有溶液は、例えば減圧濃縮、膜濃縮、硫安や硫酸ナトリ
ウム等を用いた塩析処理、メタノールやエタノール、ア
セトン等の親水性有機溶媒での分別沈殿等の手段を適宜
選択し、組み合わせて行い、沈殿せしめ、さらにこのM
−CSF活性ポリペプチド含有沈殿物を、必要に応じて
精製すればよく、例えばこの沈殿物を水または緩衝液に
熔解し、透析膜にて透析して、より低分子量の不純物を
除去してもよく、またイオン交換樹脂、吸着側やゲル濾
過側等によるイオン交換クロマトグラフィー、吸着クロ
マトグラフィー、やゲル濾過により精製してもよく、精
製M−CSF活性ポリペプチドは凍結乾燥して保存すれ
ばよい。
本発明によれば、安定的、且つ大量のMS−CSF活性
を発現する組換えベクターを提供でき、さらにそれを使
った形質転換細胞の調製により、MS−CSF活性の工
業レベルの大量生産が可能となった。
を発現する組換えベクターを提供でき、さらにそれを使
った形質転換細胞の調製により、MS−CSF活性の工
業レベルの大量生産が可能となった。
次いで本発明の実施例を挙げて本発明を具体的に説明す
るが、本発明は何らこれにより限定されるものではない
。 (以下、余白) 〈実施例1〉 ポI A ’RNAの ヒト細胞TRC−29R株(FERMBP−2375)
を5%牛脂児血清を含むD−MEM培地(ジブコ社製)
で37℃、 5%CO2インキユベーター内で4日間培
養した。 10′1個のこの細胞を40m1の6Mグア
ニジンイソチオシアネート中でホモジナイズしたのち、
18.5ゲージの太さの注射針を通して高分子DNAを
切断し粘度を下げた。 ホモジネートを3分の1容の5.7M塩化セシウム、0
、IM EDTA (PH7,5)の溶液上に重層し、
35、OOOrpm、25℃で18時間遠心した。 遠心後、沈澱物を水3+alに溶解し、等量のフェノー
ル・クロロホルムで処理し、水層を別の試験管に取り、
1o分の1容の3M酢酸ナトリウムおよび2.5倍容
のエタノールを加えて遠心し、沈澱物を集め、減圧乾燥
し、粗RNA5mKを得た。 この沈澱物を1.5mlの水に溶解後、 65℃で5分
間保温し、急冷して1.5mlの40+nM)リス−塩
酸(p H7,6)、1.0MNaC1,1mMEDT
Aおよび0.1%SDSで平衡化した75霞にのオリゴ
(d T)−セルロース(ファルマシア社製)カラムに
吸着させた。10Illlの同じ溶液で洗浄した後、
5mlの20mM)リス−塩酸(p H7,6)、O,
1MNaC1,1mMEDTAおよび0.1%SDS溶
液でポリ(A)’RNA以外のRNAを溶出させた0次
に10mM)リス−塩酸(pH7,5)、 1mMED
TA、0.05%SDSの溶液でポリ(A)’RNAを
溶出させ、始めに溶出してくる1mlを分画した。これ
に10分の1容の3M酢酸ナトリウムおよび2.5倍容
のエタノールを加え、−20℃で一晩放置し、 l 5
t OOOr p m130分の遠心で沈澱を集め、
減圧乾燥した。この様にしてポリ(A)”RNA50μ
gを得た。 〈実施例2〉 cDNA−ブー1 の 実施例1で得たポリ(A)’RNAを1μg/μmにな
るように水に溶解し、その5μlをマイクロチューブに
移し、65℃で5分間加熱し、急冷した後に、これに5
0mM)リス−塩11 (pH8゜3)、 10mM
MgC12、140aMKCI、 10―Nジチオス
レイトールおよび2鳳NのdNTPs(dATP、dG
TP、dCTP、dTTPの等量浪合物)、5μgのオ
リゴ(dT)(ファルマシア社製)と1.5単位の逆転
写酵素(全酒造社製)を加え、全量を20μmとし、4
2℃で1時間反応させた。その反応液に80mM)リス
−@m!(pH7,5)、200mM KCI、10d
MgC12,25μg/ml B、 S、 A、
にRNaseH(全酒造社製)60単位およびDN
Aポリメラーゼ■(ベーリンガーマンハイム社製)5単
位を加えてatを15′Oμmにし、 12℃で1時間
反応させたのち、22℃で1時間反応させた。20μl
の0.25M EDTAとlOμlの10%SDSを加
えて反応を停止したのち、等量のフェノール・りoロホ
ルムを加え、10.OOOrpm、 5分間遠心し、水
層を分取した。それに等量の4M酢酸アンモニウムと2
倍のエタノールを加え、 15,000rpm、15分
間遠心し、沈澱物を集め減圧乾燥した。沈澱物に100
mM)リス−塩酸(pH8,0)、 10mKEDTA
、 80MMS−アデノシルメチオニン、 100μg
/ml B、’ S、A、 および2単位のEe
oRIメチレース(プロメガバイオチック社製)を加え
、 10μlとし、37℃で1時間反応させた。反応後
1反応液に40μlの水を加え1等量のフェノール・ク
ロロホルムで処理し、遠心により分取した水層に、等量
の4に酢酸アンモニウムと2倍のエタノールを加え、7
0℃で15分間放置した。15.OOOrpm、15分
間遠心後の沈澱物に67mM)リス−塩酸(pH8,8
)、6.7eMMgC12,16,6mM硫酸アンモニ
ウム、10mM2−メルカプトエタノール、 6.7
μM EDTA、 0.167%B、 S、
A。 、各750μMdATP、dGTP、dCTP。 dTTPおよびT4DNAポリメラーゼ(全酒造社製)
4単位加え、全量を12μlとし、37℃で1時間反応
させた0等量のフェノール・クロロホルム液で処理し、
エタノール沈澱し、遠心によって沈澱物を口取し、減圧
乾燥した。 1μgのEcoRIリンカ−に50mM)
リス−塩!l[(pH7,6)、10mMMgC12、
IC)+Mジチオスレイトール、 0.1mM スペル
ミジン、 0.1+nMEDTA、10にATPおよび
3単位のT4ポリヌクレオチドカイネース(全酒造社製
)を加え、全量を10μmとし、 37℃で30分間反
応させた。これをT4DNAポリメラーゼ処理後のサン
プルに全量加え、60単位のT4リガーゼ(ファルマシ
ア社製)を加え、 14℃で一晩反応させた。この反応
液に100mMNaC1、50mM)リス−塩酸(pH
7,5)、 10e+?I M g C12、7Il1
M2−メルカプトエタノール、 100μg/mlB、
S。 A、および250単位のEcoRIを加え、全量40μ
mにて、 37℃で2時間反応させた。この反応液を1
%低融点アガロースゲルにて分画し、600〜2.OO
Oべ−XのDNAを含t?ゲ)Lr ヲ口取した。65
℃で10分間保温し、ゲルを融解した後、等量のフェノ
ールを加え、 10分間水冷後、15、OOOrpm、
4℃で10分間遠心した。水層に等量のフェノールを加
え操作を繰り返し、水層をクロロホルムで2回処理し、
10分の1容の3M酢酸ナトリウムおよび2.5倍容
のエタノールを加え、 −70℃に放置した。 15
.OOOrpm。 15分間遠心した後、沈澱を75%エタノールで2回洗
浄し、減圧乾燥した。それにラムダファージベクターλ
gtll (ストラドジーン社1!l)アームを1μ
g加え、ライゲーションキット(全酒造社製)を用いて
、26℃で10分間反応させた。 反応後のサンプルはインビトロパンケージングキット(
ストラドジーン社It)を用いて反応させた。 得られたラムダファージをエシェリヒア・コリLE39
2 (ストラドジーン社製)に感染させ、総数を調べた
ところ、5 、OX 105p f u (plaqu
efomin(unit)よりなっていた。 〈実施例3〉 M−CSF ローンのス V−二ン−グ 作製したTRC−29R株のcDNAライブラリー5.
