JPH0292288A - アクアライシンｉ前駆体をコードする遺伝子、それを含む発現ベクター、該発現ベクターを含む大腸菌及びそれを用いたアクアライシンｉの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ この発明は、耐熱性タンパク質分解酵素であるアクアラ
イシン■前駆体をコードする遺伝子、それを含む発現ベ
クター、この発現ベクターで形質転換された大腸菌及び
この大腸菌を用いたアクアライシンＩの製造方法に関す
る。

［従来の技術］ タンパク質分解酵素は、洗剤用添加物、ペプチド合成の
触媒、バイオリアクター素子等利用範囲が広く、極めて
重要な酵素である。アクアライシン■は、高度好熱性細
菌Ｔｈｅｒｓ＋ｕｓ　＄ＹＴ−１によって産生され、安
定性に優れ、至適ｐｔｔをｌＯ付近に持つ耐熱性のアル
カリ性タンパク質分解酵素で、界面活性剤にも強い耐性
を有しておリ、洗剤用添加物として、またバイオリアク
ター素子としての利用等、応用が期待される。

アクアライシンＩは、従来、　ＴｈｅｒｍｕｓＵ」工１
ｃｕｓ　ＹＴ−１の培養上清から分離することによって
生産されているが、　Ｔｈｅｒｍｕｓ　ｕ」工匡邦ｙｒ
−ｔはその培！Ｉ温度が６５℃と高いので培養コストが
高く、また、培養上清より精製するため培地中の不純物
が混入するという欠点を有する。さらに、　Ｔｈｅｒｍ
ｕｓ　狙ｌ占」ＹＴ−１によるアクアライシン■の生産
量は多くない。

上記のような問題点を解決するため、 Ｔｈｅｒａ＋ｕｓ　ｕμ山１ｃｕｓ　ＹＴ−１からアク
アライシンＩ遺伝子を切り出し、大腸菌用ベクターに組
み込んで大腸菌中で発現させようとする試みがあるが、
アクアライシン■は大腸菌に対して有毒であり、菌体中
でアクアライシンＩが発現するとその大腸菌が死滅して
しまう、このため、遺伝子工学的手法により、大腸菌に
アクアライシンＩを生産させることは未だ成功していな
い。

［発明が解決しようとする問題点１ 従って、この発明の目的は、安いコストで大量にアクア
ライシン■を生産することができ、かつ、生産されたア
クアライシンＩの精製か容易な、遺伝子工学的手法によ
るアクアライシンＩの製造方法並びにそれに用いられる
遺伝子、発現ベクター及び大腸菌形質転換株を提供する
ことである。

［問題点を解決するための手段］ 本願発明者らは、鋭意研究の結果、アクアライシンｌ構
造遺伝子の上流にシグナルペプチドコード領域とプロ領
域とを有し、かつ、アクアライシンｌ構造遺伝子の下流
にアクアライシン■の活性を阻害する部分をコードする
テール領域とを含む遺伝子を大腸菌中で発現させると、
菌体中ではアクアライシン■は不活性な状態にあるため
大腸菌に有毒な作用を与えず、シグナルペプチドの存在
により、菌体中で産生されたアクアライシン■前駆体は
べりプラズム中に分泌され、さらにこの状態で菌体を熱
処理するとシグナル領域、プロ領域及びテール領域か切
断されて成熟アクアライシンＩがほぼ精製された形て菌
体外に分泌されることを見出し２本発明を完成した。

すなわち１本発明は、シグナルペプチドをコードする領
域と、該シグナルペプチドコード領域の下流に存在する
プロ領域と、該プロ領域の下流に存在する、アクアライ
シンＩをコードする領域と、該領域の下流に存在するテ
ール領域とを含む遺伝子を提供する。

