PT96103B - Processo para a preparacao de proteinas fibrinoliticas e anti-tromboticas activaveis - Google Patents

Processo para a preparacao de proteinas fibrinoliticas e anti-tromboticas activaveis Download PDF

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Description

BRITISH BIO-TECHNOLOGY LIMITED
PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE PROTEÍNAS FIBRINOLíTICAS Ε ΑΝΤΪ-TROMBóTICAS ACTIVÁVEIS
MEMÓRIA DESCRITIVA
RESUMO
O presente invente diz respeite & u® processo para a preparação de compostos proteicos que são activáveis por enzimas da cascada de coagulação para terem actividade fibrinolitica ou de inibição da formação de coágulos» Por exemplo, ura análoga da plasminogénio è activável para plasmina pela trombina ou pelo Factor Xa. A actividade fibrinolitica ou de inibição da formação de coágulos fica portanto limitada ao sítio da formação coáqu.los»
U referido processo consiste no acoplamento sucessivo de resíduos de aminoácidos uns aos outros e/ou ligação de peptídeos e/ou polipeptídeos» oligo-
Este invento está que podem ser activados para terem actividade fibrinolítica ou para inibirem a formação de coágulos sanguíneos» Ele está também relacionado com ácido nucleico CDNA ou. RNA) codificador da totalidade ou parte de tais compostos» Nas realizações preferidas, o invento está relacionado com análogos do plasminogénio, sua preparação, composições farmacêuticas contendo—os e sua utilização no tratamento de doenças trombóticas» plasminogénio é um componente t-have uo ^i^uema •f ibrinolítico que é a contrsparte natural do sistema de coagulação no sangue.-. No processo de coagulação do sangue, está envolvida uma cascada de actividades enzimaticas para gerar uma rede de fibrina que forma a estrutura de um coágulo ou trombus» A degradação da rede de fibrina Cfibrinólise) ê conseguida pela acção da enzima plasmina» □ plasminogénio é o precursor inactivo da plasmina e a conversão do plasminogénio em plasmina é conseguida por clivagem da ligação peptídica entre a argimna 5õi e a valina 562 do plasminogénio» Em condições fisiológicas esta, clivagem é catalisada pelo activador do plasminogénio tipo tecido ítPA) ou pelo activador do plasminogénio tipo uroguinase CuPAl» squi 1 íbrio entre
C3 to to X S l_toiTí-S to- u ξ perturbado, podem fibrinolítico ficar localmente coágulos intravasculares em sítios inadequados conduzindo a condições tais como trombose coronária e enfarte do miocárdio, trombose de veias profundas, choque, oclusão arterial periférica e embolismo» Em tais casos, a administração de agentes fibrinclíticos demonstrou-se ser uma terapia benéfica par-a a promoção da dissolução de coágulos.
rormar-se da com a disponibilidade da uma série da activadores dc
Γ ϊ
ρ1asminoqénio CS1S tf n:.
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Demonstrou—se ÍZjLÍS? 3X-Sdi5. LUH
coágulos5 mas todos têm dsfio
Xl“£*4 ©S· tL?*© *C.OCf LI. 3. ΓΊQ Ο *-.-OKI {.,? .τ. ?**. Ο plasminogénio .anxsoiiãidoy Αγ-oAu. ?stss aoentes promove a lisa de nelas no seu perfil de actividade o qu.e os torna agentes terapêuticos pouco ideais parai o tratamen— to de trombose (revisto por Marder e Sherry, New Enqlant of Mscdicins Í939i ioS
1513-1520} . Um dos principais problemas com o tPA para o tratamento de enfarte do miocàrdio agudo ou outras perturbações trombóticas é que é rápidamente eliminada da circulação com uma semx—vxda no plasma no nomem de cerca de 3 minutos CBounameaux et al» ems Contsmporary Issuss in Haemostasis and Thrombosis vol. í p5-91P 1985. Collen et al. eds, Churchill Livingstone). Isto resulta na necessidade de administrar tPA por infusão em grandes doses. 0 tratamento é portanto caro e é retardado pois o paciente tem de ser hospitalizado antes do tratamento poder começar. A uroquinase,. na formai de cadeia simples CscuPA) ou na forma de duas cadeias CtcuPA)s tem um eliminação do plasmai igualmente rápida; e também requere administração por infusão contínua.
Um dos principasiproblemas partilhado por todos estes agentes é que em doses clínicamente úteis, eles não são específicos dos trombus pois podem activar o plasminogénio na circulação geral» A principal consequência disto é que as proteínas tais como fibrinogénio envolvidas na coagulação do sangue são destruídas e podem ocorrer hemorragias perigosas. Isto também acontece com o tPA apesar do facto de sm concentrações fisiológicas ele se ligar à fibrina e apresentar activação do plasminogénio selectiva para fibrina»
Uma activadcres do outra deficiência importante na actuação dos plasminogénio existentes é que & re—oclusão do vaso sangumso reperfundido ocorre normalmente após a cess« ΐ i w.S .t Q cd
administração do agente trombolítico. Pensa-se que isto seja devido à persistência de matéria] dissolução do trombus.
trombogénico no local da
Uma abordagem alternativa para aumentar a íibrinólise foi agora projectada,, a qual se baseia na utilização ds moléculas activáveis para terem actividade fibrinolítica ou para inibirem a formação ds coágulos. A activação (que pode envolver clivagem) pode ser catalisada por uma ou mais enzimas endógenas envolvidas na coagulação do sangue. Uma vantagem desta abordagem é ser conseguida selectividade parai o trombus da actividade fibrinolítica ou de inibição da formação de coágulos através da localização específica de trombus das enzimas activadoras.
De acordo com o primeiro aspecto do presente invento? é proporcionado um composto proteico que é activével, por uma enzima envolvida na coagulação do sangue, para ter actividade fibrinolítica ou para inibir a formação de -coágulos.= bompostos proteicos acordo com o primeiro aspecto do invento, são portanto activáveis pelo menos através- ds uma de duas maneiras. Primeira, um composto pode ser activado para ter actividade fibrinolítica. Segundo, um composto pode ser activado para inibir a formação de coágulos. Do mesmo modo, um composto pode ser activado para ter ambas as funções.Em muitos- casos a activação é mais convenientemente conseguida por clivaqem.
De prefsr‘s‘rii_ia u Coísípoc-to, quando activado, Lem subs— tancialmente a mesma actividade qualitativa do agente fibrinolí— tico natural de mamífero e/ou um inibidor mamífero da formação de coágulos. Em termos quantitativos, se bem que seja preferido que que a actividade natural,
TãO OQst tj SETí-SO IH%S rr do que o compost os benefícios do invento podem ainda ser bons mesmo que a actividade nSo seja toda. faoa, Será entendido que os compostos preferidos do invento podem portanto ter a mesma actividade qualitativa de um precursor natural de um agente íáe um agente
-£ ·» Ι-* u~* 4 , formação αε coâguios. Novamente em termos quantitativos, a facilidade com qus o precursor pode ser activado é preferencialmente., mas não necsss-àriaments, tão boa como natural.
ao composto
Um composto natural proteico que é activávsl para ter actividade fxorinolxtica é o pias-mxnogénxo» o quai e clivado para formar plaasina. Os análogos do plasminogénio formam um grupo preferido de compostos deste invento.
A análise da molécula do plasminogénio tipo selvagem revelou que é uma glicoproteína composta por um domínio protease serina, cinco domínios em ansa e uma sequência N-terminal de 78 amxnoácxdos que pode ser removxda por clxvagem com plasmxna. ft clivagem por plasmina envolve a hidrólise das ligações ArgCéS)-MetCê-9), Lis(77) -Lisΐ78) ou Lis<78)-Vai<79) para criar formas ds plasminogénio com um resíduo de metionina, lisxna ou. valina N-terminalg todos eles normalmente designados como 1is-plasmino·-gênio. D plasminogénio intacto é referido como glu—plasminogénio pois tem Um resxduo de ãcido glufámxco N—terminal, A giicosi1ação ocorre nos resíduos Asn<289) e Tre<346) mas o grau e composição são variável
C un d U Ξ X ϊ , d sj prfSSí !>_·3 díuma =-érxe de »armas dí ρ1asminoqenxc diferentes pes-Qs moleculares no plasma» 0 domínio de protease sarina pode ser rseconhecido pela sua homoloqia com outras proteases- ser ina e na activação para plasmina é o domínio cataiiticamente activo envolvido na degradação de fibrxna. Os cinco domínios em ansa são homólogos outr proteínas do plasma tais como tHA e protrombina e estão envolvidos na ligação a fxbrina e portanto localização do plasminogénio i
>
Protein Sequence and Strucp.95 (1978))que indicou que e plasmina para o coágulo. 0 plasminogénío é um zimogénio que normalmente circula no sangue como uma cadeia polipeptidica simples e é convertido enzima plasmina da duas cadeias por clivagem ds uma ligação peptídica entre os aminoácidos 561 íarg) e 562 íval). Esta clivagem é catalisada especificamente por activadores do plasminogénío tais como tPA e uPft» Isto está revisto sõí; Castellino, F.J., 19S4, Ss-minars in Thrombosis_-and
Haemostasis 16—23. Mesta especificação, o plasminogénío está numerado de acordo com os estudos ds sequenciação da proteína ds Sottrup-Jensen et ai „Cems Atlas of ture íDayhoffj M.O., ed.5 5 supl. 3, o plasminogénío era uma proteína de 790 aminoácidos s que o sitio da clivagem era a ligação peptídica Arg(560)~Val<561)« Mo entanto, um cDNA de plasminogénío adequado útil nesta realização do invento ε o isolado por Forsgren et al, (FEBS Letters 213 254-26© (1987)) codificam uma proteína de 791 resíduos com uma Ile extra na posição 65. Mesta especificação, a numeração dos aminoácidos no plasminogénío corresponde à do cDNA usado. Pode haver polimorfismo na estrutura do plasminogénío e pode haver formas de plasminogénío nas quais a numeração do sitio de clivagem difere mas pretende-se que tais variantes sejam incluídos na realização.
Portanto o termo análogo do plasminogénío, conforme é usado nesta especificação, significa uma molécula que difere do plasminogénío tipo selvagem e tendo a capacidade para ser clivada ou ou de outro modo trabalhada para formar uma nolécula tendo actividade de plasmina.
t emi—vida no- plasma de gl
do 2,2 dias e a do 1 is-p
Ξ- çi H„ e Vermylen, J. 1 ε>*74.
ãsTixnogenxo como senão 1974. Bxochxm. Bxophvs. Acta 342;
351-359; Walisn, P« ε Wiman, B. em; “Proteases and Bíoloqical r
Con t ro 1!! 5 293. -303» Re i c h >
Laboratory).
eds. Uolti Spring
Qs análogos do plas-minogênio dentro do Smbito desta realização do invento retêm a actividade de ligação à fibrina do ρ 135$xnogsnio Όρο seivagem n«ís grau íhss t.em caraccer—s ticas de activação alteradasj os análogos do plasminogénio pi- eTsrxdos rsín uuts sem.t vxda no p!Xe-sama i|us e pelo menos o do plasminogénio tipo selvagem, mas esta propriedade não é essen— ε is I, mecanismo de coagulação do sangue compreende uma série de reacçSes enzimáticas que culminam na produção de fibrina insolúvel, a qual forma, a. estrutura de proteína em rede dos coágulos sanguíneos. A trombina s a enzima responsável pela conversão do fibrinogénio solúvel em fibrina. A conversão ds. protrorabina, o precursor inactivo da trombina, para, trombina é catalisado pelo Factor X activado (Factor Xa)» (Trombina. é também conhecida como Factor Ha e a protromfaina como Factor II.)
Factor Xa. é gerado a partir do Factor X extrínseca ou intrinsecamente. Na via extrínseca, o Factor VII é activado para
Factor VIIa, o qual gera h; Ais s « i s
Factor Xa a partir tio Factor X, Na via λ para bactejr Xa é cacalzsada pelo Factor IXa, 0 Factor IXa é gerado a partir do factor IX pela que por sua vez e gerado p*els acçao do XI. 0 Factor Xlla. é gerado a. psritr do de calicreína, Qs Fsctores VIIIa e Va pensa.—se actuarem como cofactores na. activação dos Factores X e II, res pec t i verne.n ce» acção do rsetor Xla, Factor XIIa no Factor Factor XII pela acção
A fibrina. 5 como inicialmente formada a partir do fibrinogénio existe numa forma frouxa., A fibrina frouxa, é convertida em fibrina cerrada pela acção do Factor faz a ligação cruzada de moléculas de fibrina.» '11 Ia, o qual
A proteína C activada é uma protease serina anticoagu™ Xante gerada na área da. formação do coágulo pela acção da trombi— na? em combinação com a tromhomodulina, na proteína C»
A proteína C activada. regula a formação de coágulos por clivagem e inactivação dos cofactores pro-coagulantes Va e VlIIa.
termo enzima envolvida na coagulação do sa.nguecomo é usado nesta especificação inclui portanto calicreina» Factores
XIIa, XI, :Xa„ VII, e trombina (Factor lia) , os quais estão directamente envolvidos na formaçãode fibrina e proteína C activada, a qual está envolvida no controle da coagulação sanguínea» As enzimas mais preferidas sso Factor Xa s trombina, pois estão mais i medi a. tamen te envolvidos na formação de fibrina»
A geração e actividade de pelo menos Factor Xa e trombina está muito bem regulado para assegurar que a geração de trombus é restringida ao sítio do estímulo trombogénico» Esta localização é conseguida pela operação combinada de pelo menos dois mecanismos de controle» a.s enzimas de coagulação oo sangue funcionam como complexos intimamente associados com os fosfolípidos das membranas celulares tie plaquetas e células endoteliais no sítio do dano vascular CMann, K»8», 1984, em: Proqress in Hemostasis and Thrombosis, í - 24, ed» Spast, T«H. Brune e Strattonlj e s trombina livre ou Factor Xa. libertado a. partir do sítio do trombus para a circulação s rápidamsnte inactivado pela acção de inibidores das p-rotea.ses- tais como antitrombina III»
Assim, as actividades da penúltima (Factor Xa) e última (trombina) enzimas na cascada de coagulação são particularmente ί
bem localizadas no sitio da geração do trombos e por esta razão são preferidas.
