PT87869B - Processo para a preparacao de um activador de plasminogenio hibrido - Google Patents

Description

presente invento está relacionado com uma enzima fibrinolitica hibrida, sua preparação composição farmacêuticas que a incluem e sua utilização no tratamento de doença trombotica, e com derivados da enzima para usar no tratamento de doenças tromboembó1icas , em parti cular enfarte do miocardio agudo.

A patente Europeia No.O 009 879 descreve derivados de enzimas fibrinoliticas i η v i vo que são uteis como agentes terapêuticos no tratamento de trombose venosa. Os derivados são caracterizados por o sitio catali- ί tico activo nas enzimas ser bloqueado por um grupo que é removível por hidrólise de modo que a constante de velocidade de pseudo-primeira ordem para a hidrólise está na gama de 10'⁶ a 10³ seg’¹ .

EP-0155387 descreve proteina hibrj_ da fibrinoliticamente activa, que compreende uma cadeia de uma protease de 2 cadeias ligada a uma cadeia de uma protease de 2 cadeias diferente ou à mesma cadeia da mesma protease, pelo menos uma das cadeias na proteina hibrida sen. do derivada de uma protease fibrinoliticamente activa, de tal modo que a proteina hibrida tem um sitio catalítico essencial à actividade fibrinolitica que está facultativamente bloqueada por um grupo bloqueador removível.

Exemplos da proteina hibrida incluem cadeia A plasmina ligada â cadeia B do activador do plasmino genio tipo tecido (t-PA) ou â cadeia B da urocinase.

As proteínas híbridas podem ser preparadas misturando uma cadeia de uma protease com uma cade

-4de uma outra protease facultativamente com diálise, em condi ções oxidativas.

Como alternativa, as proteínas hibri das podem ser preparadas pegando na informação genetica (sequência de DNA) de cadeia uma das proteinas, cortando e ligando estas para construir uma nova sequencia de DNA codifica, dora da proteína híbrida e expressão deste DNA em hospedeiros procarioticas ou eucarióticos.

São conhecidas as sequências de aminoácidos que constituem a enzima activador do plasminogenio tipo tecido (t-PA) e a sequencia de nucleotideos do cDNA que codifica o t-PA/ ver Pennica et a 1 , 1983; Nature 301 , 214 ). Sabe-se que o t-PA tem actividade fibrinolitica.

Tal como aqui é usado, o termo acti_ vador do plasminogenio tipo tecido (t-PA) significa um activador do plasminogenio do grupo que tem as propriedades imuno lógicas definidas para o t-PA no XXVIII, Meeting of the International Committee on Thrombosis and Haemostasis, Berga. mo, Italia, 27 de Julho de 1982.

E conhecida a sequencia de aminoacidos dos vários formas de t-PA. A referencia Nature 1983 atras mencionado descreve a sequencia das formas de cadeia L e cadeia S madura do t-PA, também divulgadas por Vehrar et a I , Biotechnology, 1984, 2, 1051-7, em que o descrito processamento do t-PA inicialmente formado por remoção de uma pro-sequencia para dar a forma de cadeia S Pohl et al ,

FEBS letters, 1984, Vol. 168 No. 1, 29-32, refere-se à multiplicidade N-terminal do t-PA e descreve a forma de cadeia U.

sistema de numeração da sequencia de aminoácidos do t-PA

-5aqui usado é o descrito na referencia Nature 1983 para o t-PA madura cadeia (S)., em que a serina N-terminal é o nume ro 1 .

Por este sistema a cadeia L- do t-PA tem um residuo glicina N-terminal na posição -3 e a cadeia U do t-PA tem uma valina N-terminal na posição 4.

As referencias do t-PA aqui inclusas pretendem cobrir todas estas formas variantes.

t-PA nativo é composto por uma cadeia B ou leve (L) e numa cadeia A pesada (Η). A cadeia B contem o sitio activo da enzima. 0 sitio de clivagem para a conversão do t-PA a partir da forma de cadeia unica em forma de duas cadeias está situada entre os resíduos arg-275 e ile-276. Na forma de duas cadeias, as cadeias são mantidas juntas por uma ponte dissulfureto formada entre os resíduos cis-264 na cadeia A e cis-395 na cadeia B.

Mostrou-se (NYr. T. et a 1 , 1984; Proc. Natlh .Acad .Sei . USA 81 , 5355 ) que a cadeia A apresenta um numero de domínios estruturais e funcionais que são homologos de estruturas com pontes dissulfureto triplas ou^A ansas múltiplas, sem dominio tipo facto de crescimento e um dominio tipo dedo de fibronectina.

A região dos resíduos de aminoacidos 44 a 91 foi designada dominio factor de crescimento (Banyai, L. et a 1 ., FEBS Lett. 163 , 37, 1983). A informação genetica que codifica a maior parte deste dominio, resíduos 51 a 86 inclusivé e que codifica parcialmente os residuo:; 50 a 87, fica num unico exão. A região do primeiro ao ultimo residuo cisteina dentro desta região, resíduos 51 a 84 inclusivé, define uma estrutura ligada por pontes dissulfure to triplas que será aqui referida como dominio de factor de crescimento do t-PA.

-6A fibronectina tem doze domínios em dedo por monómero, responsáveis pela afinidade para a fibrina (Eur. J. Biolhem. 154 , 15-29 (1986)). As sequências de aminoácidos destes domínios em dedo são conhecidas (EMBO J. 4, 1755-1759 (1985); Eur. J. Biochem. 128 , 605-623 (1982); proc. Natl. Acad. Sei. USA 80, 137-141 (1983). Mostrou-se (J. Biol. Chem. 260 , 5328-5341 e 13666-13676 (1985)) que parte do Factor XII possui homologia estrutural com os domínios em dedo da fibronectina. Demonstrou-se também (Bányai, L. et a 1 ., 1983; FEBS Lett. 163, 37) que uma parte da enzima t-PA apresenta homologia estrutural com os domínios em dedo da fibronectina. Esta região do residuo de aminoácido 6 ao 43 foi designada por domínio em dedo do t-PA. A informação genetica para este domínio reside num unico exão (Ny, T. et a 1 . , 1984; Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81 , 5355 ). 0 termo domínio em dedo será usado daqui em dj_ ante para referir uma sequencia de aminoácidos tendo homologia estrutural com os domínios em dedo da fibronectina ou a própria sequencia de um domínio em dedo da fibronectina.

São conhecidas a sequencia de aminoacidos que constituem a enzima activador do plasminogenio tipo urocinase (u-PA) nas suas formas de cadeia unica e de duas cadeias (Vers traete, M.e Collen. D., 1986); Blood 67, 1529 ) e a sequencia de nucleotideos para ocDNA e que codifica o u-PA humano (Holmes, W.E. et a 1,, 1985); Biotechnolo gy, 2’ 923-929 ). 0 activador do plasminogenio tipo urocinase possui actividade fibrinolitica.

As duas cadeias do u-PA são designadas cadeia A e cadeia Β. A cadeia B contem o sitio activo da enzima. 0 sitio de clivagem para aconversão do u-PA da forma de cadeia unica em forma de duas cadeias está situado entre os resíduos lis-158 e ile-159. Na forma de duas cadei_ as são mantidas ligadas por uma ponte dissulfureto formada entre os resíduos cis-148 na cadeia A e cis-279 na cadeia B.

Tal como aqui é usado o termo act_i_ vador do plasminogenio tipo urocinase (u-PA) significa num £ ctivador de plasminogenio do grupo tendo as propriedades imu nologicas definidas para o u-PA no XXVIII Meeting of the International Committee on Thrombosis and Haemostasis, Bergamo, Italia, 27 de Julho de 1982.

sistema de numeração para as sequências de aminoácidos e nucleotideos do u-PA aqui usado é o descrito em Holmes, W.E. et a 1 . , 1985 (o px i t.) em que o residuo serina N-terminal é numerado 1.

Além das formas nativas do t-PA e u-PA atras descritas, são também conhecidas varias mutainas, ver por exemplo :

EP-A-0201 1 53 , WO 86/01538, WO- 86/04351 , EP-A-0238304 , WO 87/04722

EP-A-0233013, EP-A-0227462, EP-A-0236040. EP-0225286 , EP-A-0236289 .

EP-A-0199574 , EP-A-0253582 , EP-A-02 004 5 1 , DE 3537176,

As referencias aqui feitas às especies de t-PA e u-PA incluem para formas activas e muteínas.

A plasmina é uma protease serina de duas cadeias que pode ser obtida por clivagem do precussor de cadeia unica, plasminogenio, numa ligação peptídica interna especifica. E conhecida a sequencia de aminoácidos

-8do plasminogenio humano (Wiman e tèlters (1975) Enr. J. Biochem. 50, 489-494 e 58, 539-547; Wiman (1977) Enr. J. Biochem. 76 , 129-137; Sottrup-Jensen et a 1 (1978 ) Fibrinolysis and Thrombolysis vol.3, 191 -204, Raven Press, new York, e Sottrup-Jensen et al (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure Vol.5, Suppl. 3, p91, National Biomedical Research Foundation, Silver Spring, MD,).

Também foi descrita uma sequencia de nucleotideos parcial codificadora dos residuos de amino£ eidos 272-790 do plasminogenio humano (Malinowski, D.P. et a 1 1984, Biochemistry 23 , 4243-4250). 0 sitio de clivagem do plasminogenio humano está situado entre os residuos arg-560 e val-561 (de acordo com a numeração de sequencia de Sottrup -Jensen et a 1 (1978). Atlas of Protein Sequence (cp.cit).

Foram identificadas duas especies de plasminogenio (F.J. Castellino, Chemical Reviews Vol. 81 p.431 (1981).; glu₁ que tem um residuo N-terminal de acido glutâmico na posição 1 e 1iSyy que tem um residuo lisina N-terminal na posição 77. Glu-plasminogenio é tmabme facilmente convertido por digestaão plasmica limitado noutra forma modificadas com valina N-terminal (valyg) ou metionina (metgg) (C. Miyashita

E. Wenzel e M.Heinden, Haemostasis 18, sup. 1 pag.7-13 (1988). As referencias aqui feitas ao plasminogenio pretendem incluir todas estas especies.

Recentemente foi descrita uma sequencia completa de nucleotideos (Forsgnen M. et a 1 , 1987 FEBS Letters 213 254-260). A sequencia de nucleotideos prevê a existência de um residuo isoleucina extra, não divulgado anteriormente perto do extremo N de cadeia A,

Este resultado foi independentemen^ te confirmado (McLean, J.N. et al, 1987, Nature 330, 132-137 )

Assim toda a numeração de sequen. cias (aminoácidos e nuc1eotideos) abaixo segue clivagem do plasminogenio está situado entre os resíduos arg-561 e val-562 e as formas N-terminais modificadas são designadas ^me^69 Ι*^s78 ^{e va 1}79 · ρ1 asminogenio tem cinco estrutu ras de ansas múltiplas. A região do primeiro ao ultimo residuo de cisteina de cada estrutura de ansas múltiplos resíduos 84 a 152, 166 a 243, 256 a 333, 358 a 435 e 462 a 541 inclusive serão aqui referidos como os domínios

K.jp, K₂P, K₃p, K^p e K₅p respectivamente.

De acordo com o presente invento é proporcionado um activador do ρ1 asminogenio híbrido que compreende os cinco domínios de ansas múltiplas do plasminogenio ligado à cadeia B do t-PA ou u-PA., via uma sequen cia de aminoácidos compreendendo, respectivamente, o sitio de clivagem do t-PA entre os resíduos e 275 e 276 e o residuo cisteina 264 do t-PA ou o sitio de clivagem do u-PA entre os resíduos 158 e 159 e o residuo cisteina 148 do u-PA.

Devera entender-se que o termo cadeia B inclui pelo menos a porção da cadeia B que contem o centro activo funcional do t-PA ou u-PA e de preferencia compreende os resíduos 276-527 ou 159-411, respectivamente.

A sequencia de aminoácidos de 1 iga_ ção pode ser introduzida sinteticamente durante a preparação do activador do plasminogenio híbrido (PA) e/ou derivada das sequências nativas.

plasminogenio nativo inclui resi

-10duos cisteina nas posições 548 e 558, C-terminal relativamente ao dominio de ansas múltiplas 5 do plasminogenio, que participam nas pontes dissulfureto entre cadeias da forma de plasmina com duas cadeias. Na realização preferida estes resíduos não estão presentes na sequencia de ligação.

Como se verá para evitar a clivagem das ansas múltiplas do plasminogenio cadeia B do t-PA ou u-PA in vivo , a sequencia de ligaçao deverá ser escolhida de modo a evitar a presença de um sitio susceptivel â clivagem proteolitica tipo tripsina N-terminal relativamente ao residuo cis-264 do t-PA ou cis-148 do u-PA, conforme adequado.

Quando se empregar a cadeia B do t-PA, a sequencia de aminoácidos de ligação compreende preferencialmente os resíduos 264 a 275 do t-PA inclusivé, mais pref erenc i a 1 mente os resíduos 262 a 275 inclusive.

Quando se empregar a cadeia B do u-PA a sequencia de aminoácidos de ligação de preferencia compreende os resíduos 148 a 158 inclusive do u-PA, mais preferencialmente os resíduos 137 a 158 inclusivé.

Num aspecto preferedo o PA híbrido pode ser representado simbolicamente como:

(Y-)_m(Kp-Z^t-)₅B^t onde

B^t compreende os resíduos 276-527 do t-PA, m e 0 ou 1,

-11de preferencia 1, cada um dos 5 valores de K^p representa um dominio de ansas múltiplos derivado do plasminogenio em sequêr cia e Y e cada um dos 5 valores de Z^t independentemente representa uma ligação ou uma sequencia de aminoácidos de ligação que pode ser introduzida sinteticamente durante a preparação do pA híbrido e/ou derivada do plasminogenio e/ou sequências do t-PA, a sequencia Z^ compreende pelo menos os resíduos cis-264 e arg-275 do t-PA.

PA híbrido pode ser

Num segundo aspecto preferido, o representado simbolicamente como:

(Y-)_m(K^p

onde

B^u compreende os resíduos 159-411 do u-PA, Y e cada um dos 5 valores de Z^u independentemente representa uma ligação ou uma sequencia de aminoácidos de ligação que pode ser intre duzida sinteticamente durante a preparação do PA híbrido e/ou derivada do plasminogenio nativo e/ou sequências do u-PA, a sequencia Z_g ^u compreendendo pelo menos os resíduos cis-148 e lis-158 do u-PA eme cada um dos 5 valores de K^p são como previamente definidos.

Quando m for 1, a sequencia Y pode tomar um dos valores encontrados em varias formas de plasminogenio nativo, como sejam as formas de glu₁ ou liSyg, ou seja os resíduos do plasminogenio 1 a 83 ou 78 a 83 respecti vamente.

-12Facultativamente, conforme ensinado de um modo geral em EP-A-0241210 , a sequencia Y pode come çar em um ou mais dominios em dedo, aqui definidos como uma sequencia de aminoácidos tendo homologia estrutural com os dominios em dado da fibronectina , como seja um dominio em dedo da própria fibronectina ou um dominio em dedo do t-PA de preferência um dominio em dedo do t-PA.

Quando um dominio derivar do t-PA, a sequencia do dominio em dedo pode facultativamente prolongar-se no extremo N para incluir os resíduos que precedem o residuo 6 do t-PA nativo, como sejam os resíduos 4 e 5, a 5 ou -3 a 5 respectivamente das formas de cadeia U, S ou L do t-PA nativo.

A sequencia do dominio em dedo de preferencia prolonga-se no extremo N para incluir os resíduos a 1 a 5 do t-PA nativo.

Cada sequencia de dominio em dedo pode facultativamente ser ligada a uma segunda sequencia de aminoácidos que corresponde ao dominio de factor de crescimento do t-PA nativo.

Assim, representando a sequencia de dominio em dedo por exemplo resíduos 6 a 43 do t-PA) por F e a sequencia do dominio de factor de crescimento (resíduos 51 a 84 do t-PA) por G, Y compreende uma ou mais unidades N-terminais da forma A-F-Xj- e/ou A-F-X₂-G-X₃~ , onde Χ-j > ^X2 ’ ^e X 3 representam ligações ou sequências de aminoácidos de ligação que podem ser introduzidas sinteticamente durante a preparação do PA híbrido e/ou ser derivadas das sequências nativas do t-PA adjacentes aos dominios F e G.

-13e A é uma extensão N-terminal facultativa do domínio F.

Num aspecto preferido, a sequencia de ligação compreende os resíduos de aminoácidos seleccio nados entre os resíduos 44 a 50 e 85 a 91 , e mais preferencialmente compreende os resíduos 44 a 50 e 88 a 91, do t-PA nativo, facultativamente ligados no extremo C a uma seuqnecia de aminoácidos como seja -pro-gli-, A sequencia de ligação X₂ preferencialmente compreende resíduos seleccionados entre os residuos 44 a 50 do t-PA nativo e mais preferencialmente compreende os residuos 44 a 50.

A sequencia de ligação X^ de preferencia compreende os residuos seleccionados entre os residuos 85 a 91 do t-PA nativo e mais preferencia 1 mente compreende os residuos 85 a 91., facultativamente ligados no extremo C a uma sequencia do aminoacido como seja -pro-gli.

Como se verá para evitar clivagem do(s) dominio(s) adiciona1(ais) uns dos outros ou do restante do activador do plasminogenio híbrido in vivo, as sequen_ cias de ligação, inter-dominios e as sequências de ligação, entre o(s) dominio(s) adiciona1(ais ) e a molécula do activador do plasminogenio deve ser escolhido de modo a evitar a presença de um sitio susceptível â clivagem proteolitica. Assim, em particular, a sequencia de ligação X₁ ou X₃ terminará de preferencia com um residuo diferente de arginina ou 1 i s i na .

Y de preferencia comprende até 6 domínios em dedo adicionais, de preferencia até 2, ainda mais preferível 1, cada um dos queais pode ser facultativamente ligado a um domínio de factor de crescimento.

-14\ L --Ζρ Ζ₂, Ζβ e Ζ₄ de preferencia representam as sequências inter-dominios do plasminogenio n£ tivo entre os domínios de ansas múltiplas do plasminogenio 1 e 2, 2 e 3, 3 e 4, e 4 e 5, respectivamente.

Sequências adequadas (ZgX que ligam o domínio C-terminal de ansas múltiplas do plasminogenio à cadeia B do t-PA incluem:

1. [AAPSTCGLRQYSQPQFR]

2. [AAPSTCGLRQYSQPQFQ]

3· [STCGLRQYSQPQFR] (notação de aminoácidos com letras isoladas), pelo que se pode ver que as sequências 1 e 2 consistem nos resíduos 524-544 do plasminogenio e nos residuos 263 a 275 do t-PA ligados por um resíduo serina. 0 resíduo serina entreposto pode ser identificado com ser-545 do plasminogenio ou ser-262 do t-PA. Na sequencia 2, 0 resíduo 275 do t-PA foi substitu_í do por glutamina de acordo com EP-A-0233013. A sequencia 3 consiste nos residuos 262 e 275 do t-PA.

A sequencia preferida (Z^u5) de ligação do dominio C-terminal de ansas múltiplas de plasminogenio â cadeia B do u-PA é:

[AAPSFPSSPPEELKFQCGQKTLRPRFK]

-15(a notação de aminoácidos com latras isoladas) pelo que se pode ver que a sequencia consiste nos residuos 542-546 do plasminogénio e nos residuos 137 a 158 do u-PA.

Os PAs híbridos preferidos do invento têm as seguintes estruturas:

1. Plg 1-541[AAPSTCGLRQYSQPQFR]B^

2. Plg 1-541[AAPSTCGLRQYSQPQFQ]Bt

3. Plg 1-541 [ STCGLRQYSQPQFR ] B^onde

Pdg 1-541 representa os residuos 1-541 do plasminogénio (ou seja, incluindo os domínios de ansas múltiplas 1 a 5), B¹' é como previamente definido e os símbolos entre parêntesis representam residuosde aminoácidos de acordo com a notação de aminoácidos de letras isoladas, incluindo as variantes de uma e duas cadeias, variantes lis^g e glu^ e suas misturas.