また１本発明は、上記本発明の遺伝子を含み、宿主中で
該遺伝子かコードするアクアライシンＩを発現すること
がてきる発現ベクターを提供する。

さらに本発明は、上記本発明の発現ベクターて形質転換
された大腸菌を提供する。

さらにまた、本発明は、上記本発明の大ＩＷ菌を培養し
た後、菌体な熱処理し、アクアライシン■を裸地するこ
とから成るアクアライシン■の製造方法を提供する。

［発明の効果］ 本発明により、従来の試みにおいて成功しなかった、ア
クアライシン■の遺伝子工学的手法による製造か初めて
可能になった。すなわち、本発明により、安いコストで
大量にアクアライシンＩを生産することが初めて可能に
なった。また１本発明の方法によると、アクアライシン
Ｉがほぼ精製された形！息で分泌されてくるので、精製
操作か簡単であり、不純物の混入も抑制される。

〔発明の詳細な説明〕

上述のように、本発明のアクアライシン■前駆体遺伝子
は、その最も上流にシグナルペプチドをコードする領域
（以下、シグナル領域と言う）を含む０図１には、後述
の実施例においてクローニングされた１本発明の遺伝子
を含むＤＮＡｐＪｉ片の全塩基配列が示されているが１
図１において、シグナル領域は、ＡＴＯから始まりＧＣ
Ｃで終わる。アンダーラインか引かれた領域である。図
１に示すシグナル領域は、Ｔｈｅｒｍｕｓ　ａｑｕａｔ
ｉｃｕｓ　ＹＴ−１のＤＮＡ中に、そのまま含まれてい
るものである。シグナル領域は、ポリペプチドを宿主の
菌体外に分泌させる機能を有するものであり、図１に示
す配列以外にもいくつかのシグナル領域が知られている
０例えば、シグナル領域は下記の公知文献に記載されて
いる。　１Ｂｉｓｏｎ　Ｅら、Ｃｏｍｐｉｌａｔｉｏｎ
　ｏｆ　　ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ　ｓｉｇｎａｌ、５ｅｑ
ｕｅｎｃｅｓ　　。

Ｎｕｃｌｅｉｃ　　Ａｃ１ｄｓ　　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、
ｖｏｌ、　　１２．Ｎｏ、　　１：ｌ。

１９８４、本発明においては、これら公知のいずれのシ
グナル領域をも採用することができる。また。

これら以外の公知のシグナル領域であっても、宿主菌体
外への分泌機能を有する領域は全て本発明のシグナル領
域として用いることができる。

シグナル領域の下流には、プロ領域と呼ばれる領域が存
在する。プロ領域は、　Ｔｈｅｒｓｕｓａｑｕａｔｉｃ
ｕｓ　ＹＴ−１のＤＮＡ中において、前記シグナル領域
と後述するアクアライシンＩコード領域（図１において
実線で囲まれている領域）との間に挟まれた領域であり
、アクアライシンＩの成熟化（を熟アクアライシンＩと
プロ領域の間の切断）に関与する部分である。なお、こ
のようなプロ領域を有する他のセリンプロテアーゼも知
られており（例えば下記文献に記載、高木博史、「タン
パク質工学的手法による枯草菌プロテアーゼ・サチライ
シンの構造と機能に関する研究」、東京大学農学部博士
論文１９８８年）、本発明においては、このような他の
セリンプロテアーゼのプロ領域をも用いることかできる
。

プロ領域の下流には、アクアライシン■をコードする領
域が存在する。アクアライシンＩをコードする領域はＴ
ｈｅｒｍｕｓ　ａｑｕａｔｉｃｕｓ　ＹＴ−１のＤＮＡ
中に含まれており、その塩基配列は従来より知られてい
る（櫂錫泰、「高度好熱性細菌Ｔｈｃｒ＋５ｕｓａｑｕ
ａｔｉｃｕｓ　ＹＴ−１の菌体外プロテアーゼ（アクア
ライシンＩ）の生化学的、遺伝子工学的研究」東京大学
農学部博士論文、　１９８７年）０図１において、アク
アライシンＩコード領域は実線で囲まれた部分である。