OX 10’p f uをエシェリヒア・コリLE39
2を指示菌として、 1.5%LB寒天培地(11につ
き、バタトトリプトン10 go バクトイ−ストエ
キストラクト5g、NaNaC11O上にひらき、プラ
ークハイブリダイゼーション法を用いて、M−CSF遺
伝子のクローン選択を行った。又、公知のM−C8F遺
伝子のDNA配列[5icence、Vol、230.
p293−296(1985)コに基づいて、24塩基
の合成ヌクレオチド(5’ −GAGGAGGTGTC
GGAGTACTGTAGC)を作製した。 LBプレート上に溶菌したプラークをナイロン膜上ニ移
シテカラ、Il[を0.5NNaOH11,5M Na
C1、で5分、3M酢酸ナトリウム(pH5,5)で5
分処理した後、80℃減圧下で2時間乾燥した。欣にこ
の膜をビニール袋に入れ、 5濃度度SSC(1倍:
150sMNac1、15+aMクエン酸ナトリウム
)、5倍デンハルト液(1倍:0.02%フィコール、
0.02%ポリビニルピロリドン、0.02%B、
S、 A、 )、50mMリン酸ナトリウム(p
H6,5)、0.1%SDS (ラウリル硫酸ナトリウ
ム)、250μg / m 1サケ精子DNA、 20
%ホルムアミド 10m1中で、37℃、4時間保温し
た。液を除いてから、5′端を12pでラベルした上記
の合成オリゴヌクレオチドプローブ(10”c p m
/ p g)を20ng上液に加え、 37℃で一晩ハ
イブリダイズさせた。 その後膜を2倍5SC10,1%SDSで室温で3回、
37℃で10分洗浄し、通風乾燥して一晩オートラジオ
グラムを行った。シグナルの出た位置の培地をくり抜き
、SM液(0,IMNaCl、8mMMg5Oa、 5
0mM)リス−塩酸(pH7,5)0.(13)%ゼラ
チン)1mlに懸濁し、希釈してLBプレートにひらき
直し、同じプローブでスクリーニングを繰り返し、プラ
ークを純化した結果、2株のクローンを得た。 〈実施例4〉 Ml−CSF“−の 実施例3で得た組換え体ラムダファージ1×105pf
uを宿主菌LE392に感染させ、LB寒天培地プレー
)(13c団X9cm)2枚にひらl/)た。 1枚につき15m1のSM液を加えて、ファージをSM
に浸潤させ、試験管に上層寒天ととも番こ移し、8.O
OOrpm、10分間遠心した。上滑にC0単位のDN
asel(全酒造社製)および1100pのRNase
A(シグマ社製)を加え、37℃で30分間保温した。 これに等量の20%ポリエチレングリコール、 2.5
にNaC1を加え。 1時間氷冷した後、15.OOOrpm、 20分間遠
心し、沈澱物を得た。この沈澱物を0.5mlのSM液
に懸濁し、等量のクロロホルムを加えて処理し、遠心後
の水層に密度が1.15になるように塩化セシウムを加
えた8次いでそれを密度が1.6(2ml)、 1.5
(3ml)、1.4 (3ml)になるように塩化セシ
ウムを加えたSMの溶液上に重層し、30.OOOrp
m、3時間遠心した。 遠心後、密度1.5と1.4の間に表れるファージを含
むバンドを分取し、 トリス−塩酸(pH7,5)に溶
解し、40.OOOrpm、1時間遠心によって沈澱物
を得た。沈澱物を、 20aNEDTA、0.5%SD
S、50μg/mlプロテアーゼK(シグマ社11)で
65℃、1時間処理した。この反応液に等量のフェノー
ルを加え、遠心後の水層を等量のフェノール・クロロホ
ルムで処理し、再度遠心後の水層をクロロホルムで処理
し、水層に1゜分の1容の3M酢酸ナトリウムと2.5
倍容のエタノールを加え一70℃に15分間放置した。 15.000rpm、 15分の遠心にて回収した沈澱
物を75%エタノールで2回洗浄し、減圧乾燥した。 5μg/m1RNaseAを含む水50μlに沈澱を溶
かし、 10μlをHa街液□IHHiatisら、M
o1ecular Cloning、104.Co1d
Spring Harbor(1982))中におい
てEcoRI (東洋紡績社製)で完全消化して挿入断
片を調べると、約1 、Ok b pの最長の断片を有
する、M−C8Fクローンが得られた。EcoRI消化
後に得られた約1.0 k b Pの挿入断片を低融点
アガロースゲル電気泳動により回収した。この約1.0
kbpの挿入断片について、各種制限酵素で消化した結
果、第1図に示す制限酵素地図であった(図中、BはB
amHI、EはEcoRI、SCは5caI、StはS
tu工の各制限酵素サイト告示す、) さらにベクターpUc118をEcoRIで完全消化し
た後1.5(13)1Mトリス−塩酸(pH8,0)中
にバクテリアアルカリホスファターゼ(東洋紡績社製)
を0.5単位加え、 65℃で1時間反応させた。反応
液をフェノール・クロロホルム液テ2回処理した後、水
層に10分の1容の3M酢酸ナトリウムおよび2倍容の
エタノールを加え、遠心してベクターを回収した。ゲル
から回収した挿入断片とEcoRI消化したベクターp
Uc118を、ライゲーションキット(全酒造社製)を
用いて連結させ、 プラスミドpUc118−Ml−C
SFと命名した。 〈実施例5〉 M−C8−de eteの pUcllB−Ml−CSF 50 μ g を、
100mMNaC1、50mM)リス−塩酸(pH
7,5)10mMMgC12、7Il1M2−メルカプ
トエタノールおよび100単位の制限酵素EcoRIを
含む100μmの反応液で、 37℃、2時間消化した
。この反応液に等量の水飽和フェノールを加えて攪拌後
、遠心して水層を分取した。水層に10分の1容の3M
酢酸ナトリウム(pH5,5)と2.5倍量のエタノー
ルを加えて攪拌後、 −80℃で15分間放置した。1
5.OOOrpm、 15分間遠心し、白色のペレッ
トを取得した。このペレットを67nM KPOa、
6.7mM MgCl2、1mM2−メルカプトエタ
ノールおよび33μにのdATP、dCTP、dGTP
、 dTTPを含む反応液10μlに溶解し、フレノ
ウ断片酵素(宝酒造社m1)20単位を加え、22℃で
1時間反応した。 この反応液を1%低融点アガロースゲル(BRL社製)
で電気泳動し、約70obpと約3.2kbpのDNA
断片を抽出、単離した。3.2kbpのDNAIFi片
20ugを、制限酵素St、uIで同様に消化し、3.
