JPH02501106A - 新規プラスミノゲン活性化因子 - Google Patents
新規プラスミノゲン活性化因子Info
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- JPH02501106A JPH02501106A JP62506364A JP50636487A JPH02501106A JP H02501106 A JPH02501106 A JP H02501106A JP 62506364 A JP62506364 A JP 62506364A JP 50636487 A JP50636487 A JP 50636487A JP H02501106 A JPH02501106 A JP H02501106A
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- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
5、請求項1記載のプラスミノゲン活性化因子とそれの医薬上許容される担体と
からなる医薬組成物。
6、請求項4記載の形質転換された哺乳動物細胞を培養し、それにより産生じた
プラスミノゲン活性化因子を単離することを特徴とするプラスミノゲン活性化因
子の調製方法。
明 細 書
新規プラスミノゲン活性化因子
発明の分野
本発明はプラスミノゲン活性化因子およびそのコーディング配列を有する組換え
型DNA分子に関する。
発明の背景
フィブリン溶解は、特異的フィブリン溶解系の活性化後、脈管内および脈管外の
フィブリン沈積物を除去する工程である。該工程は2つの主要な事象、すなわち
、プラスミン形成とフィブリン分解とからなる。第1の事象において、不活性な
先駆体のプラスミノゲンは、いわゆるプラスミノゲン活性化因子により、タンパ
ク分解酵素であるプラスミンに変えられる。第2の工程において、プラスミンは
不溶性フィブリンネットワークを分解し、かくして血餅を溶解する。種々の起源
のプラスミノゲン活性化因子が知られている。これらのうち有力なものは、細菌
オリギンのストレプトキナーゼ(streptokinase)および両方共ヒ
トオリギンであるウロキナーゼ(urokinaseXU K )および組織プ
ラスミノゲン活性化因子(tissueP lasminogen Activ
ator)(t P A)である。
ウロキナーゼに関する生化学的研究は、3形態の酵素が存在することを示してい
る。第1の形態は、約54000ダルトンの分子量(Mr)を有し、高Mr−U
K(HMW−UK)と称され;それは各々、18000および33000ダルト
ンの2つのジスルフィド架橋鎖AおよびBからなる。B鎖はウロキナーゼの活性
部位を有し、別のセリンプロテアーゼ(serine proteases)に
よく類似している。第2の分子形のウロキナーゼは、分子量33000ダルトン
で、既知アミノ酸配列から証明されたように、八−鎖(低分子量UK。
LM〜V−UK)のアミノ[22135と136の間のタンパク質分解開裂によ
り、HMW−UKから誘導される。HMWおよびLMW−[Kは両方共、治療に
用いられる優れたプラスミノゲン活性化因子である。しかしながら、UK−注入
の間に起こりうるプラスミノゲンの観察される全身的活性化により、出血の危険
性が増すため、血栓崩壊剤としてのそれらの使用は制限される。
最近、1本鎖の先駆体形のウロキナーゼの存在が示された。プラスミンへの暴露
を調整すると、この先駆体は2重鎖HMW−UKに活性化される。フィブリンに
結合した酵素的に活性なプラスミンを、α、−抗ブラスミンのようなプラスミン
抑制因子による不活性化から部分的に保護した場合、プロウロキナーゼ(pro
urokinase)の2本鎖分子への変形を、血餅表面に限定することができ
た。したがって、プラスミノゲン活性化は、主として、系内にて生成されたHM
W−UK付近のフィブリンクロットを直接取り巻いている外界に限定できる。こ
の点において、HMW−UKの先駆体の治療的使用は、活性酵素で観察される副
作用を回避することができる。実際に、UK−先駆体を用いる血栓崩壊は、UK
により達成される血栓崩壊と比べ、非常に限定された全身性活性化の条件下にて
達成することができる。
しかしながら、最近、プロウロキナーゼ自体が、強力なプラスミノゲン活性化因
子であることが観察された。したがって、第3の形態のUKは、1本鎖のウロキ
ナーゼ型プラスミノゲン活性化因子(scu−P A )である。したがって、
5cu−PA誘発血栓崩壊の間に観察される限定全身性活性化は、フィブリンに
付随した5cu−PAからHMW−UKへの変形により生じるものではなく、む
しろフィブリン表面での5cu−PAによる直接的プラスミノゲン活性化により
生じるものである。実際、プラズマ・コンペティターの存在により、5cu−P
Aは、プラズマ相中のプラスミノゲンを活性化することができない。しかしなが
ら、フィブリンが存在するやいなや、抑制が相殺され、プラスミンを形成する。
組織プラスミノゲン活性化因子は、免疫学的にウロキナーゼとは異なる。それは
、タンパク分解開裂により比較的活性な2本鎖分子に変換される1本のポリペプ
チド鎖(70000ダルトン)からなる。
1重鎖tPAのC0OH末端から誘導されるtPAの軽鎖は、活性部位を有し、
他のセリンプロテアーゼとよく類似しくペン二カら(Pennica et a
l、)、ネイチャー(Nature)、30上:214(1983));1重鎖
tPAのNH2末端から誘導される重鎮は、凝固およびフィブリン溶解系におけ
る他のタンパク質の構造特性に類似する構造特性を有する。例えば、重鎮は、プ
ロトロンビン、プラスミノゲンおよびウロキナーゼにおいて見られる構造に類似
する「クリングル(kr ing Ie)」構造を有し、またフィブロネクチン
のフィブリン結合「フィンガー」一様構造に類似する成長因子一様ドメインおよ
び別のドメインを有する。
HM〜V−UKとtPAとを比較することで、重要な類似点が明らかになる。両
方の分子のB鎖は、活性部位を有し、大いに相同しており、他のセリンプロテア
ーゼ活性部位によく類似している。他方、両タンパク質のNH2末端は異なる。
tPA分子は2つのクリングルドメインを有しているのに対して、ウロキナーゼ
種は1つのドメインを有しているにすぎない。加えて、tPAはウロキナーゼに
はないフィブリン結合機能を有する。
発明の要約
本発明は、tPAの重N (鎖A)から誘導されたポリペプチドを、UKの重鎖
(鎖B)からのポリペプチドに融合させ、キメラまたは雑種プラスミノゲン活性
化因子を得るという知見にある。このように、tPAおよびUKよりも優れた異
なる免疫学的または生物学的特性を有する新規なプラスミノゲン活性化因子を調
