FI105202B - Menetelmä aktivoitavien fibrinolyyttisten ja veren hyytymistä estävien plasminogeenianalogien valmistamiseksi - Google Patents

Menetelmä aktivoitavien fibrinolyyttisten ja veren hyytymistä estävien plasminogeenianalogien valmistamiseksi Download PDF

Info

Publication number
FI105202B
FI105202B FI922610A FI922610A FI105202B FI 105202 B FI105202 B FI 105202B FI 922610 A FI922610 A FI 922610A FI 922610 A FI922610 A FI 922610A FI 105202 B FI105202 B FI 105202B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
plasminogen
factor
thrombin
protein
arg
Prior art date
Application number
FI922610A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI922610A (fi
FI922610A0 (fi
Inventor
Keith Martyn Dawson
Richard Mark Edwards
Joan Mabel Forman
Original Assignee
British Biotech Pharm
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by British Biotech Pharm filed Critical British Biotech Pharm
Publication of FI922610A publication Critical patent/FI922610A/fi
Publication of FI922610A0 publication Critical patent/FI922610A0/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI105202B publication Critical patent/FI105202B/fi

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/6435—Plasmin (3.4.21.7), i.e. fibrinolysin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/315—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Streptococcus (G), e.g. Enterococci
    • C07K14/3153—Streptokinase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/81—Protease inhibitors
    • C07K14/815—Protease inhibitors from leeches, e.g. hirudin, eglin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/64—Cyclic peptides containing only normal peptide links
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C12N15/625—DNA sequences coding for fusion proteins containing a sequence coding for a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/6456—Plasminogen activators
    • C12N9/6459—Plasminogen activators t-plasminogen activator (3.4.21.68), i.e. tPA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21007—Plasmin (3.4.21.7), i.e. fibrinolysin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21069—Protein C activated (3.4.21.69)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/108—Plasmid DNA episomal vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/001—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination
    • C12N2830/002—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination inducible enhancer/promoter combination, e.g. hypoxia, iron, transcription factor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/15—Vector systems having a special element relevant for transcription chimeric enhancer/promoter combination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/32—Vector systems having a special element relevant for transcription being an silencer not forming part of the promoter region
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/55—Vector systems having a special element relevant for transcription from bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/70—Vector systems having a special element relevant for transcription from fungi
    • C12N2830/702—Vector systems having a special element relevant for transcription from fungi yeast
    • C12N2830/704—S. cerevisiae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
    • C12N2840/10—Vectors comprising a special translation-regulating system regulates levels of translation
    • C12N2840/107—Vectors comprising a special translation-regulating system regulates levels of translation inhibiting translational read-through