PA híbrido do invento pode ser derivatizado para dar conjugados farmaceuticamente uteis analogos aos conjugados contendo PA conhecidos, por exemplo:

-16(a) um conjugado de enzima-proteina como decsrito na EP-A-0-155 388, em que o sitio catalítico na enzima que é responsável pela actividade fibrinolitica está bloqueado por uma proteina humana que lhe está ligada através de um grupo de ligação reversível.

í (b) um conjugado de enzima proteina como descrito em EP-A-0 152 736 compreendendo pel o menos uma enzima fibrinol itica facultativamente bloqueada ligada através de um sitio que não seja o sitio catalítico responsável pela actividade fibrinolitica a pelo menos uma proteina humana;

(c) um conjugado de proteina-polimero como descrito em EP-A-0 183 503 compreendendo uma proteina farmaceuticamente util ligada a pelo menos um polímero solúvel em agua através de um grupo de ligaçSo reversivel; ou (d) um conjugado de enzima como descrito em EP-A-0 184 363 compreendendo uma pluralidade de enzimas fibrinoliticas ligadas umas às outras através dos seus centros activos por meio de um grupo bloqueador removível.

PA hibrido do invento pode tomar o lugar de um PA como componente enzimatico ou proteico (humano), conforme adequeado, de qualquer um dos conjugados descritos atras.

Os derivados atras referidos do PA hibrido podem ser usados em qualquer um dos métodos e com

-17posições descritas aqui para o proprio PA hibrido.

Num outro aspecto o invento propor ciona um processo para a preparação de activador do plasmino genio hibrido de acordo com o inevnto, processo esse que compreende a expressão de DNA codificador do referido activa^ dor do plasminogenio hibrido numa célula hospedeira recombj. nante e recuperação do produto activador do plasminogenio.

polimero de DNA compreendendo uma sequencia de nucleotideos que codifica o PA hibrido também faz parte do invento.

processo do invento pode ser efectuado por técnicas recombinantes convencionais tal como descrito em Maniatis et alMolecular Cloning- A Laboratory Mannual; Cold Spring Harbor, 1982, e DNA Cloning vols.

I, II e III (D.M.Glover ed. IRL Press Ltd) .

Em particular o processo pode compreender os passos de:

i) preparação de um vector de expressão replicavel capaz numa célula hospedeira, de expressar um polimero de DNA compreendendo uma sequencia de nucleotideos que codifica o referido activador do plasminogenio hibrido;

ii) transformação de uma célula hospedeira com o referj. do vector;

-18iii) cultura da referida célula hospedeira transformada em condições que permitam a expressão do referido polimero de DNA para produzir o referido activador do plasminogenio híbrido; e iv) recuperação do referido activador do ρ1amsinogenio híbrido.

invento também proporciona um processo para a preparação do polimero de DNA por condensação das unidades de nucleotideos mono-, di- ou oligomericas adequadas:

A preparação pode ser efectuada qui micamente, enzimaticamente ou por uma combinação dos dois me todos in vitro ou in vivo conforme adequado. Assim, o DNA pode ser preparado pela ligação enzimatica dos fragmentos de DNA adequados, por métodos convencionais como sejam os des critos por D.H. Roberts et a 1 em Biochemistry 1985, 5090-5098.

Os fragmentos de DNA podem ser obtidos por digestão do DNA contendo as sequências de núcleo tideos necessárias usando as enzimas de restrições adequadas, por sintese química, por polimerização enzimatica ou por uma combinação destes métodos.

-19A digestão com enzimas de restrição pode ser efectuada num tampão adequado a uma temperatura de 20° - 70° C, geralmente num volume de 50 ^ul ou menos com 0,1-10 ^ug de DNA.

A polimerização enzimatica do DNA pode ser efectuada in vitro uma DNA polimerase, como seja, a DNA polimerase I (fragmento Klenow) num tampão adequado contendo os tripolifosfatos de nucleosideo dATP, dCTP, dGTP e dTTP conforme necessário a uma temperatura de 10°37°C, geralmente um volume de 50 ou menos.

A ligação enzimatica de fragmentos de DNA pode ser efectuada usando uma DNA ligase como seja a DNA ligase de num tampão adequado a uma temperatura entre 4°C e a temperatura ambiente, geralmente num volume de 50 ul ou menos.

A sintese química de polímero de DNA ou fragmentos pode ser efectuada por química de fosfotriester ou fosforamidato convencional, usando técnicas de fase solida como sejam as descritas em Chemical and Enzy matic Synthesis of Gene Fragments - A Laboratory Manual (ed. H.G. Gassen e A. Lang), Verlag Chemie, Weinheim (1982) ou noutras publicações cientificas, por exemplo M.J. Gait,

H.W.D.Matthers, M. Singh, B.S. Sproat e R.C. Titmas,

Nucleic Acids Research 1982, J_0, 6243; B.S. Sproat e W.

Bannwarth , Tetrahedron Letters, 1983, 24, 5771; M.D. Mattencci e M.H. Caruthers , Tetrahedron Letters 1980, 21 , 719; M.D. Matteucci e M.H. Caruthers, Journal of the American Chemical Society, 1981, 103, 3189; S.P. Adams et a 1 Journal of the American Xhemical Society 1983, 105, 661;

N.D. Sinha, J.Biernat, J. McMannus e H. Koester, Nucleic Acids Research, 1984; J_2, 4539; e H.W.D. Matthers et al ,

EMBO Journal 1984, 3, 801. Emprega-se de preferencia um

-20sintetizador de DNA.(automatico).

polímero de DNA é preferencialmente preparado pela ligação de duas ou mais moléculas de DNA que em conjunto constituem uma sequencia codificadora do PA hibrido.

As moléculas de DNA podem ser obtidas pela digestão com enzimas de restrição adequadas, dos vectores portadores de sequências codificadoras necessárias.

A estrutura precisa das moléculas de DNA e o modo como são obtidas depende da estrutura do produto PA hibrido pretendido. A esquematização de uma estria tegia adequada para a construção da molécula de DNA codificadora de PA hibrido é uma questão de rotina para os que trabalham no tema.

Numa execução preferida a molécula de DNA pode ser convenientemente preparada pela ligação de uma primeira molécula de DNA codificadando os domínios de ansas múltiplas 1 a 5 do plasminogenio com uma ou mais moléculas de DNA que, juntamente com a referida molécula de DNA, codifica a cadeia B do t-PA ou u-PA de modo que a molécula ligada codifique a sequencia de ligação de aminoácidos compreendendo, respectivamente o sitio de clivagem entre os resíduos 275 e 276 e o residuo cisteina 264 do t-PA ou o sitio de clivagem de u-PA entre os resíduos 158 e 159 e o residuo cisteina 148 do u-PA.

Como exemplo e guia descrevem-se abaixo duas estratégias para a construção de moléculas de

DNA codificadores de dois activadores do plasminogenio híbridos específicos.

-21Estratégia A

A primeira molécula de DNA pode ser obtida pela digestão de um primeiro vector portador da parte necessária da sequencia codificadora do plasminogenio. Por conveniência a sequencia do plasminogenio nativa é mod_i_ ficada para introduzir um novo sitio Nar I 3' relativamente á região codificadora de , de preferencia na posição de nucleotidoes 1758 e qualquer outro sitio Nar I preesnte no vector e destruído. De preferencia o primeiro vector também possui pelo menos parte da sequencia codificadora do t-PA incluindo o sitio SstI na posição de nucleotideos 1417 (Penn_[ ca et a 1, 1983, op .c it) na região codificadora da cadeia B e a porção da região codificadora da cadeia B situada 3' relativamente a de. A digestão do primeiro vector com as enzimas de restrição Nar I e Sst I proporciona assim uma mole cuia de DNA codificadora dos domínios de ansas múltiplas 1 a 5 do plasminogenio e parte da cadeia B do t-PA e portadora de funções do vector.

Uma segunda molécula de DNA pode ser obtida pela digestão de um segundo vector portador da se quencia codificadora da cadeia B do t-PA. A digestão do segundo vector com enzima(s) de restrição adequada(s) tais como BamII proporciona uma molécula de DNA codificadora de parte de cadeia B do t-PA. 0 extremo coesivo Ban II e compatível com o extremo coesivo Sst I da primeira molécula de DNA.

\

As primeira e segunda moléculas de DNA são ligadas via um adaptador oligonucleotideo tendo ex tremos coesivos adequados compatíveis com os extremos coesj_ vos Nar I e Ban II das referidas moléculas de DNA e tendo uma estrutura tal que, quando da ligação das primeira e segunda moléculas de DNA com o adaptador a molécula resultante codj_ fica uma sequencia de aminoãcidos de ligação compreendendo o sitio de clivagem do t-PA entre os resíduos 275-276 e o residuo cisteina 264 do t-PA. Convenientemente o adaptador oligonucleotidico tem a seguinte estrutura:

5' CG CCG TCG ACC TGC GGC CTG AGA CAG TAC AGC 3' GGC AGC TGG ACG CCG GAC TCT GTC ATG TCG

CAG CCT CAG TTT CGC ATC AAA GGA GGG CT 3' GTC GGA GTC AAA GCG TAG TTT CCT C 5'

A ligação das primeira e segunda moléculas de DNA com o adaptador acima pode ser efectuada sequencialmente ou, preferencialmente, um unico passo.

A ligação dos extremos coesivos BanII e SstI das moléculas refaz a região codificadora da cadeia B do t-PA. A sequencia resultante no sitio NarI reconstituído pensa-se ser como se segue:

-23Narl

GCG	qcG	CCG	TCG	ACC	TGC	GGC	CTG
CGC	CGC	|ggc	AGC	TGG	ACG	CCG	GAC
ala	ala	pro	ser*thr	cys	giy	leu
542	543	544		263	264	265	266

Os aminoácidos marcados 542-544 são os residuos C-terminais de uma sequencia peptidica compreen_ dendo os residuos 1 a 544 do plasminogénio. 0 residuo ser^ na marcada * pode ser identificado com serina 545 do plasminogenio ou serina 262 do t-PA. Os aminoácidos marcados 263-266 são os residuos N-terminais de uma sequencia peptidica compreendendo os residuos 263-527 do t-PA.

referido primeiro vector portador da parte necessária da sequencia codificadora do plasminoge nio, ou seja, domínios de ansas multplias 1 a 5 e com um sj_ tio NarI introduzido na posição de nucleotideos 1758, pode convenientemente ser obtido pala digestão com as enzimas de restrição Hind III e Ahall e, separadamente, Ahall e Ddel de um vector portador de gene de plasminogénio, em que qualquer sitio NarI existente no vector foi removido por métodos convencionais.

sitio HindIII esta situado na região não traduzida 5' e o sitio Ahall na posição de núcleo tideos 1572 e o sitio Ddel na posição de nucleotideos 1748 estão na região codifica-dora do domínio de ansas múltiplas 5

-24do gene do plasminogenio.

Os fragmentos Hind 111-Aha11 e Ahall Ddel podem ser ligados uns com os outros a um adaptador oligonucleotidico tendo um extremo coesivo Ddel, codificando o restante da região codificadora do dominio de ansas multj_ pias 5 e contendo um sitio Narl.

adapatador possui de preferencia um extremo coesivo Blgll, de modo que a molécula de DNA resu]_ tante, codificadora dos domínios de ansas múltiplos 1 a 5, do plasminogenio, tem um extremo coesivo HindIII e Bgl II e pode ser mantida num vector adequado como seja pTRE12 (EP-A-0 201 153), entre os seus sitios Hind III e BglII, criando o vector (A).

Para introduzir a parte da sequenci^ codificadora da cadeia B do t-PA que esta situada 3' relativamente ao sitio SstI no vector portador da região -K$P do plasminogenio, o fragmento BglII codificador do polípeptideo t-PA maduro obtido a partir de um vector adequado (B) que o codifica como seja ρTRE15 (EP-A-0 201 153) foi inserido no sitio BglII do vector (A). A porção não pretendida do vector resultante pode ser então removida por digestão com as enzimas de restrição Narl e SstI para dar a referida primeira molécula de DNA codificadora dos domínios de ansas múltiplas do plasminogenio 1 a 5, cadeia B do t-PA situada 3' relativamente ao sitio SstI e funções do vector.

referido segundo vector portador da parte necessária da sequencia codificadora do t-PA ou seja, a cadeia B, pode ser por exemplo um vector (B) codificador do t-PA maduro, como seja pTRE15 (EP-A-0 201 153).

-25Estrategia B

A primeira molécula de DNA pode ser obtida pela digestão de um primeiro vector portadoe da parte necessária da sequencia codificadora do plasminogenio. Por conveniência a sequencia do plasminogenio activo e modificada para introduzir um novo sitio NarI 3' relativamente â região codificadora de K₅ ^P, de preferencia na posição de nucleotideos 1758 e qualquer sitio NarI presente no vector e destrui do. 0 primeiro vector, por conveniência, também tem um sitio BglII colocado de modo a que a digestão do primeiro vector com as enzimas de restrição NarI e BglII proporcione uma molécula de DNA codificadora dos dominios de ansas múltiplos do plasminogenio 1 a 5 e portador de função do vector.

Uma segunda molécula de DNA pode ser obtida pela digestão de um segundo vector portador da sequencia codificadora da cadeia B do u-PA. Convenientemente a sequencia de u-PA nativa e primeiro modificada pela introdução de um sitio SstI 5' relativamente à região codificandora da cadeia B do u-PA.

segundo vector de preferencia também possui pelo menos parte da segunda sequencia codificadora da cadeia A do u-PA 5' relativamente à sequencia cod^ ficadora da cadeia B e convenientemente tem um sitio BglII 3' relativamente à sequencia codificadora de cadeia B. A digestão do segundo vector com as enzimas de restrição BglII e SstI proporciona assim uma molécula de DNA codificadora da cadeia B do u-PA e parte da cadeia A.

-26As primeira e segundas moléculas de DNA são ligadas via um o 1 i gonuc 1 eot i deo adaptador tendo extremos coesivos adequados, de preferencia um extremo coesivo NarI e 5¹ e um extremo coesivo SstI 3' e tendo uma estrutura tal que, quando da ligação das primeira e segundas moléculas de DNA com o adaptador , a molécula resultante codj fique uma sequencia de aminoácidos de ligação compreendendo o sitio de clivegem de u-PA entre os resíduos 158 e 159 e o residuo cisteina 148 do u-PA. Convenientemente o adaptador oligonucleotideo tem a seguinte estrutura:

5' CG CCT	TCA	TTT	CCC	TCC	TCT CCT	CCA	GAA GAG CT	3 1
3 ' GGA	AGT	AAA	GGG	AGG	AGA GGA	GGT	CTT C	5'
				A	1igação	das	primeira e	segunda

moléculas de DNA com o adaptador acima referido pode ser efec tuada sequencialmente ou de preferencia, um unico passo.

A sequencia resultante nos sitios NarI e SstI reconstruídos pensa-se como se segue:

NarI ★

5 1

. . . TGT

GCG

GCG

CCT

TCA

TTT

CCC

TCC

TCT

CCT

CCA

GAA

3 '

. . . ACA

CGC

CGC]

[GGA

AGT

AAA

GGG

AGG

AGA

GGA

GGT

CTT

cys

ala

ala

pro

ser

phe

pro

ser

ser

pro

pro

glu

541

542

543

544

545

546

137

138

139

140

141

142

SstI

-27Os aminoácidos marcados 541-546 são os residuos C-terminais de uma sequencia peptídica com preendendi os residuos 1 a 546 do plasminogenio. Os aminop eidos marcados 137-145 são os residuos N-terminais de uma sequencia peptídica compreendendo os residuos 137-411 do u-PA.

Os nucleotideos marcados * substituíram os nucleotideos nativos no decurso da formação dos sítios de restrição NarI e SstI, sem alteração dos aminoacidos codificados.

referido primeiro vector portador da parte necessária da sequencia codificadora de plasminogenio, ou seja do domínios de ansas múltiplas 1 a 5 e com um sitio NarI introduzido na posição de nucleotideos 1758, pode ser obtido convenientmente como descrito na etapa da estratégia A acima.

referido segundo vector portadoe da parte necessária da sequencia codificadora do u-PA ou seja, a cadeia B e com um sitio SstI 5' re 1 at i vamente â região codj_ ficadora da cadeia B pode ser convenientemente obtido por técnicos mutagenese convencional para introduzir o sitio SstI num vector (c) codificador do polopeptideos u-PA, convenientemente na posição de nucleotideos 5 63. 0 polipeptideo u-PA e convenientemente mantido entre os sitios HindIII e Bgl II de um vector adequado, como seja, pTRE 12 (EP-A-0 201 153).

-28A expressão do polimero de DNA codificador do PA hibrido numa célula hospedeira recombinante pode ser efectuada por meio de um vector de expressão replj_ cavei capaz, na célula hospedeira, de expressar o polimero de DNA. 0 vector de expressão e novo e também faz parte do invento.

vector de expressão replicavel pode ser preparado de acordo com o invento, por clivagem de um vector compatível com a célula hospedeira para dar um segmento de DNA linear tendo um replicão intacto e combineção do referido segmento linear com uma ou mais moléculas de DNA que juntamente com o referido segmento linear, codifica o PA hibrido, em condições de ligação.

A ligação do segmento linear e mais de uma molécula de DNA pode ser efectuada simultaneamente ou sequencialmente conforme pretendido.

Assim, o polimero de DNA pode ser preformado ou formado durante a construção do vector, conforme desejado.

A escolha do vector sera determinda em parte pela célula hospedeira, que pode ser procariotica, como seja E.coli ou eucariótica, como seja C 127 ratinho, mieloma de ratinho, ovário de hamster chinês ou levedura. Os vectores adequados incluem plasmídeos bacteriofagos, cosmideos e virus recombinantes.

-29A preparação do vector de expressão replicavel pode ser efectuada convencionalmente com as enzimas adequadas para restrição, polimerização e ligação do DNA, por processos descritos em, por exemplo, Maniatis et a 1 . , atras citado. A polimerização e ligação podem ser efe ctuados como decsrito atras para a preparação do polímero de DNA. A digestão com enzimas de restrição pode ser efectua da num tempão adequado a uma temperatura de 20° - 70°C, geralmente num volume de 50 ^il ou menos com 0,1-10 jjg de DNA.

A célula hospedeira recombinante e preparada, de acordo com o invento, pela transformação de uma célula hospedeira com um vector de expressão replicavel do invento em condições de transformação. As condições de transformação adequadas spao as convencionais e estão descri tas em, por exemplo, Maniatis et a 1, citado atras, ou DNA Cloning, VolII, D.M. Glover ed. IRL Press Ltd.,1985.

A escolha das condições de transfor mação e determinada pela célula hospedeira. Assim, um hospe deiro bacteriano como seja E.coli. pode ser tratado com uma solução de CaClg (Cohen et a 1 , proc. Natl.Acad. Sei.

1973, 69, 2110) ou com uma solução compreendendo uma mistura de RbCl, MnClg, acetato de potássio e glicerol e depois com acido 3-/~N-morfolino7propano-sulfonico , RbCl e glicerol. As células de mamifero em cultura podem ser trans_ formadas por coprecipitação com cálcio do DNA vector sobre as células.

invento também inclui uma célula hospedeira transformada com um vector de expressão replicavel do invento. A cultura da célula hospedeira transformada em condições que permitam a expressão do polímero de DNA e

-30efectuada convencionalmente, como decsrito por exemplo em maniatis et a 1, e DNA Cloning referidos atras. Assim, de preferencia a célula e crescida em meio nutritivo a uma temparatura abaixo de 45°C.

produto da expresão PA híbrido e recuperado por métodos convencionais de acordo com a celu_ la hospedira. Assim, quando a célula hospedeira foi uma bactéria, por exmeplo E. coli ela pode ser lisada fisicamente quimicamente ou enzimaticamente e o produto proteína isolado a partir do lisado resultante. Quando a célula hospedeira e de mamífero e o produto pode geralmente ser isolado a partir do meio nutritivo.

polimero de DNA pode ser montado em vectores projectadas para o isolamento de linhas celulares de mamífero transformadas estáveis expressando o PA hibrido; e.g. os vectores de papilomavirus bovino ou vectore amplificados em células de ovário de hamster chinês (DNA Cloning VolII. D.M. Glover ed., IRLPress 1 985; Kaufman ,

R.J. et a 1 , Molecular and Cellular Biology 5, 1 750- 1759 1985; Pavlakis G.N. e Hamer, D.H. Proceedings of the National Academy of Sciences (USA) 80, 397-401, 1983; Goeddel,

D.V. et al.; Pedido de Patente Europeia No.009 3519, 1983 ).