製することができる。好ましいかかる新規なプラスミノゲン活性化因子は、tP
Aのフィブリン結合機能とウロキナーゼのプロテアーゼ機能を併用している。
本発明の代表的具体例は、Fg−tP A/U K 410、Fg、tPA/U
K410/366、tPPUK410/366およびUK−に2410/366
からなる群より選択されたプラスミノゲン活性化因子第1図は本発明の組換え型
DNA分子を説明しており、UKから誘導された配列とtPAから誘導された配
列を示す。
第2図は真核生物シャトルベクターDSP 1.1 BGHの最新の表示である
(プファーら(Pfarr et al、)、DNA54,461−467.1
985)。
発明の詳細
な説明の組換え型DNA分子を用いた場合、変異およびキメラプラスミノゲン活
性化因子を、真核生物細胞、または他の宿主、例えば、細菌および酵母において
産生することでき、生物学的活性を示すことが明らかにされた。天然ウロキナー
ゼおよびtPA分子は、以下の第1a表および第1b表に示すコーディング配列
およびアミノ酸配列を有する。ヤコブスら(J acobs et al、)の
配列は、131にてCysの代わりにTrpを、366にてGlyの代わりにC
ysを、かつ410にてAlaの代わりにVatを有する点において、他の人、
例えば、グンジラーら(Gunzler et al、)、ホツペ・セイラーズ
・カイトクリット・ビューア・フイジオロジシエ・ケミ−(Hoppe 5ey
ler″SZ 、Physiol、Chem、)、363 : 1155 (1
982) 、ノーイネカー(Heyneker)、欧州特許公開明細書EP−A
−92182号およびステンフェンスら(Steffens et al、Xc
ite)により報告されている配列と異なることに注意すべきである。
本願発明において用いる変異およびキメラプラスミノゲン活性化因子は、天然ウ
ロキナーゼおよびtPA分子のDNA配列およびアミノ酸配列とは異なる配列を
有する。変異またはキメラプラスミノゲン活性化因子のコーディング配列は、第
1図に示されているような天然UKおよびtPAのコーディング配列とは異なる
ものである。
したがって、本発明の組換え型DNA分子は、例えば、クローニングまたは発現
ベクターのようなより大きなりNA分子を単離するが、または中にあるいずれか
の変異またはキメラコーディング配列である。本発明の組換え型分子は、以下に
説明するように、標準合成または遺伝学処理方法または両方の組み合わせにより
調製される。
本発明の組換え型DNA分子内にて構成されたコーディング配列は、UKおよび
tPAのDNA分子から誘導された1または数個のDNA配列を組み合わせるか
、またはUKおよびtPA分子の決められt;領域内において1以上のコドンの
1以上の置換、付加または欠失を行なうかである。本発明の典型的な組換え型D
NA分子内の変異またはキメラプラスミノゲン活性化因子、明細書中に例示され
ているそれらの組立ておよび使用が、第1a表および第1b表に示された天然U
KおよびtPAと比較して第1図において説明されている。本発明の組換え型D
NA分子により真核生物にて発現しt;変異またはキメラブラスミノゲン活性化
因子の発現および生物学活性を、以下の第2表に示す。すべての列挙したプラス
ミド発現ベクターは、SV40およびウシ成長ホルモンポリアゾニレ−ジョン部
位の初期プロモーターを用いる。
プラスミドの組立ては、以下の実施例において記載する。報告されている典型的
発現および生物学活性データーは、標準方法により得た(ドラビニール・ジェイ
・シー、テヌ・ジェイ・ピー、レマイレ・ジーおよびペチットジエイ・エフ(D
rapier J 、C,、TenuJ、P、、LemaireG、およびPe
tit J F) 、バイオケミ−(B iochemie)、l上、463〜
471,1979)。第1図および第2表もまた、各ベクターの産生物に付与さ
れj;名称を示す。
天然に生じる多形体のいずれのものも本発明を実施するための出発物質として用
いることができ、天然UKおよびtPA分子のコーディング配列は、ウロキナー
ゼについてはヤコブスら(1985)により、tPAについてはペン二カら(1
983)により用いられている方法のごとき標準方法により得ることができる。
また、例えば、tPAについては、オプデンアッカーら(Opdenakker
et al、)、ヨーロピアン・ジャーナル・オン・バイオケミストリー(E
ur、J 、Biochem、)、±21 : 269 (1982);ニドラ
ンドら(Edlund et al、)、ブロシイーデインダス・オン・ナショ
ナル・アカデミ−・オン・サイエンシス(Proc、Natl、Acad、Sc
i、) USA% 80 : 349 (1983);ゴエッデルら(Goed
del et al、) 、欧州特許公開明細書第93619号;レビンソンら
(Levinson et al、)、欧州特許公開明細書第117059号、
ゴールドバーブら(Goldberg et al、)、PCT W○85−0
3949 ;メイハックら(Meyhack et al、)、欧州特許公開明
細書第143081号;およびUKについては、ハイネッカーら(Heynek
er et al、) 、欧州特許公開明細書第92182号;ヒラマツら(H
iramatsu et al、) 、欧州特許公開明細書第154272号;
コバセビックら(Kovacevic et al、) 、英国特許第2133
797号参照。
本願明細書に示されている組換え型DNA分子は、例示にすぎない。DNA断片
の選択的または付加的組合せまたは塩基対の置換およびコドンの欠失は、分子遺
伝学の分野にてよく知られた方法により行なうことができる。真核生物細胞の発
現の際のかかる組合せ、置換および欠失の効果は、例えば、へりオンら(Her
ion et al、)(1983)により開示されているように、モノクロー
ナル抗体全包含する酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)により容易に測定す
ることができる。得られたタンパク質の活性は、例えば、色素産生基質5244
4 (カビ・ビトラム、ストックホルム、スウェーデン(Kabi Vitru
mSStockholm、 Sweden)を用いる直接アミドライティック活
性検定法(Direct amidolytic activity assa
y)のような周知のスクリーン法またはプラスミノゲンのプラスミンへの触媒変
換を、色素産生基質52251(カビ・ビトラム、ストックホルム、スウェーデ
ン)により検出する検定により容易に検定することができる(ドラビニールら、
1979)。
プラスミノゲン活性化因子分子における突然変異は、周知方法により行なうこと