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

105202
Menetelmä aktivoitavien fibrinolyyttisten ja veren hyytymistä estävien plasmi-nogeenianalogien valmistamiseksi Tämä keksintö koskee valmistusmenetelmää proteiinipitoisille yhdisteille, jotka voi-5 daan aktivoida omaamaan fibrinolyyttistä aktiivisuutta tai inhiboimaan verihyyty-män muodostumista. Se koskee myös nukleiinihappoa (DNA ja RNA), joka koodit-taa kokonaan tai osaa tällaisista yhdisteistä. Edullisissa suoritusmuodoissa keksintö koskee plasminogeenianalogien valmistusta.
Plasminogeeni on avainkomponentti fibrinolyyttisessä järjestelmässä, joka on luon-10 nollinen vastine hyytymisjärjestelmälle veressä. Veren hyytymisprosessissa on osallisena kaskadi entsyymiaktiivisuuksia fibriiniverkoston muodostamisessa, joka muodostaa verihyytymän rungon eli veritulpan. Fibriiniverkoston hajoaminen (fibrino-lyysi) toteutetaan plasmiini-entsyymin vaikutuksella. Plasminogeeni on plasmiinin ' ei-aktiivinen prekursori, ja plasminogeenin konversio plasmiiniksi toteutetaan plas-15 minogeenin arginiini 561:n ja väliini 562:n välissä olevan peptidisidoksen katkaisulla. Fysiologisissa olosuhteissa tätä katkaisua katalysoi kudostyyppinen plasminogee-niaktivaattori (tPA) tai urokinaasityyppinen plasminogeeniaktivaattori (uPA).
Jos hyytymis- ja fibrinolyyttisen järjestelmän välinen tasapaino häiriintyy paikallisesti, voi sopimattomiin kohtiin muodostua verihyytymiä johtaen tiloihin, kuten se-20 pelvaltimon veritulppa ja sydäninfarkti, syvä laskimoveritulppa, halvauskohtaus, ää-reisvaltimotukkeuma ja veritulppa (embolismi). Fibrinolyyttisten aineiden annon on osoitettu olevan tällaisissa tapauksissa edullisen hoidon verihyytymän liuottamisen • · edistämisessä.
Fibrinolyyttisestä terapiasta on tullut suhteellisen laajalle levinnyt joukon plasmino-25 geeniaktivaattoreita kuten tPA:n, uPA:n, streptokinaasin ja anisoyloidun plasmino-geeni/streptokinaasi-aktivaattorikompleksin (APSAC) saatavuuden myötä. Jokaisen näistä aineista on osoitettu edistävän verihyytymän liukenemista, mutta kaikkien aktiivisuusprofiileissa on puutteita, jotka tekevät ne vähemmän kuin ihanteellisiksi terapeuttisina aineina veritulpan hoidossa (katsausartikkeli: Marder ja Sherry, New 30 England Journal of Medicine 318 (1989) 1513-1520). Yksi tärkeimmistä ongelmista tPA:lla akuutin sydäninfarktin tai muiden veritulppahäiriöiden hoidossa on, että se puhdistuu nopeasti verenkierrosta plasman puoliintumisiän ollessa ihmisessä noin 5 min (Bounameaux et ai. teoksessa: "Contemporary Issues in Haemostasis and Thrombosis" voi. 1 s. 5-91, 1985. Collen et al. toim. Churchill Livingstone). Tästä 2 105202 on tuloksena tarve antaa tPA.ta infuusiona suurina annoksina. Tämän vuoksi hoito on kallista ja viivästyy, koska potilas on otettava sairaalaan ennen kuin hoito voi alkaa. Urokinaasilla, joko yksiketjuisessa muodossa (scuPA) tai kaksiketjuisessa muodossa (tcuPA), on samanlainen nopea puhdistuma plasmassa, ja vaatii myös antoa 5 jatkuvalla infuusiolla.
Tärkeä ongelma, joka on yhteinen kaikille näille aineille on, että ne eivät ole kliinisesti käyttökelpoisilla annoksilla veritulppaspesifisiä, koska ne aktivoivat plasmino-geenin yleisverenkierrossa. Pääasiallinen seuraus tästä on, että veren hyytymiseen liittyvät proteiinit kuten fibrinogeeni tuhoutuvat, ja voi tapahtua vaarallista veren-10 vuotoa. Tätä tapahtuu myös tPAilla riippumatta siitä tosiseikasta, että se sitoutuu fysiologisilla konsentraatioilla fibriiniin ja sillä nähdään fibriiniselektiivinen plas-minogeeniaktivaatio.
Toinen tärkeä puute olemassa olevien plasminogeeniaktivaatimien suorituskyvyssä on, että trombolyyttisen aineen annon lopettamisen jälkeen tapahtuu yleisesti reper-15 fusoidun verisuonen uudelleen tukkeutumista. Tämän ajatellaan johtuvan veritulppia aiheuttavan materiaalin säilymisestä veritulpan liukenemiskohdassa.
Nyt on keksitty vaihtoehtoinen lähestymistapa fibrinolyysin lisäämiseksi perustuen molekyylien käyttöön, jotka ovat aktivoitavissa omaamaan fibrinolyyttistä aktiivisuutta tai inhiboimaan veritulpan muodostumista. Aktivaatiota (johon voi liittyä kat-20 kaisu) voidaan katalysoida yhdellä tai usealla endogeenisellä entsyymillä, jotka liittyvät veren hyytymiseen. Tämän lähestymistavan yksi etu on, että aktivoivien entsyymien veritulppaspesifisellä Iokalisoinnilla saavutetaan fibrinolyyttisen tai veri-tulpanmuodostuksen estoaktiivisuuden veritulppaselektiivisyys.
Keksinnön oleelliset tunnusmerkit on esitetty oheisissa patenttivaatimuksissa.
25 Keksinnön ensimmäisen näkökannan mukaisesti aikaansaadaan proteiinipitoinen, yhdiste, joka on aktivoitavissa veren hyytymiseen liittyvällä entsyymillä omaamaan fibrinolyyttistä aktiivisuutta tai estämään verihyytymän muodostuminen.
*
Keksinnön ensimmäisen näkökannan mukaiset proteiinipitoiset yhdisteet ovat sen vuoksi aktivoitavissa ainakin toisella kahdesta tavasta. Ensiksi, yhdiste voidaan akti-30 voida omaamaan fibrinolyyttistä aktiivisuutta. Toiseksi, yhdiste voidaan aktivoida estämään verihyytymän muodostuminen. On ajateltavissa, että yhdiste voi olla aktivoitava omaamaan molemmat funktiot. Aktivaatio saavutetaan useissa tapauksissa \ mukavimmin katkaisemalla.
3 105202
Edullisesti yhdisteellä on aktivoituna oleellisesti sama kvalitatiivinen aktiivisuus kuin luonnollisella nisäkkään fibrinolyyttisellä aineella ja/tai nisäkkään verihyyty-mänmuodostusesto. Kvantitatiivisessa mielessä, vaikka on edullista, että aktiivisuus on yhtä hyvä, tai parempi kuin luonnollisen yhdisteen, keksinnön edut voidaan yhä 5 säilyttää, vaikka aktiivisuus ei ole yhtä hyvä. Ymmärretään, että keksinnön mukaisilla edullisilla yhdisteillä voi sen vuoksi olla sama kvalitatiivinen aktiivisuus kuin luonnollisella nisäkkään fibrinolyyttisen aineen luonnollisella prekursorilla ja/tai nisäkkään verihyytymänmuodostusesto. Jälleen, kvantitatiivisessa mielessä, helppous, jolla prekursori voidaan aktivoida, on edullisesti, muttei tarvitse välttämättä olla, 10 yhtä hyvä kuin luonnollinen yhdiste.
Luonnollinen proteiinipitoinen yhdiste, joka on aktivoitavissa omaamaan fibrino-lyyttistä aktiivisuutta on plasminogeeni, joka katkeaa muodostaen plasmiinia. Plas-minogeenianalogit muodostavat keksinnön yhdisteiden edullisen ryhmän.
Villityyppiplasminogeenimolekyylin analyysi on paljastanut, että se on glykoprote-15 iini, joka koostuu seriiniproteaasialueesta, viidestä kringlealueesta ja N-terminaali-sesta 78 aminohapon sekvenssistä, joka voidaan poistaa plasmiinikatkaisulla. Katkaisuun plasmiinilla liittyy Arg(68)-Met(69)-, Lys(77)-Lys(78)- tai Lys(78)-Val(79)-sidosten hydrolyysi muodostaen plasminogeenimuotoja, joissa on N-termi-naalinen metioniini-, lysiini- tai valiinitähde, joita kaikkia merkitään yhteisesti ni-20 mellä lys-plasminogeeni. Ehjää plasminogeenia kutsutaan glu-plasminogeeniksi, koska siinä on N-terminaalinen glutamiinihappotähde. Glykosylointi tapahtuu tähteissä Asn(289) ja Thr(346), mutta laajuus ja koostumus ovat vaihtelevia, johtaen plasmassa joukkoon eri molekyylipainoisia plasminogeenimuotoja. Seriiniproteaa-" sialue voidaan tunnistaa homologiallaan muiden seriiniproteaasien kanssa ja akti- 25 vaatiossa plasmiiniksi se on fibriinin hajotukseen liittyvä katalyyttisesti aktiivinen alue. Viisi kringle-aluetta ovat homologisia kringle-alueiden kanssa, jotka ovat muissa plasmaproteiineissa kuten tPA ja protrombiini, ja ne ovat osallisina fibriinin sitoutumiseen ja siten plasminogeenin ja plasmiinin paikallistumiseen veritulppiin. Plasminogeeni on tsymogeeni, joka kiertää normaalisti veressä 1-ketjuisena poly-. 30 peptidiketjuna ja muuttuu kaksiketjuiseksi plasmiinientsyymiksi aminohappojen 561 (arg) ja 562 (vai) välisen peptidisidoksen katkaisulla. Tätä katkaisua katalysoivat erityisesti plasminogeeniaktivaattorit, kuten tPA ja uPA. Tästä esittää katsauksen Castellino, F. J., 1984, Seminars in Thrombosis and Haemostasis 10: 18-23. Tässä julkaisussa plasminogeeni numeroidaan proteiinisekvensointitutkimusten mukaan, 35 jotka on kuvannut Sottrup-Jensen et ai. (teoksessa: Atlas of Protein Sequence and Structure (Dayhoff, M. O., toimittaja) 5 suppl. 3, s. 95 (1978)), jossa ilmaistaan, että 4 105202 plasminogeeni oli 790 aminohapon proteiini, ja että katkaisukohta oli Arg(560)-Val(561)-peptidisidos. Kuitenkin sopiva plasminogeeni-cDNA, joka on käyttökelpoinen keksinnön tässä suoritusmuodossa ja jonka on eristänyt Forsgren et ai. (FEBS Letters 213 254-260 (1987)), koodittaa 791 tähteen proteiinia, jossa on yli-5 määräinen Ile asemassa 65. Tässä julkaisussa aminohappojen numerointi plasmino-geenissa vastaa käytetyn cDNA:n numerointia. Plasminogeenin rakenteessa voi olla polymorfiaa ja voi olla plasminogeenimuotoja, joissa katkaisukohdan numerointi poikkeaa, mutta on tällaiset variantit on tarkoitettu suoritusmuotoon sisältyviksi.
Tämän vuoksi käsite "plasminogeenianalogi" tarkoittaa tässä julkaisussa käytettäes-10 sä molekyyliä, joka eroaa villityyppiplasminogeenistä ja jolla on kyky katketa tai muuten vaikuttua muodostamaan molekyylin, jolla on plasmiiniaktiivisuutta.
glu-plasminogeenin plasmapuoliintumisikä on määritetty 2,2 päiväksi ja lys-plasmi-nogeenin 0,8 päiväksi (Claeys, H. ja Vermylen, J. 1974. Biochim. Biophys. Acta 342: 351-359; Wallen, P. ja Wiman, B. teoksessa: "Proteases and Biological Cont-15 rol", 291-303. Reich, E. et ai. toimittajat, Cold Spring Harbor Laboratory).
Keksinnön tämän suoritusmuodon alan plasminogeenianalogit säilyttävät villityyp-piplasminogeenin fibriininsitomisaktiivisuuden riittävässä asteessa, mutta niillä on muuttuneet aktivaatio-ominaispiirteet; edullisilla plasminogeenianalogeilla on plas-mapuoliintumisaika, joka on vähintään villityyppiplasminogeenin plasmapuoliintu-20 misaika, mutta tämä ominaisuus ei ole välttämätön.
Veren koaguloitumismekanismi käsittää sarjan entsyymireaktioita, jotka kulminoituvat liukenemattoman fibriinin muodostumiseen, joka muodostaa verihyytymien verkkomaisen proteiinirungon. Trombiini on entsyymi, joka on vastuussa liukoisen fibrinogeenin muuttumisesta fibriiniksi. Protrombiinin, trombiinin inaktiivisen pre-25 kursorin muutosta trombiiniksi katalysoi aktivoitu tekijä X (tekijä Xa). (Trombiini tunnetaan myös tekijänä Ila, ja protrombiini tekijänä II.)
Tekijä Xa muodostuu tekijä X:stä ulkopuolisesti tai sisäpuolisesti. Ulkopuolisessa reitissä tekijä VII aktivoituu tekijäksi Vila, joka muodostaa tekijän Xa tekijästä X. Sisäpuolisessa reitissä tekijän X aktivaatiota tekijäksi Xa katalysoi tekijä IXa. Tekijä 30 IXa muodostuu tekijästä IX tekijän Xla vaikutuksella, joka puolestaan muodostuu tekijän Xlla vaikutuksella tekijään XI. Tekijä Xlla muodostuu tekijästä XII kallikre-iinin vaikutuksella. Tekijöiden Villa ja Va ajatellaan toimivan kofaktoreina tekijöiden X ja Π aktivaatiossa, vastaavasti.
* 5 . 105202
Fibriini on ensin fibrinogeenista muodostuttuaan löyhässä muodossa. Löyhä fibriini muuttuu tiiviiksi fibriiniksi tekijän Xllla vaikutuksesta, joka verkkouttaa fibriinimo-lekyylejä.
Aktivoitu proteiini C on hyytymistä estävä seriiniproteaasi, joka muodostuu verihyy-5 tymänmuodostumisalueella trombiinin vaikutuksesta yhdistelmänä trombomodulii-nin kanssa proteiiniin C. Aktivoitu proteiini C säätelee verihyytymän muodostumista katkaisemalla ja inaktivoimalla pro-koagulanttikofaktorit Vaja Villa.
Käsitteeseen "veren hyytymiseen liittyvä entsyymi" luetaan tässä julkaisussa käytettäessä mukaan kallikreiinitekijät XHa, XIa, IXa, Vila, Xa ja trombiini (tekijä Ila), 10 jotka ovat suoraan osallisina fibriinin ja aktivoitiin proteiini C:n muodostumiseen, joka proteiini C on osallisena veren hyytymisen kontrollissa. Edullisimpia entsyymejä ovat tekijä Xa ja trombiini, koska ne ovat välittömimmin osallisina fibriinin muodostumisen kanssa.
Ainakin tekijän Xa ja trombiinin muodostuminen ja aktiivisuus ovat tarkasti säädel-15 tyjä varmistamaan, että veritulpan muodostuminen rajoittuu trombogeenisen ärsykkeen kohtaan. Tämä paikallistaminen saavutetaan ainakin kahden kontrollimekanismin yhdistetyllä toiminnalla: veren hyytymisentsyymit toimivat komplekseina, jotka ovat assosioituneet läheisesti verihiutaleiden ja endoteelisolujen fosfolipidisolu-membraaneihin veri suoni vaurion kohdassa (Mann, K. G., 1984, teoksessa: 20 "Progress in Hemostasis and Thrombosis", 1-24, toimittajat Spaet, T. H. Grune and Stratton); ja veritulppakohdasta verenkiertoon vapautunut vapaa trombiini tai tekijä Xa inaktivoituu nopeasti proteinaasi-inhibiittorien, kuten antitrombiini ΠΙ:η, vaiku-.. · tuksesta.
Siten viimeistä edellisen (tekijä Xa) ja viimeisen (trombiini) entsyymin aktiivisuus 25 hyytymiskaskadissa ovat erityisen hyvin lokalisoituneet veritulpan muodostumis-kohtaan ja ovat tästä syystä edullisia.
Trombiinin on keksitty pysyvän assosioituneena veritulppien kanssa ja sitoutuvan ei-kovalenttisesti fibriiniin. Sulatettaessa veritulppia plasmiinilla vapautuu aktiivista trombiinia, ja sen ajatellaan myötävaikuttavan veritulppien uudelleenmuodostumi-30 seen ja verisuonien uudelleentukkeutumiseen, joka tavallisesti tapahtuu trombolyyt-tisen plasminogeeniaktivaattoreilla käsittelyn jälkeen (Bloom A. L., 1962, Br. J. Haematol. 82, 129; Francis et ai., 1983, J. Lab. Clin. Med. 102, 220; Mirshahi et ai., 1989, Blood 74, 1025).
6 105202 Näistä syistä keksinnön määrätyissä suoritusmuodoissa on edullista modifioida plas-minogeeniä tai muuta mahdollisesti aktivoitavaa proteiinipitoista yhdistettä sen tekemiseksi trombiinilla tai tekijällä Xa aktivoitavaksi luoden siten edullisen luokan veritulppaselektiivisiä, fibrinolyyttisiä tai verihyytymän muodostumista estäviä pro-5 teiineja. Edullisimmat plasminogeenianalogit säilyttävät emäplasminogeenimole-kyylin edullisen ominaisuuden, pitkän plasmapuoliintumisiän, ja niillä on veritulp-paselektiivisyyttä yhdistämällä kaksi mekanismia, ts. fibriininsitomisen kringle-alu-eiden kautta ja uuden ominaisuuden muuttuen plasmiiniksi uuden veritulpan muo-dostuskohdassa yhden entsyymeistä vuorovaikutuksella, joka on osallisena veritul-10 pan muodostukseen ja edullisesti paikallistuen siellä.
Tekijä Xa (E.C.3.4.21.6) on seriiniproteaasi, joka muuttaa ihmisen protrombiinia trombiiniksi katkaisemalla spesifisesti Arg(273)-Thr(274)- ja Arg(322)-Ile(323)-peptidisidokset (Mann et ai. 1981, Methods in Enzymology 80 286-302). Ihmisen protrombiinissa Arg(273)-Thr(274)-kohtaa edeltää tripeptidi Ile-Glu-Gly ja 15 Arg(322)-Ile(323)-kohtaa edeltää tripeptidi Ile-Asp-Gly. Rakenne, joka vaaditaan tekijällä Xa tunnistamiseen, vaikuttaa määräytyvän paikallisella aminohapposekvenssillä, joka edeltää katkaisukohtaa (Magnusson et ai., 1975, teoksessa: "Proteases and Biological Control", 123-149, toimittajat, Reich et ai. Cold Spring Harbor Laboratory, New York). Spesifisyys sekvenssille Ile-Glu-Gly-Arg- ja Ile-20 Asp-Gly-Arg- ei ole absoluuttinen, koska tekijän Xa on keksitty katkaisevan muita proteiineja, esimerkiksi tekijää VIII asemissa 336, 372, 1689 ja 1721, jossa edeltävä aminohapposekvenssi poikkeaa merkittävästi tästä muodosta (Eaton et ai, Biochemistry 25 (1986) 505-512). Koska tekijän Xa pääasiallinen luonnollinen substraatti on protrombiini, edulliset tunnistussekvenssit ovat sellaiset, joissa arginiini ja gly-25 siini ovat Pl-ja P2-asemissa, vastaavasti, hapan tähde (asparagiini-tai glutamiini-happo) on P3-asemassa ja isoleusiini tai muu pieni hydrofobinen tähde (kuten ala-niini, väliini, leusiini tai metioniini) on P4-asemassa. Koska tekijä Xa voi kuitenkin katkaista sekvenssejä, jotka poikkeavat tästä muodosta, voidaan keksinnön mukaisesti käyttää muita sekvenssejä, jotka ovat katkaistavissa tekijällä Xa, samoin kuin 30 muita sekvenssejä, jotka ovat katkaistavissa muilla verenhyytymiskaskadin entsyymeillä.