Como se vera dependendo da célula hospedeira, o PA hibrido preparado de acordo com o invento pode ser glicosilado em grau variavel. Ainda, como observadc por Pohl et al . , Biochemistry, 1984 , 23, 3701 -3707 , também se pode encontrar vários graus de glicosilação no t-PA natu ral não modificado. 0 plasminogenio também apresenta vários graus de glicosilação (Hayer M.L. J. Biol. Chem. 254, 8768, 1979). Também são incluídos formas mutantes do PA hibrido em que os sitios de glicosilação são removidos por técnicas

-31de engenharia genetica, por exemplo como descrito em EP-A-0 238 304, EP-A-0 225 286, DE-3537176, W0 87/04722 ou

EP-0236 289. 0 PA híbrido do invento engloba tais variações g1icos i1adas .

Também sera, apreciado que, depeig dendo das condições de expressão, o PA híbrido preparado de acordo com o invento pode existir nas formas de cadeia simples e de duas cadeias ou suas misturas. 0 invento abrange todas estas formas.

PA híbrido do invento compreende a cadeia B do t-PA ou u-PA nativo ligada a uma cadeia A compreendendo os cinco domínios de ansas múltiplas derivados de plasminogenio e a sequencia de ligação de aminoácidos compreendendo os resíduos 264 e 275 do t-PA ou resíduos 158 e 148 do u-PA.

Esta cadeia A de PA híbrido pode ser empregue como uma cadeia de uma proteína híbrida fibrinoliticamente activa como por exemplo como descrito em EP-0 155 387. A cadeia A híbrida, o DNA que codifica a cadeia A híbrida e uma proteína híbrida compreendendo a cadeia A híbrida ligada â cadeia B de uma proteína fibrinoliticamente activa, o sitio catalítico da qual esta facultativamente bloqueado por um grupo bloqueador removível, formam todos parte do Invento.

A cadeia A híbrida pode ser prepara_ da por separação da cadeia B através de redução suave. Como alternativa a cadeia A híbrida pode ser preparada através de expressão de DNA que a codifica numa célula hospedeira recombinante e recuperação do produto cadeia A híbrida. A proteína híbrida compreendendo a cadeia A hibrida ligada à

-32cadeia B de uma protease fibrinoliticamente activa pode ser preparada por (a) mistura das referidas cadeias A e B em condições oxidativas; ou (b) ligação do DNA codificador da referida cadeia A a DNA codificadora da referida cadeia B e expressão do DNA ligado num hospedeiro procariotico ou eucariotico; e a partir daqui bloqueio facultativo do sitio catalítico da proteína híbrida com um grupo bloqueador removível. As condições de oxidação e redução são as geraj_ mente descritas em EP-A-0 165 387.

A proteína híbrida resultante pode ser usada em qualquer um dos métodos e composições aqui de£ critas para o proprio PA híbrido.

PA híbrido do invento ou seu conjugado pode ainda ser derivado de modo a que qualquer sitio catalítico essencial para a actividade fribrinolitica seja facultativamente bloqueado por um grupo bloqueador removível .

Conforme aqui usada a expressão grupo bloqueador removível inclui grupos que são removíveis por hidrólise a uma velocidade tal que a constante de velocidade de pseudo-primeira ordem para a hidrólise e r 1 2 1 na gama de 10“ seg“ a 10“ seg“ , de preferencia entre — fi 1 2 1

10“ seg“ e 10“ seg“ , em meios aquosos isotonicos a pH 7,4 a 37°C.

Tais grupos bloqueadores estão descritos na Patente Europeia No. 000 9879 e incluem grupos acilo como sejam benzoílo facultativamente substituido ou acriloilo facultativamente substituido.

Os substituintes facultativos adequados para grupos bloqueadores de benzoílo incluem haloge-33---- \ nio, alquilo C^_g, alcoxilo C _g, alcanoi loxi lo C₁ g, alcanoilamino Ci_₆, amino ou p-guanidino.

Os substituintes facultativos adequados para os grupos bloqueadores de acriloilo incluem alquj lo C_1-6, furilo, fenilo ou alquilfenilo C^g.

Num aspecto preferido, o grupo bloqueador removível e um grupo 2-aminobenzoilo substituido na posição 3 ou 4 com um atomo de halogênio e facultativamente ainda substituido com um ou mais grupos removedores ou dadores fracos de electrões em que a constante de velocidade de pseudo primeira ordem para a hidrólise do derivado

-5 -4 _ i esta na gama de 6,0 χ 10 a 4,0 χ 10 seg , quando medido num sistema tampão consistindo em fosfato de sodio 0,05M cloreto de sodio 0,1M, 0,01% v/v de detergente compreendendo monoleato de polioxietilenossorbitano tendo um peso molecular de aproximadamente 1300 a pH 7,4 a 37°C.

De preferencia a constante de velo cidade de pseudo-primeira ordem para a hidmlise do derivado - 5 -4 1 esta na gama de 6,0 χ 10 a 2,75 χ 10 seg , de preferer^ cia entre 6,0 χ 10^ e 2,5 χ 10^-4 s^_1, mais preferivelmente - 5 -4-1 entre 6,0 χ 10 e 2,0 χ 10 s ainda mais preferível entr 6,0 χ 10~⁵ e 1,5 χ 10^-4 s~^ e o mais peferido de 7,0 χ 10“$ a 1,5 χ 10~⁴ s¹ .

De preferencia, o grupo 2-aminobein zoilo e substituido com um atomo de halogênio na posição 4.

De preferencia o atomo de halogênio e fluor, cloro ou bromo.

-34Quando o grupo e ainda substituido os grupos preferidos incluem substituintes alquilo C^_g, alcoxilo e alcenilo C^g nas posições 3 ou 5 do anel.

De preferencia, o grupo bloqueador e 4-f1uoro-2-aminobenzoilo , 4-cloro-2-aminobenzoilo ou 4-bromo-2-aminobenzoilo.

Os grupos bloqueadores 2-aminobenzoilo substituídos atras mencionados podem ser usados para derivatlzar qualquer activador do plasminogenio compreender^ do o dominio de protease serina do t-PA ou u-PA. Este novo grupo de enzimas bloqueadoras dentro do âmbito largo da EP0009 879 mas não ali descritas especificamente, verificou-se sofrerem regeneração de centros activos funcionais a velocidades correspondentes a constantes de velocidade de -5 -4 -1 pseudo primeira ordem de 6 χ 10 a 4 χ 10 seg . A ultima gama de constantes de velocidade e esepcificamente adequada à actividade fubrinolitica durante o tratamento de enfarte agudo do miocardio com agentes tromboliticos .

Assim, num outro aspecto, o invento proporciona um derivado de um activador do plasminogenio com preendendo o dominio de protease serina do t-PA ou u-PA, em que o sitio catalítico essencial à actividade de activador do plasminogenio e bloqueado por um grupo 2-aminobenzoilo substituido na posição 3 ou 4 com umatomo de halogénio e facultativamente ainda substituido com um ou mais grupos dadores ou removedores fracos de electrões, em que a constante de velocidade de pesudo primeira ordem para a hidrólise do -5 -4 -1 derivado esta na gama de 6,0 χ 10 a 4,0 χ 10 seg quando medido num sistema tampão consistindo em fosfato de sodio 0,05M, cloreto de sodio 0,1M 0,01% v/v de detergente compreendendo monoleato de polipxietilenossorbitano tendo um peso molecular de aproximadamente 1300 a pH 7,4 a 37oC.

-35Um detergente adequado para usar no tampão e o produto com a marca registada Tween 80.

São exemplos adequados do grupo bloqueador os descritos atras.

termo activador do plasminogenio inclui o activador do plasminogenio tipo tecido (t-PA) humano e urocinase (ambas as formas de alto e baixo peso molecular) Tais enzimas spao obtidas a partir de sangue, urina ou tecidos de memifero ou por métodos de DNA recombinante em que o organismos hospedeiros heterologos tais como bactérias, leve duras, fungos ou células de mamífero expressam genes que espe cificam os enzimas. 0 termo também inclui:

(a) proteínas híbridas fibrinoliticamente activas divulgadas em EP-A-0 155 387, como seja cadeia A do plasmina liSyg/t-PA ile₂₇₆;

(b) conjugados de proteina descritos em EP-A-0 152 736, como seja urocinase ligada a plasmina reversivelmente bloqueada;

(c) derivados de enzimas fibrinoliticas descritos em EP-A-0 155 388, em que o componente de proteina humana compreende o domínio de protease serina do t-PA ou urocinase, como seja uricinase ligada reversivelmente ao centro activo da plasmina humana.

-36(d) conjugados compreendendo uma enzima fibrinolitica ligada a um polímero solúvel em agua por meio de um grupo de ligação reversível como descrito em EP-A-0 183 503; e (e) derivados obtidos por engenharia genetica incluindo muteinas de activadores do p1 asminogenio naturais como sejam os divulgados em EP-A-0 020 1153, EP-A-0207 589

W0-8604351, EP-0041766, EP-0213794, EP-0199574,

EP-A-0240334, EP-A-0241208, EP-A-0241209 , EP-A-024 1210, EP-A-0233 013,; Pedido de Patente Europeia No.883 01897.0 e USSN 163959, Pedido de Patente Europeia No.88304626.0 , EP-A-02 13 794, EP-A-0 231

883, W0 8704722, EP-A-0242 836 , EP-A-0234051 ,

EP-A-025382, EP-A-0253 241, W0-8604351, EP-A-0236

040, EP-A-0200461 , EP-A-023 8304, EP-A-0225 286,

DE-3537176, EP-A-0236 289, W0-8601538, EP-0227 462

AU-86616804, W0-8703906 e EP-0199574, como seja des (cis₅₁-asp_g7)t-PA;

desde que as enzimas enumeradas de (a) a (e) compreendam o dominio de protease serina do t-PA ou urocinase.

Os derivados preferidos deste inven to incluem o seguinte:

4-fluoro-2-aminobenzoil-urocinase,

4-cloro-2-aminobenzoi1-urocinase ou t-PA e

4-bromo-2-aminobenzoil-t-PA;

t - PA ·

2-amino-4-clorobenzoi1 (lis^g cadeia A da plasmina)il²⁷⁶

-37os derivados de 4-cloro- e 4-f 1 uoro-2-aminobenzoi 1 o dos conjt£ gados em que urocinase (alto ou baixo peso molecular) esta ligada reversivelmente ao centro activo do ρ 1 asmina-humana o derivado de 4-cloro-2-aminobenzoilo do des(cis₅₁-asp_g7 ) t-PA; e preferencialmente.

4-cloro-2-aminobenzoi1 plg-1-544/t-PA 262-527 (duas cadeias) incluindo as variantes glu₁ e 1is₇g e suas misturas e

4-cloro-2-aminobenzoi 1 plg 1-541/t-PA 262-527 (duas cadeias) incluindo as variantes glu^ e 1isyg e suas misturas.

presente invento também proporcio na um processo para a preparação de um derivado do invento, processo em que compreende a reacção do activador do plasminogenio com um agente bloqueador JK em que J e um grupo colocador que medeia a ligação do agente ao sitio catalítico da enzima e K e um grupo 2-aminobenzoilo substituido na posi ção 3 ou 4 com um atomo de halogénio e facultativamente ainda substituido com um ou mais grupos removedores ou dadores fracos de electrões.

Exemplos do grupo J incluem 4-amidinofenilo e 2-cloro-4-amidinofenilo.

Agentes preferidos JK são 2'-amino-4 '-fluorobenzoato de 4-amidinofeni1 o; 2 '-amino-4¹-c1orobenzoato de 4-amidinofenilo e 2 ¹-amino-4 ¹-bromobenzoato de 4-amid inofen ilo.

Os agentes bloqueadores JK como definidos atras sao novos e fazem parte do invento.

^“5

-38As reacções bloqueadoras são de preferencia efectuadas em meios aquosos, a um pH na gama de 7,0 a 8,5 e a temperaturas na gama de 0°C a 30°C. A gama de concentrações preferidas para o agente bloqueador vai de 0,01 a 2,0 milimolar e a gama de concentrações de enzima preferida vai de 1 a 500 micromolar.

Em certos casos, particularmente, com activadores do plasminogenio tais como t-PA e os estruturalmente relacionados ou derivados do plasminogenio, e desejável efectuar a reacção bloqueadora na presença de aditivos so1ubi1izadores ou estabilizadores da enzima, como sejam 1-arginina, 1-lisina, ou acido 6-amino-hexanoico . Verificou-se que estes materiais são compatíveis com os agen_ tes bloqueadores do invento.

Os agentes bloqueadores JK podem ser preparados pela reacção do acido benzoico substituido ade quado com o álcool adequado numa base organica como seja piri dina e na presença de um agente de condensação tal como diciclo-hexllcarbodiimida.

A reacção de condensação pode ser efectuada sem protecção previa do substituinte 2-amino no componente acido.

Os ácidos antranilicos substituídos precursores podem ser preparados por uma variedade de métodos conhecidos. Em geral, as posições relativas dos substituintes pretendidos determinarão a escolha do material de partida. Quando necessário um substituinte facultativo como seja metilo ou metoxilo, este esta geralmente presente no material de partida. Os grupos halo, amino e de acido carboxílico são sucessivamente introduzidos, conforme neces λ

λ

-39sario, em qualquer origem adequada, por substituição aromatica convencional. Os grupos amino e de acido carboxílico podem ser proporcionados na forma de percursor. Os grupos amino podem ser obtidos a partir de grupos nitro por redução Os grupo de acido carboxílico podem ser obtidos a partir de grupos metilo por oxidação ou a partir de grupos ester ou tio ester por hidrólise. Durante a introdução sucessiva dos substituintes, pode ser necessário proteger os grupos amino e/ou de acido carboxílico.

Uma via preferida compreende a preparação de um derivado de aminotolueno adequado por redução do correspondente nitrotolueno, protecção do grupo amino(por exemplo, por acetilação), oxidação de função metilo para um grupo de acido carboxílico (por exemplo com permanganato de potássio) e remoção do grupo protector por hidrólise.

Os ácidos 4-halo-5-meti1-antranilicos podem ser preparados protegendo em primeiro lugar o carboxilato em acido 4-amino-m-toluico com dimetilamina de cloreto de tionilo (para dar a dimetilamida) , seguindo-se a nitratação do anelna posição 2 com excesso de buti1-litio/ nitrato de acetilo, diazotização do grupo amino livre e substituição com um atomo de halogênio usando a reacção Sandmeyer, redução do grupo nitro para dar a amina na posição 2 e finalmente hidrólise da dimetilamina para dar o acido livre. Os mesmos compostos (ou, por exemplo, os corres^ pondentes derivados de 5-metoxilo) podem também ser preparados a partir de 4-nitrotolueno ou 4-nitro-anisole por halo genação na posição 2 com cloro/cloreto de alumínio, redução para dar a amina que e então protegida por acetilação, inseiç ção de um precursor carboxilo por substituição electrofi 1 ica com cloreto de alumínio e estH' ou tioester de cloroformato e finalmente hidrólise de ambos os grupos acetilo e ester/

-40tioester para libertar as funções aminas e carboxilo não protegidas.

PA hibrido e derivado do invento são adequadamente administrados na forma de uma composição farmacêutica.

Deste modo o presente invento também proporciona uma composição farmacêutica compreendendo um pA hibrido ou derivado do invento em combinação com um veiculo farmaoeuticamente aceitavel.

As composições de acordo com o invento podem ser formuladas de acordo com processos de rotina como composições farmacêuticas adaptadas a administração intravenosa em seres humanos.

Tipicamente as composições para administração intravenosa são soluções da enzima esteril em tampão aquoso isotonico esteril. Quando necessário a composição pode incluir também um agente de solubi1ização para manter o PA hibrido ou derivado em solução e um anestésico local como seja linhocaina para diminuir a dor no sitio da injecção. Geralmente, o PA hibrido ou derivado ser^Tao fornecidos na forma de dosagem unitaria por exemplo como um po seco ou concentrado sem agua num recipiente hermeticamente fechado como seja uma ampola ou saqueta indicando a quantidade de proteína em unidades de actividade.

Quando a composição compreender um derivado do invento ou quando o PA hibrido incluir um grupo bloqueador removível pode ser dada uma indicação do tempo em que a proteína livre sera libertada. Quando a proteína se destinar a administração por infusão, ela sera s

-41distribuída com uma garrafa de infusão contendo Agua para Injecção esteril grau de pureza farmacêutica ou soro fisio logico. Quando a proteína se destinar a administração por injecção, ela sera distribuída com uma ampola de agua esteril para injecção ou soro fisiologico. A composição injectavel ou para infusão sera feita misturando ingredientes antes da administração.

A quantidade de material administra, do dependera da quantidade de fibrinolise necessária e da velocidade com que e necessária, da gravidade do estado tromboembo1ico e posição e tamanho do coagulo. A dose precisa a ser empregue e o modo de administração deve per for ce face à natureza de problema ser decidido de acordo com as circunstancias pelo medico que supervisa o tratamento.

No entanto, em geral, um paciente a ser tratado de um coagulo recebera geralmente uma dose dia ria de 0,01 a 10 mg/kg de peso do corpo, como seja 0,10 a 2,0 mg/kg, quer por injecção, por exemplo ate cinco doses, quer por infusão.

Dentro da gama de dosagem acima irg dicada não estão indicados efeitos toxicologicos adversos com os compostos do invento.

Assim, num outro aspecto do invento e proporcionado um método de tratamento de doenças tromboticas que compreendem a administração a um paciente de uma quan tidade não toxica eficaz de PA hibrido do invento.

Num outro aspecto o invento propor ciona o uso de PA hibrido do invento para a produção de um medicamento para o tratamento de doenças tromboticas.

-420 invento também proporciona um PA híbrido do invento para uso numa substancia terapêutica acti va e em particular para uso no tratamento de doenças trombot^ cas.

presente inevnto proporciona ainda um método de tratamento de doenças trombóticas, em particular enfarte agudo do miocardio, método esse que se caracteriza pela administração ao paciente de uma quantidade não toxica e eficaz de um derivado de invento.

invento também proporcionar o uso de um derivado do invento para a produção de um medicamento para o tratamento de doenças tromboembo 1 icas , em partj_ cular enfarte agudo do miocardio.

Num outro aspecto, o invento proporciona um derivado do invento para novo como substancia terapêutica activa, em particular, para o tartamento de doeii ças tromboembo1icas tais como enfarte agudo do miocardio.

Os Métodos e Exemplos que se seguem ilustram o invento.

-43I. Métodos gerais usados nos Exemplos (i) Clivagem de DNA

Em geral a clivagem de cerca de 1^i de DNA de plasmídeo ou de fragmentos de DNA foi efectuado usando cerca de 5 unidades de uma enzima de restrição (ou en zimas) em cerca de 20 ul de uma solução tampão adequada.

(ii) Obtenção de extremos cegos: Se foram necessários extremos cegos eles foram produzidos por tratamento da preparação de DNA com DNA polimerase I, fragmento Klenow como descrito por Maniatis et a 1 (Molecular Cloning - A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982 ) ou como altejç nativa (onde indicado), por digestãi usando nuclease de Mung Bean (Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982).

_ (iii) Produção de extremos coesivos usando adapatdores: 01igonucleotideos adaptadores pequenos e fosfosilados codificando sem ou mais sitios de restrição foram ligados a fragmentos com extremos cegos, o(s) adaptador (es) foi diger_i_ do com a endonuclease de restrição adequada produzindo o extremo coesivo necessário para posterior manipulaçao. (Molecular Cloning - A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory 1982).

(iv) Ligação de fragmentos de DNA: As reacções de ligação foram efectuadas como descrito em Maniatis et al , (Molecular Cloning- A Laboratory Manual, Cold Spring, Harbor

-44Laboratory , 1982 ) .

(v) A transformação de DNA de plasmídeo em células de L· coli HB101 ou E.coli DH5 usou células competentes HB101 ou DH5 fornecidas pela Gibco BRL (Paisley, Scotland), de acordo com as instruções do fornecedor).