ができる。ある種のかかる有用な方法については、ホトスタインら(Botst
ein et al、)、サイエンス(S cienceX 1985)参照。
これらは、例えば、コーディング配列を制限エンドヌクレアーゼで処理し、つづ
いて所望によりエキソヌクレアーゼ、例えば、Ba131またはヤエナリ(mu
ng bean)ヌクレアーゼで処理することによるコドンの欠失を包含する。
かかる欠失後、合成配列を挿入し、部分的またはすべての欠失領域を置換するこ
とができる。
プラスミノゲン活性化因子のコーディング配列は、一般的には、生殖細菌細胞、
例えば、イー・コリーにおいてクローを発生させる。
クローニング後、コーディング配列を、選択された宿主にて作用する調節領域に
フレームにて(in−frame)融合し、遺伝発現単位を調製する。かかる宿
主は、クローニングおよび発現系が利用できるいづれの微生物または細胞とする
こともできる。これらは、例えば、イー・コリー、パシラス(B acillu
s)およびストレプトミセス(S treptomyces)のような細菌;サ
ツカロミセス(S accharomyces)およびビチア(P 1chia
)のような酵母、CHO,R1610、NIH3T3およびCO5細胞のような
哺乳動物細胞を包含する。
有用な調節領域は、一般に、リポソームでのRNAポリメラーゼ結合および転写
開始が必要なまたは望ましい配列からなる。細菌および酵母細胞の場合、コーデ
ィング配列の下流に転写ターミネータ−を有し、発現を安定化させることが、時
には有利である。
本発明の組換え型DNA分子の発現について好ましい宿主は、噛乳動物細胞であ
る。かかる細胞において、調節領域は、哺乳動物細胞発現ベクターの組立てにお
いて通常用いられる領域、または同様の機能を発揮する領域とすることができる
。かがる領域は、典型的には、プロモーター領域、すなわち、RNAポリメラー
ゼの結合およびRNA転写開始に作用し、組換え型プラスミノゲン活性化因子の
コーディング配列の上流にある領域からなる。通常、哺乳動物細胞発現ベクター
にて用いられるプロモーター、すなわち、本発明にて有用であるプロモーターは
、メタロチオネインプロモーター、特にサル、マウスおよびヒトのメタロチオネ
インプロモーター;シミアンウィルス40 (SV40)初期プロモーターまた
はsV40後期プロモーターのようなウィルス性プロモーター;マウス乳腺癌ウ
ィルス(MMTV)のLTR,ヒトT−細胞リンパ栄養性ウィルス(HTLV)
L nまたは■のLTRまたはニワトリ肉腫ウィルスのLTRのようなウィルス
性LTRを包含する。かがるプロモーターは、それらが天然にて存在する遺伝子
または細胞から誘導することができる。かかるプロモーターもまた修正し、その
配列を変えることができる。
一般的に、組換え型プラスミノゲン活性化因子のコーディング配列の下流に、ポ
リアゾニレ−ジョン(ポリA)領域、すなわち、RNAトランスクリプトのポリ
アゾニレ−ジョンに作用する領域が存する。かかるポリA領域は、明らかに、転
写を安定化する役割を果たす。哺乳動物細胞の発現ベクターにて通常用いられる
ポリアゾニレ−ジョン領域、すなわち、本発明において有用であるポリアゾニレ
−ジョン領域は、SV40初期領域、ウシ成長ホルモンおよびヒトコラーゲンプ
ロa2 (I)のポリアゾニレ−ジョン領域を包含する。かかる領域は、それら
が天然にて存在する遺伝子から誘導することができる。かかる領域はまた、ポリ
アゾニレ−ジョンおよびトランスクリプト安定化機能が有意に逆に影響を及ぼさ
ない条件にて修正され、その配列を変えることができる。
スプライシング部位、転写活性化因子およびエンハンサ−を含む他の調節機能部
もまた、遺伝子発現単位内に、または遺伝子発現単位からなるDNA分子内の別
の場所にて構成することができる。
異種DNAまたは宿主細胞に有意に逆の影響を及ぼすことなく、異種DNAを宿
主細胞に導入させるいずれかの方法により、哺乳動物細胞を組換え型プラスミノ
ゲン活性化因子遺伝子発現単位でトランスフェクションに付す。かかる方法は、
リン酸カルシウム沈澱、エレクトロポレーション(electroporati
on) 、原形質融合、微量注入およびウィルス性トランスフェクションを包含
する。
本発明のプラスミノゲン活性化因子遺伝子発現単位は、トランスフェクションの
前に、より大きなりNA分子を組み入れることが好ましい。かかる大きなりNA
分子は、組換え型プラスミノゲン活性化因子機能部に加えて、少なくとも遺伝選
択マーカーからなることが好ましい。該選択マーカーは、トランスフェクション
に付された宿主細胞において、容易に検出可能な表現型変化を発現するいずれか
の遺伝子または遺伝子類とすることができる。かかる表現型変化は、例えば、ウ
シ乳頭腫ウィルス(BPV)ベクターを用いた場合に起こりうるフォーカス形成
:ネオマイシン、G418またはヒグロマイシン(hygromycin) B
耐性に対する遺伝子のような薬剤耐性;またはキサンチン・グアニン・ホスホリ
ボシル・トランスフェラーゼ(xgprt)、チミジンキナーゼ(TK)および
ガラクトキナーゼ(galK)のような他の選択可能なマーカーである。増幅機
能を付与する選択マーカーを用い、マーカーおよび遺伝子発現単位のトランスフ
ェクション効率を増加させるか、または細胞内複製を強化するかのいずれかによ
り、コピー数を増加させることができる。
遺伝子コピー数を増幅させるのにも役立つマーカーは、ジヒドロホレート・レダ
クターゼ(dihydrofolate reductase) (メトトレキ
セート耐性) 、CAD (N−ホスホンアセチル−L−アスパルテート耐性)
8よびアデノシンデアミナーゼ(2−デオキシフルホマイシン耐性)の遺伝子を
包含する。
組換え型プラスミノゲン活性化因子の遺伝子発現単位からなる大きなりNA分子
は、哺乳動物細胞トランスフェクシントにおけるエビソマールメインテナンス能
を有し、または有していなくてもよいプラスミドとすることができる。安定した
エビソマールメインテナンス能を有するかかるプラスミドは、tPA遺伝子□発
現単位に加えて、メインテナンス機能部、すなわち、HAK細胞にてDNAに有
糸分裂染色体複製に独立して複製させる領域からなる。かかるメインテナンス機
能部は、典を的には、例えば、ウシ乳頭腫ウィルス(BPV)、シミアンウィル
ス40(SV40)、BKウィルス(BKV)、アデノウィルス、エプスタイン
・バー・ウィルス(E B V)、ポリオーマウィルスおよび単純性庖疹ウィル
ス(HS V)のような動物ウィルスを包含するウィルス性起源にある。かかる
メインテナンス機能部は容易に調製され、哺乳動物細胞の安定したエビソマール
メインテナンスにて試験することができる。プラスミド、かくして、組換え型プ
ラスミノゲン活性化因子遺伝子のコピー数は、一般的には1〜1000の範囲に