Encontrou-se que a trombina permanece associada aos coágulos e ss liga não covalentemente á fibrina. Na digestão dos coágulos com plasmina., a trombina activa é libertada e pensa-se que contribui -para a reformação do coágulo e para a reoclusão de vasos que normalmente ocorre após tratamento trombolitico com activadores do plasminogénio (Bloom A.L». 1962? Br. J. Haemato 1, 82, 129; Francis et a 1,, 1983, J. tab. Clin. Med., 102, 22®; Mirshahi st al,, 1989, Blood 74, 10251.
For estes motivos., é preferido em certas realizações do invento para modificar o plasminogénio ou outro composto proteico potencialmente activável torna—lo activável pela trombina ou
Factor Xa para assim criar uma f i b r i η o 1 í t i c as· ou inibido r as- d a classe preferida de proteínas Formação de coágulos selectivas para coágulos. Os análogos do plasminogénio mais preferidos retãm a propriedade favorável da molécula de plasminogénio parental de possuir uma semi-vida no plasma longa e apresentar selectividade para trombus através de uma combinação de dois mecanismos5 nomeadamente ligação a fibrina através dos domínios em ansa e da nova propriedade de serem convertidos em plasmina no local da formação do novo trombus pela acção de uma -das enzimas envolvidas na geração do trombus © preferencialmente ali localizada»
Q Factor Xa <h. = C = 3 = 4.21,6) ê uma protease serina qua :onverte protrombina humana em trombina através de uma clivagem
-IleC3235 (Mann et al
rsC274> ε ArgC
mology 8® 286-:
' / Ã* ) pr” edido
Ί — : 7.·“ 77 \ X. preci
Em protrombina humana? tr i pe pt í deo 11e-B1u-Bl pelo tripeptídso Ile-Asp-Gli. A estrutura necessária para
/ reconhecimento pelo Factor Xa parece ser determinada pela sequência de aminoácidos local precedendo o sítio de clivagem (Maqnus— iteases and Bíological Contrai, 123Cold Sprinq Harbor Laboratory,
sufi «t al. , 1975,
149, eds., Reich g,-t
York). A espec ,i f ici>
a i
New
A especificidade para a sequência Ile-Glu-Gli-Arg e Ile-Asp-Gli-Arg não é absoluta pois encontrou-se que o Factor Xa cliva outras proteínas, por exemplo o Factor VIII nas posições 336, 372, 1689 e 1721, onde a sequência de aminoácidos precedente difere significativamente deste formato (Eaton st al., 1986 8 i oc hem i s t r y 25 5®5~512), Uma vez que o principal substracto para o Factor Xa & a protrombina, as sequências de reconhecimento preferidas são aquelas em que arginina e glicina ocupam a.s posições Pi e Fz, respectxvamente, um rssxtíuo scxdxco kácioo sspértico ou qlutâmíco) ocupa a posição P3 e isoleucina ou um outro resíduo hidrofóbico pequeno (coma seja alanina, valina, leucina ou metionins) ocupa a posição P4« No entanto, como o Factor Ma pode clivar sequências que diferem deste formato, outras sequências cliváveis pelo Factor Xa oodem ser usadas no invento, tal como podem ser outras sequências cliváveis por outras enzimas tía cascada de coagulação.
A conversão do plasminogénío em plasmina pelo tPA e uPA envolve a clivagem da ligação peptídica entre arginina 561 e valina 562 para produzir uma proteína de duas cadeias ligadas por pontes dissulfureto com uma valina amino-terminal na cadeia leve idofiixmo de protsãss/ e uma arginxna carooxx cermxnax na cadexa pesada. □ plasminogénío não é clivado e activado num grau significativo pela trombina ou Factor Xa e para se fazer análogos do plasminogénío que sejam cliváveis por estas enzimas preferidas, o sítio de clivagem Pro(559), G1ÍC560), ArgCSéi), Vai(562) reconhecido pelo tPA e uPA tem de ser alterado. Para fazer análogos do plasminogénío que sejam cliváveis por exemplo pelo Factor Xa, uma sequência de aminoácidos clivável pelo Factor Xa pode ser
substituída na molécula. ds plasminogênio» A sequência Ile-Glu-Gli-Arg que está num dos sítios na protombrina clivado pelo Factor Xa pode ser uma dessas sequências» Outras possibilidades seriam sequências ou simulações da sequências cliváveis pelo Factor Xa noutras proteínas ou peptídeos» Um análogo do plasminogênio bíb que Pro(55S> è removido e substituido por Ile-Slu, pode ter a ligação peptídica ArgCSôl)-Vai(562) (numeração do plasminogênio tipo selvagem) pelo Factor Xa para produzir um análogo da plasmina ds duas cadeias ligado por pontes dissul•fino-terminai na cadeia leve (domínio srboxí-terminal na cadeia pesada» 0 DNA .e-Glu-Gli-Arg como parte carboxi—ter3or ciivável como auxiliar para a produção de
furetOj com u»ia Vcs 1 ms
protea.se) e uma. arginine.
codificador da sequência
minai de um adaptador cl
proteína es tá divulgado
a utilização de uma sequênci í-tílu-iíli-Arg para, permitir processo de activação alterado para o zimogé-nio não está descri?
naquela especi ficação,
A ciivayfcfm e auiiv-ação de variante—- do plasminogênio ou de outros compostos proteicos potencial mente activáveis por um-a encima da cascada de coagulação tal como trombina ou Factor Xa pode ser medido de uma variedade tíe maneiras5 por exemplo por análise de SDS-PASE, e no caso das variantes do plasminogênio testando quanto ê. formação da plasmina. usando o ensaio cromogénico S2251 ou um ensaio lise de fibrir em ufcfjt
A trombina Ct»U» 3»4»2í»5) é uma proteass ssrina que catalisa a proteólise de uma série de proteínas incluindo íibrinogénio (cadeias A alfa e B beta)» Factor XIII3 Factor V3 Factor VII, Factor VIII? proteína C e antitrombina III» A estrutura necessária para o reconhecimento pela trombina parece ser pareialmente determinado pela sequência tíe aminoácidos local à volta do sítio de clivagem mas é também determinada até certp ponto por
sequênciaCs) afastadas do sítio de clivagem. Por exemplo, na cadeia alfa A do fibrinogénio, os resíduos P2 (Vai), P9 (Fen) e PIO (Asp) são cruciais para a clivagem catalisada por «--tronibinana ligação peptídica ArgCló)-Sli<17) (Ni, F. st al. 1989, Biochemistry 28 3082-3094). Estudos comparativos de várias proteínas- ε peptídeos que são clivados pela trombina conduziu ã hipótese de os sítios de clivagem óptimos para s—trombina poderei» ter a estrutura de íi) P4--P3-Pro~Arg~Pí ?™P25 onde P3 e p4 são cada um independentementeum aminoãcido hidrofóbico (coíbo seja valina) e Pi’ e P'2’ é cada um independentemente um amionoácido não acídico tal como um aminoãcido hidrofóbico como seja valina ou (ii) P2~Arg~PÍ’ onde P2 ou Pi5 é glicina CChang, J. 1.985, Eur» J« Biochem. 15Í 217-224). Existem, no entanto, excepçSes a estas estruturas gerais que são clivadas por trombina e que podem ser usadas no invento. Para produzir um análogo do plasminogénio que possa ser clivado e activado por trombina, um sítio reconhecido e clivado pela trombina pode ser substituido na molécula de plasminogénio num local adequado. Pode ser usada uma sequência ds aminoácidos tal como a clivada pela trombina na cadeia alfa A do fibrinogénio. Outras sequências possíveis incluirão as envolvidas ria clivagem pela trombina de fibrinogénio beta B, Factor XIII, Factor V, Factor VII, Factor VIII, proteína C, anti-trombina III e outras proteínas cuja clivagem é catalisada pela trombina. Um exemplo de um análogo do plasminogénio clivável pela trombina pode ser um em que a sequência Proí559), GliC56@> ê alterada para 81ÍC559)—ProC560)-Argí5ál) —VaiÍ562) que é idêntica ã encontrada nas posições 17-20 no fibrinogénio alfa A. Este não ê o principal sítio de clivagem pela trombina no fibrinogénio alfa A pois a trombina ρο-ds clivar a ligação peptídica Arg C Í9)-Val Í20) .
Tais alterações sâ’o importantes se caracteristicas importantes tais como actividade e estabilidade se mantiverem no derivada mutante
Numa com análogos adições ou. del Cis(566) inclu pela troíRbina, ção do sangue realização preferida o x do ρ 1 asminogén 10 com uma* sções de aminoácidos entre sive. Tais análogos do pia
Factor Xa ou outras enzima para produzir análogos da nvento está, relacionado ou mais substituições, os resíduos ProC555) e sminogénio são clivados s envolvidas na coagula— plasmina com actividade fibrinolítica„ análogos do plasmínogénio de acordo com a realização preferida do invento pode conter com o glu-plasminogénio tipo selv outras modificações (comparado gem) que podem ser uma ou mais adiç-S poder mais es, deleçSes ou •5 Ξ-ί?!'” H ROlÇtí.Or.
domínios em ansa substituições. Um exemplo de tal remoção, substituição ou alteraç; para aumentar a actividade de modificação o de um ou ligação da fibrina»
Um exemplo de uma modificação envolvendo deleção seria variantes lis—plasHiinoyêmo de análuyos do p quais os aminoácidos amino-terminais 68, 77 ou 7 dos. Tais variantes podem ter uma actividade de aumentada, tal como foi observado para o lis-plas rado com glu—plasmínogénio tipo selvagem (Boks W.F. 1985, Biochemistry 24 3279-3286).
lasminogénio nas 8 foram eliminsligaçso a íxbrina minogénio compaR.A. e Mangel, inibidor da plasmina anti-plasmina alfa—2 estã presente no sangue e fica incorporado na matrix de fibrina dos coágulos sanguíneos. 0 papel deste inibidor é restringir a actividade da plasmina no coágulo e na circulação. Para os análogos do plasmínogénio altamente selectivos de coágulos do presente invento pode ser vantajoso introduzir uma mutação no domínio de protease serina que inter dor da plasmina. Esta mutação poder mostraoa para evitar a ligação de fere com a á ser numa χ π i o i d o r&
ligação posição ao ac do initaianaloqa è.
tivador do
plasminogênio tipo tecido al. 1989 Natare 3-59 /21 _79Λ
Outros análogos do plasminogênio modificados em vários sítios de acordo com o invento podem incluir uma. ou mais modificações para evitar, reduzir ou alterar os aos ql icosilsção» Os análogos do plasminogênio que incorporam tais modificações podem ter uma semi-vida mais longa, uma eliminação dc> plasma reduzida ε/ou uma actividade especifica mais elevada.
Outras proteínas podem também ser alteradas de forma a que sejam clivadas ou de outra forma activadas, por enzimas envolvidas na coagulação do sangue, para serem fibrinoiíticamente activas ou para serem inibidoras da formação ds coágulos» □ activador do plasminogênio uroquxnase ds cadeia simples CscuPA) é um exemplo de uma proteína f ibrinoi ítica e uma proteína. C ê um exemplo de uma enzima envolvida na inibição ds da coagulação do sangue que poderá ser deste modo activada.
scuPfi é activada para uPA de duas cadeias CtcuPA) por clivagem com plasmina da. ligação peptídica Lisí 1585 — Ilei 159} . A trombina inactiva scurA por clivagem da ligação peptídica ArgCÍSóJ—Fení157)· Um análogo de scuPA poderá ser construído em que a sequência de aminoácidos à voltai do sítio ds clivagem foi alterada de forma a qus a clivagem pela trombina ou por uma. outra, enzima envolvida na coagulação do sangue produzirá tcuPA activo»
A proteína C é clivada para a sua forma activada pela acção de trombina ligada à trombomodulina» Um análogo da proteína C dentro do âmbito deste invento foi modificado de forma a ser clivável pela trombina per se para formar proteína c activada.
As proteinas de fusão podem ser construídas para se conseguir uma libertação selectivs ds proteínas fibrinolíticas ou anticoagulantes no sítio de coagulação do sangue. Para se conseguir isto, as proteinas envolvidas na fibrinólise ou inibição da. coagulação são ligadas por uma região de ligação que é clivável por uma enzima envolvida na coagulação do sangue. Exemplos de proteinas que podem ser incorporadas em tal proteína clivável incluem tPA, uPA, estreptoquinase, plasminogénio, proteína C, hirudina e anti-trombina III. A fusão ds tais proteinas com uma proteína com uma propriedade favorável não d i rec tamen te- relacionado com a dissolução ds coágulos do sangue (por exemplo a albumina, a qual tem uma semi—vida lonqa no plasma) pode também se r ben ê f ic a.
Características preferidas de análogos do plasminogénio dentru du âmbito do inveiitu tambs ‘Hl apiica, sempre qus auequado, a outros comoostos do invento, mutatis mutandi*
Us compostos de scordc com o primeiro aspecto do invento podem ser sintetizadas por qualquer via adequada» De acordo com um segundo aspecto do invento e proporcionado um ρΓΌίΣ S55O p-ΞΙ !“-3. -S pS^Spcfct^SÇcfQQ© L-.ίίι COÍupOSXQ Q((3 P€~ Í.CO COÍT-O ÚSS-CF* X tlO atrás, o processo compreendendo a acoplagem sucessiva de resíduos de aminoácidos uns aos outros e/ou ligando o1iqopeptídeos. Se bem que as proteinas possam em principio ser sintetizadas total ou parcialmente por meios químicos, a via de eleição será a tradução ribossomal, de preferência in vivo, de uma sequência de ãcido nucleico correspondente. A proteína pode ser glicosilada adequa— damente.
