HU210863B - Method for expression of zymogen forms of human protein c and for preparation of vectors for these - Google Patents

Method for expression of zymogen forms of human protein c and for preparation of vectors for these Download PDF

Info

Publication number
HU210863B
HU210863B HU886577A HU657788A HU210863B HU 210863 B HU210863 B HU 210863B HU 886577 A HU886577 A HU 886577A HU 657788 A HU657788 A HU 657788A HU 210863 B HU210863 B HU 210863B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
leu
gly
ser
glu
asp
Prior art date
Application number
HU886577A
Other languages
English (en)
Other versions
HUT50499A (en
Inventor
Brian William Grinnel
Nils Ulrik Bang
Hartmut Josef Ehrlich
Sau-Chi Betty Yan
Original Assignee
Lilly Co Eli
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Lilly Co Eli filed Critical Lilly Co Eli
Publication of HUT50499A publication Critical patent/HUT50499A/hu
Publication of HU210863B publication Critical patent/HU210863B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/6464—Protein C (3.4.21.69)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21069—Protein C activated (3.4.21.69)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Description

A jelen találmány olyan új DNS vegyületekkel és rekombináns DNS klónozó vektorokkal foglalkozik, amelyek humán C fehérje új zimogén formáit kódolják. Ezeket a zimogéneket in vivő kizárólag trombinnal lehet aktiválni klinikai jelentőségű sebességgel, és ezek sokkal fogékonyabbak a trombin/trombomodulinnal végzett aktiválásra, mint a negatív C fehérje zimogén. A kifejező vektorok egyszerű és hatékony eszközt szolgáltatnak ezeknek a humán C fehérje zimogéneknek a kifejezéséhez rekombináns gazdasejtekben. A natív humán zimogének magas szintű trombinos, vagy trombinos és trombomodulinos kezelést igényelnek az aktiváláshoz, vagy más, drága enzimet igényelnek az aktiváláshoz. A jelen találmány eljárást nyújt humán C fehérje zimogén formáinak előállítására, amelyek sokkal jobb szubsztrátumként szolgálnak a trombin számára, következésképpen kisebb trombin, vagy trombin/trombomodulin vagy más enzim-szintek jelenlétében is képesek aktiválódni. Ami a legfontosabb, a humán C fehérje jelen találmány szerinti zimogén formáit lehet aktiválni még a fiziológiás Ca2+ jelenlétében is, amely a natív C fehérje zimogén trombinnal való aktiválásánál gátló hatású. A humán C fehérje új zimogén formái különböznek a szakterületen eddig ismertektől az aktivációs peptid aminosavszekvenciájában, amelyet a zimogén formákról eltávolítanak, hogy aktivált humán C fehérjét kapjanak. A C fehérje ezen új zimogén formái speciális előnyöket nyújtanak a vér rendellenességeinek, pl. az alvadásnak a kezelésében.
A C fehérjének, amely K-vitamin-függő plazmafehérje, nagy fiziológiai jelentősége van a hemosztázis ellenőrzésében, és fontos szerepet játszik a véralvadásnak a szabályozásában. A C fehéije inaktív molekulaként keletkezik, amelyet itt naszcensz C fehérjének nevezünk. A naszcensz C fehéije komplex feldolgozáson megy keresztül, létrehozva egy sor különböző inaktív molekulát, amint ezt a későbbiekben részletesen leírtjuk. A C fehérjének inaktív, kiválasztott formáit itt zimogén C fehérjének, vagy C fehérje zimogénnek nevezzük. A C fehérje aktiválása a vérben olyan reakcióval történik, amelyben egy trombomodulin-trombin komplex is érdekelt. Az aktivált C fehérje, S fehéije kofaktorával együtt, nagy fiziológiai jelentőségű aívadásgátló szer (antikoaguláns). Az aktivált C fehérje megakadályozza az intravaszkuláris trombózist és szabályozza a már meglevő rögök kiteijedését. A C fehérje aktivált formájának reakciómechanizmusát és az inaktív zimogén aktív proteázzá való aktiválásának mechanizmusát az elmúlt években tisztázták [áttekintés céljából lásd pl.: Gardiner J. E. és Griffin J. H.: Progress in Hematology, XHI. 265-278; szerkesztő: Brown Elmer B. kiadó Grune és Stratton, Inc. (1983)].
A C fehérje aktiválásában érdekelt a trombin, az alvadási reakciósorban az utolsó szerint-proteáz, és egy endotéliális sejtmembránnal társult glikoprotein, amelyet trombomodulinnak neveznek. A trombomodulin szoros, sztöchiometrikus komplexet képez trombinnal. A trombomodulin, amikor komplexbe lép a trombinnal, teljes megváltoztatja a trombin funkcionális tulajdonságait. A trombin normális esetben megalvasztja a fibrinogént, aktiválja a vérlemezkéket és átalakítja az
V. és VHI. alvadási kofaktorokat aktivált formáikká, Va-vá és VÜIa-vá. Végül a trombin aktiválja a C fehérjét, de csak nagyon lassan és kevéssé hatékonyan, és az aktiválást tovább gátolja a fiziológiás Ca2+ jelenléte. Ezzel ellentétben a trombomodulinnal komplexben lévő trombin nem akasztja a fibrinogént, aktiválja a vérlemezkéket, vagy átalakítja az V. és VIII. alvadási faktorokat aktivált Va. és Villa, változataikká, de nagyon hatékony aktivátorává válik a C fehérje zimogénnek fiziológiás Ca2+ jelenlétében is. A C fehéije zimogén trombomodulin-trombinnal való aktiválásának sebességi állandója több, mint 1000-szer nagyobb, mint a trombin sebességi állandója egyedül.
Abból a célból, hogy megértsük, hogyan szabályozza az aktivált C fehérje alacsony szintre a véralvadást az alábbiakban megadjuk az alvadási enzimrendszer rövid leírását. Az alvadási rendszer a legjobban úgy szemléltethető, mint egy láncreakció, amely a zimogének egymás utáni aktiválását foglalja magában aktív szerin proteázokká. Ez a láncreakció végülis a trombin enzimet alakítja ki, amely korlátozott proteolízis révén a plazma fibrinogént átalakítja a fibrin oldhatatlan géllé. Az alvadási reakciósor két kulcslépése a X. alvadási faktor átalakítása Xa. faktorrá a IXa. alvadási faktor segítségével, és a protrombin átalakítása trombinná a Xa. alvadási faktor segítségével. Mindkét reakció sejtfelületeken megy végbe, leginkább a vérlemezkék felületén, és mindkét reakció kofaktorokat igényel. A főbb kofaktorok, az V. és VHI. faktorok, a rendszerben viszonylag inaktív prekurzorokként keringenek, de amikor az első néhány trombin molekula keletkezik, a trombin visszahat és aktiválja a kofaktorokat korlátozott proteolízissei. Az aktivált kofaktorok, az Va. és Villa, mintegy öt nagyságrenddel meggyorsítják a protrombin átalakítását trombinná, valamint a X. faktor átalakítását Xa. faktorrá. Az aktivált C fehérje előnyösen úgy működik, hogy proteolitikusan elbontja, hidrolizálja és így irreverzíbilisen elroncsolja az Va. és Villa, kofaktorokat, az inaktív V. és VIII. alvadási faktorok aktivált formáit. Az V. és VIII. faktorok viszont nagyon rossz szubsztrátumai az aktivált C fehérjének in vivő.
Az aktivált C-fehérje számára fontos kofaktor az S fehéije, egy másik K-vitamin-függő plazmafehérje. Az S fehéije jelentősen, 25-szörösen megnöveli az Va. és Villa, faktoroknak aktivált C-fehérjével közvetített hidrolízisét.
A C fehérjéről felismerték, hogy értékes gyógyszer (lásd pl. a 0 215 548 és 0 191 606 számú európai szabadalmi közzétételi iratokat. Az aktivált C fehérje új antitrombotikus szer szélesebb terápiás indexszel, mint a jelenleg rendelkezésre álló aívadásgátló szerek, pl. a heparin és a hidroxi-kumarin típusú orális aívadásgátló szerek. Sem a zimogén C fehérje, sem az aktivált C fehéije nem hatékony addig, míg trombin nem rendelkezik, mivel trombin szükséges ahhoz, hogy az V. alvadási faktor átalakuljon Va.-vá és a VHI. alvadási faktor átalakuljon VIIIa.-vá; ennek a két kofaktornak az aktivált formája az előnyös szubsztrátuma az aktivált C fehérjének. Trombin szükséges a zimogén C fehérje aktiválásához is, mivel a trombomodulin-trom2
HU 210 863 B bin komplex nélkül a zimogén C fehérje nem alakul át aktív változatává.
Az aktivált C fehérje igény szerinti alvadásgátló szer, mivel az aktivált C fehérje úgy működik, hogy inaktiválja az Va. és Villa, kofaktorokat. Mivel trombin szükséges az V. és VIII. faktor átalakításához aktivált változataikba, Va.-ba és VIIIa.-ba, a C fehérje csak az után működik alvadásgátlóként, miután trombin alakult ki. A hagyományos alvadásgátló szerek viszont, az aktivált C fehérjével ellentétben, állandó antikoaguláns állapotot tartanak fenn a vérkeringésen keresztül, mindaddig, amíg ezeket kapja a beteg, ezáltal lényegesen növelve a vérzési komplikációk kockázatát a C fehérjéhez vagy aktivált C fehérjéhez viszonyítva. Az aktivált C fehérje ennek megfelelően csak igény szerinti alvadásgátló szer, széles klinikai alkalmazhatósággal, amelyet úgy lehet alkalmazni, mint alternatívát a heparinnal és a hidroxi-kumarinokkal szemben.
Bizonyos betegségi állapotokban, pl. öröklött C-fehérje hiányban, a C fehérje zimogén nagy terápiás fontosságú. A veleszületett homozigótás C fehérje hiányban az érintett egyének már korai gyermekkorban meghalnak heveny vörhenyben (purpura fulminans), amely a kiterjedt intravaszkuláris alvásnak gyakran halálos formája. A heterozigótás C fehérje hiányban az érintett egyének súlyos, ismétlődő, tromboembóliás eseményekben szenvednek. Klinikailag jól megállapított tény, hogy a B hemo- vagy IX. faktor hiány kezelésére szánt plazmafehérje koncentrátumok hatásosak az intravaszkuláris alvadás megelőzésében és kezelésében heterozigótás C fehérje hiány esetében. A C fehérje szintekről azt is feljegyezték, hogy abnormálisán alacsony trombotikus állapotokban, pl. kiterjedt intravaszkuláris alvadásban, és trombózisra hajlamosító betegségekben, pl. nagyobb balesetekben, nagyobb sebészeti beavatkozásban és rákban.
Abból a célból, hogy megkönnyítsük a C fehérje aktiválásának és a találmánynak a megértését, az alábbiakban bemutatjuk a naszcens humán C fehérje kódoló szekvenciáját és az ennek megfelelő aminosavszekvenciát. Ez az aminosavgyök szekvencia és megfelelő vonatkozó részeik szintén jellemzik a „natív humán C fehérjét” a jelen találmány céljaira.
20
5'-ATG TGG CAG CTC ACA AGC CTC CTG
30 CTG TTC GTG GCC ACC 40 TGG GGA ATT THR SER LEU LEU 5
H2N-MET TRP GLN VAL ALA LEU THR
LEU PHE 10
TRP GLY 15 ILE
50 60 70
TCC GGC ACA CCA GCT CCT CTT GAC TCA
80 90
GTG TTC TTC AGC AGC GAG CGT
SER GLY THR PRO ALA PRO LEU ASP SER
20 25
VAL PHE SER SER SER GLU ARG
30
100 110 120
GCC CAC CAG GTG CTG CGG ATC GGC AAA
130 140
CTG GCC AAC TCC TTC CTG GAG
ALA HIS GLN VAL LEU ARG ILE ARG LYS
35 40
ARG ALA ASN SER PHE LEU GLU
45
150 160 170
GAG CTC CGT CAC AGC AGC CTG GAG CGG
180 190
GAG TGC ATA GAG GAG ATC TGT
GLU LEU ARG HIS SER SER LEU GLU ARG
50 55
GLU CYS ILE GLU GLU ILE CYS
200 210
GAC TTG GAG GAG GCC AAG GAA ATT TTC
220 230
CAA AAT GTG GAT GAC ACA CTG
ASP PHE GLU GLU ALA LYS GLU ILE PHE
65 70
GLN ASN VAL ASP ASP THR LEU
75 80
250 260
GCC TTC TGG TCC AAG CAC GTC GAC GGT
270 280
GAC CAG TGC TTG GTC TTG CCC
ALA PHE TRP SER LYS HIS VAL ASP GLY
85
ASP GLN CYS LEU VAL LEU PRO
90 95
290 300 310
TTG GAG CAC CCG TGC GCC AGC CTG TGC
320 330
TGC GGG CAC GGC ACG TGC ATC
LEU GLU HIS PRO CYS ALA SER LEU CYS
100 105
CYS GLY HIS GLY THR CYS ILE
110
340 350 360
GAC CGC ATC GGC AGC TTC AGC TGC GAC
370 380
TGC CGC AGC GGC TGG GAG GGC
ASP GLY ILE GLY SER PHE SER CYS ASP
115 120
CYS ARG SER GLY TRP GLU GLY
125
390 400 410
CGC TTC TGC CAG CGC GAG GTG AGC TTC
420 430
CTC AAT TGC TCG CTG GAC AAC
ARG PHE CYS GLN ARG GLU VAL SER PHE
130 135
HU 210 863 Β
LEU ASN CYS 140 SER LEU ASP 450 ASN 460 750 ACA VAL GCG GCC CAC HIS 760 TGC ATG GAT
LEU ILE PRO 245 SER TRP VAL LEU
440
GGC GGC TGC ACG CAT TAC TGC CTA GAG 5 THR ALA ALA HIS CYS MET ASP
470 480 250 255
GAG GTG GGC TGG CGG CGC TGT
GLY GLY CYS THR HIS TYR CYS LEU GLU 770 780 790
145 150 GAG TCC AAG AAG CTC CTT GTC AGG CTT
GLU VAL GLY TRP ARG ARG CYS 10 800 810
155 160 GGA GAG TAT GAC CTG CGG CGC
GLU SER LYS LYS LEU LEU VAL ARG LEU
490 500 260 265
AGC TGT GCG CCT GGC TAC AAG CTG GGG GLY GLU TYR ASP LEU ARG ARG
510 520 15 270
GAC GAC CTC CTG CAG TGT CAC
SER CYS ALA PRO GLY TYR LYS LEU GLY 820 830 840
165 TGG GAG AAG TGG GAG CTG GAC CTG GAC
ASP ASP LEU LEU GLN CYS HIS 850 860
170 175 20 ATC AAG GAG GTC TTC GTC CAC
TRP GLU LYS TRP GLU LEU ASP LEU ASP
530 540 550 275 280
CCC GCA GTG AAG TTC CCT TGT GGG AGG ILE LYS GLU VAL PHE VAL HIS
560 570 285
CCC TGG AAG CGG ATG GAG AAG 25
PRO ALA VAL LYS PHE PRO CYS GLY ARG 870 880 890
180 185 CCC AAC TAC AGC AAG AGC ACC ACC GAC
PRO TRP LYS ARG MET GLU LYS 900 910
190 AAT GAC ATC GCA CTG CTG CAC
30 PRO ASN TYR SER LYS SER THR THR ASP
580 590 600 290 295
AAG CGC AGT CAC CTG AAA CGA CAC ACA ASN ASP ILE ALA LEU LEU HIS
610 620 300
GAA GAC CAA GAA GAC CAA GTA
LYS ARG SER HIS LEU LYS ARG ASP THR 35 920 930
195 200 CTG GCC CAG CCC GCC ACC CTC TCG CAG
GLU ASP GLN GLU ASP GLN VAL 940 950 960
205 ACC ATA GTG CCC ATC TGC CTC
LEU ALA GLN PRO ALA THR LEU SER GLN
630 640 650 40 305 310
GAT CCG CGG CTC ATT GAT GGG AAG ATG THR ILE VAL PRO ILE CYS LEU
660 670 315 320
ACC AGG CGG GGA GAC AGC CCC
ASP PRO ARG LEU ILE ASP GLY LYS MET 970 980
210 215 45 CCG GAC AGC GGC CTT GCA GAG CGC GAG
THR ARG ARG GLY ASP SER PRO 990 1000
220 CTC AAT CAG GCC GGC CAG GAG
PRO ASP SER GLY LEU ALA GLU ARG GLU
680 690 700 325
TGG CAG GTG GTC CTG CTG GAC TCA AAG 50 LEU ASN GLN ALA GLY GLN GLU
710 720 330 335
AAG AAG CTG GCC TGC GGG GCA
TRP GLN VAL VAL LEU LEU ASP SER LYS 1010 1020 1030
225 230 ACC CTC GTG ACG GGC TGG GGC TAC CAC
LYS LYS LEU ALA CYS GLY ALA 55 1040 1050
235 240 AGC AGC CGA GAG AAG GAG GCC
THR LEU VAL THR GLY TRP GLY TYR HIS
340 345
730 740 SER SER ARG GLU LYS GLU ALA
GTG CTC ATC CAC CCC TCC TGG GTG CTG 60 350
HU 210 863 B
1060 1070 1080
AAG AGA AAC CGC ACC TTC GTC CTC AAC
109C i 1100
TTC ATC AAG ATT CCC GTG GTC
LYS ARG ASN ARG THR PHE VAL LEU ASN
355 360
PHE ILE LYS ILE PRO VAL VAL
365
1110 1120 1130
CCG CAC AAT GAG TGC AGC GAG GTC ATG
1140 1150
AGC AAC ATG GTG TCT GAG AAC
PRO HIS ASN GLU CYS SER GLU VAL MET
370 375
SER ASN MET VAL SER GLU ASN
380
116C ) 117C )
ATG CTG TGT GCG GGC ATC CTC GGG GAC
1180 1190 1200
CGG CAG GAT GCC TGC GAG GGC
MET LEU CYS ALA GLY ILE LEU GLY ASP
385 390
ARG GLN ASP ALA CYS GLU GLY
395 400
1210 1220
GAC AGT GGG GGG CCC ATG GTC GCC TCC
1230 1240
TTC CAC GGC ACC TGG TTC CTG
ASP SER GLY GLY PRO MET 405 VAL ALA SER
PHE HIS GLY THR TRP- PHE LEU
410 415
1250 1260 1270
GTG GGC CTG GTG AGC TGG GGT GAG GGC
1280 1290
TGT GGG CTC CTT CAC AAC TAC
VAL GLY LEU VAL SER TRP GLY GLU GLY
420 425
CYS GLY LEU LEU HIS ASN 430 TYR
1300 1310 1320
GGC GTT TAC ACC AAA GTC AGC CGC TAC
1330 1340
CTC GAC TGG ATC GLY VAL TYR THR CAT LYS HIS GGG VAL GLY CAC SER ARG TYR
LEU ASP 435 TRP ILE 445 HIS 440
1350 1360 1370
ATC AGA GAC AAG GAA GCC CCC CAG AAG
1380
AGC TGG GCA CCT TAG-3'
ILE ARG ASP LYS GLU ALA PRO GLN LYS 450 455
SER TRP ALA PRO-COOH 460 ahol Ajelentése dezoxiadenil gyök, G jelentése dezoxiguanilgyök, C jelentése dezoxicitidil gyök, T jelentése timidil gyök, ALA jelentése alanin gyök, ARG jelentése arginin gyök, ASN jelentése aszparagin gyök, ASP jelentése aszparaginsav gyök, -COOH jelentése karboxi terminális, CYS jelentése cisztein gyök, GLN jelentése glutamin gyök, GLU jelentése glutaminsav gyök, GLY jelentése glicin gyök, H2N- jelentése amino terminális, HIS jelentése hisztidin gyök, ILE jelentése izoleucin gyök, LEU jelentése leucin gyök, LYS jelentése lizin gyök, MET jelentése metionin gyök, PHE jelentése fenilalanin gyök, PRO jelentése prolin gyök, SER jelentése szerin gyök, THR jelentése treonin gyök, TRP jelentése triptofán gyök, TYR jelentése tirozin gyök, és VAL jelentése valin gyök.