(vi) Preparação de plasmídeos: A preparação em larga escala de DNA de plasmideo e as mini-preparações de plasmídeo foram efectuadas como descrito em Maniatis et a 1 (Molecular, Qoning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory 1982) .

(V i i) Isolamento de fragmentos de DNA a partir de geis de agarose de ponto de fusão baixo (LMP): Os frag_ mentos de DNA foram isolados a partir de geis de agarose de LMP como descrito por Maniatis et a 1 (Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory 1982)

Como alternativa a banda de gel removida foi purificada usa£

TM do GENECLEAN (Stratech Scientific London) usando de acordo com as instruções do fornecedor.

(Viii) 01igonucleotideos : os oligonucleotideos foram feitos num sintetizador de DNA Applied Biosystems 381A de acordo com as instruções do fabricante e foram fosforilados como descrito em M aniatis et al , op.cit. Quando usados na construção de plasmídeos os oligonucleotideos foram emparelhados aquecendo-os em conjunto a 95°C durante 5 minutos e arrefecendo lentamente ate à temperatura ambiente. Os oligonideotideos emparelhados ficaram então prontos para a ligação. No caso de terem sido emparelhados quatro oligonucleotideos a reacão de empare1hamento foi seguida, como

-45descrito atras mas efectuando em 2 reacções cada uma contendo um par de oligonucleotideos complementares. Apos arrefecimento as 2 reacções foram misturadas antes da ligação.

(ix) Sequenciação de DNA :

(a) Método de cadeia simples

A determinação da sequencia de n/ cleotideos foi efectuada pelo método da terminação de cadeias didesoxi de Sanger como descrito em Sanger, S. Nicklen S. e Coulson, A.R. (1977) Proc. Natkl. Acad. Sei. USA 74, 5463-5467 usando dATP marcado com ^^S.

(b) Método de cadeia dupla '

A sequenciação foi efectuada usan TM do Sequenase (United States Biochemical Corporation) essencialmente de acordo com as instruções do fabricante.

(x) Expressão transitória de activadores do plasminogenio em células de HeLa (a) Pequena escala

Preparação de células: as células foram tripsinizadas e semeadas a aproximadamente 2,4 χ 10 células por placa de 35mm e incubadas em 1,5 ml de meio de cresci*mento (este e meio RPMI 1640 tamponado com Hepes

-46(041-2400) contendo 10% de soro (021-6010), 1% de solução stock de penici 1 ina/estreptomicina (043-5070), 2% de solu.

ção de bicarbonato de sodio (043-5080) , 1% de Glutamina stock (043-5030); Gibco, Paisley, Scotland) a 37°C numz estufa humidificada numa atmosfera de 5% C0₂/95% de ar.

Apos 72 h as células foram novamente alimentadas e usadas para transfecção 24h mais tarde.

Processo de transfecção; As culturas foram mudadas para Eagles MEM (041-1095 ) 10% de soro, 1% de penici 1 ina/estrejD tomicina, 1% de Glutamina e 1% de aminoácidos (não essenciai (043-1140) 3h antes da transfecção. As transfecções usaram coprecipitação com cálcio como descrito em DNA Cloning Ed .

D.M. Glover (Capitulo 15, C. Gorman). Usaram-se o choque com glicerol e tratamento com butirato 5mM. 0(s) activador(es) do plasminogenio secretados pelas células transfect£ das foi colhido em 1,0 ml de meio RPMI 1640 (como atras mas sem soro, contendo 4% de peptona de soja (Sigma) durante 24h e a actividade foi medida usando placas de fibrina com referencia a t-PA normal (J.H. Robinson, Thromb. res, 1984; 33, 155).

Como alternativa as células HeLa fo ram semeadas a 5 χ 10 por placa, neste caso as células foram alimentadas de novo apenas apos 24h e depois usadas como atras.

(b ) Larga-esca1 a

Preparação das células:

As células foram tripsinizadas e semeadas a uma densidade fi o de aproximadamente 2,5 χ 10° células por frasco de 175 cnr

-47em 30 ml de meio de crescimento (acima). Apos 72 h adicionou-se mais 25 ml de meio de crescimento e as células foram usadas para transfecção de DNA 24h mais tarde (como acima).

Usou-se 25 ml de meio de colheita por frasco.

Como alternativa as células foram semeadas a uma densidade de aproximadamente 2,0 χ 10θ células por frasco e 25 ml de meio de crescimento foi adicionado apos 96h de incubação e as células usadas como atras.

As duas densidades de sementeira e o numero de adições de novo meio nos protocolos de pequena e larga escala foram eleborados para permitir um horário ade quado das experiencias. Ambos os protocolos permitiram uma expressão eficaz do(s) activador(es).

(xi) Transferencia Western/coloração com imuno-ouro prata

Apos SDS-PAGE, as proteínas foram transferidas para nitrocelulose (NC) por transferencia electroforetica durante a noite a 4°C, 40v, 100mA em 25mM Tris /192 mM Glicina/20% (v/v)Metanol pH 8,3.

Os sitios que não reagiram na nitro celulose foram bloqueados com 5% de albumina de soro bovina (BSA) /tampão de fosfatos salino (PBS) pH 7,2 durante 1h, seguido de uma incubação de 2h com IgG de coelho anti-cadeia B do t-PA(48 ug/ml) em 1% BSA /0,5%Tween 80/PBS pH 7,2 (diluente). A NC foi lavada, 3x5 mins, em 0,5% Tween 80/

-48/PBS pH 7,2 e depois incubado durante 1 h em anticorpo secundário biotinilado (Janssen; 2ug/ml em diluente): A NC foi lavada como acima, seguido de 1 χ 1 min. em agua desionizada e reforçada a coloração com prata usando o Kit Inten SE II (Janssas) durante 15-20min. Todos os passos foram efectuados à temperatura ambiente com agitação suave.

II. Identificação de nucleotideos resíduos de aminoácidos, extremos, domínios das proteínas e natureza das cadeias nos exemplos (i) Sequências

Toda a numeração do t-PA como em Pennica et a 1 (1983) op cit., numeração de aminoácidos do plasminogenio baseado em Sottrup-Jenssen et aI (1978),

Atalas of Protein Sequence and Structure Vol.5, Suppl. 3, p 91, National Biomedical Research Foundation, Silver Spring

M.D. mas actualizada para incluir 5 resíduos de aminoácidos extra identificado por Forsgren , M. et a 1 ( 1987) FEBS Letters 213, 254 760. As sequências de nucleotideos do plasminogenio como em Forsgreen et a 1 (op.cit). Toda a numeração da urocinase corresponde a Holmes et al (1985) Bio Technology, 3, 923-929.

(i i ) Extremos N . t-PA:

extremo N maduro pensa-se normaj. mente ser equivalente a ser₁ (Pennica et a 1 , 1983). Também existem outras formas e.g. gli_₃ ou val₊₄ (Pohl et a 1, 1986 FEBS Letters , 168, 29-32).

2. Plasminogenio:

glu^ indica que a proteína compreendera o extremo N do plasminogenio nativo (nascente) i.e. residuos de aminoácidos de 1 em diante.

iSyg indica que a proteína compreendera o extremo N processado lis 78. Na natureza conhe cem-se extremos N processados alternativos e.g. met^g e valyg (Miyashita et a 1, 1988).

(iii) Domínios das proteínas

Os domínios das proteínas descritas nos exemplos foram abreviados por conveniência e são definidos como se segue:

-501 . t-PA:

F^t = resíduos de aminoácidos 6 a 43 inclusive

G¹ = 51 a 84

B^l = 276 a 527

2. Plasminogenio:

P _ ll ll

a 162 inclusive

166 a 243

256 a 333

358 a 435

462 a 541

Os 5 domínios de ansas * múltiplos do plasminogenio

K₁ - K₅ 84 a 541

-51(i ν) Natureza da cadeia sc, indica que a proteina esta na forma de cadeia simples tc, indica que a proteina esta na forma de duas cadeias.

(v) Vectores pTRE12 - (EP-0201153 ) - vector de expressão básico pTRE15 - (EP-020 1 153 ) - codifica t-PA selvagem pTRE24 - (EP-0207589 ) - codifica des (cis₅₁-asp_Q7 ) t-PA pTRE 6F - (EP-0241208) - codifica o dominio em dedo do t-PA

III. Construção e Expressão de proteinas híbridas

A expressão das proteinas dos Exemplos 1 a 7 foi efectuada em células HeLa.

τ—λ

-52Exemplo 1

Plasminogenio 1-544/t-PA 262-527 (H204)

1.1 Construção de um plasmídeo protador de cDNA do plasminogenio

Um clone de cDNA do plasminogenio foi obtido a partir de uma biblioteca de cDNA de figado humano apos despiste com uma sonda oligonucleotidica da sequenc i a (A):

5' CC CCT CAC ACA CAT AAC AGG 3' (A) correspondendo aos nucleotidoes 49 a 68 da sequencia descrj_ ta em Malinowski et al Biochemistry 23, p4243 (1984).

A sequencia de DNA da porção do clone de cDNA do plasminogenio codificando a cadeia A da proteína foi determinada e foram observadas duas diferenças relativamente à sequencia de cDNA do plasminogenio de Forsgren et a 1 (1987 ) .

nucleotideo na posição 846 e T, o nucleotideo na posição 948 e G.

extremo 5' do clone mostrou-se corresponder ao nucleotideo 27 da sequencia de Forsgren et a 1 ( 1987).

cDNA do plasminogenio foi subclonado no vector pUC8 (Viej_ ra e Messing 1982, Gene 19, 259) entre os sítios HincII e EcoRI para criar o plasmídeo pTRH6, Fig.1a.

-531.2 Modificação de pTRE12 único sitio NarI inicialmente presente no plasmídeo pTRE12 (EP-A-0 201 153) foi destruído cortando com enzimas de restrição fazendo extremos cegos e realizando dando origem a pTRE12D Nar. A remoção de sitio NarI ajudou à posterior manipulação.

1.3 Construção de um plasminogenio hibrido: molécula de cDNA do t-PA (plasmídeo pTRH204) (Toda a numeração de nucleotideos do palsminogenio corresponde a Forsgren et a 1 , 1987, op .cit).

Estes fragmentos foram preparados por digestão de restrição e electroforese em gel de agarose. Estes fragmentos são como se segue :

I: aproximadamente 1,6 kb: da digestão com HindIII mais Ahall (HindIII /“5* relativamente â sequencia codificadora do plas_ minogenio? ate Ahall (1572) do pTRH6.

II: aproximadamente 0,18Kb: da digestão com Ahall mais Ddel (Ahall (1572) ate Ddel (1748) do pTRH6.

III: aproximadamente 5,3 Kb: o fragmento maior da digestão com HindIII mais BglII, do pTRE12D Nar. Este fragmento e portador das funções de vector do pTRE12DNar.

Estes fragmentos (I, II, III) foram ligados com um oligonucleotideo adaptador fosforilado

-54(adaptador IV) compreendendo dois ol igonucleotideos com as sequências :

5' TCAGTGTGCGGCGCCTGGTACCA 3’ (B)

5' GATCTGGTACCAGGCGCCGCACAC 3'(C)

Apos transformação de E .coli HB101 isolou-se o plasmideo pTRH9 (Fig.2)

DNA no plasmideo pTRH9 codifica a maior parte da cadeia A do plasminogenio ate â prolina 544 inclusive, i.e. domínios de ansas múltiplos 195; faltam o DNA codificador da cadeia B do plasminogenio e o restante da cadeia A. 0 uso do adaptador IV na construção do pTRH9 introduz um sitio NarI unico, como se pode ver pela Tabela 1 (que mostra a junção dos fragmentos II e III e o adapatador IV).

-55TABELA I

Junção dos fragmentos II e III e adaptador IV no plasmídeo pTRH9

Fragmento —FragmentolI-><-Adaptador IV-9 <-III—

Ddel NarI BglII ¹⁷⁴⁵ , X y ⁷⁵⁵ .'—'X *⁷⁶⁵ ’ GAT GTC CC*r CAG TGT GCG GCG* CCT GGT ACC ÀGA TCT 3 ’ ' CTA CAG GGA Gljc ACA CGC CGC | GGA CCA TGG TCT AG^A 5 ' asp vai pro gin cys ala ala pro

537 538 539 540 541 542 543 544

Esta apresentada a sequencia de aminoácidos do plasminogenio * Este residuo e C no cDNA do plasminogenio

Esta incluída a numeração dos nucleotideos (acima da sequencia) plasmídeo pTRH9 foi cortado com BglII e ligado ao fragmento BglII de 2Kb codificador do polipeptídeo t-PA maduro isolado a partir do pTRE15 (EP-A-0 201 153).

Isolou-se um clone de E .coli HB101 portador da inserção do t-PA na mesma orientação ( 5 ¹ ->3 ¹ ) do DNA da cadeia A do plasminogenio; este plasmídeo foi designado pTRH20 (ver Fig.3/).

-560 plasmídeo pTRH20 codifica uma molécula compreendendo os cinco domínios de ansas múltiplas do plasminogenio (resíduos 1 a 544) ligados ao extremo N do t-PA maduro através do tripeptideo gli-tre-arg. A junção da cadeia A do plasminogenio e do DNA de cadeia A do t-PA do plasmídeo pTRH20 esta apresentado na Tabela 2.

TABELA 2

Junção do DNA da cadeia A do plasminogenio e DNA da cadeia A de t-PA no plasmídeo pTRH20.

BglII

5'

CCT

CAG

TGT

GCG

GCG

CCT

GGT

ACC

ApA

TCT

TAC

CAA 3

3 '

GGA

GTC

ACA

CGC

CGC

GGA

CCA

TGG

TCT

ag|a

ATG

GTT 5

pro

gin

cys

ala

ala

pro

gly

thr

arg

ser

tyr

gin

539

540

541

542

543

544

1

2

3

Sequências do Plasminogenio

->

Sequências de aminoácidos

Tripeptideo de ligação

-570 DNA codificador da cadeia A do t-PA e de parte da cadeia B foi removido do pTRH20 por digestão com NarI e SstI(situado no nucleotideo 1417 do t-PA como descrito por Pennica et al 1983). 0 fragmento maior

SstI-NarI (7,9 Kb) foi isolado (fragmento V).

Um fragmento BanII de aproximadamente 0,4 Kb (fragmento VI) foi isolado a partir de pTRE15. Os dois sitios BanII importantes estão situados nos nucleotideos 1024 e 1417 na sequencia do cDNA do t-PA descrita por Pennica et a 1 (1983). BanII tem um sitio de reconhecimento degenerado, i.e:

' . . . . G Pu GC Py C.....3 ' ' . . . . C Py CG Pu G.....5 '

Note-se que o sitio BanII em

1417 e idêntico ao sitio SstI em 1417 e também que o extremo coesivo criado e compatível com um extremo coesivo SstI. Os fragmentos BanII de 0,4Kb codifica a maior parte da cadeia B do t-PA.

Dois nucleotideos (D) e (E)

5' CGCCGTCGACCTGCGGCCTGAGACAGTACAGCCAGCCTCAGTTTCGCATC AAAGGAGGGCT 3' _(D}

5’ CTCCTTTGATGCGAAACTGAGGCTGGCTGTACTGTCTCAGGCCGCAGGTC GACGG 3' ,p >

-58foram sintetizados, fosforilados e combinados para formar o adaptador VII adaptador VII tem um extremo coe sivo 5' NarI, compatível com o extremo coesivo NarI do fragmento V e um extremo coesivo 3' BanII compatível com o extremo Bani I(nucleotideo 1024) do fragmento VI.

Os fragmentos V e VI juntamente com o adaptador VII foram ligados e transformados em E .coli HB101 . Isolou-se um plasmídeo (pTRH204) com a estrutura descrita na Fig.4.

Na Tabela 3 esta apresentada a junção do fragmento V e do adaptador VII.

A ligação dos fragmentos V e VI através dos extremos coesivos BamII (1417) e SstI completou a reconstrução da região codificadora da cadeia B do t-PA.

-59Tabela 3

Junção de fragmentos V e adaptador VII no plasmideo pTRH204 ·· —Fragmento V-—Adaptador VII

Ddel NarI

CCT	CAG	TGT	GCG	GCG CCG	TCG ACC	TGC	GGC	CTG	3 *
GGA	GTC	ACA	CGC	cgc|ggc	AGC TGG	ACG	CCG	GAC	5 '
pro	gin	cys	ala	ala pro	ser*thr	cys	giy	leu
539	540	541	542	543 544	263	264	265	266

Sequências do Sequências do plasminogenio t-PA

Mostram-se as sequências de aminoacidos do plasminogenio e do t-PA na junção (plasminogenio numeração 539-544 e t-PA numeração 263-265). 0 residuo serina assinalado com # pode ser considerado equivalente à serina 545 do plasminogenio ou serina 262 do t-PA.

plasmídeo pTRH204 foi usado para transfectar as células HeLa humanas (como descrito nos Me todos) e produzir um novo activador do plasminogenio (H204) que se pensa ter a estrutura do plasminogenio 1-544/t-PA 262-527.

-601.4 Processo alternativo para o plasmídeo pTRH9 clone de cDNA do plasminogenio obtido a partir de uma biblioteca de cDNA de fígado humano apos despiste com a sonda ol igonucleotidica (A), foi subclona^ do no vector pTRE12 (EP-A-0 201 153) entre os sitios HindIII e BglII para criar o plasmídeo pTRH3, Fig.1 (b). 0 sitio uni co NarI inicialmente preesnte no plasmideo pTRE12 foi destruj_ do cortando com enzimas de restrição , fazendo extremos cegos e realização. A remoção do sitio NarI ajuda a posterior manipulação.

Tres fragmentos do pTRH3 foram preparados por digestão com enzimas de restrição e electroforese em gel de agarose. Estes fragmentos são como se segue:

I: aproximadamente 1,6Kb: a partir de digestão com HindIII mais Ahall (HindIII /“5' relativamente â sequencia codificadora do palsminogenio7 atras Ahall (1572).

II: aproximadamente 0,18Kb: a partir da digestão com Aha II ou mais Ddel (Ahall (1572) ate Ddel (1748).

III: aproximadamente 5,3Kb: o fragmento maior de uma digestão com HindIII e BglII, portador das funções de vector do pTRH3.

Estes fragmentos (I, II, III) são ligados com o adaptador oligonucleotideo fosforilado IV descrito acima.

Exemplo 2

Plasminogenio 1-544/t-PA 262-527 (arg-=► g1 η) (H 205 )

Construção do plasmídeo pTRH205

Uma molécula de activador do pias minogenio hibrido semelhante â produzida no Exemplo 1 mas d_i_ ferindo apenas no residuo de aminoacido 275 do t-PA, que e glutamina em vez de arginina, também faz parte do invento.

DNA codificador deste activador do plasminogenio foi preparado de um modo geral como descrito no Exemplo 1, diferin do apenas na sequencia de nucleotideos do adaptador em que o tripleto codificador de arg-275, CGC, no adaptador VII foi substituido por CAG codificador de glu-275. 0 plasmídeo resultante pTRH205 foi usado para transfectar células HeLa humanas (como descrito nos Métodos) e produziu um novo actj_ vador do plasminogenio (H205) que se pensa ter a estrutura do plasminogenio 1-544/t-PA 262-527 (arg^g -► glu).

-62Exemplo 3

Plasm i nogen i o	1-541/t-PA 262-527 (H37)
Construção do	plasmideo pTRH37

plasmideo pTRH37 foi construído pela ligação de 2 fragmentos do pTRH204 (Exemplo 1) juntamente com o fragmento VI do pTRE15 e um oligonucleotideo adaptador (adaptador XI):

Fragmento IX:	o fragmento de 7,2 kb de pTRH204 desde o sitio SstI na região codificadora de cadeia B do t-PA/nucleotideos 1417 na sequencia do t-PA) ate ao sitio BstXI na região codificado ra da cadeia A do p1 asminogenio(nucleotideo 1209 na sequencia do plasminogenio). ( 0 frag mento IX contem assim todas as sequências do vector).
Fragmento X:	o fragmento de 484pb do pTRH 204 desde o sitio BstXI (1209) ate ao sitio Avall na região codificadora da cadeia A do plasmino genio no nucleotideo (1693)
Fragmento VI :	(SstI-BanII) foi descrito anteriormente (Exem pio 1 ) .