アクアライシンＩコード領域の下流には、テール領域が
存在する。テール領域は、アクアライシン■の活性を阻
害する機能を有し、また、アクアライシンＩ前駆体の安
定化とアクアライシンＩの菌体外への分泌に関与してい
ると考えられる。テール領域が存在するために、大腸菌
でこのアクアライシンＩ前駆体遺伝子を発現させてもア
クアライシン■は不活性な状態にあり、大腸菌に対して
害を与えない、テール領域は１７１１においてはアクア
ライシンＩコード債域の下流からターミネーションコド
ンＴＡＧまでの領域（アクアライシンＩコード領域より
も下流でアミノ酸配列を記載した領域）である０図１に
おけるテール領域はＴｈｅｒｍｕｓ　ａｑｕａｔｉｃｕ
ｓ　ＹＴ−１のＤＮＡ中に天然に存在するものである。

もっとも１図１に示したアミノ酸配列をコードする塩基
配列以外の配列であっても、アクアライシンＩの活性を
阻害することができ、アクアライシンＩの分泌等に悪影
響を芋えない塩基配列であればいずれの塩基配列をも採
用することがてきる。

なお、本発明の遺伝子に含まれる各領域を説明したが、
一般に、１つのアミノ酸をコードするコドンは複数存在
する０図１に示したアミノ酸配列をコードする他の塩基
配列も図１に示す塩基配列と同一のものであると解釈す
る。さらにまた。

生理活性を有するペプチドにおいて、少数のアミノ酸が
置換し、欠失し又は少数のアミノ酸が付加されてもその
ペプチドの生理活性が影響を受けないことがあることは
当業者において広く認識されていることである。従って
１図１に示す上述した各領域において、少数の塩基が置
換し、欠失し又は付加された結果、各領域がコードする
アミノ酸配列のうちの少数のアミノ酸が置換し、欠失し
又は付加された場合であっても、各領域が有する上記し
た機能が実質的に影響を受けない場合には、その領域は
図１に示されたものと実質的に同一であり１本願発明の
範囲内に含まれるものと解釈する。従って、例えばプロ
領域について言えば１図１に示したプロ領域かコードす
るアミノ酸配列のうちの少数のアミノ酸か置換し、欠失
し又は少数のアミノ酸が付加された場合であっても、プ
ロ領域の機能、すなわち、アクアライシンＩの成熟化を
達成することができる場合には、その領域は図１に示さ
れたプロ領域と実質的に同一であると解釈される。

本発明の遺伝子は、上記で説明した各領域を含んでいれ
ばよく、上記領域にさらにＤＮＡが付加されていてもよ
い０例えば、図１にはシグナル領域の前及びテール領域
の後にそれぞれＤＮＡ領域を含んでいるが、このような
遺伝子も当然本発明の遺伝子に包含される。

本発明の遺伝子は、Ｔｈｅｒｓｕｓ　ａｑｕａｔｉｃｕ
ｓ　ＹＴ−１の遺伝子から１図１に示す適当な制限酵素
１例えばＳａｃ　ＩやＳ■ａｌ−５ａｃｌで切り出し、
クローニングすることにより得ることができる。

本発明はまた、上記した本発明の遺伝子を含み、宿主中
でアクアライシン■を発現させることかできる発現ベク
ターを提供する。この本発明の発現ベクターは、上記本
発明の遺伝子の他に、従来よりこの分野において周知の
他の発現ベクターと同様、宿主内で複製するための複製
開始点と。

上記遺伝子の上流に存在する、例えば匡プロモーターの
ようなプロモーターと、上記遺伝子の下流に存在する１
例えばｒｒｎＢ　Ｔ、Ｔ、のようなターミネータ−と１
例えば抗生物質耐性のような適当な選択マーカーとを有
し、好ましくはさらに、ペプチドの発現を制御するため
の、例えば１ａｃｌ’のようなリプレッサー遺伝子を有
する。これらの部分を含むベクターは市販されているの
で、市販のベクターに含まれるこれらの部分をそのまま
利用することができる。

本発明の発現ベクターは、例えば以下のようにして調製
することができる。なお、本発明のベクターの調製方法
は種々のものが可能であり、以下に記載するものに限定
されないことは言うまでもない、また、以下に記載する
方法では、アクアライシン■コード領域中のＸｂａ１部
位で本発明の遺伝子を２分割し、それでれ別々にクロー
ニングした後に結合しているが１本発明のベクターの調
製方法はこのような方法に限定されるものではない。

