PT86620B

PT86620B - Processo para a preparacao de uma enzima fibrinolitica

Info

Publication number: PT86620B
Application number: PT86620A
Authority: PT
Inventors: Michael Joseph Browne; Jeffrey Hugh Robinson
Original assignee: Beecham Group Plc
Priority date: 1987-01-28
Filing date: 1988-01-26
Publication date: 1992-04-30
Also published as: ZA88512B; DK37988D0; GB8701811D0; AU1077688A; JPS63226285A; AU611409B2; IE880198L; NZ223291A; KR880009128A; DK37988A; EP0277751A2; EP0277751A3; PT86620A

Description

PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE UMA ENZIMA FIBRINOLITICA

processo consiste em se expressar o DNA codificador do referido activador de plasminogénio tipo tecido modificado numa célula hospedeira recombinante e se recuperar o produto activador de plasminogénio tipo tecido modificado e depois, quando necessário se bloquear facultativamente o sitio catalítico com um grupo bloqueador removível.

ί

Ο presente invento está relacionado com uma enzima fibrinolitica modoficada em particular activador do plasminogénio tipo tecido modificado, com a sua preparação, composições farmacêuticas que o incluem e sua utilização no tratamento de doenças trombóticas.

São conhecidas as sequências dos aminoácidos que constituem a enzima activador do plasminogénio tipo tecido (t-PA) e a sequência de nucleotídeos do cDNA que codifica o t-PA (ver Pennica et al, 1983; Nature 301, 214). Sabe-se que o activador do plasminogénio tipo tecido possui actividade fibrinolitica.

Foi demonstrado (Banayai, L. et al 1983; FEBS Lett, 163, 37) que uma parte da enzima t-PA apresenta homologia estrutural com os factores de crescimento epidérmicos humano e murino. Esta região compreendendo os resíduos de aminoácidos 44 a 91 foi designada domínio do factor de crescimento. A informação genética que codifica a maior parte deste domínio, resíduos 51 a 86 inclusive e que codifica parcialmente os resíduos 50 a 87, está num único exão (Ny, T. et al, 1980; Proc. Nat. Acad. Sei. U.S.A., 81 5355).

EP-A-0207589 descreve t-PA modificado na região do dominio de factor de crescimento, em particular pela delecção dos resíduos de aminoácidos 51 a 87 inclusive do t-PA nativo. EP-A-0233013 divulga t-PA compreendendo um outro aminoácido que não arginina ou lisina na posição 275, em particular glutamina.

Os requerentes identificaram agora formas modificadas da enzima t-PA que retém actividade fibrinolitica.

De acordo com o presente invento é proporcionado um activador do plasminogénio tipo tecido fibronoliticamente activo que foi modificado:

a) na região domínio de factor de crescimento e

b) para se obter um outro aminoácido diferente de arginina ou lisina na posição 275.

As modificações adequadas do domínio de factor de crescimento (modificação (a) podem incluir remoção ou deleção de certos resíduos de aminoàcidos ou substituição de um ou mais resíduos de aminoàcidos por resíduos de aminoàcidos diferentes.

Num aspecto preferido, a modificação (a) compreende a deleção de todo ou parte do dominio de factor de crescimento.

Num outro aspecto preferido, a modificação (a) ocorre na região dos resíduos de aminoàcidos 51 a 87 inclusive, em particular por deleção daquela região.

Os aminoàcidos preferidos para substituição na posição 275 (modificação (b) são os semelhantes à arginina em hidrofobicidade e tamanho. Assim, são preferi dos a histidina, treonina, serina, asparagina, ácido aspártico, glutamina e ácido glutâmico. Outros aminoácidos adequados incluem alanina e glicina.

Num outro aspecto preferido a modificação (b) é tal que o aminoácido na posição 275 é glutamina.

Conforme aqui é usado o termo activador do plasminogénio tipo tecido significa um activador do plasminogénio do grupo que tem propriedades imunológicas definidas para o t-PA no XXVIII Meeting of the International Commitee on Thromboses and Haemostasis, Bergamo, Itália, 27 de Julho de 1982.

São conhecidas as sequências de ami noácidos das várias formas de t-PA.

A referência Nature 1983 atrás mencionada divulga a sequência da cadeia L e das formas de cadeia S madura do T-PA, também discutidas por Vehar et al Biotechnology, 1984, 2_, 1051-7 em que é divulgado o processa mento do t-PA inicialmente formado por remoção de uma pró-sequência para dar a forma de cadeia S. Pohl et al, FEBS Letters, 1984, vol. 168, No.l, 29-32, refere-se à multiplicidade N-terminal do t-PA e divulga a forma de cadeia U. O sistema de numeração da sequência de aminoácidos do t-PA aqui usada é a descrita na referência Nature 1983 para o t-PA maduro (cadeia S) em que a resina N-terminal tem o número 1. Por este sistema, o t-PA cadeia L tem um resíduo glicina N-terminal na posição-3 e o t-PA cadeia U tem uma valina N-terminal na posição 4. Deve ser entendido que o activador do plasminogénio tipo tecido modificado de acordo

-Μ com ο presente invento engloba todas estas formas variantes.

t-PA modificado do invento pode ser derivatizado para dar conjugados farmaceuticamente úteis análogos a conjugados contendo t-PA conhecidos, por exemplo:

(a) um conjugado enzima-proteina conforme divulgado em EP-A-0 155 388, em que o sitio catalítico na enzima é responsável pela actividade fibrinolitica está bloqueado por uma proteína humana a ele ligada através de um grupo de ligação reversível; l (b) um conjugado de enzima-proteina conforma divulgado em EP-A-0 152 736 compreendendo pelo menos uma enzima fibrinolitica facultativamente bloqueada ligada através de um t sitio que não seja o sitio catalítico responsável pela actividade fibrinolitica a pelo menos uma proteína humana;

(c) um conjugado de proteina-polimero conforme divulgadc em EP-A 0183 compreendendo uma proteína farmaceuticamente útil ligada a pelo menos um polímero solúvel em água através de um grupo de ligação reversível; ou (d) um conjugado de enzima conforme divulgado em EP-A-0184363 compreendendo uma pluralidade de enzimas fibrinoliticas ligadas umas às outras através dos seus centros activos por meio de um grupo bloqueador removível.