ある。
組換えをプラスミノゲン活性化因子の遺伝子発現単位を組み入れることのできる
プラスミドは、多くの出所源から入手可能であり、または組換えff1DNA法
による哺乳動物宿主における遺伝子発現の分野においてよく知られた方法により
組み立てることができる。該出所源の中、公共供託所として、メリーランド、ロ
ックビル、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクシ9ンを包含し、そのカタ
ログにはいくつかの有用なプラスミドが含まれる。
遺伝子発現単位は、前記の増幅可能機能遺伝子のような他のDNA!能部と共に
、共トランスフェクションに付すことができる。かかる他のDNA機能部を、直
接または間接的に組換え型プラスミノゲン活性化因子遺伝子発現単位にリンクさ
せ、または、すなわち、異なる分子上にてリンクさせないこともできる。例えば
、Axe+、米国特許第4399216号参照。
トランスフェクション後、遺伝子発現単位を有する細胞を、回収可能な量の組換
え型プラスミノゲン活性化因子を産生ずるような条件下、栄養培地にて培養する
。標準的な哺乳動物細胞培養培地を用いることができる。細胞培養は、大気圧、
30〜45°C1好ましくは35〜42°C1最も好ましくは37°Cにて保存
する。
標準プロトコルは、カルシウム沈澱法による組換え型プラスミノゲン活性化因子
の遺伝子発現単位からなるプラスミドDNAでのトランスフェクション、約4〜
6時間インキュベートした後、グリセロールショック処理を包含する。形質転換
は、一般的には、約1〜20コピー数までのtPA遺伝子発現単位を有する宿主
細胞をもたらす。増幅法を用い、そのコピー数を約1000まで増加させること
ができる。形質転換の約24時間後、細胞を選択培地に置き、約2〜3週間培養
する。生存コロニーを24ウエル・マイクロタイタブレートに置き、交会するま
で、すなわち、1/2〜1週間インキュベートする。ついで、該ウェルを組換え
型プラスミノゲン活性化因子産生について検定する。ついで、高産生コロニーを
、各約1週間、T25フラスコ、T75’7ラスコ、ローラーボトル、最後に産
生ユニットにて連続的にインキュベートすることにより膨張させる。産生ユニッ
トにおいて、調整培地は、プラスミノゲン活性化因子を連続的に、または周期的
に採収することができるように、循環させ、まI;は周期的に取り出し、取り替
えることができる。産生ユニットは、粘着細胞用にデザインされたいずれかの培
養系、ファイバー、マイクロキャリアー、マイクロカプセルおよび細胞ファクト
リ−を用いる細胞培養ユニットであることが好ましい。
細胞培養後、組換え塁プラスミノゲン活性化因子を、標準タンパク単離法により
調整培地から単離する。これらは、一般に、例えば、イオン交換、逆相およびア
フィニティークロマトグラフィー操作を含む一連のクロマトグラフィー操作を包
含する。精製後、プラスミノゲン活性化因子を、非毒性、すなわち、有意に不利
な副作用がなく、かつ動物、特にヒトに投与した後、血栓崩壊を引き起こすに有
効な量のプラスミノゲン活性化因子からなる各投与単位のごとき医薬組成物に処
方する。一般に、心筋梗塞の治療用のかかる医薬組成物は、静脈内注射または注
入に適する形態であり、医薬上許容される希釈剤または担体中、プラスミノゲン
活性化因子0.1〜lomg/艷からなる。急性の心筋梗塞を患っている大人に
対する典型的な始原は、プラスミノゲン活性化因子80〜150mgを1.25
〜6時間にわたって静脈内に注入することからなる。適当な希釈剤および担体は
、医薬組成物の調製方法として、製薬化学者によく知られている。
実施例
以下の実施例は例示であり、本発明を限定するもので1まなし)。すべての酵素
は商業的に入手することができ、実質的に供給者の指示にしたがって用いた。D
NAアダプターはDNA合成2こより調製し、それを、以下の第3表において示
す。
■
ぢ舌上 云■f、呆g
実施例1 pULB 9122
ウロキナーゼ遺伝子を、ヤコブスら(1985)に記載されたcDNAクローン
pULB 1000から単離した。
該遺伝子は、シグナル配列におけるaa−16から停止コドンまでのUK−cD
NA分子、ポリC拡張および124bpのpBR322配列を含むBgl I−
Bg、] I (1440bp)断片上にて得た。この断片を74 DNAポリ
メラーゼ(マニアティスら(Maniatis et al、)(1982)
)で処理し、その5′末端上、21bpHindlff−Bgl I (平滑末
端部位)二重鎖合成りNAアダプター(第3表、アダプター1)に結紮し、AT
G開始コドンおよびaa−16までのウロキナーゼシグナルペプチドに対応する
配列を再組立を行なった。
ついで、プレグロウロキナーゼ(preprourok 1nase)であるp
pUKのコード化した再組立て分子を、中間イー・コリー・プラスミド、pUL
B1221 (ヤコブスら(1984))に結紮しくマニアティスら(1982
))、HindIIIおよびBgll?切断した。得られた組換え型プラスミド
をさらに、第1に、エフセブンタリー(excedentary) 3 ’ p
B R322配列を除去し、第2にpULB 1000またはI)ULB11
35(ヤコブスら(1985))に存するVa1410についてのコドンを、ア
ラニンを特定するコドンで置換する操作を行なった。この置換は、グンツラーら
(Gunzleret al、) (1982) 、ステラフェンスら(S t
effens et al、X l 982)およびハイネカーら(Heyne
ker et al、)、欧州特許公開明細書第9218’2号に報告されてい
るアミノ酸配列が、410位にてアラニンを有するという事実を考慮して行なっ
たものである。
この操作は、aa398から停止コドンまでのウロキナーゼコーディング配列お
よびpBR322配列を含む211bpBamHI−3acI断片を、プラスミ
ドから排除することにより行なった。
この断片を、5acI部位のすぐ上流にあるアミノ酸398から停止コドンまで
をコード化する48bpBamHI−3ac に重鎖合成りNAアダプター(第
3表、アダプター2)により置換した。
この組立体から誘導する組換え型プラスミド、pULB9117を形質転換によ
りイー・コリーのコンピテント細胞(マニアティスラ(1982))に導入した
。組換え型プラスミドを増幅させるため、1つの形質転換体をアンピシリンに富
んだ培地にて成長させt;。ppUK410のコード化1309bpHindI
[[−5aclカセツト(第1図、ppUK410)を、適当な酵素での消化に
よりプラスミドpULB9117から切除し、結紮により、真核生物シャトルベ
クター、DSP 1.1 BGH(ブファーら、DNA、4.461〜467.