-630 adaptador XI foi formado por emparelhamento de 4 oligonuc1eotideos (Η, I, J e K ) com as sequências:

5' GTCCCTGGTG CTACACGACA AATCCGCGGA AACTTTACGA CTACTGTGAT GTCCCTCAGT GTTCGACCTG CGGCC 3' (H)

5' TGAGACAGTA CAGCCAGCCT CAGTTTCGCA TCAAAGGAGG GCT 3' (I)

5' CTCCTTTGAT GCGAAACTGA GGCTGGCTGT ACTGTCTCAG GCCGCAGGTC GAACACTGAGGG 3' (J)

5’ ACATCACAGT AGTCGTAAAG TTTCCGCGGA TTTGTCGTGT AGCACCAGG 3' (K)

Isolou-se um plasmídeo (pTRH37) que tem a estrutura mostrada na Fig.5. 0 plasmídeo, quando introduzido nas células HeLa humanas, dirigiu a expressão de um novo activador do plasminogenio (H37) que tem a mesma sequencia de aminoácidos da proteina H204 (Exemplo 1) excepto no que respeita a uma delecção dos resíduos de aminoacidos alanina (542), alanina(543) e prolina (544) imedi£ tamente C4erminais relativamente ao dominio de ansas múltiplas 5. A estrutura da proteina hibrida entre o dominio de ansas múltiplos 5 e o sitio de clivagem por proteases es ta mostrada em baixo usando a notação de letras únicas: ^{54 * 54}J?TCGLRQYSQPQFR?⁷⁶ cadeia B do t-PA

-64Ο residuo no domínio de ansas múltiplas 5. A asterisco pode ser identificada com nio ou serina₂g2 t-^pA·

541 e a ultima cisteina serina marcada com um serina₅₄₅ do plasminoge.

Exemplo 4

Plasminogenio 78-544/t-PA 262-527(H00)

4.1 Construção do plasmideo com cassete liSyg plasmideo com acassete liSyg e uma forma do plasmideo pTRE12 contendo um pedatp~de DNA sintético que pode ser usado para converter um clone do plasminogenio da forma glu^ (glu^ e o extremo N normalmente secretado) para a forma 1iSy_g(liSy_g e então o aminoacido N-termina 1 ) .

Um par de oligonucleotideos adaptadores fosforilados (R+S e T+V) compreendendo quatro oli gonucleot i deos:

I

-655' AGCTTCCAGT CCCAAAATGG AACATAAGGA AGTGGTTCTT

CTACTTCTTT TATTTCTGAA ATCGGGACAA GGAAAAGTGT ATCTCT 3' (R)

5' ACACTTTTCC TTGTCCCGAT TTCAGAAATA AAAGAAGTAG

AAGAACCACT TCCTTATGTT CCATTTTGGG ACTGGA 3' (S)

5' C AGAGTGCAAG ACTGGGAATG GAAAGAACTA CAGAGGTACC ATGTCCAAAA CAAAAAATGG CATCACCTGT CAA 3' (T)

5' GATCTTGACA GGTGATGCCA TTTTTTGTTT TGGACATGGT

ACCTCTGTAG TTCTTTCCAT TCCCAGTCTT GCACTCTGAG AGAT 3' (V) foram preparados a ligados ao fragmento Hind 111-Bg 111 do pTRE12 .

plasmídeo resultante continha uma região formada pelos oligonucleotideos incluindo os nucleotideos 65-132 inclusive, 364-450 inclusive do plasminog os codificam a sequencia sinal por Forsgren et a 1 ( 1987) e os da cadeia A do plasminogenio. Κρη I (Tabela 4). A estrutura foi verificada por sequenciaçã ligados aos nucleotideos nio nativo. Estes nucleotide de 19 aminoácidos como descrito aminoácidos 78-106 inclusive Introduziu-se um sitio unico da inserção oligonucleotidica do DNA.

-66TABELA 4

Estruturas da inserção da cassete 1is_7Q

	met	glu	his	lys	glu	vai	vai	leu	leu
AGCTTCCAGTCCCAAA	ATG	GAA	CAT	AAG	GAA	GTG	GTT	CCT	CTA
HincÍAGGTCAGGGTTT	TAC	CTT	GTA	TTC	CTT	CAC	CAA	GAA	GAT

ii:

leu

leu

leu

phe

leu

lys

ser

gly

gin

giy:

*lys

vai

tyr

CTT

CTT

TTA

TTT

CTG

AAA

TCA

GGT

CAA

GGA

AAA

GTG

TAT

GAA

GAA

AAT

AAA

GAC

TTT

AGT

CCA

GTT

CCT

TTT

CAC

ATA

leu

ser

glu

cys+lys

thr

gly

asn

gly

lys

asn

tyr

arg

CTC

TCA

GAG

TGC

AAG

ACT

GGG

AAT

GGA

AAG

AAC

TAC

AGA

GAG

AGT

CTC

ACG

TTC

TGA

ccc

TTA

CCT

TTC

TTG

ATG

TCT

gly

thr

met

ser

lys

thr

lys

asn

gly

ile

thr

cys

gin

GGT

ACC

ATG

TCC

AAA

ACA

AAA

AAT

GGC

ATC

ACC

TGT

CAA

!BglIX

CCA

TGG

TAC

AGG

TTT

TGT

TTT

TTA

CCG

TAG

TGG

ACA

GTT

ctagJ

Kpnl SfaNI

Usaram-se os extremos coesivos HindIII e BglII para clonar nos sitios HindIII-Bg1II em pTRE12. SfaNI corta num sitio longe da sua sequencia de reconhecimento, gli * indica o ultimo residuo da sequencia sinal; cis⁺ e o primeiro residuo do dominio K^.

-674.2 Construção do plasmideo pTRH34 (Plasminogenio 1-561/t-PA 276-527 plasmideo pTRH34 foi construído essencialmente como decsrito para o plasmideo pTRH204 (Exemplo 1) pela ligação dos fragmentos V e VI juntamente com um adap tador, mas em vez disso do adaptador VII, usou-se o adaptador VIII. 0 adaptador VII foi formado por empare1hamento de 2 oligonucleotideos (F e G):

5' CGCCTTCATT TGATTGTGGG AAGCCTCAAG TCGAGCCGAA GAAATGTCCC GGGAGGATCA AAGGAGGGCT 3'

5' CTCCTTTGAT CCTCCCGGGA CATTTCTTCG GCTCGACTTG AGGCTTCCCA CAATCAAATG AAGG 3'

Isolou-se um plasmideo pTRH34, com a estrutura mostrado na Fig. 6. 0 plasmideo pTRH34 quando usado para transfectar células HeLa humanas dirige a síntese de um novo activador do plasminogenio compreendendo toda a cadeia A do plasminogenio (g1u₁-arg₅g₁ ) ligada direct/ mente â cadeia B completa do t-PA ( ^^e276~P^ro527 '

-684.3 Construção do plasmideo pTRHOO plasmideo pTRHOO e uma forma do plasmideo pTRH204 (Exemplos 44), em que a sequencia de nucleotideos codificadora dos aminoácidos glu_₁ 1is₇₇ da protej_ na plasminogénio foi eliminada.

Os fragmentos de DNA que se seguem foram preparados por digestão com endonucleases de restrição e electroforese em gel de agarose:

Fragmento I: aproximadamente 160pb; a partir de uma digestão com HindIII mais SfaN1 do plasmideo com a cassete 1iSyg do Exemplo 4.1 /i.e. desde o sitio HindIII no extremo s¹ da sequencia do adaptador olIgonucleotidico ate ao sitio SfaN1 interno-ver tabela 47 e e portador de uma sequencia de nucle£ tideos codificadora da sequencia sinal de 19 aminoácidos como descrito por Forsgreen et al( 1987 ) ligada aos aminoácidos 78-104 inclusive (o extremo protuberante SfaN1 estende-se ate aos aminoácidos 105 a 106 ) da cadeia A do plasminogénio

Fragmento II: -aproximadamente 772pb; a partir de uma diges_ tão com SfaN1 mais BstXI do pTRH34 do Exemplo 4.2 (SfaN1 (437 ) ate BstXI ( 1209), este possui a maior parte de K^, to do o e KgP e a secção N-terminal do «₄ ^P.

Fragmento III : -aproximadamente 7kb; a partir de uma digestão com BstXI e Hind III do pTRH204 (Bst XI corta em (1209) e HindIII esta situado 5'relativamente â sequencia Codificadora do plasminogénio). Este possui a maior parte de K₄ ^P, todo ο Κ^^ρ, e as funções de vector do pTRE12.

-69Estes fragmentos foram ligados, apos transformação em coli HB101 isolou-se o plasmídeo pTRHOO (Fig.7). pTRHOO foi usado para expressar o novo activador do plasminogenio híbrido H00 em células HeLa.

Exemplo 5 t-PA 1-50/ t-PA 88-91/pro-gli-ser/plasminogenio

84-544/t-PA 262-527 (H01) plasmídeo pTRH101 foi projectadô para codificar uma proteína madura em que o dominio codific^ dor do t-PA e ligado ao extremo 5' do dominio codificador do k/ no plasmídeo pTRHOO (Exemplo 4) ; a estrutura global dos domínios da proteína nativa codificada pode ser abrevia^ do como se segue:

F^tK₁pK₂PK₃PK₄PK₅PB^t

Construção do plasmideo pTRHOl

Dois fragmentos de DNA preparada pela digestão com endonucleases de restrição e electroforese em gel de agarose. Estes fragmentos foram como se segue:

-70Fragmento I: - aproximadamente 360pb: a partir de uma digestão com HindIII mais BamHI do plasmídeo pTR6F (descrito em EP-024 1208). A inserção em pTR6F possui a região 5' não traduzida e as regiões sinal/pro assim como o dominio

Fragmento II : - aproximadamente 8kb: a partir de uma digestão com HindIII mais Kpml do plasmídeo pTRHOO (Exemplo 4) este e portador de quase todo o K^, todo o K₂ ^P, K3^P, K4^P, K_g ^p, B^p e as funções de vector do pTRE12.

Estes fragmentos foram ligados a um o 1igonuc1eotideos adaptador fosforilado compreendendo dois oligonucleotideos (W e X) com a sequencia:

5' GATCTTGCAAGACTGGGAATGGAAAGAACTACAGAGGTAC 3' (w)

5' CTCTGTAGTTCTTTCCATTCCCAGTCCTGCAA 3' (X)

Apos transformação em E.coli isolou-se o plasmídeo pTRHOl (Fig.8). A sequenciação de DNA confirmou a estrutura de ligação F^/K^ (Tabela 5).

-71pTRHOl foi usado para expressar um novo activador do plasminogenio híbrido (H01 ) , que se pensa ter a sequencia t-PA 1-50/t-PA 88-91/pro-g1i-ser/ plasminogenio 84-544/t-PA 262-527, em células HeLa.

Tabela 5

Junção dos fragmentos I e II e adaptador (W+X) no plasmídeo pTRHOl

Fragmento I

5 '	... ACC	AGG	GCC	ACG	CCC
3 '	... TGG	TCC	CGG	TGC	GGG
	Thr	Arg	Ala	Thr	Pro

- Adaptador

BamHI

G|3A TCT TGC AAG ACT GGG AAT
CCT	AGA 1	ACG	TTC	TGA	CCC	TTA
Gly	Ser	Cys	Lys	Thr	Gly	Asp

Kl plgn ~2>·^—Fragmento II

Kpnl

GGA AAG AAC TAC AGA GGT

Acfc:

ATG

CCT TTC TTG ATG TCT dCA TGG TAC

I

Gly Lys Asn Tyr Arg Gly Thr Met, ►

-72Exemplo 6 t-PA 1-91/pro-g1i-ser/plasminogenio 84-544/t-PA 262-527 (H02) plasmideo pTRH02 foi projectado para codificar uma proteína madura em que os domínios codifj_ cadores e do t-PA são ligados ao extremo 5' do domínio codificador de no plasmideo pTRHOO (Exemplo 4); a estr£ tura global dos dominios da proteina nativa codificada pode ser abreviada como abaixo:

F^tG^tK₁PK₂PK₃PK₄PK₅PB^t

6.1 Preparação de DNA codificador dos dominios em dedo e do factor de crescimento do t-PA (mais as regiões sinal /pro e 5' não traduzida, do t-PA

6ug do plasmideo pTRE15/descrito em EP-A-0 201 153) foi digerido com Maell. 0 DNA cortado com Mae II foi dotado de extremos cegos e adaptadores BamHI fosfori1ados(0,1 unidades Α₂θθ; Amersham DC1203) da sequencia 5'CCCGGATCCGGG3' foram ligados a 5 ug dos fragmentos Mae II de extremos cegos₄. Apos ligação os adaptadores em excesso foram removidos e criados extremos coesivos por digestão com BamHI. 0 produto da digestão com BamHI foi sujeito a electroforese num gel de 1% de agarose de baixo ponto de fusão. Neste gel houve um grupo de tres bandas com mobilidade entre as dos fragmentos de 1353 e 872 pares de bases encontradas na digestão de DNA de Lambda-Hind 111/X174RF-Hae III (Drigest TMIII, Pharmacia). A maior destes tres bandas,

-73aproximadamente 1200pb, foi recuperada (não foi feita qualquer tentativa especial para assegurar que as outras bandas com mobilidade semelhante não contaminassem esta preparação, uma vez que as molceulas indesejáveis foram eliminadas na estratégia de clonagem). 0 fragmento de 1200 pb foi digerido com HindIII para criar o fragmento pretendido com aproximadamente 470pb com um extremo coesivo HindIII 5' e um extremo coesivo BamHI 3' (convertido a partir do sitio MaelI).

Este DNA codificador dos domínios em dedo mais factor de crescimento foi subclonado no plasmideo pTRE12 (EP-A-0 2007589) entre os sitios HindIII e BamHI para criar o plasmídeo pTR6FG. pTR6FG também possui a região não traduzida 5' e as regiões sinal/pro.

6.2 Construção de pTRH02

Dois fragmentos de DNA foram preparados por digestão com endonucleases de restrição e electro forese em gel de agarose. Estes fragmentos são como se segue :

Fragmento I: aproximadamente 470pb: a partir de digestão com HindIII mais BamHI de plasmídeo pTR6FG.

Fragmento II : aproximadamente 8kb: a partir de digestão com HindIII mais Kpnl do plasmídeo pTRHOO (Exemplo 5), portador de quase toda K^^p, todo o K₂ ^P, K3^P, K4^P, K₅ ^P, B^ e as funções de vector do pTRE12.

Estes fragmentos foram ligados com um oligonucleotideo adaptador fosforilado compreendendo dois oligonucleotideos (W) e (X) do Exemplos 5.

Apos transformação em E .coli .0 plasmideos pTRH02 foi isolado (Fig.9).

plasmídeo pTRH02 foi usado para expressar um novo activador do plasminogenio hibrido (H02), que se pensa ter a sequencia t-PA 1-91/pro-gli-ser/plasmingenio 84-544/t-PA 262-527, em células HeLa.

Exemplo 7

Plasminogenio 1-546/u-PA 137-411(H 25)

Construção do plasmídeo pTRH25

Um clone de cDNA da urocinase huma na foi identificado por despiste com uma sonda oligonucleotidica e foi isolado por meios convencionais (Holmes et al (1985) Bio Technology, 2’ 923-929). 0 clone de cDNA foi modificado por técnicas de mutagenes in vitro convencionais para incorporar num istio SstI no nucleotideo 563 e um sitio BglII na região 3' não traduzida. Os aminoácidos 143 e 144 foram então codificados pelos tripletos de nucleotideos GAG CTC em vez de GAA TTA nativo (plasmídeo pTRU2).

λ

-/5Para criar a sequencia codificadora da enzima hibrida, o plasmídeo pTRH9 (Exemplo 1) foi digerido com NarI e BglII e isolado o fragmento I de aproximadamente 7kb(poratdor das funções de vector e da maior parte da região codificadora da cadeia A da plasmina). 0 plasmidep pTRU2 foi digerido com SstI e BglII e isolado o fragmento II codificador da cadeia B da urocinase. Produziu-se um oligonucleotideo adaptador III composto por dois oligonucleotideos fosforilados Y e Z.

5' CG CCT TCA TTT CCC TCC TCT CCT CCA GAA GAG CT 3' (Y)

3' GGA AGT AAA GGG AGG AGA GGA GGT CTT C 5' ( Z )

Os fragmentos I e II e o adaptador III foram ligados e usados para transformar E.coli HB1O1 e isolado o plasmídeo pTRH25 (Fig.10). 0 novo plasmídeo codifica uma nova enzima hibrida. A estrutura na região da ligação entre os fragmentos I, II e adaptador III pensa-se ser como se mostra na Tabela 6.

Tabela 6

-76Nar I

TGT	GCG	OCG	CCT	TCA	TTT	CCC
ACA	CGC	CGC1	IGGA	AGT	AAA	GGG
cys	ala	ala	pro	ser	phe	pro
541	542	543	544	545	546	137

TCC	TCT	CCT	CCA	GAA
AGG	AGA	GGA	GGT	CTT
ser	ser	pro	pro	glu
138	139	140	141	142

«-1-_>

Sequências do plasminogenio Sequências da urocinase

Sst	I
GAG	οφ	AAA . . .
cfrc	GAG	TTT ...
glu	leu	lys
143	144	145

plasmídeo pTRH25 foi usado para transfectar células HeLa humanas e produzir um novo activador do plasminogenio.

-77Exemplo 8

Expressão do plasminogenio 1-544/t-PA 262-527(H204) em células do Ovário de hamster Chinês plasmideo pSV₂dhfr foi obtido na American Type Culture Collection (ATCC 37146: Molec. Cell Biol .J_, : 854-864, 1981). 0 plasmideo BPV-mT-Xhol foi obtido de D. Hamer (National Institute of Health, Bethesda, Maryland) e contem uma versão do gene da meta 1otioneina I de ratinho (Hamer e Mailing ( 1982 ) J.Mol.Appl. Genet. 1, 273-288 )em que o sitio BglII foi imediatamente 5' relativamente ao ponto de iniciaçaõ da tradução foi convertido num sitio Xhol com adaptadores. 0 plasmideo pTRE24 da muteina do t-PA foi anteriormente descrito (EP-0 207 589).

8.1 Construção de um vector de expressão ampl if icavel :

a. Construção de pTRH69 plasmideo pTRH69 foi convertido a partir de dois fragmentos A e B isolados a partir do plasmj_ deo PSV₂dhfr e do plasmideo BPV-MT-Xhol, respectivamente.

Fragmento A: 0 plasmideo PSV₂dhfr (fig.11) foi linearizado com EcoRI, dotado de extremos cegos por preenchimento e ligação de adaptadores Xhol. 0 plasmideo linearizado foi então digerido com Xhol e BglII dando origem ao fragmento A (um fragmento de 3,4 kb codificador do cDNA da redutase do di-

-78-hidrofolato e da sequencia do promotor precoce do SV40.

Fragmento B : 0 plasmideo BPVMT-Xhol foi linearizado com

SstI dotado de extremos cegos por digestão com nuclease e provido de adaptadores BglII nos extremos. 0 plasmideo 1ine ar foi então digerido com HindIII, dotado de extremos cegos, por preenchimento e provido de adaptadores Xhol. 0 plasmideo foi então digerido com BglII e Xhol dando origem ao fra£ mento B (0,3 kb codificando as sequências 3' de poliadenilação da metalotioneina (Fig.12).

Os fragmentos A e B foram isolados por electroforese em agarose LPM e ligados ao outro. 0 DNA ligado foi usado para transformar E.coli HB101 e obtido o plasmideo pTRH69 (Fig.13).

b. Construção de pTRH71 plasmideo pTRH69 foi linearizado com Xhol e tratdo com fosfatase. 0 fragmento purificado em agarose LMP foi ligado com um fragmento Xhol de 3,3kb derivado do plasmideo pTRE24 que codifica uma proteína t-PA modificada. 0 DNA ligado foi usado para transformar E.coli HB 101 e obteve-se o plasmideo pTRH71 (Figura 14).

c. Construção do pTRH11 plasmideo pTRH11 foi digerido com MluI e BamHI ; isolou-se uma fragmento de 4,5kb (compreendendo as funções de vector) por purificação em gel de aga-

-79rose LPM e foi ligado com um fragmento MluI/BamHI de 4,1 kb isolado a partir de pTRH204 (Exemplo 1) codificada da prote/ na hibrida H204. 0 DNA ligado foi usado para transformar

E.co1i HB101 e obtido o plasmideo pTRH11 (Fig.15).