O t-PA modificado do invento pode tomar o lugar de t-PA como componente enzimático ou proteína (humano), conforme adequado, ‘de qualquer um dos conjugados descritos atrás.

t-PA modificado do invento ou seu conjugado pode ser ainda derivatizado de modo a que qualquer sitio catalítico essencial para a actividade fibrinolitica seja facultativamente bloqueado por um grupo bloqueador removível .

Os derivados acima referidos do tPA modificado podem ser usados em qualquer um dos métodos e composições aqui a seguir descritas para o próprio t-PA modi ficado.

Conforme aqui usada a expressão grupo bloqueador removivel inclui grupos que são removíveis por hidrólise a uma velocidade tal que a constante de velocidade de pseudo-primeira ordem para a hidrólise está na gama de 10 seg a 10^_ seg~ em meio aquoso isotónico a pH 7,4 a 3 7°C.

Tais grupos bloqueadores estão na Patente Europeia No.0009879 e incluem grupos acilo tais como benzoilo facultativamente substituído ou acriloilo facultativamente substituído.

Substituintes facultativos adequado; para grupos bloqueadores benzoilo incluem halogénio, alquilo C_{n r} , alcoxilo C, ,, alcanoiloxi C, _r , alcanoilamino C. _c ,

1-6' 1-6' 1-6' 1-6' amino ou p-guanidino.

-8Substituintes facultativos adequa- , dos para grupos bloqueadores acriloilo incluem alquilo, i furilo, fenilo ou alquilfenilo C^-Cg.i i

,I

Num outro aspecto, o invento proporciona um processo para a preparação de activador do pias- j minogénio tipo tecido modificado de acordo com o invento, processo esse que compreende a expressão de DNA codificador do referido activador do plasminogénio tipo tecido modificado numa célula hospedeira recombinante e recuperação do produto activador do plasminogénio tipo tecido modificado.

A modificação do t-PA pode portanto ser efectuada por técnicas convencionais de engenharia genética em que o cDNA que codifica o t-PA é modificado e o cDNA modificado expresso num hospedeiro procariótico ou euca- ^!riótico.

polimero de DNA compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica o t-PA modificado tam bém faz parte do invento.

processo do invento pode ser efectuado por técnicas recombinantes convencionais como sejam as descritas em Maniatis et al, Molecular Cloning - A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor, 1982.

Em particular o processo pode com preender os passos de:

i) preparação de um vector de expressão replicável capaz de expressar numa célula hospedeira, um polímero de DNA compreendendo uma sequência de nucleotideos que codifica o referido activador do plasminogénio tipo tecido modificado;

ii) transformação de uma célula hospedeira com o referido vector;

iii) cultura da referida célula hospedeira transformada em condições que permitem a expressão do referido polímero de DNA para produzir o referido activador do plasminogénio tipo tecido modificado e iv) recuperação do referido activador do plasminogénio tipo tecido modificado.

invento também proporciona um processo para preparação do polímero de DNA por condensação das unidades de nucleotideos mono-, di- ou oligoméricas adequadas .

A preparação pode ser efectuada quimicamente, enzimaticamente ou através de uma combinação dos dois métodos, in vitro ou in vivo conforme adequado. Assim, o polímero de DNA pode ser preparado através da ligação enzimática dos fragmentos de DNA adequados, por métodos convencionais tais como os descritos por D.M.Roberts et al, em Biochemistry 1989, 24., 5090-5098. Os fragmentos de DNA podem ser obtidos pela digestão de DNA contendo as sequências de nucleotideos necessários com as enzimas ou por uma combinação destes métodos. A digestão com enzimas de restrição pode

ser efectuada num tampão adequado a uma temperatura de 20° 70°C, geralmente num volume de 50 fui ou menos com 0,l-10pg de DNA.

A polimerização enzimática do DNA pode ser efectuada in vitro usando uma DNA polimerase como seja a DNA polimerase I (fragmento Klenow) num tampão adequado contendo os trifosfatos de nucleosideo dATP, dCTP, dGTP e dTTP conforme necessário a uma temperatura de 10°-37°C, geralmente num volume de 50 jul ou menos. A ligação enzimática dos fragmentos de DNA pode ser efectuada usando uma DNA ligase tal como DNA ligase de T4 num tampão adequado, como seja Tris 0,05 M (pH7,4), 0,01M MgCl₂, ditiotritol 0,01 M, espermidina 1 mM, ATP lmM/ml de albumina do soro bovino, a uma temperatura entre 4°C e a temperatura ambiente, geralmente num volume de 50 ul ou menos. A sintese quimica dos polímeros de DNA ou seus fragmentos pode ser efectuada por quimica convencional de fosfotriésteres, fosfitos ou fosforamidetos, usando técnicas em fase sólida tais como as descritas em Chemical and Enzymatic Synthesis of Gene Fragments - A Laboratory Manual ¹ (ed. H.G. Gassen e A. Lang), Verlarg Chemie, Weinheim (1982)ou noutras publicações cientificas por exemplo M.J.Gait, H.W.D.Mather, M.Singh, B.S.Sproat, e

R.C.Titmas, Nucleic Acids Research, 1982, 10, 6243; B.S. Sproat, e W.Bannwarth, Tetrahedron Letter, 1983 24, 5771;

M.D.Matteucci e M.H Caruthers, Journal of the American Chemical Society, 1981, 103, 3185; S.P.Adams et al., Journal of the American Chemical Society, 1983, 105, 661; N.D. Sinha, J.Biernat, J.McMannus, e H.Koester, Nucleic Acids Research, 1984, 12, 4539; e H.W.D. Mathes et al., EMBO Journal, 1984, 3, 801.

polímero de DNA que codifica o t-PA modificado pode ser preparado por mutagénese da cDNA que codifica o activador do plasminogénio tipo tecido, por métodos convencionais tais como os descritos por G.Winter et al em Nature 1982, 299, 756-758 ou por Zoller e Smith 1982; Nucl. Acids Res. 10, 6487-6500 ou mutagénese de delecção tal como descrito por Chan e Smith em Nucl. Acids Res., 1984, 12, 24072419 ou por G. Winter et al em Biochem. Soc. Trans., 1984, 12, 224-225.

