JPH022376A - 酵素前駆体型ヒトプロテインｃの発現のためのベクターおよび化合物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

産業上の利用分野 本発明は、新規な酵素前駆体型のヒトプロティンＣをコ
ードしている新規ＤＮＡ化合物および組換えＤＮＡクロ
ーニングベクターに関する。これらの酵素前駆体は、イ
ンビボにおいてトロンヒン単独により臨床的に有意な速
度で活性化することが可能であり、また、天然のプロテ
ィンＣ酵素前駆体よりトロンビン／トロンボモジュリン
による活性化を受けやすい。本発現ベクターは、これら
のヒトプロティンＣ酵素前駆体を組換え宿主細胞中で発
現させる簡単かつ効率的な手段を与える。 天然のヒトプロティンＣ酵素前駆体は、高レベルのトロ
ンビン、またはトロンビンとトロンボモジュリン、また
は他の活性化用の高価な酵素による処理を必要とする。 本発明は、トロンビンのさらに良好な基質として作用し
、従って比較的低いレベルノトロンヒンアルいはトロン
ビン／トロンボモジュリン、またはその他の酵素の存在
下で活性化されうる、酵素前駆体型のヒトプロティンＣ
を製造するための方法を提供するものである。最も重要
なことは、本発明の酵素前駆体型のヒトプロティンＣは
、トロンビンによる天然のプロティンＣ酵素前駆体の活
性化を阻害する生理学的なＣａ２＋の存在下であっても
トロンビンによって活性化されうるということである。 この新規な酵素前駆体型のヒトプロティンＣは、活性化
ペプチドのアミノ酸残基配列が当分野で知られているも
のと異なっている（この活性化ペプチドは酵素前駆体型
のヒトプロティンＣから除去されて活性化されたヒトプ
ロティンＣを与える）。これら新規な酵素前駆体型のプ
ロティンＣは、凝固が関与する血液疾患の治療に特別の
利点を与える。 発明の背景および従来技術 ビタミンに依存性の血漿タンパク質であるプロティンＣ
は、主として止血のコントロールにおいて生理学的な重
要性を有し、血液凝固の調節において重要な役割を演す
る。プロティンＣは不活性分子として合成される（本明
細書では形成期プロティンＣと呼ぶ）。この形成期プロ
ティンＣは複雑なプロセッシングを経て、以下さらに詳
しく説明する多数の別種不活性分子を生成する。不活性
な、分泌された形のプロティンＣ配本明細書では酵素前
駆体プロティンＣと呼ぶ。プロティンＣの活性化は、ト
ロンポモジュリンートロンビンコンプレノクスが関与す
る反応により血液中で起こる。活性化されたプロティン
Ｃは、その補助因子プロティンＳとともに、生理学的に
重要な抗凝固剤である。活性化されたプロティンＣは、
血管内の血栓症を防止することができ、既存の血餅の拡
大を抑制することができる。活性型プロティンＣの作用
機序、および不活性酵素前駆体の活性プロテアーゼへの
活性化機序はこの数年の間に明らかにされている［Ｊ、
Ｅ、Ｇａｒｄｉｎｅｒ　ａｎｄ　Ｊ、Ｈ，Ｇｒｉｆｆｉ
ｎ。 Ｐｒｏｇｒｅｓｓ　ｉｎ　［（ｅｍａｔｏｌｏｇｙ、　
Ｖｏｌ、Ｘ１ｌｌ、　２６５−２７８頁Ｅ１ｍｅｒ　Ｂ
、　Ｂｒｏｗｎ編、　Ｇｒｕｎｅ　ａｎｄ　５ＬｒａＬ
ｔｏｎ、　Ｉｎｃ。 １９８３を参照１゜ プロティンＣの活性化には、トロンビン、凝固カスケー
ドの最後のセリンプロテアーゼ、およびトロンボモジュ
リンと呼ばれる内皮細胞膜関連の糖タンパク質が関与し
ている。トロンボモジュリンはトロンビンと強固かつ化
学量論的なコンプレックスを形成する。トロンビンとコ
ンプレックス化しｌ二ときのトロンボモジュリンはトロ
ンビンの機能的な性質を完全に変化させる。通常、トロ
ンビンはフィブリノーゲンを凝固させ、血小板を活性化
し、血餅形成の補助因子Ｖおよび■をその活性型である
Ｖａおよび■ａに変換する。最後に、トロンビンはプロ
ティンＣを活性化するが、それは極めてゆっくりであり
、かつ非効率的なものでしかなく、さらにこの活性化は
生理学的なＣａ”によって阻害される。対照的に、トロ
ンボモジュリンとコンプレックス化し！ニトロンヒ゛ン
１まフィブリノーゲンを凝固させず、血小板を活性化せ
ず、あるいは血餅形成の補助因子Ｖおよび■をその活性
型であるＶａおよび■ａに変換しないが、生理学的なＣ
ａ２＋の存在下で極めて効率のよいプロティンＣ酵素前
駆体の活性化因子となる。トロンボモジュリン−トロン
ビンによるプロティンＣ酵素前駆体活性化の速度定数は
トロンヒン単独の速度定数の１０００倍以上である。 活性化されたプロティンＣがどのようにして血液凝固を
下方調節するのかを理解するため、凝固酵素系の簡単な
説明を以下に挙げる。凝固系は、酵素前駆体の活性セリ
ンプロテアーゼへの逐次活性化からなる連鎖反応と考え
るのが最もよい。この連鎖反応により最後には酵素トロ
ンビンが生成し、これが限定されたタンパク質加水分解
により血漿のフィブリノーゲンを不溶性ゲルのフィブリ
ンに変換する。この凝固カスケードにおける２つの鍵と
なる現象は、凝固形成因子ｒＸａによる凝固形成因子Ｘ
のＸａへの変換、および凝固形成因子Ｘａによるプロト
ロンビンのトロンビンへの変換である。この両者反応は
、細胞表面、とりわけ血小板表面で起こり、両反応は補
助因子を必要とする。系中の主補助因子、即ち因子Ｖお
よび■は、比較的不活性な前駆体として循環しているが
、トロンビンの最初の数分子が生成すると、トロンビン
か輪（ループ）を後戻りし、限定されたタンパク質加水
分解により補助因子を活性化する。活性化された補助因
子Ｖａおよび■ａは、プロトロンビンのトロンビンへの
変換、および因子Ｘの因子Ｘａへの変換の両方を約５オ
ーダー促道する。活性化されたプロティンＣは優先して
凝固形成補助因子Ｖａおよび■ａ（不活性な凝固形成因
子■および■の活性型）をタンパク質加水分解により減
成し、加水分解し、そして不可逆的に破壊するように作
用する。対照的に、凝固形成因子■および■は、インビ
ボでは活性化されたプロティンＣの基質となることが極
めて少ない。 活性化プロティンＣ用の重要な補助因子は、別のビタミ
ンに依存性の血漿タンパク質であるプロティンＳである
。プロティンＳは、活性化プロティンＣが介する因子Ｖ
ａおよび■ａの加水分解を実質的に２５倍増加させる。 プロティンＣは有用な治療剤であると認識されている［
例えば、欧州特許公開Ｎ　ｏ、０２１５５４８およびＮ
ｏ、０１９１６０６を参照１゜活性化されたプロティン
Ｃは、現在利用可能な抗凝固剤（ヘパリンや経口のヒド
ロキシクマリン型の抗凝固剤）よりも広い治療インデッ
クスを有する新規な抗血栓症剤である。 凝固形成因子ＶをＶａに、そして■を■ａに変換するの
にトロンビンか必要とされるので、酵素前駆体のプロテ
ィンＣも活性化されたプロティンＣもトロンビンが生成
するまでは有効ではない；活性型のこれら２種類の補助
因子は活性化プロテインＣの好ましい基質である。また
、トロンボモジュリン−トロンビンのコンプレックスが
ないとプロティンＣ酵素前駆体がその活性型に変換され
ないので、酵素前駆体のプロティンＣを活性化するのに
トロンビンが必要とされる。 活性化プロティンＣは補助因子Ｖａおよび■ａを不活性
化することによって作動するので、活性化プロティンＣ
は要求があって働く抗凝固剤である。 因子■および■をその活性型のＶａおよび■ａに変換す
るのにトロンビンか必要とされるので、プロティンＣは
トロンビンが生成した後にだけ抗凝固剤として作用する
。活性化プロティンＣとは対照的に、通常の抗凝固剤は
それが患者に投与されて循環している間はずっと一定の
抗凝固状態を維持するので、出血合併症の危険がプロテ
ィンＣあるいは活性化プロティンＣのときより実質的に
増加する。このように、活性化プロティンＣは要求があ
って作動する抗凝固剤であり、ヘパリンやヒドロキンク
マリン類に代わるものとして広い臨床用用途を有してい
る。 遺伝性のプロティンＣ欠損などのある疾患状態では、プ
ロティンＣ酵素前駆体は大きな治療上の重要性を有する
。先天的なホモ接合のプロティンＣ欠損では、その患者
は幼い時に、致死型の播種住血管内凝固を伴うことが多
い電撃性紫斑病で死んでしまう。ヘテロ接合のプロティ
ンＣ欠損では、その患者は重篤な、再発性の血栓塞栓に
苦しむ。 血友病Ｂあるいは因子■欠損を治療するために設計した
血漿タンパク質濃縮物（不純物としてプロティンＣを含
んでいる）はへテロ接合性のプロティンＣ欠損での血管
内凝固の防止および治療に有効であることが臨床的に十
分確立されている。また、播種性の血管内凝固などの血
栓状態では、ならびに大けが、大手術、および癌などの
血栓症になりやすい疾患状態では、プロティンＣのレベ
ルか異常に（氏いことがわかっている。 本発明およびプロティンＣ活性化の理解を容易にするた
め、形成期ヒトプロティンＣの暗号配列、および対応す
るアミノ酸残基配列を以下に示す。 このアミノ酸残基配列およびその中の関連部分は、本発
明の目的に対する、「天然のヒトプロティンＣ」の特徴
をも示している。

【遺伝子配列】

［配列中、Ａはデオキシアデニノ呟Ｇはデオキ／クアニ
ル、Ｃはデオキシシチジル、ＴはチミジルＡＬＡはアラ
ニン、ＡＩ？Ｇはアルギニン、ＡＳＮはアスパラギン、
ＡＳＰはアスパラギン酸、−Ｃｆ’）０１１はカルボキ
シ末端、ｃｙｓはンスティン、ＧＬＮはグルタミン、Ｇ
ＬＵはグルタミン・酸、ＧＬＹはグリノン、１１２Ｎ−
１まアミノ末端、１１１ｓはヒスチジン、　　ＩＬＥは
インロイノン、ＬＥＵはロイシン、　ＬＹＳはリジン、
ＭＥＴはメチオニンＰＩＩＦはフェニルアラニン、　Ｐ
ｌ？Ｏはプロリン、ＳＥＲはセリン、　ＴＨＲは（・レ
オニン、ＴＲＰはトリプトファンＴＹＲはチロシン、そ
してＶＡＬはバリンである１゜上に挙げたＤＮＡ配列は
、ヒトプロティンＣをコードしているヒト肝臓ｍＲＮＡ
から調製したｃＤＮＡクローンから得た。遺伝コードの
縮重性により同一のアミノ酸残基配列をコードしている
多数の別種ＤＮＡ配列を組み立てることができることは
当業者の理解する七ころである。従って、上記の形成期
ヒトプロティンＣのｃＤＮ、Ａ配列は、可能性のある多
数の形成期ヒトプロティンＣ−コード化配列の１つであ
るにすぎない。ｃＤＮＡクローンの組み立てにおいて、
５°ポリＧ配列、３′ポリＣ配列、ならびに両５゛およ
び３′のＰｓｔｒ制限酵素認識配列を、プロティンＣを
コードしているｃＤＮＡの両末端に構築した。これらｃ
ＤＮＡクローンの２つを操作して、形成期ヒトプロティ
ンＣの暗号配列、ならびに暗号領域の５′および３゛末
端の非翻訳化ｍＲＮＡをコードしているＤＮＡ部分の両
方を含むＤＮＡ分子を構築した。このＤＮＡ分子をプラ
スミドｐＢＲ３２２のＰｓｔ１部位に挿入してプラスミ
ドｐＨＣ７を構築した。従って、プラスミドｐＨＣ７は
上記の暗号配列を含んでおり、また、形成期ヒトプロテ
ィンＣの暗号配列の解読鎖の５′および３″末端のそれ
ぞれに以下の付加的な配列を含んでいる（分子の１本の
鎖だけを示す）： ５−ＣＴＧＣＡＧＧ　ＧＧＧ　ＧＧＧ　ＧＧＧ　ＧＧＧ
　ＧＧＧ　ＧＧＧ　ＣＴＧ　ＴＣＡＴＧＧ　ＣＧＧ　Ｃ
Ａに　ＧＡＣＧＣ：ＣＧＡＡ　ＣＴＴ　ＧＣＡ　ＧＴＡ
　ＴＣＴＣＣＡ　ＣＧＡ　ＣＣＣＧＣＣＣＣＴ　ＡＣＡ
　ＧＧＴ　ＧＣＣＡＧＴ　ＧＣＣＴＣＣＡＧＡ−３’ および ５’　−ＣＧＡ　ＣＣＣＴＣＣＣＴＧ　ＣＡＧ　ＧＧＣ
ＴＧＧ　ＧＣＴ　ＴＴＴ　ＧＣＡＴＧＧ　ＣＡＡ　ＴＧ
Ｇ　ＡＴＧ　ＧＧＡ　ＣＡＴ　ＴＡＡ　ＡＧＧ　ＧＡＣ
ＡＴＧＴＡＡ　ＣＡＡ　ＧＣＡ　ＣＡＣＣＣＣＣＣＣＣ
ＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＴ　ＧＣＡ　
Ｇ−３’ＤＮＡ塩基が対になる相補性の性質により、２
本Ｍ４ＤＮＡ分子のうち１本鎖の配列はもう一方の鎖の
配列を決めるのに十分である。プラスミドｐ）（Ｃ７は
、ノーザン・リージョナル・リザーチ・ラポラｌゝリ−
［Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　Ｒｅｇｉｏｎａｌ　Ｒｅ５ｅａｒ
ｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＮＲＲＬ）、　Ｐｅｏｒ
ｉａ、　［１ｌｉｎｏｉｓ］に寄託され、その永久保存
培養物コレク７ヨンの一部をなしている菌株である大腸
菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）Ｋ　ｌ　２　　ＲＲｌ　／ｐＨ−Ｃ
７から常法により単離することができる。大腸菌Ｋ　ｌ
　２　　ＲＲｌ／ｐＨＣ７の培養物はＮＲＲＬから取得
番号ＮＲＲＬ　　Ｂ−１５９２６のもとで入手すること
ができる。プラスミドｐＨＣ７の制限部位および機能地
図を添付の第２図に示す。 また、形成期のプロティンＣを次のように図示すること
もできる： ＜ＨＣ−＞ ブレープロ：形成期ヒトプロティンＣのアミノ酸残基１
〜４２であり、プロティンＣ の分泌およびγ−カルポキンル化に重 要なヒトプロティンＣのシグナルペ プチドおよびプロペプチドをコード している。 ｒ−ｃ　　　　：形成期プロティンＣのアミノ酸残基４
３〜＋９７であり、翻訳後に修飾 されると２本鎖の酵素前駆体（ＫＲジ ペグチドの除去により１本鎖の酵素 Ｒ Ｐ ＭＣ 前駆体から生成する；後に説明する） および活性化形のプロティンＣの両 者の軽鎖（ＬＣ）を構成する。 ・形成期ヒトプロティンＣのアミノ酸 残基１９８〜１９９であり、これら の残基は、おそらくは最初の切断（残 基１９７−１９８あるいは１９９ ２００の間）とそれに続くカルボキン ペプチダーゼあるいはアミノペプチ ダーゼの作用からなる２ステツプの 工程で除去されて２本鎖のプロティ ンＣを生成するものと考えられてい る（つ／プロティンＣとの相同性に基 づいて）。 ・形成期プロティンＣのアミノ酸残基 ２００〜２１１であり、酵素前駆体 形のプロティンＣから除去されて活 性化プロティンＣを与える活性化ペ プチドを構成している。 ：形成期プロティンＣのアミノ酸残基 ２１２〜４６１であり、翻訳後に修 飾されると活性プロティンＣの活性 化された重鎮（ＡＨＣ）を構成する。 ＨＣニアミノ酸残基２００〜４６１、即ちＡＰおよびＡ
ＨＣからなる、翻訳後 に修飾された後の、２本鎖形のプロ ティンＣ酵素前駆体の重鎮。 ヒトプロティンＣ酵素前駆体は、肝臓で合成され、血液
中に存在するセリンプロテアーゼ前駆体である。完全な
生物学的活性を現すためには、プロティンＣは翻訳後の
修飾を必要とし、これにビタミンＫが必要となる。２本
鎖の、ジスルフィド結合したプロティンＣ酵素前駆体が
、部分的なタンパク質加水分解によって１本鎖の酵素前
駆体から生成する。この部分的なタンパク質加水分解に
は、アミノ酸残基１９８および１９９の切断および除去
が含まれるものと考えられている。この２本鎖の酵素前
駆体の活性なセリンプロテアーゼへの活性化にはＡＲＧ
−ＬＥＵペプチド結合（残基２１１および２１２）のタ
ンパク質加水分解による切断か関与している。この後者
の切断は、２本鎖酵素前駆体分子の大きい方の鎖（重鎖
）のアミノ末端を構成している活性化ペプチドであるド
デカペプチド（残基２００〜２１１）を放出する。プロ
ティンＣは相当にグリコジル化されている；成熟酵素は
〜２３％の炭水化物を含んでいる。また、プロティンＣ
は、γ−カルボキシグルタミン酸およびβ−ヒドロキシ
アスパラギン酸（エリスローし一β−ヒドロキンアスパ
ルテート）を含む多数の普通ではないアミノ酸を含有し
ている。γ−カルボキングルタミン酸（ｇｌａ）は、補
助因子としてビタミンＫを必要とする肝ミクロソームの
カルボキンラーゼの働きにより、グルタミン酸残基から
γ−グルタミルカルボキシル化によって生成する。 また、ヒトプロティンＣの活性化を以下のように図示す
ることもできる。図に示した各ステップの順序が必ずし
もインヒポの経路での各ステップの順序を反映したもの
ではないことは当業者の認めるところである。 プレープローＬＣ−ＫＲ−ＡＰ−ＡＩ（Ｃ形成期プロテ
ィンＣ ／ル化 による切断か関与している ＬＣ−ＫＲ−ＡＰ−ＡＨＣ１本鎖の酵素前駆体Ｃ ２本鎖の酵素前駆体 ＬＣ 活性化プロティンＣ ＡＨＣ 発明の目的および構成 本発明は新規なプロティンＣ酵素前駆体の組換え発現の
ための新規化合物、ベクター、形質転換体、および方法
を提供するものである。 本明細書中で用いる用語を以下に定義する。 Ａｄ２ＬＰ：アデノウィルス２型の主後期プロモーター タンパク質またはペプチド中のアミノ酸残基は次の短縮
形で示した： ３文字短縮形　　アミノ酸残基　　　１文字短縮形ＰＨ
Ｅ　　　　　フェニルアラニン　　　ＦＬＥＵ　　　　
　ロイ７ン　　　　　　　ＬＩＬＥ　　　　　イソロイ
ノン　　　　　１ＭＥＴ　　　　　メチオニン　　　　
　　ＭＶＡＬ　　　　バリン　　　　　　　ＶＳＥＲセ
リン　　　　　　　５ ＰＲＯプロリン　　　　　　　　Ｐ ＴＨＲトレオニン　　　　　　Ｔ ＡＬＡ　　　　　アラニン　　　　　　　ＡＴＹＲチロ
シン　　　　　　　Ｙ ＨＩＳ　　　　　ヒスチジン　　　　　　ＨＧＬＮ　　
　　　グルタミン　　　　　　　ＱＡＳＮ　　　　　ア
スパラギン　　　　　ＮＬＹＳ　　　　　リジン　　　
　　　　　　ＫＡＳＰ　　　　　アスパラギン酸　　　
　ＤＧＬＵ　　　　　グルタミン酸　　　　　ＥＣＹＳ
　　　　　システィン　　　　　　ＣＴＲＰ　　　　　
トリプトファン　　　　ＷＡＲＧ　　　　　アルギニン
　　　　　　ＲＧＬＹ　　　　　グリシン　　　　　　
　ＧＡｐＲ：アンビンリン耐性の表現型またはそれを付
与する遺伝子。 ＢＫ　：　ＢＫウィルス由来のＤＮＡ。 ＣＡＴ：クロラムフェニコールアセチルトランスフェラ
ーゼ遺伝子。 Ｅｎｈまｔ二は工ンハンサー：ＢＫウィルスのエンハン
サ− ｅｐまたは５Ｖ４０ｅｐ：　ＳＶ４０のＴ−抗原遺伝子
の初期プロモーター、Ｔ−抗原結合部位、ＳＶ４０のエ
ンハンサ−１およびＳＶ４０の複製起源を含有するＤＮ
Ａセグメント。 γ−カルポキンル化：グルタミン酸のγ−炭素にカルポ
キ／ル基を付加する反応。 γ−カルボキシル化されたタンパク質：グルタミン酸残
基のいくつかがγ−力ルポキシル化を受けたタンパク質
。 ＩＶＳ：イントロンをコードしているＤＮＡであり、介
在配列とも呼ばれる。 ＭＭＴｐｒｏ＋マウスのメタロチオネイン−■遺伝子の
プロモーター 形成期タンパク質：ｍＲＮＡ転写体の翻訳によって生成
したポリペプチドであり、翻訳後の修飾を全く受けてい
ないもの。しかし、ｍＲＮＡ転写体からタンパク質が完
全に翻訳される前に、グルタミン酸残基のγ−力ルポキ
シル化およびアスパラギン酸残基のヒドロキシル化など
の翻訳後修飾を受けることもある。 ＮｅｏＲ：不才マイシン耐性を付与する遺伝子であり、
この遺伝子を用いて抗生物質Ｇ４１８に対する耐性を付
与することもできる。 ｐＡ：ポリアデニル化ングナルをコードしているＤＮＡ
配列。 プロモーター：　ＤＮＡをＲＮＡに転写させるＤＮＡ配
列。 プロティンＣ活性：タンパク質加水分解活性、アミド分
解活性、エステル分解活性、および生物学的活性（抗凝
固あるいはプロフィプリン分解活性）の原因であるヒト
プロティンＣのすべての性質。タンパク質の抗凝固活性
の試験方法は当分野でよく知られている［Ｇｒｉｎｎｅ
ｌｌ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８７．　Ｂｉｏｃｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｙ　５：１１８９を参照ｌ。 組換えＤＮＡクローニングベクター：１またはそれ以上
の別のＤＮＡセグメントを付加したか、または付加する
ことかでさるＤＮＡ分子を含有するあらゆる媒体であり
、染色体に組込まれる媒体、自律的に複製するプラスミ
ド、およびファージが含まれるかこれらに限定はされな
い。 組換えＤＮＡ発現ベクター：遺伝子産物が発現されるよ
うにプロモーターを導入し、設置したあらゆる組換えＤ
ＮＡクローニングベクター組換えＤＮＡベクター：あら
ゆる組換えＤＮＡクローニングベクターまたは発現ベク
ターレプリコン：プラスミドまｌ二はｆ也のベクターの
自律的な複製を支配し、それを可能にするＤＮＡ配列。 制限フラグメント：１またはそれ以上の制限エンドヌク
レアーゼ酵素の作用によって生成したあらゆる直線状の