A fentebb bemutatott DNS szekvencia emberi máj humán C fehérjét kódoló mRNS-ból készített cDNS klónokból származik. Azok, akik a szakterületen jártasak, felismerik, hogy a genetikai kód degenerált természete lehetővé teszi bárki számára, hogy sok különböző DNS szekvenciát állítson elő, amelyek ugyanolyan aminosavszekvenciát kódolnak. A naszcensz emberi C fehérjét kódoló cDNS szekvenciák közül a fentebb ábrázolt szekvencia csak egyike a lehetséges sokféle naszcensz humán fehérje C-kódoló szekvenciának. A cDNS kiónok megalkotásában egy 5’ poli G szekvenciát, egy 3’ poli C szekvenciát, és mind 5’, mind 3’ PstI restrikciós enzim felismerő szekvenciát hozunk létre a C fehérje-kódoló cDNS végein. Ezek közül a cDNS kiónok közül kettőt manipulálunk olyan módon, hogy olyan DNS molekulát alakítsunk ki, amely tartalmazza a naszcensz humán C fehérje kódoló szekvencián kívül a nem transzlatált mRNS-t kódoló DNS részleteit is a kódoló terület 5’ és 3’ végeinél. Ezt a DNS molekulát a pBR322 plazmid PstI helyébe iktatjuk be, hogy megalkossuk a pHC7 plazmidot. A pHC7 plazmid így magában foglalja a fenti kódoló szekvenciát valamint ismét csak egy szálát ábrázolva a molekulának - ezeket a további szekvenciákat tartalmazza.
5'-C TGC AGG GGG GGG GGG GGG GGG
GGG CTG TCA TGG CGG CAG GAC
GGC GAA CTT GCA GTA TCT CCA CGA CCC
GCC CCT ACA GGT GCC
AGT GCC TCC AGA- -3 ' , és
5'-CGA CCC TCC CTG CAG GGC TGG GCT
TTT GCA TGG CAA TGG ATG GGA
CAT TAA AGG GAC ATG TAA CAA GCA CAC
CCC CCC CCC CCC CCC CCC
CCC CCC CCT GCA G-3‘ F
a naszcensz humán C fehétje kódoló szálának 5’ illetve 3’ végeinél. A DNS bázispár-képzés komplementer természete következtében a kettős szálú DNS molekula egyik szálának szekvenciája elegendő, hogy meghatározzuk az ellenkező szál természetét. A pHC7 plazmid kényelmesen izolálható az E. coli K12 RRl/pHC7-ból; ez a törzs deponálva van a Northern Régiónál Research Laboratories (NRRL; Peoria, Illinois) állandó törzste5
HU 210 863 Β nyészet gyűjteményében és annak részét képezi. Az E. coli KI2 RRl/pHC7 tenyészetét az NRRL-től az NRRL-B-15 926 számon kaphatjuk meg. A pHC7 plazmid restrikciós hely- és működési térképét a mellékelt ábrák közül a 2. ábra mutatja be.
A naszcensz C fehérjét vázlatosan ábrázolhatjuk az alábbiak szerint is.
142 43197 198 199 200211 212461
pre-pro LC KR AP AHC
- HC -► pre-pro a naszcensz humán C fehérje 1-42 aminosavgyökei alkotják a szignált pepiidet és a humán C fehérje propeptidjét, amely fontos a C-fehérje kiválasztásához és γ-karboxilezéséhez.
LC- a naszcensz C fehérje 43-197 aminosav-gyökei, amelyek a transzláció után módosítva a könnyű láncát alkotják mind a kétláncú zimogének (amely az egyláncú zimogénből képződik a KR dipeptid eltávolítása után, amint a későbbiekben tárgyaljuk), mind a C fehérje aktivált formáinak.
KR - a naszcensz humán C fehérje 198-199 aminosavgyökei; ezekről a gyökökről úgy véljük, hogy eltávolítódnak (a szarvasmarha C fehéijével való homológja alapján), valószínűleg egy kétlépéses folyamattal, amely tartalmaz egy első hasítást (vagy a 197-198 vagy a 199-200 gyökök között), amelyet a karboxipeptidáz vagy aminopeptidáz tevékenysége követ, így alakítva ki a kétláncú C fehérjét.
AP - a naszcensz humán C fehérje 200-211 aminosavgyökei alkotják az aktiváló peptidet, amely eltávolítódik a C fehérje zimogén formáiról, hogy aktivált C fehérjét kapjuk.
AHC- a naszcensz C fehérje 212-461 aminosav-gyökei, amelyek a transzláció után módosítva az aktív C fehérje aktivált nehéz láncát (AHC) alkotják.
HC - a C fehérje zimogén kétláncú formájának nehéz lánca, amely a transzláció után módosítva a 200461 aminosavgyökökből, az AP-ből és AHC-ből tevődik össze.
A humán C fehérje zimogén olyan szerin proteáz prekurzor, amely a májban szintetizálódik és a vérben van jelen. A teljes biológiai aktivitás kifejezéséhez a C fehérje transzláció utáni módosításokat igényel, amelyhez K vitamin szükséges. A kétláncú, diszulfiddal kapcsolt C fehérje zimogén az egyláncú zimogénből keletkezik korlátozott proteolízissel. A korlátozott proteolízisről úgy véljük, hogy magában foglalja a 198, és 199. aminosav-gyökök hasítását és eltávolítását. A kétláncú zimogén aktiválása az aktív szerin proteázzá magában foglalja egy ARG-LEU peptid kötés (211. és 212. gyökök) proteolitikus hasítását. Ez utóbbi hasítás egy dodekapeptidet bocsát ki (200-211. gyökök); ez az aktiváló peptid, amely a kétláncú zimogén molekula nagyobb (nehéz) láncának amino-terminálisát alkotja. A C fehérje jelentősen glikozilezve van; az érett enzim -23% szénhidrátot tartalmaz. AC fehérje tartalmaz egy sor szokatlan aminosavat is, beleértve a γ-karboxi-glutaminsavat és a β-hidroxi-aszparaginsavat (eritro-L-βhidroxi-aszpartát). Αγ-karboxi-glutaminsav (gla) a glutaminsav gyök γ-glutamil-karboxilezésével keletkezik egy máj mikroszomális karboxiláz segítségével, amely K vitamint igényel kofaktorként.
A humán C fehérje aktiválását bemutatjuk vázlatban is, amint ez az alábbiakban látható. Azok, akik a szakterületen jártasak, tudják, hogy a vázlatban bemutatott lépések sorrendje nem tükrözi szükségszerűen az in vivő biokémiai út lépéseinek sorrendjét.
pre-pro-LC-KR-AP-AHC naszcensz C fehérje transzláció utáni módosítás, vagyis speciális glutaminsav-gyökök γ-karboxilezése, egy aszparaginsav-gyök β-hidroxilezése, és glikozilezés kiválasztás, az 1-42. gyökök eltávolítása, amely egynél több proteolitikus hasítást foglal magában
LC-KR-AP-AHC egyláncú zimogén a 198-199 gyökök eltávolítása; az emberi vérben található zimogén C fehérje mintegy 90%-a kétláncú formában van (S-S = diszulfíd-kötés)
LC
I
S-S kétláncú zimogén I
AHC-AP aktiválás trombin-trombomodulinnal
LC
I
S-S aktivált C-fehérje I
AHC
A jelen találmány eljárást nyújt új C fehérje zimogének rekombináns kifejezéséhez, és nyújtja az ehhez szükséges új vegyületeket, vektorokat és transzformánsokat.
A jelen bejelentés céljára az alábbi leírásokhoz és igénypontokhoz az alább meghatározott kifejezéseket használjuk.
Ad2LP - a 2. típusú adenovírus nagyobb késői promotora. Az aminosav-gyököket az itt leírt fehérjékben és peptidekben az alábbiak szerint rövidítjük:
Hárombetűs rövidítés Aminosavgyök Egybetűs rövidítés
PHE fenilalanin F
LEU leucin L
1LE izoleucin 1
MET metionin M
HU 210 863 Β
Hárombetűs rövidítés Aminosavgyök Egybetűs rövidítés
VAL valin V
SER szerin s
PRO propin P
THR treonin T
ALA alanin A
TYR tirozin Y
HIS hisztidin H
GLN glutamin Q
ASN aszparagin N
LYS lizin K
ASP aszparaginsav D
GLU glutaminsav E
CYS cisztein C
TRP triptofán W
ARG arginin R
GLY glicin G
ApR- az amplicin-rezisztens fenotípus, vagy az ezt átadó gén
BR - a BK vírusból származó DNS
CAT - a klóramfenikol acetiltranszferáz gén
Enh vagy fokozó - a BK vírus fokozója ep vagy SV40ep - olyan DNS szegmens, amely tartalmazza a T-antigén gén SV40 korai promotorát, a T-antigén kötőhelyeket, az SV40 fokozót, és az SV40 replikációs origót.
γ-karboxilezés - az a reakció, amely karboxil-csoportot tesz hozzá a glutaminsavhoz a γ-szénnél γ-karboxilezett fehérje - olyan fehérje, amelyben bizonyos glutaminsav-gyökök γ-karboxilezésen mentek keresztül
IVS - egy intront kódoló DNS, amelyet beavatkozó szekvenciának is nevezünk
MMTpro - az egér metallotionein-I gén
Naszcens fehérje - egy mRNS átirat transzlációjakor keletkezett polipeptid, bármiféle transzláció utáni módosítás előtt. Bizonyos transzláció utáni módosítások, mint pl. a glutaminsav-gyökök γ-karboxilezése és aszparaginsav gyökök hidroxilezése megtörténhez még az előtt, mielőtt a fehérje teljesen transzlatálva lenne egy mRNS átiratból.
NeoR - neomicin rezisztencia átadó gén, amelyet lehet alkalmazni G418 antibiotikum elleni rezisztencia átadására is.
pA - poliadenilezó szignált kódoló DNS szekvencia promotor - olyan DNS szekvencia, amely DNS átirányítását irányítja RNS-sé
C fehérje aktivitás - a humán C fehérje bármely tulajdonsága, amely felelős a proteolitikus, amidolitikus, eszterolitikus és biológiai (alvadásgátló vagy pro-fibrinolitikus) aktivitásokért. A fehérje alvadásgátló aktivitásának vizsgálatára szolgáló módszerek jól ismertek a szakterületen, pl. Grinell és munkatársai: Biotechnology, 5, 1189 (1987).
Rekombináns DNS klónozó vektor - bármilyen közvetítő anyag, beleértve (de nemcsak ezekre korlátozva) a kromoszomálisan integrálódó anyagokat, az autonóm módon replikálódó plazmidokat és fágokat, ahol ezek a közvetítő anyagok olyan DNS molekulát tartalmaznak, amelyhez további DNS szekvenciák vannak adva, vagy amelyhez további DNS szegmensek adhatók.
Rekombináns DNS kifejező vektor - bármely rekombináns DNS klónozó vektor, amelybe egy promotor van beépítve és úgy elhelyezve, hogy elősegítse egy géntermék kifejeződését.
Rekombináns DNS vektor - bármilyen rekombináns
DNS klónozó vagy kifejező vektor Replikon - olyan DNS szekvencia, amely szabályozza és lehetővé teszi egy plazmid vagy más vektor autonóm replikációját
Restrikciós fragmentum - bármely lineáris DNS szekvencia, amely egy vagy több restrikciós endonukleáz enzim tevékenysége révén jött létre
Érzékeny gazdasejt - olyan gazdasejt, amely nem képes növekedni egy adott antibiotikum vagy más toxikus anyag jelenlétében egy olyan DNS szegens nélkül, amely ellenállást ad át az adott antibiotikumra vagy más toxikus anyagra.
TcR- a tetraciklin rezisztens fenotípus vagy az ezt átadó gén
Transzformálás - DNS bevezetése egy befogadó gazdasejtbe, amely megváltoztatja a befogadó sejt genotípusát
Transzformáns - befogadó gazdasejt, amely transzformáláson ment keresztül
Transzlációs aktiváló szekvencia - bármely DNS szekvencia, beleértve egy riboszomális kötőhelyet és transzlációs start kodont, pl. 5’-ATG-3’-t, kódoló DNS szekvenciákat, amelyek lehetővé teszik egy mRNS átirat transzlációját valamely pepiiddé vagy polipeptiddé
Zimogén - egy proteolitikus enzim enzimatikus szempontból inaktív prekurzora. A C fehérje zimogén, ahogyan itt használjuk, a C fehérjének kiválasztott, inaktív formáira vonatkozik, mind az egyláncúakra, mind a kétláncúakra.
Az 1. ábra négy részből áll, és vázlatosan ismerteti a pLPC plazmid megalkotásának munkamenetét; ez a plazmid a kiindulási anyag a pLAPC kiindulási plazmid megalkotásához.
Az 1. ábra A. része a pBKneol plazmid megalkotását ábrázolja BK vírusból és pdBPV-MMtneo plazmidból.
Az 1. ábra B része a pLPcat plazmid megalkotását ábrázolja a 2. adenovírusból és a pSV2cat plazmidból.
Az 1. ábra C része a pBLcat plazmid megalkotását ábrázolja a pBKneol plazmidból és pLPcat plazmidból
Az 1. ábra D része a pLPC plazmid megalkotását ábrázolja a pBLcat plazmidból és pLl 33 plazmidból
A 2. ábra vázlatosan bemutatja a pL 133 plazmid megalkotását, ez a plazmid kiindulási anyag a pLPC plazmid megalkotásában.
HU 210 863 Β
A jelen találmány olyan DNS vegyületekkel foglalkozik, amelyek humán C fehérje új zimogén formáinak kifejeződését kódolják. Számos eljárást írtak már le natív humán C fehéije zimogén és naszcensz humán C fehéije előállítására (lásd pl. a 215 548 és 191 606 számú európai szabadalmi közzétételi iratokat). A technika jelenlegi állása szerinti eljárások humán C fehérje olyan zimogén formáit nyújtják, amelyek nem különböznek az emberi vérben jelen levő zimogén formáktól. Az ezekkel az eljárásokkal termelt C fehéije zimogént kezelni kell olyan anyagokkal, mint pl. α-trombin, tripszin, vagy trombin és trombomodulin keveréke (akár in vivő, akár in vitro), hogy aktivált C fehérjét kapjunk. Ezen kívül a rekombináns DNS technológiával termelt humán C fehéije zimogén formája, amely az emberi vérben természetesen talált humán C fehéije zimogén formájának felel meg, a testben a természetes aktiválási út révén aktiválódik, de csak a trombin-trombomodulin komplex segítségével. A natív humán C fehérje aktiválódhat csak a trombinnal is, az aktiválás azonban Ca2+ távollétét igényli, és a trombinnak és/vagy C fehéije zimogénnek olyan magas szintjét igényli, hogy ez nem is jelentős in vivő biológiai út az aktivált C fehérjéhez.
A jelen találmány a humán C fehérjének olyan zimogén formáit nyújtja, amelyet in vivő trombinnal egyedül is lehet aktiválni, klinikailag is jelentős sebességgel. Ezen kívül ezek a zimogén formák sokkal fogékonyabbak trombin/trombomodulin aktiválásra, mint a natív humán C fehérje zimogén. A jelen találmány szolgáltat továbbá DNS vegyületeket, rekombináns DNS kifejező vektorokat, transzformált sejtvonalakat és eljárásokat a humán C fehérje ezen új zimogén formáinak rekombináns kifejeződéséhez. A humán C fehérje ezen zimogén formáinak előállítására szolgáló eljárás az alábbi lépésekből áll:
(A) egy eukarióta gazdasejt transzformálása egy rekombináns DNS vektorral, ahol az említett vektor tartalmaz (i) egy DNS szekvenciát, amely egy aminosavszekvenciát kódol, a nevezett aminosavszekvencia az amino-terminálistól a karboxi-terminálisig tartalmaz
a. ) egy γ-karboxilezett, kiválasztott fehérje szignál peptidjét és pro-peptidjét;
b. ) a humán C fehérje könnyű láncát
c. ) egy LYS-ARG, ARG-LYS, LYS-LYS vagy
ARG-ARG dipeptidet; és
d. ) az alábbi aminosavszekvenciát
200
ASP THR GLU ASP GLN GLU ASP GLN VAL
209 210 211 214
Rx r2 ARG LEU ILE r3 gly : LYS MET
THR ARG ARG GLY ASP SER PRO
TRP GLN VAL VAL LEU LEU ASP SER LYS
LYS LYS LEU ALA CYS GLY ALA
VAL LEU ILE HIS PRO SER TRP VAL LEU
THR ALA ALA HIS CYS MET ASP
GLU SER LYS LYS LEU LEU VAL ARG LEU
GLY GLU TYR ASP LEU ARG ARG
TRP GLU LYS TRP GLU LEU ASP LEU ASP
ILE LYS GLU VAL PHE VAL HIS
PRO ASN TYR SER LYS SER THR THR ASP
ASN ASP ILE ALA LEU LEU HIS
LEU ALA GLN PRO ALA THR LEU SER GLN
THR ILE VAL PRO ILE CYS LEU
PRO ASP SER GLY LEU ALA GLU ARG GLU
LEU ASN GLN ALA GLY GLN GLU
THR LEU VAL THR GLY TRP GLY TYR HIS
SER SER ARG GLU LYS GLU ALA
LYS ARG ASN ARG THR PHE VAL LEU ASN
PHE ILE LYS ILE PRO VAL VAL
PRO HIS ASN GLU CYS SER GLU VAL MET
SER ASN MET VAL SER GLU ASN
MET LEU CYS ALA GLY ILE LEU GLY ASP
ARG GLN ASP ALA CYS GLU GLY
ASP SER GLY GLY PRO MET VAL ALA SER
PHE HIS GLY THR TRP PHE LEU
VAL GLY LEU VAL SER TRP GLY GLU GLY
CYS GLY LEU LEU HIS ASN TYR
GLY VAL TYR THR LYS VAL SER ARG TYR
LEU ASP TRP ILE HIS GLY HIS
ILE ARG ASP LYS GLU ALA PRO GLN LYS
SER TRP ALA PRO- -COOH
ahol R, jelentése PHE, GLY, TYR vagy TRP, R2 jelentése VAL vagy PRO, R3 jelentése ASP vagy ASN, és ahol ARG jelentése arginin-gyök, ASN jelentése aszparagin gyök, ASP jelentése aszparaginsav gyök, -COOH jelentése karboxi terminális, CYS jelentése cisztein gyök, GLN jelentése glutamin gyök, GLU jelentése glutaminsav gyök, GLY jelentése glicin gyök, HIS jelentése hisztidin gyök, ILE jelentése izoleucin gyök, LEU jelentése leucin gyök, LYS jelentése lizin gyök, MET jelentése metionin gyök, PHE jelentése fenilalanin gyök, PRO jelentése prolin gyök, SER jelentése szerin gyök, THR jelentése treonin gyök, TRP jelentése triptofán gyök, TYR jelentése tirozin gyök és VAL jelentése valin gyök; és (ii) egy promotort úgy elhelyezve, hogy elősegítse az említett DNS szekvencia kifejeződését; és (B) az (A) lépésben transzformált említett gazdasejt tenyésztése olyan körülmények között, amelyek lehetővé teszik az említett DNS szekvencia kifejeződését. Ezt az eljárást és az eljárásban alkalmazható anyagokat az alábbiakban részletesebben is leírjuk.
A jelen találmány DNS vegyületeket is szolgáltat humán C fehérje ezen új zimogén formáinak előállításában való felhasználásra. Ezek az új vegyületek mind egy pre-pro peptidet kódolnak, amely egy szignált peptidet tartalmaz a kiválasztás irányítására és egy propeptidet egy γ-karboxilezett fehérjéből (ahol a γ-karboxilezés egy K-vitamin-függő karboxiláz tevékenysége révén ment végbe). Az ilyen propeptid szekvenciák jól ismertek a szakterületen [lásd pl. Suttie és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. 84, 634-637 (1987)]. Előnyösen, és a megalkotás megkönnyítésére, mind a szignálpeptid kódoló szekvencia, mind a propeptid kódoló szekvencia egy γ-karboxilezett fehérje pre-pro-peptidjének aminosavszekvenciájából származik. Ilyen γ-karboxi8
HU 210 863 Β lezett fehérjék lehetnek (de nemcsak ezekre korlátozódnak) a VII. faktor, IX. faktor, X. faktor, protrombin, S fehérje, Z fehérje, és C fehérje. A humán C fehérje pre-propeptidjét kódoló DNS szekvencia a legelőnyösebb a jelen találmány vektoraiban való felhasználásra.
A jelen találmány DNS vegyületei tartalmazzák továbbá a humán C fehéije könnyű láncát kódoló szekvenciát, a pre-propeptid kódoló szekvenciájával közvetlenül szomszédosán elhelyezve, attól lefelé, és azzal transzlációs leolvasó keretben. A humán C fehéije könnyű lánca tartalmazza a naszcensz C fehérje 43.-197. aminosavgyökeit (a határértékeket is beleértve), amint ezt a technika állásánál ismertettük. A K-vitamin-függő plazmafehérjék amino-terminális részei, pl. a C fehérje könnyű lánc amino-terminális része, felelősek ezeknek a fehérjéknek a kalcium-kötő aktivitásáért. Ezeknek a plazma fehérjéknek, pl. a VII. faktornak, IX. faktornak, X. faktornak, S fehéijének és protrombinnak a kalcium-kötő tartományai kicserélhetők egymás között (lásd a 0 215 548A1 számú európai szabadalmi közzétételi irat 12. és 13. oldalait), és ekvivalensek a humán C fehérje könnyű láncának kalcium-kötő tartományával.