Em particular, a preparação pode ser efectuada pela aplicação simultânea ou sequenciada do método de mutagénese descrito em EP-A-0207589 e da mutagénese dirigida do cDNA codificador do t-PA no codão formado pelos nucleotideos 1012-1014 codificadora da arginina 275 conforme descrito em EP-A 0233013. Assim a preparação pode compreender a mutagénese simultânea do cDNA codificador do t-PA nativo na região codificadora do domínio do factor de crescimento (para dar a modificação (a)) e no codão codificador da arginina 275 (para dar a modificação (b)). Como alternativa, a preparação pode compreender a mutagénese do DNA que codifica o t-PA tendo numa das modificações (a) e (b), para se obter a outra modificações (a) e (b), para se obter a outra modificação.

Como alternativa e de preferência, o polímero de DNA pode ser preparado pela ligação enzimática de um primeiro fragmento de DNA que codifica uma porção do t-PA englobando a modificação (a) com um segundo fragmento de DNA que codifica uma porção dp t-PA englobando a modificação (b). Os fragmentos de DNA podem ser obtidos pela digestão dos polímeros de DNA codificadores do t-PA contendo a modificação (a) e a modificação (b) respectivamente. Por conveniência selecciona-se o mesmo sitio de restrição que fique entre os sítios ou potenciais sitios de ambas as modificações, para ambos os polímeros DNA, de modo a que os fragmentos resultantes possam ser ligados para restaurar a sequência de DNA do t-PA mas incluindo as modificações (a) e (b). 0 sitio NarI é um sitio de restrição adequado.

A expressão do polímero de DNA codificador do t-PA modificado numa célula hospedeira recombinante pode ser efectuada através de um vector de expressão replicável capaz de expressar, numa célula hospedeira, o polímero de DNA. 0 vector de expressão é novo e também faz parte do invento.

vector de expressão replicável pode ser preparado de acordo com o invento, por clivagem de um vector compatível com a célula hospedeira para se obter um segmento de DNA linear tendo um replicão intacto e combinação do referido segmento linear com uma ou mais moléculas de DNA que juntamente com o referido segmento linear codifica o activador do plasminogénio tipo tecido modificado, como seja o polímero de DNA codificador do t-PA modificado ou seus fragmentos em condições de ligação.

Assim, o polímero de DNA pode ser pré-formado ou formado durante a construção do vector, conforme pretendido.

A escolha do vector será determinada em parte pela célula hospedeira que pode ser procariotica ou eucariótica. Os vectores adequados incluem plasmideos, bacteriófagos, cosmideos e virus recombinantes.

A preparação do vector de expressão replicável pode ser efectuada convenientemente com enzimas apropriadas para restrição, polimerização e ligação do DNA, por processos descritos por exemplo em Maniatis et al citado atrás. A restrição, polimerização e ligação podem ser efectuadas como descrito acima para a preparação do polimero de I DNA.

A célula hospedeira recombinante pre para-se de acordo com o invento, por transformação de uma célula hospedeira com um vector de expressão replicável do invento em condições de transformação. As condições de transformação adequadas são as convencionais e estão descritas por exemplo em Maniatis et al citado atrás ou DNA cloning Vol II, D.M. Glover ed. IRL Press Ltd, 1985.

A escolha das condições de transformação é determinada pela célula hospedeira. Assim, um hospedeiro bacteriano tal como E.Coli pode ser tratado com uma solução de CaCl₂ (Cohen et al, Proc. Nat.Acad. Sei. 1973, 69, 2110) ou uma solução compreendendo uma mistura de RbCl, MnCl₂, acetato de potássio e glicerol e depois com ácido

3-/~N-morfolino7propano-sulfónico, Rb-Cl e glicerol. As células de mamifero em cultura podem ser transformados por coprecipitação de DNA vector com cálcio sobre as células. O invento também inclui uma célula hospedeira transformada com um vector de expressão replicável do invento.

A cultura de células hospedeiras transformadas em condições que permitam a expressão do polimero de DNA é efectuada de modo convencional, como descrito por exemplo em Maniatis et al., DNA Cloning citado atrás. Assim, de preferência é fornecido às células nutrien tes e outras cultivadas abaixo de 45°C.

produto de expressão t-PA modificado é recuperado por meios convencionais de acordo com a célula hospedeira. Assim, quando a célula hospedeira foi bacteriana, como seja E.Coli, pode ser lisada fisicamente, quimicamente ou enzimaticamente e o produto proteico isolado a partir do lisado resultante. Quando a célula hospedeira fôr de mamífero, o produto pode de um modo geral ser isolado a partir do meio nutritivo. 0 polímero de DNA pode ser montado em vectores destinados ao isolamento de linhas celulares de mamífero transformadas, estáveis e expressando o t-PA modificado; e.g. vectores de polilomavirus bovino (DNA Cloning Vol II D.M.Glover Ed. IRL Press 1985; Kaufman, R.J. et al, Molecular and Cellular Biology 5, 1750-1759, 1985; Pavlakis

G.N. e Hamer, D.H., Proceedings of the National Academy of Sciences (USA) 80, 397-401, 1983; Goeddel, D.V. et al., Pedido de Patente Europeia No. 0093619, 1983).

Será avaliado que, dependendo da célula hospedeira o t-PA modificado preparado de acordo com o invento pode ser glicosilado em vários graus. Ainda, conforme observado por Pohl et al., Biochemistry, 1984, 23, 3701-3707, vários graus de glicosilação podem ser encontrados em t-PA natural não modificado. O t-PA modificado do invento pretende incluir tais variações de glicosilação.

O t-PA modificado do invento é adequadamente administrado na forma de uma composição farmacêutica.

Assim, o presente invento também propo£ ciona uma composição farmacêutica compreendendo t-PA modificado do invento em combinação com um veiculo farmaceuticamente aceitável.

-15As composições segundo o invento podem ser formuladas de acordo com processos de rotina na forma de composições farmacêuticas adaptadas à administração intravenosa em seres humanos.