ＤＮＡ配列。 感受性宿主細胞：ある抗生物質またはその他の毒性化合
物の存在下では、それらに対する耐性を付与するＤＮＡ
セグメントがないと生育することができない宿主細胞。 ＴｃＲ：テトラサイタリン耐性の表現型またはそれを付
与する遺伝子。 形質転換：受容宿主細胞にＤＮＡを導入することであり
、これにより受容宿主細胞の遺伝型が変化する。 形質転換体：形質転換を経た受容宿主細胞。 翻訳活性化配列：ｍＲＮＡ転写体をベグチドまた１まポ
リペプチドに翻訳させる、５’−ＡＴＧ−３’などの翻
訳開始コドンおよびリポソームの結合部位をコードして
いる配列を含むあらゆるＤＮＡ配列。 酵素前駆体：タンパク質加水分解酵素の酵素的に不活性
な前駆体。本明細書中で用いるプロティンＣ酵素前駆体
とは、それが１本鎖であっても２本鎖であっても、分泌
された不活性型のプロティンＣを指す。 第１図は４つの部分からなり、出発プラスミドｐＬ　Ａ
　Ｐ　Ｃの構築に用いる出発物質であるプラスミドｐＬ
ｐｃの構築プロトコールを示すものである。 第１Ａ図は、ＢＫウィルスおよびプラスミドｐａＢＰＶ
−ＭＭＴｎｅｏからのプラスミドｐＢＫｎｅｏｌの構築
を示す工程図である。 第１Ｂ図は、アデノウィルス２およびプラスミドｐ３Ｖ
２ｃａｔからのプラスミドｐＬＰｃａｔの構築を示す工
程図である。 第１Ｃ図は、プラスミドｐＢＫｎｅｏｉおよびプラスミ
ドｐＬＰｃａｔからのプラスミドｐＢＬｃａｔの構築を
示す工程図である。 第１Ｄ図は、プラスミドｐＢＬｃａｔおよびプラスミド
ｐＬ　ｌ　３３からのプラスミドｐＬｐｃの構築を示す
工程図である。 第２図は、プラスミドｐＬＰｃの構築に用いる出発物質
であるプラスミドｐＬ　ｌ　３３の構築を示す工程図で
ある。 本発明は、新規な酵素前駆体型のヒトプロティンＣの発
現をコードしているＤＮＡ化合物に関する。天然のヒト
プロティンＣ酵素前駆体および形成期ヒトプロティンＣ
を製造するための方法がいくつか開示されている（欧州
特許公開Ｎ　ｏ、２１５５４８およびＮｏ、１９１６０
６を参照）。これら先行技術の方法は、ヒト血液中に存
在する酵素前駆体型ヒトプロティンＣとは異なるところ
のない酵素前駆体型ヒトプロティンＣの発現を提供する
ものである。 活性化されたプロティンＣを得るためには、これらの方
法によって得たプロティンＣ酵素前駆体を、σ−トロン
ビン、トリプンン、あるいはトロンビンとトロンボモジ
ュリンの混合物などの物質で処理しなければならない（
インビボであろうとインビトロであろうと）。さらに、
ヒト血液中に天然に見い出される酵素前駆体型のヒトプ
ロティンＣと同一である、組換えＤＮＡ法によって得ら
れた酵素前駆体型のヒトプロティンＣは、体中ではトロ
ンヒンートロンポモジュリンコンブレノクスが関与する
天然の活性化経路によって活性化されるにすぎない。天
然のヒトプロティンＣ酵素前駆体まトロンビン単独によ
って活性化されうる；しかじ、この活性化は、活性化プ
ロティンＣへの重要なインヒポ経路ではないほど高レベ
ルのトロンビンおよび／またはプロティンＣ酵素前駆体
、およびＣａ２＋が存在しないことを必要とする。 本発明は、トロンビン単独によりインヒポにおいて臨床
的に存意な速度で活性化されうる酵素前駆体型のヒトプ
ロティンＣを提供するものである。 さらに、これらの酵素前駆体型は天然のヒトプロティン
Ｃ酵素前駆体よりもトロンピン／トロンボモノニリンに
よる活性化をずっと受けやすい。また、本発明は、これ
ら新規な酵素前駆体型のヒトプロティンＣ（７）組換え
発現のだめのＤＮＡ化合物、組換えＤＮＡ発現ベクター
、形質転換セルライン、および方法を提供するものであ
る。これら酵素前駆体型のヒトプロティンＣを製造する
ための方法は、 （ｌ＼）以下の（ｉ）および（ｉ）を含有する祖換えＤ
Ｎ八へクターで真核宿主細胞を形質転換し：（Ｉ）アミ
ン末端からカルホキ／末端にかけて、ａ）γ−カルボキ
シル化され、分泌されるタンパク質のシグナルペプチド
およびプロペプチド： ｂ）ヒトプロティンＣの軽鎖； Ｃ）リジン−アルギニン、アルギニン−リジン、リジン
−リジン、およびアルギニン−アルギニンからなる群か
ら選はれるジペプチド；および ｄ）次のアミノ酸残基配列：

【アミノ酸配列】

［配列中、Ｒ１はＰＨＥ、　ＧＬＹ、　ＴＹＩ？および
ＴＲＰからなる詳から選ばれ、１′７２はＶＡＬおよび
ＰＲＯからなる群がら選ば４１、Ｒ３はＡＳＰｊ；よび
ＡＳＮからなる群から選はれ、ＡＬＡはアラニン、ＡＲ
Ｇはアルギニン、ＡＳＮはアスパラギ／、ＡＳＰはアス
パラギンｍ、　−ＣＯＯＩ＋はカルポキ７末Ｘａ、ＣＹ
Ｓはノスティン、ＧＬＮはグルタミン、ＧＬＵはグルタ
ミンＬ　ＧＬＹはグリノン、１１□トはアミノ末端、ｌ
ｌｌ５はヒスチジン、ＩＬＥはインロイノン　ＬＥＵは
ロイノン、ＬＹＳはリジン、１．ｔＥＴはメチオニン、
ＰｌｌＥはフェニルアラニン、　ＰＲＯはプロリン、Ｓ
ＥＲはセリン、ＴＩＩＲはトレオニン、ＴＲＰはトリプ
ト７７ン、ＴＹＲはチロ／ン、そしてＶＡＬはバリンで
ある１；を含んでいるアミノ酸残基配列をコードしてい
るＤＮＡ配列； （ｉ）該ＤＮＡ配列を発現させるように設置したプロモ
ーター； （Ｂ）工程（Ａ）で形質転換した宿主細胞を、該ＤＮＡ
配列を発現させる条件下で培養すること、を特徴とする
。本方法および本方法に有用な化合物を後記でさらに詳
細に説明する。 本発明は、これら新規な酵素前駆体型のヒトプロティン
Ｃを製造するための方法に用いるＤＮＡ化合物をも提供
するものである。これらの新規化合物はすべて、分泌さ
せるだめのングナルペプチドおよびγ−カルポキノル化
される（ビタミンに依存性のカルホキ／ラーゼの作用に
よって）タンパク質由来のプロペプチドからなるプレー
プロペプチドをコードしている。このようなプロペプチ
ド配列は当分野でよく知られている。例えば、サラティ
ー等［５ｕｔｔｉｅ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８７．　Ｐ
ｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。 Ｓｃｉ、　８４：６３４−６３７］を参照。好ましくは
、そして構築を容易にするため、シグナルペプチドの暗
号配列およびグロペプチドの暗号配列の両者はγ−カル
ボキシル化されるタンパク質のプレープロペプチドのア
ミノ酸残基配列から得る。そのようなγカルボキシル化
されるタンパク質の例には、因子■、因子■、因子Ｘ１
プロトロンビン、プロティンＳ１プロテインＺ１そして
プロティンＣが含まれるが、これらに限定はされない。 ヒトプロティンＣのプレープロペプチドをコードしてい
るＤＮＡ配列が、本発明のベクターで用いるのに最も好
ましい。 また、本発明のＤＮＡ化合物は、プレープロペプチドの
暗号配列の下流にすぐ隣接して、そして該配列を含む翻
訳リーディングフレーム内に設置されたヒトプロティン
Ｃの軽鎖の暗号配列を含有している。ヒトプロティンＣ
の軽鎖は、前記のように、形成期プロティンＣのアミノ
酸残基４３〜１９７を含んでいる。プロティンＣの軽鎖
のアミン末端部分などのビタミンに依存性の血漿タンパ
ク質のアミン末端部分は、これらタンパク質のカル／ラ
ム結合活性の原因である。これら血漿タンパク質、例え
ば因子■、因子■、因子Ｘ１プロトロンビン、およびプ
ロティンＳなどのカルンウム結合領域は交換可能であり
（欧州特許公開Ｎｏ、０２１５５４８ＡＩ、第１２およ
び１３頁を参照）、ヒトプロティンＣの軽鎖のカルンウ
ム結合領域と等価である。 さらに、本発明のＤ　Ｎ　Ａ化合物は、軽鎖の暗号配列
の下流にすぐ隣接して、そして該配列を含む翻訳リーデ
ィングフレーム内に設置されたジペプチドＬＹＳ−ＡＲ
Ｇ（ＫＲ）の暗号配列を含有している。ＬＹＳ−ＡＲＧ
などの二塩基性ノペプチドは、形成期タンパク質中の、
軽鎖のカルボキン末端側に位置している。発現されるタ
ンパク質中のＬＹＳ−ＡＲＧジペプチドの配向は本発明
の目的には関係しない。ＬＹＳ−ＬＹＳあるいはＡＲＧ
ＡＲＧなどの二塩基性ジペプチドは、本発明においては
ＬＹＳ−ＡＲＧジペプチドと等価である。 しかし、本発明の目的に対しては、天然のヒトプロティ
ンＣ中のジペプチドであるＬＹＳ−ＡＲＧジペプチドか
好ましい。 ＬＹＳ−ＡＲＧジペプチドのコドンのすぐ下流は、活性
化ペプチドの暗号配列である。本発明の化合物において
、活性化ペプチドの暗号配列（８よび対応するアミノ酸
配列）における変化は、これら新規酵素前駆体の増大し
たトロンビン−感受性の性質の主な原因である。 本発明の酵素前駆体型が、主として以下に記載の点で天
然の酵素前駆体型のヒトプロティンＣと異なっているの
は当業者の理解するところであろう。天然のヒトプロテ
ィンＣでは、活性化ペプチドは次の配列で示される・ ＡＳＰ−ＴＨＲ−ＧＬＵ−ＡＳＰ−ＧＬＮ−ＧＬＵ　−
ＡＳＰ−ＧＬＮ−ＶＡＬ　−ＡＳＰ−ＰＲＯ−ＡＲＧ［
配列中、数字は形成期ヒトプロティンＣ中のアミノ酸残
基の位置を示している］。 本発明は、位置２０９のＡＳＰ残基をＰＩ（Ｅ％ＧＬＹ
、　ＴＹＲ。 またはＴＲＰ残基のいずれかに変えると、トロンビ／−
トロンボモジュリンコンプレックスによる切断に対する
一段と高い感受性に加えて、トロンビン単独による切断
に対するさらに高い感受性を有する対応の酵素前駆体型
になることを開示するものである。 位置２０９の置換に加えて、他のアミノ酸の置換も得ら
れる酵素前駆体のトロンビン−感受性を増強することか
できる。「得られる酵素前駆体」なる用語は、置換は形
成期ヒトプロデインＣ中のアミノ酸位置を参考に説明す
るが、形成期ヒトプロティンＣは最初に分泌されて（ア
ミノ酸残基ｌ〜４２の除去につながる）酵素前駆体型か
得られなけれはならないことを示すのに用いる。上に記
した位置２０９における４種類の置換のいずれか１つに
加えて、形成期ヒトプロティンＣ中の位置２１０のプロ
リン残基（活性化ペプチド中）をバリン残基に置換する
と、本発明の新規酵素前駆体になる。また、上に記した
位置２０９における４種類の置換のいずれか１′つに加
えて、そして上記の位置２１０の置換かあろうとなかろ
うと、形成期ヒトプロティンＣ中の位置２１４のアスパ
ラギン酸残基（活性化重鎖中）をアスパラギン残基に置
換すると、本発明の新規酵素前駆体になる。 即ち、本発明の好ましい新規酵メ・：旧型体型のヒトプ
ロティンＣは、次のアミノ酸残基配列ををする形Ｄｋ期
ヒトプロティンＣ分子の＞）　尼、　ｊｉよびプロセノ
／ングによって１与らノする：

【アミノ酸配列】

［配列中、Ｒ３は円（Ｅ１ＧＬＹ％ＴＹＲ，またはＴＲ
Ｐであり；Ｒ２はＰＲＯまたはＶＡＬテあり：そしテＲ
，はＡＳＰまたはＡＳＮである］。 遺伝コードの縮重により多種のＤＮＡ化合物か上記のポ
リペプチドをコードすることかでさることは当業者の認
識するところであろう。従って、後記で説明する構築、
ならびに本発明の好ましいＤＮＡ化合物、ベクター、お
よび形質転換体についての実施例で説明する構築は単な
る例示であって、本発明を限定するものではない。 本発明の新規暗号配列は、部位特異的な突然変異誘発に
よってＡＰをコードしている領域を削除しておいた形成
期ヒトプロティンＣの暗号配列から出発して容易に構築
することができる。図で示すと、この暗号配列は次の構
造を有している。 後記実施例で説明するように、この暗号配列を組換えＤ
ＮＡ発現ベクターに挿入し、得られたベクターをプラス
ミドｐＬ　Ａ　Ｐ　Ｃと命名した。プラスミドｐＬＡ　
Ｐ　Ｃは、本発明の新規な酵素前駆体型のヒトプロティ
ンＣを高レベルで組換え発現させる本発明の例示ベクタ
ーを構築するための有用な出発物質として用いられる。 出発プラスミドｐＨ０７からのプラスミドｐＬ　Ａ　Ｐ
　Ｃの構築のプロトコールを実施例１で説明する。プラ
スミドｐＨＣ７は、／−ザン・リージョナル・リサーチ
・センター（Ｎ　ＲＲＬ　；　Ｐｅｏｒｉａ、　ＩＬ　
６１６０４）から、取得番号ＮＲＲＬ　　Ｂ−１５９２
６のもと、大腸菌Ｋ１２ＲＲＩ／ｐＨｃ７で入手できる
。 プラスミドｐＬＰＣ−１６７Ｇは、形成期ヒトプロティ
ンＣ中の位置２０９のアスパラギン酸のコドンかグリノ
ンのコドンに変えられている本発明の例示用の発現ベク
ターである。このプラスミドｐＬＰｃ−１６７Ｇ構築の
プロトコールを実施例３で詳細に説明する。重要なこと
は、この構築がプロティンＣの暗号配列の部位特異的な
突然変異誘発を包含しているということである。活性化
ペプチドをコードしているＤＮＡを含むプロティンＣの
暗号配列の部分をプラスミドｐＨＣ７から単離し、ファ
ージＭ１３ｍｐ１ｇ中に挿入し、次いで部位特異的な突
然変異誘発によって変えた。次に、この突然変異誘発し
た暗号配列を真核生物性のクローニングベクター中にク
ローンして、位置２０９のアスパラギン酸のコドンに代
えてグリツツのコドンか置換されている活性化ペプチド
の暗号配列を挿入したこと以外はプラスミドｐＬ　Ａ　
Ｐ　Ｃと同であるプラスミド（ｐＬＰＣ−１６７Ｇと命
名）を得た。 プラスミドｐＬＰＣ−１６７Ｆは、形成期ヒトプロティ
ンＣ中の位置２０９のアスパラギン酸のコトンがフェニ
ルアラニンのコドンに変えられている本発明の例示の発
現ベクターである。このプラスミドｐＬＰＣ−＋６７Ｆ
構築のプロトコールを実施例４で詳細に説明する。構築
に用いる突然変異誘発オリゴヌクレオチドが異なること
以外は、プラスミドＩ）ＬＰＧ−１６７Ｆ構築のプロト
コールはプラスミドｐＬＰＣ−１６７Ｇ構築のプロトコ
ールと実質的に同一である。 後記実施例に記載した部位特異的な突然変異誘発の方法
は例示であって、この方法を用いて本発明の他の化合物
およびベクターを得ることができる。これら本発明の他
の化合物には、上記のように、本発明のＤＮＡ暗号配列
から生成したｍＲＮＡ転写体の翻訳によって得られる形
成期タンパク質か含まれる。また、本発明の化合物群に
は、本発明の形成期タンパク質の分泌によって得られる
酵素前駆体型が含まれる。さらに、位置２１４のアスパ
ラギン酸残基がアスパラギン残基に変えられて（・る本
発明の化合物の場合には、この酵素前駆体型の活性化に
よって得られる活性化プロティンＣ誘導体も本発明の化
合物となる。このように、本発明の化合物群には、ＤＮ
Ａ暗号配列、これらの配列を発現させる発現ベクター、
これらの暗号配列から生成したｍＲＮＡ転写体の翻訳に
よって得られる形成期タンパク質、これらの形成期タン
パク質の分泌によって得られる酵素前駆体、およびこの
酵素前駆体のいくつかの活性化誘導体が含まれる。 好ましい本発明の暗号配列（従って、好ましい形成期タ
ンパク質、酵素前駆体、および活性化分子）では、暗号
配列は、位置２０９．２１０および２１４の置換を除く
と形成期ヒトプロティンＣのアミノ酸残基配列と同一の
配列をコードしている。これらの置換を次の第１表に示
す。 第１表好ましい本発明の暗号配列中の位置２０９．２１
０、および２１４にコードされているアミノ酸残基 化合物　　　　２０！Ｊ　　　　２１０　　　２１４１
　　　　　　　ＰＨＥ　　　　　ＰＲＯＡＳＰ２　　　
　　　　ＰＨＥ　　　　　ＰＲＯＡＳＮ３　　　　　　
　ＰＩ（Ｅ　　　　　ＶＡＬ　　　　　ＡＳＰ４　　　
　　　　ＰＲＥ　　　　　ＶＡＬ　　　　　ＡＳＮ５　
　　　　　　ＧＬＹ　　　　　ＰＲＯＡＳＰ６　　　　
　　　ＧＬＹ　　　　　ＰＲＯＡＳＮ７　　　　　　　
ＧＬＹ　　　　　ＶＡＬ　　　　　ＡＳＰ８　　　　　
　　　　　　　ＧＬＹ　　　　　　　　　ＶＡＬ　　　
　　　　　　ＡＳＮ９　　　　　　　ＴＹＲＰＲＯＡＳ
Ｐ ＯＴＹＲＰＲＯＡＳＮ Ｉ　　　　　　　ＴＹＲＶＡＬ　　　　　ＡＳＰＴＹＲ
ＶＡＬ　　　　　ＡＳＮ ３　　　　　　　ＴＲＰ　　　　　ＰＲＯＡＳＰ４　　
　　　　　ＴＲＰ　　　　　ＰＲＯＡＳＮ５　　　　　
　　　　　　丁ＲＰ　　　　　　　　ＶＡＬ　　　　　
　　　ＡＳＰ６　　　　　　　ＴＲＰ　　　　　ＶＡＬ
　　　　　ＡＳＮまた、本発明のＤＮＡ化合物を、化学
的に、あるいは制限フラグメントの組合せによって、あ
るいは当分野で既知の方法を組合せることによって合成
することができる。さらに、ＤＮＡ合成機も使用するこ
とができ、これを用いて本発明の化合物を構築すること
かできる。 本発明の例示ベクターであるプラスミドｐＬＰＣ−１６
７ＧおよびｐＬＰＣ−１６７Ｆは、本発明の暗号配列の
アデノウィルス主後期プロモーターによる転写を刺激す
るように設置されたＢＫエンハンサ−を含有している。 極めて多数の真核性のプロモーター、エンハンサ−１お
よび発現ベクターが当分野で知られていること、ならび
にこれらを本発明方法で用いることができることは当業
者の認識するところである。また、当業者は、真核性の
発現ベクターかエンハンサ−要素なしで機能しうろこと
も認識している。本発明の鍵となる点は、プロティンＣ
酵素前駆体を発現させるために用いる特定のエンハンサ
−あるいはプロモーターにあるのではなく、むしろ、新
規暗号配列および該配列から得られる対応のタンパク質
にある。 Ｌ７かし、プロモーター、エンハンサ−１および選択マ
ーカーなとのベクター要素の選択は、真核宿主細胞が産
生するタンパク質の最終レベルに大きな影響を与える。 欧州特許公開Ｎ　ｏ、０２４５９４９は、形成期ヒトプ
ロティンＣを発現させるように設置した真核性のプロモ
ーターを刺激するためにＢＫエンハンサ−を利用してい
る、天然の酵素前駆体プロティンＣ用の多数の発現ベク
ターを開示している。これらのベクターは、真核細胞に
導入したとき特に高いレベルで発現をし、また大きいＤ
ＮＡウィルスの即時型遺伝子産物、例えはアデノウィル
スのＥＩＡ遺伝子産物なとも発現させる。本明冊書中に
記載した例示ベクターｐＬＰＣ−１６７ＧおよびｐＬＰ
Ｃ−１６７Ｆから明らかなように、このＢＫエンハンサ
ー−ＥＩＡ遺伝子産物の発現方法は本発明のベクターで
用いるのに特に好ましい。 本発明は特定の真核宿主細胞の使用に限定されるもので
はない。多種の真核宿主細胞が寄託所、例えばアメリカ
ン・タイプ・カルチャー・コレクンヨン［Ａｍｅｒｉｃ
ａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏ
ｎ（Ａ　ＴＣＣ）、　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　ＭＤ　２
０８５２］などから入手可能であり、本発明のベクター
とともに用いるのに適している。特定の宿主細胞の選択
は、ある程度は本発明のプロティンＣをコードしている
ＤＮＡ化合物を発現させるために用いる特定の発現ベク
タに依存している。しかし、本発明の形成期ヒトプロテ
ィンＣおよびその誘導体は実質的な翻訳後ｖＳ飾を受け
るので、ある種の宿主細胞が本発明のベクターとともに
用いるのにより好ましい。グリン不ル等（Ｇｒｉｎｎｅ
ｌｌ　ｅｔ　ａｌ、、１９８７．Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｙ５：１Ｉ８９）には、アデノウィルスで形質転
換したヒト胚腎細胞が、ヒトプロティンＣなどのγ−カ
ルポキ／ル化されたタンパク質の組換え製造において用
いるのに特に好ましいことが記載されている。 このようなアデノウィルスで形質転換したヒト肝腎セル
ラインの１つは、ＡＴＣＣから取得番号ＣＲＬ　　１５
７３のもとで入手可能な２９３セルラインである。この
２９３セルラインは本発明のベクターとともに用いるの
にも好ましい。 しかし、アデノウィルスで形質転換されたセルライン中
でγ−力ルポキ／ル化されたタンパク質（例えは、ヒト
プロティンＣ酵素前駆体など）を産生させることの利点
は、アデノウィルスで形質転換されたヒト胚腎細胞に限
定されるものではない。 実際のところ、アデノウィルスで形質転換された細胞は
γ−カルポキンル化されたヒトプロティンＣの産生用と
しては一般的には例外的な宿主である。この型の特に好
ましいセルラインの１つは、ＡＴＣＣから取得番号ＣＲ
Ｌ　　９５９５のもとて入手可能なＡＶ！２−６６４（
以下、ＡＶＩ２という）セルラインである。ヒトアデノ
ウィルス１２をゴールデンハムスターの首筋に注射し、
生じた腫瘍から細胞を単離することによって、このＡＶ
１２セルラインを作成した。後記実施例５は、例示ベク