1985)に挿入した。第2図参照。
得られた雑種プラスミド、pULB9122をイー・コリーのコンピテント細胞
に導入し、増幅させた。ついで、それを用い、真核生物R1610ハムスターお
よびCo5I細胞をトランスフェクションに付した。争件は以下のとおりであっ
た:C5CQグラジェント遠心により2回精製した純粋なpULB9122プラ
スミドDNA20μgを、ウィグラーら(Wigler et al、) (1
979)およびプファーら(1985)に記載されているリン酸カルシウム共沈
澱操作を介し、5%子ウシ胎児血清を補足したダルベツコ修正最小必須培地(D
ulbecco’s modified minimal essential
medium)(DMEM)中、約2X10’細胞を有するF 80 c m
2皿に加えた。4時間インキュベートした後、細胞をDMEM中、10%グリ
セロールで4分間ショックを与えI;。3〜5日後、細胞上澄みを回収し、pU
LB9122によりフード化された産生物の産生レベルおよび生物学的活性を検
定した。これは、ウロキナーゼに拮抗して増加したモノクローナル抗体(AAU
2およびAAU6)を用い、ELISA法により培地中のppUK410の量を
測定すること(へりオンら(Herion et al、X 1983 ) )
および色素産生基質(S2251)を用い、培地中のppUK410によるプラ
スミノゲンの活性化強度を測定すること(ドラビニルら(Drapier et
al、)により行なった。データーを第2表に示す。
つづいて、ppUK410のコード化DNA配列および非翻訳SV40プロモー
ターおよびBGHポリAを、5alI発現カセットとして、BPVから誘導され
た別の真核生物ベクターに導入した。
このBPV誘導の安定した発現ベクターはユニーク5alI一部位およびイー・
コリーのシャトルに対する配列とは別のマウスcDNA DHFRを有する。組
換え型プラスミド(ミニBPV DHFR−ppUK410)を用い、前記のリ
ン酸カルシウム共沈澱法によりHAK細胞を形質転換に付した。11〜14日後
、高濃度(200〜400nM)のメトトレキセートを含有する培地中、これら
のトランスフェクションに付した細胞の直接選択により、個々のコロニーを得た
。つづいて、これらのコロニーをクローニングシリンダーにより16〜18日に
おいて単離し、さらに増殖させ、拡張し、直接32444検定によりUK−活性
についてスクリーンに付し、関連するUK−抗厘の存在を、前記のELISA法
によりモニターしtこ。
実施例2 pULB9120
HeLa細胞からmRNAの逆転写により調製されたcDNAコーディング配列
(シ、oイニングら(Schleuning et al、)、19ブリノリシ
ス)を、SV40初期タ初期タンパクモプロモーターHポリアゾニレ−ジョン部
位の間のDSPl、IBGHにフレームにて挿入しくポイチックら(Woych
ik et al、)、バイオケミストリー(B iochem、)、81:3
944 (1984));グツドウィンら(Goodwin et al、)、
欧州特許公開明細書第173552号)、tPA遺伝子発現単位を調製した。該
tPA遺伝子発現単位を、プラスミド、DSPl、1TPA25BGHにおける
5alI制限工ンドヌクレアーゼ切断部位の両末端にて結合した。
409 b pDNA断片は、酵素H4ndl[[およびRsaIで消化するこ
とによりtPAクローンから誘導した。この断片は、ATG開始トリプレットに
対応する配列、シグナル配列、いわゆるフィンガーモジュール(finger
module)およびいわゆるtPA分子のEGFモジュール(a a 67ま
で)部を含む(ペン二カら、1983)。
他方、1219bpDNA断片を、酵素Ba1Iおよび5ailで消化すること
により、ウロキナーゼcDNA、クローンpULB1135(ヤコブスら、19
85)から誘導しI;。この断片は、ウロキナーゼのタンパク質分解部における
aa149から停止コドンまでのcDNA分子を含み、3’pBR322配列を
有する。
Rsa IおよびBa1I末端を有し、tPAのアミノ酸67およびプロウロキ
ナーゼの136〜149をコード化する43bp二重鎖合成りNAアダプター(
第3表、アダプター3)を、その分野においてよく知られた化学合成法により調
製した。ついで、前記3つの断片を一緒に、予めH4ndI[Iおよび5ail
で切断したイー・コリー中間ベクター(pULBl 221、ヤコブスら、19
84)DNAに結紮した。コンピテントイー・コリーMM294細胞に導入し、
増幅させ、得られた組換え型プラスミドを、さらに、外来性3’pBR322配
列を除去する操作を行なった。これは実施例1における記載のように行なった。
最終組換え型分子、pULB9115を用い、イー・コリーのコンピテント細胞
を形質転換し、増幅した。Fg、t PA/UK410のコード化1247bp
Hindm−5aclカセット(第1図)を、適当な酵素で消化することにより
プラスミドpULB9115から切除し、結紮により真核生物シャトルベクター
、DSP 1.1BGHに挿入した(ブファーら、1985)。得られた組換え
型プラスミド、pULB9120を増幅し、ついでそれを用いて、実施例1に示
すように真核生物R1610ハムスター細胞をトランスフェクションに付した。
Fg、tPA/UK410の産生検定および生物学活性の測定のようなさらなる
操作を、実施例1のように行なった。データーを第2表に示す。
ついで、Fg、t PA/UK410雑種分子を発現する不変細胞ラインを得る
ため、Fg、t PA/UK410のコード化DNA配列の他の真核生物発現ベ
クターBPVへの挿入を、実施例1のように行なった。しかしながら、用いるB
PV−ベクターの型に依存するため、今回はG418抵抗性コロニー(400μ
g / mu、ゲネチシン・ギブコ(Geneticin G 1bco)を選
択した。ついで、単離、増殖、生物学活性についての拡張およびスクリーニング
、およびUK−抗原関連発現を実施例1のように行なった。トランスフェクショ
ンを行なった細胞とこの組換え型プラスミドとの成長培地における産生および生
物学活性の試験を、実施例1のように行なった。データーを第2表に示す。
実施例3 pULB9129
この組立体は、ナチュラル活性部位(Arg156、Phe157、Lys15
8)における分子のタンパク質分解活性化を抑制するため、この部位を変形(T
hr156、Phe157、Thr158)するように修正したプレプロウロキ
ナーゼのコーディング配列を有する組換え型プラスミドである。
プラスミドpULB9117から出発しく実施例1参照)、適当な酵素で消化し
た後、3175bpBalI−BamHIDNA断片を回収した。この断片はそ
の3′末端に、ATG開始シグナル、プレプロウロキナーゼのaa19からaa