1kbpの断片を単離した。この3.1 k b pの
断片2μgを5(13)1Mトリス−塩酸(pH8,0
)中にバクテリアアルカリホスファターゼ 0.511
位を加え、65℃で1時間反応させた後、フェノール抽
出とエタノール沈澱を行い、DNAll1片を回収した
。この脱リン酸化した3、1kbpのDNA断片 11
00nと先に得ている 700bpのDNAlli片
300ngをライゲーションキット(全酒造社製)で連
結し、あらかじめ用意しであるコンピテント菌エシェリ
ヒア・395M109株(全酒造社製)に加えた。これ
を、アンピシリン50μg / m lを含むLB寒天
培地上にまき、37℃で18時間培養し、形質転換体を
得た。この形質転換体よりプラスミドを調製し、DNA
配列を決定して、図2に示すM−C8F−delete
(Ml−delと略祢する)DNA配列を確認し、
pUcllB−Ml−delプラスミドを取得した。 く実施例6〉 ベ タ − pSV2−dhf r (BRL社製)プラスミドDN
A 10μgを各20単位の制限酵素Hi n d■
とBglllで37℃、 2時間消化した。さらに4種
のdNTP存在下で20単位のフレノウ断片酵素を加え
、 22℃、 1時間反応した0反応液を低融点アガロ
ースゲルで電気泳動し、そこから約3.6 kbpのD
NA断片を単離し、バクテリアアルカリホスファターゼ
処理したDNAl1片5μgをamした。別に、 pU
cllB−Ml−de110μgを20単位の制限酵素
EcoRIで37℃、2時間消化し、その後4種のd
NTP存在下で20単位のフレノウ断片酵素で22℃、
1時間反応した。反応液を低融点アガロースゲルで電
気泳動し、そこから約700bpのDNA断片を単離し
た。この断片 300ngと先に用意した3゜6 k
b pのDNA断片 1100nをライゲーションキッ
トで連結し、エシェリヒア・コリJMI C9を宿主菌
にした形質転換体を取り、これからpSV2−Ml−c
(elプラスミドを取得した。 一方、 pSV2−dhfrプラスミドDNA 1
5μgを30単位の制限酵素PvuIIで消化し、リン
酸化EcoRIリンカ−(G−G−A−A−T −T
−C−C: 全酒造社製)1μgをライゲーションキ
ットで連結した0反応液を100単位の制限酵素Eco
RIで37℃、2時間消化し、低融点アガロースゲルで
電気泳動し、約2.4kbpのDNAII片を単離した
。この断片 aoongと、先に構築したpSV2−M
l−delプラスミド5μgを10単位の制限酵素Ec
oRIで37℃、2時間消化し、さらにバクテリアアル
カリホスファターゼ処理したDNA 1100nをラ
イゲーションキットで連結した。エシェリヒア・コリJ
M109を宿主菌として形g11検体を取り、pSV2
−dhf r−Ml−delプラスミドを取得した。対
照試験に使用する発現ベクターの構築には、pUc11
8−Ml−C8F 50μgを用いて、全く同様な操
作によって、 pSV2−dhfr −Ml−CSF
プラスミドを作製した。 〈実施例7〉 遺伝子移入は電気パルス穿孔法(HIGHVOLTAG
ECELL PROCESSOR: BIOLECTR
ONIC5社製)で行った。5%牛脂児血清含有HAM
F12培地を用いてプラスティックプレート上で培
養したCHOdhfr−細胞(東京大学応用微生物研究
所より分与)を剥離酵素(ナガーゼ; 長瀬産業)によ
り剥離し、PBS(−)に懸濁、遠沈操作により細胞を
回収した。この細胞を1x107個/mlとなるように
PBS (−)で懸濁し、実施例6で作製したプラスミ
ドpSV2−dhf r−Ml−delおよびP S
V 2− d h f r −M 1− C,S Fを
各40μg / m iとなるように添加した。攪伴後
、チャンバーに懸濁液を入れて高電圧パルスをかけた。 パルス条件は、電極間比113mm、電圧1200v、
パルス幅30μs e c、 パルス回数5回で行っ
た。パルス後、すみやかに細胞懸濁液を回収して水冷下
に保持し、あらかじめ培地(5%牛脂児血清含有HA’
M F12)を加えておpzたプラスティックシャー
レに播種した。 37℃、5%CO2インキユベーター内で48時間培養
後、培地を選択培地(5%牛脂児透析血清含゛有α−M
EM)に交換した。培地交換後、 10〜14日目に選
択培地中で増殖する細胞のコロニーが確認された。この
コロニーを口紙法務こよりクローニングし、培養上清中
のM−C8F活性を渓す定した。M−C8Fの活性測定
法はM e t c a 1fによる方法[J、Bio
l、Mad、、44,287−300(1986)]に
従い、 1コロニーを1単位として活性を算定した。M
−C8F活性の確認されたトランスフォーマントはMT
X含有培地(5%牛脂児透析血清、0.1〜10μM
MTX含有 α−MEM)で培養し、MTXII度を0
.1,0.5,2.10 pMまテ段階的に上昇させた
。その結果得られた、MTX1度10μに耐性株のM−
C8F活性を測定したところ、ネイティブ型Ml−CS
F遺伝子を用いた場合、70,000ユニット/mlの
生産性を示した。また、M 1− d e l遺伝子を
使用した株では、600 、OOOユニット/ m l
の生産性を示し、膜結合部位を削除した遺伝子を移入す
ることにより約10倍生産性の高いトランスフォーマン
トを得、Ml−del 14−2と命名し、微工研菌
寄第11756号として寄託した。 トランスフォーマ
ン) (Ml−del 14−2)は、5%牛脂児血
清含有α−MEM培地で1力月間安定的に600.00
0ユニツト/rfilの生産性を示した。 〈実施例8〉 TR−29R CS 遺伝子移入は電気パルス穿孔法(HIGHVOLTAG
ECELL PROCESSOR; BIOLECTR
ONIC5社製)で行った。5%牛脂児血清含有RPM
I 1640培地を用いてプラスティックプレート上
で培養したTRC−,29R細胞(FERM BP−
2375)を剥離酵素(ナガーゼ; 長瀬産業)によっ
て剥離し、PBS (−)に懸濁、遠沈操作により細胞
を回収した。この細胞を5X106個/ m 1となる
ようにPBS(−)で懸濁し、実施例6で作製したプラ
スミドpSV2 dhfr−Ml−delおよびpS
V2−dhfr−Ml−C8Fを各40μg/ m 1
となるように添加した。攪伴後、チャンバーに懸濁液を
入れて高電圧パルスをかけた。パルス条件は、電極間y
@ 93 m m、電圧800V、パルス幅30μse
c、パルス回数3回で行った。 パルス後、すみやかに細胞懸濁液を回収して水冷下に保
持し、あらかじめ培地(5%牛脂児血清含有RPMI
1640)を加えておいたプラステイツクシャーレに
播種した。 37℃、5%C○2インキュベーター内で48時間後、
培地を選択培地(5%牛脂児血清、0418200μg
/ml含有RPMI 1640)に交換した。培地交
換後、10〜14日目に選択培地中で増殖する細胞のコ
ロニーが確認された。このコロニーを口紙法によりクロ
ーニングし、培養上滑中のM−CSF活性を測定した。 M−CSFの活性測定法はM e t c a 1 f
による方法[J、Biol、河ed、、44,287−
300(1986)]に従い、 1コロニーを1単位と
して活性を算定した。M−C8F活性の確認されたトラ
ンスフォーマントはMTX含有培地(5%牛脂児透析血
清、0.1〜10μNMTX含有 RPMI 164
0)で培養し、MTX1度を0.1,0.5,2,10
μにまで段階的に上昇させた。その結果得られた1MT
X1度10μMffl性株のM−C8F活性を測定した
ところ、ネイティブ型Ml−C8F遺伝子を用いた場合
、4.000ユニツト/ m lの生産性を示した。ま
た、Ml−del遺伝子を使用した株では、35,00
0ユニツト/mlの生産性を示し、膜結合部位を削除し
た遺伝子を移入することにより約10倍生産性の高いト
ランスフォーマント(delM−15と命名)を得るこ
とができた。さらにこのトランスフォーマント(del
M−15)は、5%牛脂児血清含有RPMI 164
0培地で1ケ月間安定的に35,000ユニツト/ m
lの生産性を示した。 〈実施例9〉 CHO細胞Ml−dal 14−2を5%牛脂児血清
を含むD−MEM培地を用いて、37℃、5%C○2イ
ンキュベーター内で2週間培養した2(13)17)ル
の培養上清を限外濾過III(ミリボア社)で2リフド
ルに濃縮後、終濃度が4MになるようNaC1を添加し
、4M NaC1を含むpH7,0の1(13)1阿リ
ン酸ナトリウム緩衝液で平衡化したPhenyl−3e
pharose CL−4B (ファルマシア社、
5×50cm)に吸着させた。これをpH7,0の10
冒にリン酸ナトリウム緩衝液(以下緩衝液Aと略する)
に4N〜OMのNaC1濃度で作製したリニアグラジェ
ントで溶出させ、NaC1濃度1.5M 〜1.0M
(7)間で溶出したM−C8F活性画分を得た。この活
性画分をYM−10膜(アミコン社)で10m1に濃縮
し、80膜MのNaclを含む緩衝液Aで平衡化した5
ephadex G−25(ファルマシア社、 9.