A jelen találmány DNS vegyületei tartalmazzák továbbá a LYS-ARG dipeptid (KR) kódoló szekvenciáját közvetlenül a könnyű lánc kódoló szekvencia szomszédságában, attól lefelé, és azzal azonos transzlációs leolvasó keretben. Egy kétszer bázisos dipeptid, mint pl. a LYS-ARG a naszcensz fehérjében a könnyű lánc karboxi-terminális oldalánál helyezkedik el. A LYSARG dipeptid orientációja a kifejezett fehérjében nem lényeges a jelen találmány céljaihoz. Az olyan kétszer bázisos dipeptidek, mint a LYS-LYS vagy az ARGARG ekvivalensek a LYS-ARG dipeptiddel a jelen találmány céljaira. A jelen találmány céljaira azonban a LYS-ARG dipeptid, vagyis az, amely a natív humán C fehérjében található, az előnyösebb.
Közvetlenül a LYS-ARG dipeptid kodonjaitól lefelé van az aktiváló peptid kódoló szekvenciája. A jelen találmány vegyületeiben a változások az aktiváló peptid kódoló szekvenciájában (és az ennek megfelelő aminosavszekvenciában) elsődlegesen felelősek ezen új zimogének megnövekedett trombin-érzékenységi tulajdonságaiért.
Azok, akik a szakterületen jártasak, tudják, hogy a jelen találmány zimogén formái elsődlegesen a humán C fehérje alább leírt zimogén formáitól különböznek. A natív humán C fehérjében az aktiváló peptid:
200 201 202 203 204 205 206 207 208 ASP-THR-GLU-ASP-GLN-GLU-ASP-GLN-VAL209 210 211
ASP-PRO-ARG, ahol a számok a naszcensz humán C fehérjében levő aminosav-gyökök számaira utalnak. A jelen találmány feltárja, hogy az ASP gyök megváltoztatása PHE, GLY, TYR vagy TRP gyökre olyan megfelelő zimogén formát eredményez, amelynek nagyobb az érzékenysége a csak trombinnal végzett hasításra, ezen kívül nagyobb az érzékenysége a trombin-trombomodulin komplexszel végzett hasításra is.
A 209. helyen végzett helyettesítéssel együtt végzett más aminosav-helyettesítések szintén növelketik az így létrejött zimogén trombin-érzékenységét. Az „így létrejött zimogén” kifejezést arra használjuk, hogy jelezze: bár helyettesítéseket írtunk le a naszcensz humán C fehérjében levő aminosav-helyekhez viszonyítva, mégis elsősorban naszcensz humán C fehérjének kell kiválasztódnia (amely az 1.-42. aminosav-gyökök eltávolításának eredménye), hogy egy zimogén formát kapjunk. A prolin gyök helyettesítése (az aktiváló pepiidben) a naszcensz humán C fehéqében levő 210. helynél, a 209. helynél fentebb leírt négy lehetséges helyettesítés valamelyikén kívül, valin gyökre egy új, jelen találmány szerinti zimogént eredményez. Az aszparaginsav gyök helyettesítése (az aktivált nehéz láncban) a naszcensz humán fehérjében levő 214. helynél aszparagin gyökre, a 209. helynél fentebb leírt négy lehetséges helyettesítés valamelyikén kívül, és a 210. helynél fentebb leírt helyettesítéssel vagy anélkül, egy, a jelen találmány szerinti új zimogént eredményez.
így a jelen találmány szerinti humán C fehérje előnyös zimogén formái keletkeznek a naszcensz humán C fehérje molekulák kiválasztásával és feldolgozásával, az alábbi aminosav gyök szekvenciával:
h2n- MET TRP GLN LEU THR SER LEU LEU
LEU PHE VAL ALA THR TRP GLY ILE
SER GLY THR PRO ALA PRO LEU ASP SER
VAL PHE SER SER SER GLU ARG
ALA HIS GLN VAL LEU ARG ILE ARG LYS
ARG ALA ASN SER PHE LEU GLU
GLU LEU ARG HIS SER SER LEU GLU ARG
GLU CYS ILE GLU GLU ILE CYS
ASP PHE GLU GLU ALA LYS GLU ILE PHE
GLN ASN VAL ASP ASP THR LEU
ALA PHE TRP SER LYS HIS VAL ASP GLY
ASP GLN CYS LEU VAL LEU PRO
LEU GLU HIS PRO CYS ALA SER LEU CYS
CYS GLY HIS GLY THR CYS ILE
ASP GLY ILE GLY SER PHE SER CYS ASP
CYS ARG SER GLY TRP GLU GLY
ARG PHE CYS GLN ARG GLU VAL SER PHE
LEU ASN CYS SER LEU ASP ASN
GLY GLY CYS THR HIS TYR CYS LEU GLU
GLU VYL GLY TRP ARG ARG CYS
SER CYS ALA PRO GLY TYR LYS LEU GLY
ASP ASP LEU LEU GLN CYS HIS
PRO ALA VAL LYS PHE PRO CYS GLY ARG
PRO TRP CYS ARG MET GLU LYS
LYS ARG SER HIS LEU LYS ARG ASP THR
GLU ASP GLN GLU ASP GLN VAL
Ri F t2 ARG LEU ILE R3 GLY LYS MET THR
ARG ARG GLY ASP SER PRO
TRP GLN VAL VAL LEU LEU ASP SER LYS
LYS LYS LEU ALA CYS GLY ALA
VAL LEU ILE HIS PRO SER TRP VAL LEU
THR ALA ALA HIS CYS MET ASP
GLU SER LYS LYS LEU LEU VAL ARG LEU
GLY GLU TYR ASP LEU ARG ARG
TRP GLU LYS TRP GLU LEU ASP LEU ASP
ILE LYS GLU VAL PHE VAL HIS
HU 210 863 B
PRO ASN TYR SER LYS SER THR THR ASP
ASN ASP ILE ALA LEU LEU LEU
LEU ALA GLN PRO ALA THR LEU SER GLN
THR ILE VAL PRO ILE CYS GLU
PRO ASP SER GLY LEU ALA GLU ARG GLU
LEU ASN GLN ALA GLY GLN ALA
THR LEU VAL THR GLY TRP GLY TYR HIS
SER SER ARG GLU LYS GLU VAL
LYS ARG ASN ARG THR PHE VAL LEU ASN
PHE ILE LYS ILE PRO VAL ASN
MET LEU CYS ALA GLY ILE LEU GLY ASP
ARG GLN ASP ALA CYS GLU GLY
ASP SER GLY GLY PRO MET VAL ALA SER
PHE HIS GLY THR TRP PHE LEU
VAL GLY LEU VAL SER TRP GLU GLU GLY
CYS GLY LEU LEU HIS ASN TYR
GLY VAL TYR THR LYS VAL SER ARG TYR
LEU ASP TRP ILE HIS GLY HIS
ILE ARG ASP LYS GLU ALA PRO GLN LYS
SER TRP ALA PRO- -COOH
ahol R, jelentése PHE, GLY, TYR vagy TRP; R2 jelentése PRO vagy VAL; és R3 jelentése ASP vagy ASN.
Azok, akik a szakterületen jártasak, tudják, hogy a genetikai kód degeneráltsága következtében DNS vegyületek széles választéka kódolhatja a fentebb bemutatott polipeptidet. Következésképpen a fentebb és az alábbi példákban leírt konstrukciók a jelen találmány előnyös DNS vegyületeivel, vektoraival és transzformánsaival csupán a bemutatás célját szolgálják és nem kívánják korlátozni a találmány oltalmi körét.
A jelen találmány új kódoló szekvenciái könnyen megalkothatok a naszcensz humán C fehérje olyan kódoló szekvenciájából kiindulva, amelyből az AP-kódoló terület ki van iktatva hely-specifikus mutagenezissel. Vázlatosan bemutatva ez a kódoló szekvencia a következő szerkezettel bír:
| pre-pro | LC | KR | AHC |
Amint ezt majd a későbbi példákban leírjuk, ezt a kódoló szekvenciát egy rekombináns DNS kifejező vektorba iktatjuk be; az így létrejött vektort pLAPC plazmidnak nevezzük. A pLAPC plazmid szolgál hasznos kiindulási anyagként a jelen találmány bemutatását célzó vektorok megalkotásához, amely vektorok elősegítik a jelen találmány szerinti humán C fehérje új zimogén formáknak a magas szintű rekombináns kifejeződését. A pLAPC plazmid megalkotásának munkamenetét a pHC7 kiindulási plazmidból az 1. példa írja le. A pHC7 plazmid a Northern Régiónál Research Center-tői (NRRL, Peoria, Illinois 61604) szerezhető be, ahol ez E. coli KI2 RRl/pHC7 törzsben található NRRL B-15926 deponálási számon.
A pLPC-167 G plazmid a jelen találmány bemutatását szolgáló egyik kifejező vektor, amelyben az aszparaginsav kodonja a naszcensz humán C fehérjében a 209. helyen ki van cserélve a glicin kodonjára. A pLPC-167G plazmid megalkotási munkamenetét részletesen a 3. példa írja le. A megalkotás lényegében a C fehérje kódoló szekvencia hely-specifikus mutagenezisét foglalja magában. A pHC7 plazmidból a C fehéije kódoló szekvencia egy részét, amely az aktiváló peptidet kódoló DNS-t tartalmazza, izoláljuk, beiktatjuk M13mpl8 fágba, majd hely-specifikus mutagenezissel megváltoztatjuk. A mutagenizált kódoló szekvenciát azután egy eukarióta klónozó vektorba klónozzuk, hogy olyan plazmidot kapjunk, amelyet pLPC-167G-nek nevezünk, és amely a pLAPCvel azzal a kivétellel, hogy az aktiváló peptidet kódoló szekvenciával végzett beiktatásnál aszparaginsavat kódoló kodon glicint kódoló kodonnal van helyettesítve a 209. helynél.
ApLPC-167F plazmid a jelen találmány bemutatását szolgáló egyik vektor, amelyben a naszcensz humán C fehérjében a 209. helynél levő aszparaginsav kodonja ki van cserélve a fenilalanin kodonjára. A pLPC-167F plazmid megalkotási munkamenetét részletesen leírtjuk a 4. példában. A megalkotásban alkalmazott eltérő mutagenizáló oligonukleotidokon kívül a megalkotási munkamenet lényegében azonos, mint a pLPC-167G megalkotási munkamenete.
A hely-specifikus mutagenezisnek a mellékelt példákban leírt módszerei bemutató jellegűek; ezeket lehet alkalmazni a jelen találmány más vegyületeinek és vektorainak kialakítására is. Amint fentebb megállapítottuk, a jelen találmánynak ezek a más vegyületei között vannak azok a naszcensz fehérjék, amelyek a jelen találmány DNS kódoló szekvenciáiból kialakított mRNS átiratok transzlációjakor keletkeznek. A jelen találmány vegyületei között vannak a jelen találmány naszcensz fehérjéinek kiválasztódásakor kialakult zimogén formák is. Ezen kívül olyan jelen találmány szerinti vegyületek esetében, amelyekben az aszparaginsav gyök a 214. helynél ki van cserélve aszparagin gyökre, a zimogén forma aktiválásakor létrejött aktivált C fehérje származék szintén jelen találmány szerinti vegyület. így a jelen találmány vegyületei az alábbiakat foglalják magukban; DNS kódoló szekvenciák, kifejező vektorok, amelyek ezeknek a vektoroknak a kifejeződését elősegítik, az ezekből a kódoló szekvenciákból kialakult mRNS átiratok transzlációjakor kialakult naszcensz fehérjék, az ezeknek a naszcensz fehérjéknek a kiválasztódásakor kialakult zimogének, és bizonyos zimogének aktivált származékai.
A jelen találmány előnyös kódoló szekvenciáiban (és így az előnyös naszcensz fehérjékben, zimogénekben és aktivált molekulákban a kódoló szekvencia olyan aminosavgyök-szekvenciát kódol, amely azonos a naszcensz humán C fehérje aminosavgyök-szekvenciájával, azzal a kivétellel, hogy helyettesítések vannak a 209., 210. és 214. helyeken. Ezeket a helyettesítéseket az I. táblázatban mutatjuk be.
7. TÁBLÁZAT
A 209., 210. és 214. helyeken kódolt aminosav gyökök a jelen találmány előnyös kódoló szekvenciáiban
Vegyület 209 210 214
1 PHE PRO ASP
2 PHE PRO ASN
HU 210 863 B
Vegyület 209 210 214
3 PHE VAL ASP
4 PHE VAL ASN
5 GLY PRO ASP
6 GLY PRO ASN
7 GLY VAL ASP
8 GLY VAL ASN
9 TYR PRO ASP
10 TYR PRO ASN
11 TYR VAL ASP
12 TYR VAL ASN
13 TRP PRO ASP
14 TRP PRO ASP
15 TRP VAL ASP
16 TRP VAL ASP
A jelen találmány szerinti DNS vegyületeket kémiai úton is lehet szintetizálni, vagy restrikciós fragmentumokból összeállítani, vagy a szakterületen ismert technikák kombinációjával előállítani. Rendelkezésre állnak DNS szintetizáló berendezések is, amelyekkel szintén ki lehet alakítani a jelen találmány szerinti vegyületeket.
A jelen találmány bemutatására szolgáló vektorok, a pLCP-167G és pLPC-167F, tartalmazzák a BK fokozót olyan módon elhelyezve, hogy stimulálja a találmány szerinti kódoló szekvencia adenovírus nagyobb késői promotorát. Azok, akik a szakterületen jártasak, tudják, hogy nagyszámú eukarióta promotor, fokozó és kifejező vektor ismeretes a szakterületen és alkalmazható a jelen találmány szerinti eljárásban. Azok, akik a szakterületen jártasak, azt is tudják, hogy egy eukarióta kifejező vektor képes működni fokozó elem nélkül is. A jelen találmány kulcsa nem az adott fokozóban van, ha egyáltalán van ilyen, nem is a C fehérje zimogén kifejezését elősegítő promotorban, hanem az új kódoló szekvenciában és az ezzel a szekvenciával előállított megfelelő fehérjében van.
A vektor elemek, pl. promotorok, fokozok és szelektálható markerek kiválasztásának azonban nagy hatása van az eukarióta gazdasejt által termelt fehérje végső szintjére. A 0 245 949 számú európai szabadalmi közzétételi irat egy sor kifejező vektort ismertet a natív zimogén C fehéijéhez, amely vektorok a BK fokozót hasznosítják, hogy stimuláljanak egy eukarióta promotort, amely úgy van elhelyezve, hogy elősegítse a naszcensz humán C fehérje kifejeződését. Ezek a vektorok különösen magas kifejeződési szinteket alakítanak ki, amikor eukarióta sejtekbe transzformálják ezeket, amely sejtek egy nagy DNS vírus géntermékét, pl. az adenovírus El A géntermékét is kifejezik. Amint ez a bemutatásra szánt, itt leírt pLPC-167G és pLPC-167F vektorokból nyilvánvaló, a BK fokozó-El A géntermék kifejezési eljárás különösen előnyös a jelen találmány szerinti vektorokkal.
A jelen találmány nem korlátozódik egy adott eukarióta gazdasejtben való alkalmazásra. Eukarióta gazdasejtek széles választéka áll rendelkezésre az olyan törzsgyűjteményekből, mint az American Type Culture Collection (ATTC; Rockville, Maryland 20 852), és felel meg a jelen találmány vektoraihoz való felhasználásra. Egy adott gazdasejt kiválasztása bizonyos mértékig függ a jelen találmány szerinti, C fehérjét kódoló DNS vegyületek kifejezésének elősegítéséhez alkalmazott adott kifejező vektortól. Mivel azonban a naszcensz humán C fehérje és a jelen találmány szerinti naszcensz humán C fehérje származékok ezt követő, transzláció utáni módosításokon mennek keresztül, bizonyos gazdasejtek előnyösebb a jelen találmány vektoraival való felhasználáshoz. Grinnell és munkatársai [Bio/Technology, 5, 1189 81987)] ismertetik, hogy az adenovírussal transzformált humán embrió vesesejtek különösen előnyösek a γ-karboxilezett fehérjék, pl. humán C fehéije, rekombináns előállításában. Az egyik ilyen adenovírussal transzformáit humán embrió vesesejtvonal a 293. sejtvonal, amely az ATCC-től beszerezhető ATCC CRL 1573 számon. A 293. sejtvonal előnyös a jelen találmány vektoraihoz való felhasználáshoz.
Egy γ-karboxilezett fehérje, pl. humán C fehérje zimogén, előállításának előnyei adenovírussal transzformáit sejtvonalban nem korlátozódnak az adenovírussal transzformált humán embrió vesesejtekre. Valójában az adenovírussal transzformált sejtek általában kivételesen jó gazdasejtek γ-karboxilezett humán C fehéije előállításához. Ennek a típusnak egyik különösen előnyös sejtvonala az AVI2-664 (ezután ezt „AV12”-nek nevezzük) sejtvonal, amely az ATCC-től beszerezhető ATCC CRL 9595 deponálási számon. Az AV12 sejtvonalat úgy alkották meg, hogy szíriai hörcsögöt injektáltak a nyak tarkói részén 12. humán adenovírussal, és az így létrejött tumorból sejteket izoláltak. Az alábbi 5. példa leírtja mind a 293., mind az AVI2 sejtvonalak transzformálását a bemutatás céljait szolgáló pLPC-167G és pLPC-167F vektorokkal.
A jelen találmány szerinti vektorokat sokféle eukarióta, főleg emlős gazdasejtbe lehet transzformálni és ezekben kifejezni. A jelen találmány vektorai, amelyek nem rendelkeznek olyan szelektálható markerrel, amellyel stabil eukarióta transzformánsokat lehet izolálni és azonosítani, nem csupán átmeneti vizsgálat céljaira alkalmasak, hanem együtt-transzformálás céljaira is; ezt az eljárást a 4 399 216 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás ismerteti. A jelen találmány vektorai tartalmaznak olyan szekvenciákat is, amelyek lehetővé teszik a replikációt E. coliban is, mivel általában hatékonyabb a plazmid DNS-t E. coliban előállítani, mint más gazdaszervezetben.
A humán C fehérjét kódoló szekvenciák, amelyeket a jelen találmány vektorai tartalmaznak, kifejezése azokban a gazdasejtekben megy végbe, amelyekben az adott promotor társulva van a szerkezeti gén funkciókkal. Azokat a példaként felhozott gazdasejteket, amelyek alkalmasak a jelen találmányban való felhasználáshoz, a II. táblázatban soroljuk fel, megfelelő megjegyzésekkel együtt.
HU 210 863 B
II. TÁBLÁZAT
Gazdasejt Eredet Beszerzési forrás Megjegyzések
HepG-2 Humán máj hepatoblasztóma *ATCC#HB 8065 A 4 393 133 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás ismerteti ennek a sejtvonalnak az alkalmazását
CV-1 Afrikai zöld majom veséje ATCC#CCL70
LLC-MK2, eredeti Rhesus majom veséje ATCC#CCL7
LLC-MK2, származék Rhesus majom veséje ATCC #CCL 7.1 Gyorsabban nő, mint az ATCCCCL7
3T3 Egér embrió fibroblaszt ATCC#CCL92
CHO-K1 Kínai hörcsög petefészek ATCC#CCL61 Prolin-igényes. ACHO-K1nek származékai, pl. a DXB11 dhfr származék, is kialakíthatók ebből a gazdaszervezetből
HeLa Humán méhnyak epiteloid ATCC#CCL2
RPMI 8226 Humán mielóma ATCC #CCL 155 IgG lambda-típusú könnyű lánc kiválasztó
H4IIEC3 Patkány hepatóma ATCC #CRL 1607 Származékokat, pl. a 8-azaguanin-rezisztens FAZA gazdasejteket, is lehet kialakítani ebből a gazdaszervezetből
Cl 271 Egér fibroblaszt ATCC #CRL 1616
HS-Sultan Humán plazmasejt plazmocitóma ATCC # CRL1484
BHK-21 Hörcsög-kölyök vese ATCC#CCL10
* American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, 20 852-1776
Amint a II. táblázat jelzi, sok emlős gazdaszervezet rendelkezik a szükséges celluláris mechanizmussal a jelen találmány szignálpeptidjének felismeréséhez és megfelelő feldolgozásához, és képes elvégezni az olyan transzláció utáni módosításokat, mint pl. a glikozilezés, γ-karboxilezés és β-hidroxilezés, ami megfigyelhető a vérplazmában jelen levő humán C fehérjében. Vektorok széles választéka létezik az ilyen eukarióta gazdasejtek transzformálásához, amint később tárgyaljuk, de az ott példaként felhozott adott vektorokat semmiképpen sem azért ismertetjük, hogy korlátozzuk ezekkel a jelen találmány oltalmi körét.