Plasminogeenin muutokseen plasmiiniksi tPAilla ja uPA:lla liittyy peptidisidoksen katkeaminen arginiini 56 linja väliini 562:n välissä tuottaen disulfidiliitetyn kaksi-ketjuisen proteiinin, jossa on aminoterminaalinen väliini keveässä (proteaasialue) 35 ketjussa ja karboksiterminaalinen arginiini raskaassa ketjussa. Plasminogeeni ei katkea ja aktivoidu merkittävässä laajuudessa trombiinilla tai tekijä Xa:lla, ja plasmi- 7 105202 nogeenianalogien, jotka voidaan katkaista näillä edullisilla entsyymeillä, tekemiseksi katkaisukohtaa Pro(559), Gly(560), Arg(561), Val(562), jonka tPA ja uPA tunnistavat, on muutettava. Plasminogeenianalogien tekemiseksi, jotka katkeavat esimerkiksi tekijällä Xa, voidaan plasminogeenimolekyyliin substituoida aminohapposek-5 venssi, joka voidaan katkaista tekijällä Xa. Sekvenssi Ile-Glu-Gly-Arg, joka on prot-rombiinissa yhdessä kohdista, jotka voidaan katkaista tekijällä Xa, voi olla tällainen sekvenssi. Muita mahdollisuuksia olisivat sekvenssit tai sekvenssien jäljittelijät, jotka tekijä Xa katkaisee muissa proteiineissa tai peptideissä. Plasminogeenianalogissa, jossa Pro(558) on poistettuja korvattu Ile-Glu:lla, voi olla Arg(561)-Val(562)- (vil-10 lityyppiplasminogeenin numerointi) peptidisidos, jonka tekijä Xa katkaisee tuottaen disulfidiliitetyn, kaksiketjuisen plasmiinianalogin, aminoterminaalisella valimilla keveässä ketjussa (proteaasialue) ja karboksiterminaalisella arginiinilla raskaassa ketjussa. DNA, joka koodittaa Ile-Glu-Gly-Arg-sekvenssiä karboksiterminaalisena osana katkaistavaa linkkeriä proteiinintuotantoapuna, kuvataan GB-patenttihake-15 muksessa A-2160206, mutta tuossa julkaisussa ei ole kuvattu Ile-Glu-Gly-Arg-sek-venssin käyttöä muutetun aktivaatioprosessin sallimiseksi tsymogeenille.
Plasminogeenivarianttien tai muiden mahdollisesti aktivoitavien proteiinipitoisten yhdisteiden katkaisua ja aktivaatiota verenhyytymiskaskadin entsyymillä, kuten trombiinilla tai tekijällä Xa voidaan mitata lukuisilla tavoilla, esimerkiksi SDS-20 PAGE-analyysillä, ja plasminogeenivarianttien tapauksessa määrittämällä plasmii-nin muodostus käyttämällä S2251 kromogeenistä määritystä tai fibriinigeelilyysi-analyysillä.
Trombiini (E.C. 3.4.21.5) on seriiniproteaasi, joka katalysoi joukon proteiineja pro-teolyysiä, mukaan lukien fibrinogeenin (Aa-ja Ββ-ketjut), tekijä XIII:n, tekijä V:n, 25 tekijä VTI:n, tekijä VIII:n, proteiini C:n ja antitrombiini III:n. Rakenne, joka vaaditaan trombiinilla tunnistamiseen, vaikuttaa määrätyvän osaksi paikallisella aminohapposekvenssillä katkaisukohdan ympärillä, mutta se määräytyy myös vaihtelevas-sa määrin sekvensseillä, jo(t)ka on/ovat etäällä katkaisukohdasta. Esimerkiksi fib-rinogeeni Αα-ketjussa tähteet P2 (Vai), P9 (Phe) ja P10 (Asp) ovat ratkaisevia a-' f. _ 30 trombiinikatalysoidulle katkaisulle Arg(16)-Gly(17)-peptidisidoksen kohdalla (Ni, F. et ai., Biochemistry 28 (1989) 3082-3094). Vertailututkimukset useilla proteiineilla ja peptideillä, jotka trombiini katkaisee, ovat johtaneet ehdotukseen, että op-timikatkaisukohdilla α-trombiinille voi olla rakenne (i) P4-P3-Pro-Arg-Pl'-P2', jossa sekä P3 että P4 on riippumattomasti hydrofobinen aminohappo (kuten väliini) ja se-35 kä ΡΓ että P2' on riippumattomasti ei-hapan aminohappo, kuten hydrofobinen ami-* nohappo kuten väliini, tai (ii) P2-Arg-P Γ jossa P2 tai P Γ on glysiini (Chang, J., Eur.
g . 105202 J. Biochem. 151 (1985) 217-224). Näissä yleisrakenteissa, joita trombiini katkaisee ja joita voidaan käyttää keksinnön mukaisesti, on kuitenkin poikkeuksia.
*
Plasminogeenianalogin tuottamiseksi, jonka trombiini voisi katkaista ja aktivoida, kohta, jonka trombiini voisi tunnistaa ja katkaista, voitaisiin substituoida plasmino-5 geenimolekyyliin sopivaan paikkaan. Voidaan käyttää aminohapposekvenssiä, kuten sitä, jonka trombiini katkaisee fibrinogeeni Aa -ketjussa. Muita mahdollisia sekvenssejä olisivat mm. sellaiset, jotka ovat osallisina fibrinogeeni Ββ:η, tekijä XHI:n, tekijä V:n, tekijä VII:n, tekijä VIII:n, proteiini C:n, antitrombiini ΙΠ:η katkaisuun trombiinilla, ja muut proteiinit, joiden katkaisua trombiini katalysoi. Eräs esimerkki 10 trombiinilla katkaistavasta plasminogeenianalogista voi olla sellainen, jossa sekvenssi Pro(559), Gly(560) on muutettu sekvenssiksi Gly(559), Pro(560) tuottamaan sekvenssin Gly(559)-Pro(560)-Arg(561)-Val(562), joka on identtinen fibrinogeeni Aa:ssa asemissa 17-20 esiintyvälle. Tämä ei ole pääasiallinen trombiinin katkaisu-kohta fibrinogeeni Aa:ssa, mutta trombiini voi katkaista Arg(19)-Val(20)-pepti-15 disidoksen.
Tällaiset hienovaraiset muutokset ovat tärkeitä, jos mutanttijohdannaisessa on säilytettävä täyden aktiivisuuden ja stabiiliuden tärkeät ominaispiirteet, kuten on edullista.
Keksintö koskee eräässä edullisessa suoritusmuodossa plasminogeenianalogeja, 20 joissa on yksi ainoa tai useita aminohapposubstituutioita, additioita tai deleetioita tähteiden Pro(555) ja Cys(566) välissä mukaan lukien. Trombiini, tekijä Xa tai muut veren hyytymiseen liittyvät entsyymit katkaisevat tällaiset plasminogeenianalogit tuottaen plasmiinianalogeja, joilla on fibrinolyyttistä aktiivisuutta.
Keksinnön edullisen suoritusmuodon mukaiset plasminogeenianalogit voivat sisältää 25 muita modifikaatioita (verrattuna villityyppi glu -plasminogeeniin), jotka voivat olla yksi tai usea additio, deleetio tai substituutio. Eräs esimerkki tällaisesta modifikaatiosta olisi additio, poisto, substituutio tai muutos yhdellä tai usealla kringle-alueella fibriininsitomisaktiivisuuden lisäämiseksi.
Eräs esimerkki modifikaatiosta, johon liittyy deleetio, olisivat plasminogeenianalo-30 gien lys-plasminogeenivariantit, joissa aminoterminaaliset 68, 77 tai 78 aminohapot on poistettu. Tällaiset variantit voivat lisätä fibriininsitomisaktiivisuutta, kuten on havaittu lys-plasminogeenilla villityyppi glu -plasminogeeniin verrattuna (Bok, R.
A. ja Mangel, W. F., Biochemistry 24 (1985) 3279-3286).
9 .
105202
Plasmiini-inhibiittori α-2-antiplasmiinia on läsnä veressä ja tulee verihyytymien fibriinimatriisin sisälle. Tämän inhibiittorin tehtävä on rajoittaa plasmiiniaktiivisuut-ta verihyytymässä ja verenkierrossa. Keksinnön erittäin verihyytymäselektiivisille plasminogeenianalogeille voi olla eduksi lisätä seriiniproteaasialueelle mutaatio, jo-5 ka häiritsee plasmiini-inhibiittorm sitomista. Tämä mutaatio voisi olla analogisessa asemassa asemalle, jonka on osoitettu estävän inhibiittorin sitoutumisen kudosplas-minogeeniaktivaattoriin (Madison, E. L. et ai., Nature 339 (1989) 721-724).
Muut keksinnön mukaiset monikollisesti modifioidut plasminogeenianalogit voivat sisältää yhden tai useita modifikaatioita estämään, vähentämään tai muuttamaan 10 glykosylointimalleja. Tällaisia modifikaatioita sisältävillä plasminogeenianalogeilla voi olla pitempi puoliintumisaika, vähentynyt plasmapuhdistuma ja/tai suurempi spesifinen aktiivisuus.
Myös muita proteiineja voidaan muuttaa niin, että ne katkeavat tai muuten aktivoituvat veren hyytymiseen liittyvillä entsyymeillä olemaan fibrinolyyttisesti aktiivisia 15 tai olemaan verihyytymän muodostumista inhiboivia. Yksiketjuinen urokinaasiplas-minogeeniaktivaattori (scuPA) on eräs esimerkki fibrinolyyttisestä proteiinista, ja proteiini C on eräs esimerkki entsyymistä, joka on osallisena veren hyytymisen inhi-boinnissa ja joka voitaisiin aktivoida.
scuPA aktivoituu kaksiketjuiseksi uPA:ksi (tcuPA) Lys( 158)-Ile( 159)-peptidisidok-20 sen plasmiinikatkaisulla. Trombiini inaktivoi scuPAin katkaisemalla Arg(156)-Phe(157)-peptidisidoksen. Voitaisiin konstruoida scuPA:n analogi, jossa aminohapposekvenssi katkaisukohdan ympärillä olisi muutettu niin, että katkaisu trombiinilla . tai muulla veren hyytymiseen liittyvällä entsyymillä tuottaisi aktiivista tcuPA:ta.
Proteiini C katkeaa aktivoituun muotoonsa trombomoduliiniin sidotun trombiinin 25 vaikutuksella. Keksinnön suoja-alaan kuuluvaa proteiini C -analogia modifioidaan niin, että se on katkaistavissa trombiinilla sinänsä aktivoidun proteiini C:n muodostamiseksi.
Voidaan konstruoida fuusioproteiineja fibrinolyyttisten tai antikoaguloivien proteiinien selektiivisen vapautumisen saavuttamiseksi veren hyytymiskohdassa. Tämän 30 saavuttamiseksi fibrinolyysiin tai koaguloitumisen estoon liittyviä proteiineja liitetään linkkerialueella, joka on katkaistavissa veren hyytymiseen liittyvällä entsyymillä. Esimerkkejä proteiineista, jotka voidaan sisällyttää tällaiseen katkaistavaan proteiiniin, ovat mm. tPA, uPA, streptokinaasi, plasminogeeni, proteiini C, hirudiini ja anti-trombiini ΙΠ. Voi myös olla edullista fuusioida tällaisia proteiineja proteiiniin 10 . 105202 jolla on suotuisa ominaisuus, ettei se liity suoraan verihyytymien liukenemiseen (esimerkiksi albumiini, jolla on pitkä plasmapuoliintumisikä).
Keksinnön suoja-alaan kuuluvien plasminogeenianalogien edulliset ominaispiirteet pätevät, milloin soveliasta, myös muille keksinnön mukaisille yhdisteille, asianmu-5 kaisin muutoksin.
Keksinnön ensimmäisen näkökannan mukaisten yhdisteiden mukaiset yhdisteet voidaan syntetisoida mitä hyvänsä tavanomaista reittiä. Keksinnön toisen näkökannan mukaisesti aikaansaadaan menetelmä edellä kuvatun proteiinipitoisen yhdisteen valmistamiseksi, menetelmän käsittäessä peräkkäisten aminohappotähteiden liittämi-10 sen yhteen ja/tai oligopeptidien liittämisen. Vaikka proteiinit voidaan periaatteessa syntetisoida kokonaan tai osaksi kemiallisesti, on valikoitu reitti vastaavan nukleii-nihapposekvenssin ribosomaalinen translaatio, edullisesti in vivo. Proteiini voidaan glykosyloida sopivasti.
On edullista tuottaa keksinnön mukaisia proteiineja yhdistelmä-DNA-teknologiaa 15 käyttämällä, erityisesti kun ne ovat luonnollisten proteiinien analogeja (joko amino-happosubstituutiolla, -deleetiolla tai -additiolla). Plasminogeenia tai muuta luonnollista proteiinia koodittava DNA voi olla cDNA:sta tai genomiklooni tai se voi olla syntetisoitu. Aminohapposubstituutiot, -additiot tai -deleetiot lisätään edullisesti kohtaspesifisellä mutageneesillä. Keksinnön suoja-alaan kuuluvat sopivat DNA-sek-20 venssit, jotka koodittavat glu-plasminogeeniä, lys-plasminogeeniä ja plasminogeeni-analogeja ja muita yhdisteitä, voidaan saada yhdistelmä-DNA-tekniikan ammattimiehen tuntemilla menettelytavoilla. Useita proteiineja, mukaan lukien esimerkiksi . kudosplasminogeeniaktivaattoria, varten on rutiininomainen menettely saada yhdis- telmä-DNA-proteiini insertoimalla koodisekvenssi ekspressiovektoriin ja transfek-25 toimella vektori sopivaan isäntäsoluun. Sopiva isäntä voi olla bakteeri, kuten E. coli, eukarioottinen mikro-organismi, kuten hiiva, tai korkeampi eukarioottisolu. Plasmi-nogeeni on kuitenkin epätavallisen vaikea ekspressoida, ja useita menestyksettömiä yrityksiä on tehty yhdistelmä-DNA-plasminogeenin tuottamiseksi nisäkässoluissa (Busby S. et ai., Fibrinolysis 2 (1988) Suppl. 1, 64; Whitefleet-Smith et ai., Arch.
• · 30 Bioc. Biop. 271 (1989) 390-399). Voi olla mahdollista ekspressoida plasminogeeni E. colissa, mutta proteiini muodostuisi liukenemattomassa muodossa ja se olisi rena-turoitava. Tyydyttävä renaturointi olisi vaikeaa nykyisellä teknologialla. Plasminogeeni on ekspressöity hyönteissoluissa baculovirus-vektorilla infektoitua solujärjes-telmää käyttämällä tasoilla 0,7-1,0 pg/106 solua (mitattu 66 tuntia infektion jälkeen) 35 (Whitefleet-Smith et ai. sama), mutta tämä menetelmä ei luo stabiilia solulinjaa, jo- 11 . 105202 ka tuottaa plasminogeeniä, eikä mikään translaation jälkeinen modifikaatio, kuten glykosylointi voi olla autenttinen.
Keksinnön kolmannen näkökannan mukaisesti aikaansaadaan synteettinen tai yhdis-telmä-DNA-nukleiinihappo, joka koodittaa edellä kuvattua proteiinipitoista yhdistet-5 tä. Nukleiinihappo voi olla RNA.ta tai DNA:ta. Keksinnön tämän näkökannan edulliset ominaispiirteet ovat kuten ensimmäisellä näkökannalla.
Keksinnön neljännen näkökannan mukaan aikaansaadaan menetelmä kolmannen näkökannan mukaisen nukleiinihapon valmistamiseksi, menetelmän käsittäessä peräkkäisten nukleotidien liittämisen yhteen ja/tai oligo- ja/tai polynukleotidien liittä-10 misen.
Keksinnön kolmannen näkökannan mukainen yhdistelmä-DNA-nukleiinihappo voi olla vektorin muodossa, joka voi olla esimerkiksi plasmidi, kosmidi tai faagi. Vektori voidaan sovittaa transfektoimaan tai transformoimaan prokarioottisia (esimerkiksi bakteeri-) soluja ja/tai eukarioottisia (esimerkiksi hiiva- tai nisäkäs) soluja. 15 Vektori käsittää kloonauskohdan ja tavallisesti ainakin yhden merkkigeenin. Eks-pressiovektorissa on promoottori, joka on toimintakykyisesti liittynyt kloonauskoh-taan liitettävään sekvenssiin, ja edullisesti sekvenssin, joka mahdollistaa proteiinituotteen erittymisen. Ekspressiovektorit ja kloonausvektorit (joiden ei tarvitse pystyä ekspressoimiseen) kuuluvat keksinnön suoja-alaan.
20 Määrätyt vektorit ovat keksinnön mukaisesti erityisen käyttökelpoisia. Keksinnön viidennen näkökannan mukaan aikaansaadaan vektori, joka sisältää ensimmäisen nukleiinihapposekvenssin, joka koodittaa proteiinia tai ilmentää kloonauskohtaa, jo- * ka on toimintakykyisesti liittynyt toiseen nukleiinihapposekvenssiin, joka sisältää vahvan promoottori- ja edistäjäsekvenssin, joka on johdettu ihmisen sytomegalovi-25 ruksesta, kolmannen nukleiinihapposekvenssin, joka koodittaa polyadenylointisek-venssiä, joka on johdettu SV40:stä, ja neljännen nukleiinihapposekvenssin, joka koodittaa valittavissa olevaa merkkiä, joka ekspressoituu SV40-promoottorista ja jossa on lisäksi SV40-polyadenylointisignaali valittavissa olevan merkkisekvenssin 3'-päässä.
30 On ymmärrettävä, että käsitettä "vektori" käytetään tässä julkaisussa funktionaalisessa mielessä, eikä sitä ole välttämättä pidettävä yhteen ainoaan nukleiinihappomo-lekyyliin rajoittuvana. Niin esimerkiksi, edellä määritellyn vektorin ensimmäinen, toinen ja kolmas sekvenssi voivat ilmetä ensimmäisessä nukleiinihappomolekyylis-sä, ja neljäs sekvenssi voi ilmetä toisessa nukleiinihappomolekyylissä.
,2 . 105202
Valittavissa oleva merkki voi olla mikä hyvänsä sopiva merkki, gpt-merkki on sopiva.
« Tällainen vektori tekee mahdolliseksi ekspressoida sellaisia proteiineja kuin plasmi-nogeeniä ja plasminogeenianalogeja (mukaan lukien glu-plasimnogeenin ja lys-5 plasminogeenin), joita voi muuten olla vaikea ekspressoida. Keksinnön tämä näkökanta aikaansaa vektorin muodostamisen, joka on käyttökelpoinen vieraiden geenni-en ja cDNA:iden ekspression ja heterologisten proteiinien tuottamisen nisäkässo-luissa. Erityinen esimerkkinä esitetty suoritusmuoto on stabiilien solulinjojen konstruointi, jotka pystyvät ekspressoimaan plasminogeenia ja plasminogeenianalo-10 geja korkeilla tasoilla.
Käyttämällä vektoria, esimerkiksi edellä kuvattua, ekspressoidaan ja eritetään edullisesti heterologisia proteiineja, kuten plasminogeenia ja plasminogeenianalogeja, solukasvatusväliaineeseen biologisesti aktiivisessa muodossa ilman tarvetta biologisille tai kemiallisille lisäproseduureille. Sopivia transformoitavia soluja tai solulin-15 joja ovat edullisesti nisäkässolut, jotka kasvavat jatkuvatoimisessa kasvatuksessa ja jotka voidaan transfektoida tai muuten transformoida vakiotekniikoilla. Esimerkkejä sopivista soluista ovat mm. kiinanhamsterin munasarja (CHO) -solut, hiiren myeloo-masolulinjat, kuten P3X63-Ag8.653, COS-solut, HeLa-solut, BHK-solut, melanoo-masolulinjat, kuten Bowes-solulinja, hiiren L-solut, ihmisen hepatoomasolulinjat, 20 kuten Hep G2, hiiren fibroblastit ja hiiren NIH 3T3-solut.
Vaikuttaa siltä, että CHO-solujen käyttö plasminogeenin ja plasminogeenianalogien ekspression isäntinä on erityisen edullista. Keksinnön kuudennen näkökannan mu-. kaan aikaansaadaan kiinanhamsterin munasarja (CHO) -solu, joka on transformoitu ekspressoimaan plasminogeenia tai plasminogeenianalogia.
25 CHO- tai muut solut, kuten hiiva- (esimerkiksi Saccharomyces cerevisiae) tai bakteeri- (esimerkiksi Escherichia coli) voivat olla edullisia keksinnön mukaisten muiden proteiinipitoisten yhdisteiden ekspressoimiseen. Keksinnön seitsemännen näkökannan mukaisesti aikaansaadaan solu tai solulinja, joka on transformoitu edellä kuvatulla nukleiinihapolla ja/tai vektorilla. Transformointi voidaan saavuttaa millä hy-30 vänsä sopivalla menetelmällä; elektroporaatio on paras menetelmä.
Tämän keksinnön mukaisia proteiinipitoisia yhdisteitä voidaan käyttää farmaseuttisissa koostumuksissa estämään tai hoitamaan veritulpan muodostumista tai muita tiloja, joissa halutaan tuottaa paikallista fibrinolyyttistä ja/tai antikoagulanttiaktiivi-suutta. Tällaisia tiloja ovat mm. sydän- ja aivoinfarkti, valtimo- ja laskimoveritulpan 13 . 105202 muodostuminen, tromboembolia, kirurgisen toimenpiteen jälkeinen taittuminen, veritulpan muodostava laskimotulehdus ja diabetekseen liittyvät verisuonisairaudet.