（１）遺伝子源 本発明の遺伝子源としては、丁ｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔ
ｉｃｕｓ　ＹＴ−１（＾ＴＣ［：２５１０４）のＤＮＡ
を利用することができる。

（２）本発明遺伝子の調製 常法によりＴｈｅｒｖｕｓ　ａｑｕａｔｉｃｕｓ　ＹＴ
−１のＤＮＡを、制限酵素Ｘｂａ　Ｉと制限酵素Ｓａｃ
　Ｉとで完全分解して断片を得、ここから常法に従って
、アクアライシン！の前駆体遺伝子の、Ｎ末端部分を有
するＤＮＡ断片（２，８ｋｂｐ）とＣ末端部分を有する
ＤＮＡ断片（０，８ｋｂｐ）を市販のベクタープラスミ
ドｐｕｃ＋２にそれぞれクローニングする。Ｎ末端部分
を有するＤＮＡ断片は、制限酵素Ｓｅａ　Ｉで部分分解
してプロモーター活性を持つと思われる５°末端部分を
削り、１．１　ｋｂｐの断片にした。Ｃ末端部分を有す
るＤＮＡ！ｔＩｒ片の不要な３°末端部分０．１ｋｂｐ
を削り、上記の１．１　ｋｂｐ断片を方向性を持たせて
結合し２図１に示すアクアライシン■の前駆体遺伝子を
構築する。

（コ）ベクタープラスミド ファルマシア社から市販されているプラスミドｐＫに２
２３−３は、選択マーカーとしてアンピシリン耐性を持
ち１強力な主プロモーターをクローニング部位の前に持
ち、クローニングの後ろにターミネータ−を持つ等の利
点を有する発現ベクターである。このｐＫＫ２２３−３
は、ベクタープラスミドｐＢＲ３２２由来の複製開始点
を有しており、コピー数かそれほど多くはないので、　
ｐＫＫ２２３−３のコピー数を増大させるために複製開
始点をベクターブラスミＦ’ｐＵＣ１８（全酒造社製）
の複製開始点に改変し、コピー数を増大させる。また、
匡プロモーターの発現を制御するために、アマジャム社
より市販されているＩａｃｌ”カートリッジベクターｐ
ＭＪＲ１ｓ６０より切り出したＩａｃリプレッサー遺伝
子を組み込む、さらに、この発現ベクターの不要な部分
を切り出し、よりコンパクトにすることが好ましい。

（４）本発明の発現ベクターの構築 上記のようにして調製したアクアライシン■前駆体遺伝
子を、上記のように調製したベクタープラスミドｐＫＩ
２２３−３のクローニング部位に方向性を持たせて結合
し、目的の本発明の発現ベクターを得る。

本発明はまた、上述したように、上記本発明の発現ベク
ターで形質転換された大Ｆｍ菌を提供する。大腸菌の形
質転換は、この分野において周知の方法をそのまま適用
することができ、例えばルビジウム法により形質転換を
行ない、発現ベクターか有する抗生物質耐性のような選
択マーカーによって選択することができる。

本発明はさらに、上記本発明の形質転換大腸菌を培養し
た後、菌体を熱処理し、アクアライシン■を採取するこ
とから成るアクアライシン■の装造方法を提供する。形
質転換株の培養は従来と同様にして行なうことができる
０発現ベクターがｔａｃプロモーターと１ａｃｌ’リプ
レツサー遺伝子を含む場合には、適当な程度にまで菌を
増殖させた後、アンピシリンのような選択用薬剤の存在
下。

０．２　ａｌｌ程度の　ＩＰＴＧで遺伝子の発現を誘導
する。

この誘導に用いる基本培地としては修ｒｓＨ培地（バク
トドリプトン２％、ＮａＣ１０，８駕）を用いることが
できる。培養は３７℃で数時間性なうことができる。こ
れにより、菌体内でアクアライシンＩ菊駆体が産生され
、ペリプラズムに蓄積される。