Tipicamente as composições para administração intravenosa são soluções da enzima estéril em tampão aquoso isotónico estéril. Sempre que necessário a composição pode também incluir um agente de solubilização para manter o t-PA modificado em solução e um anestésico local tal como linhocaína para diminuir a dôr no local da injecção. De um modo geral, o t-PA modificado será fornecido na forma de dosagens unitárias por exemplo como pó seco ou concentrado sem água num recipiente hermeticamente fechado como seja uma ampola ou uma saqueta indicando a quantidade de proteina em unidades de actividade. Quando o t-PA modificado incluir um grupo bloqueador removível pode ser dada uma indicação acerca do tempo que demora a ser libertada a proteina livre. Sempre que a proteina se destina a ser administrada por infusão, será distribuída com um frasco de infusão contendo Agua para Injecção ou soro fisiológico de grau farmacêutico e estéril. Sempre que a proteina seja administrada por injecção, ela é distribuída com uma ampola de água estéril para injecção ou soro fisiológico. A composição para injecção ou para infusão será reconstituída misturando os ingres dientes antes da administração. A quantidade de material administrado dependerá da quantiadde de fibrinólise necessária e da velocidade a que é necessário, da gravidade do estado tromboembólico e da posição e tamanho do coágulo. A dose precisa a ser empregue e o modo de administração deve forçosamente face à natureza do mal ser decidido de acordo com as circunstancias pelo médico que supervisiona o tratamento. No entanto, em geral, um paciente a ser tratado de um trombus maduro, fresco de nascente receberá de um modo geral uma dose diária entre 0,01 e 10 mg/kg de peso do corpo quer por injecção até por exemplo cinco doses ou por infusão.

Dentro da gama de dosagens acima indicada, não estão indicados efeitos toxicológicos adversos para os compostos do invento.

Assim, num outro aspecto do invento é proporcionado um método para tratamento de doenças trombóticas que compreende a administração ao paciente de uma quantidade eficaz não tóxica do t-PA modificado do invento.

invento também proporciona um t-PA modificado do invento para uso como substância terapêutica e, em particular, para uso no tratamento de doenças trombóticas.

Os exemplos que se seguem ilustram o invento.

Exemplo 1

5¹ d(TCCTTTGATCTGAAACTG)3¹

Os 18-meros (octadecâmero) atrás referido foi preparado pelo método de fosforamideto em fase sóli. da usando um sintetizador de DNA Applied Biosystems 381A nas condições recomendadas pelo fabricante. 0 produto foi analisado por cromatografia liquida de alta pressão de permuta iónica (HPLC) conforme descrito abaixo; não se efectuou qualquer outra purificação do produto. 0 rendimento foi de 20 unidades DO (260 nm) quando dissolvido em lml.

Métodos usados nos Exemplos 2 e 3

Clivagem de DNA

Em geral a clivagem de cerca de lpg de DNA de plasmideo ou de fragmentos de DNA foi efectuada usando cerca de 5 unidades de uma enzima de restrição (ou enzimas) em cerca de 20 pl de uma solução tampão adequado.

Produção de extremos cegos: Se forem necessários extremos cegos eles são produzidos por tratamento da preparação de DNA com DNA polimerase I, fragmento Klenow (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory 1982).

Marcação do extremo 5' dos oligonucleotídeos: A adição de grupos fosfatos marcados radioactivamente a oligonucleotideos foi efectuada como descrito (Maxam e Gilbert, Method in Enzymology Vol 65 p499-560 Ed. Grossman e Moldave publicado por Academic Press 1980).

Ligação de fragmentos de DNA: As reacções de ligação foram efectuadas como descrito(Maniatis et al Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory 1982).

Transformação de DNA de M13 em células bacterianas foi efectuada usando tratamento com cloreto de cálcio (Cohen et al 1973, PNAS 69, 2110).

-18A transformação de DNA de plasmídeo em células E.coli HB101 foi como descrito por Hanahan (DNA Cloning Vol. I Capítulo 6, D.M.Glover ed. IRL Press, 1985) no Protocolo 3 excepto a incubação com RFI ter sido de 5 minutos.

Isolamento de clones de cDNA do t-PA

Isolou-se RNA a partir da linha celular TRBM6 (Browne et et 1985, Thrombosis and Haemostasis; 54; 422-424) usando extracção com fenol quente/SDS (M.R.D.Scott, 1982, pHD. Thesis, Universidadecfe Londres) e o RNA mensageiro purificado usando cromatografia em oligo dT celulose. Fez-se uma bivlioteca de cDNA de TRBM6 através da sintese de cDNA de cadeia dupla usando este RNA mensageiro essencialmente como descrito por M.R.D.Scott (Ph.D. Thesis, 1982, Universidade de Londres). Esta preparação de cDNA foi digerida com BglII, fraccionada de acordo com o tamanho numa coluna de Biogel A150 e ligada a um vector pAT153 que tinha sido modificado através da introdução de um adaptador BglII no sitio NruI; o clone de DNA resultante foi propagado em células E.Coli K12 DH1. Usou-se uma sonda de oligonucleotideos especifica para o t-PA (Browne et al 1985; Gene 33 , 279-284) para identificar um clone de cDNA do t-PA na biblioteca de cDNA, este clone é conhecido como pTR108 e é portador de um fragmento BglII de 2kb codificador t-PA madura (Pennica et al, 1983, Nature, 301, 214-221) .

Um outro clone de cDNA ÁTRIO foi isolado a partir de uma segunda biblioteca de cDNA de TRBM6. A biblioteca de cDNA foi construída usando o vector ,\gt 10 como descrito em DNA Cloning Volume I, Capítulos 2 e 3 (Ed. D.M.Glover (IRL Press, 1985). A biblioteca foi testada

usando oligonucleotídeos específicos do t-PA adequados e sondas de plasmídeos usando métodos descritos préviamente (Browne et al, 1985, Gene, 32., 279-284). 0 clone -^-TRIO isolado desta biblioteca possui mais DNA 5' além do presente em pTR108, correspondendo à região prepro-codificadora e parte da região 5' não traduzida (Pennica et al, 1983, Nature, 301, 214-221).