A pSV2-típusú vektorok tartalmazzák az SV40 genomnak azokat a szegmenseit, amelyek egy meghatározott eukarióta transzkripciós egység promotort (ep), beavatkozó szekvenciát (IVS), és poliadenilező helyet (pA) alkotnak. SV40 T-antigén távollétében a pSV2 típusú vektorok az emlős és más eukarióta sejteket úgy transzformálják, hogy integrálódnak a gazdasejt kromoszomális DNS-be. pSV2-típusú plazmidok sokaságát alkották már meg [lásd: „Eukaryotic Viral Vectors”, szerkesztette Gluzman, kiadó: Gold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, New York (1982)], ilyenek a pSV2-gpt, a pSV2-neo, a pSV2-dhfr, a pSV2hogy, és a pSV2-P-globin plazmidok, amelyekben az SV40 promotor segíti elő egy beiktatott gén transzkripcióját. Ezek a vektorok alkalmasak a jelen találmány kódoló szekvenciáihoz való felhasználásra, és beszerezhetők vagy az American Type Culture Collection-tól (ATCC, Rockville, Maryland), vagy a Northern Régiónál Research Laboratory-tól (NRRL, Peoria, Illinois).
A pSV2-dhfr plazmid (ATCC 37 146) tartalmaz egy rágcsáló dihidrofolát reduktáz (dhfr) gént az SV40 korai promotor szabályozása alatt. Ismert, hogy megfelelő körülmények között a dhfr gén sokszorozódik vagy másolódik a gazdaszervezet kromoszómájában. Ez a sokszorozódás, amelyet Schimke ír le összefoglaló cikkében [Cell, 37, 705-713 (1984)], olyan DNS szekvenciákat érint, amelyek szorosan határosak a dhfr génnel, pl. a jelen találmány naszcensz humán C fehérje-kódoló szekvenciáit, és így ezt a sokszorozódást fel lehet használni a jelen találmány C fehérje zimogénjei termelésének fokozására.
Azok a plazmidok, amelyeket a jelen találmány naszcensz C fehérjéjének és C fehérje zimogénjeinek emlősökben és más eukarióta gazdasejtekben való kifejezéséhez alkotunk meg, nagyob sokféle promotort képesek használni. A jelen találmány semmiképpen sem korlátozódik csak azokra a promotorokra, amelyeket itt példaként felhozunk. Az olyan promotorok, mint az SV40 késői promotor, vagy azok az eukarióta promotorok, amelyeket Bucher és munkatársai ismertet12
HU 210 863 Β nek [Nuc. Acids Rés. 14 (24), 1009 (1986)], vagy eukarióta génekből származó promotorok, mint pl. az ösztrogénnel indukálható csirke ovalbumin gén, az interferon gének, a glükokortikoiddal indukálható tirozin aminotranszferáz gén, a timidin kináz gén, és a nagyobb korai és késői adenovírus-gének könnyen izolálhatok és módosíthatók olyan rekombináns DNS kifejező vektorokban való alkalmazáshoz, amelyeket humán C fehérje zimogén előállítására szánunk eukarióta gazdasejtekben. Eukarióta promotorokat lehet alkalmazni egymás után (tandem) is, hogy elősegítsék egy találmány szerinti kódoló szekvencia kifejezését. Ezen kívül nagyszámú retrovírusról is ismert, hogy fertőz sokféle eukarióta gazdasejtet. A retrovírus DNS-ben jelen levő hosszú terminális ismétlődések gyakran kódolnak promotor aktivitást és így alkalmazhatók a jelen találmány kódoló szekvenciái kifejezésének elősegítésére.
A pRSVcat plazmid (ATCC 37 152) tartalmazza a Rous szakróma vírus (RVS) hosszú terminális ismétlődésének részeit, amely vírusról ismert, hogy fertőz csirkéket és más gazdasejteket. Az RVS hosszú terminális ismértlődő szekvenciáit a pRSVcat plazmid -0,76 kb-s Ndel-Hindül restrikciós fragmensében lehet izolálni. Az RSV hosszú terminális ismétlődő szekvenciáiban levő promotor [Gorman és munkatársai: PNAS 79, 6777 (1982)] alkalmas a jelen találmány vektoraiban való felhasználásra. A pMSVi plazmid (NRRL B15 929) tartalmazza a rágcsáló szarkóma vírus (MSV) hosszú terminális ismétlődéseit; erről a vírusról ismert, hogy egereket és más gazdasejteket fertőz. Ezek az ismtétlődő szekvenciák alkalmasak promotorként való felhasználásra a jelen találmány vektoraiban. Az egér metallotionein (MMT) promotor szintén jellemezhető azzal, hogy felhasználható eukarióta gazdasejtekben és alkalmas a jelen találmány vektoraiban való felhasználásra. Az MMT promotor a 15 kb-s pdBPV-MMTneo plazmidban (ATCC 37 224) van jelen, amely kiindulási anyagként szolgálhat a jelen találmány további plazmidjainak megalkotásában.
Az itt példaként bemutatott DNS szekvenciák és plazmidok számos módosítása és változata lehetséges, így pl. a genetikai kód degenerációja lehetővé teszi nukleotidok helyettesítését végig a polipeptid kódoló területek mentén, valamint a transzlációs stop szignálban, anélkül, hogy a kódoló polipeptid szekvencia megváltozna. Az ilyen kicserélhető szekvenciák kikövetkeztethetők a humán C fehérje ismert aminosav- vagy DNS szekvenciáiból, és az alábbi ismertetett hagyományos szintetikus eljárásokkal vagy hely-specifikus mutagenezissel alkothatok meg. A szintetikus eljárásokat lényegében Itakura és munkatársai [Science, 198, 1056 (1977)] és Crea és munkatársai [Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 75, 5765 (1978)] eljárásai szerint végezhetjük el. Ennek megfelelően a jelen találmány nem korlátozódik kizárólag azokra a DNS szekvenciákra és plazmidokra, amelyeket itt konkrétan példaként leírunk.
A jelen találmány valamely vektorának transzformálására után valamely eukarióta gazdasejtbe transzformánsokat lehet kiválasztani szelektálható fenotípus alapján. Ezt a szelektálható fenotípust a gazdasejtbe vagy a kifejező vektoron jelen levő szelektálható markénál, vagy egy, a kifejező vektorral együtt transzformáit másik vektoron jelen levő szelektálható markerral lehet átadni. Amikor transzformánsokat választunk ki, kívánatos azonosítani, melyik transzformánsok fejezik ki a legmagasabb szinten a kifejező vektorban kódolt kívánt fehérjét. Ez az azonosítás különösen fontos az együtt-transzformálási eljárás után, amely egy sor olyan transzformánst alakít ki, amely csupán a szelektálható markert tartalmazó plazmidot tartalmazza és nem tartalmazza a kifejező vektort. A későbbi 6. példában leírunk egy olyan munkamenetet, amely nem csupán azonosítja azokat a sejteket, amelyek a kívánt fehérjét kifejezik és kiválasztják, hanem mennyiségileg is értékelik a kiválasztott fehérjét az ezzel a módszerrel vizsgált többi sejthez viszonyítva. A munkamenet lehetővé teszi a kívánt fehérjét legmagasabb szinten kiválasztó élő sejtek izolálását is.
Az aktivált C fehérjének jelentős trombózis-ellenes tulajdonságai vannak az intravénás trombusok kiterjedésének megakadályozásában, artériás trombusok képződésének megakadályozásában, és Gram-negatív fertőzésből, endotoxémiából és kiterjedt intravaszkuláris alvadásból eredő elhalálozás és szervi károsodás megakadályozásában. Állatkísérletekben natív zimogén C fehérje infúziónak nincs hatása sokk-kai járó Gram negatív szeptikémia és kiterjedt intravaszkuláris alvadás (DIC) kezelésében. Ezek a negatív eredmények azt jelzik, hogy a széles körben elterjedt mikrovaszkuláris trombózisnak ebben a formájában, bár jelentős a trombin-képződés, nincs jelen elegendő trombomodulin ahhoz, hogy komplex képződjék trombinnal és az infúzióval beadott zimogén aktiválódjék.
Az aktivált C fehéije fő hátránya, mint minden aktivált szerint proteázé, a rövid fél-élettartam (T'/2) a zimogén prekurzorral Összehasonlítva. A T*/2-et kutyákban 11 percnek, majmokban 22-26 percnek határozták meg. Ezzel összehasonlítva a natív C fehérje zimogén T,/2 értékét emberben 6 órára becsülték. Az aktivált szerint proteázok, köztük az aktivált C fehérje, zimogénjeikkel összehasonlítva rövidebb biológiai fél-élettartamának oka komplex, és érinti mind a celluláris, mind a humorális mechanizmust. Az aktivált szerin proteázok komplexeket is képeznek a plazmában normálisan jelen levő szerin proteázokkal. Az aktivált C fehéije (APC) komplexet képez egy újonnan leírt APC inhibitorral, valamint az alfa-2 markoglobulinnal is. Az inaktív zimogének, köztük a jelen találmány C fehéije zimogénjei, nem reagálnak a szerin proteáz inhibitorokkal.
A jelen találmány C fehérje zimogénjeinek előnye az, hogy trombinnal jobban aktiválódnak, mint a natív C fehérje zimogén, mivel a trombin számára nem abszolút követelmény, hogy trombomodulinnal komplexben legyen ezeknek a zimogéneknek az aktiválásához Ca2+ jelenlétében. Ebből következik, hogy ezek a C fehérje zimogének, amikor beadjuk, aktiválódni képesek az intravaszkuláris trombin képződés helyeinél, vagyis bármely olyan helyen, ahol intravaszkuláris trombus van kifejlődőben. így ezeket a a rekombináns C fehérje zimogéneket elő-gyógyszerként alkalmazhat13
HU 210 863 B juk, amelyek csak a trombin-képződés helyén válnak aktiválttá. Mivel ezeket a trombin-érzékeny zimogéneket zimogén formában adhatjuk be, ezek nem képeznek komplexet C fehérje inhibitorokkal, és a natív C fehérje zimogén biológiai fél-élettartamával azonos biológiai fél-élettartamot mutatnak.
A jelen találmány rekombináns C fehérje zimogénjei alkalmasak sokféle betegségi állapot megelőzésében és kezelésében, ilyenek pl. az intravaszkuláris alvadás, ezen belül a mélyvénás trombózis; tüdő embólia; perifériás artériás trombózis; a szív- és perifériás artériákból eredő embóliák, akut szívizom-infarktus, trombotikus szélütés, és kiterjedt intravaszkuláris alvadás. Ezeket a C fehérje származékokat hatékonyan lehet alkalmazni sok olyan beteg kezelésében, akiknek heterozigótás C fehérje hiánya van, amely ismétlődő mély vénás trombózisban jelentkezik, vagy homozigótás C fehérje-hiányos betegek esetében, akiknek heveny vörhenye (purpura fulminans) van.
Kísérleti és klinikai adatok azt sugallják, hogy a hagyományos alvadásgátló szerek, főleg a warfarin, hasznosak a fejlődő rákok kezelésében, és úgy működnek, hogy megakadályozzák vagy csökkentik ezeknek a rosszindulatú daganatoknak a távoli áttételes károsodásait. Ezen kívül jól megállapított tény, hogy a gyulladást stimuláló szerek, mint az endotoxinok, a tumor nekrózis faktor, és az interleukin 1, felélik a trombomodulint az endotéliális sejtek felületéről, amelyről úgy gondoljuk, hogy előidézi a mikrovaszkuláris és makrovaszkuláris trombózist. A találmány rekombináns C fehéije zimogénjei hatásos alternatíváját képviseli a hagyományos alvadásgátlóknak ezekben a klinikai szituációkban.
A jelen találmány C fehérje zimogénjeinek adagjait, megnyújtott T 1/2 értékek miatt, jelentősen lehet csökkenteni klinikai szituációkban, összehasonlítva az aktivált C fehérjével. Homozigóta C fehérje hiányban a jelen találmány C fehérje zimogénjeinek adagja az 5 mg és 100 mg/kezelés közti tartományban van, és heterozigótás C fehérje hiányban a 2,5 és 50 mg/kezelés közti tartományban van.
Az aktivált C fehérjének előnyös terápiás indikációja a mély vénás trombózis és a tüdőembólia megelőzése, ezt jelenleg heparin kis adagjaival kezelik. Azoknál a betegeknél, akiknél nagy kockázattal kell számolni, főleg azoknál a betegeknél, akik sebészeti beavatkozáson mentek keresztül, a rekombináns aktivált C fehérje adagja a mély vénás trombózis megelőzésére 1-10 mg/nap. A jelen találmány C fehérje zimogénjének adagja 0,255 mg/nap közti tartományban van. Ezeknek a zimogéneknek további előnye az, hogy ezeket be lehet adni nagyobb injekció-adagban, állandó IV infúzió helyett. Az aktivált C fehérjét állandó IV infúzióban kell beadni ennek a fehéijének a rövid T 1/2 értéke miatt. Kifejlődött, objektívan dokumentált mélyvénás trombózisban és/vagy tüdőembóliában az aktivált C fehérje dózisa terhelp dózisként 1-10 mg közti tartományban van, ezt folyamatos IV infúzió követi 3-30 mg/nap közti tartományban. A jelen találmány C fehérje zimogénjeit viszont ismételt injekció adagokban adhatjuk be, amelyek nem haladhatják meg a 12 mg-ot 24 óránként.
Hasonló adagolási munkamenet alkalmazható perifériás artériás trombusok kezelésére is. Kisebb a valószínűsége a vérzési komplikációknak a jelen találmány C fehérje zimogénjeinek infúziójakor. így ezek a zimogének helyettesíthetik a heparint sebészeti beavatkozás közben és az után tromboektómiával és embolektómiával kapcsolatban; ezek azok a sebészeti eljárások, amelyek megvédik az iszkémiás végtagokat az amputálástól egy akut artériás elzáródás fellépése esetében. Ezek a zimogének az aktivált C fehérjéhez viszonyítva hosszú T 1/2 értékük miatt, valamint beadásuk viszonylagos könnyűsége miatt - inkább alkalmasak, mint az aktivált C fehérje, a szívből eredő artériás embólia kezelésére. Ezeknek a zimogéneknek a hoszszútávú beadása olyan adagokban, amelyek a kialakult mélyvénás trombózis-tüdőembólia kezeléséhez használt adagokhoz hasonlók, fontos alkalmazási formát jelent a szívtáji embóliák megelőzésében.
Hasonlóképpen a jelen találmány C fehérje zimogénjei alkalmazhatók a perifériás artériákban, elsősorban a nyaki verőérben levő trombusokból eredő embóliák kezeléséhez, amelyek nem kezelhetők, vagy nem előzhetők meg megfelelően a jelenleg rendelkezésre álló kezelési munkamenet szerint, amelyek közül pl. az alábbiakat említjük meg: a vérlemezke-müködés elfojtására képes gyógyszerek, szájon át beadható alvadásgátlók, vagy mindezek kombinációit. Szívtáji embóliák esetében ezeket a zimogéneket hosszú távon azonos módon adhatjuk be, mint ahogyan ezt szívtáji embóliáknál más esetekben körvonalazták; ezek főbb lehetősége a szívtáji artériák trombusaiból eredő és embóliás hűdést előidéző embóliák megelőzésében van.
A jelen találmány szerinti C fehérje zimogének használhatók trombotikus hűdések esetén is. Manapság a hűdéseket általában nem kezelik hagyományos koagulánsokkal. A hűdések kezelése vagy heparinnal, vagy orális alvadásgátlókkal, bár alkalmanként hasznos lehet, a vérzés kockázatát hordozza a trombózistól sújtott agyi területen, ezáltal súlyosbítva a hűdést kísérő neurológiai hiányosságokat. Vérzési komplikációk okozásának csekély lehetősége és szelektivitása miatt a jelen találmány szerinti zimogéneket be lehet adni hűdéses betegeknek, és ezek előnyösek lehetnek az összetömörödött artériás trombusok helyi kiterjedésének megakadályozásában, ezáltal csökkentve a hűdés eredményeképpen létrejövő neurológiai hiányosságokat. A hűdés kezelésében hatékony zimogén mennyisége kisebb, mintha aktivált C fehérjét alkalmaznánk, de a dózis változhat betegenként a hűdés természetétől és súlyosságától függően.
A jelen találmány szerinti zimogének hasznosak lehetnek akut szívizom infarktus kezelésében is, profibrinolitikus tulajdonságaik miatt, miután aktiváltak lettek. Ezeket a zimogéneneket szöveti plazminogén aktivátorral együtt lehet beadni a szívizom infarktus akut fázisai során. Miután az elzáró koszorúér trombus feloldódott, a zimogéneket további napokon át is adhatjuk, hogy megelőzzük az akut szívizom újabb infarktusát. Ha ebben a helyzetben aktivált C fehérjét adunk be, a betegeknek 1-10 mg terhelő dózist adunk
HU 210 863 B akkor, amikor a plazminogén aktivátor kezelés kezdődik, ezt követi az aktivált C fehérje folyamatos infúziója 3-30 mg/nap közötti tartományban. Ezzel ellentétben a jelen találmány szerinti zimogéneket egyedi injekcióként (bóluszként) adhatjuk be 3-4-szer naponta olyan adagokban, hogy az összmennyiség ne haladja meg a 12 mg/nap mennyiséget.
Az aktivált C fehéije hasznos a szétteijedt intravaszkuláris alvadás kezelésében. Heparint és az orális alvadásgátlókat adták a szétteijedt intravaszkuláris alvadásban (DIC) szenvedő betegeknek kiterjedt klinikai kísérletekben, de az eredmények csalódást okoztak. A szétterjedt intravaszkuláris alvadásban az aktivált C fehéije, valamint a jelen találmány zimogénjei, határozott előnyt mutatnak a hagyományos alvadásgátlókhoz viszonyítva. Amint fentebb említettük, állatkísérletekben határozottan megállapították, hogy a C fehérje zimogén hatástalan a Gram negatív szeptikémiából és a szétterjedt intravaszkuláris alvadásból eredő szervi károsodás és pusztulás megakadályozásában. Ezzel ellentétlen a jelen találmány C fehéije zimogénjei, mivel nagyon fogékonyak a trombinnal való aktiválásra, hatékonyak a szétteijedt intravaszkuláris alvadás kezelésében. Az aktivált C fehéije becsült szükséglete DIC kezelésre mintegy 100 mg/nap; a jelen találmány zimogén formáinak dózisa DIC kezelésére nem haladja meg a 30 mg/napot, amely ismételt bólusz injekciókként adhatók be.
A hagyományos alvadásgátló gyógyszerek, főleg a warfarin, hasznos a behatoló rosszindulatú tumorok kezelésében. Több tumorsejt termel olyan anyagokat, amelyek beindítják az alvadási rendszer aktiválását, helyi fibrin tartalékokat eredményezve. Ezek a fibrin tartalékok „fészekéként működnek, amelyekben a ráksejtek osztódnak áttételes rendellenességeket képezve. Nem lehetséges azonban beadni warfarint vagy más hagyományos alvadásgátlókat a kemoterápia intenzívebb és hatékonyabb forméival kombinálva, mivel az ilyen terápia mindig éles csökkenést vált ki a vérlemezke-számban, és a trombocitopénia warfarin terápiával kombinálva a beteget súlyos vérzési komplikációk elfogadhatatlanul nagy kockázatának teszi ki, így viszont lehetővé válik a behatoló rákban szenvedő betegek kezelése hatékony és intenzív kemoterápiával a jelen találmány C fehérje zimogénjével kombinálva. A kezelést egy olyan adagolási munkamenet követheti, amely a mély vénás trombózisban és a tüdő-embóliában alkalmazott munkamenethez hasonló.
A jelen találmány szerinti zimogéneket és aktivált származékait ismert módszerekkel szerelhetjük ki, hogy gyógyászatilag hasznos kompozíciókat képezzünk, ahol a humán C fehéije zimogént összekeverjük gyógyászatilag elfogadható hordozóanyagokkal. Megfelelő hordozóanyagokkal illetve kiszereléseket, beleértve más humán fehérjéket, pl. humán szérum albumint is, ír le pl. az alábbi irodalmi hely: Remington’s Pharmaceutical Scienses, 16. kiadás, Mack Publishing Co. (kiadó) szerkesztették: Osol és munkatársai (1980); ezt az irodalmi helyet referenciaként beépítjük a jelen bejelentésbe. Az ilyen kompozíciók tartalmaznak egy hatékony mennyiségű C fehérje zimogént megfelelő mennyiségű hordozóanyaggal együtt, hogy így készítsük el a gazdaszervezetbe való hatékony beadáshoz alkalmas, gyógyászatilag elfogadható kompozíciókat. A C fehéije kompozíciókat parenterálisan lehet beadni, vagy más olyan módszerekkel, hogy ezek bejutása a véráramba hatékony formában biztosítva legyen.