ターｐＬＰＣ−１６７ＧおよびｐＬＰＣ１６７Ｆによる
２９３およびＡＶ１２の両セルラインの形質転換を説明
するものである。 本発明のベクターを、多種の真核宿主細胞、特に哺乳動
物宿主細胞に導入し、発現させることができる。安定な
真核細胞形質転換体を単離し、同定するための選択マー
カーを全く持っていない本発明のベクターは、−時的な
検定用にだけでなく、米国特許Ｎｏ、４．３９９，２１
６に記載されている方法である同時形質転換用にも有用
である。また、本発明のベクターは、大腸菌中での複製
を可能にする配列を含むことができる（一般に、大腸菌
中でプラスミドＤＮＡを調製する方か他の宿主微生物中
で調製するより効率的であるので）。 本発明のベクターに含まれるヒトプロティンＣの暗号配
列の発現は、この構造遺伝子に関連する特定のプロモー
ターが機能する宿主細胞で起こる。 本発明で用いるのに適した宿主細胞の例を、適切な注と
ともに第２表に挙げる。 第２表 由　来　　　　　　供給源　　　庄 ヒト肝芽細胞腫　　ＡＴＣＣ＃　ＨＢ　８０６５　　＊
アフリカミドリ ザル腎臓　　　　　　ＡＴＣＣ＃　ＣＣＬ　７０アカゲ
ザル腎臓　　　ＡＴＣＣ＃　ＣＣＬ　７アカゲザル腎臓
　　　ＡＴＣＣ＃　ＣＣＬ　７．１　　＊＊マウス胚線
維芽細胞　ＡＴＣＣ＃　ＣＣＬ　９２チヤイニーズハム スター卵巣　　　　　ＡＴＣＣ＃　ＣＣＬ　６１　　＊
林ヒト頚部エビテロ イド　　　　　　　ＡＴＣＣ＃　ＣＣＬ　２ＲＰＭＩ８
２２６　　　　　ヒト骨髄腫　　　　ＡＴＣＣ＃　ＣＣ
Ｌ　１５５　＊＃＊Ｈ４１１ＥＣ３ラット肝帽瘍　　　
　ＡＴＣＣ＃　ＣＲＬ　１６００　＊＊＊林Ｃ１２７１
マウス線維芽細胞　　ＡＴＣＣ＃　ＣＲＬ　１６１６Ｈ
３−５ｕｌｔａｎ　　　　　ヒト直漿細胞プラス？細胞
腫　　　　　ＡＴＣＣ＃　ＣＲＬ　１４８４ＢＨＫ−２
１幼ハムスター腎臓　　ＡＴＣＣ＃　ＣＣＬ　１０本　
　このセルラインを使用することは米国特許Ｎｏ、４，
３９３．１３３に記載されている。 ＊＊　　　ＡＴＣＣ＃　ＣＣＬ　７より早く増殖する。 林木　プロリンを必要とする。ｄｈｆｒ−誘導体ＤＸＢ
ＩＩなど、ＣＨＯ−Ｋｌの誘導体をこの宿主から得るこ
とができる。 ＊＊＊＊　　ＩｇＧＡ型の軽鎖を分泌する。 林ネ林８−アザグアニン耐性のＦＡＺＡ宿主細胞などの
誘導体をこの宿主から得ることができる。 ｅＬａ ＬＬＣ−ＭＫ、加盟 ＬＬＣ−ＭＫ　！誘導体 Ｔ３ ＣＨＯ−Ｋｌ 宿主細胞 ｅｐＧ−２ Ｖ−１ 第２表に示したように、多数の哺乳動物宿主細胞か、本
発明の形成期タンパク買上のシグナルペプチドを認識し
て適切にプロセッシングするために必要な細胞機構を備
えており、血漿中に存在するヒトプロティンＣで観察さ
れるようなグリコンル化、γ−カルポキ／ル化、および
β−ヒドロキンル化などの翻訳後修飾を付与する。後記
のような多種多様のベクターがこのような真核宿主細胞
の形質転換用に存在しているが、以下に例示する特定の
ベクターは本発明の範囲を限定しようとするものではな
い。 ｐｓｖ２型のベクターは、明確な真核性の転写単位−プ
ロモーター（ｅｐ）、介在配列（ＩＶＳ）、およびポリ
アデニル化（ｐＡ）部位−を構成しているＳＶ４０ゲノ
ムのセグメントを含有している。ＳＶ４０のＴ−抗原の
ないところでは、プラスミド１）ＳＶ２型のベクターは
宿主細胞の染色体ＤＮＡ中に組込まれることによって哺
乳動物宿主細胞およびその他の真核宿主細胞を形質転換
する。ＳＶ４０プロモーターが挿入遺伝子を転写させる
、プラスミドｐｓＶ２−ｇｐｔ、　ｐｓＶ２−ｎｅｏ、
　ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ、　ｐｓ　Ｖ　２−ｈｙｇ、およ
びｐｓｖ２−β−グロビンなどの多種のグラスミド１）
ＳＶ２型のベクターが構築されている［　ｒＥｕｋａｒ
ｙｏｔｉｃ　Ｖｉｒａｌ　ＶｅｃｔｏｒｓＪ、グルズマ
ン（Ｇｌｕｚｍａｎ）編、コールド・スプリング・ハー
バ−嗜ラボラトリーズ（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａ
ｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐ
ｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ１９８２）
版を参照１゜これらのベクターは本発明の暗号配列とと
もに用いるのに適しており、アメリカン・タイプ・カル
チャー・コレク／ヨン（ＡＴＱＣ）（Ａｍｅｒｉｃａｎ
　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、
　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　Ｍａｒｙｌａｎｄ）またはノ
ーザン・リージョナル・リサーチ・ラボラトリ−（Ｎ　
ＲＲＬ　）（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　Ｒｅｇｉｏｎａｌ　Ｒ
ｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｐｅｏｒｉ
ａ、　ｌ１ｌｉｎｏｉｓ）から入手することができる。 プラスミドｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ３７１４６）
は、ＳＶ４０初期プロモーターの支配下にある不ズミの
ジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）遺伝子を含有してい
る。適当な条件下では、このｄｈｆｒ遺伝子は宿主の染
色体中で増幅されるか、またはコピーされることか知ら
れている。／ムケの総説（Ｓｃｈｉｍｋｅ１９８４、Ｃ
ｅ１ｌ　３７：７０５−７１３）に記載されているこの
増幅は、ｄｈｆｒ遺伝子に密に隣接しているＤＮＡ配列
（例えば、本発明の形成期ヒトプロティンＣをコドして
いる配列など）を包含することができ、従ってこれを用
いて本発明のプロティンＣ酵素前駆体の産生を増加させ
ることができる。 哺乳動物宿主細胞およびその他の真核宿主細胞中で本発
明の形成期プロティンＣおよびプロティンＣ酵素前駆体
を発現させるために構築した本発明のプラスミドは、多
種多様のプロモーターを利用することができる。本発明
は、本明細書中に例示した特定の真核生物性プロモータ
ーを用いることに限定されるものではない。ブソチャー
等［Ｂｕｃｈｅｒ　ｅｔ　ａｔ、、　１９８６．　Ｎｕ
ｃ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１４（２４）：１００９］
か開示している真核生物性プロモーターあるいはＳＶ４
０後期プロモーターなとのプロモーターまたは、例えば
エストロゲン誘導が可能なニワトリ卵アルブミン遺伝子
、インターフェロン遺伝子、グルココルチコイド誘導か
可能なチロンンアミノドランスフェラーゼ遺伝子、チミ
ジンキナーゼ遺伝子などの真核生物性遺伝子、および主
初期および後期アデノウィルス遺伝子からのプロモータ
ーを容易に単離することができ、そして真核宿主細胞に
おいてヒトプロティンＣ酵素前駆体を産生ずるように設
計した組換えＤＮＡ発現ベクターで用いるように修飾す
ることができる。また、真核生物性プロモーターを直列
で用いて本発明の暗号配列を発現させることもできる。 さらに、多数のレトロウィルスが、広範囲の真核宿主細
胞に感染することか知られている。レトロウィルスＤＮ
Ａ中の長末端反復はプロモーター活性をコードしている
ことが多く、従って本発明の暗号配列を発現させるのに
用いることができる。 プラスミドｐＲ５ＶｃａＬ（ＡＴＣＣ３７１５２）は、
ラウス肉腫ウィルス（Ｒ５Ｖ；ニワトリおよびその他の
宿主細胞を感染させることが知られているウィルス）の
長末端反復の部分を含有している。Ｒ５Ｖの長末端反復
配列をプラスミドｐＲ５Ｖｃａｔの−０，７６ｋｂ　Ｎ
ｄｅｒ　−Ｈ１ｎｄｌｌｌ制限フラグメントで単離する
ことができる。Ｒ５Ｖの長末端反復中のプロモーター［
ゴーマン等（Ｇｏｒｍａｎ　ｅｔａｌ、、　１９８２．
　Ｐ、Ｎ、Ａ、Ｓ、　７９：６７７７）］は本発明のベ
クターで用いるのに適している。プラスミドｐＭＳＶｉ
（ＮＲＲＬ　　Ｂ−１５９２９）は、不ズミ肉腫ウィル
ス（ＭＳＶ；マウスおよびその他の宿主細胞を感染させ
ることが知られているウィルス）の長末端反復を含有し
ている。これらの反復配列は本発明のベクター中のプロ
モーターとして用いるのに適している。また、マウスの
メタロチオネイン（ＭＭ　Ｔ　）プロモーターは、真核
宿主細胞での使用用にその特徴がよく調べられており、
本発明のベクターで用いるのに適している。このＭＭＴ
プロモーターは１５ｋｂのプラスミドｐｄＢ　Ｐ　Ｖ−
ＭＭＴｎｅ。 （ＡＴＣＣ３７２２４）中に存在しており、本発明の他
のプラスミドを構築するだめの出発物質として用いるこ
とができる。 本発明の例示ＤＮＡ配列およびプラスミドには多数の修
飾および変異が可能である。例えば、遺伝子コードの縮
重は、コードされているポリペプチドの暗号配列を変え
ることなく、ポリペプチド暗号領域中の、ならびに翻訳
停止フグナル中のヌクレオチドを置換することを可能に
する。このような置換しうる配列はヒトプロティンＣの
既知のアミノ酸およびＤＮＡ配列から推定することがで
き、次の一般的な合成法あるいは部位特異的な突然変異
誘発法によって構築することができる。合成法は、実質
的にイタクラ等（ｌｔａｋｕｒａ　ｅｔ　ａｌ、、　１
９７７、５ｃｉｅｎｃｅ　１９８：１０５６）およびフ
レア等（Ｃｒｅａ　ｅｔａｌ、、　１９７８．　Ｐｒｏ
ｃ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７５：５７６
５）の方法に従って行うことができる。従って、本発明
ま具体的に例示したＤＮＡ配列およびプラスミドに限定
されるものではない。 本発明のベクターを真核宿主細胞に導入した後、選択し
うる表現型に基づいて形質転換体を選択することができ
る。この選択しうる表現型は、発現ベクターに存在する
選択マーカーによって、または宿主細胞に発現ベクター
と同時導入される別のベクターに存在する選択マーカー
によって付与することができる。形質転換体が選択され
たら、どの形質転換体か発現ベクターにコードされてい
る所望のタンパク質を最高レベルで発現しているかを同
定するのが望ましい。このような同定は、選択マーカー
を含むプラスミドだけを含有し、発現ベクターを含有し
ていない形質転換体を多数生成する同時形質転換法の後
では特に重要である。後記の実施例６において、目的の
タンパク質を発現し、分泌する細胞を同定するだめのプ
ロトコールだけでなく、この方法を用いて試験した他の
細胞との関連において分泌タンパク質量を定量するだめ
のプロトコールをも説明する。また、このプロトコール
は、最高レベルの目的タンパク質を分泌している生存細
胞の単離を可能にする。 活性化プロティンＣは、静脈内血栓の拡大の防止に、動
脈血栓の生成の防止に、ならびにダラム陰性敗血症、内
置血症および播種性の血管内凝固による器官衰弱および
死の防止において、実質的な抗血栓の性質を有している
。動物の実験では、天然の酵素前駆体プロティンＣの注
入は、播種性の血管内凝固（Ｄ　Ｉ　Ｃ）とンヨソクを
ともなうグラム陰性敗血症の治療には効果がなかった。 これらの陰性の結果は、大量のトロンビン生成を含むこ
の型の広範囲微血管血栓症においては、トロンビンとコ
ンプレックス化し、注入した酵素前駆体を活性化するに
十分なトロンボモジュリンは存在していないことを示し
た。 活性化されたプロティンＣの第１の不利な点は、あらゆ
る活性化セリンプロテアーゼのように、その半減期（Ｔ
Ｉ／２）か酵素前駆体に比べて短いことである。イヌで
のＴＩ／２はｌ１分であり、サルでのＴＩ／２は２２〜
２６分であることがわかっている。対照的に、ヒトでの
天然のプロティンＣ酵素前駆体のＴＩ／２は６時間と見
られている。活性化セリンプロテアーゼ（活性化プロテ
ィンＣを含む）の比較的短い生物学的半減期（それらの
酵素前駆体と比較したときの）の原因は複雑であり、細
胞性および体液性機序の両方が関与している。また、活
性化セリンプロテアーゼは、通常血漿に存在するセリン
プロテアーゼ阻害剤類とコンプレックスを形成する。活
性化プロティンＣ（ＡＰＣ）は、新規記載のＡＰＣ阻害
剤と、ならびにα−２マクログロブリンとコンプレック
ス化する。不活性な酵素前駆体（本発明のプロティンＣ
酵素前駆体を含む）はセリンプロテアーゼ阻害剤と反応
しない。 本発明のプロティンＣ酵素前駆体の利点は、これらか天
然のプロティンＣ酵素前駆体よりさらに良好にトロンビ
ンによって活性化されるということである（何故なら、
トロンビンは、Ｃａ”″の存在下でこれらの酵素前駆体
を活性化するためにトロンボモジュリンとコンプレック
ス化するという絶対的な必要性をもはや有していないか
らである）。 このことは、これらのプロティンＣ酵素前駆体が投与さ
れたときには、血管内のトロンビン生成の部位、即ち血
管内血栓が生成しつつあるあらゆる部位で活性化されう
るということにつながる。従って、これらの組換えプロ
ティンＣ酵素前駆体はプロドラッグとして用いることが
でき、トロンビン生成の部位においてのみ活性化される
ことになる。 これらのトロンビン−感受性の酵素前駆体は酵素前駆体
の形で投与することができるので、プロティンＣ阻害剤
とコンプレックス化せず、天然のプロティンＣ酵素前駆
体の生物学的半減期と同じ半減期を示す。 本発明の組換えプロティンＣ酵素前駆体は、深静脈血栓
症、肺塞栓症、末梢動脈血栓症、心臓または末梢動脈由
来の塞栓、急性心筋梗塞、血栓性の発作、および播種性
の血管内凝固を含む血管内凝固が関与する多種多様の後
天的な疾患状態の予防および治療に有用である。また、
これらのプロティンＣ誘導体は、再発性の深静脈血栓症
を示すヘテロ接合性のプロティンＣ欠損を有するかなり
多数の患者の治療において、および電撃性紫斑病を有す
るホモ接合性のプロティンＣ欠損の患者の場合において
有効に用いることができる。 実験データおよび臨床データによれば、通常の抗凝固剤
、特にワルファリン（ｗａｒｆａｒｉｎ）は侵入性の癌
の治療に有用であり、これら悪性腫瘍の遠く離れた転移
性病巣を防止あるいは減少させるように作用することが
示唆される。さらに、内毒素、腫瘍壊死因子およびイン
ターロイキンｌなどの炎症性刺激が内皮細胞の表面から
トロンボモジュリンを激減させることかよく認められて
おり、これが微小血管および大きな血管の血栓症を引き
起こすものと考えられている。本発明の組換えプロティ
ンＣ酵素前駆体は、これらの臨床下において通常の抗凝
固剤に代わるものとして有用である。 本発明のプロティンＣ酵素前駆体の用量は、そのＴＩ／
２が長くなっているので、活性化プロティンＣの場合と
比べると臨床時に実質的に減少させることができる。本
発明のプロティンＣ酵素前駆体の用量は、ホモ接合性の
プロティンＣ欠損では、処置あたり約５７１ｇ〜１００
ｍｇの範囲、モしてヘテロ接合性のプロティンＣ欠損で
は、処置あたり約２　、５　ｍｇ〜５０ｒｎｇの範囲と
なろう。 活性化プロティンＣの有用な治療学的指標は、現在低用
量のヘパリンで治療されている深静脈血栓症および肺塞
栓症の防止にある。危険性の高い患者、特に手術を受け
ている患者では、深静脈血栓症を防止するための組換え
活性化プロティンＣの用量はｌｌ−１Ｏｚ／日の範囲で
ある。本発明のプロティンＣ酵素前駆体の用量は１日あ
たり約０゜２５〜５＋＋１ｇの範囲となろう。これらの
酵素前駆体のさらに別の利点は、これらを一定のＩＶ注
大のかわりにポーラス注射で投与してもよいということ
である。活性化プロティンＣは、このタンパク質のＴｌ
／２が短いため持続的な［Ｖ注入によって投与しなけれ
ばならない。認められ、客観的に証明された深静脈血栓
症および／または肺塞栓症では、活性化プロティンＣの
用量は負荷用量として１〜ｌ０ｍｇの範囲であり、これ
に３〜３０ｍｇ１日の範囲の用量の持続注入が続く。一
方、本発明のプロティンＣ酵素前駆体は、２４時間あた
り約１２ｍｇを越えない用量で繰り返しポーラス注射す
ることによって投与することができる。 同様の投与スケジュールが末梢動脈血栓の治療に適用で
きる。本発明のプロティンＣ酵素前駆体の注入からくる
出血合併症の可能性は比較的低い。 従って、これらの酵素前駆体は、急性動脈閉塞の状況下
で虚血性の肢を切断から救うのに必要であることか多い
手術法である血栓摘出あるいは塞栓摘出の手術中および
手術後に、ヘパリンに取って代わることかできる。活性
化プロティンＣと比較したときのその長いＴｌ／２、お
よびその相対的な投与の容易性のゆえに、これらの酵素
前駆体は心臓からくる動脈塞栓の治療には活性化プロテ
ィンＣよりも適している。明確な深静脈血栓−肺塞栓の
治療に用いられる用量と同等の用量でのこれら酵素前駆
体の長期投与は、心臓性の塞栓の防止に実際的な用途を
有している。 同様に、本発明のプロティンＣ酵素前駆体は、末梢動脈
、特に頚動脈中の血栓由来の塞栓の治療に用いることが
できる。これらは、血小板の機能を抑制することができ
る薬物、経口の抗凝固剤、またはそれらの組合せを含む
現在用いられている処方によっては満足に治療、あるい
は予防されない。、シ・魔性の塞栓の場合と同様、これ
らの酵素前駆体は、心臓性の塞栓について説明したもの
と同し方法で長期間投与することができ、そして頚動脈
血栓に由来し、塞栓性の発作につながる塞栓の予防に主
な可能性を有している。 本発明のプロティンＣ酵素前駆体は血栓性の発作にも有
用である。現在のところ、発作を通常の抗凝固剤で治療
するのは一般的ではない。発作をヘパリンまたは経口の
抗凝固剤で治療するのはときには有益であるが、梗塞し
た脳の領域中への出血の危険性が高く、それによって発
作に付随する神経欠損を悪化させる。出血合併症を起こ
す可能性が低いこと、およびその選択性のゆえに、本発
明の酵素前駆体は、発作患者に投与することができ、閉
塞している動脈血栓の局所的な拡大を防止するのに有益
であり、それによって発作からくる神経欠損を減少させ
ることができる。発作の治療に有効な酵素前駆体の量は
、活性化プロティンＣと比べるとさらに低くなるであろ
うが、その用量は発作の性質および重篤度に依存してそ
れぞれの患者によって変わる。 また、本発明の酵素前駆体は、活性化されたときのその
ブローフィブリン溶解の性質のゆえに、急性心筋梗塞の
治療にも有用である。これらの酵素前駆体を急性期の心
筋梗塞の間に組織グラスミノーゲン活性化因子とともに
投与することができる。閉塞している冠状動脈の血栓を
溶解しｔ；後、さらに数日間酵素前駆体を投与して再び
急性心筋梗塞するのを防止することができる。この状況
下で活性化プロティンＣを投与するときには、患者は、
プラスミノーゲン活性化因子治療を始めるときに１−１
０ｍｇの負荷用量を投与され、続いて３〜３０＋＋１ｇ
Ｚ日の範囲の活性化プロティンＣが持続注入される。対
照的に、本発明の酵素前駆体は、約１２ｒＡｇ／日を越
えない用量での１日３〜４回のポーラス注射によって投
与することができる。 活性化プロティンＣは播種性の血管向凝固の治療に有用
である。ヘパリンおよび経口の抗凝固剤が厳格な臨床試
験において播種性の血管向凝固（ＤＩＣ）を有する患者
に投与されていたが、その結果は期待に反するものであ
った。播種性の血管向凝固においては、活性化プロティ
ンＣならびに本発明の酵素前駆体は通常の抗凝固剤を越
える全く異なった利点を有している。前記のように、動
物の実験においては、プロティンＣ酵素前駆体は播種性
の血管内凝固およびダラム陰性敗血症からくる死および
器官の損傷の防止には効果的ではないことが認められて
いる。対照的に、本発明のプロティンＣ酵素前駆体は、
トロンビンによる活性化を極めて受けやすく、播種性の
血管内凝固の治療に効果的となろう。ＤＩＣを治療する
ための活性化プロティンＣの概算必要量は約１００ｍｇ
／日である。ＤＩＣを治療するための本発明の酵素前駆
体型の用量は、繰り返しポーラス注射で投与して約３０