Crescimento do DNA de cadeia simples de M13: Uma placa isolada do fago M13 foi repicada numa diluição de 1:100 em 2YT (1,6% de Bactotryptose, 1% de extracto de levedura 1% NaCl) de uma cultura fresca, cultivada durante a noite, de E. coli estirpe BMM 71-18 (Gronenborn et al, 1976, Mol. Gen. Genet. 148, 243-250). A cultura foi cultivada a 37°C com agitação durante 5-6 horas.Sedimentaram-se as bactérias e guardou-se o sobrenadante. A este adicionou-se 200 ^ul de 2,5M NaCl, 20% PEG 6000 e incubou-se a mistura à temperatura ambiente durante 15 minutos. A mistura foi centrifugada durante 5 minutos numa mini-centrifuga Eppendorf e o sedimento de fagos resultante foi ressuspenso em 100 |il de 10 mM Tris pH 7,9, 0,1 mM EDTA. Após extracção com fenol o DNA fágico foi precipitado com etanol. O sedimento de DNA foi lavado com etanol a 70%, seco ao ar e ressuspenso em 30 jil de 10 mM Tris pH 7,9, 0,1 mM EDTA.

Crescimento de DNA de M13 de cadeia dupla: Uma placa isolada do fago M13 foi repicada para 1 ml de 2YT e crescida com agitação a 37°C durante 6 horas. Sedimentaram-se as bactérias e guardado o sobrenadante contendo o fago M13. Entretanto uma cultura de um litro da diluição, 1:100 de uma cultura de E. coli estirpe BMM 71-18 cultivada durante a noite foi crescida a 37°C com agitação durante 2 horas. Adicionou-se 500 pl do sobrenadante de fagos M13 e agitou-se a cultura a 37°C durante mais 4 horas. A preparação de DNA de cadeia dupla foi efectuada como descrito por Maniatis et al

Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982).

Mutagénese dirigida específica de sítio: As reacções de mutagénese dirigida efectuaram-se essêncialmente como descrito por Cárter et al (Oligonucleotíde site-directed mutagenesis in M13, An Experimental Manual, Anglian Biotechnology Ltd., 1985 ).

A mistura de iniciação que se segue foi feita num volume total de 10 jil:l jug de DNA molde (mTR30 forma de cadeia simples, ver Exemplo 2); 3 ng de oligonucleo tídeo iniciador mutagénico e fosforilado (como descrito acima); 1 jil de tampão TM lOx (100 mM Tris pH 8,0, 100 mM MgCl₂); 5,5 pl de A mistura foi fechada num capilarde vidro, fervida durante três minutos e deixada arrefecer até à temperatura ambiente. A mistura de iniciação foram então adicionados: -20 pl de tampão TM lOx; 1 μΐ de uma mistura de dATP, dGTP, dCTP e dTTP, 4 mM de cada 1 p.1 de rATP 5 mM;

pl de DTT 100 mM; 12 pl de H₂O; 1 unidade de DNA polimerase I (fragmento Klenow); 7 unidades de DNA ligase de dando um volume final total de 30 pl. A mistura foi incubada durante 4 h a 14°C.

O DNA, em porções de 3 pl, foi usado para transformar E. coli estirpe BMH 71-18 mut L (Kramer et al, 1984, Cell 38, 879-887). As bactérias transformadas foram semeadas numa camada formada por E. coliestirpe BMH 71-18. Algumas das placas das transformações foram repicadas e semeadas para formar arranjos tipo grelha em duplicado de colónias bacterianas. Estas foram transferidas para nitrocelulose e lisadas como descrito (Grunstein e Hogness, 1975, P.N.A.S. 72, 3961).

Condições de despiste: Os filtros de nitrocelulose foram pré

-hibridados durante 3 h a 30°C em SSC 6x (SSC lx é 150 mM NaCl, 15 mM citrato tri-sódico), 0,1% de SDS, solução de Denhardt lOx (solução de Denhardt é 0,02% de polivinilpirrolidona, 0,02% de Ficoll, 0,02% de BSA), 50 pg de DNA de esperma de salmão tratado com ultrassons e desnaturado pelo calor. Os filtros foram então misturados com iniciador mutagénico marcado radioactivamente nas mesmas condições de tampão e foram hibridados durante a noite a 30°C.

Lavaram-se os filtros a uma série de temperaturas diferentes em SSC 6x mais 0,1% de SDS: 15 minutos a 30°C; 3 minutos a 45°C; 3 minutos a 50°C.

Após cada uma das lavagens os filtros molhados foram expostos a filme rais X Fuji RX-100 (com um écran intensificador ) .

Sequênciação: A sequênciação de DNA foi efectuada pelo método de terminação didesoxi (Sanger, Nicklen e Conlson, 1977, P.N.A.S. 74 , 3463) .

Preparação de plasmídeos: A preparação em larga escala de DNA de plasmídeo e as mini-preparações de plasmídeos foram efectuadas como descrito em Maniatis et al (Molecular Cloning - A Laboratory, Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982 ) .

Isolamento de fragmentos de DNA a partir de géis de agarose de baixo ponto de fusão (LMP)

Isolaram-se os fragmentos de DNA a partir de geís de agarose LMP como descrito por Maniatis et al (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 1982. Cold Spring Harbor).

Ligação dos adaptadores sintéticos a DNA

Adaptadores sintéticos codificadoresde enzimas de restrição foram fosforilados e ligados a DNA de extremos cegos como descrito por Maniatis et al (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 1982, Cold Spring Harbor).

Desfosforilação de DNA

DNA vector foi desfosforilado, sempre que adequado, por tratamento com fosfatase alcalina de intestino de vitela como descrito por Maniatis et al (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 1982, Cold Spring Harbor ) .

Cobertura de fibrina/agar para detecção da expressão de tPA

Preparação das células: as células fo5 ram tripsinizadas e semeadas a 5,4x10 células por placa de 60 mm e deixadas 72 h em meio de cultura (10% de soro, 1% da solução stock de penicilina/estreptomicina, 1% de glutamina em meio RPMI 1640; Gibco, Paisley, Scotland) a 37°C numa estirpe humidificada com uma atmosfera de 5% de CC^/ /95% de ar. As células foram então novamente alimentadas e usadas para transformação após mais 24 horas.

Processo de transfecção: A transfecção em Eagles MEM, fez-se através de coprecipitação com cálcio como descrito em DNA Cloning Ed. D.M. Glover (Capítulo 15, C. Gorman). Usou-se o choque com glicerol e tratamento com butirato 5 mM.