Azt is meg kell jegyeznünk, hogy a jelen találmány szerinti zimogéneket alkalmazhatjuk aktivált C fehéije in vitro előállítására. Bár rekombináns módszerek aktivált C fehérje előállítására közvetlenül eukarióta sejtekben ismeretesek, ezeknél a módszereknél az szükséges, hogy az aktivált C fehéije sokáig maradjon a tenyészközegben. Ezen kívül az aktivált C fehérjét tisztítani kell a tenyészközegből, amely drága, soklépéses folyamat. Mivel az aktivált C fehéije viszonylag kevéssé stabil, ezek a közvetlen kifejezési módszerek csak kis mennyiségű aktivált C fehérjét termelhetnek. Ezzel szemben a jelen találmány zimogénjeit egyedül trombinnal is lehet aktiválni, még Ca2+jelenlétében is, és így ez az eljárás jelentős előnyöket biztosít az ismert eljárásokkal szemben az aktivált C fehérje előállításában.
Az alábbi példák bemutatják az eljárásokat és leírják a megalkotás! munkamenetet a jelen találmány bemutatásának céljait szolgáló vegyietekhez, vektorokhoz és transzformánsokhoz, anélkül, hogy találmányunkat csak ezekre korlátoznánk.
1. példa
A pLAPC plazmid megalkotása
Ez a példa részletes munkamenetet mutat be a pLAPC plazmid megalkotásához. Röviden ismertetve az 1 A. példa leírja a C fehérje molekula egy részét, beleértve az aktiváló peptidet, kódoló DNS fragmentum izolálását a pHC7 plazmidból. Az IB. példa leírja ennek a DNS fragmentumnak a klónozását az M13mpl8 fágba és az aktiváló peptidet kódoló DNS eltávolítását az így létrejött rekombináns fágból hely-specifikus mutagenezissel. Az IC. példa leírja a végső lépéseket a pLAPC plazmid megalkotásában, pontosabban a mutagenizált fragmentum izolálását és ennek ligálását két olyan fragmentummal, amelyek a pLPC plazmidból származnak; így kapjuk meg a pLAPC plazmidot. A pLPC plazmid megalkotás! munkamenetét a 2. példa írja le.
A. A humán Cfehérje aktiváló peptidjét kódoló szekvenciát tartalmazó DNS fragmentum izolálása A pHC7 plazmid tartalmazza a naszcensz humán C fehéije teljes kódoló szekvenciáját. 1 liter L tápközeget (10 g pepton, 10 g NaCl, és 5 g élesztőkivonat), amely tartalmaz 15 pg/ml tetraciklint is, indukálunk E. coli K12 RRl/pHC7 (NRRL B-15 926) tenyészetével, és inkubáljuk levegőn rázó inkubátorban 37 °C hőmérsékleten, amíg az optikai sűrűség (OD) nem éri el 590 nmnél a -1 abszorbancia értéket; ekkor 150 mg klóramfenikolt adunk a tenyészethez. Az inkubálást folytatjuk mintegy 16 órán át; a klóramfenikol hozzáadása gátolja a fehérjeszintézist, és így gátolja a további sejtosztódást, de lehetővé teszi, hogy a plazmidreplikáció tovább folytatódjék.
HU 210 863 Β
A tenyészetet centrifugáljuk Sorwall GS1 rotorban (DuPont Co., Instrument Products, Biomedical Division, Newtown, CN 06 470) 6000 fordulat/percnél 5 percen át 4 °C hőmérsékleten. Az így kapott felülúszót eldobjuk, és a sejtüledéket mossuk 40 ml TES pufferral (10 mmól/1 trisz-HCl, pH 7,5; 10 mmól/1 NaCl; és 1 mmól/1 EDTA), majd újra üledékbe visszük. A felülúszót ismét eldobjuk, és a sejtüledéket szárazjég-etanolos fürdőben fagyasztjuk, majd felengedjük. A felengedett sejtüledéket újra szuszpendáljuk 10 ml, 25% szacharózt és 50 mmól/1 EDTA-t tartalmazó oldatban. Mintegy 1 ml 5 mg/ml-es lizozim oldatot, 3 ml 0,25 mól/1 EDTA oldatot (pH 8,0); és 100 μΐ 10mg/les RN-áz A-t adunk az oldathoz, amelyet azután jégen inkubálunk 15 percen át. 3 ml lizáló oldatot [amely úgy készül, hogy összekeverünk 3 ml 10%-os Triton-X100at, 75 ml, 0,25 mól/l-es EDTA-t (pH 8,0), 15 ml 1 mól/l-es trisz-HCl-t (pH 8,0), és 7 ml vizet] adunk a lizozimmal kezelt sejtekhez, összekeverjük, és az így létrejött oldatot jégen inkubáljuk további 15 percen át. A lizált sejteket szárazjég-etanolos fürdőben fagyasztjuk, majd felengedtetjük.
A sejttörmeléket az oldatból centrifugálással távolítjuk el, 25 000 fordulat/percnél 40 percig SW27 rotorban (Beckman, 7360 N. Lincoln Avenue, Lincolnwood, Illinois, 60 646) végezve a centrifugálást. Mintegy 30,44 g CsCl-t és ~1 ml 5 mg/ml-es etidium-bromidot adunk az oldathoz, amelynek térfogatát azután 40 ml-re állítjuk be.
Az oldatot Vti50 centrifuga-csőbe dekantáljuk (Beckman). A csövet leforrasztjuk, majd Vti50 rotorban centrifugáljuk -16 órán át. Az így létrejött plazmid csíkot, amelyet ultraibolya fénnyel teszünk láthatóvá, izoláljuk, majd ti75 csőbe és rotorba (Bechman) helyezzük és centrifugáljuk 55 000 fordulat/percnél 16 órán át. Bármilyen szükséges térfogatbeállítást 0,761 g/ml CsCl-t tartalmazó TES-t alkalmazva végzünk. A plazmid csíkot ismét centrifugáljuk, az etidium-bromidot kivonjuk sóval telített izopropanollal, és végül 1:3 arányban hígítjuk TES pufferra]. Ezután két térfogat etanolt adunk az oldathoz, és az így létrejött keveréket egy éjszakán át inkubáljuk -20 °C hőmérsékleten. A plazmid DNS-t üledékbe visszük olyan módon, hogy az oldatot SS34 rotorban (DuPont Co.) centrifugáljuk 15 percig 10 000 fordulat/percnél.
Az ezzel az eljárással kapott, mintegy 1 mg pHC7 plazmid DNS-t 1 ml TE pufferban [10 mmól/1 trisz-HCl (pH 7,6), és 0,1 mmól/1 EDTA] szuszpendálunk, és -20 °C hőmérsékleten tároljuk. A pHC7 plazmid restrikciós hely- és működési térképét a mellékelt ábrák közül a 2. ábra mutatja be.
Mintegy 7 gg (7 μΐ) pHC7 plazmid DNS-t hozzáadunk 25 μΐ 10 x Core pufferhoz [Core puffer (BRL) 500 mmól/1 trisz-HCl-ben (pH 8,0); 500 mmól/1 NaCl; és 100 mmól/1 MgCl2], 198 μΐ H2O-hoz és 12 μΐ SstI restrikciós enzimhez [-60 egység, Bethesda Research Laboratories (BRL), Gaithersburg, Maryland 20 877; az összes enzim, amelyre ebben a példában hivatkozunk, kapható, hacsak másként nem jelezzük, a BRLnél vagy a New England Biolabs-nál (NEB; Beverly,
Massachussets 01 915-9990); ezeket az enzimeket lényegében a gyártó ajánlásaival összhangban alkalmazzuk], és 8 μΐ (80 egység) Sáli restrikciós enzimhez. A reakciókeveréket 37 ’C hőmérsékleten 4 órán át inkubáljuk; ezután az Sstl-gyel és Sall-gyel emésztett pHC7 plazmid DNS-t először fenollal, majd kloroformmal extraháljuk, etanollal végzett kicsapással és centrifugálással összegyűjtjük, végül 15 μΐ TE/10 pufferban [10 mmól/1 trisz bázis (pH 7,6) és 0,1 mmól/1 EDTA] szuszpendáljuk.
A reakciókeveréket ezután elektroforézisnek vetjük alá -0,6%-os, alacsony gélesedési hőmérsékletű agaróz (FMC Corporation, Maríné Colloids Division, Rockland, Maine 04 841) gélen 2-3 órán át -130 V-nál és -65 mAnél trisz-acetát pufferban. A gélt etidium-bromid híg oldatával festjük, majd a -0,7 kb-s SstI—Sáli restrikciós fragmentumot alkotó DNS csíkját, amelyet hosszúhullámú UV fénnyel teszünk láthatóvá, kivágjuk a gélből egy kis szegmens térfogatát a szegmens tömege és sűrűsége alapján meghatározzuk, és 4 térfogat, 0,2 mól/1 NaCl-t is tartalmaz TE-t adunk a szegmenst tartalmazó csőhöz. A szegmenst azután 72 ’C hőmérsékleten végzett inkubálással megolvasztjuk. A pHC7 plazmid -0,7 kb-s SstI— Sáli restrikciós fragmentumának mintegy 0,5 pg-ját kapjuk meg mintegy 400 μΐ térfogatban. A DNS további tisztítását érhetjük el, ha a DNS oldatát átengedjük egy NACS-prepac oszlopon (BRL) a gyártó útmutatásai szerint; a tisztított fragmentumot újra szuszpendáljuk 15 μΐ ionmentesített vízzel.
B. Rekombináns fág megalkotása és az aktiváló peptidek kódoló DNS eltávolítása hely-specifikus mutagenezissel
Mintegy 1 μg M13mpl8 fág (amelyet a New England Biolabstól szerzünk be) RF (replikatív forma) DNS-t emésztünk SstI és Sáli restrikciós enzimekkel, lényegében az 1A. példában leírt eljárással összhangban. A reakciót úgy állítjuk be, hogy a reakciókeveréket előbb fenollal, majd kloroformmal extraháljuk; ezután a DNS-t kicsapjuk, centrifugálással összegyűjtjük, és újra szuszpendáljuk 15 μΐ TE pufferban. Az emésztésből kapott két fragmentumot elkülönítjük -0,6%-os, alacsony gélképzési hőmérsékletű agaróz gélen, majd a nagyobb fragmentumot kihasítjuk a gélből és tisztítjuk olyan módon, ahogyan az 1A. példában leírttuk.
Mintegy 0,1 μg-ot (7 μΐ H2O-ban) a pHC7 plazmid -0,7 kb-s SstI—Sáli restrikciós fragmentumából hozzáadunk 5 μΐ, Sstl-gyel és Sall-gyel emésztett M13mpl8 RF DNS-hez 2 μΐ 10 x ligáz pufferral [0,5 mól/1 trisz-HCl (pH 7,8), 60 mmól/1 MgCl2, és 0,2 mól/1 ditiotreitol (DTT)], 2 μΐ 1 mg/ml BSA-val, 1 μΐ 25 mmól/l-es ATP-vel, 1 μΐ (-400 egység) T4 DNS ligázzal (NEB) és 2 μΐ vízzel együtt. A ligációs reakciókeveréket 25 ’C hőmérsékleten egy éjszakán át inkubáljuk; a ligáit DNS alkotja a kívánt M13mpl8-HE1 DNS-t kétszálú formában.
E. coli KI2 JM101 egy éjszakán át nőtt tenyészetéből (New England Biolabs) mintegy 300 μΐ-t alkalmazunk 30 ml 2 x TY tápközeg (TY tápközeg: 10 g/1 tripton, 10 g/1 NaCl; és 5 g/1 élesztőkivonat) inokulálására
HU 210 863 Β és az így létrejött tenyészetet 37 ’C hőmérsékleten inkubáljuk levegőztetés mellett, amíg az ODgoo érték ~0,5 lesz. A tenyészetet 10 percen át hűtjük jéghideg vízben, centrifugálással összegyűjtjük, és újra szuszpendáljuk 15 ml hideg 10 mmólÁ-es NaCl-ben. A sejteket újra szuszpendáljuk 1,5 ml hideg 30 mmól/l-es CaCl2-ben. A sejteket 20 percre jégre helyezzük és centrifugálással összegyűjtjük. A sejteket újra szuszpendáljuk 1,5 ml hideg 30 mmól/l-es CaCl2-ben; a sejtek 200 μΐ-es alikvotjait kivesszük, hozzáadjuk 9 μΐ, fentebb készített ligáit DNS-hez, és jégen inkubáljuk mintegy 30 percen át. A sejt-DNS keveréket azután 42 °C hőmérsékleten inkubáljuk 2 percig, majd hozzáadjuk 3 ml fedő-agarhoz (TY tápközeg 0,5% agarral, 45 ’C hőmérsékleten olvadt állapotban tartva), amely tartalmaz még 50 μΐ 2%-os X-Gal-t („X-Gal”: 5-bróm4-klór-3-indolil-|3-D-galaktopiranozid), 50 μΐ 100 mmól/1 IPGT-t („IPGT”: izopropil-p-D-tiogalaktopiranozid) és 100 μΐ, logaritmikus növekedési fázisban levő E. coli K12 JMlOl-et is. A sejt-fedőagar keveréket azután TY agar lemezekre helyezzük és a lemezeket 37 'C hőmérsékleten egy éjszakán át inkubáljuk.
A következő reggelen négy tiszta tarfoltot használunk fel egyenként 2 ml 2 x TY tápközeg inokulálására, és az így létrejött tenyészeteket 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk levegőztetés mellett 6 órán át. Ezután a tenyészeteket centrifugáljuk és az így létrejövő felülúszók 500 μΐ-ét (a sejtüledéket arra a célra használjuk fel, hogy fág DNS-t készítsünk restrikciós enzimes elemzéshez), hozzáadjuk E. coli K12 JM101 500 μΐ tenyészetéhez (OD550 = 0,5) és 50 ml 2 x TY tápközeghez. Ezeket a tenyészeteket azután egy éjszakán át inkubáljuk 37 ’C hőmérsékleten. Az RF fág DNS-t a sejtüledékből az 1 A. példában leírt eljárás kisebb léptékű változatát alkalmazva izoláljuk, azzal a kivétellel, hogy antibiotikumot nem alkalmazunk a tenyészközegbe, és az ultracentrifugálási lépést fenollal és kloroformmal végzett extrahálás helyettesíti. Az M13mpl8HE1 fág DNS-t tartalmazó transzformánsokat fág DNSük restrikciós enzimes elemzésével azonosítjuk.
Az egy éjszakán át nőtt tenyészeteket centrifugáljuk, és mintegy 1 ml olyan oldatot, amely 20% polietilénglikol (PEG) 6000-t és 2,5 mmól/1 NaCl-t tartalmaz, adunk hozzá 5 ml felülúszóhoz; ezt azután szobahőmérsékleten inkubáljuk 10 percen át. A keveréket 10 percig centrifugáljuk 10 000 fordulat/percnél, és az így létrejött üledéket, amely egyszálú M13mpl8-Hel fág DNS-t tartalmaz, újra szuszpendáljuk 500 μΐ TES pufferban [20 mmól/1 trisz-HCl (pH 7,5); 0,1 mól/1 EDTA; és 10 mmől/1 NaCl], A DNS oldatot először kloroformmal extraháljuk, majd kétszer extraháljuk TE-vel telített fenollal, majd ismét kloroformmal. Az egyszálú DNS-t azután kicsapjuk NaOAc-ot, és etanolt alkalmazva, centrifugáljuk, és miután az üledéket 70%-os etanollal mostuk és szárítottuk, az így létrejött üledéket feloldjuk 80 μΐ H2O-ban. Ezt a fág-készítményt alkalmazzuk a következő lépésben, a hely-specifikus mutagenezisben, hogy eltávolítsuk az aktiváló peptidet kódoló DNS-t.
Az aktiváló peptidet kódoló DNS eltávolítására szolgáló mutagenezisben alkalmazott egyszálú DNS fragmentumot automatikus DNS szintetizáló berendezésen szintetizáljuk, ennek szerkezete az alábbi:
5'-GCGCAGTCACCTGAAACGACTCATTGATGGGGAAGATGA-3'
Mintegy 30 pikomol (1 μΐ) fentebb ábrázolt egyszálú DNS-t (a mutagén oligonukleotid”-ot) és 1,5 μΐ (7,5 pikomol) Ml3 univerzális prímért [amelyet a Boehringer-Mannheim Biochemicals (BMB) 7941 Castleway Drive, P.O. Box 50 816, Indianapolis, Indiana 46 250, hoz forgalomba] egyenként kezelünk 5-5 egység T4 polinukleotid kinázzal (Pharmacia, P-LBiochenicals, Inc., 800 Centennial Avenue, Piscataway, New Jersey 08 854) 10 μΐ 1 x kináz pufferban [100 mmól/1 trisz-HCl (pH 8,3); 100 mmól/1 DTT; és 100 mmól/1 MgCl2], amely 1 μΐ 1 mmól/l-es ATP-t is tartalmaz, 30 percen át 37 °C hőmérsékleten; ezt követi 10 perces inkubálás 65 ’C hőmérsékleten, majd fagyasztás. A kinázzal kezelt DNS-eket alkalmazzuk az alább leírt mutagenezis-eljárásban.
A mutagenezis eljárás első lépésében a mutagén oligonukleotidot és az Ml3 univerzális promert összeforrasztjuk az egyszálú fág DNS-sel. Az összeforrasztási reakciót úgy végezzük, hogy 300 nanogramm (0,5 μΐ) egyszálú M13mpl8-HE1 fágot hozzáadunk 1 pikomol (1,2 μΐ) univerzális primerhez, 1 pikomól (0,3 μΐ) mutagén oligonukleotidhoz, 2 μΐ 10 x összeforrasztó pufferhoz [100 mmól/1 trisz-HCl (pH 7,5); 1 mmól/1 EDTA; és 500 mmól/1 NaCl], és 16 μΐ H2Ohoz. A keveréket 80 ’C hőmérsékleten 2 percig, majd 50 ’C hőmérsékleten 5 percig inkubáljuk, végül a keveréket hagyjuk szobahőmérsékletre lehűlni.
Amikor az oligonukleotidok összeforrtak, a fág DNS-t kétszálúvá tesszük olyan módon, hogy a prímért DNS polimerázzal kiterjesztjük. A kiterjesztési reakciót úgy hajtjuk végre, hogy 3 μΐ 10 x kiterjesztő (extenziós) puffért [500 mmól/1 trisz-HCl (pH 8); 1 mmól/1 EDTA; és 120 mmól/1 MgCl2]; 3 μΐ 10 x ligáz puffért; 1,5 μΐ 0,2 mmól/l-es DTT-t; 3 μΐ dNTP keveréket (0,5 mmól/1 mindegyik dNTP-ből); 1,2 μΐ 25 mmól/les ATP-t; 0,5 μΐ Klenow-enzimet (5 egység/μΐ; BMB); 1 μΐ T4 DNS ligázt (400 egység; NEB); és 19,8 μΐ H2O-t adunk az összeforrasztott DNS keverékéhez. A kiterjesztési reakciókeveréket szobahőmérsékleten inkubáljuk 30 percen át, majd 37 ’C hőmérsékleten 4 órán át, végül 4 ’C hőmérsékleten egy éjszakán át.
A reakciót fenol-kloroformos extrahálással állítjuk le, és a DNS-t etanollal és nátrium-acetáttal (NaOAc) kicsapjuk. A DNS-t centrifugálással összegyűjtjük és újra szuszpendáljuk 40 μΐ SÍ pufferban [0,3 mól/1 NaCl; 0,03 mól/1 NaOAc (pH 4,5); és 0,3 mmól/1 ZnCIJ. Az alább leírt S1 kezelésről leírták, hogy előnyös a hely-specifikus mutagenezis eljárásában. A jelen találmány feltalálói azonban nem találtak jelentős előnyöket az SÍ kezelésben, és a további példákban itt leírt megalkotási munkamenetben teljesen elhagyják az SÍ kezelést.
A DNS oldatot egyenlő arányban két csőbe osztjuk el, és a csövek egyikébe 100 egység SÍ nukleázt (BMB) adunk. Az SÍ reakciókeveréket szobahőmérsékleten inkubáljuk 5 percen át, majd a reakciót leállít17
HU 210 863 Β juk olyan módon, hogy a reakciókeveréket egyszer extraháljuk ΊΈ-vel telített fenol-kloroformmal (50:509. A DNS-t kicsapjuk a reakciókeverékból és az SÍ-gyei nem kezelt mintából NaOAc-cal és etanollal.