ｍｇ１日を越えるべきではない。 通常の抗凝固薬、特にワルファリン（ｖａｒｆａｒｉｎ
）は侵入性の悪性帽瘍の治療に有用である。腫瘍細胞の
多数は、局所的なフィブリンの堆積につながる凝固系の
活性化を引き起こす物質を産生ずる。 これらのフィブリン堆債物は「巣」として機能し、ここ
で癌細胞は分裂して転移性の病巣を形成することができ
る。しかし、ワルファリンまたは他の一般的な抗凝固剤
をもつと強力かつ効果的な形の化学療法と組み合わせて
投与することはできない。 何故なら、このような療法は常に血小板数の急激な減少
を生じ、ワルファリン療法と組み合わさった血小板減少
は、許容することができない重篤な出血合併症の危険に
患者をさらすことになるからである。本発明のプロティ
ンＣ誘導体は、活性化プロティンＣと同様、通常の抗凝
固剤より選択性が高く、ヘパリンまたは経口の抗凝固剤
よりはるかに高い治療インデックスを有しており、血小
板減少の患者に比較的安全に投与することができる。 従って、本発明のプロティンＣ酵素前駆体と組み合わせ
た効果的かつ強力な化学療法で侵入性癌の患者を治療す
ることができる。治療は深静脈血栓肺塞栓で用いる投与
処方と同様の処方に従えばよい。 本発明の酵素前駆体およびその活性化型は、医薬として
有用な組成物を製造するための既知の方法に従って製剤
化することができ、これによって本発明のヒトプロティ
ンＣ酵素前駆体または活性化プロティンＣを薬学的に許
容しうる担体と混合する。適当な担体およびその製剤例
（他のヒトタンパク質、例えばヒト血清アルブミンを含
む）は、例えばｒＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍ
ａｃｅｕｔｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅｓ第１６版」（Ｏ
ｓｏｌ　ｅｔ　ａｔ、編、Ｍａｃｋ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉ
ｎｇ社、１９８０年）に記載されている。このような組
成物は、有効量のプロティンＣ酵素前駆体またはその活
性化体を、宿主に効果的に投与するのに適した薬学的に
許容しうる組成物を製造するための適切な量の担体とと
もに含んでいる。このプロティンＣ組成物は、非経口で
、または効果的な形での血流への投与が確実なその他の
方法で投与することができる。 また、本発明の酵素前駆体を用いてインビトロで活性化
プロティンＣを製造できることにも注意すべきである。 真核細胞中で活性化プロティンＣを直接製造するための
組換え法が知られているが、これらの方法は活性化プロ
ティンＣが培養培地に長時間残っていることを必要とす
る。さらに、活性化プロティンＣは、高価につく多段階
の工程によって培養培地から精製しなければならない。 活性化プロティンＣは比較的不安定であるので、これら
の直接発現法は少量の活性化プロティンＣを与える。対
照的に、本発明の酵素前駆体はＣａ”″の存在下であっ
てもトロンビン単独により活性化されうるので、活性化
プロティンＣを製造するための既知の方法を凌ぐ重要な
利点が提供される。 以下に実施例を挙げて本発明の方法、ならびに代表的な
化合物、ベクターおよび形質転換体の構築（作成）プロ
トコールを説明するが、これらは本発明を限定しようと
するものではない。 （以下、余白） 実施例１　プラスミドｐｒ−Ａｐｃの構築本実施例はプ
ラスミドｐＬ　Ａ　Ｐ　Ｃ構築の詳細なプロトコールを
提供するものである。簡単に説明すると、実施例ＩＡは
、活性化ペプチドを含むプロティンＣ分子の一部をコー
ドしているＤＮＡフラグメントのプラスミドｐＨＣ７か
らの単離を説明するものであり、実施例ＩＢは、このＤ
ＮＡ７ラグメントのファージＭ１３ｍｐ１８へのクロー
ニング、および部位特異的な突然変異誘発による、得ら
れた組換えファージからの活性化ペプチドをコードして
いるＤＮＡの除去を説明するものであり、実施例ＩＣは
、プラスミドｐＬ　Ａ　Ｐ　Ｃ構築の最後の工程、さら
に詳しくは、この突然変異フラグメントを単離し、プラ
スミドｐｔｐｃ由来の２つのフラグメントとライゲート
してプラスミドｐＬ　Ａ　Ｐ　Ｃを得ることを説明する
ものである。プラスミドｐｔ−ｐｃ構築のプロトコール
は実施例２で説明する。 Ａ、ヒトプロティンＣの活性化ペプチドの暗号配プラス
ミドｐＨＣ７は形成期ヒトプロティンＣの完全な暗号配
列を含んでいる。１５ｇｇ／ｍＱのテトラサイタリンを
含む１Ｑのしブロス（［０９ペプトン、ｌ　Ｏｇ　Ｎａ
ＣＱ、および５ｇ酵母抽出物）に大腸菌Ｋ１２　　ＲＲ
Ｉ／ｐＨＣ７（ＮＲＲＬ　Ｂ−１５９２６）の培養物を
接種し、５９０ｒ＋ｍでの光学密度（０，Ｄ、）が〜ｌ
吸収単位となるまで空気−振盪インキュベーター中、３
７℃でインキュベートし、この時点でクロラムフェニコ
ール（１５０ｍｇ）全培養物に加えた。約１６時間イン
キュベートを続けた。タロラムフェニコールの添加はタ
ンパク質の合成を阻害し、従ってさらに細胞分裂するの
を阻害するか、プラスミドの複製は継続させる。 この培養物を、５ｏｒｖａｌｌ　ＧＳＡローター（Ｄｕ
ｐｏｎｔＣｏ、、Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ　Ｐｒｏｄｕｃ
ｔｓ、　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ　Ｄｉｖｉｓｉｏｎ。 Ｎｅｗｔｏｗｎ、　ＣＮ　０６４７０）中、６０００ｒ
ｐｍ、　　４°Ｃで５分間遠心した。この上清を捨て、
細胞ペレットをＴＥＳ緩衝液［１０ｍＭトリス−ＨＣＬ
ｐＨ＝７．５；　ｌ　ＯｍＭ　ＮａＣ１１；および１ｍ
Ｍ　ＥＤＴＡ］（４０ｍＱ）で洗浄し、再ペレット化し
た―もう一度上済を捨て、細胞ペレットをドライアイス
ルエタノール浴で凍結させ、そして解凍した。解凍した
細胞ペレットを２５％スクロース１５０ｍＭＥＤＴＡ溶
液（１０ｍ１２）に再懸濁した。５ｍｇ／ｍＱのリソチ
ーム溶液（約１ｍ（１）；０．２５ＭのＥＤＴＡ、ｐＨ
＝８゜０（３ｍＱ）；およびｌ０ｍｇ／ｍＱのＲＮアー
ゼＡ（１００μＱ）をこの溶液に加え、次いでこれを氷
上で１５分間インキュベートした。このリソチーム処理
した細胞に３ｍＱの溶菌溶液［１０％トリトン−Ｘ］　
００（３ｍ（１）；　０．２５Ｍ　ＥＤＴＡ、ｐＨ−８
，０（７５ｍＱ）　；　ｌ　Ｍ　　トリス−ＨＣＱ、ｐ
Ｈ＝８．０（１５ｍＱ）；および水（７ｍＱ）を混合し
て調製］を加え、混合し、得られた溶液を氷上でさらに
１５分間インキュベートした。この溶解した細胞をドラ
イアイス−エタノール浴で凍結させ、次いで解凍した。 ５Ｗ２７０−ター（Ｂｅｃｋｍａｎ、　７３６０　Ｎ、
Ｌｉｎｃｏｌｎ　Ａｖｅ、。 しｉｎｃｏｌｎｗｏｏｄ、　　ＩＬ　６０６４６）中、
　２５　、ＯＯＯｒｐｍで４０分間遠心することによっ
てこの溶液から細胞の残骸を除去した。この溶液にＣｓ
Ｃｌ２（約３０．４４ｇ）および５ｍｇ／ｍＱ臭化エチ
ジウム溶液（〜１　ｍｆ２）を加え、その容量を４０ｍ
Ｑに調節した。この溶液をＶｔ１５０超遠心管（Ｂｅｃ
ｋｍａｎ）にデカンテーションした。この管を密封し、
Ｖｔ　ｉ５０ローター中、４２．００Ｏｒｐｍで〜１６
時間遠心した。紫外光で見えるようにしてプラスミドの
バンドを単離し、ｔｉ７５管およびローター（Ｂｅｃｋ
ｍａｎ）に入れ、５５，０００ｒｐｍで１６時間遠心し
た。必要な容量の調節はすべて０．７６１ｇ／ｍＱのＣ
５ＣＱを含むＴＥＳを用いて行った。プラスミドのバン
ドをもう一度単離し、臭化エチジウムを塩−飽和のイン
プロパツールで抽出し、最後にＴＥＳ緩衝液でｌ：３に
希釈した。 次いで、この溶液に２容量のエタノールを加え、得られ
た混合液を一２０°Ｃで一部インキユベートした。この
溶液を、５Ｓ３４０−ター（ＤｕＰｏｎｔ　Ｃｏ、）中
、１０．０００ｒｐｍで１５分間遠心することによって
プラスミドＤＮＡをペレット化した。 この方法によって得られたプラスミドｐＨＣ７ＤＮＡ（
−１ｍｇ）をＴＥ緩衝液［１０ｍＭ　　トリスーＨＣＱ
、ｐＨ＝７．６、およびＱ、１ｍＭＥＤＴＡ］（ｌ　ｍ
Ｑ）に懸濁し、−２０°Ｃで保存した。プラスミドｐＨ
Ｃ７の制限部位および機能地図を添付の第２図に示す。 プラスミドｐＨＣ７ＤＮＡ（約７μり；７μＱ）を、１
０　Ｘ　Ｃｏｒｅ緩衝液”（２５μ（１）［Ｃｏｒｅ緩
衝液ＴＭ（’５ＲＬ）は５００ｍＭ）リス−ＨＣＱ、ｐ
Ｈ−８，０；　５００ｍＭ　ＮａＣＱ；およびｌ　ＯＯ
ｍＭ　ＭｇＣｌ２．である１、水（１９８μＱ）、制限
酵素５ｓｔｌ（１２μＱ；〜６０単位）［Ｂ　ＲＬ　（
Ｂｅ１．ｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｉｅｓ、　Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、　ＭＤ　
２０８７７）　；実施例中で言及する酵素のすべては、
他に記載がなければ、ＢＲＬから、またはＮ　Ｅ　Ｂ　
（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ、　Ｂｅｖ
ｅｒｌｙ、　ＭＡ　０１９１５−９９９０）から入手可
能であり、これらを実質的に製造元の推奨に従って用い
た］、および制限酵素５ａｉｌ（８μＱ；８０単位）に
加えた。 この反応混合物を３７°Ｃで４時間インキュベートし、
次いで５ｓｔｌ−５ａｌｌ消化したプラスミドｐＨＣ７
ＤＮＡを始めフェノールで、次にクロロホルムで抽出し
、エタノール沈澱および遠心によって集め、最後にＴＥ
／１０緩衝液［１０ｍＭトリス塩基、ｐＨ−７，６；お
よびＱ、１ｍＭ　ＥＤＴＡ］（１５μＱ）に懸濁した。 次に、この反応混合物を、トリス−酢酸塩緩衝液中、−
１３０Ｖおよび一６５ｍＡで２〜３時間、〜０．６％低
ゲル化温度アガロース（ＦＭＣＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ
、Ｍａｒｉｎｅ　Ｃｏ１１ｏｉｄｓ　Ｄｉｖｉｓｉｏｎ
、Ｒｏｃｋｌａｎｄ、　Ｍａｉｎｅ０４８４１）ゲルで
電気泳動にかけた。このゲルを臭化エチジウムの希釈溶
液で染色し、長波長のＵＶ光で見えるようにし、−０，
７ｋｂ　５ｓＬＩ−３ａｉｌ制＠７ラグメントを含むＤ
ＮＡのバンドを小さな切片でゲルから切り取った。この
切片の体壁を切片の密度と重量から求め、切片を入れた
試験管に４容量の０．２５Ｍ　ＮａＣＱ含有のＴＥを加
えた。 次いで、この切片を７２℃でインキュベートして溶解し
た。約４００μθ中に、プラスミドｐＨＣ７の−０，７
ｋｂ　５ｓｔｌ−５ａｌｌ制限フラグメントが約０．５
μｇ得られた。このＤＮＡ溶液を製造元の推奨に従いＮ
ＡＣ５−ｐｒｅｐａｃ’カラム（ＢＲＬ）に通すとさら
に精製されたＤＮＡが得られた。この精製フラグメント
を脱イオン水（１５μＱ）に再懸濁した。 誘発による除去 約１μ９のファージＭ　ｌ　３　ｍｐ　ｌ　８　（Ｎｅ
＋ｙ　ＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓから入手）のＲＦ
（複製型）ＤＮＡを、実質的に実施例１Ａ記載の方法に
従って、制限酵素５ＳＬＩおよび５ａｉｌで消化した。 この反応混合液をフェノールで、次いでクロロホルムで
抽出することによって反応を止め、そしてＤＮＡを沈澱
させ、遠心して集め、約１５μＱのＴＥ緩衝液に再懸濁
した。この消化によって得られた２種類の７ラグメント
を〜０．６％の低ゲル化温度アガロースゲルで分離し、
大きい方のフラグメントをゲルから切り出し、実施例Ｉ
Ａの記載のようにして精製しＩこ。 このＳｓｔ　Ｉ　−５ａｌ　Ｉ消化したＭ１３ｍｐ１８
ＲＦ　　ＤＮＡ（５１ＺＱ）に、プラスミドｐＨＣ７の
〜０゜７ｋｂ　Ｓｓｔ　ｌ　−Ｓａｌ　Ｉ制限フラグメ
ント（約Ｏｌμｇ：水７μＱ中）を、ＩＯＸ　　リガー
ゼ緩衝液［０，５Ｍトリフ、−ＨＣＱＳｐＨ−７，８；
　６０ｍＭ　ＭｇＣＱ２；および０．２Ｍジチオトレイ
トール（Ｄ　Ｔ　Ｔ　）］（２ｕＱ）、ｌ　ｍｙ／ｍＱ
　Ｂ　Ｓ　Ａ（２μＱ）、２５ｍＭＡＴＰ　（ｌ　ｕＱ
）、Ｔ４　　ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢＸｌμｆｆ；〜４
００単位）、および水（２μＱ）とともに加えた。 このライゲート反応液を２５°Ｃで一部インキユベート
した。ライゲートしたＤＮＡは２本鎖形の所望のファー
ジＭｌ　３ｍｐｌ　８−ＨＥ　Ｉ　　ＤＮＡからなって
いた。 大腸菌Ｋ　ｌ　２　　Ｊ　Ｍ　Ｉ　Ｏｌ　（Ｎｅｗ　Ｅ
ｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）の−晩培養物（約３０
０μＱ）を２Ｘ　ＴＹブロス［ＴＹブロスはｌＯり／Ｑ
トリプトン、ｌＯｇ／ＣＮａＣ（！、および５ｇ／Ｑ酵
母抽出物である］（３０ｍＱ）に接種し、この培養物を
、Ｏ、Ｄ　、、、ｏが〜０．５になるまで曝気しながら
３７°Ｃでインキュベートした。培養物を氷水浴で１０
分間冷却し、遠心して集め、冷１０ｍＭ　ＮａＣＣ（１
５ｍ＋２）に再懸濁した。 細胞をもう一度遠心して集め、冷却した３０ｍＭのＣａ
ＣＱｚＣｌ　５　ｍＱ）に再懸濁した。この細胞を氷上
に２０分間置き、遠心して集めた。細胞を冷３ＯｍＭ　
ＣａＣＱ２（ｉ５ｍＱ）に再懸濁し、その２００μＱを
取り、上記調製のライゲートＤＮＡ（９μα）に加え、
氷上で約３０分間インキュベートした。次いで、この細
胞−ＤＮＡｉ合物を４２°Ｃで２分間インキュベートし
、トップ寒天［４５℃で溶融するように保たれた０、５
％寒天含有のＴＹブロスであり、２％Ｘ−ガル（５−ブ
ロモ−４−クロロ３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピ
ラノシド）（５０μＱ）、Ｉ　ＯＯｍＭ　　Ｉ　ＰＴＧ
（イソプロピル　βＤ−チオガラクトピラノンドＸ　５
０　ｕａ）、および対数増殖期の大腸菌Ｋ１２　　ＪＭ
ＩＯＩ（１００μＱ）をも含んでいる］（３ｍＯ，）に
加えた。次いで、この細胞−トノブ寒天の混合物をＴＹ
−寒天プレートに蒔き、このプレートを３７°Ｃで一部
インキユベートした。 翌朝、４つの透明なプラークを２Ｘ　ＴＹプロス（２ｍ
（１）に別々に接種し、この培養物を曝気しなから３７
°Ｃで６時間インキュベートした。次に、培養物を遠心
し、得られた上清（細胞ベレットは制限酵素分析用のフ
ァージＤＮＡの調製に用いた）（５００μＱ）を大腸菌
Ｋ１２　　ＪＭＩＯＩの培養物（５００μＱ；Ｏ，Ｄ、
５ｓｏ＝０，５）および２Ｘ　ＴＹブロス（５０ｍＱ）
に加えた。これらの培養物を３７°Ｃで一部インキユベ
ートした。この細胞ベレットから、培養培地に抗生物質
を全く用いなかったことと超遠心の工程をフェノールお
よびクロロホルム抽出に置き換えたこと以外は実施例Ｉ
Ａ記載の方法のスケールを小さくした方法を用いて、フ
ァージＲＦ　　ＤＮＡを単離した。ファージＭＩ３ｍｐ
１８−ＨＥＩ　　ＤＮＡを含む形質転換体をその７７−
ジＤＮＡの制限酵素分析によって同定しＩ；。 −晩培養物を遠心し、上清５ｍｆ２あたりに、２０％ポ
リエチレングリコール（ＰＥＧ）６０００と２゜５ｍＭ
　ＮａＣＱからなる溶液約ＩｍＱを加え、次いで室温で
１０分間インキュベートした。この混合物を１０，００
０ｒｐｍで１０分間遠心し、得られたベレット（１本鎖
のファージＭ１３ｍｐ１８−ＨＥＩＤＮＡを含んでいる
）をＴＥＳ緩衝液［２０ｍＭ）リス−ＨＣＱ、ｐＨ＝７
．５　；　０．１Ｍ　ＥＤＴＡ：および１０ｍＭ　Ｎａ
ＣＣ］（５００μＱ）に再懸濁　。 した。このＤＮＡ溶液を、始めクロロホルムで、次いで
ＴＥ飽和のフェノールで２回、さらにもう−度クロロホ
ルムで抽出した。次いで、エタノールおよびＮａ０Ａｃ
を用いて１本鎖のＤＮＡを沈澱させ、遠心し、そしてベ
レットを７０％エタノールで洗浄し、乾燥した後、得ら
れたベレットを水（８０μＱ）に溶解した。このファー
ジ調製物を次の工程（部位特異的な突然変異誘発）で用
い、活性化ペプチドをコードしているＤＮＡを除去した
。 活性化ペプチドをコードしているＤＮＡを除去するため
の突然変異誘発に用いる１本鎖のＤＮＡ７ラグメントは
自動ＤＮＡ合成機で合成したが、これは次の配列を付し
ている； ５’　−ＧＣＧＣＡＧＴＣＡＣＣＴＧＡＡＡＣＧＡＣＴ
ＣＡＴＴＧＡＴＧＧＧＡＡＧＡＴＧＡ−３’この１本鎖
のＤＮＡフラグメント（「突然変異誘発オリゴヌクレオ
チド」）（約３０ｐモル；ｌμＱ）、およびＭ］３普遍
プライマー［Ｂｏｅｈｒ　ｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉ
ｍ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｂ　Ｍ　Ｂ　）、７９
４１　Ｃａｓｔｌｅｗａｙ　Ｄｒｉｖｅ。 Ｐ、Ｏ，Ｂｏｘ　５０８１６．Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉ
ｓ、ＩＮ　４６２５０から市販されている）（７，５ｐ
モル；１．５μＣ）を、１ｍＭのＡＴＰ（ｌμＱ）を含
むＩＸキナーゼ緩衝液［１１００ｆｆ１トリス−ＨＣＱ
、ｐＨ＝８．３　；　１００ｍＭ　ＤＤＴ；およびｌ　
００　ｍＭ　ＭｇＣＱｚ］（１０μＱ）中、Ｔ４ポリヌ
クレオチドキナーゼ５単位［Ｐｈａｒｍａｃ　ｉａ　。 Ｐ−Ｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｉｎｃ、、８００
　Ｃｅｎｔｅｎｎｉａｌ　Ａｖｅｎｕｅ。 ＰｉｓｃａＥａｗａｙ、ＮＪ　０８８５４］　を用いて
、３７℃で３０分間別々に処理し、次いで６５℃で１０
分間インキュベートし、そして凍結させた。このキナー
ゼ処理したＤＮＡを以下に記載の突然変異誘発に用いｌ
こ。 突然変異誘発の最初の工程では、突然変異誘発オリゴヌ
クレオチドとＭ１３普遍プライマーを１本鎖のファージ
ＤＮＡにアニーリングした。普遍プライマー（ｌｐモル
；Ｉ、２μＱ）、突然変異誘発オリゴヌクレオチド（ｌ
ｐモル；０，３μ０．）、ＩＯＸアニーリング緩衝液［
１００ｍＭ１−リス−Ｈ（１％ｐＨ＝７．５　；　１ｍ
Ｍ　ＥＤＴＡ；および５００ｍＭＮａｃＱ］（２μＱ）
、および水（１６μＱ）に１本鎖の７７一ジＭｌ　３ｍ
ｐｌ　８−ＨＥ　ｌ（３００ｎｇ；　０．５μＱ）を加
え、この混合物を８０°Ｃで２分間、次いで５００Ｃで
５分間インキュベートし、最後に混合物を室温まで冷却
してアニーリング反応を行った。 オリコ゛ヌクレオチドがアニーリングされたなら、ＤＮ
Ａポリメラーゼでブライマーを延長することによりファ
ージＤＮＡを２本鎖にした。この延長反応は、アニーリ
ングしたＤＮＡの混合物にｌＯＸの延長緩衝液［５００
ｍＭ）リス−ＨＣＩ２．ｐＨ＝８　；　ＩｍＭ　ＥＤＴ
Ａ　；および１２０ｍＭ　Ｍｇ（，２２］（３ｕＱ）、
ＩＯＸのリガーゼ緩衝液（３ｐＱ）、０．２ｍＭ　ＤＴ
Ｔ（＋、５μＱ）、ｄＮＴＰ混合物［各ｄＮＴＰが０　
、５　ｍＭ］（３ｕＱ）、２５ｍＭ　ＡＴＰ（１，２μ
１２）、フレノウ酵素［５Ｕ／μ（１；ＢＭＢ］　（０
，５μＱ）、Ｔ４　　ＤＮＡリガーセ［４０００；ＮＥ
Ｂ］（ｌμＱ）、および水（１９，８μＱ）を加えるこ
とによって行った。この延長反応液を、室温で３０分間
、次いで３７°Ｃで４時間、さらに４°Ｃで一部インキ
ユペートした。 この反応を、フェノール−クロロホルム抽出、およびエ
タノールと酢醜ナトリウム（ＮａＯＡｃ）によるＤＮＡ
沈澱によって停止させた。ＤＮＡを遠心して集め、Ｓｌ
綴衝液［０，３Ｍ　ＮａＣｌ２；　０゜０３Ｍ　Ｎａ０
Ａｃ、　ｐＨ＝４．５　；および０　、３　ｍＭＺ　ｎ
Ｃ４ｚ］（４０ｕＱ’ｌに再懸濁し、次いでＤＮＡの溶
液に加えた。以下に記載するＳｌ処理は、部位特異的な
突然変異誘発法に有用であると報告されている。しかし
、本発明者等はＳｌ処理に有意の利点を全く見い出すこ
とができず、本明細書の後記実施例で説明する構築プロ
トコールではこのＳｌ処理を完全に削除した。 ＤＮＡの溶液を２本の試験管に均等に分け、この試験管
の１本に８１ヌクレアーゼ（１００単位ＢＭＢ）を加え
た。このｓ１反応液を室温で５分間インキュベートし、
反応混合物をＴＥ飽和のフェノール−クロロホルム（５
０：５０）で１回抽出することによって反応を停止させ