é preferido produzir proteínas usando tecnologia de DNA recombinante.
oe acoroo com o invento particularmente quando elt anâioqos su bs t i t u i ç ão = d e1eç ão ou ad i c ão d e
l£3 aminoácidos) de proteínas naturais. 0 DNA codificador de plasminogénío ou de uma outra proteína natural pode ser de um clone de cDNA ou genómicoou oode ser sintetizado. As substituições, adições ou deleções são preferenciaimente introduzidas por mutagénse dirigida. Sequências de DNA adequadas codificadoras de glu-plasminogénio, lis-plasminogénio s análogos do plasminogénio © outros compostos dentro do âmbito do inventa podem ser obtidas por processos familiares dos familiarizados com a engenharia genética. Para várias proteínas, incluindo por exemplo o activador do plasminogénio, é um processo de rotina obter proteína recombinante por inserção da sequência codificadora num vector de expressão e transfecção do vecto numa célula hospedeiras adequada. Um hospedeiro adequado pode ser uma bactéria tal como E. coli, um microorganismo eucariótico tal como levedura ou umas
Siuia eucariótica superior. 0 plasminogénio, no entanto, é invulgarmente díficil de expressar e foram feitas várias tentativas sem êxito para a produção de plasminogénoo recombinante nas células de mamífero CBusby 8= et al. 1988. F1brino1ysis, 2, Supl. 1, 64, Whitefleet-Smith et al.·, 1989, Arch. Bioc. Biop. 271 390-399). Pode ser possível expressar plasminogénio em E. coli mas a proteína seria feita numa forma insolúvel e teria de ser renaturada» Com a tecnologias corrente será díficil uma renaturação satisfatória. 0 plasminogénio foi expresso em células de insecto por oacuiovírus em nxveis usando um sistema ds células infsctadá de 0,7 - 1,0 pg/í©'”5 células (medido 66 horas pós-infecção) (Whitefleet-Smith et al. (ibid) mas este método não gera uma linha celular estável produtora de plasminogénio s quaisquer modificações pós-tradução, tais cosmo glicosilação, poderão não ser as autênticas.
De acordo com um terceiro aspecto do invento, é proporcionado ácido nucleico sintético ou recombinante codificador d© um composto proteico como descrito atrás. 0 ácido nucleico pode
ser RNA ou DNA. As características preferidas deste aspecto do invento são as do primeiro aspecto»
De acordo coo um quarta aspecto do invento, é proporcionado uns processo para a preparação de ácido nuclsico de acordo o processo compreendendo com o terceiro aspecto, sucessiva de nucleótidos e/ou po1inuc1eótidos» a acoplagem uns aos outros e/ou ligação de oligo— □ ãcido nucleico recombinante de acordo com o :eiro aspecto do invento pode estar na forma de um vector, o qual pode por exemplo ser um plasmídeo, cosmideo ou fago» 0 vector pode ser /adaptado para transfectar ou transformar células procarióficas (por exemplo bactérias) e/ou células eucarióticas (por exemplo de levedura ou da mamífero)= Um vector compreenderá um sítio de clonagem e de um modo geral pelo menos um gene marcador. Um vector de expressão terá um promotor operacionalmente ligado ã sequência a ser inserida no sítio de clonagem e, preferencialmente, uma sequência que permita a secreção do produto proteico» Os vectores de expressão e necessitam de ser capazes vectores de clonagem (os quais não le exoressão) estão incluidos no âmbito □o invento,
Certos vectores são particularmente úteis no presente invento» Da acordo com um quinto aspecto do invento, é proporcionado um vector compreendendo uma primeira sequência de ácido nucleico codificadora de uma proteína ou tendo um sítio de clonagem, operacionalmente ligado a uma sequnda sequência de ácido nuclsico contendo um promotor forte e uma sequência potenciadora derivada de citomegalovirus humano, uma terceira sequência de ácido nucleico codificadora ds uma sequência de poliadeni— lação derivada do SV40 e uma quarta sequência de :odificadora de uma marca seleccionável ;í;pr sa ácido nuc1eico a partir de um
promotor de SV4® e tendo um sinal de poliadenilação adicional do SV4© no extremo 35 da sequência da marca selecionável.
Beve-se entender que o termo vector é usado nesta.
especificação num sentioo funcional oensado como estando necessáriamente limitado a uma única molécula de ácido nucleico. Assim. por exemplo, as primeira, segunda e terceira sequências do vector definido atrás podem ser colocadas numa primeira molécula de ácido nucleico s a quarta sequência poderá ser colocada numa segunda molécula de ácido nucleico.
A marca seleccionável pode ser qualquer marca adequada,, A marca gpt s adequada.
Tal vector permite a expressão de proteínas tais como plasminogènio e análogos do plasminogènioCincluindo glu—plasmino— génio e lis-plasminogénioí que podem de outro modo ser difíceis de expressar. Este aspecto do invento proporciona a. construção de um vector que é útil para a expressão de genes estranhos e cDNAs e para a produção ds proteínas heteróIogas sm células ds mamífero. r-í particular exemplifiçada é construção linhas celulares estáveis que são capazes de expressar plasminogénio e análogos do plasminogènio sm níveis elevados.
Usando um vector, por exemplo como descrito atrás, procsxÍ-as hecsí· oxogas, tais como pxasminogemo s análogos oo plasminogènio, são preferencialmente expressos e sscretados para o meio de cultura celular numa forma biologicamente activa sem necessidade de outro processos biológicos ou químicos. Células ou linhas celulares adequadas a serem transformadas são preferenciaImente células de mamífero que crescem em cultura contínua e qus podem ser transfectadas ou de outro modo transformadas por = Exemplos de células adequadas técnicas convenc.tonais incluem
células de ovário de hamster mieloma de murganho tais como HeL.a, células BHK, linhas celu celular de Bowes, células L hepatoma humano tais como He células 3T3 N1H de murganho.
chinês íCHO), linhas c P3X63-Ag8.653, cé1u1as lares de melanoma tais de murganho, linhas c rp 82, fibroblastos de elulares de COS, células como a linha elulares de murganho e para a expressão ao plasminogénio s os anaiogos é particularmente benéfica. De acordo com um invento, é portanto proporcionada uma célula de chinês (CHO> para expressar plasminogénio ou plasminogénio.
CHO ou outras células, tais como levec 8ac c ha romyc es cerevisiae) ou bactérias f. por ex
Parece que a utilização de células CHO como hospedeiros do plasminogénio sexto aspecto do ovário de hamster ι um análogo do lura (por exemplo ímpio Escherichia col .1) podem ser referidas para a expressão de outros compostos proteicos do inventa. De acordo com um sétimo aspecto do invento, é proporcionada uma célula ou uma linha celular transformada pelo ácido nucleico e/ou um vector como descrito atrás. A transformação pode ser conseguida por qualquer método conveniente? electro— poração é um método preferido.
usados em
Os compostos c om pos iç oss to de trombose ou de outros est actividade T3.brxnola.tica e/ou incluem enfarte do miocárdio e venosa, tromboembolismo, adesões v asc u 1 o pa t i as d i a bé t i c ss, p-roteicos do presen armacéuticas para a te invento podem ser prevenção ou tratamen.dos em que se pretenda produzir anticoagulante. Tais condições cerebral, trombose arterial e pós-cirúrgicas, trombailebite e
Ds acordo com um oitavo jpecto do invento, é proporcxonaoa uma composição farmacêutica compreendendo um ou mais
compostos de -acordo com o primeiro aspecto do invento e um veículo farmacêutica ou veterinériamente aceitável» Tal composição pode ser adaptada à administração intravenosa e deve portanto ser estéril» Exemplos de composições ds acordo com o presente invento incluem preparações estéreis de análogoísl do plasminogénio em soro fisiológico isotónico e/ou tampão» A composição pode incluir um anestésico local para aleviar a dor da injecção» Os compostos do invento podem ser fornecidos na forma de dosagem unitária, por exemplo como um pó seco ou concentrado sem água num recipiente herméticamente fechado como seja uma ampola ou saqueta indicando a quantidade de proteina» Sempre que um composto tenha de ser administrado por infusão, ele pode ser distribuído por meio de um. frasco para infusão contendo água estéril para injseções- ou soro fisiológico ou um tampão adequado» Sempre que ele tiver de ser administrado por injecção pode ser distribuído com uma ampola de água para injecção, soro fisiológico ou um tampãoadequado» A composição ρ-ara infusão ou injectável pode ser feita, misturando os ingredientes antes da administração» Sempre que tenha de ser administrado como um tratamento tópico, ele pode ser distribuído numa base adequada»
A quantidade de material a ser administrada dependerá da quantidade de fibrinóliss ou inibição da coagulação necessária, da. velocidade de acçâo necessária, da gravidade da posição tromboembólica e do tamanho do coágulo» A dose precisa a. ser administrada devido è natureza do estado a que se destina este tratamento, ssrS determinada pelo médico» Como guia» no entanto, um doente a ser tratado de um trombus maduro receberá de um modo geral uma dose diária de um análogo do plasminogénio entre @,©1 e 10 mg/Kg de peso do corpo por injecção por exemplo em 5 doses ou por infusão» invento pode ser usado num método para o tratamento ou profiláxia de trombose, compreendendo a administração de uma
quantidade eficaz não tóxica de um composto de acordo com α primeiro aspecto» De acordo com um outro aspecto do invento é proporcionada a utilização de um composto como descrito atrás na preparação de um aqente trombolitico e/ou anticoagulante»
U invento diz respeito especialmente a DN.As, vectores, estirpes hospedeiras transformadas, proteínas análogas do plasminogénio e processo para a sua preparação como descrito nos exemplos»
ento que se seguem São
limitação do in ver? to» Os
ressão do plasminogénio e
de célula s eucariót •í. X. CX Z?
esc rsvem a èíXps .U mm í~í u
plasminogénio e de variantes do plasminogénio e suas propriedí des» Nos desenhos referidos nos exemplos:
Figura í mostra a construção de pSWHs riyura 2 mostra a q1u-p1asm inoqéni o sequência de nucleótidos do cEMMA de e a sequência ds aminoácidos
Figura. 3 mostra um mapa do vector de expressão pSWHqPí;
Figura 4 mostra as sequências do sitio de clivagem dos r ” análogos do plasminogénio activados pelo Factor Xa§ mostram as sequências do sitio de clivagem de análogos do plasminogénio activados pela t r om sins 5
Figura 6 mostra a activação de X2 pela trombina num gel de agar com pa; j. u r du uO r λ fxbrina?
Fiqura 7 mostra a plasminogénio X3, trombina (para Ti: 21, TI3 ê usado n activação dos mutantes do T13 e T19 pelo Factor Xa Cpars X: 5 e T19):í X3 é usado nos Exemplos js Exemplos 13 e 24 e T19 é usado ) ou 5 s nos t x em ρ i os 1 e e 26 §
Figura S mostra a activação do mutante TÍ9 do plasminogénio (Exemplos 16 e 26) pela trombina, conforme determinado por ensaio da plasmina?
Figura 9 mostra um gel de SDS—PASE mostrando a clivagem de X2 pelo Factor Xa e de T2 pela trombina? e
Figura 10 mostra a velocidade de clivagem do plasminogénio mutante T19 (Exemplos 16 e 26) com a trombina =
Exemplo 1 plasmídeo pSSl ê um vector com sequência sinal que proporciona um sinal de secreção para qualquer gene sem tal sequência» pGWl deriva deste vector e pBWH é um vector de expressão contendo um promotor.
Construção de pSSl
1„ 0 plasmideo pUClS (Figura 1.1) foi usado como estrutura de base do vsctor pois contem simultaneamente a origem de replicação ds E. coli, que permite a produção do DNA de plasmideo em E, coli e um gene ds resistência ã ampicilina, permitindo a selecção do plasmideo em E. coli (Figura i»ίϊ. CpUCÍS está descrito sm Gene 19 259-268 (1982) e Gene 26 101-106 (1983) e esta depositado na American Type Culture Collection com o depósito NQ ATCC 37253)» pUClS também contem poliadaptador no qual o DNA sintético foi inserido mas este poliadaptador tem um sítio EcoRI que foi necessário eliminar antes da inserção da sequência sintética» Isto foi feito por clivagem do DNA com EcoRI e tratando com nuclease muno bean”, uma nuclease de cadeia simples e depois religando o DNA de plasmideo (Figura 1«2).
2» 0 DNA de pCiS modificado foi clivado com HindIII e BamHI e nestes sítios um fraqmento sintético
AGCTTCCACCATBAABTBCTCCTGGSTBATCTTCTTCCT6ATGGCCGTGGT
BACCGGCGTGAACTCGCGAGATCTAGAGTCGACCTGCAGGATATCBAATTCATT
3’ (cadeia de cima),
5’ 6ATCAATGAATTCGATATCCTGCASGTCGACTCTAGATCTCBCBAGTTCAC6 GTCACCACGGCCATCAGGAAGAASATCACCCAGGAGCACTTCATGGTGGA 3’ (cadeia de baixo) contendo uma sequência sinal de imunoglobulia (Mafure 331» 173—175- Rogelj et al» ,, 1988) mais um ooliadap— tador, o qual contem restrição e também um uma variedade de sítios p-=tra enzima^ de r pares de bases» isolado a partir de DNA do 8V4D e que contem um sinal ue :4
poliaden.il ação, foram ligados numa reacção ds três vias (Figura
1.3). Os sinais de poliadenilação dos outros genes, taií como hormona ds crescimento bovino, pode rã u também s-er usados na, construção deste vector. Ds segmentos restantes da estrutura ds base do pUCíSs nomeadaiuen te oí si tios ><.pn ί e s~ bmai permanecem rlt— nesta construção- e portanto estes sítios forma eliminados por digestão do DNé os plasmxoeo oom r-.pn x s 5amh 1, remoção do f rag mento s inserção ds um adaptador da, cadeia de baixo (55 GATCCGTAC 3’) o qual destrói os sítios Kpnl e SmaI mas reconstitui o sítio BamHI (F igara 1=3).
3. Para tornar este vector útil na expressão transitória em células COS uma origem ds replicação sintética, do SV40 de TO pares de bases ( 5 ’ TATGAAGACGTCGCCTCCTCACTSCTTCTSGAATAGCTCAGAGGCCGAGGC
GGCCTCGGCCTCT6CATAAATAAAAAAAATTAGTCAGGG 3S (cadeia de cima)), 5 CGCCCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGSCCGAGGCCGCCTCGGCCTC TGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCGTCTTCA 3’ (cadeia de baixo), foi ligada nos sítios Ndel—NarI do pUCIS para substituir um fragmento ds 33 pares ds bases (Figura 1.4)=
4. Uma sequência de DNA sintético Í5S AABCBBCCBCGBCCAT— 6CCSGCCACTAGTCTCGAGTT 3? (cadeia ds cima); 5’ AACTCGAGACTAGTGGCCGGCATGGCCGCGGCCGCTT 3? (cadeia de baixo)), que codifica sítios de enzimas de restrição que cortam pouco frequentemente o genoma de mamíferos e que ajuda, a linearização do DNA do plasmídeo antes da transfecção, foi ligada ao plasmídeo no sitio SspI para for.mar o vector sem promotor pSSI (Figura 1,5)» o» A sequência de nucleótidos de todo o plasmídeo fí confirmada.