1 m l )で脱塩し、同緩衝液で平衡化したDEA
E−Ce 11 u 1 。 fine(生化学工業社、2.5xlOcm)に吸着サ
セ、 0.1〜0.5M のNaC1m度で作製したリ
ニアグラジェントで溶出させた。NaC11度0.12
〜0.15Mの間で溶出した、M−CSF活性画分をY
M−l ogで6mlに濃縮後、11衝液Aで平衡化し
た Ul trogel AcA34 (IBF
バイオチク=yり社、 2.5×92cm)でゲルi!
!過し、M−CSF活性画分を得た。 この活性画分を7mlに濃縮し、終濃度4Mになるよう
NaC1を添加し、4MのNaC1を含む緩衝液Aで平
衡化した Phenyl−8uper。 se(ファルマシア社、 1.OXlocm)に吸着さ
せ、NaC1濃度4M〜OMで作製したリニアグラジェ
ントで溶出した。NaC1濃度2 ?I −1?lで溶
出したM−CSF活性画分を200倍量のwIw液Aに
対して透析し、最終精製標品とした。この精製標品につ
いて、緩衝液Aで平衡化した 5uperose 1
2 (ファルマシア社、 1.OX30cm)による分
子量測定を行ったところ、約70.000ダルトンであ
り、 5DS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結
果 28.000±2.000ダルトンのやや幅広なバ
ンドを示した。さらに、この精製標品の総量をUV吸収
で測定した結果。 A 21111= 0.26であった。また、軟寒天コ
ロニ法におけるM−CSF活性の測定の結果、1゜2×
10 ”u / A 2@eであった。 〈実施例10> 実施例9で得られた標品250μg (9ml)を透析
チューブに入れ、 5ephadex G−100
をまぶして約1mlにまで濃縮した後、200m1の0
.IM β−メルカプトエタノール、 1% SDS、
10%グリセロールを含む65■にトリス緩衝液pH6
,8に対して24時間透析し、SH基の還元と蛋白の変
性を行った。この透析内液に終濃度150+aMになる
ようモノヨード酢酸を加え、室温に30分放置してMl
−CSFを還元カルボキシメチル化した。これを0.0
(13)% PEG で平衡化したイオン交換樹脂 A
G11A8(バイオ−ラッド社、 0.6×10cm)
と 5ephadex G−50(ファルマシア社、
1.0×9.0cm)をつないだカラムにより脱塩、
脱SDSを行った。ELISAにより同定した還元カル
ボキシメチル化Ml−C8F両分を凍結乾燥後、1ml
の10eMEDTA、10mMDTT、0.1%SDS
、1%Triton X−100を含む100mNリ
ン酸ナトリウム緩衝液pH7,0に溶解し、 IUのN
−Glycanase (ジエンザイム社)を添加し
、37℃で24時間反応させMl−C8Fの糖鎖を切断
した。この脱11M 1−CSFをTMC−PACK
AP−303300AODS (山村化学社)に吸着
させ、0〜70%のアセトニトリル濃度のリニアグラジ
ェントで溶出した。 60%アセトニトリル濃度で溶出
された脱糖鎖Ml−CSFを凍結乾燥し、4ooμlの
10mM リン酸ナトリウム!l@液p H7,0に
溶解し、5μgのエンドプロテイナーゼ Lys−C(
ベーリンガー・マンハイム社)を加えて37℃で17時
間反応を行った。この反応系を、20mMCaCl2を
含む50口M#酸緩衝液p H5,0で平衡化した50
0μlのアンヒドロトリプシンアガロース(宝酒造社)
に供し、素通り画分を分取した。この素通り画分に含ま
れるC末端ペプチドをTSKODS 120T ()
−ソー社)に吸着させ、 5〜60%のアセトニトリル
濃度のリニアグラジェントで溶出し、アセトニトリル濃
度25%で溶出されるC末端ペプチドを分取した。これ
をPSG−1自動アミノ酸シークエンサー(島津製作所
社)で解析した結果、−Asn−X −Asp−^5n
−5er−Phe−Ala−Glu−X −5er−3
er−Gln−Gly−His−Glu−Arz−Gl
n−5er−Glu−Gly−5er−であった。 対照として、ネイティブ型Ml−CSF遺伝子を持つC
HO細胞Ml−CSF高生産株から、上記実施例9およ
び実施例10で示した方法によりMl−CSFを精製し
、エンドプロテイナーゼLys−C切断で生じたC末端
ペプチドのアミノ酸配列を決定した結果、−^sn−X
−^5p−Asn−5er−Phe−^1a−Glu−
X −5er−5er−Gln−Gly−His−Gl
u−^rg−Gin−5er−Glu−Gly−5er
−であり、 Ml−del14−2細胞の生産するM−
CSF活性を有するポリペプチドがネイティブ型Ml−
CSFと一敗するこ
るが、本発明は何らこれにより限定されるものではない
。 (以下、余白) 〈実施例1〉 ポI A ’RNAの ヒト細胞TRC−29R株(FERMBP−2375)
を5%牛脂児血清を含むD−MEM培地(ジブコ社製)
で37℃、 5%CO2インキユベーター内で4日間培
養した。 10′1個のこの細胞を40m1の6Mグア
ニジンイソチオシアネート中でホモジナイズしたのち、
18.5ゲージの太さの注射針を通して高分子DNAを
切断し粘度を下げた。 ホモジネートを3分の1容の5.7M塩化セシウム、0
、IM EDTA (PH7,5)の溶液上に重層し、
35、OOOrpm、25℃で18時間遠心した。 遠心後、沈澱物を水3+alに溶解し、等量のフェノー
ル・クロロホルムで処理し、水層を別の試験管に取り、
1o分の1容の3M酢酸ナトリウムおよび2.5倍容
のエタノールを加えて遠心し、沈澱物を集め、減圧乾燥
し、粗RNA5mKを得た。 この沈澱物を1.5mlの水に溶解後、 65℃で5分
間保温し、急冷して1.5mlの40+nM)リス−塩
酸(p H7,6)、1.0MNaC1,1mMEDT
Aおよび0.1%SDSで平衡化した75霞にのオリゴ
(d T)−セルロース(ファルマシア社製)カラムに
吸着させた。10Illlの同じ溶液で洗浄した後、
5mlの20mM)リス−塩酸(p H7,6)、O,
1MNaC1,1mMEDTAおよび0.1%SDS溶
液でポリ(A)’RNA以外のRNAを溶出させた0次
に10mM)リス−塩酸(pH7,5)、 1mMED
TA、0.05%SDSの溶液でポリ(A)’RNAを
溶出させ、始めに溶出してくる1mlを分画した。これ
に10分の1容の3M酢酸ナトリウムおよび2.5倍容
のエタノールを加え、−20℃で一晩放置し、 l 5
t OOOr p m130分の遠心で沈澱を集め、
減圧乾燥した。この様にしてポリ(A)”RNA50μ
gを得た。 〈実施例2〉 cDNA−ブー1 の 実施例1で得たポリ(A)’RNAを1μg/μmにな
るように水に溶解し、その5μlをマイクロチューブに