A DNS üledékeket újra szuszpendáljuk 60 μΐ H2Oban és ezt használjuk fel E. coli K12 JM101 transzformálására azzal az eljárással összhangban, amelyet az M13mpl8-Hel fág megalkotása során alkalmaztunk, azzal a kivétellel, hogy IPGT-t vagy X-Gal-t nem adunk a lemezekhez. A mutánsokat átvizsgáljuk a mutagén oligonukleotid egy kis részletét, az 5’-TGAAACGACTCATTGA-3’-t (radioaktívan jelezve) alkalmazva vizsgáló mintaként tarfolt- vagy pont-folt (dotblot) hibridizálásban. Több tarfoltot, amelyek a hibridizálásban pozitívnak tűntek, felszúrtunk és egyenként inokuláljuk 2 ml, logaritmikus növekedési fázisban levő E. coli KI2 JM101 tenyészetbe. Ezeket a tenyészeteket 37 ’C hőmérsékleten inkubáljuk levegőztetés mellett 6 órán át, amikor ezeket azután egyszálú DNS előállítására használjuk fel, amint ezt fentebb az M13mpl8-Hel fágnál leírtuk.
Az egyszálú DNS-t szekvenciaelemzésnek vetjük alá a didezoximódszert alkalmazva [Smith J. H.: Methods in Enzymology, 65, 560-580 (1980)]. Számos fágot azonosítunk a kívánt mutációval. Azt a fágot, amelyben az aktiváló peptid kódoló szekvenciája kiiktatódott, M13mpl8-HE2-nek nevezzük. A mutáció az M13mpl8-HE2-ben 36 bp méretcsökkenést okoz a természetes kódoló szekvenciához viszonyítva, ez már olyan különbség, amelyet fel lehet használni olyan DNS azonosításának megkönnyítésére, amely tartalmazza a mutált területet. Az M15mpl8-HE2 fág RF formáját is elkészítjük a további konstrukciókban való felhasználáshoz.
C. A pLAPC plazmid végső megalkotása az
Ml3mpl8-HE2 fágból és a pLPC plazmidból
Az M13mpl8-HE2 RF-formájának mutagenizált Sstl-Sall (-0,7 kb) restrikciós fragmentumát kihasítjuk a fágból és izoláljuk lényegében az 1 A. példa szerint. A kívánt -0,7 kb-s fragmentum -0,1 pg-ját tartalmazó -100 pl oldatot az alacsony gélképzésű agaróz 1:2 hígításban azonban nem engedjük át semmiféle tisztító oszlopon, hanem közvetlenül használjuk a ligálásban, hogy a pLAPC plazmidot alkossuk meg az alábbiak szerint.
Három DNS fragmentumot ligálunk együtt, hogy a pLAPC plazmidot kialakítsuk: az M13mpl8-HE2 fág -0,7 kb-s Sstl-Sall restrikciós fragmentumát, amelyet fentebb írtunk le, valamint két DNS fragmentumot a pLPC plazmidból. A pLPC plazmid megalkotást munkamenetét a 2. példában írjuk le. A pLPC plazmid restrikciós hely- és működési térképét a mellékelt ábrák közül az 1. ábra mutatja be. A Sáli, SstI és EcoRI restrikciós enzim felismerő helyek elhelyezkedése miatt a pLPC plazmidon a kívánt EcoRI-Sall és EcoRI-SstI restrikciós fragmentumokat két külön emésztéssel kell készíteni.
Abból a célból, hogy az EcoRI-SstI fragmentumot előállítsuk, mintegy 40 pg pLPC plazmidot 25 μΐ H2Oban hozzáadunk 10 μΐ 1 mg/ml-es BSA-hoz, 10 μΐ 10 x Core pufferhoz (BRL), 5 μΐ (50 egység, BRL)
EcoRI restrikciós enzimhez, 5 μΐ (25 egység, BRL) SstI restrikciós enzimhez és 45 μΐ H2O-hoz, és az így létrejött reakciókeveréket 37 ’C hőmérsékleten inkubáljuk 1,5 órán át. Az Sstl-gyel és EcoRI-gyel emésztett pLPC plazmid DNS-t etanollal végzett kicsapással és centrifugálással gyűjtjük össze. Az Sstl-gyel és EcoRl-gyel emésztett DNS-t újra szuszpendáljuk vízben, majd ~0,6%-os alacsony gélesedési hőmérsékletű agaróz gélre terheljük, hogy a DNS fragmentumokat elektroforézissel elkülönítsük.
Abból a célból, hogy az EcoRI-Sall fragmentumot előállítsuk, mintegy 15 pg pLPC plazmidot 9 μΐ vízben először Apai restrikciós enzimmel kezeljük, hogy elkerüljük a szennyeződést hasonló méretű restrikciós fragmentumokkal, Mintegy 10 μΐ 10 x Apai puffért [60 mmól/1 NaCl; 60 mmól/1 triszHCl (pH 7,4); 60 mmól/1 MgCl2; és 60 mmól/1 DTT], 10 μΐ 1 mg/mles BSA-t, 69 pl H2O-t, és 2 μΐ Apai restrikciós enzimet (50 egység, NEB) adunk a pLPC plazmid DNS oldatához, és az így létrejött reakciókeveréket 37 ’C hőmérsékleten inkubáljuk egy órán át. Ezután 15 μΐ 2 mól/1es NaCl-t, 69 μΐ H2O-t, 8 μΐ Sáli restrikciós enzimet (NEB) és 8 μΐ EcoRI restrikciós enzimet (NEB) adunk az Apai-gyei emésztett pLPC plazmid DNS oldatához, és az így létrejött reakciókeveréket 37 ’C hőmérsékleten egy órán át inkubáljuk. Az Apai-gyei, Sall-gyel és EcoRI-gyel emésztett pLPC plazmid DNS-t először fenollal extraháljuk, majd kloroformmal; majd etanollal végzett kicsapással és centrifugálással összegyűjtjük, végül újra szuszpendáljuk 25 μΐ H2O-ban. A DNS-t azután -0,6%-os, alacsony gélesedési hőmérsékletű agaróz gélre terheljük és a DNS fragmentumokat elektroforézissel elkülönítjük.
A -3,76 kb-s EcoRI-Sall és a -2,0 kb-s EcoRI-SstI restrikciós fragmentumokat a gélekről kihasítjuk és a gél-fragmentumokat felolvasztjuk, miután azonos térfogatú 10 mmól/l-es trisz-HCl-t (pH 7,6) adtunk hozzá, amint ezt az 1 A. példában leírtuk. Ilyen módon a pLPC plazmid -3,76 kb-s EcoRI-Sall restrikciós fragmentumából mintegy 2 pg-ot kapunk -200 1 10 mmól/l-es trisz-HCI-ben (pH 7,6), amely az olvadt agarózt tartalmazza. A pLPC plazmid -2,0 kb-s EcoRI-Sall restrikciós fragmentumából mintegy 2 pg-ot kapunk 10 mmól/l-es trisz HCl (pH 7,6) másik, agarózt tartalmazó -200 μΐ-ében.
A két tisztított restrikciós fragmentum mindegyikének (a pLPC plazmid -3,76 kb-s EcoRI-Sall fragmentuma, és a pLPC plazmid -2,0 kb-s EcoRI-SstI restrikciós fragmentuma) oldatából 12,5-12,5 pl-t adunk az M13mpl8-HE2 fág -0,7 kb-s Ssl-Sall restrikciós fragmentumának 20 μΐ-éhez, 10 μΐ 1 mg-ml-es BSA-hoz, 10 pl 10 mól/l-es ATP-hez, 10 pl 10 x ligáz pufferhez, 2 μΐ (-800 egység; NEB) T4 DNS ligázhoz, és 23 pl H2O-hoz, és az így létrejött ligálási reakciókeveréket 15 ’C hőmérsékleten egy éjszakán át inkubáljuk. A ligáit DNS alkotja a kívánt pLAPC plazmidot. A pLAPC plazmid a pLPC plazmidtól (1. ábra) csak az aktiváló pepiidet kódoló DNS kiiktatásában különbözik.
Abból a célból, hogy a plazmid szerkezetét ellenőrizzük és a pLAPC plazmid nagyobb mennyiségét
HU 210 863 Β kapjuk meg az eukarióta sejt transzformáláshoz és további konstrukciókhoz, a ligáit DNS-t tartalmazó pLAPC plazmidot E. coli KI 2 RV308 transzformálására használjuk fel, amely az NRRL-nél NRRL B-15 624 számon szerezhető be.
E. coli K12 RV308 50 ml-es tenyészetét L tápközegben növesztjük -0,6 optikai sűrűségig (O. D.) 590 nm-nél mérve. A tenyészetet jégen hűtjük 10 percig, és a sejteket centrifugálással összegyűjtjük. A sejtüledéket újra szuszpendáljuk 25 ml hideg, 10 mmól/l-es NaCllel. A sejteket ismét üledékbe visszük centrifugálással és az üledéket újra szuszpendáljuk 25 ml hideg, 30 mmól/1 CaCl2-ben, és jégen inkubáljuk 30 percig. A sejteket centrifugálással ismét Összegyűjtjük és újra szuszpendáljuk 2,5 ml hideg, 30 mmól/l-es CaCl2-ben.
Ebből a sejtszuszpenzióból 200 pl-t összekeverünk a ligáit DNS-t tartalmazó pLAPC plazmiddal és jégen inkubáljuk 60 percig. A keveréket azután 42 ’C hőmérsékleten inkubáljuk 2 percig, ezután 10 percig inkubáljuk szobahőmérsékleten. Mintegy 10 ml 2 x TY tápközeget adunk a sejt-DNS keverékhez, majd a sejteket levegőn rázó inkubátorban inkubáljuk 125 ml-es lombikban, 37 ‘C hőmérsékleten két órán át.
A sejtkeverék alikvotjait TY agar lemezekre szélesztjük (TY tápközeg 15 g/1 agarral), amelyek 100 pg/ml ampicillint is tartalmaznak, majd a lemezeket 37 ’C hőmérsékleten egy éjszakán át inkubáljuk. Az E. coli KI 2 RV308/pLAPC transzformánsokat plazmid DNS-ük restrikciós enzimes elemzésével igazoljuk. Az E. coli K12 RV308/pLAPC transzformánsokból lényegében az 1 A. példa kitanítása szerint kapunk plazmid DNS-t, azzal a kivétellel, hogy 50 pg/ml ampicillint, és nem tetraciklint alkalmazunk szelektív szerként.
2. példa pLPC plazmid megalkotása
A pLPC plazmidot köztes vektorként alkalmazzuk a pLAPC plazmid megalkotásában (lásd az IC. példát). A pLPC plazmid egy olyan DNS szegmenst tartalmaz, amely a BK vírus fokozót kódolja és tartalmazza az adenovírus 2. késői promotort úgy elhelyezve, hogy elősegítse a humán C fehéije kifejeződését. A pLAPC plazmid megalkotás! munkamenete lényegében a pLPC plazmidon levő humán C fehérje kódoló szekvencia helyettesítését eredményezi egy másik humán C fehérje kódoló szekvenciávak, amelyből az aktiváló peptidet kódoló DNS el van távolítva.
A BK fokozó/adenovírus késői promotor kifejező kontroll szekvenciákat a pLPC és pLACP plazmidokon aktivitásukban nagy mértékben stimulálja egy nagy DNS vírus köztes korai géntermékének, pl. adenovírus El A gén termékének jelenléte.
A pLPC plazmid megalkotási munkamenetét az alábbiakban adjuk meg. A pLPC plazmid teljes megalkotási munkamenetét vázlatosan a mellékelt ábrák közül az 1. ábra mutatja be. Röviden a 2A. példa leírja a BK vírus DNS izolálását, amelyből a BK fokozót megkaphatjuk. A 2B. példa a pBKneol plazmid megalkotási munkamenetét ismerteti; ez a plazmid a BK fokozó beiktatásának eredménye a pdBPV-MMTneo plazmidba. A 2C. példa kitanítást ad a pLPcat plazmid megalkotásának munkamenetéről; ez a plazmid az adenovírus 2. késői promotor beiktatásának eredménye pSV2cat plazmidba. A 2D. példa kitanítást ad a pBLcat plazmid megalkotássának munkamenetétől; ez a plazmid tartalmazza a BK fokozót olyan módon elhelyezve, hogy stimulálja az adenovírus késői promotor aktivitását. A 2E. példa leírja a pL133 plazmid megalkotási munkamenetét, amely plazmid egy C fehérje kifejező vektor; a munkamenet a pHC7 plazmid kiindulási anyaggal indul, folytatódik a pSV2-HPC8 köztes plazmid megalkotásával, végül a pL133 plazmid végső megalkotásával. Végül a 2F. példa kitanítást ad a pLPC plazmid megalkotásának munkamenetéről, amely plazmid tartalmazza a pBLcat plazmid BK fokozó/adenovírus késői promotor kifejező kontroll szekvenciáját a pL133 plazmidba olyan módon beiktatva, hogy elősegítse a humán C fehérje kifejeződését.
A. A BK vírus DNS előállítása
A BK vírust az American Type Culture Collectiontól szerezzük be, ahol ez az ATCC VR-837 számon található. A vírus fagyasztva szárított formában van, ezt Hank-féle kiegyensúlyozott sóoldatban (Gibco, 3175 Staley Road, Grand Island, New York 14 072) szuszpendáljuk olyan arányban, hogy a titer mintegy 105 tarfoltképző egység (pfu)/ml legyen. A BK vírus DNS előállításához kiválasztott gazdaszervezet a primer humán embrió vese (PHEK) sejt, amely a Flow Laboratories, Inc.-től (7655 Old Springhouse Road, Mc Lean, Virginia 22 101) szerezhető be, ahol ez a 0-100 katalógusszámon található, vagy az M. A. Bioproducts-tól szerezhető be, 70-151 katalógusszámról.
Mintegy 75 mm2-es polisztirol lombikokat alkalmazunk a vírus előállítására, amelyek mintegy 106 PHEK sejt összefüggő egyrétegét tartalmazzák. Az egyes lombikokhoz mintegy 1 ml BK vírust adunk 105 pfu/ml titerrel, ezt azután 37 ’C hőmérsékleten inkubáljuk egy órán át, majd friss tápközeget (Dulbeccoféle módosított Eagle-tápközeg, Gibco, Grand Island, New York 14 072, kiegészítve 10% borjúembrió-szérummal) adunk hozzá, és a fertőzött sejteket 37 ’C hőmérsékleten inkubáljuk 10-14 napig, vagy addig, amíg a vírus teljes citopatogén hatását észleljük. Ez a citopatogén hatás sejtvonalról sejtvonalra és vírusról vírusra változik, de általában abból áll, hogy a sejtek összeállnak, összecsomósodnak és pörk-szerűen leválnak a tenyésztő edényről.
A vírust a sejtből három fagyasztási-felengedtetési ciklussal nyeljük ki, és a sejttörmeléket 5000 g-vel végzett centrifugálással távolítjuk el. A vírust 1 liter felülúszó folyadékból kicsapjuk és összegyűjtjük 100 g PEG6000 hozzáadásával, az oldat inkubálásával 24 órán át 4 ’C hőmérsékleten, és 5000 g-vel 20 percen át végzett centrifugálással. Az üledéket feloldjuk 0,1 x SSC pufferban [1 x SSC = 0,15 mól/liter NaCl és 0,015 mól/1 nátrium-citrát (pH 7)] az eredeti térfogat 1/100 részében, A vírusszuszpenziót telített KBr 15 ml-es oldatára rétegezzük egy csőben amelyet 75 000 g-nél centrifugálunk 3 órán át. Két csík látható a KBr oldatában a centrifiigálás után.
HU 210 863 B
Az alsóbb csíkot, amely a teljes viriont tartalmazza, összegyűjtjük és sómentesítjük Sephadex G-50 oszlopon (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri 63 178), eluáló pufferként TE puffért [10 mmól/1 triszHCl (pH 7,8) és mmól/1 EDTA] alkalmazva.
Az oszlopról kapott tisztított virionok oldatához nátrium-dodecil-szulfátot (SDS) adunk 1% koncentrációig; pronáz (Sigma) proteázt adunk hozzá 100 pg/ml koncentrációig, és az oldatot 37 ’C hómérsékleten órán át inkubáljuk. Cézium-kloridot adunk ezután az oldathoz 1,56 g/ml sűrűségig, és etidium-bromidot adunk az oldathoz 100 pg/ml végső koncentrációig. Az oldatot centrifugáljuk Sorvall 865 rotorban (DuPont, Newton, Connecticut 06 470) vagy hasonló függőleges rotorban 260 000 g-nál 24 órán át. Centrifugálás után a vírus DNS csíkját izoláljuk és ötször extraháljuk 100 mól/l-es trisz-HCl-lel (pH 7,8) telített izoamil-alkohollal. A BK vírus DNS oldatát azután dializáljuk TE puffer ellen, amíg a DNS 260 nm/280 nm abszorbnacia hányadosa 1,75 és 1,90 között lesz. A DNS-t úgy csapjuk ki, hogy az NaCl koncentrációt 0,15 mól/l-re állítjuk be, hozzáadunk két térfogat etanolt, az oldatot -70 °C hőmérsékleten inkubáljuk legalább 2 órán át, és az oldatot 12 000 g-nél centrifugáljuk 10 percig. A BK vírus DNS így létrejött üledékét TE pufferban szuszpendáljuk 1 mg/ml koncentrációban. A BK vírus restrikciós hely- és működési térképét a mellékelt ábrák közül az 1. ábra mutatja be.
B. A pBKneol plazmid megalkotása
Az E. coli K12 HBlOl/pdBPV-MMT-neo sejteket liofilezett formában kapjuk az American Type Culture Collection-tól, ahol ez az ATCC 37 224 deponálási számon található. A liofilezett sejteket L-agar lemezekre szélesztjük, amelyek 100 pg/ml ampicillint is tartalmaznak, és 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk, hogy egyedi telep izolátumokat kapjuk.
liter L tápközeget (10 g tripton, 10 g NaCl, és 5 g élesztőkivonat literenként), amely 50 pg/ml ampicillint is tartalmaz, inokulálunk E. coli K12 HBlOl/pdBPVMMTneo telepével, és inkubáljuk levegőben működő rázógépen 37 ’C hőmérsékleten, amíg az OD590 érték eléri a -1 abszorbencia értéket; ekkor 150 mg klór-amfenikolt adunk a tenyészethez. Az inkubálást folytatjuk mintegy 16 órán át; a klóramfenikol hozzáadása gátolja a fehérjeszintézist, és így meggátolja a további sejtosztódást, de lehetővé teszi, hogy a plazmid replikáció folytatódjék. Ezután a tenyészetből pdBPV-MMTneo plazmid DNS-t állítunk elő lényegében az 1A. példában leírt eljárás szerint.
Az ezzel az eljárással kapott pdBPV-MMTneo plazmid DNS -1 mg-ját szuszpendáljuk 1 ml TE pufferban és tároljuk -20 ’C hőmérsékleten. Általában az 1A. példában leírt plazmid-izolálási munkamenetet alkalmazzuk, amikor nagy mennyiségű, nagyon tiszta plazmid DNS-hez kívánunk jutni. A munkamenetet módosíthatjuk, hogy gyorsan kapjuk kisebb mennyiségű, kevésbé tiszta DNS-t, olyant, amely akkor szükséges, amikor transzformánsokat vizsgálunk át egy adott plazmid jelenlétére; ebben az esetben csak mintegy ml tenyésztett sejtet használnuk fel, a sejteket lizáljuk megfelelően lépték-csökkentett mennyiségű lizáló pufferban, és a centrifugálási lépést fenolos és kloroformos extrahálással helyettesítjük.
Mintegy 5 pg (5 pl), a fentebbiek szerint készített pdBPV-MMTneo plazmid DNS-t és 5 pg (5 pl) fentebb leírtak szerint készített BK vírus DNS-t egyenként emésztünk 37 °C hőmérsékleten 2 órán át olyan oldatban, amely 2 pl 10 x BamHI puffért [1,5 mól/1 NaCl, 60 mmól/1 trisz HCl (pH 7,9); 60 mmól/1 MgCl2; és 1 mg/ml BSA], 1 pl (~10 egység) BamHI restrikciós enzimet és 6 pl H2O-t tartalmaz. A reakciót olyan módon állítjuk le, hogy extrahálunk azonos térfogat fenollal, majd kétszer extrahálunk kloroformmal. Az egyes BamHIgyel emésztett DNS-eket ezután kicsapjuk, centrifugálással összegyűjtjük és újra szuszpendáljuk 5 pl H2O-ban.
Mintegy 1 pl 10 x ligáz puffért adunk a BamHIgyel emésztett pdBPV-MMTneo plazmid (1 pl) és a BamHI-gyel emésztett BK vírus DNS (1 pl) keverékéhez. Miután 1 pl (~5 egység) T4 DNS ligázt és 6 pl H2O-t adtunk a DNS-ek keverékéhez, az így létrejött reakciókeveréket 16 ’C hőmérsékleten egy éjszakán át inkubáljuk. A ligáit DNS alkotja a kívánt pBKneol és pBKneo2 plazmidokat, amelyek csak a BK vírus DNS orientációja tekintetében különböznek egymástól. A pBKneol plazmid restrikciós hely- és működési térképét a mellékelt ábrák közül az 1. ábra mutatja be.