Cobertura: Agarose (Indubiose Α^γ), 2,4 g em 95 ml de Eagles MEM (Gibco aquecida até ao ponto de fusão num bico de bansen, foi então colocada num banho-maria mantido a 48°C. Diluiu-se 5,6 ml de fibrinogénio (20 mg/ml) a 1:1 com 5,6 ml de Eagles MEM (contendo mais 7 mg/ml de NaCl) e mantêve-se em gelo. Colocou-se 3,3 ml de Eagles MEM (sem adições) num bijou contendo 86 ^ul de trombina bovina a 50 Unidades NIH/ml

(mantidos em gelo). Lavaram-se as células três vezes com Eagles MEM para remover o soro. A trombina e o fibrinogénio foram aquecidos a 37°C num banho-maria. Distribuiu-se

9,5 ml de agarose por frascos universal pré-aquecidos. Adicionou-se a trombina ao agar, seguido do fibrinogénio. 0 gel foi vertido sobre a camada de células e incubado a 37°C até aparecimento de zonas de lise.

| Exemplo 2A

Alteração da sequência de DNA do t-PA (1012-1014)

Produziu-se DNA codificador de uma nova proteína t-PA modificado usando o oligonucleotídeo atrás mencionado (Exemplo 1) com a sequência:

5¹ d(TCCTTTGATCTGAAACTG)3¹

Este oligonucleotídeo é complementar dos oligonucleotídeos 1006-1023 inclusivé do cDNA do t-PA (Pennica et al, Nature, 1983, 301, 214-221) exceptuando nos dois desemparelhamentos nas posições 1013-1014. 0 codao na posição 1012-1014 foi assim alterado de CGC para CAG. A sequência de DNA resultante foi expressa num sistema de células eucarióticas para dar uma proteína fibrinolíticamente activa.

Toda a manipulação de DNA referida abaixo foi efectuada como descrito na Secção de Métodos.

Um clone de cDNA codificadora da proteína t-PA isolado a partir de mRNA preparado a partir da linha celular TRBM6 descrita em Thrombosis and Haemostasis , 1985, 54, 422-424. O fragmento BglII de 2 kb codificador da sequência de cDNA do t-PA maduro foi isolado, dotado de ex-

tremos cegos e subclonado em M13mpl0 (Amershem International PLC Prod. No. N.4536) no sítio Sall que também foi tornado cego. Isolaram-se clones com a inserção em ambas as orietações. Os dois tipos de clone serão daqui em diante conhecidos como mTRlO e mTR20. Um destes, mTR20, possui a inserção de cDNA do t-PA na grelha de leiturae orientação correctas, para permitir a expressão de uma proteína de fusão com t-PA a partir do promotor lacZ no genoma do M13 mplO (Slocombe et al, 1982, P.N.A.S. 79 , 5455-5459). Esta construção não deu bons rendimentos quer de DNA de cadeia simples quer de cadeia dupla.

cDNA do t-PA foi retirado da grelha de leitura cortando o DNA de cadeia dupla do clone mTRlO com as enzimas BamHI e HindIII. A mistura de DNA na sua totalidade compreendendo o DNA vector clivado e o DNA da inserção de t-PA foi dotada de extremos cegos e religada. A construção resultante verificou-se possuir, através de sequenciação de DNA, a estrutura que se segue no ponto de inserção, indicando que o cDNA do t-PA está fora da grelha de leitura relativamente ao promotor lacZ sequência derivada de mp10

5’ GGG GAT CAG CTT GGG CTG CAG GTC GA ___>

transcrição

sequência

TCT '

1IÍ

Este clone será conhecido como mTR30. A mutagénese dirigida foi efectuada no clone mTR30 como descrito nos Métodos.

Após despiste seleccionaram-se cinco sinais positivos em duplicado. Faz-se sequênciação do DNA de cadeia simples dos cinco isolados e todos apresentaram claramente uma sequência de DNA alterada. A sequência é 5'd(CAGTTTCAGATCAAAGGA)3' e o clone designado mTR60.

Exemplo 2B

Expressão transitória do DNA de t-PA modificado (arg27Çj —^^gIⁿ275 ^ ^em células eucarióticas

i) Construção do vector o

O vector pRSV- j-globma (Gorman et al Science, 221, 551-553, 1983) foi modificado para permitir a inserção e expressão do cDNA do t-PA (ver Fig. 1). As sequências da 5-globina foram removidas por digestão de 10 jig de DNA de pRSV- <β-globina com HindIII e BglII, 20 unidades de cada, durante 2 hr e isolamento do fragmento maior de DNA a partir de um gel de 1% de agarose de baixo ponto de fusão como descrito na secção dos métodos. As sequências da /9-globina foram substituídas por um fragmento de DNA codificador da região 5' do cDNA de .AtrIO que é um clone de cDNA em /.gtlO (DNA Cloning, Vol. I, capítulo 2 e 3, Ed.

D.M. Glover, IRL Press, 1985) construído usando o RNA mensageiro das células TRBM6 (Thrombosis and Haemostasis, 1985, 54, 422-424). A inserção de cDNA no /.TRIO codifica a região 5' não traduzida, sequências prepro e sequências de proteína madura até ao sítio EcoRI equivalente à base 801 (Pennica et al., Nature, 1983, 301, 214-221). A inserção de cDNA foi clivada do vector por digestão de 5 jig de DNA com 24 unidades de EcoRI durante 1,5 h. O DNA foi então extraído com fenol/clorofórmio, precipitado com etanol, ressuspenso, dotado de extremos cegos e ligado aos adaptadores HindIII fosforilados como descrito na secção de Métodos. A ligação dos adaptadores foi à temperatura ambiente durante 7 horas

e depois durante a noite a 4°C. Digeriu-se então o DNA com 20 unidades de HindIII durante 2 horas e isolou-se um fragmento de 800 pb correspondendo ao cDNA de t-PA com extremos HindIII foi isolado após electroforese num gel de 1% de agarose de baixo ponto de fusão. Este fragmento de 800 pb foi misturado com o fragmento grande de DNA derivado de pRSV- p -globina descrito acima e precipitado com etanol. O DNA foi ressuspenso e digerido com HindIII e BglII 10 unidades de cada durante 1,7 h, extraído com fenol/clorofórmio, precipitado com etanol, ressuspenso e ligado como descrito na secção de métodos durante 5 h à temperatura ambiente e durante a noite a 4°C. Usou-se 2 jil de DNA para transformar E. coli HB101 e as colónias portadoras de plasmídeos contendo o extremo 5' do cDNA do t-PA até ao sítio BglII equivalente ao número 187 em Pennica et al (Nature, 1983, 301, 214-221), foram identificadas por digestão de mini-preparações de plasmídeo com HindIII/BglII e o plasmídeo designado pTREl.