移し、65℃で5分間加熱し、急冷した後に、これに5
0mM)リス−塩11 (pH8゜3)、 10mM
MgC12、140aMKCI、 10―Nジチオス
レイトールおよび2鳳NのdNTPs(dATP、dG
TP、dCTP、dTTPの等量浪合物)、5μgのオ
リゴ(dT)(ファルマシア社製)と1.5単位の逆転
写酵素(全酒造社製)を加え、全量を20μmとし、4
2℃で1時間反応させた。その反応液に80mM)リス
−@m!(pH7,5)、200mM KCI、10d
MgC12,25μg/ml B、 S、 A、
にRNaseH(全酒造社製)60単位およびDN
Aポリメラーゼ■(ベーリンガーマンハイム社製)5単
位を加えてatを15′Oμmにし、 12℃で1時間
反応させたのち、22℃で1時間反応させた。20μl
の0.25M EDTAとlOμlの10%SDSを加
えて反応を停止したのち、等量のフェノール・りoロホ
ルムを加え、10.OOOrpm、 5分間遠心し、水
層を分取した。それに等量の4M酢酸アンモニウムと2
倍のエタノールを加え、 15,000rpm、15分
間遠心し、沈澱物を集め減圧乾燥した。沈澱物に100
mM)リス−塩酸(pH8,0)、 10mKEDTA
、 80MMS−アデノシルメチオニン、 100μg
/ml B、’ S、A、 および2単位のEe
oRIメチレース(プロメガバイオチック社製)を加え
、 10μlとし、37℃で1時間反応させた。反応後
1反応液に40μlの水を加え1等量のフェノール・ク
ロロホルムで処理し、遠心により分取した水層に、等量
の4に酢酸アンモニウムと2倍のエタノールを加え、7
0℃で15分間放置した。15.OOOrpm、15分
間遠心後の沈澱物に67mM)リス−塩酸(pH8,8
)、6.7eMMgC12,16,6mM硫酸アンモニ
ウム、10mM2−メルカプトエタノール、 6.7
μM EDTA、 0.167%B、 S、
A。 、各750μMdATP、dGTP、dCTP。 dTTPおよびT4DNAポリメラーゼ(全酒造社製)
4単位加え、全量を12μlとし、37℃で1時間反応
させた0等量のフェノール・クロロホルム液で処理し、
エタノール沈澱し、遠心によって沈澱物を口取し、減圧
乾燥した。 1μgのEcoRIリンカ−に50mM)
リス−塩!l[(pH7,6)、10mMMgC12、
IC)+Mジチオスレイトール、 0.1mM スペル
ミジン、 0.1+nMEDTA、10にATPおよび
3単位のT4ポリヌクレオチドカイネース(全酒造社製
)を加え、全量を10μmとし、 37℃で30分間反
応させた。これをT4DNAポリメラーゼ処理後のサン
プルに全量加え、60単位のT4リガーゼ(ファルマシ
ア社製)を加え、 14℃で一晩反応させた。この反応
液に100mMNaC1、50mM)リス−塩酸(pH
7,5)、 10e+?I M g C12、7Il1
M2−メルカプトエタノール、 100μg/mlB、
S。 A、および250単位のEcoRIを加え、全量40μ
mにて、 37℃で2時間反応させた。この反応液を1
%低融点アガロースゲルにて分画し、600〜2.OO
Oべ−XのDNAを含t?ゲ)Lr ヲ口取した。65
℃で10分間保温し、ゲルを融解した後、等量のフェノ
ールを加え、 10分間水冷後、15、OOOrpm、
4℃で10分間遠心した。水層に等量のフェノールを加
え操作を繰り返し、水層をクロロホルムで2回処理し、
10分の1容の3M酢酸ナトリウムおよび2.5倍容
のエタノールを加え、 −70℃に放置した。 15
.OOOrpm。 15分間遠心した後、沈澱を75%エタノールで2回洗
浄し、減圧乾燥した。それにラムダファージベクターλ
gtll (ストラドジーン社1!l)アームを1μ
g加え、ライゲーションキット(全酒造社製)を用いて
、26℃で10分間反応させた。 反応後のサンプルはインビトロパンケージングキット(
ストラドジーン社It)を用いて反応させた。 得られたラムダファージをエシェリヒア・コリLE39
2 (ストラドジーン社製)に感染させ、総数を調べた
ところ、5 、OX 105p f u (plaqu
efomin(unit)よりなっていた。 〈実施例3〉 M−CSF ローンのス V−二ン−グ 作製したTRC−29R株のcDNAライブラリー5.
OX 10’p f uをエシェリヒア・コリLE39
2を指示菌として、 1.5%LB寒天培地(11につ
き、バタトトリプトン10 go バクトイ−ストエ
キストラクト5g、NaNaC11O上にひらき、プラ
ークハイブリダイゼーション法を用いて、M−CSF遺
伝子のクローン選択を行った。又、公知のM−C8F遺
伝子のDNA配列[5icence、Vol、230.
p293−296(1985)コに基づいて、24塩基
の合成ヌクレオチド(5’ −GAGGAGGTGTC
GGAGTACTGTAGC)を作製した。 LBプレート上に溶菌したプラークをナイロン膜上ニ移
シテカラ、Il[を0.5NNaOH11,5M Na
C1、で5分、3M酢酸ナトリウム(pH5,5)で5
分処理した後、80℃減圧下で2時間乾燥した。欣にこ
の膜をビニール袋に入れ、 5濃度度SSC(1倍:
150sMNac1、15+aMクエン酸ナトリウム
)、5倍デンハルト液(1倍:0.02%フィコール、
0.02%ポリビニルピロリドン、0.02%B、
S、 A、 )、50mMリン酸ナトリウム(p
H6,5)、0.1%SDS (ラウリル硫酸ナトリウ
ム)、250μg / m 1サケ精子DNA、 20
%ホルムアミド 10m1中で、37℃、4時間保温し
た。液を除いてから、5′端を12pでラベルした上記
の合成オリゴヌクレオチドプローブ(10”c p m
/ p g)を20ng上液に加え、 37℃で一晩ハ
イブリダイズさせた。 その後膜を2倍5SC10,1%SDSで室温で3回、
37℃で10分洗浄し、通風乾燥して一晩オートラジオ
グラムを行った。シグナルの出た位置の培地をくり抜き
、SM液(0,IMNaCl、8mMMg5Oa、 5
0mM)リス−塩酸(pH7,5)0.(13)%ゼラ
チン)1mlに懸濁し、希釈してLBプレートにひらき
直し、同じプローブでスクリーニングを繰り返し、プラ
ークを純化した結果、2株のクローンを得た。 〈実施例4〉 Ml−CSF“−の 実施例3で得た組換え体ラムダファージ1×105pf
uを宿主菌LE392に感染させ、LB寒天培地プレー
)(13c団X9cm)2枚にひらl/)た。 1枚につき15m1のSM液を加えて、ファージをSM
に浸潤させ、試験管に上層寒天ととも番こ移し、8.O
OOrpm、10分間遠心した。上滑にC0単位のDN
asel(全酒造社製)および1100pのRNase