菌体の熱処理は、誘導条件下で培養した菌を一旦遠心分
離にて集め、＊樹液中（ｐＨ４〜１０．好ましくはｐＨ
７、ｓ　）　、例えば４０℃ないし９０℃、好ましくは
６５℃において数時間熱処理を行なうことにより成熟ア
クアライシン■が大ｆ！ｌ！ｉｌｌから分泌される。こ
の熱処理において、アクアライシン■の安定化のために
、約１ｍＭないし１００　ｍＭ、好ましくは１０　ｍＭ
のＣａＣＩｇを緩衝液中に添加しておくことが好ましい
。

分泌されたアクアライシンＩの回収は、アクアライシン
■がかなり精製された状態で分泌されるので、比較的容
易に回収、ＭＷすることができる０例えば、熱処理後の
菌体懸濁液を遠心分離にかけ、上清を９０％飽和の硫安
で沈殿する画分を集め、緩衝液（ｐＨ４〜１０．好まし
くはｐｔｔａ　）に喝 透析し、これを同緩衝液で平衡化した陰イオン交換カラ
ムにかけ、０〜０．３　ｍＭ　ＮａＣ１濃度勾配で溶出
させ、　０．０６　ｓＭ　ＮａＣｌ付近の活性画分を回
収することにより回収、精製することができる。この方
法により、得られたアクアライシンＩは５Ｏ５−ＰＡＧ
Ｅにかけると単一タンパク質にまで精製されていること
が確認されている。

［実施例］ 以下１本発明の実施例を示し１本発明をさらに具体的に
説明する。もっとも、本発明は、下記実施例に限定され
るものではないことは明らかである。

なお、下記の実施例において、各操作は、特に明示がな
い限り、　Ｔ、　Ｍａｎｉａｔｉｓら、”ｌｌｏｌｅｃ
ｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ、　　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ　Ｍａｎｕａｌ”、　（１９８２）、　ＣｏｌｄＳｐ
ｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ記載の方法記載り行なった。ま
た、制限酵素は市販のものを用い、その具体的使用方法
は市販品の指示書に従った。

Ｔｈｅｒｍｕｓ　ａｑｕａｔｉｃｕｇ　ＹＴ−１（ＡＴ
ＣＣ２５１（１４）の染色体ＤＮＡをＭａｒｍｕｒ法（
Ｍａｒｍｕｒ、　Ｊ、　　（１９６１）　Ｊ。

謔ｏ１．　Ｒｉｏｌ、、　３．２０８−２１８）に従い
調製した。これを制限酵素ＸｂａｌとＳａｃ　Ｉとで完
全分解して、シグナル領域（Ｓ）、プロ領域（Ｐ）及び
アクアライシン頁コード領域（Ｍ）のＮ末端側を含む断
片（２Ｊ　ｋｂｐ　、以下、Ｎ末端側断片と言う）と、
アクアライシン頁コード領域のＣ末端側及びテール領域
（Ｔ）を含む断片（０，８ｋｂｐ　、以下、Ｃ末端側断
片と言う）とに分断した。これらをそれぞれ市販のプラ
スミドベクターであるｐｕｃｔｚ　　（宝酒造社袈）に
組み込みクローニングした（図２中、工程の）。

一方、市販のｐｌＪｃｌＢをεｃｏＲＩ及びＢａｗｌ目
で消化し、さらにフレノウ断片ラージフラグメント（以
下ＬＦと言う）で処理し、ライゲーションしてｐＵｃｌ
ｇのＳ鳳ａ１部位をつぶし、プラスミドベクターｐｕｃ
ｔａΔを調製した（図２中、■程■）。