Construção de pGV)l
Muitos cuNAs ou genes a serem expressos j-â possuem uma sequência sinal e portanto pSSI foi modificado para remover o sinal de secreção.
ó» □ DNA foi clivado com HindiII e NruI« o fragmento removido e um adaptador (5’ABCTTCCCGBBATAGGTACCTCS 3’ (cadeia de cima), 5’ CGAGGTACCTATCCC6GGA 3’ (cadeia de baixo)) contendo os sítios HindiϊI, Smal, Kpnl e NruI foi inserido (Finura 1,6)» Além da remoção da sequência sinal isto também adiciona ao poli-adaptador dois sítios para enzimas de restrição tornando-o assim mais versátil» Este vector sem promotor é designado pGWI e a sua. montagem correcta foi confirmada por análise da sequência de nucleótidos do plasmídeo completo,
Construção de pSWH
7. 0 plasmídeo pSSI não tem promotor ou sequência potenciadora. Este pode ser convenientemente adicionado pela ligação dos fragmentos de BNfi adequados no poli-adaptsdor, por exemplo no sítio HindiII. Uma sequência promotor/potenciador adequada para usar é a região precoce imediata reguladora da transcrição do citomegalovírus humano (HCHV) CProc. Na11» Acad, Sc i. USA, 81, 659-663, Thomsen et al . 1984), se bem que outras regiSes reguladoras possam ser usadas e.g» repetição terminal longa do Vírus do Sarcoma de Rous (RSV LTR), região promotor/potenciador precoce ou tardia do SV4©, LTR do vírus do tumor mamário de murganho ÍMMTV), promotor da metalotioneina de murganho» Isto foi inserido em p-GWi no sítio Hindi11 e depois a orientação foi testada por digestão com endonucleases de restrição. 0 sítio Hindi11 5S foi então eliminado fazendo uma. digestão parcial com HindiII, de forma a ser clivado apenas o sítio 55. Este sitio foi então removido por tratamento com nuclease de mung bean“ e subsequente reliqação para formar pGWH (Figura 1.7). A montagem correcta do vector foi confirmada por análise da sequência de nucleótidos de todo o plasmídeo.
8» Um fragmento de DMA incluindo o gene da marca seleccionável gpt e a sequência promotor/potenciador precoce do SV40 e a sequência de poliadenilação foi clonada no sítio BamHI do vector para formar pGWHg, e permitir a selecção de células que tenham estávelmente integrado o BNfi de plasmídeo» Podem igualmente ser usados genes codificadores de proteínas qus conferem resistência à S41S ou è hi-gromocina ou uma variedade de selecçSes metabó1icas« i
Este sistema de expressão particular* ê preferido devido à sua eficácia mas a sus utilização não pretende limitar o âmbito do presente invento» Na literatura, estão descritos muitos métodos alternativos de expressão de genes em células de mamífero e tais sistemas da expressão são bem conhecidos dos- familiarizados com a área da engenharia genética e foram pelo menos parcialmente documentados por Gorman em ”DNA Cloning 9ol» IIs A Praticai Approach1' CD»n» Blover, ed» 1RL Press» Oxford (1985) ρρ 143-190)»
Exemplo 2 - Expressão ds lálu-Plasminoqénio us metoces qu pooem ser usado* par so ! amen to d s cDNA estão bem documentei isolamento ds cDNA do que se segue» 0 cuNA de sequenexado írors-gren ex a 1 dos e um processo que tem sido plasBiinogônio está resuiBxdo no p1asminogén i o hum-ano FEBS Letters, 21 -3,, :
Asado para prOTOCX' JL o foi cIonado 54-260 í1987)>
£·?
kNA foi o-reparado a partir de fígado humano fresco usando o método do tiocianato B i oc hem 1. s t ry 10.s 3294 C 1979 5 5 e oligo-dT CAviv e Leder PIMAS 69 s de guanidina (Chxrgwxn et al., purificado usando uma coluna de
2» A biblioteca de cDNA foi preparada como descrito no rrouocolD oa Amersham \ 'cDWa Synchesxs ano Lloninu system »
Amersham International plc liqado num vector lambda»
198o), 0 cDNA de cadeia dupla foi
3» As placas foram de cDNA do plasminogênio por los-e usando oligonucleotidos representando os extremos 3 despistadas rslativaments á hibridação de réplicas em ni sondas marcados com ’-’“p (17 e b“ do ρ1asminogêniο, num ressnça roeelume r os) 5 tampão bSu CdtíC é 150 mM Naul, 15 mn citrato de sódio), 5 x de esperma de salmão á filtros foram lavados
Of
0,1 mg/ml de DNA
Den ha rd t? s, ¢3, temperatura ambiente durante a noite. Os usando 6 x SSC, 0,1 X SDS a purificadas, sujeitas a resgat de plasmídeo recombinante empacotados
As placas pws.itivsts fwram £ -Η3·Π»3.0·~0£ □u seus ti o to t-lcMitoS íde su bc1onss foram sequenciados por uma modificação do método didesoxi usando dATF'—55—u—l -^53 tiof osf a to (Ver secção Métodos) ca uma proteína glu-plasminogénio ds 791 aminoácidos que ponde ao comprimento do plasminogénío descrito por Forsgen et al. (ibid) e contem um aminoácido extra (Ileó5>quando comparado
Este cDNA codifícorrsscom a sequência de aminoácidos tieterminadé
5eo uen c i ac ão d e proteína (Sottrup—Jensen et al.„ ibid). A sequência de nucleóti— dos do cDNA e a sequência de /91 está apresentada na Figura 2= aminoácidos do qlu-piasminoqénio
P*j£3to'fíi toto*r~ UtoxiQtoto OUtLFOS sTsétodoS d exemplo mRMA isolado a partir de células que produzem plasminogénio pode ser preparado usando o método do tiocianato de guanidina (Chirgwin et al.Biochemistry 1©;5294 (1979)) e sintetizada uma primeira cadeia de DNA complementar usando trsnscripte.se reversa.
isoiamenco.
ρε
A Reacção em Cadeia Jol imerase (F‘CR) pode então ser usada para, amplificar a sequência do plasminogénío (Saiki R„ et al., Science, 259, 4S7—491 <Í9S8)>. A reacção PCR poderá também ser usada para amplificar a sequência a partir de DNA preparado a partir de uma biblioteca de DNA genómico ou de cDNA que contenha sequências codificadoras do plasminogénío. Como alternativa, o gene poderá ser montado a partir de oligonucleótidos sintetizados q u í m i c amen te.
fragmento de glu-plasminogénío Bal 1-S-phI de 2,5 Kb foi subclonado no poli-adaptador de pUCiS .nos sítios Smal-Sphl
(Figura 2). 0 cDNA do plasminogénio foi então removido do pUCÍ8 por clivagem num fragmento Kpnl-Sphl e ligado ao vector pGWH para criar pBWHP, preparado como descrito no Exemplo 1, nos sítios ΚρηI e EcoRI usando um adaptador EcoRI-Sphl <5S AATTCCATG 3’)» Assim a transcrição do cDNA do plasminogénio pode ser iniciada no promotor/potsnciador de HCMV ít-igura
A marca seleccionàvel gpt, expressa a partir do promotor do SV4® poliadenilação no seu extremo 3% foi cionado no sitio BamHI do pBWHP para criar pSWHgPl (Figura 3) e a orientação testada por digestão com endonucleases de restrição, 0 DNA de plasmídeo foi introduzido nas células CHO por electroporação usando Q©0 Ve 25 pF como descrito na secção de métodos abaixo, 0 meio selectivo (250 μΙ/ml de xantina, 5pg/ml de ácido micofenólico, íx hipoxantina-timidina CHT) foi adicionado às células 24 horas após transfscção ε o meio mudado de dois em dois ou de trãs em trãs dias. As placas que deram colónias resistentes a gpt foram despistadas quanto & produção de plasminogénio usando um ensaio ELISA, As células, produtoras dos níveis mais elevados do antigé— nio foram novaissnts cionadas s os melhores produtores foram amplificados sendo a produção cuidadosamente controlada. Os stocks congelados de todas as linhas celulares foram estabelecidos, As linhas- celulares Cí,44 e Cl =75, que produzem ambas glu-plasfiíinogénio numa concentração de >3mg/litro, foram amplificadas em frascos rolantes para proporcionar meio condicionado a partir do qual -a proteína plasminogénio foi purificada usando lisina SEPHAR08E 4B= CA palavra SEPHAROSE é uma. marca registada.) U plasminogénio purificado foi então testado quanto -à. sua capacidade para ser clivado plasmina por tPA ou estreptoquinase usando o ensaio de coágulos da fibrina em agar, A clivagem do zimoqénio foi também estabelecida usando SDS-PASE (Nature, 527, 680, Laemm li, 1 '770),
As técnicas de manipulação genética, expressão e purificação de proteínas usadas na manufactura deste plasminogénio tipo selvagem, assim como as dos exemplos do plasminogénio modificado que se seguem, são bem conhecidos dos familiarizados com a área de engenharia genética. Uma descrição da maior parte das técnicas pode ser encontrada num dos seguintes manuais de laboratórios Molecular Cloning de T. Maniatis, E.F. Fritsch e J. Sambrook publicado pelo Cold Spring Harbor Laboratory, Box 100, New York, ou Basic Methods in Molecular Bioloqy de L.G»
Davis, M.D.
Battey publicado pela Elssvier Science
Publishinq Co. Inc,, New York:
Na secção de métodos abaixo estão detalhadas metodologias adicionais e modificadas.
Exemplo 3 - Construção e Expressão de XI
Construíram-se análogos que foram alterados a volta dos sítios de clivagem ArgCSól), VaiC562) para modificar o sítio e permitir o reconhecimento e clivagem por enzimas alternativas. XI é um análogo do plasminogénio em que o resíduo de aminoãcido Pro(559) foi substituido por He ε Glu (Figura 4). Este sitio foi baseado num sítio de clivagem pleo Factor Xa na protrombina. A estratégia de modificação neste exmplo foi subclonar o fragoíento ΚρπΙ-HincII de 1,87' Kb do cDNA do plasminogénio num vector pUClS, no bacteriófago de cadeia simples M13 mpití para facilitar a mutagénese. Preparou-se o molde de cadeia simples e as mutações foram feitas por mutaqénese dirigida. Neste caso usou—se um oligonucleôtido de 21 bases de comprimento í5? CCCTTCCCTCGATACATTTCT 3’) pa.ra dirigir a mutagénese. Us clones portadores da mutação foram identificados por ssquenciação e depois totalmente
4· sequenciados para assegurar que nenhuma outra fiiutaçSo foi inadvertidamente introduzida» 0 DNA forma replicativa (RF) foi então
p re pa r acf £ contendo a mutação iranstenoa para o vector exρressoo substituição do fragmento ΚρηΙ-tcoKV tipo selvagem com o fragmento mutaqenizado» 0 plasmídeo pSWHg portador do plasminogénio mutante foi então linearizado com a endonuclease de restrição Ngtl e introduzido nas células CHO por electroporacão» 0 protocolo de expressão foi então como descrita no Exemplo 2= A linha celular usada para produzir esta proteína mutante é C7»9» A activação e clivagem deste mutante com Factor Xa foram estudadas como descrito para os Exemplos ΞΘ e 29 =
Exemplo 4 — Construção e expressão de X2 processo do Exemplo 3 foi seguido de um modo geral excepto o iniciador usado ser o mero (55 tíCTTCCCTCBATGCCACATT—
TC3’í» D derivado do plasminogénio mutante resultante tem as seguintes alteraçSes de aminoécidoss ProC559) para Bli, BliCSóô) para Ile e adição de Slu e Gli antes de ArqíSól) CFioura 4). Este sítio de clivagem baseia-se num sítio de clivagem pelo Factor Xa na protrombina» A linha celular CS = 24 foi cultivada para produzir esta proteínas mutante» Excepto isto, seguiu—se de um modo geral o processo do Exemplo 3» A activação e clivagem deste mutante foi estudada como descrito nos Exemplos 20 e 27»
Exemplo 5 — Construção e expressão de X3
Effl X3, FTOC5595 foi substituída por Gli, Ala, Hee Glu usando o48 mero C5’CCCCCCCACAACCCTTCCCTCTATTBCACCACATTTCTTCGBCTCCAC3S5(Figura 4), A linha celular C37,4 foi usada para produzir esta proteína que tem um sítio de clivagem baseado no sítio de clivagem pelo Factor Xa na protroíBbina» Excepto isto, seguiu-se de um modo geral o processo do Exemplo mutante está descrita no Exsnsolo 21 abaixo
Exemplo b - Construção e expressão de X5
X5 teíR Pro(5595 foi substituída por Gli, Tir, Ile e Asp usando um 48 mero (5’CCCCCCCACAACCCTTCCGTCTATGTAACCACATTTCTTCGBCTCCAC3’) (Figura 45, A linha celular C37.4 foi usada para, produzir esta proteína que tem um sitio de clivagem baseado no sítio de clivagem pelo Factor Xa na protrombina» Excepto isto, seguiuse de um modo geral o processo do Exemplo 3» A activação deste mutante está descrita no Exemplo 21 abaixo,
Exemplo 7 - Construção e expressão de Xó
Além da mutação em X5, Xó tem Vai(5615 substituída por Ile (Figura 45. Isto foi feito usando o 32 mero C3’CACACCCCCCCAC— AATCCTTCCGTCTATGTAACCACATTTCTTCGGCTCCACS’5, A linha celular C3Ó,1 foi usada para produzir esta proteína» Excepto isto, seguiu-se de um modo geral o processo do Exemplo 3. A activação deste mutante está descrito no Exemplo 21 abaixo»
Exemplo 8 - Construção e -expressão de Tí
TI é um derivado do plasminogénío em que F’roí559) e Gli(56Ô) foram trocadas para dar Bli na posição 559 e Pro em 560 (Figura 5). Este sítio de clivagem mascara o sítio de clivagem da trombina em Argí19>-Val(20) na cadeia alfa A do fibrinogénio. Seguiu-se de um modo geral o processo do Exemplo 3 excepto o iniciador usado ter sido o 2í mero í5’CAACCCTTGGACCACATTTCT3’). A linha celular produtora do mutants Ti é C6.23. A activação s clivagem desta proteína estão descritas nos Exemplos 22 e 28 abaixo,
Exemplo 9 - Construção e expressão de T2 ímxnugéiiio que toi mudifiuado a partir do plasminogénío tipo selvagem do mesmo modo que Tí mas em que foi adicionado uis aminoácido láli extra entre Gli(059) e F'ro(5ó0) CFigu.ra 5), D processo do exemplo 3 foi generalidade exceptuando o iniciador usado para mutante ser um22 mero (5»ACCCTTGGACCACCACATTTCT3’) na
i.-seguido fazer este « A linha celular C5»i6 foi usada para produzir esta proteína mu. tan te, A activação e clivagem deste mutante estão apresentados nos Exemplos abai xo»
Exemplo ÍO
Construção de Tó
Na aminoácidos» proteína Tô existem dois sítios de alteração de Os aminoácidos Pro(559), Gli(560), Arq(Sói),
Vai(562) foram substituídos por seis aminoácidos para ficarem G11C559), Val(56@), Vslíõól), Pro(562), Arg(563), 811(564). Além destas alterações, Vai<553), LisC556), LisC567) foram substituidos por Leu, Glu e Leu respectivamente usando um 6í mero C5S GGBCCACACACCCCCCCACTCCCCTA6GCACAACTCCACATAGCTCCGGCTCCAGTTGAGG 35) ÍFigura 5). Esta modificação baseia-se num sítio de clivagem da trombina no Factor ΧΠ» A linha celular C45.1 foi usada para produzir esta proteína. Exceptuando isto seguiu—se na generalida— oe o izxemplo o. e acczvação e 1 iv-zigení descrito nos Exemplos 23 e 29 abaixo= pKO Cóf xfsa Si»
Exemplo 11 — Construção e expressão de T/
; descrita para T6 nomi
□60), Arg( 561) ç. Vai (56:
559), Vali 560) 5 Vai CS·
ão vai(533 ) 5 Li s(556) <
Numa outra modificação baseada num sítio de clivagem da trombina no Factor XIII, T7 incorpora a primeira série de alterasemente a substituição de Pro(559). por seis aminoácidos para se tornar , Pro(562), Arg(563), Gli(564). Em adição vai(553), LisC556) s LisC557) foram substituídos por Leu, Gin e Leu respectivamente usando o mero Í5? 6GCCACACACCCCCCCACTCCCCTAGGCACAACTCCACATAGTTGCGGCTCCAGTTGAGG 35) (Figura 5). A linha celular C26.5 foi usada para produzir esta proteína. Excepto isto o processo do Exemplo 3 foi seguido na generalidade. A activação e clivagem desta protsina estão descritas nos ~ pios 23 e 29 abaixo.