8.2 Exepressão de proteína hibrida

a. Preparação das células

Células CHO foram tripsinizadas e semeadas a 5x10 por placa de 60mm e deixadas em meio de cultura (meio nutritivo Hams F12 (041-1765) com 1% de solução stock de glutamina (043-5030) 1% de penicilina/ estreptomicina stock¹¹ (043-5070 ) e 10% de soro fetal de vitela (013-6290); Gibco, Paisley, Scotland) a 37°C numa incubadora humidificada numa atmosfera de 5% de 00^/95% de ar. Apos 18hrs. as células foram novamente alimentadas, apos mais 3 horas as células foram usadas para transfecção de DNA.

b . Processo de transfecção processo de transfecção, efectuado em meio de crescimento usou coprecipitação em cálcio e choque com glicerol como descrito em DNA Cloning Ed.D.M. Glover(Capitulo 15, C. Gorman). Apos transfecção as células foram mantidas em meio de crescimento durante 46 horas nas condições de cultura (como acima) antes do processo de sele/ ção.

-80c. Selecção e co-amplificação processo de selecção e co-amplificação foi efectuado essencialmente como descrito por R.J. Kaufman (1985) Molecular and Cellular Biology 5, 1750-1759. 46hrs. depois da transfecção mudou-se o meio as células para meio selectivo (Eagles MEM (041-1095) com 1% de piruvato de sodio stock (043-1360) 1% de glutamina stock (043-5030), 1% de penici1ina/estreptomicina stock (043-5070), 0,35% de prolina (22 mg/ml) e 10% de soro fetal de vitela dia 1 isado(063-6300 ) (Gibco, Paisley, Scotland).

As células foram mantidas em meio selectivo durante 8-10 dias ate aparecerem colonias de células dhfr⁺. Quando surgiram colonias as células mudaram para um meio selectivo contendo metotrexato (A 6770); Sigma), England). Apos 6 dias em meio selectivo contendo metotrexato o meio selectivo foi modificado por substituição dos componentes Eagles MEM e piruvato de sodio comHMEM (041-02561). A concentração de metotrexato foi inicialmente de 0,02ρΜ e foi aumentada gradualmente ate 0,05uM.

d. Detecção da proteina hibrida H204

Durante o processo de amplificação amostras do meio de crescimento das células em cultura, foram testadas quanto â produção de activador do plasminogenio pelas placas de fibrina e zimografia como descrito por Dodd et a 1 ( 1986 ) Thrombos i s and Haemostasis, 55 , 94-96. A zimografia revelou uma proteina fibrinoliticamente activa con Mr aparente de aproximadamente 100 000, que e consistente con o peso molecular esperado da proteina hibrida H204.

-81IV. Purificação e modificação pos-sintetica de proteínas híbridas

Exemplo A

Purificação do plasminogenio 1-544/t-PA 262-527 (H204)

200 ml de meio de cultura condicio nado obtido a partir de culturas de células HeLa transfectadas com o plasmideo pTRH204 (Exemplo 1) foi centrifugado a 9000 g durante 30 minutos e o sobrenadante guardado. Aplicou-se numa coluna (di , 90mm; alt.220mm) de Sephadex G 25* equilibrada em PBS (Dulbecco A) /0,01% Tween 80 pH 7,4 (PBS/TW). Rejeitou-se os primeiros 0,35 vt aproximei damente. Os 500 ml de que se seguiram foram guardados e cromatografados em quelato de zinco-Sepharose (vt=80ml) e lisina -Sepharose (vt=20 ml) essencialemente como descrito anteriormente (Dodd,I. et al (1986a) FEBS Lett 209, 13)

A principal diferença foi que o activador purificado foi dissociado da segunda coluna usan do fosfato de sodio 0,05M/cloreto de sodio 0,1M (0,01% Tween 80 pH7,4). (PST) contendo acido £-aminocaproico ( £-ACA) 0,02M.

As fracções activas eluidas pelo tampão PST/ £-ACA foram identificadas usando o substracto cromogenico H-D-ile-pro-arg-p nitroaleto (Dodd,I. et a 1 ( 1986b) Thromb. Haem. 55, 94) e foram concentradas por ult£ filtração com célula de agitação (YM10, Amicon).

♦ Sephadex e Sepharose são marcas registadas.

-820 material retido ultrafi ltrado (2,0 ml) continha 14 400 UI e 4800 SU (Dodd, I et aj_(1986b)

A electroforese em gel de dodeci1sulfato de sodio e poliacrilamida (SDS-PAGE) seguido de zimografia com fibrina (Dodd I, et aI , 1986b) mostrou que o produto continha um especie fibrinolitica principal com M_f aparente de aproximadamente 100 000 consistente com o isolamento de uma forma glu₁ do activador hibrido.

Exemplo B

Sintese da proteina 1is^g tc H204 (plasminogenio de duas cadeias 78-544/t-PA 262-527

Uma preparação da proteina H204 purificada do Exemplo A, a que tinha sido mudado o tampão para PST/10 mg ml^-1 de manitol/ S-ACA 50 jjM (89 000 UI,

1,9 ml) foi tratada com um excesso molar de 0,01 vezes de plasmina a 25°C durante 16 h e depois guardada a -40°C.

A analise subsequente do produto mostrou que continha 68 000 UI e 32 000 SU. 0 activador tinha um M_p aparente de aproximadamente 10 000 por SDS-PAGE seguido de zimografia com fibrina. A natureza lis, tc do produto foi confirmada porpor SDS-PAGE seguido de immunoblotting usando um anticorpo policlonal contra a cadeia B do t-PA (ver secção dos Métodos).

-83Exemplo C

Preparação de 2-amino-4-clorobenzoi1-plasminogenio 78-544/ t-PA 262-527 (duas cadeias) ex., células HeLa

A proteina lis^-tc H204 purificada do Exemplo B (3900 SU) em PST/12,5 pM £-ACA/2,5 mg ml~^{* 1} de manitol (1 ml) foi tratada com uma solução de 5mM de hidrocloreto de 4-amidinofeni1-2¹-amino-4 ¹ -c1orobenzoato (Exemplo 11 aqui) em dimetilulfoxido (2 p1 , 20 e.g.).Apos h de incubação a 25°C observou-se uma inibição de 40%

Uma outra quantidade pequena (4μ1 , 40 e.g.) de solução de agente de acilação foi adicionado e apos mais 1 h a 25°C obteve-se 93% de inibição. Mudou-se o tampão do material usando uma coluna de Sephadex G25 (PD 10) em PST/16^uM e ^-ACA/1,66 mg/ml“¹ de manitol (1,35 ml) e congelou-se a -40°C. 0 material foi desacilado por diluição da solução stock (0,3 ml) com PST(0,2 ml) para dar uma solução final de PST/100 ^iM ó-ACA/1 mg ml^-1 de manitol. A velocidade de desacilação no sistema tampão acima a 37°C foi de 1,05 χ 10“4 seg“1 i.e., a t¹/2 de 110 min.

-84Exemplo D

Purificação do plasminogenio 1-544/t-PA 262-527 (3^275—* g1 η)(H205 )

515 ml de meio de cultura condicionada obtido a partir de culturas de HeLa transfectadas com pTR H205 (Exemplo 2) foi usado em purificação como des crito no Exemplo A. 0 activador hibrido foi eluido da coluna de 1isina-Sepharose usando PST/20 mM, £-ACA, foi concentrado por ultrafiltração e mudou-se então 0 tampão para PST/1O mg ml^-1 de manitol 50 ^iM £-ACA (2,0 ml).

produto continha 18 000 UI e 6600 SU. A analise por SDS-PAGE seguido de zimografia com fibrina mostrou que a preparação continha duas especies fibrinoliticas principais, com Mr aparente de aproximadamente 100 000 e 90 000.

Pensa-se que estas sejam as formas glu₁ e lisyg do activador hibrido.

-85Exemplo Ε

Purificação do plasminogénio 1-541/t-PA 262-527 (H 37)

510 ml de meio de cultura condicio nado clarificado que tinha sido obtido a partir de culturas de células HeLa que foram previamente transfectadas com o plasmideo pTR H37 (Exemplo 3) foi purificado essencialmente com o descrito para H204 no Exemplo A. 0 activador híbrido foi dissociado da coluna de 1isina-Sepharose usando PST/20 mM e L-ACA, foi concentrado por ultrafiltra^ ção e trocou-se-lhe em seguida o tampão para PST/10 mg ml^-1 de manitol / í-ACA 50 juM (2,0 ml).

produto continha 36 000 UI e 15 000 SU. A analise para SDS-PAGE seguido de zimografia com fibrina mostrou que a preparação continha duas especies fibrinoliticas principais, com uma Mr aparente de apro ximadamente 100 000 e 90 000.

Pensa-se que estas sejam as formas do activador glu^ e liSyg. SDS-PAGE do activador não reduzido seguido de coloração com prata mostrou que a preparação continha bandas fortes de proteína a Mr de aproximadamente 10000.

A analise por SDS-PAGE seguido de immunoblottingusando um anticorpo policlonal contra a cadeia B do t-PA apoiou os resultados de zimografia indicando a presença das formas glu₁ e liSyg e mostrou que o produto consistia todo na forma de duas cadeias.

-86Exemplo F

Preparação da proteina liSygtc H37 (plasminogenio de duas cadeias 78-541/t-PA 262-527)

A proteina H37 purificada (0,28 ml, 7400 SU/ml)preparada como descrito no Exemplo E, contendo quantidades iguais das formas glu^ e lis^g, foi tratada com ou sem um excesso molar aproximado de 0,03 vezes de plasmina a 37°C. durante 17h.

A actividade amidolitica (SU) de ambos os produtos foi a mesma da testemunha que tinha sido guardada a -40°C. A analise por SDS-PAGE seguido de zimo grafia com fibrina mostrou que a proteina H37 tratada com plasmina e um grau menor a proteina H37 não tratada com plasmina, tinha sido convertida na forma lis^g.

Exemplo G

Síntese de 2-amino-4-clorobenzoi1-plasminogenio 1-541/t-PA 262-527 (duas cadeias) e -plasminogenio 78-541/t-PA 262-527 (duas cadeias)

A proteina H37 purificada do Exem pio F (10 nmoles) em PST/10 mg ml^-1 de manitol/50 ^iM £-ACA (2,0 ml) foi tratada com 4-amidinofeni1-2¹-amino-4'-cloro benzoato. HC1 (2 ^imoles, 40 jul) a 25°C.

Apos 60 min a actividade amidolitica da preparação tinha decrescido para Z 2% da actividade

-87original. Mudou-se o tampão do material para PST/10 ug ml^-1 de manitol/50μΜ £-ACA (3,0 ml) e guardou-se a -40°C.

Uma amostra do produto acilado _ 1 foi mais tarde diluido com 5 volumes de PST/10 mg ml de manitol/50 jjm S -ACA e deixou-se desacilar a 37°C.

Exemplo H

Purificação de plasminogenio 78-544/t-PA 262-527 (HOO)

500 ml de meio de cultura condicio nado obtido a partir de culturas de células HeLa transfe£ tado com o plasmídeo pTR H00 (Exemplo 4) foi clarificado por centrifugação (9000g/30min.) e foi purificado como de£ crito para a proteína H204 no Exemplo A. 0 activador hibrido foi eluido da coluna de 1isina-Sepharose (UT, 49 ml) usando PST/20 mM 6-ACA, foi concentrado por ultrafiltr^ ção e depois mudado o tampai para PST/10 mg ml de manitol /50 pM L -ACA. (2,1 ml). 0 produto continha 5700 UI e 2700 SU SDS-PAGE., seguido de zimografia com fibrina indicou a presença de uma especie fibrinolitica principal com Mr aparente de aproximadamente 90 000. SDS-PAGE seguido de coloração da proteína com prata ou immunoblotting usando anticorpo policlonal contra a cadeia B do t-PA reve lou que o material estava na forma de duas cadeias. Estes resultados são consistentes com o isolamento de activador do plasminogenio hibrido lisygtc.

-88Exemplo I

Purificação de t-PA 1-91/pro-g1i-ser/plasminogenio 84-544/ t-PA 262-527(H02)

380 ml de meio de cultura condicio nado obtido a partir de culturas de células HeLa transfectadas com o plasmideo pTR H02 (Exemplo 6) foi clarificado por centrifugação (9 OOOg /30 min.) e purificado essencia/ mente como descrito para a proteína H204 no Exemplo A.

activador hibrido foi dissociado da coluna de 1isina-Sepharose (VT, 55ml ) usando PST/ mM 7-ACA. 0 eluato foi concentrado por ultrafiltração e depois trocado o tampão para PST/10 mg ml^-1 de manitol /50 ^jM e £-ACA, (2,0 ml) para dar o produto.

Este continha 42 000UI e 20 400 SU. SDS-PAGE seguido de zimografia com fibrina revelou uma especie fibrinolitica principal a Mr de aproximadamente 100 000.

SDS-PAGE seguido de coloração da proteína ou immunoblotting usando um anticorpo policlonal contra a cadeia B do t-PA mostrou que a enzima híbrida estava na forma de duas cadeias.

-89Exemplo J

Sintese de 2-amino-4-clorobenzoi1-t-PA 1-91/pro-g1i-ser/ plasminogenio 84-544/t-PA 262-527 (duas cadeias)

A proteína H02 (1 ml 0,25 nmoles) purificada como descrito no Exemplo I foi tratada com 4amidinofeni 1 -2 ¹ -amino-4 '-clorobenzoato . HCl (1,25 jj 1 , nmoles) a 25°C. Apos 1 h, 93% da actividade amidolitica (S2288) da preparação de tinha sido perdida.

Apos adição de mais 25 nmoles de agente de acilação e ainda incubação durante 15 minutos o material foi mudado de tampão, para PST/10 mg ml^-1 de manitol/50jjM <5-ACA (2,2ml), distribuído em pequenos volu mes e guardado a -70°C.

Subsequentemente, uma amostra do produto foi diluída em 1 volume de 0,1M Tris/0,15M NaCl 20% (v/v) glicerol/0,01 % Tween 80 pH 7,4 e deixado desacilar a 37°C. A velocidade de desacilação foi determinada testando a actividade S2288 da solução.A.constante de velocidade de desacilação da proteína acilada nas condições descritas foi de 3,9 χ 10 seg .

-90Exemplo K

Purificação de t-PA 1-50/t-PA 88-91/pro-gli-ser/plasminoge nio 84-544/t-PA 262-527 (H01)

2,0 ml de meio de cultura condicio nado de culturas de células HeLa transfectadas com o plasmideo pTRHOl (Exemplo 5) foi mudado de tampão para PST 10 mg ml^- de manitol/50juM £_-ACA (3,0 ml) e concentrado por ultrafiltração (Centricon* 10, Amicon) ate cerca de 0,45 ml .

concentrado continha 520 Ul/ml analise por SDS-PAGE seguido de zimografia com fibrina revelou uma especie fibrinolitica principal de Mr aparente de aproximadamente 100 000.

activador hibrido foi purificado incubando a solução de 0,45 ml com 0,2 ml de suspensão de 1 is 1 na-Sepharose, removendo o sobrenadante , levando o gel com PST e finalmente eluindo o activador adsorvido com PST/20mM £-ACA para dar cerca de 0,8 ml de solução contendo 60UI/ml de proteína H01 parcialmente purificada.

* Centricon e uma marca Registada

-91Exemplo L

Purificação do plasminogenio 1-544/t-PA 262-527 (H204) produzido por células de ovário de hamster chinês.

As células CHO transfectadas com pTRH11 (Exemplo 8.1.c) e seleccionada pela sobrevivência em metotrexato a 0,05/uM (Exemplo 8) foram colhidas (25 ml o por frasco de 175 cm ) durante 24h em qó MEM(041-02561 ) contendo 1% de penici1ina/estreptomicina (043-5070), 1% de glutamina (043-5030) (Gibco, Paisley, Scotland) e butirato de sodio 3mM (9686730F; BDH Chemical Ltd. Poole, England). Colheu-se 1400 ml de meio de cultura.

meio de cultura foi clarificado por centrifugação (9000g/30 min) e purificado em quelato de zinco-Sepharose (Vt, 230 ml) e 1isina-Sephadore (Vt, 46 ml) usando essencia 1 mente o mesmo método descrito para a proteína H204 no Exemplo A.

A principal diferença foi que a coluna de 1isina-Sepharose não foi eluida com tampão conten do £-ACA, mas com o seguinte sucessivamente:

“λ

-92a. 0,02Μ Tris/0,5M NaCl/0,01% Tween 80 pH 7,4

b.	como	a.	mas	também	contendo	0,1M	L-arginina
c.	como	a.	mas	também	contendo	0,2M	L-arginina
d.	como	a.	mas	também	contendo	0,3M	L-arginina
e.	como	a.	mas	também	contendo	0 ,4M	L-arginina
f.	como	a.	mas	também	contendo	0,5M	L-arg i n i na

A analise das fracções individuais que tinham sido colheitas mostrou que tanto o t-PA endogeno de células CHO como a proteína H204 tinham adsorvido à coluna de 1isina-Sepharose e ambos tinham sido dissociados por tampão contendo arginina. A analise por SDS-PAGE seguido de zimografia com fibrina mostrou ainda que a maio ria da proteína H204 purificada tinha sido claramente separada do t-PA endogeno das células CHO, este ultimo sendo dissociado por uma concentração de arginina mais baixa. A Mr aparente de H204 por SDS-PAGE seguido de zimo grafia com fibrina foi de aproximadamente 100 000 (com uma especie menor a aproximadamente 90 000 ), claramente diferente do t-PA endogeno de CHO a Mr de aproximadamente 65 000

Posterior analise da proteína H204 por transferencia Western usando um anticorpo policlonal contra a cadeia B do t-PA mostrou que a maior parte da proteína estava na forma de duas cadeias.

-93Exemplo Μ

Sintese de 2-amino-4-clorobenzoi1-plasminogenio 1-544/t-PA 262-527 e 2-amiηο-4-c1orobenzoi1-plasminogenio 78-544/ t-PA 262-527 ex., células CHO.

000UI da proteína H204 de duas cadeias purificada e derivada de células CHO(Exemplo L) em PST/10 mg /ml^-1 de manitol/50^iM S-ACA (1ml) foi trata, da com 4-amidinofeni1-2¹-amino-4'-c1orobenzoato. HC1 (20mM 25ul) durante 1h a 25°C seguido de mais 2,5^il durante ainda 20 min. A H204 acilada foi mudada de tampão para PST/10 mg ml”¹ de manitol/50^jM £-ACA (1,5 ml)usando Sephadex G25 e distribuída em pequenas volumes. 0 ensaio de placas de fibrina indicou que o produto acilado continha 3600 Ul/ml.

A constante de velocidade de desacilação foi determinada como 1,2 χ 10”⁴seg”¹.

A analise do produto final acilado por SDS-PAGE seguido de zimografia com fibrina mostrou duas especies definitivas, com um Mr aparente de aproximadamente 100 000 e 90 000. A primeira devera ser a forma glu₁ de H204 acilada. A ultima e provavelmente a forma 1ÍS/q.

-94V· Preparação de derivados do invento

Métodos para os Exemplos 9-17 (a) Ensaio de substracto cromogenico

A urocinase e o t-PA foram tratados contra os substractos cromogenicos (KabiVitrum, Suécia)

S-2444 e S-2288, respectivamente numa concentração de substracto de 1mM em 0,1 M trietanolamina. HC1 pH 8,0 a 25°C. Uma SU e definida como a quantidade de actividade que da um aumento de D.O. de 0,001/min., em 0,5 ml de substracto numa célula com 1 cm de espessura (b) Determinação de constantes de velocidade

A constante de velocidade de pseudo-primeira ordem e determinadz por hidrólise da acilenzima em condições fisiológicas , i.e., em meios aquosos isotonicos a pH 7,4 e a 37°C. Em intervalos regulares retiram-se as amostras e incubam-se com um substracto cro mogenico e a velocidade de conversão do substracto e medida como indicado atras.