ｐＨｃ１８ΔをＸｂａ　Ｉで消化し、一方、先に得られ
た。Ｎ末端側断片をｐＵｃ１２中に組み込んだプラスミ
ドｐｓｘｔをＡｖｒｎ及びＸｂａ　１で消化して切り縮
め。

これらをライゲーションしてプラスミドｐＡＸＬを得た
（図２中、工程■）。

ｐＡｘｔを５ａｌｌで切断し、ＬＦ処理を行なった後Ｓ
膳ａｌで部分分解し、ライゲーションしてプラスミドｐ
ＢＸＬを得た（図２中、工程＠）。

ｐＢＸＬをＸｂａ　＋と旧ｎｄｍで消化し、一方、先に
調製した、Ｃ末端側断片をｐＨｃ１２中にクローニング
したプラスミドｐＸＳＳをＸｂａｌと旧ｎｄｍで消化し
、ライゲーションしてプラスミドｐＣＸを得た（図２中
、王程■）　、　ｐＣＸ中では、Ｎ末端側断片とＣ末端
側断片とか連結され、完全なアクアライシン■萌駆体が
挿入されている。

リンカ−を用い、　ｐＣＸ中のＮ末端側断片中の旧ｎｄ
ｍをＥｃｏＲＩに変え、Ｃ末端側断片中のＥｃｏＲＩを
旧ｎｄｌＩＩに変えてプラスミドｐＤＸを得た（図２中
、工程■）。

一方、ファルマシア社から市販されているプラスミドベ
クターｐＫＫ２２３−３をＰｖｕ■と　Ｐｖｕ　Ｉとで
消化し、　ｐＵｃＩ８もこれらの制限酵素で消化してラ
イゲーションし、ｐＫＫ２２３−３の複製開始点をｐｕ
ｃｉａの複製開始点に変えたプラスミドｐＫｃ２２３−
３を得た。　ｐＫＣ２２コーコをＰｖｕｌＩで消化し、
一方、アマジャム社から市販されている１ａｃｌ”カー
トリッジベクターであるｐＭＪＲ１５６０を旧ｎｄｍ、
Ｋｐｎｌで消化した後ＬＦ熱処理、これらをライゲーシ
ョンしてｐＫＣ２２コー３中にＩａｃｌ’遺伝子を組み
込んだｐＫｆ２２：ｌ−３を得た。

ｐＫＩ２２：ｌ−３をＥｃｏＲＩと旧ｎｄｍで消化し、
一方、ｐＤＸを同様に消化してライゲーションし、ｐＫ
Ｉ２２３−３のクローニング部位にアクアライシン■前
駆体遺伝子が挿入されたプラスミド９ＥＸを得た（図２
中、工程■）。

ｐＥＸをＸｈｏｌ及び旧ｎｄｍで処理し、ＬＦ熱処理、
ライゲーションしてＣ末端側断片のＸｈｏｌ−１１ｉｎ
ｄｍを間を削り（図２中、■程■）、次いでＢａ■旧及
び５ｐｈｔで消化し、ＬＦ熱処理、ライゲーションして
ｔａｃプロモーターと１ａｃｌＱ遺伝子の間を除き（図
２中、工程■）、さらにＢａｍＨＩで消化し、ＬＦ熱処
理、ライゲーションしてＢａ■旧部位をつぶして目的と
するプラスミドｐＡＱ　Ｉを得た（図２中、工程ｏ）、
プラスミドｐＡＱＩの遺伝子地図を図３に示す。

宿主微生物としての大Ｉｌｌ菌ＭＶＩ　１８４株（宝酒
造社製）を、常法であるルビジウム法に従って上記で得
られたプラスミドｐＡＱ　＋で形質転換し、アンピシリ
ンをマーカーとして選択し、形質転換株を得た。なお、
プラスミドｐＡＱ　Ｉで形質転換された大腸菌（Ｅ、　
ｃｏｌｉ　ＭＶ＋１８４　（ｐＡＱＩ））は工業技術院
微生物工業技術研究所に寄託されており、その受託番号
は、微工研菌′８第１０２６１号である（なお、寄託さ
れた微生物の表示は寄託者の事務管理ＬＥｓｃｈｅｒｉ
ｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＪＴＳ　８７３−Ｌ２となってい
る）。