txenExemplo 12 — Construção ε expressão de Tã
IS baseia~se no sítio de clivagem da. trombina. no l-actor XIII e nesta proteína Pro(559), Bli(560), ArgC561), VaiC562) foram substituídos por Vai, Glu, Leu, Gin, Bli, Vai, Vai, Pro, Arg, Bli usando um óí mero C5!CACACACCCCCCCACTCCCCTABBCACTACTCCTTGTASTTCTACACATTTCTTCGGCTCC 35) (Figura 5)» A linha celular C34»5 foi usada para produzir esta proteína» Exceptuando isto, o processo do Exemplo 3 foi seguida na. generalidade» A activação e clivagem desta proteína está descrito nos Exemplos 23 e 29 abaixo»
Exemplo 13 - Construção e expressão de T13
No derivado do plasminogênio T13 os dois aminoácidos F'ro(559), Bli(56©), foram substituídos pelos- três aminoácidos Vai, Vai e Pro usando um41 mero <5? CACCCCCCCACAACCCTAGGTACAACACATTTCTTCGGCTC 3-’) (Figura 5)» A linha celular C51»1 foi usada para, produzir esta proteína» Exceptuando isto, o processo do Exemplo 3 foi seguida na generalidade» A activação e clivagem desta proteína está descrito nos Exemplos 24 e 29 abaixo»
Exemplo 14 - Construção e expressão de T14 análogo do plasminogênio T14 tem um sítio de clivagem da trombina baseado num sitio clivado pela trombina em calcitonina„ Neste mutante os aminoácidos Bli e Tir foram inseridos entre foi ainda eliminada (Figura 5).
ndo uííí 41 mero (5? CACCCCCCCACAAC< A linha celular usada sara
C i s ( 556 ) e P ro ( 539) e Gli C 36©) Estas mutações foram feitas usa CCTAGGGTATCCACATTTCTTCGGCT 3’) produzir exemplo sta proteína foi C61»1» Exceptuando foi seguido na generalidade» sto, o processo do
Exemplo i;
Construção e expressão de T17 tem um sítio de clivagem baseado num :livagem pela trombina em colecistiquininina» Esta proteína tem Ser inserida entre Pro559 e Gli 56@ e foi feita usando um 38 mero CS5 CACCCCCCCACAACCCTTCCACTAGGACATTTCTTCGG 35> (Figura 5). A linha celular C49 = 7 foi usada para produzir esta, proteína» Exceptuando isto, o processo do Exemplo 3 foi seguido na generalidade» A activação e clivagem desta proteína está
Exemplo 16 — Construção e expressão de T19
U sitio de clivagem desta, proteína baseia-se num sítio de clivagem da trombina no Factor XIII» Este mutante difere de TS por o aminoácido Pí’ ser Vai em vez de Gli» A clivagem produz plasmina. T19 de duas cadeias com uma sequência da cadeia, leve natxva» Nesta protBins Proi3o9), GlxCo&iíí, Argio&i.» foram substi.— tuidas por Vai, Blu, Leu, Gin, Gli, Vai, Vai, Pro, ftrç usando um 61 mero C5? CACACCCCCCCACAACCCTTSSGACTACTCCCTGCAATTCTACACATTTCTTCGGCTCCAC 3’í (Fiqura 5)» A linha, celular C53.5, foi usada para produzir a proteína» Exceptuando isto, o processo do exemplo 3
fax seguida na generalidade» A análise de activação e t desta proteína está apresentada nos Exemplos 26 e 29 abai>
aySm
Exemplo 17 — Construção e expressão de Τ2Θ
J □ sítio de clivagem desta proteína é semelhante a T19 mas a sequência uet mmal amma oa caoeia leve da plasmina gerada por clivagem tem Vai(562)» Vai(563) eliminadas» Nesta proteína Ff ufuj7?, c? 1 .i.(, argCbol /, Vax (562) e vai xooo) foram substituídas por Vai, Glu, Leu, Bln, Bli, Vai, Pro, arg usando um 58 mero (55 GGCCACACACCCCCCCCTTGGGACTACTCCCTGCAATTCTACACATTTCTTCGBCTCC 3?) (Figura 5)= a linha celular C54»2 foi usada para produzir proteína» hxceptuando isto, o processo do Exemplo seguido na general idade» foi
Exemplo 18 — Construção e expressão de T21 em de Tò por o aminoáoido Pi? ser vez de Bli» A clívagem produz plasmina T21 de duas cadeias
Este mutante difere )NA codificador dí uma sequência da cabeia leve nativa» □ cDNA codificador de* sroteína foi feito usando o molde de cDNA T6, descrito no Exem? Lt? e o 23 mero Co5L-ACL-CCL-CcACTACCCTAGGCAC 3S)(Figura 5)» A lir
P10 e o 23 mero (55CACCCCCC
TOi usada para produzir esta proteína,
Ííceptuar isto, o processo do Exemplo -5 foi seguido na generalidade»
Exemplo 19 - Construção e expressão de T22
Este mutante difere de T7 por c aminoácido Pl’ ser Vai em vez de 61 i. A clivagem produz plasmina T22 de duas cadeias com uma sequência de cadeia leve nativa (Figura 5). 0 cDNA codificador desta proteína foi descrito no Exemplo 11 linha celular C56.ll foi usada para Exceptuando isto, o processo do Exemplo lidade.
eito num fundo de cDNA de T7. como usando o 23mero descrito para T21. A produzir esta proteína. 3 foi seguido na gene-ra—
Exemplo 20 - Activação de Xí e X;
A activação das proteínas Xl e X2 para plasmina pelo Factor Xa. foi testada usando um ensaio da lise de fibrina. ft geração de plasmina foi dstectada pslo aparecimento de uma zona de limpidez desenvolvida num gel de fihrina-agarose como descrito no Método 12.1 (ver secção de Métodos abaixo). Lotes de 25 μΐ de mutante do plasmínogénio purificado (635 pq/ml) foram incubados CQtí! .cí., o -+ r tóu ur xa yur if zcado κ -ί·:, μο -1 a. - ν..-. A geraçao de plasmina foi testada adicionando amostras de 1©μ1 da incubação a cavidades num gel ds agar com fibrina. As amostras de plasmínogénio mutante incubadas com o Factor Xa deram uma zona límpida no gel gue não estava presente nas amostras testemunha que não foram incubadas com o Factor Xa. A activação de X2 para plasmina pelo factor Xa está apresentado na Figura 6«
Exemplo 21 - Activação de X3»
A proteína X3 purificada foi testada quanto activação usando eissaio crQíDOyêniCtí κ ver Mecodo ιζ.ύ) ensaio estão apresentados na Figura 7 em que o aumento na abs-or— vãncia a 4Θ5 nm com o tempo demonstra, que a actividade da plasmina é gerada quando da incubação de X3 com o Factor Xa. Da modo semelhante, X5 e Xó foram activados quando da incubação com o Factor Xa,
Os resutados deste
Exemplo 22 - Activação de Tí ε T2 μΐ dw
Tonam
As proteínas mutantes purificadas TI e T2 foram testa das quanto à activação como descrito no exemplo 2© excepto a proteínas mutantes terem sido pré-incuhadas com trombina Cmutant 2551 do plasminogénioC12@ pg/ml) foi incubado com 2,5 trombina unidades) e as cavidades no gel de fibrina pré—tratadas com hirudina para inibir qualquer efeito activador ds trombina que foi usada para fazer o gel= Ambos os mutantes foram activados pela trombina uma vez que as amostras incubadas com trombina produziram uma zona de limpidez no gel. As zonas de limpidez ído Toram produzidas pelas amostras bsscemunna que nao foram incubadas- com trombina» Os resultados para T2 estão apresentados na Figura ó.
Exemplo 25 — Activação de T6, T/ e TS
As proteinas mutantes foram testadas quanto á -activação usando o gnsaio cromogénico íver Método 12=3). fcsts ensaio demonstrou que Tó, T7 e TB não são activados- pela trombina Cse bem que eles eles sejam clivados - ver Exemplo 29).
Exemplo 24 - Activação de T13
A protema i 13 uun ΐ içada fui testada usando o en~-aio cromogénico como descrito no Exemplo 23. Os resultados deste ensaio estão apresentados na Figura 7 em que o aumento na absorvãncia a 4®5 nm com o tempo demonstra que TÍ3 é- activada pela trombina. A activação foi também detectada usando o ensaio cromogénico directo como descrito no Exemplo 26.
Exemplo 25 — Activação de TÍ7
A proteína T17 purificada foi cromogénico como descrito no exemplo 25 que a trombina activa T17.
testada usando Este ensaio o ensaio demonstra
Exemplo 26 - Activação de T19
A proteína Ti9 foi testada usando o ensaio cromogénico como descrito no Exemplo 23= Os resultados deste ensaio estão
apresentados na Figura / em que com o tempo demonstra que T19 ê u anulei í to na ab—-orvanc activado pela tromfains ia a 4Θ5 nm η ρ r o te χ n a mu tan f-.~ ensaio cromogênico que permi pela activação íver Método estão apresentados na Figura tempo demonstra que T19 é ac ! 19 foi Laiubêi» analisada usando um te a quantificação de plasmina gerada
12»2)» Os resultados deste ensaio 8 em que a geração de plasmina com o tivado pela trombina»
Exemplo 27 - Clivagem de Mutantes X
Amostras ds 25 μα de mutantes do plasminogénio X foram incubadas com 1,5 8g de Factor Xa em 0,25 ml de tampão e -análise de clivagem foi realizada como descrito no Método li» A Figura 9 mostra que -a banda do plasminogénio X2 com aproximadamente 92 KDa foi clivada para formar uma banda ds plasmina de cadeia pesada com aproximadamente óóKDa. Isto indica que -a seeuência de amino— ácidos mutante que introduzimos foi clivada pelo Factor Xa e que a activação demonstrada para X2 no exemplo 20 ê um resultado da clivagem do análogo do plasminogénio para produzir plasmina» xemplo 28 — Clivagem de i1 e T2
A análise de clivagem para as proteínas Ti s T2 foi efectuada como descrito no exemplo 2’ trombina (1,5 pg) em vez do factor Xa plasmina pela trombina está apresentado na Figura 9 confirmando assim que a activação demonstrada no exemplo 24 é um resultado da clivagem da trombina» excepto ter sdo usada Ai clivagem de T2 para
Exemplo 29 - Clivagem de 5ά, T7, TS, T13, T17 e T19
12,5 pg do plasminogénio mutante foram tíe trombina como descrito no Método 11» 0 utantes do plasminogénio foi determinado
Amostras de incubadas com 2,8 pg curso da clivagem dos por varrimento quantitativo do gel e os tempos de 50% de clivagem de T&, T7, T8, t!3 e T19 foram de minutos respectivamente enquanto o tempo de lo, 70 e menos ds 10 clivagem para TI7 foi de aproximadamente 30 horas» Os resultados do varrimento do oeJ para a clivagem de T19 ídesaparecimento da banda do plasminogénio) estão apresentados na Figura 10»
Exemplo 30 - Construção de Lis-3
Um cDNA codificador de um lis-plasminogénio em que a sequência sinal nativa do plasminogénio fica adjacente ao resíduo Glu<7ó) foi feito por deleção dos 75 aminoácidos da terminação amina do glu-pl-asminogénio por mutagénese de remoção de uma ansa usando um 35 mero <5’CTBA8AGATACACTTTCTTTTCTCCTTSACCTBftT35)» Exceptuando isto, o processo do Exemplo 3 foi seguido na generalidade.