た。エタノルとＮａ０Ａｃを用いてこの反応混合物から
、および５ｌｆｉ理していない試料からＤＮＡを沈澱さ
せｔ二。 このＤＮＡペレットを水（６０μＱ）に再懸濁し、これ
を用い、Ｉ　ＰＴＧまたはＸガルをプレートに全く加え
なかったこと以外はファージＭ１３ｍｐ１８−ＨＥ　ｌ
の構築に用いた方法に従って大腸菌に１２　　ＪＭＩＯ
Ｉを形質転換した。ドソトープロソトハイブリダイゼー
ンヨンおよびプラークのプローブとして突然変異誘発オ
リゴヌクレオチドの小部分５’　−ＴＧＡＡＡＣＧＡＣ
ＴＣＡＴＴＧＡ−３’　（放射性活性にラベルした）を
用いることによって突然変異体をスクリーニングした。 ハイブリダイゼ−７ヨンにより陽性と見られたいくつか
のプラークを取り、対数増殖期の大腸菌ＫＩ２ＪＭＩ０
１の培養物（２ｍＯ，）に別々に接種した。これらの培
養物を曝気しなから３７°Ｃで約６時間インキュベート
し、次いでこれらを用い、ファージＭ　Ｉ　３ｍｐｌ　
８−ＨＥ　１について上記したようにして１本鎖のＤＮ
Ａを調製しＩこ。 ジデオキン＝配列決定法［Ｊ、）１．５ｍ１ｔｈ、　１
９８０．１Ｊｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇ
ｙ　６５：５６０−５８０１を用いて１本鎖ＤＮＡの配
列決定を行った。いくつかのファージが所望の突然変異
体であると同定された。活性化ペプチドの暗号配列か削
除されているファージをファージＭ　ｌ　３ｍｐｌ　８
−ＨＥ　２と命名した。ファジＭｌ　３ｍｐｌ　８−Ｈ
Ｆ２中の突然変異は、天然の暗号配列に対して３６ｂｐ
の大きさの減少をもたらし、この差異を、突然変異した
領域を含むＤＮＡの同定を容易にするのに用いることが
できる。 後の構築に用いるためＲＦ型のファージＭＩ３ｍｐ１８
−ＨＥ２を調製した。 な構築 実質的に実施例ＩＡの方法に従い、ＲＦ型のファージＭ
　ｌ　：３ｍｐｌ　８−ＨＥ　２の突然変異誘発された
５ｓｔｌ−５ａｌｌ（−０，７ｋｂ）制限フラグメント
をファージから切り取り、単離した。しかし、１：２希
釈の低ゲル化アガロース中、〜０　、　Ｉ　１７ｇの所
望の〜０．７ｋｂフラグメントを含む〜１００μＱの溶
液をいかなる精製カラムにもかけず、直接、下記のプラ
スミドｐＬ　Ａ　Ｐ　Ｃを得るためのライゲートに用い
た。 ３種のＤＮＡフラグメント、即ち、上記のファ−ジＭ　
ｌ　３ｍｐｌ　８−ＨＥ　２の−０，７ｋｂ　５ｓｔｌ
Ｓａｌ＋制限フラグメント、およびプラスミドｐＬＰＣ
由来の２種類のＤＮＡ７ラグメントをいっしょにしてラ
イゲートし、プラスミドｐＬＡＰＣを得た。プラスミド
ｐＬＰＣ構築のプロトコールは実施例２で説明する。プ
ラスミドｐＬＰＣの制限部位および機能地図を添付の第
１図に示す。プラスミドｐＬＰＣ上の５ａｌｌ、５ｓｔ
ｌおよびＥｃｏＲＩ制限酵素認識部位の位置により、所
望のＥｃｏＲＩＳａｌｌおよびＥｃｏＲＩ　−Ｓｓｔ　
Ｉ制限フラグメントは２種類の別々の消化で調製しなけ
ればならなかった。 ＥｃｏＲＩ　−Ｓｓｔ　Ｉフラグメントを調製するため
、水（２５μＱ）中のプラスミドｐＬＰＣ（約４０μｇ
）を、１ｍｇ／ｍＱのＢＳＡ（Ｉｏｎ）、ＩＯＸのＣｏ
ｒｅ緩衝液”（１０μＬＢＲＬ）、制限酵素ＥｃｏＲＩ
（５μＱ；５０Ｕ；ＢＲＬ）、制限酵素５ｓｔｌ（５μ
Ｑ；　２５Ｕ、ＢＲＬ）、および水（４５μＱ）に加え
、得られた反応液を３７°Ｃで１．５時間インキュベー
トした。エタノールで沈澱させ、遠心することによって
Ｓｓｔ　Ｉ　−ＥｃｏＲＩ消化したプラスミドｐＬＰＣ
のＤＮＡを集めた。この５Ｓｔ［−ＥｃｏＲＩ消化した
ＤＮＡを水に再懸濁し、次いで〜０．６％の低ゲル化温
度のアガロースゲルにかけ電気泳動でＤＮＡフラグメン
トを分離した。 ＥｃｏＲＩ　−Ｓａｌ　ｒフラグメントを調製するため
、水（９μＱ）中のプラスミドｐＬＰＣ（約１５μｇ）
を始めに制限酵素Ａｐａｌで処理して似た大きさの制限
フラグメントによる汚染がないようにした。ｌＯＸのＡ
ｐａｌｆｉ衝液［６０ｍＭ　ＮａＣ＋２；　６０ｍＭ　
トリス−ＨＣＱ−ｐｉ（＝　７−４　；　６０ｍＭ　Ｍ
ｇＣ（ｈ　；および６０ｍＭ　ＤＴＴ］（約１０μＱ）
、１ｍｇ／ｍＱのＢＳＡ（ｔｏμＱ）、水（６９μＱ）
、および制限酵素Ａｐａｌ（２μＱ；５００；ＮＥＢ）
をプラスミドｐｔ、ｐｃＤＮＡの溶液に加え、得られた
反応液を３７℃で１時間インキュベートした。次に、２
Ｍ　ＮａＣ（＋（１５１１＋２）、水（６９μＱ）、制
限酵素Ｓａｌ　Ｉ　Ｃ３ｕＱ　；　Ｎ　ＥＢ）、および
制限酵素ＥｃｏＲＩ（８μＪ　ＮＥＢ）をＡｐａｌ消化
したプラスミドｐＬＰＣＤＮＡの溶液に加え、この反応
液を３７℃で１時間インキュベートシた。このＡｐａ　
Ｉ　−Ｓａｔ　Ｉ　−ＥｃｏＲＩ消化したプラスミドｐ
ＬＰＣＤＮＡを、始めフェノールで、次いでクロロホル
ムで抽出し、続いてエタノール沈澱と遠心によって集め
、最後に水（２５μＱ）に再懸濁した。次に、このＤＮ
Ａを〜０．６％の低ゲル化温度のアガロースゲルにかけ
、ＤＮＡフラグメントを電気泳動で分離した。 −３，７６ｋｂのＥｃｏＲＩ　−Ｓａｌ　■制限７ラグ
メントおよび−２，０ｋｂのＥｃｏＲＩ　−５ｓｔ　Ｉ
制限フラグメントをゲルから切り出し、実施例ＩＡ記載
のように、等量の１０ｍＭトリス−Ｈ（１％ｐＨ＝７．
６を加えた後、ゲルフラグメントを溶融した。 プラスミドｐＬＰＣの−３，７６ｋｂ　ＥｃｏＲＩ　−
５ａｌｌ制＠７ラグメント（約２μｇ）がこのようにし
てｌＱｍＭ）リス−Ｈｃａ、　ｐＨ−７，，６（−２０
０μＱ、）中に得られた（この液は溶融したアガロース
をも含んでいた）。プラスミドｐｔ、ｐｃの〜２　、　
ＯｋｂＥｃｏＲＩ　−Ｓａｌ　ｒ制限フラグメント（約
２μｇ）は、アガロースを含む別のｌＯｍＭ）リス−Ｈ
（１゜ｐＨ−７，６（〜２００μＱ）中に得られた。 ２種類の精製制限フラグメント（プラスミドｐＬＰＣの
−３，７６ｋｂ　ＥｃｏＲＩ　−３ａｌ　［制限フラグ
メント、およびプラスミドｐＬＰＣの〜２．０ｋｂＥｃ
ｏＲＩ　−５ｓｔ　Ｉ制限フラグメント）の溶液（それ
ぞれ約１２，５μＱ）を、ファージＭ１３ｍｐ１８−Ｈ
Ｅ２の−０，７ｋｂ　５ｓｔ１．−５ａｌｌ制限７ラグ
メント（２０μ（１）、　１ｍｇ／ｍＱ　　ＢＳＡ（ｌ
　ＯμＱ）、　ｌＯｍＭＡＴＰ（１０μ１２）、ＩＯＸ
　　リガーゼ緩衝液（１０μＱ）、Ｔ４　　ＤＮＡリガ
ーゼ（２μＱ：〜８００Ｕ；ＮＥＢ）、および水（２３
μＱ）に加え、得られたライゲート反応液を１５°Ｃで
一部インキュベートしｔ：。このライゲートしたＤＮＡ
は所望のプラスミドｐＬ　Ａ　Ｐ　Ｃを構成していた。 プラスミドｐＬＡＰＣは、活性化ペプチドをコードして
いるＤＮＡが欠失していることがプラスミドｐＬＰＣと
異なるたけである（第１図）。 グラスミドの構造を調べ、真核細胞の形質転換およびさ
らに構築を行うための大量のプラスミドｐＬ　Ａ　Ｐ　
Ｃを得るため、プラスミドｐＬ　Ａ　Ｐ　Ｃを含むライ
デー１−ＤＮＡを用いて大腸菌Ｋ１２　　ＲＶ３０８（
ＮＲＲＬから取得番号ＮＲＲＬ　Ｂ−１５６２４のもと
て入手可能）を形質転換した。 Ｌグロス中の大腸菌Ｋ１２　　ＲＶ３０８の培養物（５
０１１１７１）を、５９０ｎｍでの光学密度（０，Ｄ、
）が〜０．６になるまで増殖させた。この培養物を氷上
で１０分間冷却し、細胞を遠心して集めた。この細胞ベ
レットを冷１０ｍＭ　ＮａＣＱＣ２５ｍＱ）に再懸濁し
た。もう−皮細胞を遠心してペレフト化し、このペレッ
トを冷３０ｍＭ　ＣａＣＱ２Ｃ２５ｍＱ）に再懸濁し、
氷上で３０分間インキュベートした。細胞を再度遠心し
て集め、冷３０ｍＭ　ＣａＣＪ（２゜５　ｍＱ）に再懸
濁した。 この細胞懸濁液（２００μＱ）をプラスミドｐＬＡＰＣ
含有のライゲートＤＮＡと混合し、氷上で６０分間イン
キュベートした。次いで、この混合物を４２°Ｃで２分
間、続いて室温で１０分間インキュベートした。この細
胞−ＤＮＡ混合物に２ｘのＴＹグロス（約１０ｍＱ）を
加え、次いで細胞を１２５ｍＱのフラスコに入れ、空気
−振盪インキュベーター中、３７°Ｃで２時間インキュ
ベートした。 細胞混合物の一部を１００μｇ／ｍＱアンピンリン含有
のＴＹ−寒天（１５ｇ／１２寒天のＴＹブロス）プレー
トに蒔き、このプレートを３７°Ｃで一部インキユベー
トした。大腸菌Ｋ　ｌ　２　　ＲＶ３０８／ｐＬＡＰＣ
形質転換体をそのプラスミドＤＮＡの制限酵素分析によ
って確認した。選択剤としてテトラサイクリンではなく
アンピシリン（５０μｇ／ｍＱ）ヲ用いること以外は実
質的に実施例ＩＡの教示に従い、大腸菌Ｋ１２　　ＲＶ
３０８／ｐＬＡＰＣ形質転換体からプラスミドＤＮＡを
得た。 実施例２　プラスミドｐＬＰＣの構築 プラスミドｐＬＰＣをプラスミドｐＬ　Ａ　Ｐ　Ｃ構築
の中間体ベクターとして用いた（実施例ＩＣ参照）。 プラスミドｐＬＰＣは、ヒトプロティンＣを発現させる
ように配置されたアデノウィルス２の後期フロモーター
およびＢＫウィルスのエンハンサ−をコードしているＤ
ＮＡセグメントを含有している。プラスミドｐＬ　Ａ　
Ｐ　Ｃ構築のプロトコールは、本質的に、プラスミドｐ
ＬＰＣ上のヒトプロティンＣの暗号配列を、活性化ペプ
チドをコードしているＤＮＡが除去された別のプロティ
ンＣ暗号配列に置き換えることになる。 プラスミドｐｔ−ｐｃおよびｐＬ　Ａ　Ｐ　Ｃ上のＢＫ
エンハンサ−／アデノウィルス後期プロモーターの発現
コントロール配列は、大きいＤＮＡウィルスの即時型遺
伝子産物、即ちアデノウィルスのＥＩＡ選伝子産物の存
在によってその活性が大さく刺激される。 プラスミドｐＬｐｃ構築のプロトコールを以下に説明す
る。プラスミドｐＬｐｃの全構築プロトコールを添付の
第１図に図示する。簡単に説明すると、実施例２ＡはＢ
ＫウィルスＤＮＡの単離を記載するものであり、これか
らＢＫエンハンサ−を得ることができる。実施例２Ｂは
、ＢＫエンハンサ−をプラスミドｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎ
ｅｏに挿入することによって得られるプラスミドである
、プラスミドｐＢＫｎｅｏｌｌ築のプロトコールを記載
するものである。実施例２Ｃは、アデノウィルス２後期
プロモーターをプラスミドｐｓＶ２ｃａｔに挿入するこ
とによって得られるプラスミドである、プラスミドｐＬ
Ｐｃａｔ構築のプロトコールを記載するものである。実
施例２Ｄは、アデノウィルス後期プロモーターの活性を
刺激するように設置されたＢＫエンハンサ−を含むプラ
スミドである、プラスミドｐＢＬｃａｔ構築のプロトコ
ールを記載するものである。実施例２Ｅは、プロティン
Ｃ発現ベクターであるプラスミドｐＬ　１３３構築のプ
ロトコルを記載するものであり、出発プラスミドｐＨＣ
７から始め、中間体プラスミドｐＳＶ２−ＨＰＣ８の構
築を経て、最後にプラスミドｐｔ、　ｌ　３３を構築す
る。最後に、実施例２Ｆは、ヒトプロティンＣを発現す
るようプラスミドｐＬ　Ｉ　３３に挿入されｔ；、プラ
スミドｐＢＬｃａｔのＢＫエンハンサ−／　７　テノウ
ィルス後期プロモーター発現コントロール配列を含有す
るプラスミドｐＬＰＣの構築プロトコールを記載するも
のである。 Ａ、ＢＫウィルスＤＮＡ１７）ｗＲ製 ＢＫウィルス１まアメリカン・タイプ・カルチャ・コレ
ク／ヨンから取得番号ＡＴＣＣＶＲ８３７のもとで入手
する。このウィルスは凍結乾操影で供給され、こ１％を
ハング（Ｈａｎｋ）のバランス塩［Ｇｉｂｃｏ、３１７
５５ｔａｌｅｙ　Ｒｏａｄ、Ｇｒａｎｄ　ｌ５ｌａｎｄ
、ＮＹ　１４０７２］に再懸濁して約１０５プラーク形
成単位（ｐｆｕ）／酎の力価にした。ＢＫウィルスＤＮ
Ａの調製用に選択した宿主は一次ヒト胚腎（ＰＨＥＫ）
細胞であり、この細胞はＦｌｏｗ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｉｅｓ、Ｉｎｃ、（７６５５０１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇｈｏ
ｕｓｅ　Ｒｏａｄ、　ＭｃＬｅａｎ、　ＶＡ　２２１０
１）からカタログ番号０−１ｏｏのもとで、またはＭ、
Ａ、Ｂｉｏｐｒｏｄｌｉｃｋｓからカタログ番号７０−
１５１のもとで入手することができる。 全面単層の約１０’のＰＨＥＫ細胞を入れた約５個の７
５ｍｒｎ２ポリスチレン製フラスコをウィルスの調製に
用いた。各フラスコにＩＯ’ｐｆｕ／ｍＱの力価のＢＫ
ウィルス（約１　ｍＱ）を入れ、これを３７°Ｃで１時
間インキュベートし、次いで新鮮な培養培地［ダルベツ
コの改良イーグル培地（Ｇｉｂｃｏ、　Ｇｒａｎｄ　ｌ
５ｌａｎｄ、　ＮＹ　１４０７２）　；　ｌ　０％つＶ
胎児血清を追加１を加え、感染した細胞を３７°Ｃでｌ
Ｏ〜１４日間、またはウィルスの完全な細胞変性効果が
現れるまでインキュベートした。この細胞変性効果は、
セルラインの種類によって、およびウィルスの種類によ
って異なるか、通常は培養ディスクを集合させ、凝集さ
せ、そして脱落する細胞からなる。 凍結−解凍を３回繰り返すことによって細胞からウィル
スを放出させ、５０００Ｘｇで遠心して細胞の残骸を除
いた。ＰＥＧ−６０００（１００ｇ）を加え、溶液を４
°Ｃで２４時間インキュベートし、そして５０００Ｘｇ
で２０分間遠心することによって、上清液（ＩＱ）中の
ウィルスを沈澱させ、集めた。このペレットを、初めの
容量の１／＋００で０、Ｉ　ＸのＳＳＣ緩衝液［Ｉ　Ｘ
　５ＳＣ＝Ｑ、ｌ　５ＭＮａＣＱおよび０．０１５Ｍク
エン酸ナトリウム、ｐＨ＝７］に溶解した。このウィル
ス懸濁液を試験管中の飽和ＫＢｒ溶液（１５ｍ＋＋）の
上に層状に入れ、これを７５，０００Ｘｇで３時間遠心
した。遠心後、２本のバンドがＫＢｒ溶液中に現れた。 完全なピリオンを含む下方のバンドを集め、ＴＥ［１０
ｍＭトリス−ＨＣＱ、ｐＨ−７，８；および１ｍＭＥＤ
ＴＡＩを溶離緩衝液として用いる５ｅｐｈａｄｅｘＲＧ
−５０カラム［Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、
、　Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ５３１７８］で脱塩した
。 二のカラムから得た精製ピリオンの溶液にドデ／ル硫酸
ナトリウム（ＳＤＳ）を１％の濃度になるまで加え、ｐ
ｒｏｎａｓｅ”（Ｓｉｇｍａ）プロテアーゼを１００μ
ｇ　／　ｍ　Ｑ濃度になるよう加え、そしてこの溶液を
３７°Ｃで２時間インキュベートした。次いで、この溶
液に塩化セシウムを１．５６ｇ／ｍＯの密度になるよう
加え、臭化エチジウムを最終濃度１００μ９／ｍＱにな
るよう加えた。この溶液を５ｏｒｖａｌｌ　８６５０−
ター［ＤｕＰｏｎｔ　Ｃｏ、、　Ｎｅｗｔｏｎ、　ＣＴ
　０６４７０１または同様の垂直ローター中、２６０．
ＯＯＯＸｇで２４時間遠心した。遠心後、ウィルスＤＮ
Ａのバンドを単離し、１００ｍＭのトリス−Ｈ（１％ｐ
Ｈ＝７゜８で飽和したイソアミルアルコールにより５回
抽出した。次いで、ＢＫウィルスＤＮＡの溶液を、ＤＮ
Ａの２６０％ｍ／　２８０％ｍ吸収比が１．７５−１．
９０になるまでＴＥ緩衝液に対して透析した。 ＮａＣ０６度を０．１５Ｍに調節し、２容量のエタノー
ルを加え、この溶液を一７０°Ｃで少なくとも２時間イ
ンキュベートし、そして１２，０００Ｘｇで１０分間遠
心することによってＤＮＡを沈澱させた。得られたＢＫ
ウィルスＤＮＡのベレットを１ｍｇ／ｍＱの濃度でＴＥ
緩衝液に懸濁させた。ＢＫウィルスの制限部位および機
能地図を添付の第１図に示す。 Ｂ、プラスミドｐＢＫｎｅｏｌの構築 大腸菌Ｋ　ｌ　２　　ＨＢ　Ｉ　ＯＩ／ｐｄＢ　ＰＶ−
ＭＭＴｎｅｏ細胞を、アメリカン・タイプ・カルチャー
・コレクションから取得番号ＡＴＣＣ３７２２４のもと
、凍結乾燥形で入手する。この凍結乾燥細胞を１００μ
ｇ／ｍＱアンピ／リン含有のし寒天プレトに蒔き、３７
°Ｃでインキュベートして単一のコロニー単離体を得た
。 ５０ｇｇ／ｍＱアンピ／リン含有のしブロス［ＩＣあｔ
ニリトリブ［・ン　ｌＯｇ、ＮａＣｌ２　ｌｏｇ、およ
び酵母抽出物５ｇ］（１（１）に大腸菌Ｋ１２　　ＨＢ
ＩＯＩ／ｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏのコロニーを接種し
、空気−振盪型中、Ｏ，Ｄ、、、。が〜１吸収単位にな
るまで３７°Ｃでインキュベートし、この時点で培養物
にクロラムフェニコール（１５０ｍｇ）を加えた。約１
６時間インキュベートを続けた。クロラムフェニコール
の添加はタンパク質の合成を阻害し、従ってさらに細胞
分裂するのを抑制するが、プラスミドの複製は継続させ
る。次いで、実質的に実施例１Ａ記載の方法に従って、
培養物からプラスミドｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏ　ＤＮ
Ａを調製した。 この方法によって得たプラスミドｐｄＢＰＶ−ＭＭ　Ｔ
ｎｅｏ　Ｄ　Ｎ　Ａ（−１ｉｇ）をＴＥ緩衝液（ｌ　ｍ
Ｑ）に懸濁させ、−２０°Ｃで保存した。通常、実施例
ＩＡ記載のプラスミド単離法は、大量の高精製度プラス
ミドＤＮＡが所望であるときに用いられる。この方法を
少し変え、培養細胞を約５ｍＱだけ用い、この細胞を適
切にスケールダウンした量の溶菌緩衝液中で溶菌し、遠
心工程をフェノールおよびクロロホルム抽出に置き換え
ることによって、比較的少量の、やや精製度の低いＤＮ
Ａ（例えば、あるプラスミドの存在について形質転換体
をスクリニングするときに必要とされるようなりＮＡ）
を早く得ることができる。 上記のようにして調製したプラスミドｐｄＢＰＶＭＭＴ
ｎｅｏ　Ｄ　Ｎ　Ａ（約５１１９；５μＱ）、および前
記のようにして調製したＢＫウィルスＤＮＡ（５μり；
ＳＵＯ，＞のそれぞれを、ＩＯＸのＢａｍＨＩ緩衝液［
１，５Ｍ　ＮａＣＱ；　６０ｍＭ）リス−ＨＣ１２％ｐ
Ｈ−７，９；　６０　ｍＭ　ＭｇＣＱｚ　；および１ｍ
ｇ／ｍＱＢＳＡ］（２μＱ）、制限酵素ＢａｍＨＩ（Ｉ
μ１２；　〜ｌ　Ｏ単位）、および水（７μＱ）を含む
溶液中、３７°Ｃで２時間消化した。等量のフェノール
で抽出し、続いてクロロホルムで２回抽出する二とによ
って反応を停止させた。次いで、ＢａｍＨＩ消化したＤ
ＮＡのそれぞれを沈澱させ、遠心して集め、水（５μＱ
）に再懸濁した。 ＢａｍＨ１ｉ肖化しｔコブラスミドｐｄＢＰＶ−ＭＭＴ
ｎｅｏ（ｌ　ｕＱ）とＢａｍＨ１消化したＢＫウィルス
ＤＮＡ（ＩμＱ）の混合物にＩＯＸのリガーゼ緩衝液（
約ｌ　ｕＱ）を加えた。このＤＮＡ混合物に７４　　Ｄ
ＮＡリガーゼ（ｌ　ｐＱ　；〜５単位）および水（６μ
Ｑ）を加えた後、得られた反応液を１６°Ｃで一部イン
キユベートした。ライゲートしたＤＮＡは所望のプラス
ミドｐＢＫｎｅｏｌおよびｐＢＫｎｅ０２からなり、こ
れらはＢＫウィルスＤＮＡの配向だけが異なっていた。 プラスミドｐＢＫｎｅｏｌの制限部位および機能地図を
添付の第１図に示す。 大腸菌ＫＩ２　　ＨＢＩＯＩ細胞はノーザン・リジョナ
ル・リサーチ・ラボラトリ−から取得番号ＮＲＲＬ　Ｂ
−１５６２６のもと凍結乾燥形で入手可能である。■−
ブロス中の大腸菌Ｋ１２ＨＢｌｏｔの培養物（５０ｉＱ
）を、６５０ｎｍでの光学密度（０−Ｄ−ａｓ。）が約
０．４吸収単位になるまで増殖させた。この培養物を氷
上で１０分間冷却し、細胞を遠心して集めた。この細胞
ペレットを冷１００　ｍＭ　Ｍ　ｇＣＩ２２（２５ｍＱ
＞に再懸濁し、氷上で２５分間インキュベートした。細
胞を再度遠心してペレット化し、ペレットを冷１００　
ｍＭ　ＣａＣＬ（２−５ｍＱ）に再懸濁し、氷上で３０
分間インキュベートした。インキュベートした後には、
この細胞は形質転換用ＤＮＡの取込みに対してコンピテ
ントであっｔ二。 この細胞懸濁液（２００μＱ）を上記調製のライゲート
化ＤＮＡと混合し、氷上で３０分間インキュベートした
。この時間が経過した時点で、細胞を４２°Ｃの水浴中
に２分間入れ、次いでさらに１０分間氷上に戻した。細
胞を遠心して集め、Ｌブロス（１ｍｆ２）に再懸濁し、
３７°Ｃで１時間インキュベートした。形質転換した細
胞を１００μｇ／ｍＱアンピシリン含何のＬ寒天プレー
トに蒔いた。大腸菌Ｋ　］　２　　ＨＢ　ｌ　０１／ｐ
ＢＫｎｅｏｌおよび大腸菌に１２　／ｐＢ　Ｋｎｅｏ２
形質転換体は、そのアンピンリン耐性の表現型、および