大Ｉｌ＆Ｓ菌形質転換株の培養 ０．１！グルコースを含むＬＢ培地にアンピシリン１０
０　＃Ｌｇ／ｍｌを加えて調製した培地２００　ｍｌを
５００■！の坂ロフラスコに入れ、これに予め一晩同様
の培地で３０°Ｃにて培養した大Ｉｍ菌形質転換株を２
■ｌ（１％）接種し、３７°Ｃにて数時間往復振盪培養
した。−旦集菌した後に、０．２−Ｍ　ＩＰＴＧとアン
ピシリン１００　％ｇ／■１を含む修飾Ｈ培地（バクト
ドリプトン２％、　ＮａＣ１Ｏ，８％）に懸濁し、さら
に３時間培養を続けて誘導をかけ、アクアライシンＩ前
駆体遺伝子を発現させて該前駆体を生産させた。

成熟アクアライシンＩの生産 上記のようにしてアクアライシン■前駆体を発現させた
菌体な遠心分離て集菌した。これを。

１０　ｍｌ　ＣａＣ１，を含ｔｒ　５０８Ｍ　ＨＥＰＥ
Ｓ−ＮａＯＩ１１衝液に懸濁し、６５℃において熱処理
を３時間行なうことにより、緩衝液中にアクアライシン
■が成熟酵素として時間経過と共に生産された。この場
合の生産量の推移を横軸に時間、縦軸に酵素活性（カゼ
イン分解活性、１単位は２８０　ｎｍにおける吸光度を
０．００２／分増大させる量、特開昭５８−１５２４８
２に記載）をとって表わした図が図４である０図４から
、菌体を熱処理すると成熟アクアライシン■か分泌され
てくることがわかる。

アクアライシン■の精製 熱処理した緩衝液中の菌体を遠心分離し、上清の硫安濃
度９０駕飽和で沈殿する両分を集め、上記緩衝液に溶解
し、Ｉｓ緘ＣａＣ１，を含む１０　ｍｌ１ｌリン酸緩衝
液（ｐＨ６，０）に対して透析した。これを、同緩衝液
で平行化した陽イオン交換カラムにかけθ〜０．：ｌ　
ａｌｌ　ＮａＣｌ濃度勾配で溶出させた。活性画分は０
．０６皇Ｍ　ＮａＣｌ付近に溶出した。この段階でアク
アライシン■はＳＯ３−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動で単一タンパク質にまで精製されていた。また、この
アクアライシンＩはＴｈｅｒｓｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓ
　ＹＴ−１の作るアクアライシン■と電気泳動的に、ま
た、免疫的に同一であった。免疫的に同一であることは
「細胞工学Ｊ　　ｖｏｌ、　１２．　Ｎｏ、　８゜１９
８３、　ｐ１０６２に記載されたウェスタンブロッティ
ングにより確認した。

【図面の簡単な説明】

図１は本発明のアクアライシン■前駆体遺伝子の塩基配
列の一例をそのコードするアミノ酸配列と共に示す図、 図２は本発明のアクアライシンＩ前駆体発現ベクターを
構築する工程を示す図、 図３は本発明のアクアライシン■前駆体発現ベクターの
一例の遺伝子地図、 図４は本発明の方法により生産されるアクアライシンＩ
の量の時間的推移を示す図である。

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. （１）シグナルペプチドをコードする領域と、該シグナ
   ルペプチドコード領域の下流に存在するプロ領域と、該
   プロ領域の下流に存在する、アクアライシン I をコー
   ドする領域と、該領域の下流に存在するアクアライシン
   I のテール領域とを含む遺伝子。
2. （２）図１に記載されたアミノ酸配列をコードする請求
   項１記載の遺伝子。
3. （３）図１において第４０７番目ないし第１９４８番目
   の塩基配列を有する請求項２記載の遺伝子。
4. （４）請求項１ないし３のいずれか１項記載の遺伝子を
   含み、宿主中でアクアライシン I 前駆体を発現するこ
   とができる発現ベクター。
5. （５）請求項４記載の発現ベクターで形質転換された大
   腸菌。
6. （６）請求項５記載の大腸菌を培養した後菌体を熱処理
   し、アクアライシン I を採取することから成るアクア
   ライシン I の製造法。