Exemplo 31 — Construção de Lis—4
Neste lis-plasminogénio, 77 aminoácidos entre B11CÍ9) da sequência sinal e Lis<78) do glu-plasminogénio foram dos pela mutagénese de remoção de uma ansa usando um 29 mero
Í5’CTGAGAGATACACTTTTCCTTGACCTGAT3?í. Exceptuando isto, o proe do Exemplo 3 foi seguido na generalidade»
Exemplo 32 — Construção de Lis-5
Neste lis-plasminogénio, 76 aminoácidos entre da sequência sinal e Lis(77) do glu-pl-asminogénio foram dos pela routaqénese de remoção de uma ans-a usando um í5?CTGAGAGATACACTTTCTTTCCTTGACCTGAT3Si. Exceptuando processo do Exemplo 3 foi seguido na generalidade»
BlíC17) eliffiina32 mero isto, o
MÉTODOS
i) Digestão com nuclease de “nsing bean”
1.0 Unidades de nuclease rnunq bean foram adicionadas a aproximadamente i pg qe
DMA enzima ds NaC 1, .z mM estrição num tampão Zn Li, iyλ glicerol» da ’-'C durante minutos.
67°C antes de ser extraído com que tinha sido digerido com uma contendo 30 mM NaGAc pH5,0, 100 mM A nuclease ,smung bean foi incuba-inactivado durante 15 minutos a fenol e precipitado com etanol»
2) Síntese de oligonucleótidos
Os ol fosforamidetos
A metodologia é S»L» e Caruther igonucleótidos foram sintetizados automatizada usando fosforamidetos agora largamente usada e foi » M.H. Tetrahedron Letters 2 puF de química de cianoetilo» descrita iFíeaucage, 4, 245 (1981).
3) Purificação de oiigonucleótidos
Ds oiigonucleótidos foram desprotegidos e removidos do suporte CPG por incubação em NH». concentrado. Tipicamente, 5® mg de CPG tendo 1 micromole de oligon.ucleótido foi desprotegido por incubação durante 5 hora* OC e«i &®0 u i
MH concentrado, sobrenadante foi transferido para ura tubo fresco e o oliqóraero precipitado com -5 volumes de mento foi seco e ressuspsnso ?tanol, Após centrifugação o sedi em i ml deágua» A concentração do oligómero bruto foi então determinada medindo a absorvSncia a 260 Γiffí.
Para a purificação em gel i® unidades de absorvSncia dos oiigonucleótidos brutos foram secas e ressuspensas em 15μ1 de corante marcador <9®% formamida desionizada, 1® mM Tris, 10 mM borato, 1 mH EDTA, ®,1% azul de bromofenol). As amostras foram aquecidas a 9®°C durante i minuto e depois aplicadas num qel desnaturante de poiiacrilaraida cora 1,2 mm ds espessura tendo cavidades de 1,6 mm de diâmetro. D gel foi preparado a partir de uma solução stock de 15% de p-oliacrilamida, ©,ó% de bisacrilamida e 7M ureia em 1 κ TBE e foi polimerizado com ©,1% de persulfato ds amónio e ®,©25% de TEMED. 0 gel foi préviaments corrido durante 1 hora. As amostras foram corridas a 1500 V durante 4-5 horas. As bandas foram visualizadas por cora iluminação UV e ascorrespondentes ao produto de tamanho completo foram cortadas e transferidas para microtubos de ensao. Qs oligómeros foram eluidos da fatia de gelpor incubação em AGEe íacetato de amónio 0,5 M, acetato de magnésio ®,®1M e Θ,ί% SDS) durante a noite. 0 tampão AGEB foi então transferido- para tubos novos e o precipitado cora três volumes de etanol a 70° durante 15 precipitado foi colhido por centrifugação numa centrífuga
Eppendorfdurante 10 minutos, o sedimenta lavado em etanol a 80%, o oliqómero purificado foi seco-, redíssolvido em 1 ml de áqua e oligómero minutos.
um microfiltro de ô,45 microns. CA ca registada») A concentração do por determinação da sua absorvância
finalmente filtrada através ds palavra EPPENDORF é uma mar produto purificado foi medida a 26© nm»
4) hosforilação ds oligómeros
1Θ0 pmoles de oligómero 2© μί de tampão cinase (7© mM Tris espermidina ©,2 mM, ditiotreitol © polinucleótido-cinase e a mistura minutos» A cinase foi então inac durante i© minutos» foram secas e ressuspensas em pH7,6, í© mM MgCl~_ 4 ΛΤΪ3, = 5 mM)» Adicionou—se 1© μί de incubada a 37°C durante 3© tivada por aquecimento a 7©°C
5) Sequenciação didesoxi protoi-ulo usado CBiggin, M.D., Qibson, T»J (1983)« Sempre que adequado a sequenciação do DMA ds pl Nu R Mucleic Acids Research foi essencialmente como já descrito , Hong, G»F= P.N.A.S. 8© 3963-3965 o método foi modificado para permitir smideo como foi descrita (Suo, L-H», 11 5521-554© (1983).
6) Transformação
A transformação foi conseguida usando processos convencionais» A estirpe usada como recipiente na clonagem usando vectores plasmídeos foi HW87, a qual tem o seguinte genótipo;
araDi39(ara-leu)del7697 (IacIPQZ¥5dell74 galU g-alK hsdR rpsL srl recA56
RZÍ032 é um derivado ds
-jl i víus nao possi nuas enzimas do metabolismo do dNAs (a.) dLíTPase Cdut) que resulta numa, alta concentração de dUTP intracelular e (b) uracilo-IM-qlicosilass íung) que é responsável pela remoção uracilos ini_orpursous no ílMA CKunksl mcorrec tamen re En zymol., 154,
Methods in
3ó /—382 (1 987) )
A sua principal vantagem é que estas mutações levam a uma frequência mais alta ds mutantes no sítio da mutagénese dirigida. RZ 1*332 tem o seguinte genótipos
HfrKLlóP0/45ElisA96í-ó2), dutl, ungi, thil, reCAl,
Zbd-279;s Τη10, supE44
JM103 é mani pu1açSes envo1vendo vectores- baseados convencional para em MÍ3.
7) Mutagénese dirigida iniciador de mutagénese fosforilado (2,5 pmolel foi emparelhado com o DNA molde de cadeia simples, o qual foi preparado usando RZ1032 como hospedeiro, íípg) numa mistura, de reacção final de 10 μϊ contendo 70 mM Tris, 10 mM ngCl„» A mistura de reacção num -microtubo ds ensaio sm poliprapile.no ÍEPPENDORF) foi colocada num copo contendo 250 ml de àgua a 70°C durante 3 minutos seguido de 30 minutos a 37*C. A mistura emparelhada foi então colocada em gelo e adicionados- os reagentes- que se seguem:
μϊ de 10 x (700 mM Tris, Í00 isiM MyCl^ ρΗ/,ώ), ί μϊ de un-a mistura dos quatro trifosfatos de desoxirribonucleótidos 5 mM cada, 2 μϊ de DMA—ligase de T4 (100u), 0,5 μϊ do fragmento Klenow da DMA-polimerase e 4,5 μϊ ds ãgua. A mistura de reacção zasa polimerase foi então incubada a Í5°C durante 4—16= horas. Após completada a reacção, adicionou-se 15© μι de iE (10 mM íris, 1 mM EDTA pHS,0> e a mistura de mutagénese guardada a -20°C.
Para cs isolamento de cionss mutantes a mistura foi então usada para transformar a estirpe recipiente JM1D3 como se segue. Uma cultura de 5 ml que cresceu durante a noite de JM103 em 2 x YT <1,6% Bactotriptona, 1% Extracto de triptona, í% NaCl) foi diluida 1 para í©© em 5© ml tíe 2 x YT pré-aquecido. A cultura foi cultivada a 37-‘C com arejamento até- a atingir 0,4« As células foram sedimentadas e ressuspensas em 0,5 ml de 5© mM CaCl^ e mantido em qelo durante 15 minutos. As células foram então re-sedimentadas a 4QC e ressuspensas em 2,5 ml de 50 mM CaCl^ frio» Para a transfecção amostras de 0,25, 1, 2, 5, 2© e 5© μΐ da mistura ds mutagénese foram adicionados a 2©© μΐ de células competentes que foram mantidas sm gelo durante 30 minutos» As células foram então submetidas a choque térmico a 42*C durante 2 mins. A cada tubo foi então adicionado 3,5 ml de agar mole YT contendo 0,2 ml de uma cultura de JM103. os conteúdos foram então misturados rápidamente e depois vertidos na superfície de uma placa pré—aquecida contendo 2 x YT solidificado com 1,5% de agar. A camada de agar mole foi deixada em repouso e as placas sm seguida incubadas a 37,:’C durante a noite.
DNA de cadeia simples foi então preparado a partir de cones isolados como se segues Placas isoladas foram repicadas para 4 ml de 2 x YT que foi semeadocom 1© gl de uma cultura fresca cultivada durante a noite de- JM103 em 2 x YT. A cultura foi agitada vigorosamente durante 6 horas. ©,5 ml da cultura foram então removidos e adicionados a ®,5 mi de 5©°-í glicerol para se obter um stock de referência, que foi guardado a -20°C. A restante cultura foi centrifugada para remover as células e í ml de sobrenadante portador das partículas fágicas foi transferido para um tubo EPPENDORF novo» Adicionou-se então 250 μΐ de 20%
ΡΕ66000, 250 mM NaCl, misturou—ss e os tubos foram incubados sm gslo durante 15 minutos. Os fagos foram então sedimentados a 10000 rpm durante 1® minutos, o sobrenadante rejeitado e os tubos novamente centrifugados para colher os últimos vestígios da solução de PEG que poderá ser então removido e rejeitado, u sedimento de fagos foi muito bem ressuspenso em 200 ul de TEN C10 mH íris, í !Ts!'l Euíh, 0,o M NaO&c). 0 dNh toi. isolado por extracção com um volume igual de fenol saturado com Tris» As fases foram separaaas através de uma centrifugação rãpida e aquosa transferida para um tubo limpo» 0 DNA foi novamente extraído com uma mistura de 100 μΐ ds fenol, 100 μϊ ds clorofórmio s as fases novamente separadas oor centrifugação» Ds vestígios de fenol foram removidos pos extracçSes subsequentes com clorofórmic e ο DNA finalmente isolado por precipitaço com 2,5 volumes de etanoi a 20’*’L· ourai a nuiLe» 0 uNh όι sedituSt 1 tauu a 10 rpm durante 10 minutos, lavado sm etanol a ressuspenso em M ul de TE» isSCu e i mamente
8) Electroporação
Células de ovário de hamster chinês (CHO) ou a linha celular de mieloma de murganho p3xó3—AgS.653 foram cultivadas e colhioas a meio oa Tase ds crescimento logarítmica» As células foram lavadas e ressuspensas em PBS s feita uma contagem de células viáveis» As céluls foram então sedimentadas e ressuspensas a 1 x 10z células/ml, 40 pg ds DNA linearizado foram adicionados a 1 ml de células e deixado em gelo durante 15 minutos. As células foram sujeitas a um pulso de 800 V/25 pF usando um sistema ds electroporação que oode ser adquirido comercialmente
CBIORAD SENE PUL8ER - marca registada). As cèlub das em gelo durante mais 1i= incubais minutos e ospois sassaaas em piacas
de 10 χ 96 cavidades com '299 μΐ de meio condicionado por cavidade (DMEM, 5% FCS, Pen/Strsp, glutamina) ou em placas de 10 x 15 cm com 15 mis de meio em cada placa e incubado durante a noite. Após 24 horas o meio foi removido e substituído com meios selectivos contendo xantina (250 pg/ml), ãcido micofsnólico CSpg/ml) ε ί x hipoxantina—timidina CHT). As células foram alimentadas ds em três dias.
:res
Hpas i_fcfrc;s ΰ= 14 di-ss Lolòuias resistentes gpt evidentes nalgumas cavidades e nas
As placas foram despistadas relauivaesnte amostra ds meio de cada usando um ensaio ELISA, t foraai ampliados e o nível c selecção pp melhor produtor ρ 1 asiHinut-i en i u
L-Hi-S d5.í de uma *éSVÍd-SdS?S OU. D1*3.0 H SCSki-LõxOCI :lonss produtores de expressão controlado para permitir a
9) ELISA para plasminogénio humano
Placas de ELISA (Fro-BintíFalcon) foram revestidas com 50 μΐ/cavidade de soro de cabra anti-plasminogénio humano (Sigma) c 3 ·
4-.oiiuioo a íuwbs om rampao (Í0.H-.U), 2,93 g MaHcO-? por durante a noite a 4°C» A solução de revestimento toi enteie removida e as placas foram bloqueadas por incubação com 50 gl/cavidade ds PBS/©,1% caseína á temperatura ambiente durante 15 minutos, fts placas foram então lavadas 3 vezes- com PBS/0,051Í Tween 20. Amostras do plasminogénio ou de padrões diluídos em PBS/Tween foram adicionadas à placa e incubadas à temperatura ambiente durante 2 horas. As pxacas foram então lavadas o vezes com PBS/Tween e depois adicionados 50 y.l/cavidade de uma diluição 1 s IO©© era PBSZTween d-e um anticorpo monoclonal anti-plasminoqénio
é incubadas á
Foram novamente lavadas 3 vezes com PBS/Tween e depois adicionado 50 μΐ/cavidade de anticorpos de cabra an.ti-IgG de murganho (Sigma) conjugado com peroxidase de rábano (Sigmale incubadas á temperatura durante í hora» As placas foram lavadas humano í American
Diagnostica >
temperatura ambiente durants
SMsw York, UisA hora o Mc placas o ve ambiente om PBS/Tween e depois incubadas com 100 μΐ/cavidade de substrato da peroxidase ácido cítrico oH 6,0 (tampão acetato de sódio 0,114/ tampão contendo 100 mg/litro de 3,3’,5,5’—tetrametilbenzidinae 13 Hi-jCL-j» A reacçao toí pe.rsoa apos cerca» de o minutos pela adição 25μ1/cavidade de ácido sulfúrico 2,5M e a absorvãncia a 450 lida num leitor de placas.
mK
Í0> Purificação de variantes do plasminogénio
Qs variantes do plasminogénio foram purificados num só passo por cromatografia em 1 is-me SEPHAROSE 4B (Pharmacia)» Um-a coluna foi equilibrada com pelo menos Í0 volumes de coluna de tampão fosfato de sódio 0,0514 pH 7,5» Na coluna foi aplicado o meio condicionado numa proporção de 1 ml de resina por 0,6 mg de variante do plasminogénio conforme determinado por ELISAusando glu.-plasminogénio humano como padrão» Tipicamente 400 mi de meio condicionado contendo plasminogénio foram aplicados a uma coluna de 10 ml (HsD=4) com um fluxo linear de 56 ml/cm/h a 4°C» Após completada a aplicação, a coluna foi lavada com um mínimo de 5 volumes de coluna de tampão fosfato 0,0514 pH 7,5 contendo 0,5 M haL·-1 até proteína inespecificamente ligada cessar de ser eluida. A remoção da proteína ligada foi conseguida pela aplicação de ácido epsilon-amina-capróico em água desionizada pH 7,0» A eluição requere 2 volumes de coluna, e é realizada com um fluxo linear ds 17' ml/cm7h« Após análise por 8DS—PAGE para testar a pureza,
u Suidu eObl 1θΠ~ isOiii 5U“!_ãpráxuo iox •ubbsQUSíi teaian te PBS removido e substituído ρ-or um tampão HEPES ou acetato, por cromatografia em colunai PD1® préviamente cheias contendo SEPHADEX B—2SK íPharmacia) . CA palavra SEPHADEX é urna marca registada). Tipicamente, 2,5 ml de cada mutante do plasmínogénio numa concentração de 0,3 mg/ml foram processados de acordo com as instruções do fabricante. As fracçSes contendo plasmínogénio, como determinado por Α^„Λ foram então removidas.