As sequências codificadoras de repetição terminal longa do vírus de sarcoma de Rous (RSV-LTR) região 5' do cDNA do t-PA e as sequências 3' do vírus de Simio 40 (SV40) foram então reconstruídas em pAT153 de modo a formarem um único fragmento Xhol. Em primeiro lugar, a LTR de RSV foi removida de pRSV- -globina por digestão de 6 jig de DNA com 4U de SfaNI durante 2,5 h. O DNA foi então extraído com fenol/clorofórmio precipitado com etanol, ressuspenso e dotado de extremos cegos. Os adaptadores Xhol foram fosforilados e ligados ao DNA à temperatura ambiente durante 8 h e durante a noite a 4°C, depois incubados a 70°C durante 15 minutos para inactivar a ligase e precipitados com etanol. O DNA com adaptadores foi então ressuspenso e digerido com HindIII e Xhol, 15 unidades de cada durante 6 h e um fragmento de i-u 500 pb correspondendo à RSV-LTR foi isolado após electroforese num gel de 1% de agarose LMP. Este fragmento de DNA foi clonado em pAT153 preparado como se segue: 6 jig de pAT153 foi digerido com 30U de EcoRI durante 2 h, depois extraído com fenol/clorofórmio e precipi-27-

tado com etanol. 0 DNA foi ressuspenso, dotado de extremos cegos, ligado a adaptadores Xhol, ressuspenso e digerido com HindIII e Xhol como acima. Isolou-se um fragmento de _Λ 3,4 kb após electroforese num gel de 1% de agarose LMP e precipitou-se com etanol juntamente com o fragmento de /v500 pb atrás referido. 0 DNA foi ligado para dar pTREO.

fragmento de ^0,2 kb codificador da parte 5' do cDNA do t-PA foi isolado a partir de pTREl por digestão de 10 |ig do DNA com HindIII e BglII, 30 unidades de cada, durante 2 horas e o fragmento isolado após electroforese num gel de 1% de agarose LMP. Este fragmento foi clonado em pAT153 preparado como se segue: 5 |ig de pAT153 foi digerido totalmente com BamHI. Após extracção com fenol/clorofórmio e precipitação com etanol, o DNA foi ressuspenso e dotado de extremos cegos, depois ligado a adaptadores BglII fosforilados. O DNA foi extraído com fenol/clorofórmio, precipitado com etanol, ressuspenso e digerido com HindIII e BglII, 30 unidades de cada durante 3 h. A banda do fragmento grande de DNA foi isolada após eletroforese nul gel de 1% de agarose LMP, precipitado com etanol juntamente com ofragmento de _tx0,2 kb acima e ligados um ao outro para dar pTRE8.

Um fragmento de DNA codificador das sequências do SV40 de pTREl foi isolado como se segue: 5 pg de pTREl foi digerido com 60 unidades de EcoRI durante 2 h, dotada de extremos cegos e ligado a adaptadores Xhol como descrito anteriormente. Após extracção com fenol/clorofórmio e precipitação com etanol, o DNA foi ressuspenso e digerido sequêncialmente com BglII e Xhol. Uma banda de A/1,6 kb codificadora das sequências do SV40 foi isolada após electroforese num gel de 1% de agarose LMP e clonado em pTRF8 preparado como se segue: 5 pg de pTRE8 foi digerido com 15 unidades de Sall durante 3 1/2 h, dotado de extremos cegos e ligados a adaptadores Xhol como descrito anteriormente. Após extracção com fenol/clorofórmio e precipitação com eta-28-

nol, o DNA foi ressuspenso e digerido sequenciadamente com 30 unidades de BglII durante lhe com 10 unidades de Xhol durante 2 h. A banda grande de DNA foi isolada após electroforese num gel de 1% de agarose LMP, precipitada com etanol juntamente com o fragmento A/1,6 kb acima e ligado para dar pTREll.

Um fragmento de DNA ^2 kb codificador das sequências 5' do cDNA do t-PA sequências do SV40 e parte de pAT153 foram clivadas do pTREll por digestão de 5 |ig de DNA com 30 unidades de HindIII e 6 unidades de XmalII durante 6 h. Após electroforese num gel de 1% de agarose LMP isolou-se uma banda de 2 kb e clonou-se em pTREO preparado como se segue: 4,8 pg de pTREO foi digerido com HindIII e XmalII como acima e o fragmento grande de DNA isolado após electroforese num gel de 1% de agarose LMP. Este fragmento foi precipitado com etanol juntamente com o fragmento 4/2 kb atrás referido e ligado para dar pTRE12.

Os fragmentos BglII de cDNA do t-PA foram clonados no único sítio BglII do pTRE12 como se mostra na Figura 2. pTRE7 contem um fragmento BglII V 2 kb, codificador da proteína t-PA madura e parte da região 3' não traduzida derivada de uma biblioteca de cDNA produzida a partir de células TRBM^, (Thrombosis and Haemostasis, 1989, 54, 422-424), clonada no único sítio BglII de pTREl. 5 pg de pTRE7 foi totalmente digerido com BglII e o fragmento 4/ 2 kb isolado após electroforese num gel de 1% de agarose LMP. Este foi precipitado com etanol e ligado a pTRE12 , préviamente digerido com BglII e desfosforilado como descrito na secção de métodos para dar pTRE15 que expressa t-PA selvagem. mTR60 foi digerido com BglII e um fragmento h 2 kb isolado e clonado em pTRE12como descrito acima para dar pTRE32 que expressa t-PA mutagenizado.

ii) Cobertura de fibrina/agar

A expressão de t-PA modificado e não modificado a partir de células HeLa humanas transfectadas (24 horas pós-trasfecção) foi detectada usando a técnica de cobertura com fibrina/agarose como descrito na secção de | métodos. As zonas líticas foram obtidas a partir de células transfectadas com pTRE15 (t-PA não modificado) e pTRE32 (t-PA modificado), mas não a partir de células transfectadas com vector parental pTRE12 sem inserção (t-PA).