149のコード化配列を、その5′末端に、aa398ないし停止シグナルのコ
ード化配列を有し、これらの2つの領域はグラスミドに存するpULB1221
配列により分けられている。他方、292bpEcoRI−Xh。
ItDNA断片をpULB9117から誘導する:それはプレプロウロキナーゼ
のaa163からaa260までをコード化する。該組立体に要する第3の断片
をまた、pULB9117から調製する:それはプレプロウロキナーゼ分子のa
a260〜aa398’rコード化する4 14bpXhol[−BamH1断
片である。
最後に、前記2つのアミノ酸置換を含むaa 149ないしaa163をコード
化する二重鎖41 bpBa l I−EcoRI合成りNAアダプター(第3
表、アダプター4)を、周知化学合成法により調製した。ついで、前記の4つの
断片を一緒に結紮し、得られた組換え型プラスミド、pUL89128を、コン
ピテントMM294イー・コリー細胞に導入した。1つの形質転換体の増幅およ
びプラスミドpULB9128の精製を行なった後、産生物5cupanc 4
10のコード化Hind■−5acIカセット(第1図)を、適当な酵素での消
化による1309bp断片として回収し、結紮により真核生物シャトルベクター
DSPIIBGHに導入した(ブフア−ら、l 985)。得られた組換えをプ
ラスミド、pULB9129を用い、イー・コリーコンピテント細胞を形質転換
し、増幅した。
ついで、それを実施例1および2のように、R1610およびCo5Iに導入し
た。分泌産物の発現レベルおよびプラスミノゲン活性化能を実施例1および2に
おける記載のように試験した。
実施例4 pULB9134
この組立体は、pULBlooOまたはpULBl l 35にて存t6Cys
366についてのコドンを、グリシン特定コドンにより置換できるように修正し
たプレプロウロキナーゼのコーディング配列を有する組換え型プラスミドである
。この置換は、グンッラーら(1982)およびステラフェンスら(1982)
において報告されているUKアミノ酸配列が、366位にてグリシンを有すると
いうことを考慮してなされたものである。
pULB9117から出発しく実施例1参照)、2661bpHindI[[−
BamHIDNA断片を、適当な酵素での消化により産生した。この断片は、5
′ないし3′にて、ウロキナーゼDNAのaa398ないし停止コドンの配列お
よびpULBl221から誘導される配列を有する。他方、ATG開始シグナル
のコード化1140bpHindIII−Aval[DNA断片、シグナルペプ
チドおよびウロキナーゼ分子のaalないしaa358もまた、pUL、B91
17から切除しI;(実施例1)。この組立体に要する第3のナチュラルDNA
断片は、酵素Fnu4H1およびBamHlでのpULB9117の消化により
調製した。それは、ウロキナーゼのaa367ないしaa398のコード化95
bp長のストレッチDNAである。最後に、前記の単一アミノ酸置換を含むaa
358ないしaa366のコード化二重鎖26bp長のAvall−Fnu4H
1合成りNA断片を、その分野においてよく知られた方法により化学的に合成し
た(第3表、アダプター5)。
ついで、前記4つの断片を一緒に結紮し、得られた組換え型グラスミド、pUL
B9119を増幅させるべきコンピテントMM294イー・コリー細胞に導入し
た。pULB9119の精製後、ppUK410/366のコード化Hindn
l−5acIカセット(第1図)を1309bp断片として回収し、結紮により
真核生物シャトルベクターDSP1.1BGHに導入した(プファーら、198
5)。該組換え型プラスミド、pULB9134を用い、イー・コリーコンピテ
ント細胞を形質転換し、増幅させた。
最後に、プラスミドpULB9134を、実施例1および2のようにR1610
およびCo5I細胞において導入した。分泌産物の発現レベルおよびプラスミノ
ゲン活性化能を、実施例1および2における記載のように試験した。
実施例5 pULB9135
組換え型プラスミド、puLB9135は、システィン366についてのコドン
がグリシンについてのコドンで置換されている以外、pULB9129 (実施
例3)と同じである。組換え型プラスミド、pULB9135を組立てるために
用いた操作は、実施例4に記載の操作と同じである。この組立てられた組換え型
DNAは、そのナチュラル活性化部位(scupa nc410/ 366)に
てプレプロウロキナーゼを開裂できないようにコード化し、前記実施例における
記載のように、中間イー・コリープラスミド(pULB9131) tr:増幅
させる(第1図)。
ついで、1309bpHindDI−5acIカセツトをpULB9131から
切除し、DSP 1.1 BGHに導入した(プ7アーら、1985)。ついで
、組換え型プラスミドpULB9135をイー・コリーにおいて導入し、増幅さ
せた。
最後に、それを用い、実施例1および2のようにR1610およびCo5I細胞
をトランスフェクションに付した(第2表)。分泌産物の発現レベルおよびプラ
スミノゲン活性化能を実施例1および2に記載のように試験した。つづいて、5
cupa nc410/ 366を発現する不変細胞ラインを得るため、5cu
pa nc410/ 366のコード化DNA配列の他の真核発現ベクターBP
Vへの導入を、実施例1のように行なった。その後、選択、コロニーの単離、増
殖、生物学活性の拡張およびスクリーニングおよびUK−抗体関連発現を実施例
1のように行なった。
実施例6 pULB9124
組換え型プラスミド、pULB9124は、以前にグンツラーら(1982)お
よびステラフェンら(19B2)により公表されているアミノ酸配列に従う配列
を有するように、プレプロウロキナーゼのaa366に対応するコドンを、グリ
シンについてのコドンで置換する以外、pULB9120 (実施例2参照)と
同じである。
このプラスミドを組み立てる操作は、tPAのATG開始コドンからaa67ま
で、およびプレプロウロキナーゼのaa136ないし149の領域をコード化す
るpULB9115 (実施例2参照)から精製された452bpHindn[
−Bal I断片とDSP 1.1BGHのラージHindII[−5acI断
片を含むpULB9134(実施例4参照)からの6975bpHindII[
−Ba l I断片とを一緒に結紮することであり、本発明のすべてのHind
I[l−3acIカセツトを、プレプロウロキナーゼのaa149ないし停止コ
ドンのコーディング配列を発現するように挿入する。
ついで、プラスミドpULB9124を実施例1および2のようにR1610細
胞に導入した。分泌産物、Fg、t PA/UK410/366の発現レベルお
よびプラスミノゲン活性化能を、実施例1および2に記載されているように試験
した(第1図、第2表)。