Keksinnön kahdeksannen näkökannan mukaisesti aikaansaadaan farmaseuttinen koostumus, joka sisältää yhtä tai useaa keksinnön ensimmäisen näkökannan mukais-5 ta yhdistettä ja farmaseuttisesti tai eläinlääketieteellisesti hyväksyttävää väliainetta. Tällainen koostumus voidaan sovittaa laskimonsisäiseen antoon, ja siten se voi olla steriiliä. Esimerkkejä keksinnön mukaisista koostumuksista ovat mm. steriili(e)n plasminogeenianalogi(e)n valmisteet isotonisessa fysiologisessa suolaliuoksessa ja/tai puskurissa. Koostumus voi sisältää paikallispuudutetta injektion kivun lievittä-10 miseksi. Keksinnön mukaiset yhdisteet voidaan toimittaa yksikköannosmuodossa, esimerkiksi kuivana jauheena tai vedettömänä konsentraattina hermeettisesti suljetussa astiassa, kuten ampulli tai lääkepussi, jossa ilmoitetaan proteiinin määrä. Kun yhdiste on annettava infuusiona, se voidaan jakaa infuusiopullon avulla, joka sisältää steriiliä injektiovettä tai suolaliuosta tai sopivaa puskuria. Kim sitä on annettava 15 injektioilla, se voidaan jaella injektiovesi-, suolaliuos- tai sopivan puskurin ampul-lan kanssa. Infusoitava tai injisoitava koostumus voidaan saattaa käyttövalmiiksi sekoittamalla valmistusaineet ennen antamista. Kun se on määrä antaa paikallisena käsittelynä se voidaan jakaa sopivassa emäksessä.
Annettavan materiaalin määrä riippuu vaaditun fibrinolyysin tai veren hyytymisen 20 eston määrästä, vaaditusta vaikutusnopeudesta, tromboembolisen aseman vakavuudesta ja verihyytymän koosta. Hoitava lääkäri määrää annettavan täsmällisen annoksen, riippuen tilan vakavuudesta, jota tilaa keksinnön mukaisilla yhdisteillä on määrä hoitaa. Ohjenuorana potilas, jota hoidetaan kypsän veritulpan vuoksi, saa kui-tenkin yleensä plasminogeenianalogin päivittäisannoksen 0,01-10 mg/kg kehonpai-25 noa joko injektiona esimerkiksi jopa 5 annoksena tai infuusiolla.
Keksintöä voidaan käyttää menetelmässä veritulpan muodostumisen hoitamiseksi tai ennalta estämiseksi, käsittäen ensimmäisen näkökannan mukaisen yhdisteen tehokkaan ei-toksisen määrän antamisen. Keksinnön edelleen erään näkökannan mukai-* sesti aikaansaadaan sen vuoksi edellä kuvatun yhdisteen käyttö trombolyyttisen 30 ja/tai antikoagulanttiaineen valmistuksessa.
Keksintö koskee erityisesti esimerkeissä kuvattuja DNA:ita, vektoreita, transformoituja isäntäkantoja, plasminogeenianalogiproteiineja ja menetelmiä näiden valmistamiseksi.
14 105202
Seuraavat kuviot ja keksinnön esimerkit esitetään kuvausmielessä eikä rajoittavasti. Esimerkeissä 1-3 kuvataan ekspressiovektori, jota käytetään plasminogeenin ja plas-minogeenivarianttien ekspressioon korkeammista eukarioottisoluista. Seuraavat esimerkit kuvaavat plasminogeenin ja plasminogeenivarianttien ekspressiota ja näiden 5 ominaisuuksia. Kuvioissa, joihin esimerkeissä viitataan:
Kuviossa 1 esitetään pGWH:n konstruointi;
Kuviossa 2 esitetään glu-plasminogeeni-cDNA:n nukleotidisekvenssi ja ennustettu aminohapposekvenssi;
Kuviossa 3 esitetään ekspressiovektorin pGWHgPl kartta; 10 Kuviossa 4 esitetään tekijä Xa -aktivoitujen plasminogeenianalogien katkaisukoh-tasekvenssit;
Kuviossa 5 esitetään trombiiniaktivoitujen plasminogeenianalogien katkaisukohta-sekvenssit;
Kuviossa 6 esitetään X2:n aktivointi tekijällä Xa ja T2:n aktivointi trombiinilla 15 fibriiniagargeelillä;
Kuviossa 7 esitetään plasminogeenimutanttien X3, T13 ja T19 aktivointi tekijällä Xa (X3:a varten) tai trombiinilla (T13:a ja T19:ää varten); X3 on esimerkkien 5 ja 21 kohde, T13 on esimerkkien 13 ja 24 kohteena, ja T19 on esimerkkien 16 ja 26 kohteena; 20 Kuviossa 8 esitetään plasminogeenimutantin T19 aktivointi (esimerkit 16 ja 26) trombiinilla, määritettynä plasmiinin määrityksellä;
Kuviossa 9 esitetään SDS-PAGE-geeli, jossa esitetään X2:n katkaisu tekijä Xa:lla ja T2:n katkaisu trombiinilla; ja
Kuviossa 10 esitetään plasminogeenimutantin T19 (esimerkit 16 ja 26) trombiinilla 25 katkaisun nopeus.
Esimerkki 1
Plasmidi pSSl on signaalisekvenssivektori, joka antaa käyttöön erityssignaalin mille hyvänsä geenille, jolta puuttuu tällainen sekvenssi. pGWl on johdettu tästä vektorista, ja pGWH on ekspressiovektori, joka sisältää promoottorin.
15. 105202 pSSl:n konstruointi 1. Plasmidia pUC18 (Kuvio 1.1) käytettiin vektorin runkona, koska se sisältää sekä E. coli -replikaatioalkukohdan, joka sallii plasmidi-DNA:n tuottamisen E. co-lissa, että ampisilliiniresistenssigeenin, joka saallii plasmidin valinnan E. colissa 5 (Kuvio 1.1). (pUC18 on kuvattu artikkeleissa Gene 19 (1982) 259-268 ja Gene 26 (1983) 101-106, ja se on talletettu kansainväliseen talletuslaitokseen the American Type Culture Collection talletusnumerolla ATCC 37253.) pUC18 sisältää myös polylinkkerin, johon synteettinen DNA liitettiin, mutta tässä polylinkkerissä on EcoRI-kohta, joka oli välttämätöntä poistaa ennen synteettisen sekvenssin liittämis-10 tä. Tämä suoritettiin katkaisemalla DNA EcoRI:llä ja käsittelemällä mungpapunuk-leaasilla, 1-säikeisellä nukleaasilla, ja sitten plasmidi-DNA:n uudelleen liittämisellä (Kuvio 1.2).
2. Modifioitu pUC18-DNA katkaistiin HindIII:lla ja BamHI:llä, ja synteettinen DNA-fragmentti:
15 (5' AGCTT CC ACC AT GAAGTGCTCCTGGGTGATCTT CTTCCTGATGGCCGT GGT
GACCGGCGTGAACTCGCGAGATCTAGAGTCGACCTGCAGGATATCGAATTCATT 3' (yläsäie), 5'GAT C AAT GAATTCGAT ATCCTGC AGGTCGACT CT AGATCTCGCGAGTTC ACG CCGGTCACCACGGCCATCAGGAAGAAGATCACCCAGGAGCACTTCATGGTGGA 20 3, (alasäie), joka sisältää immunoglobuliinisignaalisekvenssin (Rogelj et ai.; Nature 331 (1988) 173-175) plus polylinkkerin, joka sisältää erilaisia restriktioentsyymi-kohtia, ja myös 237 emäsparin BclI-BamHI-fragmentin, joka on eristetty SV40-DNA:sta ja joka sisältää polyadenylointisignaalin, liitettiin näihin kohtiin kolmitie-reaktiolla (three way reaction) (Kuvio 1.3). Tämän vektorin konstruoinnissa voi-25 täisiin käyttää myös polyadenylointisignaaleja muista geeneistä, kuten naudan kasvuhormonista. pUC18-rungon jäänteet, ts. Kpnl- ja Smal-kohdat, pysyivät tässä konstruktiossa, ja niin nämä kohdat poistettiin sulattamalla plasmidi-DNA:n KpnTllä ja BamHTllä, poistamalla fragmentin ja liittämällä alasäielinkkerin - ·[ (5'GATCCGTAC 3'), joka tuhoaa Kpnl-ja Smal-kohdat mutta muodostaa uudelleen 30 BamHI-kohdan (Kuvio 1.3).
3. Tämän vektorin tekemiseksi käyttökelpoiseksi tilapäiseen ekspressioon COS-soluissa 90 emäsparin SV40-replikaation alku (5'T ATGAAGACGTCGCCTCCT C ACT ACTTCTGGAAT AGCTC AG AGGCCGAGGC GGCCTCGGCCTCTGCATAAATAAAAAAAATTAGTCAGGG 3' (yläsäie)), 1« · 105202 5'CGCCCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCGGCCTC TGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCGACGTCTTCA 3', (alasäie) liitettiin pUC 18:n Ndel-Narl-kohtiin 53 emäsparin fragmentin korvaamiseksi (Kuvio 1.4).
4. Synteettinen DNA sekvenssi (5'AAGCGGCCGCGGCCATGCCGGCCAC-5 TAGTCTCGAGTT 3' (yläsäie); 5'AACTCGAGACTAGTGGCCGGCATGGCCG-CGGCCGCTT 3' (alasäie)), joka koodittaa restriktioentsyymikohtia, jotka leikkaa-vat harvoin nisäkkään genomin, ja joka auttaa plasmidi-DNA:n linearisointia ennen transfektointia, liitettiin plasmidin Sspl-kohtaan promoottorittoman vektori pSSl:n muodostamiseksi (Kuvio 1.5).
10 5. Koko plasmidin nukleotidisekvenssi varmistettiin.
pGWl:n konstruointi
Useissa ekspressoitavissa cDNA:issa tai geeneissä on jo signaalisekvenssi, ja niin . pSSl modifioitiin erityssignaalin poistamiseksi.
6. DNA katkaistiin HindllLlla ja NruLllä, fragmentti poistettiin, ja liitettiin link-15 keri (5'AGCTTCCCGGGATAGG-TACCTCG 3' (yläsäie), 5'CGAGGTACCTATC- CCGGGA 3' (alasäie)), joka sisältää Hindlll-, Smal-, Kpnl- ja Nrul-kohdat (Kuvio 1.6). Signaalisekvenssin poistamisen lisäksi tämä myös lisää polylinkkeriin kaksi restriktioentsyymikohtaa tehden sen monipuolisemmaksi. Tätä promoottoritonta vektoria kutsutaan nimellä pGWI, ja sen oikea kokoonpano varmistettiin koko 20 plasmidin nukleotidisekvenssianalyysillä.
pGWH:n konstruointi 7. Plasmidissa pSSl ei ole promoottori- tai edistäjäsekvenssiä. Tämä voidaan lisätä mukavasti liittämällä polylinkkeriin sopivia DNA-fragmentteja, esimerkiksi Hindlll-kohtaan. Yksi promoottori/edistäjä-sekvenssi, joka on sopiva käytettäväksi 25 on ihmisen sytomegaloviruksen (HCMV) välitön varhainen transkriptionsäätelyalue (Thomsen et ai.; Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 81 (1984) 659-663), vaikka muita säätelyalueita voitraisiin käyttää, esimerkiksi Rous-sarkoomaviruksen pitkä terminaalinen toisto (RSV LTR), SV40:n varhainen tai myöhäinen promoottori/edistäjä-alue, hiiren nännin kasvainvirus (MMTV) LTR, hiiren metallotioneiinipromoottori. Tämä 30 liitettiin pGWl:een Hindlll-kohtaan, ja sitten suunta tarkastettiin restriktioendonu-kleaasisulatuksella. Sitten 5'-pään Hind ΙΙΙ-kohta poistettiin suorittamalla osittainen sulatus Hind 111:11a niin, että vain 5'-kohta katkesi. Sitten tämä kohta poistettiin käsittelemällä mungpapunukleaasilla ja seuraavalla uudelleen liittämisellä pGWH:n ,7 . 105202 muodostamiseksi (kuvio 1.7). Vektorin oikea kokoonpano varmistettiin koko plas-midin nukleotidi sekvenssianalyysillä.
8. DNA-fragmentti, joka sisältää valittavissa olevan merkkigeeni gpt:n ja SV40:n varhaisen promoottori/edistäjä-sekvenssin ja polyadenylointisekvenssin, kloonattiin 5 vektorin BamHI-kohtaan pGWHg:n muodostamiseksi, ja se sallii solujen valinnan, joilla plasmidi-DNA on integroitunut stabiilisti. Voitaisiin myös käyttää geenejä, jotka koodittavat proteiineja, jotka antavat resistenssiä G418:aa tai hygromysiiniä vastaan, tai erilaisia metabolisia valintoja.
Tämä erityinen ekspressiojäijestelmä on edullinen johtuen sen tehokkuudesta, mutta 10 sen käytön ei tarkoiteta rajoittavan tämän keksinnön suoja-alaa. Kiijallisuudessa kuvataan useita vaihtoehtoisia menetelmiä geenien ekspressoimiseksi nisäkässoluissa, ja tällaiset ekspressiojärjestelmät ovat geenitekniikan ammattimiesten hyvin tuntemia, ja ne on ainakin osaksi dokumentoinut Gorman teoksessa "DNA Cloning voi. II: A Practical Approach" (D.M. Glover, toimittaja IRL Press, Oxford (1985) s. 143-15 190).
Esimerkki 2
Glu-plasminogeenin ekspressio
Menetelmät, joita voidaan käyttää cDNA:n eristämiseen, ovat hyvin dokumentoituja, ja menettelytapa, jota on käytetty plasminogeeni-cDNA:n eristämiseen, esitetään 20 yhteenvetona seuraavassa protokollassa. Ihmisen plasminogeeni-cDNA on kloonattu ja sekvensoitu (Forsgren et ai., FEBS Letters. 213 (1987) 254-260).
1. RNA valmistettiin tuoreesta ihmisen maksasta guanidiinitiosyanaattimenetel-mää käyttämällä (Chirgwin et ai., Biochemistry 10 (1979) 529) ja puhdistettiin oli-go-dT-kolonnia käyttämällä (Aviv ja Leder, PNAS 69 (1972) 1408).
25 2. cDNA-kirjasto valmistettiin yhtiön Amersham työohjeessa kuvatulla tavalla ("cDNA Synthesis and Cloning System", Amersham International plc, 1985). Kak-. ·' soissäikeinen cDNA liitettiin lambda-vektoriin.
3. Täplät seulottiin plasminogeeni-cDNA:n suhteen hybridisoimalla nitrosellu-loosareplikaatteihin käyttämällä 32P-leimattuja oligonukleotidikoettimia (17-meere-30 jä), edustaen plasminogeenin 3'- ja 5'-päitä, puskurissa, joka sisälsi 6 x SSC (SSC on 150 mM NaCl, 15 mM natriumsitraatti), 5 x Denhardt'in liuosta, 0,2 % SDS ja 0,1 mg/ml lohen maidin DNA:ta huoneenlämpötilassa yön yli. Suodattimet pestiin käyttämällä 6 x SSC, 0,1 % SDS 47 °C:ssa. Positiiviset täplät puhdistettiin, alistet- ,8 . 105202 tiin plasmidivapautukselle, ja pakatut yhdistehnä-DNA-plasmidikloonit tai niiden alikloonit sekvensoitiin dideoksimenetelmän modifikaatiolla käyttämällä dATP-5'-a-[35s]-tiofosfaattia (ks. kappaletta Menetelmät). Tämä cDNA koodittaa 791 aminohapon glu-plasminogeeniproteiinia, joka vastaa plasminogeenin pituutta, jonka on 5 kuvannut Forsgren et ai., (sama) ja sisältää ylimääräisen aminohapon (Ile65) verrattaessa aminohapposekvenssiin proteiinisekvensoinnillä määritettynä (Sottrup-Jensen et ai., sama). cDNA:n nukleotidisekvenssi ja glu-plasminogeenin 791 aminohapon sekvenssi esitetään kuviossa 2.
Voidaan käyttää muita eristysmenetelmiä, esimerkiksi mRNA, joka on eristetty so-10 luista, jotka tuottavat plasminogeenia, voidaan valmistaa käyttämällä guanidiinitio-syanaattimenetelmää (Chirgwin et ai., Biochemistry 10 (1979) 5294) ja syntetisoida DNA:n komplementaarinen ensimmäinen säie käänteistranskriptaasia käyttämällä. Sitten voidaan käyttää polymeraasiketjureaktiota (PCR) plasminogeenisekvenssin monistamiseen (Saiki R. et ai., Science 239 (1988) 487-491). PCR-reaktiota voitai-15 siin käyttää myös monistamaan sekvenssiä DNA:sta, joka on valmistettu genomi- tai cDNA-kirjastosta, joka sisältää plasminogeenia koodittavat sekvenssit. Vaihtoehtoisesti geeni voitaisiin koota kemiallisesti syntetisoiduista oligonukleotideista.
2,5 ke Ball-SphI-glu-plasminogeenifragmentti alikloonattiin pUC18:n polylinkkeriin Smal-Sphl-kohtiin (kuvio 2). Sitten plasminogeeni-cDNA katkaistiin pUC18:sta 20 Kpnl-SphI-fragmentilla ja liitettiin pGWH-vektoriin pGWHP:n muodostamiseksi, joka on valmistettu esimerkissä 1 kuvatulla tavalla, Kpnl- ja EcoRI-kohtiin käyttämällä EcoRl-SphI-linkkeriä (5'AATTCCATG 3'). Siten transkriptio plasminogeeni-cDNA:n kautta voi aloittaa HCMV promoottori/edistäjässä (kuvio 3). Valittavissa oleva merkki gpt, joka ekspressoituu SV40-promoottorista ja jonka 3'-päässä on 25 polyadenylointisignaali, kloonattiin pGWHP:n BamHI-kohtaan pGWHgPl:n muo dostamiseksi (kuvio 3), ja suunta tarkastettiin restriktioentsyyminukleaasisulatuk-sella. Plasmidi-DNA johdettiin CHO-soluihin elektroporaatiolla käyttäen 800 V ja 25 pF kuten kuvataan alla kappaleessa Menetelmät. Valikoiva väliaine (250 μΐ/ml ksantiinia, 5 pg/ml mykofenolihappoa, 1 x hypoksantiinitymidiiniä (HT)) lisättiin 30 soluihin 24 tuntia transfektoinnin jälkeen, ja väliaine vaihdettiin joka 2. - 3. päivä, gpt-resistenttejä kolonioita tuottavat levyt seulottiin plasminogeenituotannon suhteen ELISA-määritystä käyttämällä. Solut, jotka tuottivat korkeimmat antigeenitasot, kloonattiin uudelleen, ja parhaat tuottajat kasvatettiin suurempaan mittakaavaan pulloihin seuraten tuotantoa huolellisesti. Kaikista näistä solulinjoista varastoitiin 35 pakastettuja kantoja. Solulinjat Cl.44 ja Cl.75, jotka molemmat tuottavat glu-plas-minogeenia konsentraatiossa >3 mg/1, kasvatettiin suurempaan mittakaavaan pyöri- 19 . 105202 tyspulloihin aikaansaamaan tasapainotettua väliainetta, josta plasminogeeniprote-iinia puhdistettiin lysiini-SEPHAROSE 4B:tä käyttämällä. (Sana SEPHAROSE on tavaramerkki.) Sitten määritettiin puhdistetun plasminogeenin kyky katketa plasmii-niksi tPA:lla tai streptokinaasilla fibriiniagarhyytymämäärityksellä. Tsymogeenin 5 katkaisu määritettiin myös käyttämällä SDS-PAGE'a (Laemmli, Nature 227 (1970) 680).
Tämän villityyppiplasminogeenin valmistuksessa käytetyt yhdistelmä-DNA-, eks-pressio- ja proteiininpuhdistustekniikat samoin kuin seuraavien modifioitujen plas-minogeeniesimerkkien valmistuksessa käytetyt, ovat yhdistelmä-DNA-teknologian 10 ammattimiesten hyvin tuntemia. Kuvaus useimmista tekniikoista voidaan löytää seu-raavista laboratoriokäsikirjoista: "Molecular Cloning", kirjoittaneet T. Maniatis, E.F. Fritsch ja J. Sambrook, julkaisija Cold Spring Harbor Laboratory, Box 100, New York, tai "Basic Methods in Molecular Biology" kirjoittaneet L.G. Davis, M.D. Dibner ja J.F. Battey, julkaisija Elsevier Science publishing Co Inc, New 15 . York.
Muita ja modifioituja metodologioita esitetään yksityiskohtaisesti kappaleessa Menetelmät jäljempänä.
Esimerkki 3
Xl:n konstruointi ja ekspressio 20 On konstruoitu plasminogeenianalogit, joita on muutettu Arg(561), Val(562) -kat-kaisukohtien ympärillä kohdan modifioimiseksi ja tunnistuksen ja katkaisun sallimiseksi vaihtoehtoisilla entsyymeillä. Xl on plasminogeenianalogi, jossa aminohappo-tähde Pro(559) on korvattu Ile:llä ja Oluilla (kuvio 4). Tämä kohta perustui tekijä Xa-katkaisukohtaan protrombiinissa. Modifikaatiostrategia tässä esimerkissä oli ali-25 kloonata 1,87 ke Kpnl-HincII-fragmentti, plasminogeeni-cDNAista pUC18-vekto-rissa, yksisäikeiseen bakteriofaagi M13mpl8:ta mutageneesin helpottamiseksi. Valmistettiin yksisäikeinen templaatti, ja oligonukleotidilla tehdyt mutaatiot ohjasivat "mismatch"-mutageneesiä. Tässä tapauksessa mutageneesin ohjaukseen käytettiin 21 emäksen mittaista oligonukleotidia (5'CCCTTCCCTCGATACATTTCT 3'). Mu-30 taation sisältävät kloonit tunnistettiin sekvensoimällä, ja sekvensoitiin sitten täysin varmistamaan, ettei ollut lisätty epähuomiossa muuta mutaatiota. Sitten valmistettiin replikoituvaa muotoa (RF) oleva DNA, ja mutaatio siirrettiin ekspressiovektoriin, joka sisälsi Glu-plasminogeenin (joka kuvataan esimerkissä 2) korvaamalla villityy-pin Kpnl-EcoRV-fragmentti mutatoidulla fragmentilla. Sitten pGWHg-plasmidi, jo-35 ka sisältää mutanttiplasminogeenin, linearisoitiin restriktioendonukleaasi NotT.llä ja 20 105202 lisättiin CHO-soluihin elektroporaatiolla. Ekspressioprotokolla oli sitten sama kuin esimerkissä 2 käytetty. Tämän mutanttiproteiinin tuottamiseen käytetty solulinja on Cl.9. Tämän mutantin aktivaatiota ja katkaisua puhdistetulla tekijä Xa.lla tutkittiin esimerkeissä 20 ja 29 kuvatulla tavalla.