そのプラスミドＤＮＡの制限酵素分析によって同定した
。プラスミドｐＢＫｎｅｏｌの制限部位および機能地図
を添付の第１Ａ図に示す。 アデノウィルス２（Ａｄ２）のピリオンＤＮＡは、大き
さが約：３５．９４ｋｂの２本鎖の直線状分子である。 Ａｄ２の後期プロモーターを、Ａ　ｄ　２ゲノムの−０
，３２ｋｂ　Ａｃｃｌ−Ｐｖｕｌｌ制限フラグメントで
単離することができる；この〜０．３２ｋｂ制限７ラグ
メントはＡｄ２ゲノムのヌクレオチド位置５７５５と６
０７１の間の配列に対応している。所望の−０，３２ｋ
ｂ　Ａｃｃ［−Ｐｖｕｌｌ制限フラグメントを単離する
ため、初めにＡｄ２ＤＮ、Ａを制限酵素Ｂａ１ｌで消化
し、−０，３２ｋｂ　Ａｃｃｌ−Ｐｖｕｌｌ制限フラグ
メントの全配列を含有している〜２゜４ｋｂＢａｌｌ制
限フラグメントを単離した。次に、この−２，４ｋｂ　
Ｂａ１ｌ制限フラグメントをＡｃｃｌおよびＰｖｕｌｌ
で消化して所望の７ラグメントを得に。 Ａｄ２　　ＤＮＡ（約５０μ９：　ＢＲＬから入手可能
）を水（８０μＱ）およびＩＯＸのＢａ１ｌ緩衝液［１
００ｍＭ　トリス−ＨＣＱ、ｐＨ＝７．６　；　Ｉ　２
０ｍＭＮ１ｇｃｉ＋２；　ｌ　ＯＯｍＭ　ＤＴＴ　；お
よび１ｍｇ／ｍＱＢＳＡｊ（ｌｏｐｃ）に溶解した。こ
のＡｄ２　ＤＮＡの溶液に制限酵素Ｂａ１ｌ（約１０μ
Ｑ；〜２０単位）を加え、得られた反応液を３７°Ｃで
４時間インキュベートしに。 このＢａ１ｌ消化したＤＮＡをアガロースゲルにかけ、
制限フラグメントが十分に分離するまで電気泳動を行っ
た。ゲルを臭化エチジウムの希釈溶液（０，５μｇ／ｍ
Ｑ）中で染色し、染色したゲルを長波長の紫外（ＵＶ）
光にあてることによって電気泳動したＤ　Ｎ　Ａを見え
るようにした。アガロースからＤＮＡを単離する方法の
１つは次のようである。 ゲルの所望の７ラグメントの前に小さな切れ目を入れ、
ＮＡ−４５ＤＥＡＥメンプラン（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ
　ａｎｄ　５ｃｈｕｅｌｌ、　Ｋｅｅｎｅ、　ＮＨ０３
４３１）の小片をそれぞれの切れ目に入れる。さらに電
気泳動を続けると、ＤＮＡが非共有結合でＤＥＡＥメン
プランに結合する。所望のフラグメントかＤＥＡＥメン
プランに結合した後、このメンプランを取り、低塩の緩
衝液［１００ｍＭ　ＫＣＱ：　Ｏ，ＩｍＭ　ＥＤＴＡ：
および２０ｍＭ１−リス−ＨＣ（１，ｐＨ＝８］ですす
ぐ。次に、このメンプランを小さい試験管に入れ、高塩
の緩衝液［ＩＭ　ＮａＣＱ；　０．１ｍＭ　ＥＤＴＡお
よび２０ｍＭトリス−ＨＣＬｐＨ−８］に浸漬し、そし
て６５°Ｃで１時間インキュベートしてＤＥＡＥ紙から
ＤＮＡを浸出させる。この６５°Ｃのインキュベートの
後、インキュベート緩衝液を集め、メンプランを高塩の
緩衝液ですすぐ。この高塩のすすぎ液を高塩のインキュ
ベート緩衝液とともに集めに。 ＮａＣｌ２濃度が０．２５Ｍになるように高塩のＤＮＡ
溶液の容量を調節し、次いでこの溶液に３容量の冷、無
水エタノールを加えた。得られた溶液を混合し、１０〜
２０分間、−７０°Ｃにした。次に、この溶液を１５．
ＯＯＯｒｐｍで１５分間遠心した。さらに沈澱を行って
残留する塩を除去した後、ＤＮＡベレットをエタノール
ですすぎ、乾燥し、ＴＥ緩衝液（２０μＱ）に再懸濁し
た：このペレットは目的のＡｄ２の制限フラグメント（
約３ｐ９）からなっていた。得られた精製フラグメント
をＴＥ緩？Ｊｉ液（１０μＱ）に溶解した。 水（Ｊ　６　ｕＱ）オＪ：びｌ０Ｘ（７）ＡＣＣＩ緩衝
液［６０ｍ〜Ｉ　ＮａＣｌ２；　６０ｍＭ　　トリス−
ＨＣＱ、ｐＨ＝７゜５　；　６０ｍＭ　ＭｇＣＱｚ　；
　６０ｍＭ　ＤＴＴ　；およびｌ　ｍｗ／ｍＱ　Ｂ　Ｓ
　Ａｌ（２μＱ）を、Ａｄ２の−２、４ｋｂＢａｌＩ制
限７ラグメントの溶液に加えた。このＤＮＡ溶液に制限
酵素ＡｃｃＴ（約２μＱ；〜１０単位）を加えた後、反
応液を３７°Ｃで２時間インキュベートした。ＡＣＣＩ
消化した後、ＤＮＡをエタノール沈澱によって集め、水
（１６μＱ）およびＩＯＸのＰｖｕｌｌａｔ衝液［６０
０ｍＭ　ＮａＣＱ：　６０ｍＭ　　トリス−ＨＣＱ、ｐ
Ｈ＝７．５　；　６０ｍＭ　ＭｇＣＱｚ：　６０ｍＭＤ
ＴＴ；およびｌ　ｍｇ／ｍＱ　Ｂ　Ｓ　Ａｌ（２μ１２
）に再懸濁した。このＤＮＡ溶液に制限酵素Ｐｖｕｌｌ
（約２ｕＱ：約ＩＯ単位）を加えた後、反応液を３７℃
で２時間インキュベートした。 ＡＣＣＩ　−Ｐｖｕｌｌ消化した、Ａｄ２の−２，４ｋ
ｂＢａｌｌ制限フラグメントを〜６％ポリアクリルアミ
ドゲルにかけ、Ａｄ２の後期プロモーターを含有する−
０．３２ｋｂのＡｃｃ　Ｉ　−Ｐｖｕｌｌ制限フラグメ
ントが他の消化産物から分離するまで電気泳動を行った
。このゲルを臭化エチジウムで染色し、ＵＶ光を用いて
観察し、〜０．３２ｋｂのＡｃｃｌＰｖｕｌｌ制限フラ
グメントを含んでいるゲル部分をゲルから切り出し、こ
れをつぶし、そして室温で一晩、抽出緩衝液［５００ｍ
Ｍ　ＮＨ＊ＯＡｃ　；　ｌ　ＯｍＭ　ＭｇＯＡｃ；　１
ｍＭ　ＥＤＴＡ　；および０，１％ＳＤＳ］（〜２５０
μＱ）中に浸した。翌朝、この混合物を遠心し、ペレッ
トを捨てた。上清中のＤＮＡをエタノールで沈澱させた
。ｔＲＮＡ（約２μｇ）を加えて所望のフラグメントの
沈澱を確実なものにした。−０，３２ｋｂ　Ａｃｃｌ−
Ｐｖｕｌｌ制限フラグメントが約０．２μ９得られ、こ
れを水（７μ１２）に懸、蜀させた。 このＡｃｃ　Ｉ　−Ｐｖｕｌｌ制＠７ラグメントをＡｃ
ｃｌ−Ｂｃｌｌ制限フラグメントに変換するため、〜０
゜３２ｋｂ　Ａｃｃｌ　−Ｐｖｕｌｌ制限７ラグメント
にＢｃｌＩリンカ−をライゲート用シを二。Ｂｃｌ　Ｉ
リンカ−は平滑末端であるので、このリンカ−は制限７
ラグメントのＰｖｕｌｌ末端にだけ結合した。以下の配
列を有するＢｃｌｌリンカ−（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ
　Ｂｉｏｌａｂｓ）を、次の方法によりライゲート用に
キナーゼ処理し、用意した： ５’　−ＣＴＧＡＴＣＡＧ−３’ ３’　−ＧＡＣＴＡＧ丁Ｃ−５゛ リンカ−（４μＱ；〜２μｇ）を水（２０，１５μＱ）
およびＩＯＸのキナーゼ緩衝液［５００ｍＭ　　トリス
−ＨＣＱ％ｐＨ＝７．６　；およびｌ　００ｍＭ　Ｍｇ
ＣＱ、］（５μａ）に溶解し、９０°Ｃで２分間インキ
ュベートし、次いで室温まで冷却した。この混合物に７
３２Ｐ−ＡＴＰ（５μＱ；〜２０μＣｉ）、１Ｍ　ＤＴ
Ｔ（２、５ｕＱ）、およびポリヌクレオチドキナーゼ（
５μＱ；〜１０単位）を加え、３７℃で３０分間インキ
ュベートした。次に、０．０１Ｍ　ＡＴＰ（３，３５μ
Ｑ）およびキナーゼ（５μ０．）を加え、この反応液を
さらに３０分間、３７°Ｃに保った。放射活性のＡＴＰ
は、リンカ−が標的ＤＮＡにライゲートしたかどうかを
調べる際の助けとなる。 （以下、余白） キナーゼ処理したＢｅ１ｌリンカ−（約０．２５μり：
０．５ｕＱ中）を−０，３２ｋｂ　Ａｃｃ［−Ｐｖｕｌ
ｌ制限フラグメントの溶液に加え、次に、このＤＮＡ溶
液に７４ＤＮＡリガーゼ（ＩμＱ：〜１０００単位）お
よびＩＯＸのリガーゼ緩衝液（１ｕＱ）を加え、得られ
た反応液を１６°Ｃで一部インキユベートした。 Ｂｃｌｌリンカ−はＡｃｃ　Ｉ　−Ｐｖｕｌｌ制限フラ
グメントのｐｖｕｌｌ末端にだけライゲートすることが
できた。後のＤＮＡ配列決定により、Ａｃｃ　Ｉ　−Ｐ
ｖｕｌｌ制限フラグメントのＰｖｕｌｌ末端には４個の
Ｂａ１ｌリンカ−か結合していることがわかった。これ
ら余分のＢａ１ｌリンカ−はＢｃｌ＋消化と再ライゲー
トによって除くこと力１できるが、これらりンカーは余
分のリンカ−を含んでいるベクターか適切に機能するの
を妨げないので、余分のＢｃｌｌリンカは除去しなかっ
た。 大腸菌Ｋ　ｌ　２　　ＨＢ　ｌ　０１／ｐＳＶ２ｃａｔ
細胞をＡＴＣＣから取得番号ＡＴＣＣ３７１５５のもと
凍結乾燥形で入手し、テトラサイクリンの代わりに５０
μｇ／ｍＱのアンビ／リンを用いること以外は実質的に
実施例ＩＡの方法に従って、この細胞からプラスミドｐ
ＳＶ２ｃａｔＤＮＡを単離した。 このプラスミドｐｓＶ２ｃａＬの制限部位および機能地
図を添付の第１Ｂ図に示す。約１ｍｇのプラスミドｐ５
Ｖ２ｃａｔ　ＤＮＡを得、これをＴＥ緩衝液（１ｍＱ）
に溶解した。プラスミドｐＳ　Ｖ　２ｃａＬ　ＤＮＡ（
約３ｕｙ：３ｕＱ）をｌＯＸのＡｃｃｌ緩衝液（２μＱ
）および水（１６μＱ）に加え、次いでこのｐｓＶ２ｃ
ａｔＤＮＡの溶液に制限酵素ＡＣＣＩ（３μＱ；約９単
位）を加え、得られた反応液を３７°Ｃで２時間インキ
ュベートした。次に、このＡｃｃ＋消化したプラスミド
ｐＳＶ２ｃａｔ　ＤＮＡを、ＩＯＸの５ｔｕｌ緩衝液［
１，０Ｍ　ＮａＣＱ；　ｌ　００ｍＭ　　トリス−ＨＣ
Ｑ。 ｐＨ＝８．０　；　ｌ　００ｍＭ　ＭｇＣＱ２：　６０
ｍＭ　ＤＴＴ；およびｌ　ｍｇ／ｍＱ　Ｂ　Ｓ　Ａ］（
３μＱ）、水（５μＱ）、および制限酵素Ｓ　ｔｕ　Ｉ
　（約２μＱ；約ＩＯ単位）を加えることにより制限酵
素Ｓ　Ｌｕ　［で消化した。得られた反応液を３７°Ｃ
で２時間インキュベー１−　した。 この反応混合物をフェノールで１回、次いでクロロホル
ムで２回抽出することによって反応を停止させた。約０
．５μ９の目的フラグメントか得られ、これをＴＥ緩衝
液（２０μＱ）に溶解した。 Ａｃｃ　Ｉ　−５ｔｕ　ｒ　ｉ？！ｌ化しｌニブラスミ
ドｐＳｖ２ＣａｔＤＮＡ（約４μＱ）をＡｄ２の〜０．
３２ｋｂ　ＡｃｃｌＰｖｕｌｌ（Ｂｃｌ　Ｉリンカ−が
結合している）制限フラグメント（約７　ｐＱ）と混合
し、ＩＯＸのりガーゼ緩衝液（３μＱ）、水（１５μＱ
）、およびＴ４　　ＤＮＡリガーゼ（２μＱ；約１００
０単位）を加えた後、このライゲート反応液を１６°Ｃ
で一部インキユペートした。ライゲートしたＤＮＡは、
クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝
子を転写させ、従ってこれを発現させるように設置され
たＡｄ２ｉ＆期プロモーターを含有するプラスミドであ
る、目的のプラスミドｐＬＰｃａｔを構成していた。プ
ラスミドｐＬＰｃａｔの制限部位および機能地図を添付
の第１Ｂ図に示す。 このライゲートしたＤＮＡを用い、実質的に実施例２Ｂ
の方法に従って大腸菌Ｋ１２　　ＨＢＩＯ１細胞を形質
転換した。形質転換細胞を５０μｇ／ｍＱアンピ／リン
含何のＬ寒天プレートに蒔いた。 プラスミドＤＮＡの制限酵素分析により大腸菌に１２　
　ＨＢ　Ｉ　ＯＩ／ｐＬＰｃａｔ形質転換体を同定した
。選択剤としてテトラサイクリンの代わりにアンビ／リ
ンを用いること以外は実質的に実施例１Ａ記載のプラス
ミド単離法に従って、後の構築で用いるｌ；めのプラス
ミドｐＬＰｃａｔＤＮＡを形質転換体から単離した。 Ｄ、プラスミドｐＢＬｃａｔの構築 ＴＥ緩衝液（５０μＣ）中のプラスミドｐＢＫｎｅｏｌ
ＤＮＡ（約８８１１ｇ）を、ＩＯＸのＡｃｃ！緩衝液（
７゜５μＱ）、水（３０μＱ）、および制限酵素Ａｃｃ
！（１５μＱ；約７５単位）に加え、得られた反応液を
３７℃で２時間インキュベートした。このＡＣＣＩ消化
したプラスミドｐＢＫｎｅｏｌ　　ＤＮＡをアガロース
ゲルにかけ、ＢＫエンハンサ−を含む〜１．４ｋｂの７
ラグメントを他の消化産物から分離した。次いで、この
〜１．４ｋｂＡｃｃｌ制限フラグメントをゲルから単離
し、精製した。このフラグメント（約５　ｕｇ）を、Ｉ
ＯＸのＰｖｕｌｌ緩衝液（５μＱ）、水（４５１１＋２
）、および制限酵素Ｐｖｕｌｌ（５μＱ；約２５単位）
に再堅濁し、得られた反応液を３７°Ｃで２時間インキ
ュベートした。次いで、このＰｖｕｌｌ消化したＤＮＡ
を単離し、精製し、モしてライゲート用に調製した。約
２μりの所望の〜Ｉ　、２８ｋｂ　Ａｃｃｌ　−ｐｖｕ
ｌ１７ラグメントが得られ、これをＴＥ緩衝液（５μＱ
）に溶解した。 プラスミドｐＬ　Ｐｃａｔ　Ｄ　Ｎ　Ａ（約ｌμｇ）を
ＩＯＸのＡｃｃｌ＠衝液（５ｐＱ）および水（４０μＱ
）に溶解した。このプラスミドｐＬＰｃａｔＤＮＡの溶
液に制限酵素ＡＣＣＩ（約５μＱ：〜２５単位）を加え
、得られた反応液を３７°Ｃでインキュベートした。こ
のＡｃｃｌ消化したプラスミドｐＬＰｃａｔ　ＤＮＡを
エタノールで沈澱させ、ＩＯＸのＳ　Ｌｕ　［緩衝液（
５１ｔ（１）、水（４０ｕＱ）、および制限酵素５ｔｕ
ｒ（５μＱ；約２５単位）に再懸濁し、得られた反応液
を３７℃で２時間インキュベートした。このＡｃｃｌＳ
ｔｕｌ消化したグラスミドｐＬＰｃａｔＤＮＡをエタノ
ールで数回沈澱させ、大きさが約１６ｂｐの制限フラグ
メントである他の消化産物から、Ａｄ２後期プロモータ
ーおよび大腸菌の複製起源を含有する−４．８１ｋｂの
Ａｃｃｌ−５ｔｕｌ制限フラグメントを精製した。目的
の〜４．８１ｋｂ制限フラグメントが約ｌμｇ得られ、
これをＴＥｆｉ衝液（２０μＱ）に溶解した。 プラスミドｐＬＰｃａｔの−４，８１ｋｂ　ＡｃｃｌＳ
　ｔｕ　Ｉ制限７ラグメント（５μＱ）を、プラスミド
ｐＢＫｎｅｏｌの−１，２８ｋｂ　Ａｃｃｌ　−Ｐｖｕ
ｌｌ制限フラグメント（５μＱ）に加えた。このＤＮＡ
混合物に１０Ｘのりガーゼ緩衝液（３μＱ）、水（１５
μＱ）、およびＴ４　　ＤＮＡリガーゼ（２μＱ；約Ｉ
Ｏ単位）を加えた後、得られたライゲート反応液を１６
°Ｃで一部インギュベートした。ライゲートしたＤＮＡ
は目的のプラスミドｐＢＬｃａＥを構成していた。プラ
スミドｐＢＬｃａｔの制限部位および機能地図を添付の
第１ｃ図に示す。 ライゲートしたＤＮＡを用い、実質的に実施例２Ｂ記載
の方法に従って大腸菌Ｋ１２　　ＨＢＩＯ１細胞を形質
転換した。大腸菌Ｋ１２　　ＨＢＩＯ１／ｐＢＬｃａｔ
形質転換体はそのプラスミドＤＮＡの制限酵素分析によ
って同定した。後の構築に用いるため、選択剤としてテ
トラサイクリンの代わりにアンピンリンを用いること以
外は実質的に実施例ＩＡの方法に従って、プラスミドｐ
ＢＬｃａｔＤＮＡを調製しｔ；。 Ｅ、プラスミドｐＬ　ｌ　３３の構築 プラスミドｐＬ　ｌ　３３はヒトプロティンＣの発現ベ
クターである。プラスミドｐＬ　ｌ　３３は、下記のよ
うに、出発ベクタープラスミドｐＳＶ２ｇｐｔおよびｐ
ＨＣ７（プラスミドｐＨＣ７の調製は前記実施例ＩＡに
記載）を用いて中間体ベクタープラスミドｐｓＶ２−Ｈ
ＰＣＢを構築し、次いでこれをプラスミドｐＳＶ２−β
−グロビンと組合せて構築することかできる。プラスミ
ドｐＬ　ｌ　３３構築のプロトコールを以下で詳細に説
明し、添付の第２図に図示する。 プラスミドｐＨＣ７ＤＮＡ（５０μＱ；〜５０μｇ）を
、制限酵素Ｂａｎ１　（５μ１２；　−５０単位）、Ｉ
ＯＸのＢａｎ１反応緩衝液［１，５Ｍ　ＮａＣＱ：　６
０ｍＭトリス−ＨＣＱ、ｐＨ−７，９；　６０ｍＭ　Ｍ
ｇＣＱｘ；およびｌ　ｍｇ／ｍＱ　Ｂ　Ｓ　Ａｌ（Ｉ　
ＯμＱ）、および水（３５μＱ）と混合し、消化が完結
するまでインキュベートした。次いで、このＢａｎ１消
化したプラスミドｐＨＣ７ＤＮＡを、−１，２５ｋｂ　
Ｂａｎ＋制限７ラグメントが他の消化産物から分離する
まで、３゜５％ポリアクリルアミドゲル（２９：ｌ、ア
クリルアミド：ビス−アクリルアミド）電気泳動にかす
ｊこ。 〜１．２５ｋｂのＢａｎ１制限フラグメントを含んでい
るゲルの領域をゲルから切り出し、試験管に入れ、小さ
くつぶした。このフラグメントの入った試験管に抽出緩
衝液［５００ｍ〜Ｉ　Ｎ　Ｈ＊　ＯＡ　Ｃ％１０ｍ〜ｉ
　ＭｇＯＡｃ、ＩｍＭ　ＥＤＴＡ、１％　ＳＤＳ、およ
びＩ　Ｏｍｇ／ｍＱ　ｔＲＮＡ］（１ｍＱ）を加え、こ
の試験管を一晩、３７°Ｃに保った。遠心して残骸をペ
レット化し、上清を新しい試験管に移した。 残骸を抽出緩衝液（２００μＱ）で１回洗浄し、洗浄上
清を一晩抽出物の最初の上溝と合わせた。この上清をガ
ラスクールのプラグに通した後、上溝に２容量のエタノ
ールを加え、混合した。得られた溶液をドライアイス−
エタノール浴に〜１０分間入れ、次いで遠心することに
よりＤＮＡをペレット化した。 この方法により約８μりの〜Ｉ　、２５ｋｂ　Ｂａｎ　
＋制限７ラグメントが得られた。精製したフラグメント
をＴＥ緩衝液（１０ｔｉＱ）に懸濁し、−２０℃で保存
した。プラスミドｐＳＶ２−ＨＰＣ８を構築するために
は、リンカ−の付加によってＢａｎ１制限フラグメント
を修飾しなければならなかった。このリンカ−の構築に
用いるＤＮＡ７ラグメントは、５ｙｓｔｅｃ　１４５０
Ａ　ＤＮＡ合成機（Ｓｙｓｔｅｃ　Ｉｎｃ、、　３８１
６Ｃｈａｎｄｌｅｒ　Ｄｒｉｖｅ、　Ｍｉｎｎｅａｐｏ
ｌｉｓ、　ＭＮ）、またはＡＢＳ３ｇＯＡＤＮＡ合成ａ
　（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ、
。 ８５０　Ｌｉｎｃｏｌｎ　Ｃｅｎｔｒｅ　Ｄｒｉｖｅ、
　Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃ１ｔｙ、　ＣＡ　９４４０４）のど
ちらかを用いて合成した。当分野では多数のＤＮＡ合成
装置か知られており、フラグメントの調製に用いること
ができる。さらに、実質的にイタクラ等（Ｉｔａｋｕｒ
ａ　ｅｔ　ａｔ、、　１９７７、５ｃｉｅｎｃｅ。 １９８：１０５６）、およびフレア等（Ｃｒｅａ　ｅｃ
　ａｌ、、１９７８゜Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ、Ｓ
ｃｉ、ＵＳＡ、　７５：５７６５）の方法に従って７ラ
グメントを常法通りに調製することもてき１本鎖のリン
カ−それぞれ（５００ｐモル）を、Ｔ４ポリヌクレオチ
ドキナーゼ（１５単位；〜０゜５　ｕＱ）、ＩＯＸのリ
ガーゼ緩衝液（２ｕＱ）、５００μＭのＡＴＰ（ｌ　Ｑ
μＱ）、および水（７，５μＱ）を含む反応緩衝液（２
０μＱ）中でキナーゼ処理した。このキナーゼ反応液を
３７℃で３０分間インキュベートし、そして１００°Ｃ
で１０分間インキュベートすることにより反応を停止さ
せた。キナーゼ処理（ｋｉｎａｔｉｏｎ）を確実にする
ため、反応液を氷上で冷却し、これに０．２Ｍジチオト
レイトール（２μＱ）、５ｍＭ　ＡＴＰ（２，５μＱ）
、およびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（１５単位）を
加えて混合し、３７°Ｃでさらに３０分間インキュベー
トした。１００℃でさらに１０分間インキュベートする
ことによって反応を停止させ、次いで氷上で冷却した。 キナーゼ処理は別々に行ったが、キナーゼ反応後に２本
の１本鎖ＤＮＡリンカ−をいっしょにして混合した。鎖
をアニーリングするため、キナーゼ反応混合物を、水（
〜１５０ｍ４）を入れた水浴中、１００℃で１０分間イ
ンキュベートした。このインキュベートの後、水浴の加
熱をやめ、室温まで冷却させた。この工程に約３時間を
要した。次いで、キナーゼ処理したＤＮＡの試験管が入
ったままの水浴を４°Ｃで一部インキユベートした。こ
の操作により１本鎖かアニーリングした。作成したリン
カ−は次の構造を宵していた： ５’　−ＡＧＣＴＴＴＧＡＴＣＡＧ−３’３’　−ＡＡ
ＣＴＡＧＴＣＣＡＣ（１，−５’このりンカーを使用時
まで一２０°Ｃで保存した。 このリンカ−（〜５０μＱ；〜５００ｐモル）、Ｔ４　
　ＤＮＡリガーゼ（ｌμＱ；〜５単位）、ｌＯＸのリガ
ーゼ緩衝液（１０μＱ）、および水（２９μＱ）に、−
１，２５ｋｂ　Ｂａｎ＋フラグメント（−８μｇ）を加
えて混合し、得られたライゲート反応液を４°Ｃで一部
インキユベートした。６５°Ｃで１０分間インキュベー
トすることによってこのライゲート反応を停止させた。 最終濃度０．３〜１になるまでＮａ０Ａｃを加え、２容
量のエタノールを加え、ドライアイス−エタノール浴で
冷却し、次いでこの溶液を遠心することによってＤＮＡ
をペレット化した。 このＤＮＡペレットをＩＯＸのＡｐａ＋反応緩衝液［６
０ｍＭ　ＮａＣＱ；　６０ｍＭ　トリス−ＨＣＬｐＨ−
７，４；　６０　ｍＭ　ＭｇＣ１２２；および６０ｍＭ
２−メルカプトエタノール１（ｌＯμＱ）、制限酵素Ａ
ｐａ＋（５μＱ；〜５０単位）、水（８５μＱ）に溶解
し、反応液を２時間、３７°Ｃに保った。次いで、上記
のようにして反応を停止させ、ＤＮＡをペレット化しｌ
二。このＤＮＡペレットをＩＯＸのＨ４ｎｄｌｌ１反応
緩衝液（１０μＱ）、制限酵素Ｈｉｎｄｌｌｌ（５μ１