Exemplo 3

Uma outra foram mutagenizada do t-PA foi anteriormente descrita em que o domínio do factor de crescimento foi eliminado, aminoácidos 51-87 inclusive (EP-A-O207589). É aqui descrita uma forma alterada de t-PA que combina a mutação descrita em EP-A-0207589 e a presente no Exemplo 2B. O plasmídeo de expressão codificador deste t-PA modificado foi construído como se segue. 0 fragmento Narl-Sstl de aproximadamente 900 pb portador da mutação arg275 gln275 foi retirado do pTRE32 descrito acima e o fragmento HindIII-NarI de aproximadamente 410 pb foi removido do plasmídeo pTRE24 descrito em EP-A-0207589. Estes dois fragmentos foram ligados com o fragmento HindIII-SstI de aproximadamente 6 kb de pTRE15 (ERA-0207589) para formar o plasmídeo pTRE48.

O DNA de plasmídeo preparado a partir de E. coli recombinante por técnicas convencionais foi usado para transfectar células humanas HeLa em cultura pelo método de precipitação com fosfato de cálcio essêncialmente como descrito em Hogh Efficiency Gene Transfer into Mammalian Cells de C. Gorman (Em DNA Cloning VolumelI, ed. D. Glover, IRL Press Ltd., 1985).

A expressão de t-PA modificado e não modificado a partir de células humanas HeLa transfectadas (24 horas pós-transfecção) foi detectada usando a técnica de cobertura com fibrina agarose como descrito na secção de Métodos. Obtiveram-se zonas líticas indicando a presença de um activador do plasminogénio.

Nas figuras:

Figura 1 (a, b e c): Construção do vector (pTRE12) para inserção e expressão de sequências de t-PA

Abreviaturas:

TRIO - clone de XgtlO contendo a parte 5' do cDNA do t-PA

LTR - Repetição terminal longa do vírus do sarcoma de

Rous

- cDNA da β -globina de coelho

SV - sequências do vírus de Símio 40 incluindo o intrão do antigénio t pequeno e a região precoce do sítio de poliadenilação

5' - parte 5' do c-DNA do t-PA (aproximadamente 0,2 kb de comprimento) com o extremo 3' equivalente ao sítio BglII na posição 187 em Pennica et al Na-

ture 301., 214-221, 1983
B	- sítio	de	reconhecimento	para	BamHI
Bg	-sítio <	3e :	reconhecimento para :	BglII
E	- sítio	de	reconhecimento	para	EcoRI
H	- sítio	de	reconhecimento	para	HindIII
S	- sítio	de	reconhecimento	para	Sall
Sf	- sítio	de	reconhecimento	para	SfaNI
X	- sítio	de	reconhecimento	para	Xhol
Xm	- sítio	de	reconhecimento	para	XmalII

Figura 2: Construção de vectores expressando t-PA selvagem ou mutante (pTRE15 e pTRE32 respectivamente).

As abreviaturas são como na Figura 1. 0 t-PA tipo selvagem é cDNA codificador de t-PA normal, o t-PA mutante é cDNA codificador de t-PA alterado (arg2 75 gln2 75 ) .

Claims

I

REIVINDICAÇÕES

1§. - Processo para a preparação de um activador do plasminogénio tipo tecido fibrinoliticamente activo que foi modificado:

(a) na região do domínio de factor de crescimento e (b) para fornecer um aminoácido que não seja arginina ou lisina na posição 275 e em que qualquer sítio catalítico essencial para a actividade fibrinolítica é facultativamente bloqueado por um grupo bloqueador removível, caracterizado por compreender a expressão de DNA codificador do referido activador do plasminogénio tipo tecido modificado numa célula hospedeira recombinante e a recuperação do produto activador do plasminogénio tipo tecido modificado e depois, quando necessário, o bloqueio facultativo do sítio catalítico com um grupo bloqueador removível.
2§. - Processo de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por a modificação (a) ser na região entre os resíduos de aminoácidos 51 a 87 inclusivé.
3ê. - Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2 caracterizado por a modificação (a) compreender a deleção de todo ou parte do domínio de factor de crescimento.
4®. - Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por a modificação (a) compreender a deleção dos resíduos de aminoácidos 51 a 87 inclusivé.
5â. - Processo de acordo com qualquer reivindicação precedente caracterizado por a modificação (b) proporcionar um aminoácido seleccionado entre histidina, treonina, alanina, glicina, serina, asparagina, ácido aspártico, glutamina, e ácido glutâmico na posição 275.
6^. - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes caracterizado por o aminoácido na posição 275 ser a glutamina.
7a. - Processo para a preparação de um polímero de DNA compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica um activador do plasminogénio tipo tecido modificado conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6 caracterizado por se proceder à condensação de unidades de nucleotídeos mono-, di- ou oligoméricas.
8a. - Processo para a preparaçãode um vector de expressão replicável capaz de expressar numa célula hospedeira um polímero de DNA conforme definido na reivindicação 7, caracterizado por compreender a clivagem de um vector compatível com a referida célula hospedeira para proporcionar um segmento de DNA linear tendo um replicão intacto e a combinação do referido segmento linear com uma ou mais moléculas de DNA que, juntamente com o referido segmento linear, codificam o activador do plasminogénio tipo tecido modificado, em condições de ligação.
9â. - Processo para a preparação de uma célula hospedeira transformada com um vector de expressão replicável conforme descrito na reivindicação 8, caracterizado por compreender a transformação de uma célula hospedeira com o referido vector em condições de transformação.

lOâ. - Processo para a preparação de um medicamento para o tratamento de doenças trombóticas caracterizado por se incluir no referido medicamento um activador do plasminogénio tipo tecido modificado preparado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6 em combinação com veículo farmaceuticamente aceitável.

llâ. - Método de tratamento de doenças trombóticas caracterizado por se administrar ao paciente uma quantidade eficaz não tóxica de activador do plasminogénio tipo tecido modificado, preparado de acordo com a reivindicação 1, sendo a gama de dosagem diária de 0,01 a 10 mg por kg de peso corporal.

Lisboa, 26 de Janeiro de 1988