5 Esimerkki 4 X2:n konstruointi ja ekspressio
Seurattiin yleisesti esimerkin 3 menettelytapaa paitsi, että käytetty aluke oli 22meeri (5'CCTTCCCTCGATGCCACATTTC 3’). Tulokseksi saadulla plasminogeenin mu-tanttijohdannaisella on seuraavat aminohappomuutokset: Pro(559) Glyiksi, Gly(560) 10 Ileiksi, ja Glu:n ja Gly:n lisäys ennen Arg(56 l):tä (kuvio 4). Tämä katkaisukohta perustuu tekijä Xa-katkaisukohtaan protrombiinissa. Solulinja C8.24 muutettiin suurempaan mittakaavaan tämän mutanttiproteiinin tuottamiseksi. Muuten noudatettiin yleisesti esimerkin 3 menettelytapaa. Tämän mutantin aktivaatiota ja katkaisua tutkittiin esimerkeissä 20 ja 27 kuvatulla tavalla.
15 Esimerkki 5 X3:n konstruointi ja ekspressio X3:ssa Pro(559) on substituoitu Glyillä, Alailla, Ile:llä ja Gluilla käyttämällä 48meeriä (5'CCCCCCCACAACCCTTCCCTCTATT-GCACCACATTTCTTCGG-CTCCAC 3') (kuvio 4). Solulinjaa C37.4 on käytetty tuottamaan tätä proteiinia, jos-20 sa on katkaisukohta, joka perustuu tekijä Xa -katkaisukohtaan protrombiinissa. Muuten noudatettiin yleisesti esimerkin 3 menettelytapaa. Tämän mutantin aktivaatio kuvataan esimerkissä 21 jäljempänä.
Esimerkki 6 X5:n konstruointi ja ekspressio 25 X5:ssä Pro(559) on korvattu Glyillä, Tyrillä, Heillä ja Aspillä käyttämällä 48meeriä (5'CCCCCCCACAACCCTTCCGTCTATGTAACCACATTTCTTCGGC-TCCAC 3') (kuvio 4). Solulinjaa C39.7 on käytetty tuottamaan tämän proteiinin, jossa on katkaisukohta, joka perustuu tekijä Xa -katkaisukohtaan protrombiinissa. Muuten noudatettiin yleisesti esimerkin 3 menettelytapaa. Tämän mutantin aktivaatio kuva-30 taan esimerkissä 21 jäljempänä.
Esimerkki 7 X6:n konstruointi ja ekspressio 21 · 105202 X5:ssä olevan mutaation lisäksi X6:ssa on Val(561) korvattu Ile:llä (kuvio 4). Tämä tehtiin käyttämällä 52meeriä (5'CACACCCCCCCACAATCCTTCCGTCTATGTA-5 ACCACATTTCTTCG-GCTCCAC 3'). Tämän proteiinin tuottamiseen on käytetty solulinjaa C36.1. Muuten noudatettiin yleisesti esimerkin 3 menettelytapaa. Tämän mutantin aktivaatio kuvataan esimerkissä 21 jäljempänä.
Esimerkki 8
Tl:n konstruointi ja ekspressio 10 Tl on plasminogeenijohdannainen, jossa Pro(559) ja Gly(560) on vaihdettu keskenään, jolloin saadaan Gly asemassa 559 ja Pro asemassa 560 (kuvio 5). Tämä kat-kaisukohta matkii trombiinikatkaisukohtaa Arg(19)-Val(20):ssä fibrinogeeni Aa-ketjussa. Noudatettiin yleisesti esimerkin 3 menettelytapaa paitsi, että käytetty aluke oli 21meeri (5'CAACCCTTGGACCACATTTCT 3'). Tl-mutanttia tuottava solulin-15 ja on C6.23. Tämän proteiinin aktivaatio ja katkaisu kuvataan esimerkeissä 22 ja 28 jäljempänä.
Esimerkki 9 T2:n konstruointi ja ekspressio T2 on plasminogeenijohdannainen, joka on modifioitu villityyppiplasminogeenista 20 samalla tavalla kuin Tl, mutta Gly(559):n ja Pro(560):n välille on lisätty ylimääräinen Gly-aminohappo (kuvio 5). Noudatettiin yleisesti esimerkin 3 menettelytapaa paitsi, että tämän mutantin valmistamiseen käytetty aluke on 22meeri (5'ACCCTTGGACCACCACATTTCT 3'). Tämän mutanttiproteiinin tuottamiseen on käytetty solulinjaa C5.16. Tämän mutantin aktivaatio ja katkaisu esitetään esi-25 merkeissä 22 ja 28 jäljempänä.
Esimerkki 10 ' T6:n konstruointi T6-proteiinissa on kaksi aminohappomuutoskohtaa. Aminohapot Pro(559), Gly(560), Arg(561), Val(562) on korvattu kuudella aminohapolla olemaan 30 Gly(559), Val(560), Val(561), Pro(562), Arg(563), Gly(564). Näiden muutosten li säksi Val(553), Lys(556), Lys(567) on korvattu aminohapoilla Leu, Glu ja Leu vastaavasti käyttäen 61meeriä (5'GGGCCACACACCCCCCCACTCCCCTAGGCA-C AACTCC AC AT AGCT CCGGCTCC AGTT GAGG 3’) (kuvio 5). Tämä modifikaa 22 . 105202 tio perustuu trombiinikatkaisukohtaan tekijässä ΧΙΠ, Tämän proteiinin tuottamiseen on käytetty solulinjaa C45.1. Muuten noudatettiin yleisesti esimerkin 3 menettelytapaa. Tämän mutantin aktivaatio kuvataan esimerkeissä 23 ja 29 jäljempänä.
Esimerkki 11 5 T7:n konstruointi ja ekspressio
Toisessa modifikaatiossa, joka perustuu trombiinikatkaisukohtaan tekijässä ΧΠΙ, T7 sisältää T6:lle kuvatun ensimmäisen sarjan muutoksia, ts. Pro(559):n, Gly(560):n, Arg(561):n, Val(562):n korvauksen kuudella aminohapolla olemaan Gly(559), Val(560), Val(561), Pro(562), Arg(563), Gly(564). Lisäksi Val(553), Lys(556) ja 10 Lys(557) on korvattu aminohapoilla Leu, Gin ja Leu vastaavasti käyttämällä 60mee- riä (5'GGCCACACACCCCCCCACTCCCCTAGGCACAACTCCACATAGTTGC-GGCTCCAGTTGAGG 3') (kuvio 5). Tämän proteiinin tuottamiseen on käytetty solulinjaa C26.5. Muuten noudatettiin yleisesti esimerkin 3 menettelytapaa. Tämän mutantin aktivaatio kuvataan esimerkeissä 23 ja 29 jäljempänä.
15 Esimerkki 12 T8:n konstruointi ja ekspressio T8 perustuu trombiinikatkaisukohtaan tekijässä XIII, ja tässä proteiinissa Pro(559), Gly(560), Arg(561), Val(562) on korvattu aminohapolla Vai, Glu, Leu, Gin, Gly, Vai, Vai, Pro, Arg, Gly käyttämällä 61meeriä (5'CACACACCCCCCCACTCCCC-20 TAGGCACTACTCCTTGTAGTTCTACACATTTCTTCGGCTCC 3') (kuvio 5). Tämän proteiinin tuottamiseen on käytetty solulinjaa C34.5. Muuten noudatettiin yleisesti esimerkin 3 menettelytapaa. Tämän mutantin aktivaatio kuvataan esimer- t keissä 23 ja 29 jäljempänä.
Esimerkki 13 25 T13:n konstruointi ja ekspressio
Plasminogeenijohdannaisessa T13 kaksi aminohappoa Pro(559), Gly(560), on korvattu kolmella aminohapolla Vai, Vai ja Pro käyttämällä 41meeriä (5'CACCCCCCCACAACCCTAGGTACAACACATTTCTTCGGCTC 3') (Kuvio 5). Tämän proteiinin tuottamiseen käytettiin solulinjaa C51.1. Muuten noudatettiin 30 yleisesti esimerkin 3 menettelytapaa. Tämän mutantin aktivaatio kuvataan esimerkeissä 24 ja 29 jäljempänä.
Esimerkki 14
Tl4:n konstruointi ja ekspressio 23 · 105202
Plasminogeenianalogissa T14 on trombiinikatkaisukohta, joka perustuu kalsitonii-nissa trombiinilla katkaistuun paikkaan. Tässä mutantissa aminohapot Gly ja Tyr on 5 lisätty Cys(558):n ja Pro(559):n väliin, ja lisäksi Gly(560) on poistettu (kuvio 5). Nämä mutaatiot tehtiin käyttämällä 41meeriä (5'CACCCCCCCACAACCCTAGG-GTATCCACATTTCTTCGGCT 31). Tämän proteiinin tuottamiseen käytetty solu-linja oli C61.1. Muuten noudatettiin yleisesti esimerkin 3 menettelytapaa.
Esimerkki 15 10 T17:n konstruointi ja ekspressio
Proteiinissa Tl7 on katkaisukohta, joka perustuu kolekystokiniinillä katkaistuun kohtaan trombiinissa. Tässä proteiinissa on Ser lisätty Pro559:n ja Gly560:n väliin, ja se tehtiin käyttämällä 38meeriä (5'CACCCCCCCACAACCCTTCCACTAGGA-CA-TTTCTTCGG 3') (kuvio 5). Tämän proteiinin tuottamiseen käytettiin solulinjaa 15 C49.7. Muuten noudatettiin yleisesti esimerkin 3 menettelytapaa. Tämän mutantin aktivaatio kuvataan esimerkeissä 25 ja 29 jäljempänä.
Esimerkki 16 T19:n konstruointi ja ekspressio Tämän proteiinin katkaisukohta perustuu trombiinikatkaisukohtaan tekijässä XIII. 20 Tämä mutantti poikkeaa T8:sta siinä, että Pl'-aminohappo on Vai paremminkin kuin Gly. Katkaisu tuottaa kaksiketjuisen T19-plasmiinin, jossa on natiivi kevyen ketjun ·. sekvenssi. Tässä proteiinissa Pro(559), Gly(560), Arg(561) on korvattu aminoha poilla Vai, Glu, Leu, Gin, Gly, Vai, Vai, Pro, Arg käyttämällä ölmeeriä (5'CACACCCCCCCACAACCCTTGGGACTACTCCCTGCAATTCTACACATTT 25 CTTCGGCTCCAC 3') (kuvio 5). Proteiinin tuottamiseen käytettiin solulinjaa C53.5. Muuten noudatettiin yleisesti esimerkin 3 menettelytapaa. Tämän mutantin aktivaatio kuvataan esimerkeissä 26 ja 29 jäljempänä.
• n
Esimerkki 17 T20:n konstruointi ja ekspressio 30 Tämän proteiinin katkaisukohta on samanlainen kuin T19:n, mutta plasmiinin keveän ketjun aminoterminaalisesta sekvenssistä, joka on muodostettu katkaisulla, on poistettu Val(562), Val(563). Tässä proteiinissa Pro(559), Gly(560), Arg(561), Val(562) ja Val(563) on korvattu aminohapoilla Vai, Glu, Leu, Gin, Gly, Vai, Vai, 24. 105202
Pro, Arg käyttämällä 58meeriä (5'GGCCACACACCCCCCCCTTGGGACTACTC-CCTGCAATTCTACACATTTCTTCGGCTCC 3') (kuvio 5). Proteiinin tuottamiseen käytetty solulinja on C54.2. Muuten noudatettiin yleisesti esimerkin 3 menettelytapaa.
3 Esimerkki 18 T21:n konstruointi ja ekspressio Tämä mutantti poikkeaa T6:sta siinä, että ΡΓ-aminohappo on Gly.n sijasta Vai. Katkaisu tuottaa kaksiketjuisen T21-plasmiinin, jossa on natiivi keveän ketjun sekvenssi. Tätä proteiinia koodittava cDNA tehtiin käyttämällä T6-cDNA-templaattia, 10 joka kuvataan esimerkissä 10, ja 23meeriä (5'CACCCCCCCACTACCCTAGGCAC 3') (kuvio 5). Tämän proteiinin tuottamiseen on käytetty solulinjaa C55.9. Muuten noudatettiin yleisesti esimerkin 3 menettelytapaa.
Esimerkki 19 T22:n konstruointi ja ekspressio 15 Tämä mutantti poikkeaa T7:stä siinä, että ΡΓ-aminohappo on paremminkin Gly kuin Vai. Katkaisu tuottaa kaksiketjuisen T22-plasmiinin, jossa on natiivi keveän ketjun sekvenssi (kuvio 5). Tätä proteiinia koodittava cDNA tehtiin T7-cDNA-taustalla, kuten kuvataan esimerkissä 11, käyttäen T21:lle kuvattua 23meeriä. Tämän proteiinin tuottamiseen on käytetty solulinjaa C56.ll. Muuten noudatettiin yleisesti esi-20 merkin 3 menettelytapaa.
Esimerkki 20
Xl:n ja X2:n aktivaatio
Xl- ja X2-proteiinin aktivaatiota plasmiiniksi tekijällä Xa testattiin fibriinilyysi-määritystä käyttämällä. Plasmiini muodostuminen havaitaan tyhjän vyöhykkeen ke-25 liittymisellä fibriiniagaroosigeelissä kuten kuvataan Menetelmässä 12.1 (ks. kappaletta Menetelmät jäljempänä). 25 μΐ eriä puhdistettua plasminogeenimutanttia (635 μg/ml) inkuboitiin 2,5 μ1:η kanssa puhdistettua tekijä Xa:ta (0,35 pg)
f I
37 °C:ssa. Plasmiinin muodostuminen määritettiin lisäämällä 10 μΐ näytteitä inku-boinnista kaivoihin fibriiniagargeelissä. Näytteet plasminogeenimutantista, jota oli 30 inkuboitu tekijän Xa kanssa, antoi geelille tyhjän vyöhykkeen, jota ei ollut läsnä kontrollinäytteissä, jota ei ollut inkuboitu tekijän Xa kanssa. X2:n aktivaatio plasmiiniksi tekijällä Xa esitetään kuviossa 6.
105202
Esimerkki 21 X3:n, X5:n ja X6:n aktivaatio
Puhdistetulla X3-proteiinilla määritettiin aktivaatio käyttämällä liitetyn kromogeenin määritystä (ks. Menetelmä 12.3). Tämän määrityksen tulokset esitetään kuviossa 7, 5 jossa absorbanssin kasvu 405 nm:llä ajan funktiona osoittaa, että plasmiiniaktiivi-suus muodostuu inkuboitaessa X3:a tekijän Xa kanssa. Samalla lailla X5:n ja X6:n osoitettiin aktivoituvan inkuboitaessa tekijän Xa kanssa.
Esimerkki 22
Tl:n ja T2:n aktivaatio 10 Puhdistetuilla mutanttiproteiineilla Tl ja T2 määritettiin aktivaatio esimerkissä 20 kuvatulla tavalla paitsi, että mutanttiproteiinit esi-inkuboitiin trombiinin kanssa (2551 plasminogeenimutanttia (120 μg/ml) inkuboitiin 2,5 μ1:η kanssa trombiinia (0,69 yksikköä)), ja kaivot fibriinigeelissä esikäsiteltiin hirudiinilla estämään kaiken aktivoivan vaikutuksen trombiinilla, jota käytettiin geelin valmistukseen. Molemmat 15 mutantit aktivoituivat trombiinilla, koska trombiinin kanssa inkuboidut näyteet tuottivat geelille tyhjän vyöhykkeen. Kontrollinäytteet, joita ei inkuboitu trombiinin kanssa, eivät tuottaneet tyhjiä vyöhykkeitä. Tulokset T2:lle esitetään kuviossa 6.
Esimerkki 23 T6:n, T7:n ja T8:n aktivaatio 20 Mutanttiproteiineilla määritettiin aktivaatio käyttämällä liitetyn kromogeenin määritystä (ks. menetelmää 12.3). Tämä määritys osoitti, että T6, T7 ja T8 eivät aktivoidu : : trombiinilla (vaikka ne katkeavat, ks. esimerkkiä 29).
Esimerkki 24 T13:n aktivaatio 25 Puhdistettu T13-proteiini määritettiin käyttämällä liitetyn kromogeenin määritystä, ; joka kuvataan esimerkissä 23. Tämän määrityksen tulokset esitetään kuviossa 7, jos- • sa absorbanssin kasvu 405 nm:lla ajan funktiona osoittaa, että T13 aktivoituu trombiinilla. Aktivaatio havaittiin myös käyttämällä suoraa kromogeenistä määritystä, joka kuvataan esimerkissä 26.
Esimerkki 25 T17:n aktivaatio 26 . 105202
Puhdistettu T17-proteiini määritettiin käyttämällä liitetyn kromogeenin määritystä, joka kuvataan esimerkissä 23. Tämä määritys osoitti, että trombiini aktivoi T17:n.
5 Esimerkki 26 T19:n aktivaatio
Puhdistettu T19-proteiini määritettiin käyttämällä liitetyn kromogeenin määritystä, joka kuvataan esimerkissä 23. Tämän määrityksen tulokset esitetään kuviossa 7, jossa absorbanssin kasvu 405 nm:llä ajan funktiona osoittaa, että T19 aktivoituu trom-10 biinilla.
Mutanttiproteiini T19 analysoitiin myös käyttämällä suoraa kromogeenistä määritystä, joka sallii aktivaatiolla muodostuneen plasmiinin kvantisoinnin (ks. menetelmää . 12.2). Tämän määrityksen tulokset esitetään kuviossa 8, jossa plasmiinin muodostuminen ajan funktiona osoittaa, että T19 aktivoituu trombiinilla.
15 Esimerkki 27 X-mutanttien katkaisu Näytteitä, joissa oli 25 μg X-plasminogeenimutantteja, inkuboitiin 1,5 μg:n kanssa tekijää Xa 0,25 ml:ssa puskuria, ja katkaisuanalyysi suoritettiin menetelmässä 11 kuvatulla tavalla. Kuviossa 9 esitetään, että X2-plasminogeenivyöhyke noin 92 20 kDa:ssa katkesi muodostaen raskaan ketjun plasmiinivyöhykkeen noin 66 kDa:ssa.
. . Tämä osoittaa, että mutanttiaminohapposekvenssi, jonka olemme lisänneet, katkeaa tekijällä Xa, ja että esimerkissä 20 X2:lle osoitettu aktivaatio on tulosta plasmino-geenianalogin katkeamisesta muodostaen plasmiinia.
Esimerkki 28 25 Tl:n ja T2:n katkaisu ; Puhdistettujen proteiinien Tl ja T2 katkaisuanalyysit suoritettiin esimerkissä 27 ku vatulla tavalla paitsi, että tekijän Xa sijasta käytettiin trombiinia (1,5 pg). T2:n katkaisu plasmiiniksi trombiinilla esitetään kuviossa 9, varmistaen täten, että esimerkissä 24 osoitettu aktivaatio on tulosta trombiinikatkaisusta.
• .
27 · 105202
Esimerkki 29 T6:n, T7:n, Τ8:η, Τ13:η, Τ17:η ja Τ19:η katkaisu 12,5 pg plasminogeenimutanttinäytteitä inkuboitiin 2,8 pg:n kanssa trombiinia menetelmässä 11 kuvatulla tavalla. Plasminogeenimutanttien katkeaminen ajan funk-5 tiona määritettiin kvantitatiivisella geelinlukulaitteella, ja ajat T6:n, T7:n, T8:n, T13:n ja T19:n 50 % katkaisulle olivat 13, 40, 15, 70 ja alle 10 min vastaavasti, kun taas T17:n katkaisuaika oli noin 30 tuntia. Geelinlukutiedot T19:n katkaisulle (plas-minogeenivyöhykkeen katoaminen) esitetään kuviossa 10.
Esimerkki 30 10 Lys-3:n konstruointi cDNA, joka koodittaa lys-plasminogeenia, jossa natiivi plasminogeenisignaalisek-venssi on Glu(76)-tähteen vieressä, on valmistettu poistamalla glu-plasminogeenin 75 aminoterminaalista aminohappoa "loop out"-mutageneesillä käyttämällä 35meeriä (5'CTGAGAGATACACTTTCTT-TTCTCCTTGACCTGAT 3’). Muuten 15 noudatettiin yleisesti esimerkin 3 menettelytapaa.
Esimerkki 31 Lys-4:n konstruointi Tässä lys-plasminogeenissä 77 aminohappoa signaalisekvenssin Gly(19):n ja glu-plasminogeenin Lys(78):n välissä poistettiin "loop out"-mutageneesillä käyttämällä 20 29meeriä (5'CT G AG AGAT AC ACTTTTCCTT G ACCT G AT 3’)· Muuten noudatettiin yleisesti esimerkin 3 menettelytapaa.
Esimerkki 32 Lys-5:n konstruointi Tässä lys-plasminogeenissa 76 aminohappoa signaalisekvenssin Gly(19):n ja glu-25 plasminogeenn Lys(77):n välissä poistettiin "loop out"-mutageneesillä käyttämällä ; 32meeriä (5'CTGAGAGATACACTTTCTTTCCTTGACCTGAT 3'). Muuten nou- • datettiin yleisesti esimerkin 3 menettelytapaa.
Menetelmät 1) Mungpapunukleaasisulatus 30 10 yksikköä mungpapunukleaasia lisättiin noin 1 μg:aan DNA.ta, joka oli sulatettu restriktioentsyymillä puskurissa, joka sisälsi 30 mM NaOAc pH 5,0, 100 mM NaCl, 28. 105202 2 mM ZnCl, 10 % glyserolia. Mungpapunukleaasia inkuboitiin 37 °C:ssa 30 min ajan, inaktivoitiin 15 min ajan 67 °C:ssa ennen fenoliuuttoa ja etanolisaostusta.
2) Oligonukleotidisynteesi
Oligonukleotidit syntetisoitiin automatisoidulla fosforamidiittikemialla käyttämällä 5 syaanietyylifosforamidiitteja. Metodologia on nykyisin laajalti käytetty, ja se on kuvattu (Beaucage, S.L. ja Caruthers, M.H. Tetrahedron Letters 24 (1981) 245; ja Ca-ruthers, M.H., Science 230 (1985) 281-285).
3) Oligonukleotidien puhdistus
Oligonukleotidit suojauksenpoistokäsiteltiin ja poistettiin CPG-kantajalta inkuboi-10 maila konsentroidussa NH3:ssa. Tyypillisesti 50 mg CPG:tä sisältäen 1 pmol oligo-nukleotidia suojauksenpoistokäsiteltiin inkuboimalla 5 tunnin ajan 70 °C:ssa 600 piissä konsentroitua NH3:a. Supematantti siirrettiin tuoreeseen putkeen, ja oli-gomeeri saostettiin 3 tilavuudella etanolia. Sentrifugoinnin jälkeen pelletti kuivattiin ja suspendoitiin uudelleen 1 ml:aan vettä. Sitten raakaoligomeerin konsentraatio 15 määritettiin mittaamalla absorbanssin 260 nm: llä.