A(シグマ社製)を加え、37℃で30分間保温した。 これに等量の20%ポリエチレングリコール、 2.5
にNaC1を加え。 1時間氷冷した後、15.OOOrpm、 20分間遠
心し、沈澱物を得た。この沈澱物を0.5mlのSM液
に懸濁し、等量のクロロホルムを加えて処理し、遠心後
の水層に密度が1.15になるように塩化セシウムを加
えた8次いでそれを密度が1.6(2ml)、 1.5
(3ml)、1.4 (3ml)になるように塩化セシ
ウムを加えたSMの溶液上に重層し、30.OOOrp
m、3時間遠心した。 遠心後、密度1.5と1.4の間に表れるファージを含
むバンドを分取し、 トリス−塩酸(pH7,5)に溶
解し、40.OOOrpm、1時間遠心によって沈澱物
を得た。沈澱物を、 20aNEDTA、0.5%SD
S、50μg/mlプロテアーゼK(シグマ社11)で
65℃、1時間処理した。この反応液に等量のフェノー
ルを加え、遠心後の水層を等量のフェノール・クロロホ
ルムで処理し、再度遠心後の水層をクロロホルムで処理
し、水層に1゜分の1容の3M酢酸ナトリウムと2.5
倍容のエタノールを加え一70℃に15分間放置した。 15.000rpm、 15分の遠心にて回収した沈澱
物を75%エタノールで2回洗浄し、減圧乾燥した。 5μg/m1RNaseAを含む水50μlに沈澱を溶
かし、 10μlをHa街液□IHHiatisら、M
o1ecular Cloning、104.Co1d
Spring Harbor(1982))中におい
てEcoRI (東洋紡績社製)で完全消化して挿入断
片を調べると、約1 、Ok b pの最長の断片を有
する、M−C8Fクローンが得られた。EcoRI消化
後に得られた約1.0 k b Pの挿入断片を低融点
アガロースゲル電気泳動により回収した。この約1.0
kbpの挿入断片について、各種制限酵素で消化した結
果、第1図に示す制限酵素地図であった(図中、BはB
amHI、EはEcoRI、SCは5caI、StはS
tu工の各制限酵素サイト告示す、) さらにベクターpUc118をEcoRIで完全消化し
た後1.5(13)1Mトリス−塩酸(pH8,0)中
にバクテリアアルカリホスファターゼ(東洋紡績社製)
を0.5単位加え、 65℃で1時間反応させた。反応
液をフェノール・クロロホルム液テ2回処理した後、水
層に10分の1容の3M酢酸ナトリウムおよび2倍容の
エタノールを加え、遠心してベクターを回収した。ゲル
から回収した挿入断片とEcoRI消化したベクターp
Uc118を、ライゲーションキット(全酒造社製)を
用いて連結させ、 プラスミドpUc118−Ml−C
SFと命名した。 〈実施例5〉 M−C8−de eteの pUcllB−Ml−CSF 50 μ g を、
100mMNaC1、50mM)リス−塩酸(pH
7,5)10mMMgC12、7Il1M2−メルカプ
トエタノールおよび100単位の制限酵素EcoRIを
含む100μmの反応液で、 37℃、2時間消化した
。この反応液に等量の水飽和フェノールを加えて攪拌後
、遠心して水層を分取した。水層に10分の1容の3M
酢酸ナトリウム(pH5,5)と2.5倍量のエタノー
ルを加えて攪拌後、 −80℃で15分間放置した。1
5.OOOrpm、 15分間遠心し、白色のペレッ
トを取得した。このペレットを67nM KPOa、
6.7mM MgCl2、1mM2−メルカプトエタ
ノールおよび33μにのdATP、dCTP、dGTP
、 dTTPを含む反応液10μlに溶解し、フレノ
ウ断片酵素(宝酒造社m1)20単位を加え、22℃で
1時間反応した。 この反応液を1%低融点アガロースゲル(BRL社製)
で電気泳動し、約70obpと約3.2kbpのDNA
断片を抽出、単離した。3.2kbpのDNAIFi片
20ugを、制限酵素St、uIで同様に消化し、3.
1kbpの断片を単離した。この3.1 k b pの
断片2μgを5(13)1Mトリス−塩酸(pH8,0
)中にバクテリアアルカリホスファターゼ 0.511
位を加え、65℃で1時間反応させた後、フェノール抽
出とエタノール沈澱を行い、DNAll1片を回収した
。この脱リン酸化した3、1kbpのDNA断片 11
00nと先に得ている 700bpのDNAlli片
300ngをライゲーションキット(全酒造社製)で連
結し、あらかじめ用意しであるコンピテント菌エシェリ
ヒア・395M109株(全酒造社製)に加えた。これ
を、アンピシリン50μg / m lを含むLB寒天
培地上にまき、37℃で18時間培養し、形質転換体を
得た。この形質転換体よりプラスミドを調製し、DNA
配列を決定して、図2に示すM−C8F−delete
(Ml−delと略祢する)DNA配列を確認し、
pUcllB−Ml−delプラスミドを取得した。 く実施例6〉 ベ タ − pSV2−dhf r (BRL社製)プラスミドDN
A 10μgを各20単位の制限酵素Hi n d■
とBglllで37℃、 2時間消化した。さらに4種
のdNTP存在下で20単位のフレノウ断片酵素を加え
、 22℃、 1時間反応した0反応液を低融点アガロ
ースゲルで電気泳動し、そこから約3.6 kbpのD
NA断片を単離し、バクテリアアルカリホスファターゼ
処理したDNAl1片5μgをamした。別に、 pU
cllB−Ml−de110μgを20単位の制限酵素
EcoRIで37℃、2時間消化し、その後4種のd
NTP存在下で20単位のフレノウ断片酵素で22℃、
1時間反応した。反応液を低融点アガロースゲルで電
気泳動し、そこから約700bpのDNA断片を単離し
た。この断片 300ngと先に用意した3゜6 k
b pのDNA断片 1100nをライゲーションキッ
トで連結し、エシェリヒア・コリJMI C9を宿主菌
にした形質転換体を取り、これからpSV2−Ml−c
(elプラスミドを取得した。 一方、 pSV2−dhfrプラスミドDNA 1
5μgを30単位の制限酵素PvuIIで消化し、リン
酸化EcoRIリンカ−(G−G−A−A−T −T
−C−C: 全酒造社製)1μgをライゲーションキ
ットで連結した0反応液を100単位の制限酵素Eco
RIで37℃、2時間消化し、低融点アガロースゲルで
電気泳動し、約2.4kbpのDNAII片を単離した
。この断片 aoongと、先に構築したpSV2−M
l−delプラスミド5μgを10単位の制限酵素Ec
oRIで37℃、2時間消化し、さらにバクテリアアル
カリホスファターゼ処理したDNA 1100nをラ
イゲーションキットで連結した。エシェリヒア・コリJ
M109を宿主菌として形g11検体を取り、pSV2
−dhf r−Ml−delプラスミドを取得した。対
照試験に使用する発現ベクターの構築には、pUc11