Az E. coli KI2 HB101 sejtek liofilezett formában a Northern Régiónál Research Laboratory-tól szerezhetők be, ahol ez az NRR1 B-15 626 deponálási számon található. E. coli KI 2 HB 101 50 ml-es tenyészetét L tápközegben növesztjük 650 nanométernél mért (OD650) mintegy 0,4 abszorbancia egység optikai sűrűségig. A tenyészetet jégen hűtjük 10 percig, majd a sejteket centrifugálással összegyűjtjük. A sejtüledéket újra szuszpendáljuk 25 ml hideg, 100 mmól/l-es MgCl2-ben, és jégen inkubáljuk 25 percig. A sejteket centrifugálással ismét üledékbe visszük, és az üledéket újra szuszpendáljuk 2,5 ml hideg, 100 mmól/literes CaCl2-ben, majd 30 percig jégen inkubáljuk. Az inkubálás után a sejtek kompetensek a transzformáló DNS felvételére.
Ebből a sejtszuszpenzióból 200 pl-t összekeverünk a fentebb készített ligáit DNS-sel, és inkubáljuk jégen 30 percig. Ezután a sejteket 42 ’C hőmérsékletű vízfürdőbe helyezzük 2 percre, majd visszatesszük jégre további 10 percre. A sejteket centrifugálással összegyűjtjük és újra szuszpendáljuk 1 ml L-tápközegben, majd 1 órán át 37 ’C hőmérsékleten inkubáljuk. A transzformált sejteket 100 pg/ml ampicillint is tartalmazó L-agar lemezekre szélesztjük. E. coli K12 HBlOl/pBKneol és E. coli K12/pBKneo2 transzformánsokat azonosítunk ampicillin-rezisztens fenotípusuk és plazmid DNS-ük restrikciós enzimes elemzése alapján. A pBKneol plazmid restrikciós hely- és működési térképét a mellékelt ábrák közül az 1. ábra A. része mutatja be.
C. A pLPCcat plazmid megalkotása, amely köztes plazmidot a pBLeat plazmid megalkotásában alkalmazzuk
Az adenovírus 2. (Ad2) virion DNS-e kettős szálú
HU 210 863 Β lineáris molekula mintegy 35,94 kb mérettel. Az Ad2 késői promotort az Ad2 genom -0,32 kb-s AccI-PvuII restrikciós fragmentumában izolálhatjuk; ez a -0,32 kb-s restrikciós fragmentum megfelel az Ad2 genom 5755. és 6071. nukleotid helyei közti szekvenciának. Abból a célból, hogy izoláljuk a kívánt -0,32 kb-s AccI-PvuII restrikciós fragmentumot, az Ad2 DNS-t először Ball restrikciós enzimmel emésztjük, és a -2,4 kb-s Ball restrikciós fragmentumot, amely tartalmazza a -0,32 kb-s AccI-PvuII restrikciós fragmentum teljes szekvenciáját, izoláljuk. Ezután a -2,4 kb-s Ball restrikciós fragmentumot Accl-gyel és PvuII-vel emésztjük, hogy megkapjuk a kívánt fragmentumot.
Mintegy 50 pg Ad2 DNS-t (amely a BRL-től szerezhető be) feloldunk 80 pl H2O-ban és 10 pl 10 x Ball pufferban [100 mmól/1 trisz-HCl (pH 7,6); 120 mmól/1 MgCl2; 100 mmól/1 DTT; és 1 mg/ml BSA]. Mintegy 10 μΐ (-20 egység) Ball restrikciós enzimet adunk az Ad2 DNS oldatához, és az így létrejött reakciókeveréket 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk 4 órán át.
A Ball-gyel emésztett DNS-t agaróz gélre terheljük és elektroforézisnek vetjük alá, amíg a restrikciós fragmentumok jól elkülönülnek. Az elektroforézisnek alávetett DNS láthatóvá tételét a gél festésével hajtjuk végre, a festést etidium-bromid híg oldatával (0,5 pg/ml) végezve, majd a festett gél kitevésével hosszú hullámú ultraibolya (UV) fénynek. A DNS izolálásának agarózról egyik lehetséges módszere az alábbi. A gélen kis hasítást végzünk a kívánt fragmentum előtt, és egy kis darab NA-45 DEAE membránt (Schleicher és Schnell, Keene, New Hampshire, 03 431) helyezünk az egyes hasítékokba. További elektroforézisre a DNS nem kovalensen hozzákötődik a DEAE membránhoz. Miután a kívánt fragmentum a DEAE membránhoz kötődött, a membránt eltávolítjuk és leöblítjük kis sótartalmú pufferral [100 mmól/1 KC1; 0,1 mmól/1 EDTA; és 20 mmól/1 trisz · HC1 (pH 8)]. Ezután a membránt egy kis csőbe helyezzük és belemerítjük nagy sótartalmú pufferba [1 mól/1 NaCl; 0,1 mmól/1 EDTA; és 20 mmól/1 trisz-HCl (pH 8)], majd 65 °C hőmérsékleten inkubáljuk egy órán át, hogy eltávolítsuk a DNS-t a DEAE papírról. A 65 ’C hőmérsékleten végzett inkubálás után az inkubáló puffért összegyűjtjük és a membránt leöblítjük nagy sótartalmú pufferral. A nagy sótartalmú öblítő oldatot egyesítjük a nagy sótartalmú inkubáló pufferral.
A nagy sótartalmú DNS oldat térfogatát úgy állítjuk be, hogy az NaCl koncentrációja 0,25 mól/1 legyen, majd három térfogat etanolt adunk az oldathoz. Az így létrejött oldatot összekeverjük és -70 ’C hőmérsékletre helyezzük 10-20 percre. Az oldatot ezután 15 000 fordulat/percnél centrifugáljuk 15 percig. Egy további kicsapás után, hogy a maradék sót eltávolítsuk, a DNS üledéket etanollal öblítjük, szárítjuk, újra szuszpendáljuk 20 μΐ TE pufferban; ez mintegy 3 pg-ot jelent az Ad2 kívánt restrikciós fragmentumából. A kapott tisztított fragmentumot feloldjuk 10 pl TE pufferban.
Mintegy 6 pl H2O-t és 2 pl 10 x Acél puffért [60 mmól/1 NaCl; 60 mmól/1 trisz-HCl (pH 7,5); 60 mmól/1 MgCl2; 60 mmól/1 DTT; és 1 mg/ml BSA] adunk az Ad2 -2,4 kb-s Ball restrikciós fragmentumának oldatához. Miután a mintegy 2 pl (-10 egység) Acél restrikciós enzimet hozzáadtuk a DNS oldatához, a reakciókeveréket 2 órán át inkubáljuk 37 ’C hőmérsékleten. Az Acél emésztés után a DNS-t etanolos kicsapással összegyűjtjük és újra szuszpendáljuk 16 pl H2O-ban és 2 pl 10 x PvuII pufferban [600 mmól/1 NaCl; 60 mmól/1 trisz-HCl (pH 7,5); 60 mmól/1 MgCl2; 60 mmól/1 DTT; és 1 mg/ml BSA]. Miután a DNS oldatához hozzáadtuk mintegy 2 pl (mintegy 10 egység) PvuII restrikciós enzimet, a reakciókeverékhez 37 ’C hőmérsékleten 2 órán át inkubáljuk.
Az Ad2-nek Accl-gyel és PvuII-vel emésztett -2,4 kb-s Ball fragmentumát -6%-os poliakrilamid gélre terheljük és elektroforézisnek vetjük alá, amíg a -0,32 kb-s AccI-PvuII restrikciós fragmentum, amely az Ad2 késői promotort tartalmazza, elkülönül a többi emésztési terméktől. A gélt etidium-bromiddal megfestjük és UV fény alatt láthatóvá tesszük, és a gélnek a -0,32 kb-s AccI-PvuII restrikciós fragmentumot tartalmazó szegmensét kihasítjuk a gélből, összezúzzuk, és egy éjszakán át szobahőmérsékleten áztatjuk -250 pl extrakciós pufferban (500 mmól/1 NH4OAc; 10 mmól/1 MgOAc; 1 mmól/1 EDTA; és 0,1% SDS). A következő reggelen a keveréket centrifugáljuk és az üledéket eldobjuk. A felülúszóban levő DNS-t etanollal kicsapjuk; mintegy 2 pg tRNS-t adunk hozzá, hogy biztosítsuk a kívánt fragmentum teljes kicsapódását. A -0,32 kb-s AccI-PvuII restrikciós fragmentumból mintegy 0,2 pgot kapunk, ezt 7 pl H2O-ban szuszpendáljuk.
Abból a célból, hogy az AccI-PvuII restrikciós fragmentumot átalakítsuk AccI-BclI restrikciós fragmentummá, Bell kapcsolókat ligálunk a -0,32 kb-s AccI-PvuII restrikciós fragmentumhoz. Mivel a Bell kapcsoló tompa végű, a kapcsolók a restrikciós fragmentumnak csak PvuΠ végéhez kötődnek. A Bell kapcsolókat (New England Biolabs), amelyek szerkezete az alábbi.
5'-CTGATCAG-3' llllllll
3'-GACTAGTC-5' kinázzal kezeljük és előkészítjük ligáláshoz a következő munkamenet szerint. 4 1 kapcsolót (-2 pg) feloldunk 20,15 pl H2O-ban és 5 pl 10 x kináz pufferban [500 mmól/1 trisz-HCl (pH 7,6) és 100 mmól/ϊ MgCIJ, inkubáljuk 90 ’C hőmérsékleten két percig, majd lehűtjük szobahőmérsékletre. 5 pl y-32P-ATP-t (-20 μ Ci), 2,5 pl 1 mól/l-es DTT-t és 5 pl polinukleotid kinázt (-10 egység) adunk a keverékhez, amelyet azután 37 ’C hőmérsékleten 30 percig inkubálunk. Ezután 3,35 pl 0,01 mól/l-es ATP-t és 5 pl kinázt adunk hozzá, és a reakciót folytatjuk további 30 percen át 37 ’C hőmérsékleten. A radioaktív ATP segít annak meghatározásában, vajon kapcsolódtak-e a megcélzott DNShez.
Mintegy 0,25 pg kinázzal kezelt Bell kapcsolót (0,5 pl-ben) adunk a -0,32 kb-s AccI-PvuII restrikciós fragmentum oldatához, majd 1 pl (-1000 egység) T4 DNS ligázt és 1 pl 10 x ligáz puffért adunk a DNS
HU 210 863 B oldatához, és az így létrejött reakciókeveréket 16 °C hőmérsékleten inkubáljuk egy éjszakán át. A Bell kapcsolók az AccI-PvuII restrikciós fragmentumnak csak a PvuII végéhez kapcsolódnak. A későbbi DNS szekvenciaelemzés feltárja, hogy négy Bell kapcsoló kapcsolódik az AccI-PvuII restrikciós fragmentum PvuII végéhez. Ezeket a többlet Bell kapcsolókat Bell emésztéssel, majd újra-ligálással lehet eltávolítani; a többlet Bell kapcsolókat azonban nem távolítjuk el, mivel a kapcsolók nem befolyásolják azoknak a vektoroknak a megfelelő működését, amelyek a többlet kapcsolókat tartalmazzák.
Az E. coli HB101/pSV2cat sejteket liofikezett formában kapjuk az ATCC-től, ahol az az ATCC 37 155 számon található; a pSV2cat DNS plazmidot a sejtekből lényegében az 1A. példa eljárásával összehangban izoláljuk, azzal a különbséggel, hogy 50 gg ampicillint alkalmazunk tetraciklin helyett. A pSV2cat plazmid restrikciós hely- és működési térképét az 1. ábra B része mutatja be a mellékelt ábrák közül. A pSV2cat plazmid DNS mintegy 1 mg-ját kapjuk meg, és feloldjuk 1 ml TE pufferban. Mintegy 3 gg (3 gl) pSV2cat plazmid DNS-t adunk 2 gl 10 x AccI pufferhoz és 16 gl H2O-hoz, majd 3 gl (mintegy 9 egység) AccI restrikciós enzimet adunk a pSV2cat DNS oldatához, és az így létrejött reakciókeveréket 37 ’C hőmérsékleten inkubáljuk 2 órán át. Az Acclgyel emésztett pSV2cat DNS-t restrikciós enzimmel emésztjük 3 gl 10 x Stul puffer [1,0 mmól/1 NaCl; 100 mmól/1 trisz-HCl (pH 8,0); 100 mmól/1 MgCl2 600 mmól/1 DTT; és 1 mg/ml BSA], 5 gl H2O és mintegy 2 gl (mintegy 10 egység) Stul restrikciós enzim hozzáadásával. Az így létrejött reakciókeveréket 37 ’C hőmérsékleten 2 órán át inkubáljuk. A reakciót úgy állítjuk le, hogy a reakciókeveréket egyszer fenollal, majd kétszer kloroformmal extraháljuk. A kívánt fragmentumból mintegy 0,5 gg-ot kapunk, ezt feloldjuk 20 gl TE pufféiban.
Mintegy 4 gl-t az AccI és Stul-gyel emésztett pSV2cat plazmid DNS-ből összekeverünk az Ad2 -0,32 kb-s AccI-PvuII (Bell kapcsolókhoz rögzített) restrikciós fragmentumának mintegy 7 gl-ével, és 3 gl 10 x ligáz puffer, 15 gl H2O, és 2 gl (mintegy 1000 egység) T4 DNS ligáz hozzáadása után a ligálási reakciókeveréket 16 ’C hőmérsékleten egy éjszakán át inkubáljuk. A ligáit DNS elkotja a kívánt plazmidot; ez olyan plazmid, amely az Ad2 késő promotort olyan elhelyezkedésben tartalmazza, hogy elősegítse a klóramfenikol acetil transzferáz gén átírását és így kifejeződését. A pLPcat plazmid restrikciós hely- és működési térképét a mellékelt ábrák közül az 1. ábra B. része mutatja be.
A ligáit DNS-t alkalmazzuk E. coli KI2 HB101 sejtek transzformálására, lényegében a 2B. példa munkamenete szerint. A transzformált sejteket 50 gg/ml ampicillint is tartalmaz L-agar lemezekre szélesztjük; a plazmid DNS restrikciós enzimes elemzését alkalmazzuk az E. coli KI 2 HBlOl/pLPcat transzformánsok azonosítására. pLPcat DNS plazmidot izolálunk a transzformánsokból az ez utáni konstrukciókban való alkalmazáshoz, lényegében az 1A. példában leírt plazmid izolálási munkamenet szerint, azzal a kivétellel, hogy szelektív szerként ampicillint alkalmazunk tetraciklin helyett.
D. pBLcat plazmid megalkotása
Mintegy 88 gg pBKneol plazmid DNS-t 50 gl TE pufferban adunk 7,5 gl 10 x AccI pufféihoz, 30 gl H2Ohoz, és 15 gl (mintegy 75 egység) AccI restrikciós enzimhez, és az így létrejött reakciókeveréket 37 ’C hőmérsékleten inkubáljuk 2 órán át. Az Accl-gyel emésztett pBKneol plazmid DNS-t agaróz gélre terheljük, és a -1,4 kb-s fragmentumot, amely tartalmazza a BK fokozót, elkülönítjük a többi emésztési terméktől. A -1,4 kb-s AccI restrikciós fragmentumot azután izoláljuk a gélről és tisztítjuk. Mintegy 5 gg fragmentumot újra szuszpendálunk 5 gl 10 x PvuII pufferban, 45 gl H2O-ban és 5 gl (mintegy 25 egység) PvuII restrikciós enzimben, és az így létrejött reakciókeveréket 37 ’C hőmérsékleten 2 órán át inkubáljuk. A PvuH-vel emésztett DNS-t azután izoláljuk, tisztítjuk, és ligáláshoz előkészítjük. Mintegy 2 gg kívánt -1,28 kb-s AccI-PvuII fragmentumot kapunk, ezt feloldjuk 5 gl TE pufferban.
Mintegy 1 gg pLPcat plazmid DNS-t feloldunk 5 gl 10 x AccI pufferban és 40 gl H2O-ban. Mintegy 5 μ (-25 egység) AccI restrikciós enzimet adunk a pLPcat plazmid DNS oldatához, és az így létrejött reakciókeveréket 37 ’C hőmérsékleten inkubáljuk. Az Accl-gyel emésztett pLPcat plazmid DNS-t etanollal kicsapjuk és újra szuszpendáljuk 5 gl 10 x Stul pufferban, 40 gl H2O-ban, és 5 gl (mintegy 25 egység) Stul restrikciós enzimben, és az így létrejött reakciókeveréket 37 ’C hőmérsékleten 2 órán át inkubáljuk. Az Acclgyel és Stul-gyel emésztett pLPcat plazmid DNS-t etanollal többször kicsapjuk, hogy tisztítsuk a -4,81 kb-s Accl-Stul restrikciós fragmentumot, amely tartalmazza az E. coli replikációs origót és az Ad2 késői promotort a másik emésztési fragmentumtól, a mintegy 16 bp méretű restrikciós fragmentumtól elkülönítve. A kívánt -4,81 kb-s restrikciós fragmentumból mintegy 1 gg-ot kapunk, ezt feloldjuk mintegy 20 gl TE pufferban.
A pLPcat plazmid -4,81 kb-s Accl-Stul restrikciós fragmentumának 5 gl-ét hozzáadjuk a pBKneol plazmid -1,28 kb-s Accl-Pvul restrikciós fragmentumának mintegy 5 gl-éhez. Miután a DNS keverékhez hozzáadtunk 3 gl 10 x ligáz puffért, 15 gl H2O-t és 2 gl (mintegy 10 egység) T4 DNS ligázt, az így létrejött reakciókeveréket 16 ’C hőmérsékleten egy éjszakán át inkubáljuk. A ligáit DNS alkotja a kívánt pBLcat plazmidot. A pBLcat plazmid restrikciós hely- és működési térképét a mellékelt ábrák közül az 1. ábra C. része mutatja be.
A ligáit DNS-t alkalmazzuk E. coli K12 HB101 sejtek transzformálására lényegében a 2B. példában leírt eljárás szerint. Az E. coli KI2 HB101 (pBLcat transzformánsokat plazmid DNS-ük restrikciós enzimes elemzése alapján azonosítjuk. pBLcat plazmid DNS-t állítunk elő a későbbi konstrukciókban való felhasználáshoz, lényegében az 1 A. példa szerint azzal a különbséggel, hogy szelektív szerként ampicillint alkalmazunk tetraciklin helyett.
E. A pLl 33 plazmid megalkotása
A pL133 humán C fehérje kifejező vektor. Amint alább leírjuk, a pL 133 plazmidot úgy alkotjuk meg, hogy pSV2gpl és pHC7 vektor plazmidokat alkalmazunk kiin22
HU 210 863 Β dulási vektorokként (a pHC7 plazmid előállítását az 1A. példában ismertetünk), így alkotjuk meg a pSV2-HBC8 köztes vektor plazmidot, amelyet azután egyesítünk a pSV2-globin plazmiddal, hogy megkapjuk a pLl33 plazmidot. ApL133 plazmid megalkotásának munkamenetét az alábbiakban részletesen leírjuk, és vázlatosan is bemutatjuk az alábbi ábrák közül a 2. ábrában.
μΐ (-50 gg) pHC7 plazmid DNS-t összekeverünk 5 μΐ (-50 egység) Báni restrikciós enzimmel, 10 μΐ 10 x Báni restrikciós pufferral [1,5 mól/1 NaCl; 60 mól/1 triszHCl (pH 7,9); 60 mmól/1 MgCl2; és 1 mg/ml BSA], és 35 μΐ H2O-val, és addig inkubálunk, amíg az emésztés teljes lesz. A Banl-gyel emésztett pHC7 plazmid DNS-t azután elektroforézisnek vetjük alá 3,5%-os poliakrilamid gélen (29:1; akrilamid:biszakrilamid), amíg a -1,25 kb-s Báni restrikciós fragmentum elkülönül a többi emésztési terméktől.
A gélnek -1,25 kb-s Báni restrikciós fragmentumát tartalmazó területét kivágjuk a gélből, kémcsőbe helyezzük, és apró töredékekre törjük. 1 ml extraháló puffért (500 mmól/1 NH4OAc, 10 mmól/1 MgOAc, 1 mmól/1 EDTA, 1% SDS és 10 mg/ml tRNS) adunk a törmeléket tartalmazó csőhöz, és a csövet 37 ’C hőmérsékletre helyezzük egy éjszakára. Centrifugálást alkalmazunk, hogy a sejttörmeléket üledékbe vigyük, és a felülúszót egy új csőbe visszük át. A sejttörmeléket egyszer mossuk 200 μΐ extraháló pufferral; a mosás felülúszóját egyesítjük az egy éjszakán át végzett extrahálás felülúszójával. Miután a felülúszót átengedjük egy üveggyapot dugón, két térfogat etanolt adunk hozzá, és összekeverjük a felülúszóval. Az így létrejött oldatot szárazjég-etanolos fürdőbe helyezzük -10 percre, majd a DNS-t centrifugálással üledékbe visszük.