A hidrólise e seguida ate â culti^ ra em que a velocidade de conversão do substracto atinge um máximo. A constante de velocidade K pode então ser calculada colocando em gráfico:

-95Log_e (1 - At/A max ) contra t.

onde A_mov e a velocidade maxima a que uma amostra converte o substracto e A^ e a velocidade a que uma amostra converte o substracto no tempo t. De preferencia tais constantes de velocidade são calculados por analise de regressão não linear computarizada, introduzido o A^ e o tempo ne equação:

max onde Αθ e a actividade da preparação de acil-enzima antes da desacilação.

Exemplo 9

2-Amiηο-4-f1uorobenzoato de 4'-amidinofeni 1 o (a) 2-Meti 1-5-f1uoroacetan ileto

5-Fluoro-2-meti1ani1ina (6,26g mmoles) e trietilamina (7,26g), 10 ml , 72 mmoles) foram dissolvidos em diclorometano (50 ml). Esta mistura foi adicionada gota a gota a uma solução arrefecida em gelo de cloreto deacetilo (3,925g, 3,55 ml, 50 mpoles) em dicloro-

-96metano (100 ml) numa atmosfera de azoto. A solução foi arrefecida ate à temperatura ambiente e agitada durante 3h

A fase organica foi então lavada sucessivamente com uma solução, a 10% de hidrogeno-carbonato de sodio (50 ml), acido clorídrico 2M(50 ml) e solução saturada de sulfato de sodio (50 ml). A fase organica foi seca, filtrada e evaporada e o solido residual purifj_ cado por cromatografia em coluna (70 g de silica em diclorometano — 10% acetato de etilo/90% diclorometano ) para dar o composto do titulo (5,41 g, 65%).

p.f. 127°C ex., etanol e agua

H nmr (CDCljV : 6,5-7,8 (4H, m, aril-H- + N -H), 2,15

(6H,s,	ch3 +	coch3 )
ÍR/max^J01)	: 3270, 860 ,	1650 800 e
Encontrado:	C 64,40	H
c9h1onof
requere:	C 64,66	H

1600, 1530, 1285, 1250,

610 cm~1 .

6,26 N 8,27

6,03 N 8,27% (b) Acido 2-(meti1carboni1amino)-4-f1uorobenzoico

2-Mi1-5-f1uoroacetanileto (Exemplo 9a) (2,0 g 10 mmoles) foi dissolvido em agua (50 ml) e adicionou-se permanganato de potássio (2,25 g , 14 mmoles) A reacção foi agitada e aquecida ao refluxo ate desaparecer a cor purpura. Adicionou-se mais duas pequenas qua£ tidades do oxidante (2 χ 1,125 g) a intervalos de aproxi-

\

-97madamente 2Η.

Deixou-se arrefecer a reacção apos 6h e levou-se a solução a pH básico. Filtrou-se então através de celite e a solução aquosa foi acidificada. A fase aquosa foi extraida com acetato de etilo (50 ml) que foi então seco, filtrada e evaporada para deixar a composto do titulo (0,5 g, 22%).

p.f. (sublima acima de 14o°C ) a partir de etanol e agua.

Hnmr (CDCipJ : 11,4 (1H, br, s, C0₂H), 8,2 (2H, m, aril-H), 6,8 (1H, m, aril-H) , 2,15 (3H, s, C0CH₃).

(Nujol): 3470, 3410, 2500-3400, 1705, 1670, ^1R 7max

Encontrado e 1615 cm

C 54,49 H 4,34

N 6,38

C_gH₃NF0₃ requere :

C 54,83 H 4,09

N 7,10% (c) Acido 4-f1uoroantrani1ico acido 2-(meti1carboni1amino )-4f 1 uorobenzoico (Exemplo 9b) (0,45 g 2,3 mmoles) foi susper^ so em agua (15 ml) adicionado e a solução de hidroxido de sodio 5M (1,8 ml, 9 mmoles). A solução foi arrefecida a refluxo durante 24 h e depois deixada arrefecer. A solução basica foi extraida com diclorometano, o qual foi rejeitado e acidificada. A solução acida foi extraida com acetato de etilo (2 χ 25 ml), seca, filtrada e evaporada para dar o composto de titulo (0,36g, 100%).

-98p.f. 193-5°C a partir de etanol e agua ^Hnmr (CDClg/d^DMSO) 5 : 8,0(4H, m em pico br, aril-H+2

X NH e CO.H),	6,5 (2H, m,	ari1-H).
IRínax(Nujol):	3500, 3380, 1570, 1490, 890, 835,	2500-3400; 1225, 1180 760 e 620 cm	1665 , , 1145 -1	1600 , , 980,
Encontrado:	C 54,19	H 3,94	N	8,83
c7n6no2f
requere:	C 54,20	H 3,90	N	9 ,03%

(d) 2-amino-4-f1uorobenzoato de 4'-amidinofeni lo acido 2-amiηο-4-f1uorobenzoico (Exemplo 9(c) (320 mg) foi dissolvido em piridina (2ml) e adicionado 4-amidinofenol (364 mg). Adicionou-se diciclo -hexi lcarbodi imida (425 mg) e agitou-se a mistura à tempera^ tura ambiente em atmosfera de azoto durante 18h. Precipitou-se uma mistura do produto e dici1o-hexi1ureia. Esta foi triturada com etanol (10 ml) e filtrada.

produto foi precipitado pela adição de eter dietilico a solução alcoolica. 0 composto do titulo (133 mg, 21% ) foi isolado na forma de cristais brancos floculentos.

-99p.f. 250°C a partir de etanol e eter ¹H nmr (d^DMSO) S :9,5 (4H, br , s, amidina-NHj 8,0

(3H , m,	amidina ari1-H	+benzoato	aril-H) 7,5
(2H, d,	j=8Hz, amidina	aril-H) 7,0
(2H, s,	ari1-NH 2) 6,6 (1 Η, m ,	ari1 ) e 6,2
(1H, m,	ari1-H ) .
IV'ímàx<uj°l)	: 3470, 3370,	3330, 2500	-3500, 1700, 1680
	1630, 1580,	245, 1210,	1180, 1040
	745 , 700 cm	1
Encontrado:	C 53,76	H 4,23	N 13,35
c14h13n302fci.	’/4 H20
requere:	C 53 ,51	H 4,33	N 13,37%
Exemplo 10
2-Amino-4-clorobenzoato de 4'	-amidinofeni lo

Acido 2-amino-4-clorobenzoico comercial recristalizado (345 mg) e 4-amidinofenol (345 mg) foram dissolvidos em piridina (5ml). Adicionou-se diciclo-hexilcarbodiimida (824 mg, 2 eq) e agitou-se a mistura à temperatura ambiente numa atmosfera de azoto seco durante 3d. Nesta altura formou-se um solido. Este foi isolado por filtração e verificou-se consistir numa mistura do composto do titulo e diciclo-hexi1ureia . 0 material foi triturado com cloroformio ( 6 χ 10 ml) para remover

-100a ureia. Isto deixou o composto do titulo (81 mg, 12%) p.f. 230-2°C.

¹Hnmr (d^DMSO) 5 : 9,20 (4H, s, ari1-amidina-NH ) 7,90 (3H, m, aril-H) 7,52 (2H, d, J = 9Hz , aril-H).

(6,95 (3H, m, aril-H + NH^) , 6,65 (1H, m, aril-H)

		— — c
IR/n,ax<NuJ°D	: 3460, 1180 ,	3160, 1710, 1680, 1040 cm1 .	1610, 1220,
Encontrado:	C 51,79	H 4,19	N	12,57
C14H13N3C12°2
requere:	C 51,55	H 4,02	N	12,88
Exemplo 11
2-Amino-4-bromobenzoato	de 4 '-amidinofenilo
(a) 2-amino-4	-bromotolueno
		4-bromo-2-n itroto 1ueno	(13,5 g

62,5 moles) e estanho granulado (11,25 g, 95mmoles) foram colocados num frasco de fundo redondo a que se adicionou acido cloridrico concentrado (25 ml) em pequenas quanti dades (ca 5 ml). Durante este periodo de adição tornou-se evidente uma eracção suave. Quando todo o acido tinha sido adicionado a mistura de reacção foi aquecida e agitada a cerca de 100°C durante 4h. Deixou-se arrefecer a solu-101ção e adicionou-se uma solução de hidroxido de sodio (18,75g em agua (32ml). A solução foi aquecida a 100°C durante 1 h. Apos arrefecimento, juntou-se agua (200 ml) e filtrou-se a solução. 0 filtrado aquoso foi extraído com eter dietilico (200 ml). Os sais filtrados foram também extrai dos com eter dietilico (200 ml). As fases organicas combi_ nadas foram secas, filtradas e evaporadas para dar um oleo. Este foi purificado por destilação (112°C a 4 mm de Hg) para dar o composto do titulo (6,76g, 58%).

¹Hnmr (CDClg) £ : 6,8 (3H, m, aril-H) 3,6 (2H, s, NH₂) e

2,1 (3H, s, CH₃).

(b) 2-meti1-5-bromoacetani1 eto

Este foi sintetizado do mesmo modo que o analogo fluoro (Exemplo a (a) com 96% de rendimento a partir de 2-amino-4-bromotolueno (Exemplo 11 (a) . A preparação não requere qualquer cromatografia em coluna.

p.f. 108-110°C a partir de diclorometano e eter de petróleo a 40-60°.

1Hnmr (CDC13)	£ : 7,8(2H, m,	aril-H- + N)	7,1
(2H, m,	aril-H)	, 2,15	(6H, s, CH3	e C0CH3)
1RJmax01}	: 3250,	1670 ,	1650, 1580	, 1530, 1400
	1380 ,	1290 ,	1230, 1190,	1130, 860,
	800 e	700 cm	-1
Encontrado:	C	48,00	H 4,43	N 6,16

C₉H_1QN0Br requere:

C 47,39

H 4,42

N 6,14%

-102 —

(c ) Acido 2-(metilcarbonilamino)-4-bromobenzoi co

Este material foi produzido numa escala de 10 mmoles a partir de 2-meti1-5-bromoacetanileto (Exemplo 11 (b) do mesmo modo que o analogo fluoro (Exemplo 9 (b). Obteve-se um rendimento de 58%

p.f. 212-5°C a partir de metanol e agua ¹H nmr (CDC 1 g /d⁶DHS0) : S 11,4 (2H, br, s, NH e (02H),

9,3 (1H, m, aril-jd) , 8,2 (1H, m, aril-H), 7,4 (1H, m, aril-H) , 2,3 (3H, s, aril-CHg).

^IR,ím₃y (Nujol): 3250, 1670, 1650, 1580, 1520, 1290, 860 v ιll α λ

Encontrado

C_gHgBrN0₃ requere e 800 cm' C 41,43

C 41,84

H 3,08

H 3,12

N 5,31

N 5,43% (d ) Acido 4-bromoantrani1ico composto do titulo foi preparado com 48% do rendimento a partir do acido 2-(meti1carboni 1amino)-4-bromobenzoico (Exemplo 11 (c) do mesmo modo que o analogo fluoro (Exemplo 9(c).

¹Hnmr (CDC13/d⁶DMS0): $ 8,1 (3H, s, CO2H + NH₂) , 7,6 (1H, d, J=8Hz, aril-H) 6,8(1H, m aril-H) 6,6 (1H, m, aril-jd).

-103(e) 2-amino-4-bromobenzoato de 4 ¹-amidinofeni1 o acido 2-amino-4-bromobenzoico (Exemplo 11 (d) (0,90g) e 4-amidinofenol (0 ,718 g) foram di_s solvidos em piridina (10 mg). Adicionou-se diciclo-hexi lcar bodiimida (1,71 g, 2eq.). A reacção foi agitada â temperatura ambiente numa atmosfera de azoto seco durante 2d.

Foi então filtrada e o solido obtido verificou-se ser uma mistura do composto do titulo e diciclo-hexilureia. 0 mate rial foi repetidamente triturado com cloroformio ( 6 χ 20 ml ) antes de ser isolado por filtração e evaporação. Obte-⁹ ve-se o composto do titulo puro (144 mg, 9%).

¹Hnmr (d⁶DMS0)^: 9,20 (4H, 6r, s, amidina-NH), 7,90 (3H, m, aril-H) 7,55 (2H, d, 0=6Hz, aril-H),

7,1 (1H, s, aril-H) 6,95 (2H, br, s, NH₂ ) 6,80 (1 Η, m, ari1-H) ^IRámax (^NuJ’^ol)^{: 345θ}’ ^320θ> ^171θ’ ^1θ80> ¹⁶¹⁰> 1230, 1 180

1040 cm¹.

-104Exemplo 12

Métodos gerais para a preparação de derivados de centro actj. vo acilado do activador do plasminogenio tipo tecido e uroc i nase t-PA de duas cadeias (preparado como em Browne, et al , Thrombosis and Haemostasis 54, 422-424 (1985) e UK (Serono, Freiburg, W. Germany) stocks foram dissolvidos numa mistura de 10:1 de fosfato de sodio 0,05M, cloreto de sodio 0,1M, 0,01 % v/v de Tween 80* pH7,4: lisina 0,25M, 100 mg/ml de D-manitol , acido 6-amino-hexano^ co 10mM pH 7,4 (1,1 ml) para dar concentrações finais de enzima de entre 50 000 e 100 000 US ml~\ Este material foi tratado com uma solução 6-10 mM de agente acilante em dimetilsulfoxido. As acilações foram geralmente conduzidas a 0°C durante a noite, se bem que na ocasião, a temperatura fosse levantada para 25°C durante 1h para permitir mais do que 90% de acilação conforme avaliado pelo ensaio do substracto cromogenico.

A acil-enzima foi retirada o sal para fosfato de sodio 0,05M, cloreto de sodio 0,1M 0,01% v/v de Tween 80 pH 7,4 (tampão PST) por passagem através de uma coluna com PD10 (Sephadex G25M, Pharmacia).

A acil-enzima foi colhida em tampão PST(2ml). Varias amostras (0,1 ml) desta solução stock foram diluidas em tampão pre-aquecido (37°C) (0,9 ml) e a velocidade de desacilação foi determinada pelo retorno da actividade amidolitica como descrito na secção dos métodos e com os resuj_ tados dados na Tabela 7.

* Tween 80 e uma marca registada para um detergente compreen.

dendo monoleato de polioxietilenossorbitano tendo um peso molecular de aproximadamente 1300 e contendo aproximadamente 18 a 22 unidades de oxietileno.

-105TABELA

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-106Exemplo 13.

Derivado 2-amino-4-clorobenzoilo de um conjugado de urocinase com o centro activo da plasmina humana

Uma solução do conjugado entre urocinase humana tratada com iminotiolano e a acil-enzima

4- /“N-2-(3-/~2-piridiltio7propionil)aminoetilamina7benzoilplasmina humana (Exemplo 10 da EP-A-0 155 388, 0,25 ml de 0,5M 1-arginina, tris-hidroximetilaminometano 0,02M cloreto de sodio 0,5M, 0,01% p/v do detergente Tween 80 pH 7,4) foi diluída para 1,0 ml com fosfato de sodio 0,05M cloreto de sodio, 0,1M, 0,01% p/v de Tween 80 pH 7,4(tampão fosfato). Esta solução foi testada contra o substracto

5- 2444 e continha 31500 US/ml .

Uma solução de agente acilante do Exemplo 10 (20 yl de 10 mM em dimetilsulfóxido) foi adicionada e a mistura mantida a 0°C durante 2h apos o que a actj_ vidade tinha baixado para 12 440 US/ml. Adicionou-se mais 20 ^il de agente acilante e a incubação continuou a 25°C durante 30 min., o produto sendo mantido em gelo.

A actividade final foi de 1875 US/ml (6%). A mistura foi filtrada em gel numa coluna pequena de Sephadex G-25M (coluna PD10), Pharmacia) para tampão fosfato contendo acido 6-amino-hexanoico 1,0 mM. 0 produto foi guardado em solução a -70°C. A desacilação do produto, diluido a 1:10 v/v em tampão fosfato a 37°C, indicou que a acil-enzima desacilada tinha uma constante de velocidade de 4 1 pseudo-primeira ordem media de 2,64 + 0,09 χ 10 seg (se mi-vida : 43,8 min.)

-107Exemplo 14

Derivado 2-amino-4-fluorobenzoi lo de um conjugado de urocina^ se com o centro activo da plasmina humana conjugado urocinase-plasmina do Exemplo 13 acima (209900 US/ml, 2,1 ml no tampão fosfato referido acima mas contendo acido 6-amino-hexanoico 5,0 mM) foi tratado com uma solução do agente acilante do Exemplo 9 acima (41 yj 1 de 50 mM de/em dimet11su1foxido) e incubado a 25°C. Apos 45 min. adicionou-se mais 10,5 yul de agente acilante 50mM para levar a concentração final ate 1,25 mM. Apos mais 40 min a 25°C a actividade amidolitica da mistura baixou para 3,5% da actividade inicial e o produto foi filtrado em gel numa coluna pequena de Sephadex G25M para o tampão fosfato /acido 6-amino-hexanoico (3,4 ml) produto foi guardado em solução congelada a -196°C. A desacilação a 37°C em tampão fosfato deu uma constante de velocidade media de desacilação

-4 -1 de pseudo-primeira ordem de 1,0 χ 10 seg .

Dois outros lotes deste material preparados de modo semelhante, deram acil-enzimas com constantes de velocidade de desacilação de 0,94 e 1,43 χ 10’⁴ seg^-1. (semi-vida media: 101,6 min.)

-108Exemplo 15

2-Ami ηο-4-clorobenzoi1-des(cis₅₂-asp₈₇)rt-PA

Des (cis₈₁-asp₈₇ ) rt-PA (Exemplo 4B da EP-A-0 207 589) foi produzida a partir de células C127 de ratinho numa forma de duas cadeias e foi purificada essencialmente como descrito para rt-PA nativo (Dodd et a 1 Febs Lett. 1986, 209, 13-17). A muteina do t-PA purificada (1,5 ml; 5300 LIS/ml ; aproximadamente 1,5 nmoles em fosfato 0,05M/0,1M NaCl/0,01% Tween 80 /10 mg ml^-1 de manitol/1mM ^-ACA pH 7,4 (PST/ME) foi misturado com 2-amino-4-clorobenzoato de 4 '-amidinofenilo (Exemplo 10, 1 ,5ul ,

1OmM em DMSO).

Apos 30 min a 25°C a actividade da solução era de 2100 US/ml , equivalente a 60% de inibição. Outras adições garduais do agente acilante foram feitas de modo que a concentração final de agente acilante ficasse 60uM.

Num período de incubação total de 135 min, a actividade residual na solução era de 410 US/ml, equivalente a 92% de inibição. 0 excesso de agente acilante foi removido por troca de tampão para PST/ME (2,6 ml) usando Sephadex G25. 0 material que eluia no volume de exclusão (muteina de 2-amino-4-clorobenzoi1-t-PA/foi guardado a -70°C.

Uma amostra do produto foi mais tarde desacilada por diluição com 2 ml de PST, incubação a 37°C e controle da actividade amidolitica como descrito na Secção dos Métodos. Recuperou-se 78% da actividade amidolitica original. Em lotes subsequentes a constante da

-109velocidade media de desacilação verificou-se ser 7,8 χ 10 seg (semi-vida 149 + 8 min., 70 determinações).

Exemplo 16

2-Amino-4-clorobenzoi1 (liSyg cadeia A da plasmina) ί!^θ276 t-PA activador de plasminogenio hibrj_ do purificado cadeia A da plasmina lis^g /t-PA isin tetrizado essencialmente como descrito nos Exemplos 1 e 2 da EP-A-0 155 387 (9,2 ml; 66 000 US/ml, aproximadamente 40 nmoles) em tampão PST/ME (Exemplo 15) foi misturado com 2-amino-4-clorobenzoato com 4-amidinofenilo (Exemplo 10) (50 yUl ; 10mM em DMSO). Apos 60 min., de incubação a 25°C a actividade amidolitica residual da preparação era de 1900 US/ml, equivalente a 3% da actividade original. 0 exces so de agente acilante, foi removida por troca de tampão para PST/ME usando uma coluna de Sephadex G25 (245 χ 26 mm) activador do plasminogenio hibr/ do acilado eluiu no volume de exclusão da coluna e foi guar dado a -70°C.