8−Ml−C8F 50μgを用いて、全く同様な操
作によって、 pSV2−dhfr −Ml−CSF
プラスミドを作製した。 〈実施例7〉 遺伝子移入は電気パルス穿孔法(HIGHVOLTAG
ECELL PROCESSOR: BIOLECTR
ONIC5社製)で行った。5%牛脂児血清含有HAM
F12培地を用いてプラスティックプレート上で培
養したCHOdhfr−細胞(東京大学応用微生物研究
所より分与)を剥離酵素(ナガーゼ; 長瀬産業)によ
り剥離し、PBS(−)に懸濁、遠沈操作により細胞を
回収した。この細胞を1x107個/mlとなるように
PBS (−)で懸濁し、実施例6で作製したプラスミ
ドpSV2−dhf r−Ml−delおよびP S
V 2− d h f r −M 1− C,S Fを
各40μg / m iとなるように添加した。攪伴後
、チャンバーに懸濁液を入れて高電圧パルスをかけた。 パルス条件は、電極間比113mm、電圧1200v、
パルス幅30μs e c、 パルス回数5回で行っ
た。パルス後、すみやかに細胞懸濁液を回収して水冷下
に保持し、あらかじめ培地(5%牛脂児血清含有HA’
M F12)を加えておpzたプラスティックシャー
レに播種した。 37℃、5%CO2インキユベーター内で48時間培養
後、培地を選択培地(5%牛脂児透析血清含゛有α−M
EM)に交換した。培地交換後、 10〜14日目に選
択培地中で増殖する細胞のコロニーが確認された。この
コロニーを口紙法務こよりクローニングし、培養上清中
のM−C8F活性を渓す定した。M−C8Fの活性測定
法はM e t c a 1fによる方法[J、Bio
l、Mad、、44,287−300(1986)]に
従い、 1コロニーを1単位として活性を算定した。M
−C8F活性の確認されたトランスフォーマントはMT
X含有培地(5%牛脂児透析血清、0.1〜10μM
MTX含有 α−MEM)で培養し、MTXII度を0
.1,0.5,2.10 pMまテ段階的に上昇させた
。その結果得られた、MTX1度10μに耐性株のM−
C8F活性を測定したところ、ネイティブ型Ml−CS
F遺伝子を用いた場合、70,000ユニット/mlの
生産性を示した。また、M 1− d e l遺伝子を
使用した株では、600 、OOOユニット/ m l
の生産性を示し、膜結合部位を削除した遺伝子を移入す
ることにより約10倍生産性の高いトランスフォーマン
トを得、Ml−del 14−2と命名し、微工研菌
寄第11756号として寄託した。 トランスフォーマ
ン) (Ml−del 14−2)は、5%牛脂児血
清含有α−MEM培地で1力月間安定的に600.00
0ユニツト/rfilの生産性を示した。 〈実施例8〉 TR−29R CS 遺伝子移入は電気パルス穿孔法(HIGHVOLTAG
ECELL PROCESSOR; BIOLECTR
ONIC5社製)で行った。5%牛脂児血清含有RPM
I 1640培地を用いてプラスティックプレート上
で培養したTRC−,29R細胞(FERM BP−
2375)を剥離酵素(ナガーゼ; 長瀬産業)によっ
て剥離し、PBS (−)に懸濁、遠沈操作により細胞
を回収した。この細胞を5X106個/ m 1となる
ようにPBS(−)で懸濁し、実施例6で作製したプラ
スミドpSV2 dhfr−Ml−delおよびpS
V2−dhfr−Ml−C8Fを各40μg/ m 1
となるように添加した。攪伴後、チャンバーに懸濁液を
入れて高電圧パルスをかけた。パルス条件は、電極間y
@ 93 m m、電圧800V、パルス幅30μse
c、パルス回数3回で行った。 パルス後、すみやかに細胞懸濁液を回収して水冷下に保
持し、あらかじめ培地(5%牛脂児血清含有RPMI
1640)を加えておいたプラステイツクシャーレに
播種した。 37℃、5%C○2インキュベーター内で48時間後、
培地を選択培地(5%牛脂児血清、0418200μg
/ml含有RPMI 1640)に交換した。培地交
換後、10〜14日目に選択培地中で増殖する細胞のコ
ロニーが確認された。このコロニーを口紙法によりクロ
ーニングし、培養上滑中のM−CSF活性を測定した。 M−CSFの活性測定法はM e t c a 1 f
による方法[J、Biol、河ed、、44,287−
300(1986)]に従い、 1コロニーを1単位と
して活性を算定した。M−C8F活性の確認されたトラ
ンスフォーマントはMTX含有培地(5%牛脂児透析血
清、0.1〜10μNMTX含有 RPMI 164
0)で培養し、MTX1度を0.1,0.5,2,10
μにまで段階的に上昇させた。その結果得られた1MT
X1度10μMffl性株のM−C8F活性を測定した
ところ、ネイティブ型Ml−C8F遺伝子を用いた場合
、4.000ユニツト/ m lの生産性を示した。ま
た、Ml−del遺伝子を使用した株では、35,00
0ユニツト/mlの生産性を示し、膜結合部位を削除し
た遺伝子を移入することにより約10倍生産性の高いト
ランスフォーマント(delM−15と命名)を得るこ
とができた。さらにこのトランスフォーマント(del
M−15)は、5%牛脂児血清含有RPMI 164
0培地で1ケ月間安定的に35,000ユニツト/ m
lの生産性を示した。 〈実施例9〉 CHO細胞Ml−dal 14−2を5%牛脂児血清
を含むD−MEM培地を用いて、37℃、5%C○2イ
ンキュベーター内で2週間培養した2(13)17)ル
の培養上清を限外濾過III(ミリボア社)で2リフド
ルに濃縮後、終濃度が4MになるようNaC1を添加し
、4M NaC1を含むpH7,0の1(13)1阿リ
ン酸ナトリウム緩衝液で平衡化したPhenyl−3e
pharose CL−4B (ファルマシア社、
5×50cm)に吸着させた。これをpH7,0の10
冒にリン酸ナトリウム緩衝液(以下緩衝液Aと略する)
に4N〜OMのNaC1濃度で作製したリニアグラジェ
ントで溶出させ、NaC1濃度1.5M 〜1.0M
(7)間で溶出したM−C8F活性画分を得た。この活
性画分をYM−10膜(アミコン社)で10m1に濃縮
し、80膜MのNaclを含む緩衝液Aで平衡化した5
ephadex G−25(ファルマシア社、 9.
1 m l )で脱塩し、同緩衝液で平衡化したDEA
E−Ce 11 u 1 。 fine(生化学工業社、2.5xlOcm)に吸着サ
セ、 0.1〜0.5M のNaC1m度で作製したリ
ニアグラジェントで溶出させた。NaC11度0.12
〜0.15Mの間で溶出した、M−CSF活性画分をY
M−l ogで6mlに濃縮後、11衝液Aで平衡化し
た Ul trogel AcA34 (IBF
バイオチク=yり社、 2.5×92cm)でゲルi!