11) Clivagem
Os análogos do plasmínogénio foram testados quanto â susceptibilidade à clivagem por activadores proteolíticos ussando SDS”F'ABE em condições redutoras. Volumes de incubação típicos de 0,125 ml em 100 mM Tris HCI oH 7,4 s isn
Ca consistem em sxem— analogo do plssminogenxo, nas cuncsntfs^uSa mus-traoas nu? pios s os activadores Factor Xa ou trombina nas concentrações ncubacões foram realizadas a 37°C„ As mostradas nos exemplos. Aí incubações testemunhas foram realizadas nas mesmas condições na ausência de activadores. As reacções de activação foram paradas por precipitação da proteína pela adição de ácido tricloroacético para uma concentração final ds 2’ãX e deixadas a 4°C durante >4 horas. Os precipitados foram então sedimentados, lavados com acetona e ressuspensos em tampão de amostra parai SDS—PAGE ίΟ,ΙΜ Tris pH ô,S, 10% glicerol, IX SDS, 0,5% mercaptoetanol e 0,05% de azul de hremofenol). As amostras foram analisadas em géis de gradiente de 8--25% ou em géis de 12%. Os géis resultantes foram analisados usando um SHIMADZU Sei Scanner que varre o gsl e calcula a concentração de proteína nas bandas determinando a área sob os picos. (A palavra SHIMADiU ê uma marca registada») A velocidade de clivagem do Dlasminoqénio foi assim determinada
X
medindo o desaparecimento da banda do plasminogénio mente 92 KDa e o aparecimento da banda da cadei plasmina a aproximadamente 66 KDa» aproximadapesada da
12) Activação
12.1 Ensaio da Lise de coágulos de Fibrina
No ensaio de lise da fibrina, a actividade de plasmina é detectada pelo aparecimento de uma. zona ds limpidez que se desenvolve (devido à dissolução da fibrina) num gel de fibrina-agarose, 0 gel foi feito num gel de €?,!% de agarose de baixo ponto de fusão, tamponado em Tris HC1 pH7,4, 0,15 M NaCl, '2 mM CaCl„ ayravês da. -adição de fibrinogénio sem plasminogénio dissolvido em ©„9% (p/v) NaCl, para uma concentração final de 1 mq/ml. Adicionou6 unidades de trombina para couverter fibrinogénio em fibrina e a solução foi então vertida sobre uma folha de 6EL-B0MD e deixada em repouso» (A expressão 6EL-B0ND é uma marca, registada») Antes ds usar, as- cavidades foram punciona— das no gel e os pedaços de agarose foram removidos» Amostras de 3—1© ul foram aplicadas nos poços e o pei foi incubado numa câmara húmida a 37°C durante a noite (17-2© horas) ou durante um tempo adequado para aparecer uma zona de lise» D qel foi então embebido em áuidu auecico a 7»o% durante 1 hera» cursdo em green (solução a 2%) durante 1~Í0 minutos e depois descorado com metanol a 40%, 10% de ácido acético durante pelo menos 2 horas» 0 gel foi então escorrido e colocado a 37°C durante a noite para secar» Q diâmetro das zonas os lise pode ser medido e comparado com os feitos pelos padrões e»g» plasminogénio tipo selvaqem activado com tPA ou u-r'A
12.2 Ensaio Cromogênico Directo e Tempo de Activação análogo do plasminogênio (12,5 pg) foi incubado com trombina (2,3 Gg) a 37*C em 125 μΐ ds um tampão contando 100 mM Tris MCI pH 7,4 e 1 mM CaCl„. Retiraram-se amostras em intervalos e testaram-se quanto ao teôr em plasmina num ensaio cromogênico como descrita abaixo» Quando a trombina foi usada como activador o inibidor da trombina hirudina foi adicionado num ligeiro excesso molar para parar a reacção de activação e as amostras foram guardadas a -7©^. Quando o factor Xa foi usado como amostras de activador foram imediatamente congeladas para parar a reacção de activação» A plasmina foi medida usando a clivagem do substrato cromogênico tripeptídico, S225Í ÍKabi). Pequenas quantidades da amostra (25μ1) foram misturadas com 75μ1 de tampão (50 mM Tris HC1, Ô,1M EDTA» ©,©©©57 TritonXÍ©©, pH S,©) contendo ©»6 mM S2251, em placas de 96 cavidades CCostar)» As placas foram incubadas a 37*C durante 2 horas» A) reacção foi terminada pela adição de 25 μ.1 de ácido acético ©,5M e a absorvãncia lida a 405 nm usando um leitor de placas automático íDynatech). A quantificação foi realizada por comparação com uma preparação padrão de plasmina»
12.3 Ensaio Cromogênico
Foi desenvolvida uma modificação do ensaio cromogênico para medir o decurso da activação dos plasminogénios mutantes mais directamente» Neste ensaio» o plasminogênio mutants e activador foram incubados em conjunto na presença ds 32251 e a plasmina produzida por activação cliva directamente o substrato cromogênico que conduz a um aumento da absorvSncia. a 4©5nm= O ensaio foi realizado num volume total de QS0 μΐ num tampão contendo 5© mM Tris MCI, 0,1 mM EDTA, ©,©©57 Triton Χ1Θ© e ©,17
HSA, 0 substrato cromogénico '32251 foi adicionado para urna concentração final de ©,35 mg/ml e a concentração de proteína mutante usada foi de 3 gg/ml, No caso de actívação da trombina, a trombina foi adicionada para um-a concentração final de 1 ou ®,2 pg/ml„ 0 Factor Xa foi adicionado para um-a concentração final i,5 ou ®,3 pg/ml. Retiraram-se amostras de 100 μΐ da reacção intervalos e adicionou-se a 25 μΐ de ácido acético a 4X, placas de microtitulação para parar a reacção. No final da reacção as placas foram lidas num leitor de microplacas a num comprimento de onda de 405 nm. Não foi feita qualquer tentativa para quantificar a geração de plasmina neste ensaio, de em em
REIVINDICAçSES
-3
Processo para a preparação ds s um c ο m ρ ssso ρ''~ο? m
--- - - ----c r— - _ —- . _j -----j — j _ co que é activável por uma enzima, envolvida na coagulação do sangue, para ter actividade fibrinolítica ou formação de coágulos, caracterizado por compreender o de oligopeptídeos e/ou polipeptídeos.
ara inibir
5ir a acoplamento vã. — rruuesBO ds acurdo com a reivindicação 1. carac— terizado por o composto ter substancialmente a mesosa actividade qualitativa de um precursor natural de mamífero de um agente fibrinolítico e/ou de um inibidor da mamífero.
Formação de coáqulos de òs. - Processo oe acoroo com a reivinoicaç-ão 2, caracterizado por o composto ssr um análoga da plasminogénio activável para ter actividade de plasmina.
— Processo de acordo com a reivindicação 1, 2 ou 3, caracterizado por a enzima envolvida na coagulação do sangue ssr calicreína, Factor Xlla. Xía, IXa, Vila, Xa, trombina (Factor lia) ou proteína C activada.
5ã. — Processo de acordo com a reivindicação 1, 2, ou 3, caracterizado por a enzima envolvida na coagulação do sangue ssr o Factor Xa ou trombina» ’'ruutrh5O <2fc? -S.CΟΓ*L*COSI cl VXnQXCctC?cl€3 * ? ·*caracterizado por a enzima envolvida na coagulação do sangue o Factor Xa.
, caracsitio de
7sL — Processo de acordo com a reivindicaçSt terizado por o composto compreender a sequência dí clivagens P4~P3~8Ii~Arg, eos que Ρ4 representa um resíduo hidrofóbico e P3 representa um resíduo acídico»
Sê» — Processo ds acordo com a reivindicação 7 terizado por o resíduo hidrofóbico ser isoleucins» pa.
-- Prn
Processo os acordo com a reivindicação 1, 2 ou o caracterizado por trombina» ?nzima envolvida na coagulação do sangue ser
Processo d?
reiv iηoicaç&o caracterizado por o composto compreender a sequência do sítio de; clivagem P4~P3-Pro~Arg~Pi'~P2', sm que P4 e P3 representam cada um independentemente um resíduo hidrofóbico e Pi' e P2' representam cada um independentemente um resíduo não acídico»
11:
Processo de acordo com a reivindicação .1 caracwrizsso por o composto compreenocsr a seqtienoie. do Sitio do clivagem P2-Arg-Pl', em que um dos resíduos P2 e PI' representa glicina e o outro è qualquer resíduo de aminoácido» reivindicação caracterizado por o comoposto compreender a sequência do sítio de c1ivagem 81i-Pro—Arg = tíe acordo com a reivindicação a, cu mais substituições.
caracterizado por o composto ter umê adições ou eliminações ds aminoácidos entre os resíduos Pro<555) e CisíSóói inclusive»
14ã» - Processo ds acordo com a reivindicação 3 ou. 13, caracterizado por o composto conter uma ou mais modificações (comparado com glu-plasminogénio tipo selvagem) que podem ser uma ou mais adições, eliminações ou substituições»
15ê» - Processo para a preparação de um ãcido nucleico sintético ou recombinante codificador de um composto proteico de acorda com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado por compreender o acoplamento sucessivo de nucleotídeos uns aos outros ε/ou ligação de oliqonucleotídeos e/ou polinucieotídeos»
Processo de acordo com a reivindicação lo„ cracterizado por se destinar â preparação de um vector.
Í7â» - Processo para a preparação de um vector compreendendo uma primeira sequência de ácido nucleico codificadora de uma proteína ou incluindo um sítio de clonagem, operacionalmente ligada a uma segunda sequência, de ácido nucleico contendo um promotor forte e uma sequência potsnciadora derivada de citomegalovírus humano, uma. terceira sequência de ãcido nucleico codificadora de uma sequência de políadenilação derivada do SV40 e uma quarta sequência ds ãcido nucleico codificadora de uma marca seleccionávsl expressa a partir ds um promotor do SV40 e tendo sinal de polÍadenilação adicional do SV4© na extremidade 3' da sequência da marca seleccionávsl, cracterizado por compreender o acoplamento sucessivo de nucleotídeos uns aos outros e/ou a. ligação de oligonucleotideos e/ou polinucieotídeos» ibs.
Processo de acordo com a reivindicação 17 caracterizado por» no vector, a primeira sequência de ácido nucleico codificar plasminogénio ou um análogo do plasminogénio
19é.
ni ixnha celular nospedext a, uarsu car zzano ροι· uosupreendeí’ a
Processo para a preparação ds uma célula ou linb formação de uma célula ou linha celular com um vector que se pode

Claims (2)

  1. formação de uma célula ou linha celular com um vector que se pode produzir por um pruuesso ds acur 18» do cuiH a reivindicação 16» 17 ou
    20s» - Processo ds acordo com a reivindicação 19» caracterizado por as células serem células de mamífero que crescem em cultura contínua»
    21ã» - Processo para a preparação de uma célula capaz de expressar plasminogénio ou um análogo do plasminogénio, caracterizado por compreender .a tranformação ds uma célula de de ovário de hamster Chinês com um vsctor preparado por um processo de acordo com a reivindicação 16 ou 18»
    Processo para a preparação oe uma composição •farmacêutica, caracterizado por compreender a mistur de um ou mais compostos preparados por um processo de acordo com qualquer uma das reivindicações í a 14 veterxnariamente acsitãvei s um veículo farmacêutica ou
    Záã» -- Método para o tratamento ou profilaxia de doença trombótica, carcaterizado por compreender a administração de uma quantidade eficaz não toxica de um composto preparado por processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a sendo a gama de dosagem de composto activo ds 0,01 a 10 mq um 14 5 por quilograma de peso corporal por dia.
    Lisboa, 6 de Dezembro de 19vl
    J. PEREIRA DA CRUZ
    Agente Oficial da Propriedade Industrial RUA VICTOR CORDON, 10-A 3.a 1200 LISBOA
    FOLHA 1 =(15 FOLHAS)
    Narl
    Ndel Hindlll
    FIG. 1. Construção de pGWH
    BamHI
    EcoRI
    Narl Ndel
    Sinal iPoliA BamHI
    BamHI
    FOLHA 2 (15 FOLHAS)
    FIG.