２；−５０単位）、水（８５μＱ）に溶解し、反応液を
２時間、３７°Ｃに保った。このＨ４ｎｄｌｌｌ消化の
後、反応混合物を３．５％ポリアクリルアミドゲルにか
け、所望の−１，２３ｋｂ　Ｈｉｎｄｌｌｌ−Ａｐａｌ
ルミｌ制限フラグメントから単離し、精製した。約５１
１ｇの目的フラグメントか得られ、これをＴＥ緩衝液（
１０μＱ）に懸濁し、−２０°Ｃで保存した。 プラスミドｐＨＣ７ＤＮＡ（５０μＱ：〜５０μｇ）を
、制限酵素ＰＳＬＩ（５μｆｌ；−５０単位）、ＩＯＸ
のＰｓｔ１反応緩衝液Ｎ　、ＯＭ　ＮａＣＪ　１００ｍ
Ｍトリス−ＨＣＱ、ｐＨ−７，５；　ｌ　００ｍＭ　Ｍ
ｇＣＱ２：およびｌ　ｍｇ／ｍＱ　Ｂ　Ｓ　Ａｌ（１０
μＱ）、および水（３５μＱ）と混合し、３７°Ｃで２
時間インキュベートした。次いで、実質的に上記方法に
従い、Ｐｓｔｌ消化したプラスミドｐＨＣ７ＤＮＡを３
．５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、目的の
〜０．８８ｋｂ７ラグメントを精製した。約５μ９の目
的フラグメントが得られ、これをＴＥ緩衝液（ｌＯμＱ
）に懸濁し、−２０°Ｃで保存した。 この〜０．８８ｋｂ　ＰＳＬＩフラグメント（〜５μｇ
）を、自動ＤＮＡ合成機で作成した以下のリンカ−（〜
５０μＱ）に加え、混合した： ５’　−ＧＴＧＡＴＣＡＡ−３’ ３’　−ＡＣＧＴＣＡＣＴＡＧＴＴＣＴＡＧ−５’この
ＤＮＡ混合物にＴ４　　ＤＮＡリガーゼ（約ｌμＱ：〜
１０１１１位）、ＩＯＸリガーゼ緩衝液（１０μＱ）、
および水（２９μＱ）を加え、得られたライゲート反応
液を４°Ｃで一部インキユベートした。 このライゲート反応を６５°Ｃで１０分間インキュベー
トすることにより停止させた。ライゲートしたＤ　Ｎ　
Ａを沈澱させた後、このＤＮＡペレットを、１０ＸのＡ
ｐａ［反応緩衝液（１０μｆ１）、制限酵素Ａｐａ＋（
５μＱ；−５０単位）、および水（８５μＱ）に溶解し
、反応液を２時間、３７°Ｃに保った。次いで、反応を
止め、もう−度ＤＮＡをペレット化した。このＤＮＡペ
レットを、ＩＯＸのＢｇｌｌ１反応緩衝液ＮＭ　ＮａＣ
Ｑ；　ｌ　００ｍＭ　トリス−ＨＣＱ。 ｐＨ＝７．４　；　１００ｍＭ　Ｍｇ（、Ｌ；　１００
ｍＭ　２メルカプトエタノール；および１ｍｇ／ｍＱＢ
ｓＡ］（ｔｏμＱ）、制限酵素Ｂｇｌｌｌ　（５μＱ；
〜５０単位）、および水（８５μ１２）に溶解し、反応
液を２時間、３７°Ｃに保った。このＢｇｌｌ＋消化の
後、実質的に上記方法に従い、反応混合物を３．５％ポ
リアクリルアミドゲル Ａｐａ　Ｉ　−　８ｇｌｌｌ制限フラグメントを単離し
た。約１μりの目的７ラグメントが得られ、これをＴＥ
緩衝液（１０ｕＱ）に懸濁し、−２０°Ｃで保存した。 約１０μりのプラスミドｐｓＶ２ｇｐｔ　ＤＮＡ（ＡＴ
ＣＣ　　３７１４５）を、ｌＯＸのＨｉｎｄ！Ｉｆ反応
緩衝液（ｌｏμＱ）、制限酵素Ｈｉｎｄｌｌｌ（５μＱ
；　−５　０単位）、および水（８５μＩ２）に溶解し
、この反応液を２時間、３７°Ｃに保った。次に、この
反応混合物を０．２５ＭのＮａ０Ａｃとし、モして２容
量のエタノールを加え、ドライアイス−エタノール浴で
インキュベートした後、遠心してＤＮＡをペレット化し
た。このＤＮＡベレットをＩＯＸのＢｇｌｌ＋緩衝液（
１０μＱ）、制限酵素Ｂｇｌｌｌ（５μＱ；〜５０単位
）、および水（８５μＱ）に溶解し、この反応液を２時
間、３７°Ｃに保った。このＢｇｌｌｌ消化の後、この
反応混合物を１％アガロースゲルにかけ、電気泳動で７
ラグメントを分離した。このゲルを臭化エチジウムで染
色し、紫外光のもとで観察し、目的の−５、ｌ　ｋｂ　
Ｈ１ｎｄｌｌｌ　−８ｇｌｌｌフラグメントを含んでい
るバンドをゲルから切り出し、透析管に入れ、ＤＮＡか
アガロースから出てしまうまで電気泳動を続けた。この
透析管からＤＮＡ含有の緩衝液をフェノールおよびクロ
ロホルムで抽出し、次いでＤＮＡを沈澱させた。このペ
レットはプラスミドｐＳ　Ｖ　２　ｇｐｔ（７）所望ノ
ー　５　、　ｌ　ｋｂ　Ｈ１ｎｄｌｌｌ　−８ｇｌｌｌ
制限フラグメント（〜５μｇ）からなり、これをＴＥ緩
衝液（ＩＯＪＩＱ）に再懸濁した。 −Ｉ　−２３ｋｂ　Ｈｉｎｄｌｌｌ−Ａｐａｌルミｌ制
限フラグメントＱ）、−０，１９ｋｂ　Ａｐａｌ　　８
ｇｌｌ１７ラグメント（３ｕＱ）、および−５，ｌｋｂ
　Ｈｉｎｄｌｌｌ−８ｇｌｌｌフラグメント（２μＱ）
を混合し、次いで、１０ｘのリガーゼ緩衝液（１０μＱ
）、Ｔ４　　ＤＮＡリガーゼ（１μＱ；〜５００単位）
、および水（８２μＱ）とともに１６°Ｃで一部インキ
ユベートした。このライゲートしｆ：Ｄ　Ｎ　Ａは目的
のプラスミドｐＳＶ２８ＰＣ８を構成していた。このプ
ラスミドの制限部位および機能地図を添付の第２図に示
す。 実質的に、実施例２Ｂで大腸菌Ｋ１２　　ＨＢＩＯｌに
ついて記載した方法に従い、大腸菌Ｋ１２ＲＲ１，（Ｎ
ＲＲＬ　　Ｂ−１５２１０）細胞を形質転換に対してコ
ンピテントにした。上記調製のライゲートしたＤＮＡを
用いてこの細胞を形質転換し、形質転換混合物の一部を
１００μｇ／ｍＱアンビンリン含有のし寒天プレートに
蒔いた。次いで、このプレートを３７℃でインキュベー
トした。大腸菌ＫＩ２　　ＲＲＩ／ｐｓＶ２−ＨＰＣ８
形質転換体をそのプラスミドＤＮＡの制限酵素分析によ
って確認した。細胞培養中の選択剤としてテトラサイク
リンではなくアンピシリンを用いることを除き、実質的
に実施例ＩＡの方法に従って形質転換体からプラスミド
ｐＳＶ２−ＨＰＣ８ＤＮＡを調製しｌこ。 プラスミドｐｓＶ２−ＨＰＣ８（５０Ｍｇ）を、１０Ｘ
のＨｉｎｄｌｌ１反応緩衝液（１０μＱ）、制限酵素Ｈ
ｉｎｄｌｌｌ（５μ１２；−５０単位）、および水（８
５μＱ）に溶解し、この反応液を３７°Ｃで２時間イン
キュベートシた。このＨｉｎｄｌｌｌ消化の後、ＤＮＡ
を沈澱させ、ＤＮＡペレ７）をＩＯＸのＳａｌ１反応緩
衝液Ｈ，５Ｍ　ＮａＣＱ；　６０ｍＭ’　トリス−ＨＣ
Ｑ。 ｐＨ＝７．９　；　６０ｍＭ　ＭｇＣＬ；　６０ｍＭ　
　２−メルカプトエタノール；および１　ｍ９／ｒｎＱ
　Ｂ　Ｓ　Ａ　１（ＩＯμＱ）、制限酵素Ｓａｔ［（５
μ４；−５０単位）、および水（８５μＱ）に溶解した
。得られたＳａｌ１反応混合物を３７℃で２時間インキ
ュベートした。 このＨ１ｎｄｌｌｌ　−Ｓａｌ　Ｉ消化したプラスミド
ｐｓＶ２−　ＨＰ　Ｃ８を３．５％ポリアクリルアミド
ゲル番こかけ、所望の−０，２９ｋｂ　Ｈｉｎｄｌｌｌ
−５ａｉｌ制限フラグメントが他の反応生成物から分離
するまで電気泳動を行った。目的の７ラグメントをゲル
から単離した。約２ｕｇの７ラグメントか得られ、これ
をＴＥ緩衝液（１０μＱ）に懸濁した。 プラスミドｐｓＶ２−ＨＰＣ８（５０Ｍｇ）をｌＯＸの
Ｂｇ１１１反応緩衝液（１０μＱ）、制限酵素Ｂｇｌｌ
ｌ（５μＱ；５０単位）、および水（８５μＱ）に溶解
し、この反応液を３７°Ｃで２時間インキュベートした
。 このＢｇｌｌ＋消化の後、ＤＮＡを沈澱させ、ＤＮＡペ
レットをＩＯＸのＳａｌ１反応緩衝液（１０／１１２）
、制限酵素５ａｌｌ（５ｕ（ｉ；−５０単位）、および
水（８５μＱ）に溶解した。得られたＳａｌ１反応混合
物を３７°Ｃで２時間インキュベートした。このＳａｌ
ＩＢｇｌｌ＋消化したプラスミドｐｓＶ２−ＨＰＣ８を
３．５％ポリアクリルアミドゲルにかけ、所望の−１、
Ｉ　５ｋｂ　Ｓａｌ　Ｉ　−８ｇｌｌｌ制限フラグメン
トか他の反応生成物から分離するまで電気泳動を行った
。−１，１５ｋｂのＳａｌ　Ｉ　−８ｇｌｌｌ制限フラ
グメントをゲルから単離した。約８μ９の７ラグメント
を得、これをＴＥ緩衝液（１０μＱ）に懸濁した。 約ｌＯμ９のプラスミドｐＳＶ２−β−グロビンＤＮＡ
（ＮＲＲＬ　　Ｂ−１５９２８）を、ＩＯＸのＨｉｎｄ
ｌｌ１反応緩衝液（ｌｏμｄ）、制限酵素Ｈｉｎｄｌｌ
ｌ（５μＱ；〜５０単位）、および水（８５μＱ）に溶
解し、この反応液を２時間、３７°Ｃに保った。次に、
この反応混合物を０．２５ＭのＮａ０Ａｃとし、そして
２容量のエタノールを加え、ドライアイス−エタノール
浴でインキュベートした後、遠心してＤＮＡをペレット
化した。このＨｉｎｄｌｌｌ消化したプラスミドｐＳＶ
２−β−グロビンをＩＯＸのＢｇｌｌｌ緩衝液（１０μ
Ｑ）、制限酵素Ｂｇｌｌｌ（５μＱ；〜５０単位）、お
よび水（８５μＱ）に溶解し、この反応液を２時間、３
７℃に保った。このＢｇｌｌ＋消化の後、この反応混合
物を１％アガロースゲルにかけ、電気泳動で７ラグメン
トを分離した。目的の〜４゜２ｋｂ　Ｈｉｎｄｌｌｌ−
８ｇｌｌｌ制限フラグメントをゲルから単離した。約５
μ９の目的フラグメントが得られ、これをＴＥＭ衝液（
１０μＱ）に再懸濁した。 プラスミドｐＳＶ２−ＨＰＣ８の〜０．２９ｋｂＨ１ｎ
ｄｌｌｌ　−Ｓａｌ　Ｉ　７ラグメント（２ｕ＋２）、
プラスミドｐＳＶ２−ＨＰＣ８の−１，１５ｋｂ　Ｓａ
ｌｌ−８ｇｌｌ＋７ラグメント（２μＱ）、およびプラ
スミドｐｓＶ２−β−グロビンの−４、２ｋｂ　Ｈｉｎ
ｄｌｌｌＢｇｌｌ＋フラグメント（２μＱ）を混合し、
Ｔ４　　ＤＮＡリガーゼでライゲートした。ライゲート
したＤＮＡは目的のプラスミドｐＬ　ｌ　３３を構成し
ていた。プラスミドｐＬ　ｌ　３３の制限部位および機
能地図を添付の第２図に示す。このライゲート用シたＤ
ＮＡを用いて大腸菌に１２　　ＲＲＩを形質転換し、目
的の大腸菌Ｋ１２　　ＲＲＩ／ｐＬ１３３形質転換体を
、そのアンピンリン耐性の表現型によって、およびその
プラスミドＤＮＡの制限酵素分析によって同定した。 約２０μ９のプラスミドｐＢＬｃａｔ　ＤＮＡを、１０
ＸのＨｉｎｄｌｌｌ緩衝液（１０μＱ）および水（８０
μＱ）に溶解した。制限酵素Ｈｉｎｄｌｌｌ（約１０μ
Ｑ；〜１００単位）をこのプラスミドｐＢＬｃａｔ　Ｄ
ＮＡの溶液に加え、得られた反応液を３７°Ｃで２時間
インキュベートした。このＨｉｎｄｌｌｌ消化したプラ
スミドｐＢＬｃａｔ　ＤＮＡをアガロースゲルにかけ、
ＢＫエンハンサ−とＡｄ２後期プロモーターを含有する
〜０．８７ｋｂのＨ１ｎｄＨＩ制限フラグメントが他の
消化産物から分離するまで電気泳動を行った。 次いで、〜０．８７ｋｂ７ラグメントを単離し、精製し
、ライゲート用に準備した。約２ｕｇの目的フラグメン
トが得られ、これをＴＥ緩衝液（５＋Ｌｆ２）に溶解し
た。 約１，５μりのプラスミドｐＬ１３３ＤＮＡを、１０Ｘ
のＨｉｎｄｌｌｌ緩衝液（２μＱ）および水（１６μＱ
）に溶解した。このＤＮＡ溶液に制限酵素Ｈｉｎｄｌｌ
ｌ（約ｌμＱ；〜ｌＯ単位）を加え、得られた反応液を
３７°Ｃで２時間インキュベートした。次に、ＤＮＡｔ
ＴＥ緩衝液で１００μＱに希釈し、〜０．０６単位のウ
シ腸アルカリホスファターゼで処理し、この反応液を３
７℃で３０分間インキュベートした。この溶液を、ｌｘ
のＳＥＴ［５ｍＭ　　トリス−ＨＣＱ、ｐＨ＝７．８　
；　５ｍＭ　ＥＤＴＡ；および１５０ｍＭ　ＮａＣＱ）
、０．３Ｍ　Ｎａ０Ａｃ、および０゜５％ＳＤＳを含む
ように調節し、次いで６５°Ｃで４５分間インキュベー
トした。次に、Ｈ４ｎｄｌｌｌ消化したプラスミドｐＬ
１３３ＤＮＡをフェノールで２回、そしてクロロホルム
で１回抽出し、エタノールで沈澱させ、ＴＥ緩衝液（１
０μＱ）に再懸濁しｌこ。 プラスミドｐＢＬｃａｔの−０，８７ｋｂ　Ｈｉｎｄｌ
ｌｌ制限フラグメ制限フラグメントラをＨｉｎｄｌｌｌ
消化したプラスミドｐＬ１３３（１，５μ９；ｌＯμＱ
）に加え、次いで、このＤＮＡ溶液にｌＯＸのりガーゼ
緩衝液（２μＱ）、Ｔ４　　ＤＮＡリガーゼ（ｌμＱ：
〜１０重位）、および水（２μＱ）を加え、得られた反
応液を１６°Ｃで一部インキユベートした。ライゲート
したＤＮＡは目的のプラスミドｐｔ、ｐｃを構成してい
た。 実質的に実施例２Ｂの方法に従い、ライゲートしｌ：　
Ｄ　Ｎ　Ａを用いて大腸菌ＫＩ２　　ＨＢＩＯＩを形質
転換した。形質転換細胞をアンピンリン含有のし寒天プ
レートに蒔き、アンビンリン耐性形ｉ転換体のプラスミ
ドＤＮＡを制限酵素分析によって試験して大腸菌Ｋ　ｌ
　２　　ＨＢ　Ｉ　Ｏｌ／ｐＬＰＣ形質転換体を同定し
た。ＢＫエンハンサ−とＡｄ２後期後期モロモーターー
ドしている〜０．８７ｋｂＨｉｎｄｌｌｌ制限フラグメ
ントは、Ｈｉｎｄｌｌｌ消化したプラスミドｐＬ　ｌ　
３３に２つの配向のうちのいずれかで挿入することがで
きるが、そのうちの１つだけがプラスミドｐＬＰＣを生
成した。プラスミドｐＬＰＣの制限部位および機能地図
を添付の第１Ｄ図に示す。 実施例３　プラスミドｐＬＰＣ−１６７Ｇの構築実質的
に、実施例１で説明した、プラスミドｐＬＡＰＣの構築
の際に用いる部位特異的な突然変異誘発およびその他の
構築プロトコールに従い、プラスミドｐＬＰＣ−１６７
Ｇを構築した。しかし、プラスミドｐＬＰＣ−１６７Ｇ
の構築の際に用いる綴衝液およびアニーリング条件は、
シラーおよびスミス（Ｚｏｌｌｅｒ　ａｎｄ　Ｓｍ１ｔ
ｈ、　１９８４．　ＤＮＡ　３：４７９−４８９）が開
示したものによった。 プラスミドｐＬＰＣ−１６７Ｇの構築においては、以下
に示す突然変異誘発オリゴヌクレオチドを用いて、ファ
ージＭｌ　３ｍｐｌ　８−ＨＥ　ｌ（実施例ＩＢ参照）
を部位特異的な突然変異誘発にかけＩこ： ５’　−ＧＡＣＣＡＡＧＡＡＧＡＣＣＡＡＧＴＡＧＧＣ
ＣＣＧＣＧＧＣＴＣＡＴＴＧＡＴＧ−３’この部位特異
的な突然変異誘発によって得られる突然変異７アージを
Ｍ１３ｍｐ１８　　ＨＥ４と命名しｔ二。 プラスミドｐＬＰＣ−１６７Ｇの最後の構築は、実施例
１ｃに記載したプラスミドｐＬＡＰＣの構築に類似する
方法で行った。しかし、プラスミドｐＬＡＰＣは、プラ
スミドｐＬｐｃから得た２つの制限フラグメントを用い
て構築した。プラスミドｐＬＰＣ−１６７Ｇの構築では
、代わりに、これら同一の２つの７ラグメントをプラス
ミドｐＬＡＰＣから得た。プラスミドｐＬＰＣの代わり
にフラグメントの供給源としてプラスミドｐＬ　Ａ　Ｐ
　Ｃを用いた理由は、プラスミドｐＬＰＣ−１６７Ｇ形
質転換体を同定する際の制限分析を容易にするためであ
る。プラスミドｐＬｐｃとｐＬＰＣ−１６７Ｇはその大
きさが極めて接近しているので、プラスミドｐＬＰＣ−
１６７Ｇと「親」（プラスミドｐＬＰＣ）を区別するの
は困難である。ライゲートに用いるフラグメントを精製
するにもかかわらず、種々の因子によりこれらの親は存
在しうる。しかし、プラスミドｐＬ　Ａ　Ｐ　Ｃはプラ
スミドｐＬＰＣ１６，７Ｇより小さいので、プラスミド
ｐＬ　Ａ　Ｐ　Ｃから２つの７ラグメントを得ることに
より、目的のプラスミドｐＬＰＣ−１６７Ｇと親（プラ
スミドＩ）ＬＡＰＣ）を容易に区別することができる。 即ち、プラスミドｐＬＰＣ−１６７Ｇを構築するため、
ファージＭ　ｌ　３ｍｐｌ　８−ＨＥ　４の−０，７ｋ
ｂＳｓｔ１−５ａｌｌ制限フラグメントを、プラスミド
ｐＬＡＰＣの−３，７６ｋｂ　ＥｃｏＲｒ−５ａｌｔ制
限フラグメント、およびプラスミドｐＬ　Ａ　Ｐ　Ｃの
〜２．Ｏｋｂ　ＥｃｏＲＩ　−Ｓｓｔ　Ｉ制限フラグメ
ントにライプ−ｆ・シｆこ。ライゲートしにＤＮＡは目
的のプラスミドｐＬＰＣ，−１６７Ｇを構成しており、
これを大腸菌ＫＩ２　　ＲＶ３０８に導入した。得られ
た大腸菌ＫＩ２　　ＲＶ３０８／ｐＬＰＣ−１６７Ｇ形
質転換体を用いて、真核細胞の形質転換に用いるだめの
、プラスミドｐＬＰＣ−１６７Ｇ　ＤＮＡの大スケール
調製物を得た。 実施例４　プラスミドｐＬＰＣ−１６７Ｆの構築実質的
に、実施例１で説明した、プラスミドｐＬ　Ａ　Ｐ　Ｃ
の構築の際に用いる部位特異的な突然変異誘発およびそ
の他の構築プロトコールに従い、プラスミドｐＬＰＣ−
１６７Ｆを構築した。しかし、プラスミドｐＬＰＣ−１
６７Ｆの構築の際に用いる綴衝液およびアニーリング条
件は、シラーおよびスミス（Ｚｏｌｌｅｒ　ａｎｄ　Ｓ
ｍ１ｔｈ、　１９８４．　ＤＮＡ　３：４７９−４８９
）が開示したものによった。 プラスミドｐＬＰＣ−１６７Ｆの構築においては、以下
に示す突然変異誘発オリゴヌクレオチドを用いて、ファ
ージＭｌ　３ｍｐｌ　８−ＨＥ　ｌ（実施例ＩＢ参照）
を部位特異的な突然変異誘発にかけに； ５°−ＧＡ（、ＣＡＡＧＡＡＧＡＣＣＡＡＧＴＡＴＴＣ
ＣＣＧＣＧＧＣＴＣＡＴＴＧＡＴＧ−３″この部位特異
的な突然変異誘発によって得られる突然変異ファージを
Ｍ　ｌ　３ｍｐｌ　８−ＨＥ　５と命名しｔ二。 プラスミドｐＬＰＣ−１６７Ｆの最後の構築は、実施例
ＩＣに記載したプラスミドｐＬＡＰ（４）構築に類似す
る方法で行った。しかし、プラスミドｐＬ　Ａ　Ｐ　Ｃ
は、プラスミドｐＬＰＣがら得た２つの制限フラグメン
トを用いて構築した。プラスミドｐＬＰＣ−１６７Ｆの
構築では、代わりに、これら同一の２つのフラグメント
をプラスミドｐＬＡＰＣから得た。プラスミドｐＬＰＣ
の代わりに７ラグメントの供給源としてプラスミドｐＬ
　Ａ　Ｐ　Ｃを用いた理由は、プラスミドｐＬＰｃ１６
７Ｆ形質転換体を同定する際の制限分析を容易にするた
めである。プラスミドｐＬＰＣとｐＬＰＣ−１６７Ｆは
その大きさが極めて接近しているので、プラスミドｐＬ
ＰＣ−１６７Ｆと「親」（プラスミドｐＬＰＣ）を区別
するのは困難である。しかし、プラスミドｐＬ　Ａ　Ｐ
　ＣはプラスミドｐＬＰＣ−１６７Ｆより小さいので、
プラスミドｐＬ　Ａ　Ｐ　Ｃから２つの７ラグメントを
得ることにより、目的のプラスミドｐＬＰＣ−１６７Ｆ
と親（グラスミドｐＬＡＰＣ）を容易に区別することが
できる。即ち、プラスミドｐＬＰＣ−１６７Ｆを構築す
るため、ファージＭ　ｌ　３ｍｐｌ　８−ＨＥ　５の−
０，７ｋｂ　５ｓｔｌ　−５ａｌｌ制限フラグメントを
、プラスミドｐＬＡＰＣの−３，７６ｋｂ　ＥｃｏＲＩ
　−５ａｌ　［制限７ラグメント、およびプラスミドｐ
ＬＡＰＣの〜２．０ｋｂＥｃｏＲＩ　−Ｓｓｔ　Ｉ制限
フラグメントにライゲートしｔこ。ライゲートしｔこＤ
ＮＡＩま目的のプラスミドｐＬＰＣ−１６７Ｆを構成し
ており、これを大腸菌Ｋ１２　　ＲＶ３０８に導入した
。得られた大腸菌Ｋ１２　　ＲＶ３０８／ｐＬＰＣ−１
６７Ｆ形質転換体を用いて、真核細胞の形質転換に用い
るための、プラスミドｐＬＰＣ−１６７Ｆ　　ＤＮＡの
大スケール調製物を得た。 実施例５　プラスミドｐＬＰＣ−１６７ＧおよびｐＬＰ
Ｃ−１６７Ｆを用いての、アデノウィルス形質転換した
ヒト肝腎セルライン２９３の形質転換体、およびアデノ
ウィルス−形質転換したゴールデンハムスターセルライ
ンＡＶ１２の形質転換体の作成 ヒト肝腎セルライン２９３は、アメリカン・タイプ・カ
ルチャー・コレクションから、取得番号ＡＴＣＣＣＲＬ
　　１５７３のもとて入手できる。 また、アデノウィルスで形質転換したゴールデンハムス
ターセルラインＡＶ１２は、アメリカン・タイプ・カル
チャー・コレクションかも、取得番号ＡＴＣＣＣＲＬ　
　９５９５のもとで入手できる。 以下に記載する形質転換法は宿主セルラインとして２９
３細胞について言及するものであるが、この方法は、Ａ
ＶＩ２セルラインを含むほとんどの真核セルラインに、
ならびに本発明の発現ベクタに一般的に適用可能である
。 ＡＴＣＣから取得番号ＣＲＬ　　１５７３のもと、１０
％の熱−不活性化ウマ血清を含むイーグル（Ｅａｇｌｅ
）の最少必須培地（Ｇｉｂｃｏ）中に、全面単層の約５
．５ｘｌＯ’の細胞を含む２５ｍｍ”フラスコで２９３
細胞を入手した。このフラスコを３７℃ティンキュベー
トし、培地を週２回交換した。培地は、ｌＯ％ウシ胎児
血清、５０μｇ／ｍＱゲンタマイシン、およびＩ　Ｏｕ
ｇ／ｍＱ　Ａｑｕａ！ＪＥＰＨＹＴＯＮ”フィトナジオ
ン　ヒタミ７　Ｋ　、（Ｍｅｒｃｋ　５ｈａｒｐ　ａｎ
ｄ　Ｄｏｈｍｅ、Ｍｅｒｃｋａｎｄ　Ｃｏ、、Ｉｎｃ、
、Ｗｅｓｔ　Ｐｏ１ｎｔ、　ＰＡ　１９４８６）を追加
したＤ　Ｍ　Ｅ　Ｍ　（Ｇｉｂｃｏ）であった。培地を
除き、ハング（Ｈａｎｋ）のバランス塩溶液（Ｇｉｂｃ
ｏ）ですすぎ、０．２５％トリブンンＣ０，２９／Ｑ　
ＥＤＴＡを含む）を１〜２分間加え、新鮮な培地ですす
ぎ、アスピレター処理を行い、そして継代培養比ｌ：５
または１：１０で新しいフラスコに分けることにより、
細胞を継代培養した。 形質転換の１日前に、細胞を１００ｍｍ皿あたり０．７
ｘ　ｌ　Ｏ’細胞の割合で蒔いた。ＴＥ緩衝液に溶解し
た、滅菌の、エタノール沈澱したプラスミＦＤＮＡを用
いて、２５μｇ／ｍＱの形質転換用プラスミドＤＮＡ（