Geelipuhdistusta varten 10 absorbanssiyksikköä raakaa oligonukleotidia kuivattiin ja suspendoitiin uudelleen 15 pliaan merkkiväriä (90 % deionisoitua formamidia, 10 mM tris, 10 mM boraattia, 1 mM EDTA, 0,1 % bromifenolisinistä). Näytteitä kuumennettiin 1 min ajan 90 °C:ssa ja lisättiin sitten 1,2 mm paksulle denaturoivalle 20 polyakryyliamidigeelille, jossa oli 1,6 mm levyisiä rakoja. Geeli valmistettiin raaka-aineesta, jossa oli 15 % akryyliamidia, 0,6 % bisakryyliamidia ja 7 M ureaa 1 X ; : TBEissä ja polymeroitiin 0,1 %:lla ammoniumpersulfaattia ja 0,025 %:lla TEMEDiiä. Geeliä ajettiin ensin 1 tunnin ajan. Näytteitä ajettiin 1500 Villa 4-5 tunnin ajan. Vyöhykkeet tehtiin näkyviksi UV-varjostuksella, ja kokopitkää tuotetta 25 vastaavat leikattiin pois ja siiiTettiin mikroputkiin. Oligomeerit eluoitiin geelisiivusta liottamalla AGEBissä (0,5 M ammoniumasetaattia, 0,01 M magnesiumasetaattia ja 0,1 % SDSiää) yön yli. Sitten AGEB-puskuri siirrettiin tuoreisiin putkiin, ja oligo-; meeri saostettiin kolmella tilavuudella etanolia 70 °C:ssa 15 min ajan. Sakka kerät tiin sentrifugoimalla Eppendorf-mikrosentrifugissa 10 min ajan, pelletti pestiin 80 % 30 etanolissa, puhdistettu oligomeeri kuivattiin, liuotettiin uudelleen 1 mliaan vettä, ja-suodatettiin lopuksi 0,45 pm mikrosuodattimen kanssa. (Sana EPPENDORF on tavaramerkki.) Puhdistetun tuotteen konsentraatio mitattiin määrittämällä sen absor-banssi 260 nmillä.
29 105202 4) Oligomeerien kinasointi 100 pmol oligomeeriä kuivattiin ja suspendoitiin uudelleen 20 pl:aan kinaasipusku-ria (70 mM Tris pH 7,6, 10 mM MgCl2, 1 mM ATP, 0,2 mM spermidiiniä, 0,5 mM ditiotreitolia). Lisättiin 10 u T4-polynukleotidikinaasia, ja seosta inkuboitiin 5 37 °C:ssa 30 min ajan. Sitten kinaasi inaktivoitiin kuumentamalla 70 °C:ssa 10 min ajan.
5) Dideoksisekvensointi Käytettiin työohjetta oleellisesti kuvatulla tavalla (Biggin, M.D., Gibson, T.J., Hong, G.F., P.N.A.S. 80 (1983) 3963-3965). Milloin sopivaa, menetelmää modifi-10 oitiin sallimaan sekvensoinnin plasmidi-DNA:lla tavalla, joka on kuvattu (Guo, L-H., Wu R., Nucleic Acids Research 11 (1983) 5521-5540).
6) Transformointi
Transformointi suoritettiin vakiomenettelytapoja käyttämällä. Kanta, jota käytettiin vastaanottajana kloonauksessa plasmidivektoreita käyttämällä, oli HW87, jolla on 15 seuraava genotyyppi: araD139(ara-leu)del7697 (lacIPOZY)del74 galU galK hsdR rpsL srl recA56 RZ1032 on E. colin johdannainen, jolta puuttuu kaksi DNA-metabolian entsyymiä: (a) dUTPaasi (dut), josta on seurauksena solunsisäisen dUTP.n suuri konsentraatio, 20 ja (b) urasiili-N-glykosylaasi (ung), joka on vastuussa väärin sisällytettyjen urasiili-en poistamisesta DNA:sta (Kunkel et ai., Methods in Enzymol., 154 (1987) 367-382). Sen tärkein etu on, että nämä mutaatiot johtivat suurempaan mutanttien taajuuteen kohtasuunnatussa mutageneesissä. RZ1032:lla on seuraava genotyyppi:
HfrKL16P0/45[lysA961-62), dutl, ungl, thil, re[A], 25 Zbd-279::TnlO supE44 « JM103 on vakiovastaanottajakanta yhdistelmä-DNA-tekniikoissa, joissa M13-peräi-set vektorit ovat osallisina.
7) Kohtasuunnattu mutageneesi
Kinasoitu mutageneesialuke (2,5 pmol) emäspariutettiin yksisäikeiseen templaatti-30 DNA:han, joka valmistettiin käyttämällä RZ1032:ta isäntänä, (1 pg) lopullisessa re- 30 . 105202 aktioseoksessa, jossa tilavuudeltaan 10 μ1 sisältäen 70 mM Tris, 10 mM MgCl2. Re-aktioseos polypropyleenimikrokoeputkessa (EPPENDORF) sijoitettiin 3 minuutiksi maljaan, joka sisälsi 250 ml vettä 70 °C:ssa, minkä jälkeen 30 minuutiksi 37 °C:ssa. Sitten emäspariutettu seos sijoitettiin jäihin ja lisättiin seuraavat reagenssit: 1 μΐ 10 5 X TM (700 mM Tris, 100 mM MgCl2 pH 7,6), 1 μΐ seosta, jossa oli kaikkia 4 deoksiribonukleotiditrifosfaattia kutakin tasolla 5 mM, 2 μΐ T4-DNA-ligaasia (100 u), 0,5 μΐ DNA-polymeraasin Klenow-fragmenttia ja 4,5 μΐ vettä. Sitten poly-meraasireaktioseosta inkuboitiin 15 °C:ssa 4-16 tunnin ajan. Kun reaktio oli edennyt loppuun, lisättiin 180 μΐ TE:tä (10 mM Tris, 1 mM EDTA pH 8,0), ja mutageneesi-10 seosta säilytettiin -20 °C:ssa.
Sitten seos siirrettiin mutanttikloonien erotusta varten vastaanottaja-JM 103 :een seu-raavalla tavalla. 5 ml yön yli kasvatettua JM103:a 2 X YT (1,6 % Bactotryptone, 1 % hiivauutetta, 1 % NaCl) laimennettiin 1:100 50 ml:aan esilämmitettyä 2 X YT:tä. Viljelmää kasvatettiin 37 °C:ssa ilmastaen, kunnes A^o saavutti 0,4. Solut 15 pelletoitiin ja suspendoitiin uudelleen 0,5 tilavuuteen 50 mM CaCl2:ta ja pidettiin jäissä 15 min ajan. Sitten solut pelletoitiin uudelleen 4 °C:ssa ja suspendoitiin uudelleen 2,5 ml:aan kylmää 50 mM CaCl2:ta. Transfektointia varten lisättiin 0,25, 1, 2, 5, 20 ja 50 μΐ erät mutageneesiseosta 200 pl.aan kompetentteja soluja, joita pidettiin jäissä 30 min ajan. Sitten soluja lämpöshokkikäsiteltiin 42 °C:ssa 2 min ajan. Sitten 20 jokaiseen putkeen lisättiin 3,5 ml pehmeää YT-agaria, joka sisälsi 0,2 ml kasvatuksen eksponentiaalisen vaiheen loppuosan JM103:a, sisältöä sekoitettiin lyhyesti ja kaadettiin sitten ennalta lämmitetyn levyn pinnalle sisältäen 2 X YT:tä, joka oli kiinteytetty 1,5 %:lla agaria. Pehmeä agarkerros sai kovettua, ja sitten levyjä inkuboitiin 37 °C:ssa yön yli.
25 Sitten eristetyistä klooneista valmistettiin yksisäikeinen DNA seuraavalla tavalla: yksittäisiä täpliä poimittiin 4 ml:aan 2 X YT:tä, joka oli siirrostettu 10 ^l:lla tuoretta yön yli kasvatettua JM 103.a 2 X YT.ssä. Viljelmää sekoitettiin kiivaasti 6 tunnin ajan. Sitten poistettiin 0,5 ml viljelmää ja lisättiin 0,5 ml:aan 50 % glyserolia, jolloin saatiin vertailukanta, jota säilytettiin -20 °C:ssa. Viljelmän loppuosa sentrifiigoitiin 30 solujen poistamiseksi, ja 1 ml supematanttia, joka sisälsi faagipartikkeleita, siirrettiin tuoreeseen EPPENDORF-putkeen. Sitten lisättiin 250 μΐ 20 % PEG6000:ta, 250 mM NaCl, sekoitettiin, ja putkia inkuboitiin jäissä 15 min ajan. Sitten faagia pelletoitiin nopeudella 10 000 r/min 10 min ajan, supematantti heitettiin pois, ja putket sentrifiigoitiin uudelleen PEG-liuoksen viimeisten jälkien poistamiseksi, jotka 35 voitiin sitten poistaa ja heittää pois. Faagipelletti suspendoitiin perusteellisesti uudelleen 200 μl:aan TENiä (10 mM Tris, 1 mM EDTA, 0,3 M NaOAc). DNA eris- 3i . 105202 tettiin uuttamalla yhtä suurella tilavuudella Tris-kyllästettyä fenolia. Faasit erotettiin lyhyellä sentrifugoinnilla, ja vesifaasi siirrettiin puhtaaseen putkeen. DNA uutettiin uudelleen seoksella, jossa oh 100 μΐ fenolia, 100 μΐ kloroformia, ja faasit erotettiin jälleen sentrifiigoimalla. Fenolijäänteet poistettiin kolmella seuraavalla uutolla klo-5 reformilla, ja DNA eristettiin lopulta saostamalla 2,5 tilavuudella etanolia -20 °C:ssa yön yli. DNA:ta pelletoitiin nopeudella 10 000 r/min 10 min ajan, pestiin 70 % etanolissa, kuivattiin ja suspendoitiin lopulta uudelleen 50 pilaan TE:tä.
8) Elektroporaatio
Kiinanhamsterin munasaijasoluja (CHO) tai hiiren myeloomasolulinjaa p3x63-10 Ag8.653 kasvatettiin ja kerättiin logaritmisen kasvuvaiheen puolivälissä. Solut pes tiin ja suspendoitiin uudelleen PBSiään ja laskettiin elävät solut. Sitten solut pelletoitiin ja suspendoitiin uudelleen tasolle 1 X 107 solua/ml. 40 pg linearisoitua DNA.ta lisättiin 1 ml:aa soluja ja annettiin seistä jäissä 15 min ajan. Soluihin lisättiin yksi pulssi 800 V/25 pF käyttämällä kaupallisesti saatavaa elektroporaatiolaitet-15 ta (BIORAD GENE PULSER tavaramerkki). Soluja inkuboitiin jäissä edelleen 15 min ajan, ja siirrostettiin sitten joko 10 X 96-kaivoisiin levyihin, joissa oli 200 pl tasapainotettua väliainetta/kaivo (DMEM, 5 % FCS, Pen/Strep, glutamiini) tai 10 x 15 cm maljoille, joissa oli 15 ml väliainetta kussakin maljassa ja inkuboitiin yön yli. 24 tunnin kuluttua väliaine poistettiin ja korvattiin valikoivalla väliaineella, joka si-20 sälsi ksantiinia (250 pg/ml), mykofenolihappoa (5 pg/ml) ja 1 x hypoksantiinitymi-diiniä (HT). Soluja syötettiin joka kolmas päivä.
Noin 14 päivän kuluttua gpt-resistenttejä kolonioita ilmenee joissain kaivoissa ja le-. vyillä. Levyt seulottiin plasminogeenin suhteen poistamalla erä väliainetta kustakin kaivosta tai levystä ja määrittämällä ELISA-määritystä käyttämällä. Plasminogeeniä 25 tuottavat kloonit kasvatettiin suurempaan mittakaavaan, ja ekspressiotasoa tarkkailtiin parhaan tuottajan valinnan mahdollistamiseksi.
9) ELISA ihmisen plasminogeeniä varten ELISA-levyjä (Pro-Bind, Falcon) päällystetään määrällä 50 pl/kaivo vuohi-anti-ihminen-plasminogeeniseerumia (Sigma) laimennettuna 1:1000 päällystyspuskurissa 30 (4,0 g Na2CO3(10.H2O), 2,93 g NaHC03/I H20, pH 9,6) ja inkuboitiin yön yli 4 °C:ssa. Sitten päällystysliuos poistetaan, ja levyt suojataan inkuboimalla 50 pl:lla/kaivo PBS:ää/0,l % kaseiinia huoneenlämpötilassa 15 min ajan. Sitten levyt pestään kolmesti PBS/0,05 % Tween 20:llä. Levylle lisätiin plasminogeeninäyt-teet tai standardit laimennettuna PBS/Tweeniin, ja inkuboidaan huoneenlämpötilas- 32 105202 sa 2 tunnin ajan. Sitten levyt pestään kolmesti PBS/Tweenillä, ja sitten lisätään 50 μΐ/kaivo l.TOOO-laimennosta PBS/Tweenissä monoklonaalista anti-ihminen-plas-minogeenivasta-ainetta (American Diagnostica, New York, USA), ja inkuboidaan huoneenlämpötilassa 1 tunnin ajan. Levyt pestään jälleen kolmesti PBS/Tweenillä, 5 ja sitten lisätään 50 μΐ/kaivo piparjuuriperoksidaasikonjugoituna vuohi-anti-hiiri-IgG:tä (Sigma), ja inkuboidaan huoneenlämpötilassa 1 tunti. Levyt pestään viidesti PBS/Tweenillä, ja inkuboidaan sitten 100 μ1:η kanssa kaivoa kohden peroksidaasi-substraatilla (0,1 M natriumasetaatti/sitruunahappopuskuri, pH 6,0 sisältäen 100mg/l 3,3',5,5'-tetrametyylibentsidiiniä ja 13 mM H202:ta. Reaktio pysäytetään 10 noin 5 min kuluttua lisäämällä 25 μΐ/kaivo 2,5 M rikkihappoa, ja absorbanssi 450 nm:llä luetaan levynlukijalla.
10) Plasminogeenivarianttien puhdistus
Plasminogeenivariantit puhdistetaan yhdessä ainoassa vaiheessa kromatografoimalla lysiini-SEPHAROSE 4B:llä (Pharmacia). Kolonni tasapainotetaan ainakin 10 kolon-15 nitilavuudella 0,05 M natriumfosfaattipuskuria, pH 7,5. Kolonniin lisätään tasapainotettua väliainetta suhteessa 1 ml hartsia/0,6 mg plasminogeenivarianttia määritettynä ELISA:lla käyttäen standardina ihmis-glu-plasminogeeniä. Tyypillisesti 400 ml tasapainotettua väliainetta, joka sisältää plasminogeenia, lisätään 10 ml kolonniin (korkeus:halkaisija = 4) lineaarisella virtausnopeudella 56 ml/cm/h 4 °C:ssa. Kun li-20 säys on suoritettu loppuun, kolonni pestään vähintään 5 kolonnitilavuudella 0,05 M fosfaattpuskuria, pH 7,5, sisältäen 0,5 M NaCkää, kunnes eluoitava ei-spesifisesti sitoutunut proteiini loppuu. Sitoutuneen plasminogeenin desorptio saavutetaan lisäämällä 0,2 M epsilon-amino-kapronihappoa deionisoidussa vedessä, pH 7,0. Elu-ointi vaatii 2 kolonnitilavuutta, ja se suoritetaan lineaarisella virtausnopeudella 25 17 ml/cm/h. SDS-PAGE:lla analysoinnin jälkeen puhtauden tarkastamiseksi epsilon- amino-kapronihappo poistetaan seuraavaksi ja korvataan sopivalla puskurilla, esimerkiksi Tris, PBS, HEPES tai asetaatti, kromatografoimalla esipakatuilla kertakäyttöisillä PD10-kolonneilla, jotka sisältävät SEPHADEX G-25 M:ää (Pharmacia). (Sana SEPHADEX on tavaramerkki.) Tyypillisesti käsitellään 2,5 ml kutakin plas-;; 30 minogeenimutanttia konsentraatiossa 0,3 mg/ml valmistajien ohjeiden mukaisesti.
Sitten yhdistetään fraktiot, jotka sisältävät plasminogeeniä, A2so:llä määritettynä.
11) Katkaisu
Plasminogeenianalogeilla määritetään alttius katkaisulle proteolyyttisillä aktivaatto-. reillä käyttämällä SDS-PAGEa pelkistävissä olosuhteissa. Tyypilliset inkubointitila- 35 vuudet 0,125 ml 100 mM Tris HCkssä, pH 7,4 ja 1 mM Ca2+:ssa koostuvat plasmi- 33. 105202 nogeenianalogista esimerkeissä esitetyissä konsentraatioissa, ja aktivaattoreista tekijä Xa tai trombiini esimerkeissä esitetyissä konsentraatioissa. Inkuboinnit suoritetaan 37 °C:ssa. Kontrolli-inkuboinnit suoritetaan samoissa olosuhteissa ilman akti-vaattorien läsnäoloa. Aktivaatioreaktiot pysäytettiin saostamalla proteiini lisäämällä 5 trikloorietikkahappoa lopulliseen konsentraatioon 20 % ja antamalla seistä 4 °C:ssa >4 tunnin ajan. Sitten sakat pelletoitiin, pestiin asetonilla ja suspendoitiin uudelleen SDS-PAGE-näytepuskuriin (0,1 m Tris pH 6,8, 10 % glyseroli, 1 % SDS, 0,5 % merkaptoetanolia ja 0,05 % bromifenolisinistä). Näytteet analysoitiin joko 8-25 % gradienttigeeleillä tai 12 % geeleillä. Tulokseksi saadut geelit analysoitiin käyttä-10 mällä SHIMADZU-geelinlukulaitetta, joka lukee geelin ja laskee vyöhykkeissä olevan proteiinin konsentraation määrittämällä huippujen alla olevan alueen. (Sana SHIMADZU on tavaramerkki.) Täten määritettiin plasminogeenin katkaisunopeus mittaamalla plasminogeenivyöhykkeen katoaminen noin 92 kDa:ssa, ja plasmiinin raskaan leijun vyöhykkeen ilmaantumisen noin 66 kDa:ssa.
15 12) Aktivointi 12.1 Fibriiniverihyytymänliuotusmääritys
Fibriininliuotusmäärityksessä plasmiiniaktiivisuus määritetään tyhjän vyöhykkeen kehittymisen ilmenemisellä (johtuen fibriinin liukenemisesta) fibriiniagaroosigeelis-sä. Geeli valmistetaan 1 % alhaisen geeliytymislämpötilan agaroosigeeliin, joka on 20 puskuroitu 0,1 M Tris HC1 pH 7,4, 0,15 M NaCl, 2 mM CaCl2:een lisäämällä plasminogeenivapaata fibrinogeeniä liuotettuna 0,9 %:iin (paino/tilavuus) NaCl, lopulliseen konsentraatioon 1 mg/ml. 6 yksikköä trombiinia lisätään fibrinogeenin muuttamiseksi fibriiniksi, ja sitten liuos kaadetaan GEL-BOND-arkille ja jätetään : kovettumaan. (Sana GEL-BOND on tavaramerkki.) Ennen käyttöä geeliin läviste- 25 tään kaivoja, ja agaroosipalat poistetaan. 5-10 μΐ näytteet lisätään kaivoihin, ja geeliä inkuboidaan kosteuskammiossa 37 °C:ssa yön yli (17-20 tuntia), tai vyöhykkeen liukenemisen ilmestymiseen sopivan ajan. Sitten geeliä liotetaan 7,5 % etikkahapos-sa 1 tunnin ajan, värsätään nopeassa vihreässä (2 % liuos) 1-10 min ajan, ja värin-poistokäsitellään sitten 40 % metanolilla, 10 % etikkahapolla ainakin 2 tunnin ajan.
;; 30 Sitten geeli valutetaan ja sijoitetaan 37 °C:seen yön yli kuivumaan. Liukenemisvyö- hykkeiden halkaisija voidaan mitata ja verrata standardien mukaisiin, esimerkiksi villityyppiplasminogeeni, joka on aktivoitu tPA:lla tai u-PA:lla.
12.2 Suora kromogeeninen määritys ja aktivaatio ajan funktiona . Plasminogeenianalogia (12,5 μg) inkuboitiin trombiinin (2,8 μg) kanssa 37 °C:ssa 35 125 μΐιβββ puskuria, joka sisältää 100 mM Tris HC1, pH 7,4 ja 1 mM CaC^. Pois- 34. 105202 tettiin eriä aikavälein ja määritettiin plasmiinipitoisuus kromogeenisessä määrityksessä, joka kuvataan jäljempänä. Kun trombiinia käytettiin aktivaattorina, trombiini-inhibiittoria, hirudiinia, lisättiin vähäisessä moolisessa ylimäärässä aktivaatioreakti-on pysäyttämiseksi, ja näytteitä säilytettiin -70 °C:ssa. Kun tekijää Xa käytettiin ak-5 tivaattorina, näytteet pikapakastettiin välittömästi aktivaatioreaktion pysäyttämiseksi. Plasmiini mitattiin käyttämällä tripeptidikromogeenisen substraatin, S2251:n (Kabi) katkaisua. Erät näytettä (25 μΐ) sekoitettiin 75 μ1:η kanssa puskuria (50 mM Tris HC1, 0,1 M EDTA, 0,0005 % Triton X100, pH 8,0), joka sisälsi 0,6 mM S2251, 96-kaivoisissa levyissä (Costar). Levyjä inkuboitiin 37 °C:ssa 2 tunnin ajan. 10 Reaktio määritettiin lisäämällä 25 μΐ 0,5 M etikkahappoa, ja absorbanssi luettiin 405 nm:llä käyttämällä automaattista levynlukijaa (Dynatech). Kvantisointi suoritettiin vertaamalla plasmiinin standardivalmisteen kanssa.
12.3 Liitetyn kromogeenin määritys
Kromogeenisesta määrityksestä kehitettiin modifikaatio mittaamaan mutanttiplasmi-15 nogeenien aktivaatiota ajan funktiona suoremmin. Tässä määrityksessä mutantti-plasminogeeniä ja aktivaatiolla inkuboidaan yhdessä S2251 :n läsnä ollessa, ja aktivaatiolla muodostunut plasmiini katkaisee kromogeenisen substraatin suoraan johtaen absorbanssin kasvuun 405 nm.llä. Määritys suoritettiin kokonaistilavuudessa 880 μΐ puskurissa, joka sisälsi 50 mM Tris HC1, 0,1 mM EDTA, 0,005 % Triton 20 Xl 00 ja 0,1 % HS A. Kromogeenista substraattia S2251 lisättiin lopulliseen konsent- raatioon 0,35 mg/ml, ja käytetty mutanttiproteiinikonsentraatio oli 3 pg/ml. Trom-biiniaktivaation tapauksessa trombiinia lisättiin lopulliseen konsentraatioon 1 tai 0,2 pg/ml. Tekijää Xa lisättiin lopulliseen konsentraatioon 1,5 tai 0,3 pg/ml. 100 μΐ : erät reaktiota poistettiin aikavälein ja lisättiin reaktion pysäyttämiseksi 25 pl:aan 25 4 % etikkahappoa mikrotiitterilevyillä. Ajan kuluttua loppuun levyt luetaan mikrole- vynlukijalla aallonpituudella 405 nm. Tässä määrityksessä ei yritetty plasmiinin muodostumisen kvantisointia.
• » • I -