実施例7 pULB9125
この組合体は、tPAのNH2一部(シグナル配列およびaalないしaa31
3)とウロキナーゼのC0OH部(aa195ないし停止シグナル)からできて
いる雑種分子のコード化組換え型プラスミドである。それは、以下の6つの断片
の結紮により得られるニープラスミドベクターDSP 1.1BGHから誘導さ
れた6180bpH4ndI[l−3acIDNA断片。真核生物細胞の組換え
型DNAを発現するすべての必要な配列を有する。
−DSP 1.1.TPA25BGHから切除される822bpHindII[
−EcoRIDNA断片。開始シグナル、シグナルペプチドオ、11.びtPA
分子のaalないしaa204のコード化配列を有する。
−DSP1.1.TPA25BGHから精製され、tPA分子のaa205−a
a313をコード化する326bpEcoRI−AluIDNA断片。
−その5′末端が平滑末端で、その3′サイドにてBclI結合性末端を有する
ウロキナーゼのaa195〜aa l 99のコード化12bp二重鎖合成りN
Aアダプター。
−pULB9117 (実施例1参照)から精製され、プレプロウロキナーゼ分
子のa a499〜aa282をコード化する248bpBc ] I−Tag
lDNA断片。
−pULB9117 C実施例1参照)から誘導され、プレプロウロキナーゼの
aa282〜停止コドンをコード化する397MTagl−5acIDNA断片
。
特にこの実施例において、t PKUK410 (第1図)と称される新規分子
のコーディングカセットは、発現ベクターDSP1.IBGHのユニークHi
ndI[[とSac I部位の間の1805bp断片からなる(プファーら、1
985)。ついで、組換え型プラスミド、pULB9125をコンピテントイー
・コリーMM294細胞に導入し、増幅させた。
ついで、該プラスミドpULB9125を、実施例1および2のようにR161
0およびCo51細胞に導入した。分泌産物の発現レベルおよびプラスミノゲン
活性化能を実施例1および2における記載のように試験した(第2表)。
実施例8 pULB9137
ここに記載されている組立体は、tPAのクリングル2に対応するアミノ酸配列
がプレプロウロキナーゼのクリングルドメインとプロテアーゼ部の間に挿入され
ている雑種分子のコード化組換え型プラスミドからなる。下文に概説されている
構成体は、いくつかのDNA断片を中間イー・コリープラスミドベクターにサブ
クローニングすることにより得られる。実際には、該構成体を得るに必須の中間
ベクターではないが、pJRD15g(ダビソンら(Davisonet al
、)、1984)およびpJRD184(ホイステルスプロイテら(Heust
erspreute et at、)、1985)を用いた。第1に、プレプロ
ウロキナーゼのaa66〜aa121をコード化する164bpNco I−F
nu4HIDNA断片を、pULB9119 (実施例4)から切除し、二重鎖
40bpFnu4H1−Sa I I合成りNA断片(第3表、アダプター7)
をその分野においてよく知られた方法により調製した。アダプター7は、連続的
に、ウロキナーゼのaa121−aa130およびtPAのaa173−aa1
75をコード化し、この配列は5alI部位の直後にある。ついで、前記の2つ
の断片を、イー・コリーのクローニングベクターpJRDI 84から誘導され
た2916bpSal I−NcolDNAストレッチに結紮する(ホイステル
スプロイテら、1985)。得られた中間組換え型プラスミド、p’BAlを、
コンピテントMM294イー・コリー細胞に導入し、増幅させた。第2に、DS
Pl、l。
TPA25BGHから誘導しくジュロイニングら(S chleuning e
tal、)、1982年、7月22−23日、スイス、ローザンヌ、第6回国際
会議フィブリツリシス)、tPA分子のaa169〜aa255のコード化25
8bpPs t 1−Rsa lDNA断片を消化により回収した。加えて、二
重鎖55bpRsaI−BalI合成りNA断片(第3表、アダプター8)を調
製した。アダプター8は、連続的に、tPAのaa255〜aa262、および
ウロキナーゼのaa139〜aa149をコード化する。2つの断片を、イー・
コリークローニングベクターpJRD158から誘導された3436bpBa
I I−Ps t lDNAストレッチに結紮した(ダビソンら、1984)。
ついで、得られた中間組換え型プラスミド、pBA2を、コンピテントMM29
4イー・コリー細胞に導入し、増幅させた。最後に、ウロキナーゼのaa66〜
aa130およびtPAのaa173−aa174のコード化198bpNco
I−DdeIDNA断片を、pBAlから誘導しt;。加えて、tPAのaa1
74〜aa255およびウロキナーゼのaa139〜aa149のコード化29
7bpDde 1−Ba l lDNA断片をpBA2から切除した。これら2
つの断片を、pULB9119 (実施例4)から誘導した3673bpNco
IBa I lDNA断片に結紮しI;。DNAのこの最後の断片は、その3
″において、ATG開始シグナル、シグナルペプチドおよびプレプロウロキナー
ゼのaal−aa66の配列を有する。その5′において、プレプロウロキナー
ゼのaa149ないし停止シグナルをコード化する。これら2つの3′および5
′領域を分ける配列は、pULB1221から生じる。
前記断片の結紮から得られた中間組換え型プラスミド(pULB9136)を、
イー・コリーMM294コンピテント細胞に導入し、増幅させた。ついで、それ
を用い、適当な酵素で消化を行ない、UK−に2 410/366と称する産生
物に対応する1555bpHindIII−3acIコーデイングカセツト(第
1図)を誘導した。
このカセットを結紮によりシャトル真核生物発現ベクター、DSPl、1 BG
H(プ7アーら、1985)に導入し、真核生物細胞をトランスフェクションに
用いる前に、得られ!二組換え型プラスミド、pULB9137を増幅した。
ついで、該プラスミドpULB9137を、実施例1および2のようにR161
0およびCo5I細胞にて挿入した。分泌産生物の発現レベルおよびプラスミノ
ゲン活性化能を、実施例1および2における記載のように試験した。
実施例9 pULB9151
この組立体は、雑種プラスミノゲンのコード化組換え型プラスミド、すなわち、
ウロキナーゼのC0OH末端部に結合したaa262までのtPAのNH2末端
セグメント、該分子のaa139から最終aaからなる活性化因子である。それ
は、プラスミドにて組み立てられたtPAおよびウロキナーゼの相対的な大きさ
により、pULB9125(実施例7)とは異なる。
該組立体は、3つのDNA断片を含む。第1の206bpEc。
R1−Ba1IDNA断片は、pULB9136(実施例8)から切除し;それ