プラスミドｐＬＰＣ−１６７ＦまたｆｔｐＬＰＧ−１６
７Ｇの形質転換に対しては、通常、以下で説明するよう
に、２種類のプラスミドを用いる；即ち、プラスミドｐ
ＬＰＣ−１６７ＦまたはｐＬＰＣ−１６７Ｇと、選択マ
ーカーを含んでいるプラスミドである）および２５０ｍ
ＭＣａＣＱ２を含む、２ｘのＤＮＡ−ＣａＣＱ２溶液を
調製した。７．０５〜７．１５に調節したｐＨを有し、
２８０　ｍＭ　ＮａＣＱ、５０ｍＭヘペス（Ｈｅｐｅｓ
）、および１．５ｍＭ　リン酸ナトリウムを含む２ｘの
ＨＢＳＳを調製した。２ＸのＤＮＡ−ＣａＣＱ２溶液を
等量の滅菌２Ｘ　ＨＢＳＳに滴下した。２ｘのＨＢＳＳ
を入れた混合管に綿栓付きの１ｍＱの滅菌プラスチンク
ビペノトを挿入し、ＤＮＡを加えながら、気泡を吹き込
んだ。撹拌することなく室温で３０〜４５分間、カルシ
ウム−リン酸塩−ＤＮＡ沈澱物を形成させた。 次に、プラスチノクピペ／トで穏やかにピペッティング
することによって沈澱を混合し、受容細胞を覆う増殖培
地（ｌｏｎＱ）にプレートあたりｒｍＱの沈澱を直接加
えた。３７°Ｃで４時間インキュベートした後、培地を
新鮮な培地に代え、選択圧をかける前に細胞をさらに７
２時間インキュベートした。プラスミドｐＬＰＣ−１６
７ＦまたはｐＬＰＣ−１６７ｃなどのように真核細胞で
機能する選択マーカーを含んでいないプラスミドに対し
ては、プラスミドの混合物、即ち、選択マーカーを欠い
ている本発明の発現ベクターおよび真核細胞で機能する
選択マーカーを含んでいる発現ベクターを形質転換法に
用いる。このような同時形質転換系で用いるためには多
種のベクターが使え、これらにはプラスミドｐＳＶ２−
ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ３７１４６）、ｐＳＶ２−ｎｅｏ（
ＡＴＣＣ３７１４９）、ｐｓＶ２−ｇｐｔ（ＡＴＣＣ３
７１４５）、およびｐｓｖ２ｈｙｇ（ＮＲＲＬ　　Ｂ−
１８０３９）が含まれる。プラスミドｐＳ　Ｖ　２−ｈ
ｙｇは真核宿主細胞にハイグロマイシンＢ耐性を付与す
る。この同時形質転換法は、選択マーカーを持つプラス
ミドを含んでいる細胞の選択を可能にする。これらの細
胞をさらに試験して形質転換用プラスミドの両方を含ん
でいる細胞を同定する。真核細胞用の選択マーカーを含
んでおり、従って同時形質転換法の使用を必要としない
発現ベクターを本発明が包含していることはもちろんで
ある。 ハイグロマイノン耐性を付与する遺伝子を含んでいるプ
ラスミドでトランスフェクションされた細胞に対しては
、最終濃度約２００μｇ／ｍＱとなるようにハイグロマ
イシンＢを増殖培地に加える。 次いで、３〜４日毎に培地を交換しながら、２〜４週間
、３７°Ｃで細胞をインキュベートした。得られたハイ
グロマイノン耐性のコロニーを、その特徴を調べるため
別々の培養フラスコに移した。 プラスミドｐｓ　Ｖ　２−ｎｅｏはネオマイノン（Ｇ４
１８をネオマイノンの代わりに用いることもできる）に
対する耐性を付与し、Ｇ４１８を最終濃度４００μｇ／
ｍＱで加えること以外は実質的にハイグロマイノン耐性
細胞の選択方法に従って、Ｇ４１８耐性コロニーの選択
を行った。 ジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）遺伝子あるいはメト
トレキセイト耐性を付与するｄｈｆｒ遺伝子の誘導体（
ｄｈｆｒ−ｍｔｘ）を、ｄｈｆｒ−欠損のセルラインに
遺伝子あるいはプラスミドを導入するための選択マーカ
ーとして用いること、ならびに、次にプラスミドのコピ
ー数を増幅するためにメトトレキセイトを用いることは
、文献において十分に確立されている。２９３細胞はｄ
Ｍｒ陽性であるので、ｄｈｆｒ遺伝子を含むプラスミド
を含有している２９３の形質転換体は、ｄｈｆｒ陽性の
表現型（ヒポキサンチンとチミジンを欠く培地で増殖す
る能力）に基づいてのみでは選択されない。機能的なｄ
ｈｆｒ遺伝子を欠さ、ｄｈｆｒを含有するプラスミドで
形質転換されるセルラインは、　ｄｈｆｒ＋の表現型に
基づいて選択することかできる。ｄｈｆｒを産生ずる細
胞において選択および増幅マーカーとしてｄｈｆｒを用
いることは十分に研究されてはいないが、文献中の証拠
により、ｄｈｆｒ産生細胞中での遺伝子増幅用に、およ
び選択マーカーとしてｄｈｆｒを用いうろことか示唆さ
れる。本発明は、発現ベクターに用いる選択マーカーに
よって限定されるものではない。さらに、メタロチオネ
イン遺伝子、アデノシンデアミナゼ遺伝子、あるいはＰ
−糖タンパク質遺伝子で例示される多遺伝子耐性族の一
員などの増幅マーカーを用いることもできる。 プラスミドｐＬＰＣ−１６７ＦまたはｐＬＰ０１６７Ｇ
とハイグロマイノン耐性を付与するベクターの混合物で
２９３およびＡＶ’１２セルラインを形質転換し、次い
でハイグロマイシン耐性の細胞を選択すると、多数の形
質転換体が得られた（他の形質転換体は同時形質転換用
ベクターとしてプラスミドｐｓ　Ｖ　２−ｎｅｏを用い
、Ｇ４１８耐性細胞を選択することによって得た）。こ
れら形質転換体を実施例６記載のようにして分析し、ど
のハイグロマイ７ン耐性の細胞がプラスミドｐＬＰＣ１
６７ＦまたはｐＬＰＣ−１６７Ｇを含んでいるかを調べ
た。 実施例６高分泌の形質転換体の選択 実施例５で得られたハイグロマイシン耐性の形質転換体
を、組織培養皿あたり数百細胞クローンの畜産で、１０
０ｍ＋Ｉ＋２組織培養皿で増殖させた。 この培地をデカンテーンヨンし、細胞をハングのバラン
ス塩溶液（Ｇｉｂｃｏ）　Ｓ　ｍＱずつで２回すすいだ
。 滅菌した０、４５％寒天（Ｓｉｇｍａ　Ｔｙｐｅ　４ア
ガロース；カタログ＃Ａ３６４３　；　Ｓｉｇｍａ　Ｃ
ｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、　Ｐ、Ｏ。 Ｂｏｘ　１４５０８．　Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ　６３
１７８）の溶液を、１．８％寒天（４７℃；Ｉｎｃ）を
ダルベツコの改良イーグル（ＤＭＥ）塩（ＧｉｂｃｏＸ
　３７°Ｃ！；３ｍ１２）と混合することによって調製
し、この０．４５％寒天溶液（２ｍＱ）を細胞上に層状
に入れた。 ニトロセルロースフィルター（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　
ａｎｄＳｃｈｕｅｌｌ、　Ｉｎｃ、、　Ｋｅｅｎｅ、　
ＮＨ０３４３１）を煮沸し、次いで２時間オートクレー
ブ処理し、細胞に毒性である浸潤剤を除去した。次に、
このフィルターを寒天層の上に置き、気泡を除去した後
、このプレートを３７°Ｃで１〜３時間インキュベート
した。 次いで、後に行うコロニーの同定を容易にするため、皿
上のフィルターの最初の方向がわかるように、あらかじ
め印をつけておいたこのフィルターを取り、ＰＢＳ（５
０ｍＭトリス−ＨＣＬｐＨ＝７゜２８よびＩ　５ＱｍＭ
　ＮａＣ４）中に入れた。 フィルターの分析の間、皿上の細胞を生きたままに保つ
ため、１．８％寒天（４７°Ｃ；２ｍ４）、ＤＭＥ塩（
３７°Ｃ；２酎）、および２０％ウシ胎児血清を含むＤ
ＭＥ塩（３７°Ｏ；４ｍ１２）からなる混合物（８ｍＯ
，’）を細胞に重ねた。次に、この細胞を３７°Ｃのイ
ンキュベーター内に入れた。 フィルターで行うすべての洗浄および反応は、フィルタ
ーを振動台の上に置いて行った。始めにこのフィルター
を、５％の乳を含むＰＢＳ中、室温でインキュベートす
ることによってブロックした。次に、このフィルターを
ＰＢＳ中で４回すすいだ（１回のすすぎは５分間）。２
，５％ウシ血清アルブミン中の１０μｇ／ｍＱビオチン
化ヤギ抗−ヒドブロチインＣポリクローナル抗体を、フ
ィルターを覆うに十分な量でフィルターに加え、次いで
これを３７°Ｃで１時間インキュベートした。 プロティンＣに対する抗体を調製するために後に使用す
るプロティンＣの精製は、キジール［Ｋ１５ｉｅｌ、　
１９７９．　Ｊ、Ｃ１１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、　６４ニア
６１］の記載のようにして行うことができる。ポリクロ
ーナル抗体は、キャバｙ　ｔ［Ｅ、Ａ、Ｋａｂａｔ、　
”５ｔｒｕｃｔｕｒａｌ　Ｃｏｎｃｅｐ（ｓ　ｉｎ　１
ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ　＋　Ｈｏ１ｄ。 Ｒｈ１ｎｅｈａｒｔ、およびＷｉｎｓｔｏｎ版（１９６
８）］が開示した方法で調製することができる。また、
本検定で用いるのに適したモノクローナル抗体は、コー
ラ−およびミルンユタイン［Ｋｏｈｌｅｒ　ａｎｄ　Ｍ
ｉｌｓｔｅｉｎ、　１９７５゜Ｎａｔｕｒｅ、　２５６
：４９５］の記載のようにして、または米国特許Ｎｏ、
４，６９６，８９５　；　Ｅ　Ｐ　ＯＰｕｂ、　Ｎｏ、
２０５０４６　；ラウレル等［Ｌａｕｒｅｌｌ　ｅｔ　
ａｌ、、　１９８５．　ＦＥＢＳ　ＩＪ（１）ニア５］
　；スズキ等［５ｕｚｕｋｉ　ｅｔ　ａｌ、、１９８５
．　Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ。 ９７：１２７−１３８］　；およびＥ　Ｐ　ＯＰｕｂ、
　Ｎｏ、１３８２２２の記載のようにして調製すること
ができる。本検定で用いるアビジンＤおよびビオチン化
した西洋ワサビペルオキンダーゼ（ＨＲＰ）はＶｅｃｔ
ａｓｔａｉｎ”キット［Ｖｅｃｔｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｉｅｓ、　Ｉｎｃ、、　３０１ｎｇｏｌｄＲｏａｄ
、　Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、　ＣＡ　９４０１０］で入
手することができる０まｌコ、ビオチンもＶｅｃｔｏｒ
　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ。 Ｉｎｃ、から得られる。 フィルターを４℃のＰＢＳで４回すすいだ。次に、Ｖｅ
ｃｔａｓｔａｉｎ”　（Ｖｅｃｔｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｉｅｓ）キット中の製造元の指示に従って、アビジ
ンＤおよびビオチン化した西洋ワサビペルオキシダーゼ
を調製し、加えた。ＨＲＰとコンジュゲートしたアビジ
ンＤとともに４℃で１時間（タンパク質が少量分泌され
ているときには、もっと長いインキュベート時間、例え
ば−晩を用いることができる）、フィルターをインキュ
ベートし、次いで、このフィルターを４°ＣのＰＢＳで
４回すすいだ。 フィルターの指示色を発色させるため、水冷の１００％
メタノールに溶解したＨＲＰカラー発色剤（４−クロロ
−■−す７トール；　ＳｉｇｍａＸ約３０ｍｇ）をＰＢ
Ｓ（５０ｍＱ）および３０％Ｈ２Ｏ２（３０μＱ）に加
えた。この混合物をニトロセルロースフィルターに加え
、これを発色するまで室温でインキュベートした。本発
明のヒトプロティンＣ酵素前駆体を最大量分泌している
コロニーは、フィルターの最も早い発色によってだけで
なく、−段と暗いスポットによっても示される。 フィルターを発色させた後、もう−度このフィルターを
最初のプレートと並べ、どのコロニーがフィルターのど
のスポットと関係しているかを調へた。次いで、本発明
のヒトプロティンＣ酵素前駆体を最大に分泌しているコ
ロニーを選び、これを該酵素前駆体の製造に用いた。 上記の検定が高分泌セルラインを同定する方法の単なる
例示であるにすぎないことは当業者の理解するところで
あろう。この方法において多種の検定法を成功裏に用い
ることができる。例えば、ビオチン化したヤギ抗プロテ
ィンＣ抗体が、ヤギ抗−プロチインＣ抗体（ＩｇＧ）お
よびビオチン化した抗−ヤギＩｇＧ抗体に置き換えられ
ている、２１抗体反応を用いることができる。

【図面の簡単な説明】

第１Ａ図は、ＢＫウィルスおよびプラスミドｐｄＢＰＶ
−ＭＭＴｎｅｏからのプラスミドｐＢＫｎｅｏｌの構築
を示す工程図であり、 １１Ｂ図は、アデノウィルス２およびプラスミドｐｓＶ
２ｃａｔからのプラスミドｐＬＰｃａｔの構築を示す工
程図であり、 第１Ｃ図は、プラスミドｐＢＫｎｅｏｌおよびプラスミ
ドｐＬＰｃａ［からのプラスミドｐＢＬｃａｔの構築を
示す工程図であり、 第１Ｄ図は、プラスミドｐＢＬｃａｔおよびプラスミド
ｐＬ　ｌ　３３からのプラスミドｐＬＰＣの構築を示す
工程図であり、 第２図は、プラスミドｐＬＰＣの構築に用いる出発物質
であるプラスミドｐＬ　ｌ　３３の構築を示す工程図で
ある。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、アミノ末端からカルボキシ末端にかけて、 ａ）γ−カルボキシル化され、分泌されるタンパク質の
   シグナルペプチドおよびプロペプチド； ｂ）ヒトプロテインＣの軽鎖； ｃ）リジン−アルギニン、アルギニン−リジン、リジン
   −リジン、またはアルギニン−アルギニンであるジペプ
   チド；および ｄ）次のアミノ酸残基配列： 【遺伝子配列があります】 ［配列中、Ｒ＿１はＰＨＥ、ＧＬＹ、ＴＹＲまたはＴＲ
   Ｐ、Ｒ＿２はＶＡＬまたはＰＲＯ、Ｒ＿３はＡＳＰまた
   はＡＳＮであり、ＡＬＡはアラニン、ＡＲＧはアルギニ
   ン、ＡＳＮはアスパラギン、ＡＳＰはアスパラギン酸、
   −ＣＯＯＨはカルボキシ末端、ＣＹＳはシステイン、Ｇ
   ＬＮはグルタミン、ＧＬＵはグルタミン酸、ＧＬＹはグ
   リシン、Ｈ＿２Ｎ−はアミノ末端、ＨＩＳはヒスチジン
   、ＩＬＥはイソロイシン、ＬＥＵはロイシン、ＬＹＳは
   リジン、ＭＥＴはメチオニン、ＰＨＥはフェニルアラニ
   ン、ＰＲＯはプロリン、ＳＥＲはセリン、ＴＨＲはトレ
   オニン、ＴＲＰはトリプトファン、ＴＹＲはチロシン、
   そしてＶＡＬはバリンである］； を含んでいるタンパク質の暗号配列を含有するＤＮＡ化
   合物。 ２、シグナルペプチドおよびプロペプチドが形成期ヒト
   プロテインＣのシグナルペプチドおよびプロペプチドで
   ある請求項１記載のＤＮＡ化合物。 ３、ジペプチドがリジン−アルギニンである請求項１ま
   たは２に記載のＤＮＡ化合物。 ４、ＤＮＡによってコードされているポリペプチドが次
   のアミノ酸残基配列で示される請求項３記載のＤＮＡ化
   合物： 【遺伝子配列があります】 ［配列中、Ｒ＿１はＰＨＥ、ＧＬＹ、ＴＹＲまたはＴＲ
   Ｐであり；Ｒ＿２はＰＲＯまたはＶＡＬであり；そして
   Ｒ＿３はＡＳＰまたはＡＳＮである］。 ５、請求項１、２、３、または４のいずれかに記載のＤ
   ＮＡ化合物を含有する組換えＤＮＡ発現ベクター。 ６、Ｒ＿１がＰＨＥ、Ｒ＿２がＰＲＯ、そしてＲ＿３が
   ＡＳＰである請求項５記載のベクター。 ７、プラスミドｐＬＰＣ−１６７Ｆである請求項６記載
   のベクター。 ８、Ｒ＿１がＧＬＹ、Ｒ＿２がＰＲＯ、そしてＲ＿３が
   ＡＳＰである請求項５記載のベクター。 ９、プラスミドｐＬＰＣ−１６７Ｇである請求項８記載
   のベクター。 １０、請求項５記載のベクターで形質転換した真核宿主
   細胞。 １１、２９３／ｐＬＰＣ−１６７Ｆである請求項１０記
   載の真核宿主細胞。 １２、２９３／ｐＬＰＣ−１６７Ｇである請求項１０記
   載の真核宿主細胞。 １３、ＡＶｌ２／ｐＬＰＣ−１６７Ｆである請求項１０
   記載の真核宿主細胞。 １４、ＡＶｌ２／ｐＬＰＣ−１６７Ｇである請求項１０
   記載の真核宿主細胞。 １５、（Ａ）以下の（ｉ）および（ｉｉ）を含有する組
   換えＤＮＡベクターで真核宿主細胞を形質転換し： （ｉ）アミノ末端からカルボキシ末端にかけて、 ａ）γ−カルボキシル化され、分泌されるタンパク質の
   シグナルペプチドおよびプロペプチド； ｂ）ヒトプロテインＣの軽鎖； ｃ）リジン−アルギニン、アルギニン−リジン、リジン
   −リジン、またはアルギニン−アルギニンであるジペプ
   チド；および ｄ）次のアミノ酸残基配列： 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】 ［配列中、Ｒ＿１はＰＨＥ、ＧＬＹ、ＴＹＲまたはＴＲ
   Ｐ、Ｒ＿２はＶＡＬまたはＰＲＯ、Ｒ＿３はＡＳＰまた
   はＡＳＮであり、ＡＬＡはアラニン、ＡＲＧはアルギニ
   ン、ＡＳＮはアスパラギン、ＡＳＰはアスパラギン酸、
   −ＣＯＯＨはカルボキシ末端、ＣＹＳはシステイン、Ｇ
   ＬＮはグルタミン、ＧＬＵはグルタミン酸、ＧＬＹはグ
   リシン、Ｈ＿２Ｎ−はアミノ末端、ＨＩＳはヒスチジン
   、ＩＬＥはイソロイシン、ＬＥＵはロイシン、ＬＹＳは
   リジン、ＭＥＴはメチオニン、ＰＨＥはフェニルアラニ
   ン、ＰＲＯはプロリン、ＳＥＲはセリン、ＴＨＲはトレ
   オニン、ＴＲＰはトリプトファン、ＴＹＲはチロシン、
   そしてＶＡＬはバリンである］： を含んでいるアミノ酸残基配列をコードしているＤＮＡ
   配列； （ｉｉ）該ＤＮＡ配列を発現させるように設置したプロ
   モーター； （Ｂ）工程（Ａ）で形質転換した宿主細胞を、該ＤＮＡ
   配列を発現させる条件下で培養すること、を特徴とする
   真核宿主細胞からの分泌時に酵素前駆体型のヒトプロテ
   インＣを組換え法により製造する方法。 １６、組換えＤＮＡ発現ベクターがプラスミドｐＬＰＣ
   −１６７Ｆである請求項１５記載の方法。 １７、組換えＤＮＡ発現ベクターがプラスミドｐＬＰＣ
   −１６７Ｇである請求項１５記載の方法。 １８、宿主細胞が２９３またはＡＶｌ２宿主細胞である
   請求項１５記載の方法。 １９、工程（Ｂ）で培養される宿主細胞が２９３／ｐＬ
   ＰＣ−１６７Ｆ、２９３／ｐＬＰＣ−１６７Ｇ、ＡＶｌ
   ２／ｐＬＰＣ−１６７Ｆ、またはＡＶｌ２／ｐＬＰＣ−
   １６７Ｇ宿主細胞である請求項１８記載の方法。 ２０、次のアミノ酸残基配列を有するプロテインＣ酵素
   前駆体： 【遺伝子配列があります】 ［配列中、Ｈ＿２Ｎはアミノ末端であり、Ｒ＿１はＰＨ
   Ｅ、ＧＬＹ、ＴＹＲまたはＴＲＰ、Ｒ＿２はＶＡＬまた
   はＰＲＯ、Ｒ＿３はＡＳＰまたはＡＳＮであり、ＡＬＡ
   はアラニン、ＡＲＧはアルギニン、ＡＳＮはアスパラギ
   ン、ＡＳＰはアスパラギン酸、−ＣＯＯＨはカルボキシ
   末端、ＣＹＳはシステイン、ＧＬＮはグルタミン、ＧＬ
   Ｕはグルタミン酸、ＧＬＹはグリシン、Ｈ＿２Ｎ−はア
   ミノ末端、ＨＩＳはヒスチジン、ＩＬＥはイソロイシン
   、ＬＥＵはロイシン、ＬＹＳはリジン、ＭＥＴはメチオ
   ニン、ＰＨＥはフェニルアラニン、ＰＲＯはプロリン、
   ＳＥＲはセリン、ＴＨＲはトレオニン、ＴＲＰはトリプ
   トファン、ＴＹＲはチロシン、そしてＶＡＬはバリンで
   ある］。 ２１、Ｒ＿１がＰＨＥ、Ｒ＿２がＰＲＯ、そしてＲ＿３
   がＡＳＰである請求項２０記載の酵素前駆体。 ２２、Ｒ＿１がＧＬＹ、Ｒ＿２がＰＲＯ、そしてＲ＿３
   がＡＳＰである請求項２０記載の酵素前駆体。 ２３、請求項２０、２１または２２のいずれかに記載の
   酵素前駆体の止血調節剤としての使用。 ２４、活性化ヒトプロテインＣの軽鎖、および重鎖； 【遺伝子配列があります】 ［配列中、ＡＬＡはアラニン、ＡＲＧはアルギニン、Ａ
   ＳＮはアスパラギン、ＡＳＰはアスパラギン酸、−ＣＯ
   ＯＨはカルボキシ末端、ＣＹＳはシステイン、ＧＬＮは
   グルタミン、ＧＬＵはグルタミン酸、ＧＬＹはグリシン
   、Ｈ＿２Ｎ−はアミノ末端、ＨＩＳはヒスチジン、ＩＬ
   Ｅはイソロイシン、ＬＥＵはロイシン、ＬＹＳはリジン
   、ＭＥＴはメチオニン、ＰＨＥはフェニルアラニン、Ｐ
   ＲＯはプロリン、ＳＥＲはセリン、ＴＨＲはトレオニン
   、ＴＲＰはトリプトファン、ＴＹＲはチロシン、そして
   ＶＡＬはバリンである］ を含有する活性化プロテインＣ分子。 ２５、請求項２４記載の活性化プロテインＣの止血調整
   剤としての使用。 ２６、請求項２０記載の酵素前駆体をその薬学的に許容
   しうる担体とともに含有する医薬製剤。 ２７、請求項２４記載の活性化プロテインＣをその薬学
   的に許容しうる担体とともに含有する医薬製剤。