Claims (6)

105202
1. Menetelmä plasminogeenianalogin valmistamiseksi, joka analogi on aktivoita vissa veren hyytymiseen liittyvällä entsyymillä plasmiiniaktiivisuutta omaavaksi, tunnettu siitä, että transfektoidaan tai transformoidaan isäntäsolu ilmentämisvekto-5 rilla, joka sisältää mainittua plasminogeenianalogia koodaavan DNA-sekvenssin, viljellään solua sopivassa kasvualustassa sellaisissa olosuhteissa, jotka mahdollistavat plasminogeenianalogin ilmentymisen ja otetaan talteen plasminogeenianalogi viljelyalustasta, ja että veren hyytymiseen liittyvä entsyymi on kallikreiini, tekijä Xlla, XIa, IXa, Vila, Xa, trombiini (tekijä Ha) tai aktivoitu proteiini C.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että plasminogee nianalogi sisältää katkaisukohtasekvenssin a) P4-P3-Gly-Arg, jossa P4 on hydrofobinen tähde ja P3 on hapan tähde, b) P4-P3-Pro-Arg-Pl'-P2', jossa sekä P4 että P3 on toisesta riippumattomasti hydrofobinen tähde ja sekä ΡΓ että P2' on riippumattomasti ei-hapan tähde, c) P2-Arg-Pl', jossa toinen tähteistä P2 ja ΡΓ on glysiini ja 15 toinen on mikä hyvänsä aminohappotähde, ja d) Gly-Pro-Arg.
3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että analogi sisältää 1 tai useita muita modifikaatioita (verrattuna villityyppi-glu-plasminogee-niin), jotka voivat olla 1 tai useita additioita, deleetioita tai substituutioita.
4. Synteettinen tai yhdistelmä-DNA-nukleiinihappo, tunnettu siitä, että se koo-20 dittaa plasminogeenianalogia, joka on aktivoitavissa veren hyytymiseen liittyvällä entsyymillä plasmiiniaktiivisuutta omaavaksi, joka entsyymi on kallikreiini, tekijä Xlla, XIa, IXa, Vila, Xa, trombiini (tekijä Ha) tai aktivoitu proteiini C.
5. Vektori, tunnettu siitä, että se sisältää patenttivaatimuksen 4 mukaisen ensimmäisen nukleiinihapon, joka koodittaa plasminogeenianalogia tai siihen liittyy kloo- 25 nauskohta, joka on toimintakykyisesti liittynyt toiseen nukleiinihapposekvenssiin, joka sisältää vahvan promoottori- ja edistäjäsekvenssin, joka on johdettu ihmisen sytomegaloviruksesta, kolmannen nukleiinihapposekvenssin, joka koodittaa poly-adenylointisekvenssiä, joka on johdettu SV40:stä, ja neljännen nukleiinihapposekvenssin, joka koodittaa valittavissa olevaa gpt-merkkiä, joka ekspressoituu SV40-30 promoottorista ja jossa on lisäksi SV40-polyadenylointisignaali valittavissa olevan merkki sekvenssin 3'-päässä.
6. Solu tai solulinja, tunnettu siitä, että se on valmistettu transformoimalla tai : transfektoimalla solu tai solulinja patenttivaatimuksen 4 mukaisella nukleiinihapolla tai patenttivaatimuksen 5 mukaisella vektorilla. 36 . 105202
FI922610A 1989-12-07 1992-06-05 Menetelmä aktivoitavien fibrinolyyttisten ja veren hyytymistä estävien plasminogeenianalogien valmistamiseksi FI105202B (fi)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB8927722 1989-12-07
GB898927722A GB8927722D0 (en) 1989-12-07 1989-12-07 Proteins and nucleic acids
PCT/GB1990/001912 WO1991009118A2 (en) 1989-12-07 1990-12-07 Activatable fibrinolytic and anti-thrombotic proteins
GB9001912 1990-12-07