はtPAのクリングル2およびウロキナーゼのプロテアーゼ部を接合する配列を
提供する。第2のATGシグナル、シグナル配列およびtPAのaal−aa2
04.のコード化822bpHindlll−EcoRIDNA断片は、プラス
ミドDSP1.1.TPA25BGHのDNAを適当な酵素で消化することによ
り得た。
最後の断片は、6975bpHindIII−Ba 11ストレツチとして、p
ULB9134 (実施例4)の消化により得た。この断片は、ウロキナーゼの
aa149から停止シグナルまでのコーディング配列およびそのユニークHin
dI11部位からそのユニーク5acI部位における真核生物ベクターDSP
1.IBGHの配列を有する。
前記3つの断片を結紮し、1823bpHindII[−3ac Iコーディン
グカセットとして、t PPUK410/366 (第1図)と称される産生物
についての遺伝情報を有する組換え型プラスミド、pULB9151を得j;。
プラスミドpULB9151は、真核生物R1610ハムスター細胞をトランス
フェクションするのに使用する前に、イー・コリーのMM294=ンピテント細
胞に導入し、増幅させた。
ついで、プラスミドpULB9151を実施例1および2のようにR1610お
よびCo51細胞にて導入した。分泌産生物の発現レベルおよびプラスミノゲン
活性化能を、実施例1および2における記載のように試験した(第2表)。
実施例10 pULB9139
下車に記載の組換え型分子は、二重変異体プラスミノゲン活性化因子であり;そ
れはアミノ酸置換およびいくつかのアミノ酸欠失の効果を併用している。組換え
型プラスミドは、以下の修正を伴うプレプロウロキナーゼのコーディング配列を
有する:a)アミノ酸Trp131をシスティン残基により置換する。これは、
グンツラーら(1982)およびステラフェンら(1982)により記載されて
いるウロキナーゼ分子が、131位にてシスティンを有する点を考慮してなされ
たものである。
b)残基132から残基147に広がるアミノ酸配列を該分子から欠失させ、t
PA分子における場合のようにジペプチド5et−Thrにより置換しt;。
該組立ては、3つのDNA断片の結紮を包含する。第1のDNA断片は、367
3bpBall−NcoIDNA断片として、puLB9119(実施例4)か
ら切除した。それは、その3″末端にて、ATG開始シグナル、シグナル配列お
よびプレプロウロキナーゼのaal−aa66のコドンからなる。プレプロウロ
キナーゼのaa149ないし停止コドンのコード化配列は、該断片の5″末端上
に位置する。
3′および5″末端の両方は、pULB1221から誘導された配列により分離
する。第2のDNA断片は164bpNcol−Fnu4H1n用4Hて、pU
LB9119 (実施例4)から誘導した。
それは、プレプロウロキナーゼのaa66〜aa121をコード化する。第3の
断片は、周知の化学的方法により得られた二重鎖43bpFnu4H1−Ba
I 1合成りNAアダプター(第3表、アダプター9)である。前記3つの断片
を結紮し、得られt;中間組換え型プラスミドpULB9138を、増幅すべき
イー・コリーのMM294コンピテント細胞に導入した。1267bpHind
III−3acIコーデイングカセツトを、適当な酵素での消化によりpULB
9138から切除した:それは、p pUK (410/366/ 131)d
el(第1図)と称される産生物をコード化する。該カセットを真核生物シャト
ルベクター、DSPl、1BGH(プファーら、1985)に導入し、真核生物
R1610ハムスター細胞をトランスフェクションするのに用いる前に、得られ
た組換え型プラスミド、pULB9139を増幅した。
ついで、プラスミドpULB9139を実施例1および2のようにR1610お
よびCo51細胞に導入した。分泌産生物の発現しベルおよびプラスミノゲン活
性化因子能を実施例1および2における゛記載のように試験した(第2表)。
実′謄例’11 pULB9152
ごの実施例は、不活性能(aa156および158が、ArgおよびLys・の
代わりにThrである、実施例3参照)および非分解能(aa132〜147の
領域が欠失され、ジペプチド5er−Thrで置換されている、実施例1O参照
)のプレプロウロキナーゼのコーディング配列を有する組換え型プラスミド、p
ULB9152の組立てを記載している。この組立ては、5cupa nc (
410/366/131)de lのATG開始コドンからaa135までの領
′域をコード化するpULB9138 (実施例10)から切・除した4 72
b、plH’i n d’III −B a l I断片、およびDSPl、
IB G’H、cプファーら、1985)からの大きなH4ndIII−3ac
■断片を含むpULB9135(実施例5)から精製した6975b、pHi
n dI[l−Ba I Iの結紮により行なった。
ついでプラスミドpULB9152を、イー・コリーに導入し、増幅させ、最後
に実施例1および2のようにR1610およびC05I細胞をトランスフェクシ
ョンするように用いI;。分泌産生物の発現レベルおよびプラスミノゲン活性化
能を実施例1および2における記載のように試験した(第2表)。
前記説明および実施例は本発明およびその好ましい具体例を十分に記載している
。本発明は詳しく記載されている構成に限定されるものではなく、さらにすべて
の修正も含めて、以下のクレームの範囲内である。
口
第 2 図
口SP1.18GH
国際調査報告
1I11+++I116Mjlムロ*1T111#内−暖・?Cτ/EE871
0OOiE国際調査報告
FIE 8700CH8
SA 20202
Claims (6)
- 1.Fg.tPA/UK410、Fg.tPA/UK410/366およびtP PUK410/366およびUK−K2410/366からなる群より選択され るプラスミノゲン活性化因子。
- 2.Fg.tPA/UK410、Fg.tPA/UK410/366またけtP PUK410/366およびUK−K2410/366からなる群より選択され るプラスミノゲン活性化因子のコーディング配列からなる組換え型DNA分子。
- 3.哺乳動物の発現ベクターであって、プラスミノゲン活性化因子のコーディン グ配列が調節領域にアレームにて融合する請求項2記載の組換え型DNA分子。
- 4.請求項3記載の組換え型DNA分子からなる形質転換された哺乳動物細胞。
- 5.請求項1記載のプラスミノゲン活性化因子とそれの医薬上許容される担体と からなる医薬組成物。
- 6.請求項4記載の形質転換された哺乳動物細胞を培養し、それにより産生した プラスミノゲン活性化因子を単離することを特徴とするプラスミノゲン活性化因 子の調製方法。
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