Uma amostra do activador do plasminogenio hibrido acilado foi subsequentemente diluída com 19 vol. de PST e incubado a 37°C. A actividade amidolitica de preparação foi controlado como descrito na Secção dos Métodos. Os resultados indicaram que 96% do hibrido estava na forma acilada da desacilação.

-110Em lotes subsequentes a constante c 1 de velocidade de desacilação verificou-se 8,9 χ 10 seg (semi-vida) 130 + 5 min., media de 11 determinações).

Exemplo 17 derivado 2-amino-4-f1uorobenzi1 o de um conjugado de urocinase de baixo peso molecular com o centro activo da plasmina humana

Preparou-se um conjugado entre urocinase humana tiolada e a acil-enzima 4-/~N-2-(3-/~2-piridiltio)7-propionil-aminoetilamino7-benzoil-plasmina humana como descrito no Exemplo 10 da EP-A-0 155 388 excepto ter-se empregue a urocinase de baixo peso molecular (33 kilodaltons) em vez da forma de alto peso molecular (54 kilodaltons). As duas formas distinguem-se pela ausência, na molécula de 33 k, dos 135 aminoácidos N-terminais.

conjugado tinha um peso molecular de cerca de 110 kilodaltons. Este conjugado (0,8 ml em L-arginina 0,5M, clore to de sodio 0,5M , tris-hidroximetilaminometano 0,02M 0,01% p/v do detergente Tween 80 pH 7,4, actividade e 290 000 US/ml contra S-2444) foi tratado com o agente acilan te do Exemplo 9 ( 40 μΐ de 20 mM em dimetilsulfõxido seco) durante 30 min. a 25°C.). Deu-se acilação parcial (80%) e o produto foi filtrado em gel para o tampão fosfato/acido

6-amino-hexanoico descrito no Exemplo 6 acima (3,4 ml) e a acilação repetida usando as mesmas condições de atras. A actividade decresceu para 2,5% do nivel de partida e o pro-111duto foi reduzido em volume para 1,5 ml por concentração com centrifugação/Amicon C-30, 2000g , 45 min. 4°C).

Apos filtração em gel como descrito atras, o produto (3,4 ml) foi guardado a -196°C. A desacilação a 37°C em tampão fosfato deu uma constante de velocidade media de desacilação de pseudo-primeira ordem de 1,12 χ 10 seg (semi-vida media): 103,3 min.). Uma segunda serie de determinai -4 -1 ções deu um valor de 0,97 χ 10 seg .

Nas Figuras :

(N.B. não estão à escala)

Figura 1a. Estrutura de pTRH6 = sequências de pUC 8

-- = sequências de cDNA do plasminogenio

- sítios de restrição

Fig. 1b. Estrutura de pTRH3 mi = sequências do pTRE12

- = sequências de cDNA do plasminogenio (HindIII no extremo 5' BglIII no extremo 3') = sitios de restrição usados na construção.

-112Fi g . 2 . Estrutura do pTRH9

Fragmentos (I) a (III) e adaptador (IV) estão indicados:

«BB = sequências Nar D ao pTRE12.

- = sequências de inserção

PlgnA = região codificadora da cadeia A do plasminogenio = sitios de restrição usados na construção

- = outros sitios de restrição t-1 = regiões codificadoras de proteína

Figura 3, Estrutura de pTRH20 fiHi = sequências do vector

- = DNA da inserção <£□ = sitios de restrição usados na construção __ = outros sitios de restrição = sequencia de aminoácidos de ligação ?-1 - regiões codificadoras de proteína

PlgnA = região codificadoras de cadeia A do plasminogenio t_A = região codificadora da cadeia A do t-PA = região codificadora da cadeia B do t-PA

-113Fig .4. Estrutura do pTR204

Os fragmentos (V) (SstI-NarI), (VI) (BanII-SstI) e adaptador (VII) (Narl-BanII) estão indicados = sequências do vector

- = DNA da inserção = sitios de restrição usados na construção <— = outros sitios de restrição * = serina equivalente à serina do plasminogenio, seri na 262 do 545/t-PA na junção i—ι = regiões codificadoras de proteínas

PlgnA = região codificadora da cadeia A do plasminogenio (glu-1 a pro-544) t-PA = região codificadora do t-PA (tre-263 a pro-527)

-114Fig. 5 Estrutura do pTRH37

Os fragmentos (IX) (Sst Ι-BstX I), (X) (BstXI-Ava 11) e adapt£ dor (XI) (Ava11-Ban 11) estão indicados.

= sequências do vector = DNA de inserção = sítios de restrição usados na construção outros sitios de restrição = regiões codificadoras de proteina

Plgn = sequências codificadoras do plasminogenio (glu.,-^cis541>

t-PA = sequências codificadoras do t-PA (tre^s-pro^y) * = serina equivalente â serina_54g do plasminogenio/se rina₂g₂ do t-PA na junção

Fig . 6 Estrutura do pTRH34

Os fragmentos (V) (SstI-NarI) (BanII-SstI) e adapatador (VIII) (Narl-BanII) estão indicados fBSBA = sequências do vector —— = DNA da inserção = sitios de restrição usados na construção <— = outros sitios de restrição = regiões codificadoras de proteina

-115PlgnA = região codificadora da cadeia A do plasminogenio (glu₁ a arg₅₆₁ ) t-PA B = região codificadora da cadeia B do t-PA (lle^yg a pro-527)

Fig. 7 Construção de pTRHOO

Fragmento I: e um fragmento HindIII/SfaN1 do plasmídeo cassete lis^g.

Fragmento II: e um fragemnto Sfa N1/BstXI do pTRH34 conten do a maior parte do K1P,todo ο K2P e K3P e a secção N terminal do K4P.

Fragmento III e um fragmento BstXI/Hind 111 do pTRH204 contendo a maior parte do K4P, todo o K5P, Bt e as sequências de vector do pTRE12.

-116Fig.8 Construção de pTRHOl

Fragmento I: e um fragmento HindIII/BamHI do pTR6F codificador do domínio em dedo do t-PA e sequências de aminoácidos N-terminais e C-terminais associados í-e./—SYQVI7 F^t /HSVPVKSTRATPGS7 , mais a região~5' não traduzida e as regiões sinal/pro.

Fragmento II: e um fragmento Hind ΠΙ/Kpnl do pTRHOO conten do quase todo o K1p, todo ο K2P, K3P, K4P K5P, B*· e as funções de vector do pTRE12.

Adapatador: como descrito no Exemplo 6

Fig .9 Construção de pTRH02

Fragmento II: e um fragmento Hind 111/BamH I do pTR6FG codificador das domínios do t-PA F¹ e G^ e sequen_ cias de ligação N/C-terminais associados i.e., /'SYQVUF¹ /HSVPVKS7 G¹ /“EIDTRATPGS7 mais a região 5' não traduzida e as regiões signal/pro.

Fragmento I: e um fragmento HindIII/Kpnl do pTRHOO contendo quase todo ο K1P, todo ο K2P, K3P, K4P, K5P Bt e as funções do vector pTRE12.

-117Adaptador (W + X) : como descrito no Exemplo 6.

Fi g . 10 Estrutura do pTRH25

Fragmento I: Fragmento BglII - NarI do pTRH9

Fragmento II: fragmento SstI - BglII codificador da cadeia B da urocinase

Fragmento III: oligonucleotideos Y + Z

MBB = sequências do pTRE12

- = sequências da inserção = sitios de restrição usados na construção

Plgn = região codificadora do plasminoge nio (glu₁ a fen₅₄₆) n = região codificadora da urocinase (pro,₃₇ a Ieu₄₁,)

-118Fig. 11

Plasmideo PSV₂dhfr

P = sequencia de poliadeni1 ação do virus simiol ^SV40 ³

I = sequencia intão do virus simio 40 >

DH = cDNA da redutase do di-hidrofo 1 ato

SV_4Q E = promotor precoce do virus simio 40

EcoRI = sitio da enzima de restrição: EcoRI, ligada a adaptadores Xhol

BglII = Sitio da enzima de restrição: BglII

Figu . 12 Plasmideo BPV-MT-Xhol

BPV = Sequências do papilomavirus bovino

MT-I = Sequências do gene da metalotioneina de ratinhoincluindo a sequencia 3' de poliadeni1 ação (fragmen to B de 0,3kb ).

SstI = Sitio da enzima de restrição: SstI, ligado a adaptadores BglII

HindIII = Sitio da enzima de restrição: HindIII, ligada a adaptadores Xhol

-119-

Fig.13	Plasmideo pTRH69
MMT 3 1	= Sequências de poliadeni1 ação da metalotioneina de ratinho: Fragmento B excisado do plasmideo BPV-MT-Xhol
DH	= cDNA da redutase do di-hidrofo 1 ato / fragmento A
SV40E	\ retirado do = promotor precoce do virus simio 40 ( piasmiC|eo J PSV2dhfr
Xhol	= sitio de restrição da enzima Xhol
Bgin	= sitio de restrição da enzima BglII

Fig. 14	Plasmideo pTRH71
LTR	= repetição terminal longa do virus do sarcoma/,. / frag- de Rous / / mento
SV 3 1 iV40	= Sequências do intrão e de poliodenila- Λ de ção do virus simio 40 3,3kb do pTRE
MUT	= cDNA da muteina do t-PA \ 24
MMT3 '	= Sequências de poliadeni1 ação da metalotioneina de ratinho
DH	= cDNA da redutase do di-hidrofolato
SV40E	= Promotor precoce do virus simio

\ __-120-

Fig.15	Plasmideo pTRH11
LTR	= Repetição terminal longa do virus do j fragmento de sarcoma de Rous í 4,1 kb do
SV 3 1 ύν40'3	\ pTRH204 = Sequências do intrão e de poliadeni1ação\ do virus simio 40 í
H204	- cDNA da proteína hibrida H204
MMT3 1	= Sequências de poliadenilação da metalotioneina de ratinho.
DH	= cDNA da redutase do di-hidrofolato
sw	= Promotor precoce do virus simio 40.

-121 -

Claims (4)

1. REIVINDICAÇÕES

   1-.- Processo para a preparação de uma activador do plasminogenio híbrido que compreenda os cinco domínios de ansas múltiplos do plasminogenio ligados â cadeia B do t-PA ou u-PA através de uma sequencia de amj_ noacidos compreendendo, respectivamente, o sitio de clivagem do t-PA entre os residuos 275 e 276 e o residuo de cisteina 264 do t-PA ou o sitio de clivagem do u-PA entre os residuos 158 e 159 e o residuo cisteina 148 do u-PA e em que o sitio catalítico essencial à actividade fibrinolitica esta facultativamente bloqueada por um bloqueador (grupo) removível, caracterizado por compreender a expressão de DNA codificador do referido activador do plasminogenio híbrido numa célula hospedeira recombinante e a recuperação do produto activador do plasminogenio híbrido e pos. teriormente o bloqueamento facultativo do sitio catalítico essencial para a actividade fibrinolitica com um grupo blo queador removível.
2. 2³.- Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se preparar um activador do plasminogenio hibrido de formula (Y)_m(k^p-Z^t-)₅B^t onde B^ compreende os residuos 276-527 do t-PA, m e 1, cada um dos 5 valores de k^p representa um domínio de ansas múltiplas derivado do plasminogenio em sequencia e Y e cada um dos 5 valores de independentemente representa uma ligação ou uma sequencia de aminoácidos de ligação que pode ser introduzida sinteticamente durante a preparação do actj_ vador do plasminogenio hibrido e/ou derivada de sequências do plasminogenio nativo e/ou t-PA, a sequências com-

   -122preendendo pelo menos os resíduos cis-264 e arg-275 do t-PA.

   í
3. 3^?.- Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por Y representar os residuos do plasminogenio 1 a 83 ou 78 a 83 respectivamente.

   ι i

   ! 4^ã.- Processo de acordo com a rei5 vindicação 2, ou 3, caracterizado por Z¹1 , Z^t2» θ í representarem as sequências inter-dominios do plasminogenio j nativo entre os domínios de ansas múltiplas do plasminogenio

   1e2,2e3,3e4e4e5, respectivamente.

   !i

   Γ

   55.- Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 4, caracterizado por Z^t5 j ser seleccionado entre:

   i

   1. /’ AAPSTCGLRQYSQPQFR_7

   2. /' AAPSTCGLRQYSQPQFQ7

   3. /“STCGLRQYSQPQFR_7 (notação para aminoácidos com letras únicas)

   6⁵.- Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se preparar plasminogenio 1-544/t-PA 262-527 incluindo variantes de uma e duas cadeias, variantes com LiSyg e glUp e suas misturas.

   -123- plasminogenio 1-544/t-PA 262-527 (arg₂₇₅ glu) incluindo variantes de uma e duas cadeias, variantes de lis₇₈ e glu₁ e suas mi sturas , plasminogenio 1-541/t-PA 262-527 incluindo variantes de uma e duas cadeias, variantes de 1is_7g e glu₁ e suas misturas.

   t-PA 1-50/t-PA 88-91/pro-g1i-ser/ρ1asminogenio 84-544/t-PA 262-527 incluindo variantes de uma e duas cadeias, variantes de gli_₃, ser₁ e val₄ e suas misturas.

   t-PA 1-9 1/pro-g1i-ser/plasminogenio 84-544/t-PA 262-527 incluindo variantes de uma e duas cadeias, variantes de gli_₃, ser₁ e val^ e suas misturas ou plasminogenio 1-546/u-PA 137-411 incluindo variantes de uma e duas cadeias, variantes de 1is₇₈ e glu₁ e suas misturas.

   7⁵.- Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores caracterizado por a célula hospedeira ser uma célula de ovário de hamster chinês.

   8^{8 9}.- Processo para preparação de um activador do plasminogenio híbrido de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado por o grupo bloqueador removível ser um grupo 2-aminobenzoilo substituido na posição 3 ou 4 com um atomo de halogénio e facu 1tativamentí ainda substituido com um ou mais grupos removedores ou dadores fracos de electrões; e por a constante de velocidade de pseudo-primeira ordem para a hidrólise do derivado estar -5 -4 -1 na gama de 6,0 χ 10 a 4,0 χ 10 seg quando medida num sistema tampão consistindo em fosfato de sodio 0,05M, clore to de sodio 0,1M 0,01% v/v de detergente compreendendo mo noleato de polioxietilenossorbitano tendo um peso molecular

   -124- de aproximadamente 1300, a pH 7,4 a 37°C.

   9^a.- Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por o grupo bloqueador removível ser 4-f1uoro-2-aminobenzoilo , 4-cloro-2-aminobenzoiIo ou 4-bromo-2-aminobenzoilo.

   10^a.- Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se preparar 2-amino-4-clorobenzoi1-ρ1asminogenio 1-544/t-PA 262-527 (duas cadeias), incluindo variantes de glu^ e lis

   2-amino-4-clorobenzoi1-ρ1asminogenio 1-541/t-PA 262-527 (duas cadeias) variantes incluídas de glu^ e lis^g e suas misturas, ou 2-amino-4-clorobenzoi1-t-PA 1-91/pro-g1i-ser/ plasminogenio 84-544/t-PA 262-527 (duas cadeias), incluindo variantes de gli_₃, ser₁ e val₄ e suas misturas.

   11^a.- Processo para a preparação de uma composição farmacêutica caracterizada por se incluir na referida composição um activador do plasminogenio hibrido como definido em qualquer uma das reivindicações anteriores em combinação com um veiculo farmaceuticamente aceitavel , através da mistura do referido activador com o referido veiculo.

   12^a.- Processo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por se obter uma composição farmacêutica, que é utilizada no tratamento de doenças trombo ticas, por administração a referida composição a um paciente, numa quantidade total e tal que a gama de dosagem diaria de

   -125activador do plasminogenio hibrido, obtido de acordo com qua]_ quer uma das reivindicações 1 a 10, esteja situada entre 0,01 e 10 mg por quilograma de peso corporal.

   13⁹.- Processo para a preparação de um polimero de DNA compreendendo uma sequencia de nucleotide os que codifica um activador de plasminogenio hibrido obtido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracter: zado por se proceder à condensação das unidades mono-, di, ou oligoméricas adequadas.

   14⁹.- Processo para a preparação de um derivado de um activador do plasminogénio compreendendo o domínio de prótese serina do t-PA ou u-PA, em que o sitio catalítico essencial à actividade de activador do plasminogenio está bloqueado por um grupo 2-aminobenzoilo substituído na posição 3 ou 4, com um átomo de halogénio e f acul tat i vamenj te ainda substituido com um ou mais grupos removedores ou I dadores fracos de electrões, em que a constante de velocida^ de de pseudo-primeira ordem para a hidrólise do derivado -5 -4 1 está na gama de 6,0 χ 10 a 4,0 χ 10 seg quando medida num sistema tampão consistindo em fosfato de sodio 0,05M, cloreto de sodio 0,1M, 0,01% v/v de detergente compreender^ do monoleato de polioxietilenossorbitano tendo um peso mole cular de aproximadamente 1300 a pH 7,4 a 37°C., caracterizado por compreender a reacção do activador do plasminogenio com um agente bloqueador JK em que J -e um grupo coloca dor que mecfeia a ligação do agente ao sitio catalítico da enzima e K é um grupo 2-aminobenzoilo substituido na posição 3 ou 4, com um átomo de halogénio e facultativamente ainda substituido com um ou mais grupos removedores ou dadores fracos de electrões.

   -126-

   15^â.- Processo de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por a constante de velocidade

   5 -4 de pseudo-primeira ordem estar na gama de 7,0 χ 10 χ 10

   16⁹.- Processo de acordo com a rej_ vindicação 14 ou 15, caracterizado por o grupo bloqueador ser 4-f1uoro-2-aminobenzoilo , 4-cloro-2-aminobenzoilo ou 4-bromo-2-aminobenzoi1 o.

   17³.- Processo de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por se preparar um derivado seleccionado entre
4. 4-fluoro-2-aminobenzoil-urocinase

   4-c1oro-2-aminobenzoi1-urocinase ou t-PA e

   4-bromo-2-aminobenzoi1-t-pA;

   2-amíno-4-clorobenzoilo (lis₇₈ cadeia A da ρ1 asmina ) i1e₂₇gt -PA; os derivados 4-cloro- e 4-fluoro-2-aminobenzoilo dos conjugados em que urocinase (de alto ou baixo peso mole cular) é ligada de modo reversível ao centro activo da plas_ mina humana; e o derivado 4-cloro-2-aminobenzoi1 de des(cis$₁-aspgy ) t-PA.

   18³.- Processo para a preparação de uma composição farmacêutica, caracterizado por se incluir na referida composição um derivado obtido de acordo com qual_ quer uma das reivindicações 14 a 17 em combinação com um veiculo farmaceuticamente aceitavel, através do referido acti

   -127I ί

   vador e do referido veiculo.

   19³.- Processo de acordo com a reivindicação 18, caracaterizado por se obter uma composição farmacêutica, que é utilizada no tratamento de doenças trom boembólicas, por administração da referida composição a um paciente numa quantidade tal que a gama de dosagem diaria de um derivado obtido de acorco com qualquer uma das reivindicações 14 a 17, esteja situada entre 0,01 e 10 mg por quilograma de peso corporal.

   20³.- Processo para a preparação de um agente bloqueador da form ula JK em que J é um grupo colocador que medeia a ligação do agente ao sitio catalítico de uma protease serina e K é um grupo 2-aminobenzoilo substituido na posição 3 ou 4 com um átomo de halogénio e facultativamente ainda substituido com um ou mais grupos removdeores ou dadores fracos de electrões, caracterizado por compreender a reacção do acido benzoico adequado substi tuido com o álcool adequado.

   21^?.- Processo de acordo com a reivindicação 20, caracterizado por se preparar ι

   i

   -1282¹-amino-4¹-f1uorobenzoato de 4-amidinofeni1 o,

   2¹-amino-4¹-clorobenzoato de 4-ami d inof en ilo , ou

   2¹-amino-4-bromobenzoato de 4-amidinofeni1 o .