Publications (3)

Publication Number Publication Date
FI922610A FI922610A (fi) 1992-06-05
FI922610A0 FI922610A0 (fi) 1992-06-05
FI105202B true FI105202B (fi) 2000-06-30

Family

ID=10667597

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI922609A FI922609A (fi) 1989-12-07 1992-06-05 Proteiner och nukleinsyror.
FI922610A FI105202B (fi) 1989-12-07 1992-06-05 Menetelmä aktivoitavien fibrinolyyttisten ja veren hyytymistä estävien plasminogeenianalogien valmistamiseksi

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI922609A FI922609A (fi) 1989-12-07 1992-06-05 Proteiner och nukleinsyror.

Country Status (21)

Country Link
US (2) US5637492A (fi)
EP (2) EP0504241A1 (fi)
JP (2) JP2851423B2 (fi)
KR (2) KR920703818A (fi)
AT (1) ATE155812T1 (fi)
AU (3) AU644399B2 (fi)
CA (2) CA2069085C (fi)
DE (1) DE69031127T2 (fi)
DK (1) DK0502968T3 (fi)
ES (1) ES2106073T3 (fi)
FI (2) FI922609A (fi)
GB (1) GB8927722D0 (fi)
GR (1) GR3024990T3 (fi)
HU (1) HU211628A9 (fi)
IE (2) IE904416A1 (fi)
IL (2) IL96602A0 (fi)
NO (2) NO305562B1 (fi)
NZ (2) NZ236330A (fi)
PT (2) PT96104A (fi)
WO (2) WO1991009118A2 (fi)
ZA (2) ZA909854B (fi)

Families Citing this family (59)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CU22277A1 (es) * 1990-05-23 1995-01-31 Cigb Procedimiento para el aislamiento y expresion de un gen codificante para estreptoquinasa,secuencia nucleotidica obtenida,adn recombinantes y microorganismos transformados
GB9222758D0 (en) * 1992-10-29 1992-12-09 British Bio Technology Proteins and nucleic acids
GB9216558D0 (en) * 1992-08-04 1992-09-16 British Bio Technology Modified proteases
GB2286190B (en) * 1992-10-29 1996-05-01 British Biotech Pharm Thrombin activatable plasminogen derivatives
DE4323754C1 (de) * 1993-07-15 1994-12-01 Gruenenthal Gmbh Bifunktionelle Urokinasevarianten mit verbesserten fibrinolytischen Eigenschaften und thrombinhemmender Wirkung
CN1113389A (zh) * 1993-08-04 1995-12-13 西巴-盖尔基股份公司 高分子量的脱硫水蛭素
ES2080657B1 (es) * 1993-09-27 1996-11-01 Britisch Bio Technology Limite Proteasas modificadas.
US5837682A (en) 1996-03-08 1998-11-17 The Children's Medical Center Corporation Angiostatin fragments and method of use
US5945403A (en) 1997-05-30 1999-08-31 The Children's Medical Center Corporation Angiostatin fragments and method of use
CN1309833C (zh) * 1994-04-26 2007-04-11 儿童医学中心公司 血管生成抑制素及其在制备药物中的用途
GB9412131D0 (en) * 1994-06-17 1994-08-10 British Bio Technology Thrombolytic composition
DE4440892A1 (de) * 1994-11-17 1996-05-23 Gruenenthal Gmbh Proteine mit fibrinolytischen und gerinnungshemmenden Eigenschaften
DE4442665A1 (de) * 1994-11-30 1996-06-05 Gruenenthal Gmbh Chimäre Proteine mit fibrinolytischen und thrombinhemmenden Eigenschaften
US5854049A (en) * 1995-06-09 1998-12-29 President And Fellows Of Harvard College Plasmin-resistant streptokinase
US5736364A (en) * 1995-12-04 1998-04-07 Genentech, Inc. Factor viia inhibitors
US6461640B1 (en) 1995-12-08 2002-10-08 Board Of Regents, The University Of Texas System Local delivery of fibrinolysis enhancing agents
KR20000029755A (ko) * 1996-08-02 2000-05-25 로셰 디아그노스틱스 게엠베하 트롬빈에의해활성화될수있는플라스미노겐활성화제
EP0983303B1 (en) * 1997-05-21 2006-03-08 Biovation Limited Method for the production of non-immunogenic proteins
PT947585E (pt) 1998-03-19 2001-11-30 Instrumentation Lab Spa Metodo in vitro melhorado, kits e reagentes para a peaquisa de defeitos de coagulacao sanguinea
AU5571799A (en) 1998-08-20 2000-03-14 University Of Vermont And State Agricultural College, The Angiogenesis inhibitors and uses thereof
IN190822B (fi) * 1998-12-24 2003-08-23 Council Scient Ind Res
US6677473B1 (en) 1999-11-19 2004-01-13 Corvas International Inc Plasminogen activator inhibitor antagonists
US6423826B1 (en) 2000-06-30 2002-07-23 Regents Of The University Of Minnesota High molecular weight derivatives of vitamin K-dependent polypeptides
US20030211094A1 (en) 2001-06-26 2003-11-13 Nelsestuen Gary L. High molecular weight derivatives of vitamin k-dependent polypeptides
US7160540B2 (en) 2000-06-30 2007-01-09 Regents Of The University Of Minnesota Methods for detecting activity of clottings factors
AU8591901A (en) * 2000-09-05 2002-03-22 Karolinska Innovations Ab Materials and methods relating to endothelial cell growth inhibitors
DE10108212A1 (de) * 2001-02-20 2002-08-22 Aventis Pharma Gmbh Fusionsprotein zur Sekretion von Wertprotein in bakterielle Überstände
DE10108211A1 (de) * 2001-02-20 2002-08-22 Aventis Pharma Gmbh Verwendung von Fusionsproteinen, deren N-terminaler Anteil aus einem Hirudinderivat besteht, zur Herstellung rekombinanter Proteine über Sekretion durch Hefen
US7638618B2 (en) 2001-02-20 2009-12-29 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Nucleic acids encoding a hirudin and pro-insulin as superscretable peptides and for parallel improvement of the exported forms of one or more polypeptides of interest
DE10108100A1 (de) * 2001-02-20 2002-08-29 Aventis Pharma Gmbh Verwendung supersekretierbarer Peptide in Verfahren zu deren Herstellung und paralleler Verbesserung der Exportate eines oder mehrerer anderer Polypeptide von Interesse
US7202059B2 (en) 2001-02-20 2007-04-10 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Fusion proteins capable of being secreted into a fermentation medium
FR2831170B1 (fr) * 2001-10-19 2004-03-19 Inst Nat Sante Rech Med Proteines c modifiees activables directement par la thrombine
CN101044154A (zh) * 2002-02-14 2007-09-26 威廉·J·鲁特 治疗宿主中切割的嵌合分子
CN1480466A (zh) * 2002-09-03 2004-03-10 �й������ž�����ҽѧ��ѧԺ����ҽ 一类溶栓抗凝双功能融合蛋白及应用
US7985401B2 (en) 2003-10-31 2011-07-26 The Regents Of The University Of California Peptides whose uptake by cells is controllable
WO2011008992A2 (en) * 2009-07-15 2011-01-20 The Regents Of The University Of California Peptides whose uptake in cells is controllable
US9695251B2 (en) 2003-10-31 2017-07-04 The Regents Of The University Of California Activatable cell penetrating peptides with quenched fluorophores
EP1867660A1 (en) 2006-06-14 2007-12-19 CSL Behring GmbH Proteolytically cleavable fusion protein comprising a blood coagulation factor
US7939632B2 (en) 2006-06-14 2011-05-10 Csl Behring Gmbh Proteolytically cleavable fusion proteins with high molar specific activity
ES2889920T3 (es) 2006-06-14 2022-01-14 Csl Behring Gmbh Proteínas de fusión escindibles proteolíticamente con alta actividad específica molar
WO2008054592A2 (en) * 2006-09-29 2008-05-08 Proteomtech, Inc. Methods for production of recombinant plasminogen and plasmin polypeptides
CN1970574B (zh) * 2006-12-08 2010-08-25 中国药科大学 溶栓和抗凝双重功效融合蛋白、制备方法及其应用
JP5448839B2 (ja) 2006-12-22 2014-03-19 ツェー・エス・エル・ベーリング・ゲー・エム・ベー・ハー インビボで長い半減期を有する修飾された凝固因子
US8501449B2 (en) 2007-12-04 2013-08-06 Proteon Therapeutics, Inc. Recombinant elastase proteins and methods of manufacturing and use thereof
WO2010045518A1 (en) * 2008-10-16 2010-04-22 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions containing thrombomodulin domains and uses thereof
SG2014012918A (en) 2009-02-11 2014-04-28 Novozymes Biopharma Dk As Albumin variants and conjugates
RU2607374C2 (ru) 2009-10-30 2017-01-10 Новозаймс Байофарма Дк А/С Варианты альбумина
CA2807749C (en) * 2010-08-05 2023-02-28 Council Of Scientific & Industrial Research Protein fusion constructs possessing thrombolytic and anticoagulant properties
WO2013019681A2 (en) 2011-07-29 2013-02-07 Avelas Biosciences, Inc. Selective delivery molecules and methods of use
US9644196B2 (en) 2011-08-12 2017-05-09 Thrombogenics Nv Plasminogen and plasmin variants
US20140315817A1 (en) 2011-11-18 2014-10-23 Eleven Biotherapeutics, Inc. Variant serum albumin with improved half-life and other properties
PL2825556T3 (pl) 2012-03-16 2018-10-31 Albumedix A/S Warianty albuminy
CA2890766A1 (en) 2012-11-08 2014-05-15 Novozymes Biopharma Dk A/S Albumin variants
WO2014120837A2 (en) 2013-01-29 2014-08-07 The Regents Of The University Of California Pretargeted activatable cell penetrating peptide with intracellulary releaseable prodrug
KR102278630B1 (ko) 2013-01-30 2021-07-16 아벨라스 바이오사이언시즈 인코포레이티드 선택적 전달 분자 및 사용 방법
CN105007722A (zh) 2013-02-16 2015-10-28 诺维信生物制药丹麦公司 药代动力学动物模型
US10385380B2 (en) 2014-10-02 2019-08-20 The Regents Of The University Of California Personalized protease assay to measure protease activity in neoplasms
US10596259B2 (en) 2015-05-20 2020-03-24 The Regents Of The University Of California Tumor radiosensitization with monomethyl auristatin E (MMAE) and derivatives thereof
CA2989966C (en) 2015-08-20 2024-04-30 Albumedix A/S Albumin variants and conjugates

Family Cites Families (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US1897087A (en) * 1927-12-14 1933-02-14 Tamarin Bernard Jacques Vacuum cleaner cord control device
US3608333A (en) * 1968-06-20 1971-09-28 Bison Mfg Co Inc Vacuum cleaner and power unit
US4880776A (en) * 1983-12-24 1989-11-14 Beecham Group P.L.C. Plasmin A-chain urokinase B-chain hybrid protein
GB8334498D0 (en) * 1983-12-24 1984-02-01 Beecham Group Plc Compounds
DE3410437A1 (de) * 1984-03-22 1985-09-26 Bayer Ag, 5090 Leverkusen Verfahren zur herstellung von proteinen
GB8412517D0 (en) * 1984-05-16 1984-06-20 Nagai K Recombinant fusion proteins
US5087564A (en) * 1985-06-20 1992-02-11 Monsanto Company Release of recombinant peptides from polypeptides using V8 endopeptidase
DE3523701A1 (de) * 1985-07-03 1987-01-08 Bayer Ag Verfahren zur herstellung von proteinen und polypeptiden
DE3526995A1 (de) * 1985-07-27 1987-02-05 Hoechst Ag Fusionsproteine, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung
DE3541856A1 (de) * 1985-11-27 1987-06-04 Hoechst Ag Eukaryotische fusionsproteine, ihre herstellung und verwendung sowie mittel zur durchfuehrung des verfahrens
FI882407A (fi) * 1987-05-22 1988-11-23 Zymogenetics Inc Fibrinolytiska proteiner.
US5200340A (en) * 1987-05-22 1993-04-06 Zymogenetics, Inc. Thrombin-activated tissue plasminogen activators
JP2799316B2 (ja) * 1987-06-12 1998-09-17 ヘキスト・マリオン・ルセル株式会社 雑種ヒトプロテインｃおよびその遺伝子工学的製法
PT87869B (pt) * 1987-07-01 1995-03-01 Beecham Group Plc Processo para a preparacao de um activador de plasminogenio hibrido
GB8717430D0 (en) * 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
CA1340802C (en) * 1987-08-15 1999-10-26 Yasuyuki Takahashi Senile amyloid precursor protein and an antibody specific for the same
US5188829A (en) * 1987-08-19 1993-02-23 Sagami Chemical Research Center Rapidly acting prourokinase
CA1340740C (en) * 1987-12-08 1999-09-14 Eileen R. Mulvihill Co-expression in eukaryotic cells
CA1340877C (en) * 1987-12-28 2000-01-18 Takashi Sugiyama Elastase inhibitory polypeptide and process for production thereof by recombinant gene technology
ZA889497B (en) * 1987-12-28 1990-08-29 Lilly Co Eli Vectors and compounds for expression of zymogen forms of human protein c
DE3804600A1 (de) * 1988-02-13 1989-08-24 Basf Ag Mischung aus einer thrombolytisch wirkenden und einer antithrombotischen substanz
GB8809129D0 (en) * 1988-04-18 1988-05-18 Celltech Ltd Recombinant dna methods vectors and host cells
GB8822147D0 (en) * 1988-09-21 1988-10-26 Ciba Geigy Ag Pharmaceutically active combination
WO1990010081A1 (en) * 1989-02-17 1990-09-07 Codon Soluble analogs of thrombomodulin
JPH05500748A (ja) * 1989-05-01 1993-02-18 ザ　ユニバーシティ　オブ　ノートル　ダム　デュ　ラック 真核細胞系でのヒトプラスミノーゲンの発現方法および物質
US5164304A (en) * 1989-05-04 1992-11-17 Sri International Method and vectors for stabilizing hirudin and human laminin b1 expression
US5087572A (en) * 1989-12-01 1992-02-11 Genentech, Inc. Dna encoding human plasminogen modified at the cleavage site
EP0561034B1 (en) * 1991-08-26 1999-06-09 IMMUNO Aktiengesellschaft Direct molecular cloning of a modified chordopox virus genome

Also Published As

Publication number Publication date
DE69031127T2 (de) 1998-02-05
CA2069085C (en) 2000-02-01
NO305562B1 (no) 1999-06-21
AU4497693A (en) 1993-11-18
KR920703803A (ko) 1992-12-18
IE904417A1 (en) 1991-06-19
DK0502968T3 (da) 1998-03-02
CA2069105A1 (en) 1991-06-08
IL96601A (en) 1999-05-09
DE69031127D1 (de) 1997-09-04
PT96103A (pt) 1991-09-30
ZA909853B (en) 1992-08-26
NO922237L (no) 1992-08-06
JPH05502375A (ja) 1993-04-28
KR920703818A (ko) 1992-12-18
IE81046B1 (en) 1999-12-01
AU6965691A (en) 1991-07-18
FI922609A0 (fi) 1992-06-05
AU644399B2 (en) 1993-12-09
EP0502968A1 (en) 1992-09-16
FI922610A (fi) 1992-06-05
HU211628A9 (en) 1995-12-28
NZ236330A (en) 1993-05-26
WO1991009118A3 (en) 1991-10-31
GR3024990T3 (en) 1998-01-30
US5637492A (en) 1997-06-10
JP2851423B2 (ja) 1999-01-27
IL96602A0 (en) 1992-05-25
US5434073A (en) 1995-07-18
PT96104A (pt) 1991-09-30
ZA909854B (en) 1992-08-26
NO922238L (no) 1992-08-06
PT96103B (pt) 1998-08-31
WO1991009118A2 (en) 1991-06-27
IL96601A0 (en) 1991-09-16
FI922610A0 (fi) 1992-06-05
NO922237D0 (no) 1992-06-05
EP0504241A1 (en) 1992-09-23
JPH05502374A (ja) 1993-04-28
AU643247B2 (en) 1993-11-11
GB8927722D0 (en) 1990-02-07
IE904416A1 (en) 1991-07-17
CA2069085A1 (en) 1991-06-08
NZ236401A (en) 1992-03-26
EP0502968B1 (en) 1997-07-23
WO1991009125A1 (en) 1991-06-27
KR100188302B1 (ko) 1999-06-01
NO922238D0 (no) 1992-06-05
AU6954091A (en) 1991-07-18
ATE155812T1 (de) 1997-08-15
FI922609A (fi) 1992-06-05
ES2106073T3 (es) 1997-11-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI105202B (fi) Menetelmä aktivoitavien fibrinolyyttisten ja veren hyytymistä estävien plasminogeenianalogien valmistamiseksi
US9896676B2 (en) Compositions and methods for modulating hemostasis
FI114102B (fi) Menetelmä trombiinin vaikutuksesta pilkkoutuvan plasminogeenianalogin valmistamiseksi
US5688664A (en) Thrombin activatable plasminogen analogues
FI102844B (fi) Menetelmä valmistaa parannettu terapeuttisesti aktiivinen kudosplasmin ogeenin aktivaattori
AU3064989A (en) Modified gene sequences encoding modified tpa and products therefrom
JPH06133780A (ja) 新規なｔ−ＰＡ改変体
JPH06327473A (ja) 新規なｔ−ＰＡ改変体

Legal Events

Date Code Title Description
HC Name/ company changed in application

Owner name: BRITISH BIOTECH PHARMACEUTICALS LIMITED