  2. 2/1.
    cDNA DO PLASMINOGÉNIO E SEQUÊNCIA-'DE AMINOÁCIDOS
    Bali
    GATGTAAGTCAACAACATCCTGGGATTGGGACCCACTTTCTGGGCACTGCTGG^CCAGTCC 10 20 30 40 50 60
    MEHKEVVLLLLLFLKSGQG CAAAATGGAACATAAGGAAGTGGTTCTTCTACTTCTTTTATTTCTGAAATCAGGTCAAGG 70 80 90 100 110 120 >Glu plg
    EPLDDYVNTQGASLFSVTKK AGAGCCTCTGGATGACTATGTGAATACCCAGGGGGCTTCACTGTTCAGTGTCACTAAGAA 130 140 150 160 170 180
    QLGAGSIEECAAKCEEDEEF GCAGCTGGGAGCAGGAAGTATAGAAGAATGTGCAGCAAAATGTGAGGAGGACGAAGAATT 190 200 210 220 230 240
    TCRAFQYHSKEQQCVIMAEN CACCTGCAGGGCATTCCAATATCACAGTAAAGAGCAACAATGTGTGATAATGGCTGAAAA 250 260 270 280 290 300
    RKSSI IIRMRDVVLFEKKVY CAGGAAGTCCTCCATAATCATTAGGATGAGAGATGTAGTTTTATTTGAAAAGAAAGTGTA 310 320 330 340 350 360
    LSECKTGNGKNYRGTMSKTK TCTCTCAGAGTGCAAGACTGGGAATGGAAAGAACTACAGAGGGACGATGTCCAAAACAAA 370 380 390 400 410 420
    NGITCQKWSSTSPHRPRFSP AAATGGCATCACCTGTCAAAAATGGAGTTCCACTTCTCCCCACAGACCTAGATTCTCACC 430 440 450 460 470 480
    ATHPSEGLEENYCR NPDNDP
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Families Citing this family (59)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CU22277A1 (es) * 1990-05-23 1995-01-31 Cigb Procedimiento para el aislamiento y expresion de un gen codificante para estreptoquinasa,secuencia nucleotidica obtenida,adn recombinantes y microorganismos transformados
GB9222758D0 (en) * 1992-10-29 1992-12-09 British Bio Technology Proteins and nucleic acids
GB9216558D0 (en) * 1992-08-04 1992-09-16 British Bio Technology Modified proteases
GB2286190B (en) * 1992-10-29 1996-05-01 British Biotech Pharm Thrombin activatable plasminogen derivatives
DE4323754C1 (de) * 1993-07-15 1994-12-01 Gruenenthal Gmbh Bifunktionelle Urokinasevarianten mit verbesserten fibrinolytischen Eigenschaften und thrombinhemmender Wirkung
CN1113389A (zh) * 1993-08-04 1995-12-13 西巴-盖尔基股份公司 高分子量的脱硫水蛭素
ES2080657B1 (es) * 1993-09-27 1996-11-01 Britisch Bio Technology Limite Proteasas modificadas.
US5837682A (en) 1996-03-08 1998-11-17 The Children's Medical Center Corporation Angiostatin fragments and method of use
US5945403A (en) 1997-05-30 1999-08-31 The Children's Medical Center Corporation Angiostatin fragments and method of use
CN1309833C (zh) * 1994-04-26 2007-04-11 儿童医学中心公司 血管生成抑制素及其在制备药物中的用途
GB9412131D0 (en) * 1994-06-17 1994-08-10 British Bio Technology Thrombolytic composition
DE4440892A1 (de) * 1994-11-17 1996-05-23 Gruenenthal Gmbh Proteine mit fibrinolytischen und gerinnungshemmenden Eigenschaften
DE4442665A1 (de) * 1994-11-30 1996-06-05 Gruenenthal Gmbh Chimäre Proteine mit fibrinolytischen und thrombinhemmenden Eigenschaften
US5854049A (en) * 1995-06-09 1998-12-29 President And Fellows Of Harvard College Plasmin-resistant streptokinase
US5736364A (en) * 1995-12-04 1998-04-07 Genentech, Inc. Factor viia inhibitors
US6461640B1 (en) 1995-12-08 2002-10-08 Board Of Regents, The University Of Texas System Local delivery of fibrinolysis enhancing agents
KR20000029755A (ko) * 1996-08-02 2000-05-25 로셰 디아그노스틱스 게엠베하 트롬빈에의해활성화될수있는플라스미노겐활성화제
EP0983303B1 (en) * 1997-05-21 2006-03-08 Biovation Limited Method for the production of non-immunogenic proteins
PT947585E (pt) 1998-03-19 2001-11-30 Instrumentation Lab Spa Metodo in vitro melhorado, kits e reagentes para a peaquisa de defeitos de coagulacao sanguinea
AU5571799A (en) 1998-08-20 2000-03-14 University Of Vermont And State Agricultural College, The Angiogenesis inhibitors and uses thereof
IN190822B (pt) * 1998-12-24 2003-08-23 Council Scient Ind Res
US6677473B1 (en) 1999-11-19 2004-01-13 Corvas International Inc Plasminogen activator inhibitor antagonists
US6423826B1 (en) 2000-06-30 2002-07-23 Regents Of The University Of Minnesota High molecular weight derivatives of vitamin K-dependent polypeptides
US20030211094A1 (en) 2001-06-26 2003-11-13 Nelsestuen Gary L. High molecular weight derivatives of vitamin k-dependent polypeptides
US7160540B2 (en) 2000-06-30 2007-01-09 Regents Of The University Of Minnesota Methods for detecting activity of clottings factors
AU8591901A (en) * 2000-09-05 2002-03-22 Karolinska Innovations Ab Materials and methods relating to endothelial cell growth inhibitors
DE10108212A1 (de) * 2001-02-20 2002-08-22 Aventis Pharma Gmbh Fusionsprotein zur Sekretion von Wertprotein in bakterielle Überstände
DE10108211A1 (de) * 2001-02-20 2002-08-22 Aventis Pharma Gmbh Verwendung von Fusionsproteinen, deren N-terminaler Anteil aus einem Hirudinderivat besteht, zur Herstellung rekombinanter Proteine über Sekretion durch Hefen
US7638618B2 (en) 2001-02-20 2009-12-29 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Nucleic acids encoding a hirudin and pro-insulin as superscretable peptides and for parallel improvement of the exported forms of one or more polypeptides of interest
DE10108100A1 (de) * 2001-02-20 2002-08-29 Aventis Pharma Gmbh Verwendung supersekretierbarer Peptide in Verfahren zu deren Herstellung und paralleler Verbesserung der Exportate eines oder mehrerer anderer Polypeptide von Interesse
US7202059B2 (en) 2001-02-20 2007-04-10 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Fusion proteins capable of being secreted into a fermentation medium
FR2831170B1 (fr) * 2001-10-19 2004-03-19 Inst Nat Sante Rech Med Proteines c modifiees activables directement par la thrombine
CN101044154A (zh) * 2002-02-14 2007-09-26 威廉·J·鲁特 治疗宿主中切割的嵌合分子
CN1480466A (zh) * 2002-09-03 2004-03-10 �й������ž�����ҽѧ��ѧԺ����ҽ 一类溶栓抗凝双功能融合蛋白及应用
US7985401B2 (en) 2003-10-31 2011-07-26 The Regents Of The University Of California Peptides whose uptake by cells is controllable
WO2011008992A2 (en) * 2009-07-15 2011-01-20 The Regents Of The University Of California Peptides whose uptake in cells is controllable
US9695251B2 (en) 2003-10-31 2017-07-04 The Regents Of The University Of California Activatable cell penetrating peptides with quenched fluorophores
EP1867660A1 (en) 2006-06-14 2007-12-19 CSL Behring GmbH Proteolytically cleavable fusion protein comprising a blood coagulation factor
US7939632B2 (en) 2006-06-14 2011-05-10 Csl Behring Gmbh Proteolytically cleavable fusion proteins with high molar specific activity
ES2889920T3 (es) 2006-06-14 2022-01-14 Csl Behring Gmbh Proteínas de fusión escindibles proteolíticamente con alta actividad específica molar
WO2008054592A2 (en) * 2006-09-29 2008-05-08 Proteomtech, Inc. Methods for production of recombinant plasminogen and plasmin polypeptides
CN1970574B (zh) * 2006-12-08 2010-08-25 中国药科大学 溶栓和抗凝双重功效融合蛋白、制备方法及其应用
JP5448839B2 (ja) 2006-12-22 2014-03-19 ツェー・エス・エル・ベーリング・ゲー・エム・ベー・ハー インビボで長い半減期を有する修飾された凝固因子
US8501449B2 (en) 2007-12-04 2013-08-06 Proteon Therapeutics, Inc. Recombinant elastase proteins and methods of manufacturing and use thereof
WO2010045518A1 (en) * 2008-10-16 2010-04-22 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions containing thrombomodulin domains and uses thereof
SG2014012918A (en) 2009-02-11 2014-04-28 Novozymes Biopharma Dk As Albumin variants and conjugates
RU2607374C2 (ru) 2009-10-30 2017-01-10 Новозаймс Байофарма Дк А/С Варианты альбумина
CA2807749C (en) * 2010-08-05 2023-02-28 Council Of Scientific & Industrial Research Protein fusion constructs possessing thrombolytic and anticoagulant properties
WO2013019681A2 (en) 2011-07-29 2013-02-07 Avelas Biosciences, Inc. Selective delivery molecules and methods of use
US9644196B2 (en) 2011-08-12 2017-05-09 Thrombogenics Nv Plasminogen and plasmin variants
US20140315817A1 (en) 2011-11-18 2014-10-23 Eleven Biotherapeutics, Inc. Variant serum albumin with improved half-life and other properties
PL2825556T3 (pl) 2012-03-16 2018-10-31 Albumedix A/S Warianty albuminy
CA2890766A1 (en) 2012-11-08 2014-05-15 Novozymes Biopharma Dk A/S Albumin variants
WO2014120837A2 (en) 2013-01-29 2014-08-07 The Regents Of The University Of California Pretargeted activatable cell penetrating peptide with intracellulary releaseable prodrug
KR102278630B1 (ko) 2013-01-30 2021-07-16 아벨라스 바이오사이언시즈 인코포레이티드 선택적 전달 분자 및 사용 방법
CN105007722A (zh) 2013-02-16 2015-10-28 诺维信生物制药丹麦公司 药代动力学动物模型
US10385380B2 (en) 2014-10-02 2019-08-20 The Regents Of The University Of California Personalized protease assay to measure protease activity in neoplasms
US10596259B2 (en) 2015-05-20 2020-03-24 The Regents Of The University Of California Tumor radiosensitization with monomethyl auristatin E (MMAE) and derivatives thereof
CA2989966C (en) 2015-08-20 2024-04-30 Albumedix A/S Albumin variants and conjugates

Family Cites Families (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US1897087A (en) * 1927-12-14 1933-02-14 Tamarin Bernard Jacques Vacuum cleaner cord control device
US3608333A (en) * 1968-06-20 1971-09-28 Bison Mfg Co Inc Vacuum cleaner and power unit
US4880776A (en) * 1983-12-24 1989-11-14 Beecham Group P.L.C. Plasmin A-chain urokinase B-chain hybrid protein
GB8334498D0 (en) * 1983-12-24 1984-02-01 Beecham Group Plc Compounds
DE3410437A1 (de) * 1984-03-22 1985-09-26 Bayer Ag, 5090 Leverkusen Verfahren zur herstellung von proteinen
GB8412517D0 (en) * 1984-05-16 1984-06-20 Nagai K Recombinant fusion proteins
US5087564A (en) * 1985-06-20 1992-02-11 Monsanto Company Release of recombinant peptides from polypeptides using V8 endopeptidase
DE3523701A1 (de) * 1985-07-03 1987-01-08 Bayer Ag Verfahren zur herstellung von proteinen und polypeptiden
DE3526995A1 (de) * 1985-07-27 1987-02-05 Hoechst Ag Fusionsproteine, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung
DE3541856A1 (de) * 1985-11-27 1987-06-04 Hoechst Ag Eukaryotische fusionsproteine, ihre herstellung und verwendung sowie mittel zur durchfuehrung des verfahrens
FI882407A (fi) * 1987-05-22 1988-11-23 Zymogenetics Inc Fibrinolytiska proteiner.
US5200340A (en) * 1987-05-22 1993-04-06 Zymogenetics, Inc. Thrombin-activated tissue plasminogen activators
JP2799316B2 (ja) * 1987-06-12 1998-09-17 ヘキスト・マリオン・ルセル株式会社 雑種ヒトプロテインｃおよびその遺伝子工学的製法
PT87869B (pt) * 1987-07-01 1995-03-01 Beecham Group Plc Processo para a preparacao de um activador de plasminogenio hibrido
GB8717430D0 (en) * 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
CA1340802C (en) * 1987-08-15 1999-10-26 Yasuyuki Takahashi Senile amyloid precursor protein and an antibody specific for the same
US5188829A (en) * 1987-08-19 1993-02-23 Sagami Chemical Research Center Rapidly acting prourokinase
CA1340740C (en) * 1987-12-08 1999-09-14 Eileen R. Mulvihill Co-expression in eukaryotic cells
CA1340877C (en) * 1987-12-28 2000-01-18 Takashi Sugiyama Elastase inhibitory polypeptide and process for production thereof by recombinant gene technology
ZA889497B (en) * 1987-12-28 1990-08-29 Lilly Co Eli Vectors and compounds for expression of zymogen forms of human protein c
DE3804600A1 (de) * 1988-02-13 1989-08-24 Basf Ag Mischung aus einer thrombolytisch wirkenden und einer antithrombotischen substanz
GB8809129D0 (en) * 1988-04-18 1988-05-18 Celltech Ltd Recombinant dna methods vectors and host cells
GB8822147D0 (en) * 1988-09-21 1988-10-26 Ciba Geigy Ag Pharmaceutically active combination
WO1990010081A1 (en) * 1989-02-17 1990-09-07 Codon Soluble analogs of thrombomodulin
JPH05500748A (ja) * 1989-05-01 1993-02-18 ザ　ユニバーシティ　オブ　ノートル　ダム　デュ　ラック 真核細胞系でのヒトプラスミノーゲンの発現方法および物質
US5164304A (en) * 1989-05-04 1992-11-17 Sri International Method and vectors for stabilizing hirudin and human laminin b1 expression
US5087572A (en) * 1989-12-01 1992-02-11 Genentech, Inc. Dna encoding human plasminogen modified at the cleavage site
EP0561034B1 (en) * 1991-08-26 1999-06-09 IMMUNO Aktiengesellschaft Direct molecular cloning of a modified chordopox virus genome

Also Published As

Publication number Publication date
DE69031127T2 (de) 1998-02-05
CA2069085C (en) 2000-02-01
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