!過し、M−CSF活性画分を得た。 この活性画分を7mlに濃縮し、終濃度4Mになるよう
NaC1を添加し、4MのNaC1を含む緩衝液Aで平
衡化した Phenyl−8uper。 se(ファルマシア社、 1.OXlocm)に吸着さ
せ、NaC1濃度4M〜OMで作製したリニアグラジェ
ントで溶出した。NaC1濃度2 ?I −1?lで溶
出したM−CSF活性画分を200倍量のwIw液Aに
対して透析し、最終精製標品とした。この精製標品につ
いて、緩衝液Aで平衡化した 5uperose 1
2 (ファルマシア社、 1.OX30cm)による分
子量測定を行ったところ、約70.000ダルトンであ
り、 5DS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結
果 28.000±2.000ダルトンのやや幅広なバ
ンドを示した。さらに、この精製標品の総量をUV吸収
で測定した結果。 A 21111= 0.26であった。また、軟寒天コ
ロニ法におけるM−CSF活性の測定の結果、1゜2×
10 ”u / A 2@eであった。 〈実施例10> 実施例9で得られた標品250μg (9ml)を透析
チューブに入れ、 5ephadex G−100
をまぶして約1mlにまで濃縮した後、200m1の0
.IM β−メルカプトエタノール、 1% SDS、
10%グリセロールを含む65■にトリス緩衝液pH6
,8に対して24時間透析し、SH基の還元と蛋白の変
性を行った。この透析内液に終濃度150+aMになる
ようモノヨード酢酸を加え、室温に30分放置してMl
−CSFを還元カルボキシメチル化した。これを0.0
(13)% PEG で平衡化したイオン交換樹脂 A
G11A8(バイオ−ラッド社、 0.6×10cm)
と 5ephadex G−50(ファルマシア社、
1.0×9.0cm)をつないだカラムにより脱塩、
脱SDSを行った。ELISAにより同定した還元カル
ボキシメチル化Ml−C8F両分を凍結乾燥後、1ml
の10eMEDTA、10mMDTT、0.1%SDS
、1%Triton X−100を含む100mNリ
ン酸ナトリウム緩衝液pH7,0に溶解し、 IUのN
−Glycanase (ジエンザイム社)を添加し
、37℃で24時間反応させMl−C8Fの糖鎖を切断
した。この脱11M 1−CSFをTMC−PACK
AP−303300AODS (山村化学社)に吸着
させ、0〜70%のアセトニトリル濃度のリニアグラジ
ェントで溶出した。 60%アセトニトリル濃度で溶出
された脱糖鎖Ml−CSFを凍結乾燥し、4ooμlの
10mM リン酸ナトリウム!l@液p H7,0に
溶解し、5μgのエンドプロテイナーゼ Lys−C(
ベーリンガー・マンハイム社)を加えて37℃で17時
間反応を行った。この反応系を、20mMCaCl2を
含む50口M#酸緩衝液p H5,0で平衡化した50
0μlのアンヒドロトリプシンアガロース(宝酒造社)
に供し、素通り画分を分取した。この素通り画分に含ま
れるC末端ペプチドをTSKODS 120T ()
−ソー社)に吸着させ、 5〜60%のアセトニトリル
濃度のリニアグラジェントで溶出し、アセトニトリル濃
度25%で溶出されるC末端ペプチドを分取した。これ
をPSG−1自動アミノ酸シークエンサー(島津製作所
社)で解析した結果、−Asn−X −Asp−^5n
−5er−Phe−Ala−Glu−X −5er−3
er−Gln−Gly−His−Glu−Arz−Gl
n−5er−Glu−Gly−5er−であった。 対照として、ネイティブ型Ml−CSF遺伝子を持つC
HO細胞Ml−CSF高生産株から、上記実施例9およ
び実施例10で示した方法によりMl−CSFを精製し
、エンドプロテイナーゼLys−C切断で生じたC末端
ペプチドのアミノ酸配列を決定した結果、−^sn−X
−^5p−Asn−5er−Phe−^1a−Glu−
X −5er−5er−Gln−Gly−His−Gl
u−^rg−Gin−5er−Glu−Gly−5er
−であり、 Ml−del14−2細胞の生産するM−
CSF活性を有するポリペプチドがネイティブ型Ml−
CSFと一敗するこ
第1図は本願のMS−CSF活性の安定的高発現組換え
ヘクターを示し、第2図はMl−delに対応するアミ
ノ酸配列を示し、第3図はM1de+であるDNAを示
し、第4図は手順説明図をそれぞれ示す。
ヘクターを示し、第2図はMl−delに対応するアミ
ノ酸配列を示し、第3図はM1de+であるDNAを示
し、第4図は手順説明図をそれぞれ示す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 (1)dhfrマーカーDNAを有する発現ベクターに
おいて、そのdhfrマーカーDNA部位に置換して導
入したM−CSF−deleteDNA(但し、M−C
SF−deleteDNAは、M1−CSFのシグナル
ペプチドを含むポリペプチドのN末端から180番のア
ミノ酸を含むC末端側のアミノ酸残基の一部または全部
が欠損したポリペプチドをコードするDNAを示す)と
、dhfrマーカーDNAとを有し、且つ、該M−CS
F−deleteDNAと該dhfrマーカーDNAと
が少なくとも1.5kbp離れていることを特徴とする
M−CSF活性ポリペプチドの安定的高発現組換えベク
ター。 (2)M−CSF活性の安定的高発現組換えベクターが
、第1図で示されるM−CSF−deleteDNAを
含む組換えベクターである請求項(1)記載の組換えベ
クター。 (3)M−CSF−deleteDNAが、第2図で示
されるアミノ酸配列をコードするDNAである請求項(
2)記載の組換えベクター。 (4)M−CSF−deleteDNAが、第3図で示
されるDNAである請求項(2)記載の組換えベクター
。 (5)dhfrマーカーDNAを有する発現ベクターに
おいて、そのdhfrマーカーDNA部位に置換して導
入したM−CSF−deleteDNA(但し、M−C
SF−deleteDNAは、M1−CSFのシグナル
ペプチドを含むポリペプチドのN末端から180番のア
ミノ酸を含むC末端側のアミノ酸残基の一部または全部
が欠損したポリペプチドをコードするDNAを示す)と
、dhfrマーカーDNAとを有し、且つ、該M−CS
F−deleteDNAと該dhfrマーカーDNAと
が少なくとも1.5kbp離れているM−CSF活性ポ
リペプチドの安定的高発現組換えベクターを導入し動物
細胞を形質転換せしめたM−CSF活性ポリペプチドの
安定的高発現形質転換動物細胞。 (6)M−CSF活性ポリペプチドの安定的高発現組換
えベクターが、第1図で示されるM−CSF−dele
teDNAを含む組換えベクターである請求項(5)記
載の形質転換動物細胞。 (7)M−CSF−deleteDNAが、第2図で示
されるアミノ酸配列をコードするDNAである請求項(
6)記載の形質転換動物細胞。 (8)M−CSF−deleteDNAが、第3図で示
されるDNAである請求項(6)記載の形質転換細胞。 (9)動物細胞が、dhfr^−の特性を有する動物細
胞である請求項(5)記載の形質転換動物細胞。 (10)dhfr^−の特性を有する動物細胞が、CH
Odhfr^−細胞である請求項(5)記載の形質転換
動物細胞。 (11)形質転換動物細胞が、M1−del14−2「
微工研菌寄第11756号(FERMP−11756)
」である請求項(5)記載の形質転換動物細胞。 (12)動物細胞が、TRC−29R細胞である請求項
(5)記載の形質転換動物細胞。(13)dhfrマー
カーDNAを有する発現ベクターにおいて、そのdhf
rマーカーDNA部位に置換して導入したM−CSF−
deleteDNA(但し、M−CSF−delete
DNAは、M1−CSFのシグナルペプチドを含むポリ
ペプチドのN末端から180番のアミノ酸を含むC末端
側のアミノ酸残基の一部または全部が欠損したポリペプ
チドをコードするDNAを示す)と、dhfrマーカー
DNAとを有し、且つ、該M−CSF−deleteD
NAと該dhfrマーカーDNAとが少なくとも1.5
kbp離れているM−CSF活性ポリペプチドの安定的
高発現組換えベクターを、動物細胞に導入して形質転換
せしめ、メトトレキセート含有培地にて培養して高メト
トレキセート耐性株を選択して得られるM−CSF活性
ポリペプチドの安定的高発現形質転換動物細胞を、培地
にて培養することを特徴とするM−CSF活性ポリペプ
チドの安定的高発現製造法。 (14)M−CSF活性ポリペプチドの安定的高発現組
換えベクターが、第1図で示されるM−CSF−del
eteDNAを含む組換えベクターである請求項(12
)記載の製造法。 (15)M−CSF−deleteDNAが、第2図で
示されるアミノ酸配列をコードするDNAである請求項
(14)記載の製造法。 (16)M−CSF−deleteDNAが、第3図で
示されるDNAである請求項(14)記載の製造法。 (17)動物細胞が、dhfr^−の特性を有する動物
細胞である請求項(13)記載の製造法。 (18)dhfr^−の特性を有する動物細胞が、CH
Odhfr^−細胞である請求項(13)記載の製造法
。 (19)形質転換動物細胞が、M1−del14−2「
微工研菌寄第11756号(FERMP−11756)
」である請求項(13)記載の製造法。 (20)動物細胞が、TRC−29R細胞である請求項
(13)記載の製造法。
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JP2271951A JPH04148687A (ja) | 1990-10-09 | 1990-10-09 | M―csf活性ポリペプチドの安定的高発現組換えベクター |
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JP2271951A JPH04148687A (ja) | 1990-10-09 | 1990-10-09 | M―csf活性ポリペプチドの安定的高発現組換えベクター |
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IT (1) | IT1249455B (ja) |
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- 1991-10-09 IT ITRM910762A patent/IT1249455B/it active IP Right Grant
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ITRM910762A1 (it) | 1993-04-09 |
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