Mintegy 8 pg-ot kapunk a -1,25 kb-s Báni restrikciós fragmentumból ezzel az eljárással. A tisztított fragmentumot 10 μΐ TE pufferban szuszpendáljuk és -20 ’C hőmérsékleten tároljuk. A Báni restrikciós fragmentumot módosítanunk kell egy kapcsoló hozzáadásával, hogy megalkossuk a pSV2-HPC8 plazmidot. A kapcsoló megalkotásában alkalmazott DNS fragmentumokat vagy Systec 1450A DNS Synthesizer berendezés (Systec Inc., 3816 Chandler Drive, Minneapolis, Minnesota), vagy ABS 380A DNS Synthesizer berendezést (Applied Biosystems, Inc., 850 Lincoln Centre Drive, Foster City, Kalifornia 94 404) alkalmazva szintetizáljuk. Többféle DNS szintetizáló berendezés ismeretes a szakterületen, és ezeket lehet alkalmazni ezeknek a fragmentumoknak az előállítására. Ezen kívül ezek a fragmentumok kényelmesen előállíthatók Itakura és munkatársai Science, 198, 1056 (1977) és Crea és munkatársai Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 5765 (1978) eljárása szerint is.
500 pikomólt a kapcsoló egyes szálaiból kinázos kezelésnek vetünk alá 20 μΐ reakciópufferban, amely 15 egység (-0,5 μΐ) T4 polinukleotid kinázt, 2 μΐ 10 x ligáz puffért, 10 μΐ 500 μιηόΐ/l ATP-t és 7,5 μΐ H2O-t tartalmaz. A kináz reakciókeveréket 37 ’C hőmérsékleten inkubáljuk 30 percig, és a reakciót 100 ’C hőmérsékleten 10 percen át végzett inkubálással fejezzük be. Abból a célból, hogy biztosítsuk a kinázos reakció teljességét, a reakciókeveréket jégen hötjük, 2 μΐ 0,2 mól/l-es ditiotreitolt, 2,5 μΐ 5 mmól/1 ATP-t és 15 egység T4 polinukleotid kinázt adunk hozzá és összekeverjük, és ezt a reakciókeveréket további 30 percen át inkubáljuk 37 ’C hőmérsékleten. Areakciót úgy állítjuk le, hogy a reakciókeveréket további 10 percen át inkubáljuk 100 ’C hőmérsékleten, majd jégen lehűtjük.
Bár külön-külön vetjük alá kinázos kezelésnek, a DNS kapcsoló két szálát a kinázos kezelés után összekeverjük. Abból a célból, hogy a szálakat összeforrasszuk, a kinázos reakciókeveréket 100 ’C hőmérsékleten 10 percen át inkubáljuk olyan vízfürdőben, amely mintegy 150 ml vizet tartalmaz. Ez után az inkubálás után a vízfürdőt kapcsoljuk és hagyjuk szobahőmérsékletre lehűlni; ez a folyamat mintegy három órán keresztül tart. A vízfürdőt, amely tartalmazza még a kinázzal kezelt DNS csövét, ezután egy éjszakán át inkubáljuk 4 ’C hőmérsékleten. A megalkotott kapcsoló szerkezete az alábbi:
5'-AGCTTTGATCAG-3'
IUIIIII
3'-AACTAGTCCACG-5'
A kapcsolót felhasználásig -20 ’C hőmérsékleten tároljuk.
A -8 μg -1,25 kb-s Báni fragmentumot hozzáadjuk az -50 μΐ (-500 pikomól) kapcsolóhoz, 1 μΐ T4 DNS ligázhoz (-5 egység), 10 μΐ 10 x ligáz pufferhoz, és 29 μΐ H2O-hoz, összekeverjük, és az így létrejött ligálási reakciókeveréket 4 ’C hőmérsékleten egy éjszakán át inkubáljuk. A ligálási reakciót 65 ’C hőmérsékleten 10 percen át végzett inkubálással állítjuk le. A DNS-t üledékbe visszük NaOAc hozzáadásával 0,3 mól/1 végső koncentrációig, majd 2 térfogat etanol hozzáadásával, lehűtéssel szárazjég-etanolos fürdőben, majd az oldat centrifugálásával.
A DNS üledéket feloldjuk 10 μΐ 10 x Apai reakciópufferban [60 mmól/1 NaCl; 60 mól/1 trisz HCl (pH 7,4), 60 mmól/1 MgCl2; és 60 mmól/12-merkapto-etanol], 5 μΐ (-50 egység) Apai restrikciós enzimben és 85 μΐ H2Oban, és a reakciókeveréket 37 ’C hőmérsékleten tartjuk 2 órán át. A reakciót ezután leállítjuk és a DNS-t a fentiek szerint üledékbe visszük. A DNS üledéket feloldjuk 10 μΐ 10 x Hindin reakciópufferban, 5 μΐ (-50 egység) HindlII restrikciós enzimben és 85 μΐ H2O-ban, és a reakciókeveréket 37 ’C hőmérsékleten tartjuk 2 órán át. A HindlII emésztése után a reakciókeveréket 3,5%-os poliakrilamid gélre terheljük, és a kívánt -1,23 kb-s Hindin-Apai restrikciós fragmentumot a gélről izoláljuk és tisztítjuk. A kívánt fragmentumból mintegy 5 μg-ot kapunk, ezt 10 μΐ TE pufferban szuszpendáljuk, és -20 ’C hőmérsékleten tároljuk.
μΐ (-50 g) pHC7 plazmid DNS-t összekeverünk 5 μΐ (-50 egység) PstI restrikciós enzimmel, 10 μΐ 10 x PstI reakciópufferral [1,0 mól/1 NaCl, 100 mmól/1 trisz HCl (pH 7,5); 100 mmól/1 MgCl2; és mg/ml BSA], és 35 μΐ H2O-val, és inkubálunk 37 ’C hőmérsékleten két órán át. A Pstl-gyel emésztett pHC7 plazmid DNS-t azután elektroforézisnek vetjük alá 3,5%-os
HU 210 863 Β poliakrilamid gélen, és a kívánt -0,88 kb-s fragmentumot tisztítjuk lényegében a fentebb leírt munkamenet szerint. A kívánt fragmentumból mintegy 5 pg-ot kapunk, szuszpendáljuk 10 pl TE pufferban, és -20 °C hőmérsékleten tároljuk.
A 0,88 kb-s PstI fragmentum 5 pg-ját hozzáadjuk az alábbi kapcsoló -50 μΐ-éhez és összekeverjük azzal; ezt a kapcsolót automatizált DNS szintetizáló berendezésen készítjük el:
5'-GTGATCAA-3' llllllll
3'-ACGTCACTAGTTCTAG-5'
Mintegy 1 μΐ T4 DNS ligázt (-10 egység), 10 μΐ 10 x ligáz puffért és 29 pl H2O-t adunk a DNS keverékéhez, és az így létrejött ligálási reakciókeveréket 4 ’C hőmérsékleten egy éjszakán át inkubáljuk.
A ligálási reakciót 65 ‘C hőmérsékleten 10 percen át végzett inkubálással állítjuk le. A ligáit DNS kicsapása után a DNS üledéket feloldjuk 10 μΐ 10 xApal reakciópufferban, 5 μΐ (-50 egység) Apai restrikciós enzimben és 85 μΐ H2O-ban, és a reakciókeveréket 2 órán át 37 ’C hőmérsékleten tartjuk. A reakciót ezután leállítjuk és a DNS-t ismét üledékbe visszük. A DNS üledéket feloldjuk 10 μΐ 10 x BglII reakciópufferban [1 mól/1 NaCl; 100 mmól/1 trisz-HCl (pH 7,4); 100 mmól/1 MgCl2; 100 mmól/1 2-merkapto-etanol; és mg/ml BSA], 5 μΐ (-50 egység) BglII restrikciós enzimben és 85 μΐ H2O-ban, és a reakciókeveréket 37 ’C hőmérsékleten tartjuk 2 órán át. A BglII emésztés után a reakciókeveréket 3,5%-os poliakrilamid gélre terheljük, és a kívánt -0,19 kb-s Apal-BglII restrikciós fragmentumot izoláljuk lényegében a fentebb leírt munkamenet szerint. Mintegy 1 μg kívánt fragmentumot kapunk, ezt szuszpendáljuk 10 μΐ TE pufferban, és -20 ’C hőmérsékleten tároljuk.
Mintegy 10 μg pSV2gpt plazmid (ATCC 37 145) DNS-t feloldunk 10 μΐ 10 x Hindin reakciópufferban, 5 μΐ (-50 egység) Hindin restrikciós enzimben és 85 μΐ H2O-ban, és a reakciókeveréket 37 ’C hőmérsékleten tartjuk 2 órán át. A reakciókeveréket ezután NaOAc-ra bézve 0,25 mól/literessé tesszük, és két térfogat etanol hozzáadása és szárazjég-etanolos fürdőben végzett inkubálás után a DNS-t centrifugálással üledékbe visszük. A DNS üledéket feloldjuk 10 μΐ 10 x BglII pufferban, 5 μΐ (-50 egység) BglII restrikciós enzimben és 85 μΐ H2Oban, és a reakciókeveréket 37 ’C hőmérsékleten tartjuk órán át. A BglII emésztés után a reakciókeveréket 1 %os agaróz gélre terheljük, és a fragmentumokat elektroforézissel elkülönítjük. A gélt etidium-bromiddal megfestjük és ultraibolya fénnyel láthatóvá tesszük, majd a kívánt -5,1 kb-s Hindin-Bgin fragmentumot kihasítjuk a gélből és dializáló csőbe helyezzük, és az elektroforézist folytatjuk mindaddig, amgí a DNS lefut az agarózról. A DNS-t tartalmazó puffért a dializáló csőből fenollal és kloroformmal extraháljuk, majd a DNS-t kicsapjuk. Az üledéket újra szuszpendáljuk 10 μΐ TE pufferban és ez alkotja a pSV2gpt plazmid kívánt -5,1 kb-s HindlII-BglII restrikciós fragmentumát (5 μg).
A -1,23 kb-s HindM-Apal restrikciós fragmentum 2 μΐ-ét, 3 μΐ -0,19 kb-s Apal-BglII fragmentumot és 2 μΐ -5,1 kb-s HindlII-BglII fragmentumot összekeverünk, majd inkubáljuk 10 μΐ 10 x ligáz pufferral, 1 μΐ T4 DNS ligázzal (-500 egység), és 82 μΐ H2O-val 16 'C hőmérsékleten egy éjszakán át. A ligáit DNS alkotja a kívánt pSV2-HPC8 plazmidot; a plazmid restrikciós hely- és működési térképét a mellékelt ábrák közül a 2. ábra mutatja be.
E. coli K12 RR1 (NRRLB-15 210) sejteket transzformáláshoz kompetenssé teszünk lényegében a 2B. példában az E. coli KI2 HB 101-hez leírt munkamenet szerint. A fentebb készített ligáit DNS-t alkalmazzuk a sejtek transzformálására, és a transzformáló keverék alikvotjait 100 μg/ml ampicillint is tartalmazó L-agar lemezekre szélesztjük. A lemezeket ezután 37 ’C hőmérsékleten inkubáljuk. Az E. coli K12 RRl/pSV2HPC8 transzformánsok jelenlétét plazmid DNS-ük restrikciós enzimes elemzése erősíti meg. pSV2-HPC8 plazmid DNS-t készítünk a transzformánsokból lényegében az 1 A. példa munkamenete szerint, azzal a kivétellel, hogy szelektív szerként a sejtek tenyésztésének folyamán tetraciklin helyett ampicillint alkalmazunk.
μg pSV2-HPC8 plazmidot feloldunk 10 μΐ 10 x HindEŰ reakciópufferban, 5 μΐ (-50 egység) Hindin restrikciós enzimben, és 85 μΐ H2O-ban, és a reakciókeveréket 37 ’C hőmérsékleten inkubáljuk két órán át. A HindlII emésztés után a DNS-t kicsapjuk és a DNS üledéket feloldjuk 10 μΐ 10 x Sáli reakciópufferban [1,5 mól/1 NaCl; 60 mmól/1 trisz-HCl (pH 7,9), 60 mmól/1 MgCl2; 60 mmól/1 2-merkapto-etanol; és mg/ml BSA], 5 μΐ (-50 egység) Sáli restrikciós enzimben, és 85 pl H2O-ban. Az így létrejött Sáli reakciókeveréket 2 órán át inkubáljuk 37 ’C hőmérsékleten. A HindlII-mal és Sall-gyel emésztett pSV2HPC8 plazmidot 3,5%-os poliakrilamid gélre terheljük és elektroforézisnek vetjük alá, amíg a kívánt -0,29 kb-s Hindffl-Sall restrikciós fragmentum elkülönül a többi reakciótermékből. A kívánt fragmentumot a gélről izoláljuk; mintegy 2 μg fragmentumot kapunk, és ezt szuszpendáljuk 10 μΐ TE pufferban.
pg pSV-HPC8 plazmidot feloldunk 10 μΐ lOxBgin reakciópufferban, 5 μΐ (50 egység) BglII restrikciós enzimben és 85 μΐ H2O-ban, és a reakciókeveréket 37 ’C hőmérsékleten inkubáljuk 2 órán át. A BglII-vel végzett emésztés után a DNS-t kicsapjuk, és a DNS üledéket feloldjuk 10 μΐ 10 xSall reakciópufferban, 5 μΐ (-50 egység) Sáli restrikciós enzimben, és 85 μΐ H2O-ban. Az így létrejött Sáli reakciókeveréket órán át 37 ’C hőmérsékleten inkubáljuk. A Sall-gyel és BglII-vel emésztett pSV2-HPC8 plazmidot 3,5%-os poliakrilamid gélre terheljük és elektroforézisnek vetjük alá, amíg a kívánt -1,15 kb-s Sall-Bgin restrikciós fragmentum elkülönül a többi reakcióterméktől. A -1,15 kb-s SalI-BglII restrikciós fragmentumot a gélből izoláljuk; mintegy 8 pg fragmentumot kapunk, ezt 10 pl TE pufferban szuszpendáljuk.
Mintegy 10 pg pSV2-p-globin DNS-t (NRRL B15 928) feloldunk 10 pl 10 x HindlII reakciópufferban, 5 pl (-50 egység) HindlII restrikciós enzimben, és
HU 210 863 B μΐ H2O-ban, és a reakciókeveréket 2 órán át tartjuk 37 'C hőmérsékleten. A reakciókeveréket azután 0,25 mól/l-essé tesszük NaOAc-ra, majd két térfogat etanol hozzáadása és szárazjég-etanolos fürdőben végzett inkubálás után a DNS-t centrifugálással üledékbe visszük. A Hindül-mal emésztett pSV2-f$-globint feloldjuk 10 μΐ 10 x BglII pufferban, 5 μΐ (—50 egység) BglII restrikciós enzimben és 85 μΐ H2O-ban, és a reakciókeveréket 37 °C hőmérsékleten tartjuk 2 órán át. A BglII emésztés után a reakciókeveréket 1%-os agaróz gélre terheljük, és a fragmentumokat elektroforézissel elkülönítjük. A kívánt -4,2 kb-s HindlII-BglII restrikciós fragmentumot a gélről izoláljuk; a kívánt fragmentumból mintegy 5 μg-ot kapunk; ezt 10 pl TE pufferban szuszpendáljuk.
A pSV2-HPC8 plazmid -0,29 kb-s HindlII-SalII fragmentumának 2 pl-ét, a pSV2-HPC) plazmid -1,15 kb-s Sall-BglII fragmentumának 2 pl-ét, és a pSV2-Pglobin plazmid -4,2 kb-s Hindül-Bglü fragmentumának 2 μΐ-ét összekeveijük és ligáljuk T4 DNS ligázzal. A ligáit DNS alkotja a kívánt pL133 plazmidot; a pL133 plazmid restrikciós hely- és működési térképét a mellékelt ábrák közül a 2. ábra mutatja be. A ligáit DNS-t alkalmazzuk E. coli KI2 RR1 transzformálására; a kívánt E. coli K12 RRl/pL133 transzformánsokat ampicillin-rezisztens fenotípusuk és plazmid DNS-ük restrikciós enzimes elemzése alapján azonosítjuk.
F. A pLPC plazmid megalkotása a pL133 és pBLcat plazmidokból
Mintegy 20 pg pBLcat plazmid DNS-t feloldunk 10 μΐ 10 x HindlII pufferban és 80 μΐ H2O-ban. Mintegy 10 μΐ (-100 egység) HindlII restrikciós enzimet adunk a pBLcat DNS oldatához, és az így létrejött reakciókeveréket 2 órán át inkubáljuk 37 °C hőmérsékleten. A Hindül-mal emésztett pBLcat plazmid DNS-t agaróz gélre terheljük és elektroforézisnek vetjük alá, amíg a -0,87 kb-s HindlII restrikciós fragmentum, amely tartalmazza a BK fokozót és az Ad2 késői promotort, elkülönül a többi emésztési terméktől; ezután a -0,87 kb-s fragmentumot izoláljuk, tisztítjuk és ligáláshoz előkészítjük. A kívánt fragmentumból mintegy 2 pg-ot kapunk, ezt feloldjuk 5 μΙΤΕ pufferban.
Mintegy 1,5 pg pL133 plazmid DNS-t feloldunk 2 pl 10 x HindlII pufferban és 16 pl H2O-ban. Mintegy 1 pl (-10 egység) Hindm restrikciós enzimet adunk a DNS oldatához, és az így létrejött reakciókeveréket 37 ’C hőmérsékleten 2 órán át inkubáljuk. A DNS-t azután 100 pl-re TE pufferral és kezeljük -0,06 egység borjúbél alkálikus foszfatázzal, és az így létrejött reakciókeveréket 37 ’C hőmérsékleten 30 percig inkubáljuk. Az oldatot úgy állítjuk be, hogy tartalmazzon 1 x SET-et [5 mmől/l trisz-HCl (pH 7,8); 5 mmól/1 EDTA; és 150 mmól/1 NaCl], 0,3 mól/1 NaOAc-ot, és 0,5% SDS-t, majd inkubáljuk 65 ’C hőmérsékleten 45 percen át. A HindlII-mal emésztett pL133 plazmid DNS-t azután kétszer extraháljuk fenollal és egyszer kloroformmal, etanollal kicsapjuk, és újra szuszpendáljuk 10 pl TE pufferral.
A pBLcat plazmid -0,87 kb-s HindlII restrikciós fragmentumának mintegy 5 pl-ét hozzáadjuk a Hindlümal emésztett pL133 plazmid mintegy 1,5 pg-jához (10 pl), majd 2 pl 10 x ligáz puffért, 1 pl (-10 egység) T4 DNS ligázt és 2 pl H2O-t adunk a DNS oldatához, és az így létrejött reakciókeveréket 16 ’C hőmérsékleten egy éjszakán át inkubáljuk. A ligáit DNS alkotja a kívánt pLPC plazmidot.
A ligáit DNS-t E. coli K12 HB 101 transzformálására használjuk, lényegében a 2B. példa eljárása szerint. A transzformált sejteket ampicillint is tartalmazó Lagar lemezekre szélesztjük, és az ampicillin-rezisztens transzformánsok plazmid DNS-ét restrikciós enzimes elemzéssel vizsgáljuk, hogy azonosítsuk az E. coli KI2 HB 101/pLPC transzformánsokat. A -0,87 kb-s HindlII restrikciós fragmentum, amely a BK fokozót és az Ad2 késői promotort kódolja, a Hindül-mal emésztett pL133 plazmidba a két orientáció egyikében iktatódhat be, amely orientációknak csak egyike alakítja ki a pLPC plazmidot. A pLPC plazmid restrikciós hely- és működési térképét a mellékelt ábrák közül az 1. ábra D. része mutatja be.
3. példa
A pLPC-167G plazmid megalkotása
A pLPC-167G plazmidot lényegében a pLAPC plazmid megalkotásában alkalmazott, az 1. példában leírt hely-specifikus mutagenezis és más megalkotási munkamenetek szerint alkotjuk meg. A pLPC-167G plazmid megalkotásában alkalmazott pufferek és öszszeforrasztási körülmények azonban azok, amelyeket Zoller és Smith írtak le [DNA, 3, 479^189 (1984)].
A pLPC-167G plazmid megalkotásában az M13mpl8-HE1 fágot (lásd az IB. példát) hely-specifikus mutagenezisnek vetjük alá, az alábbi mutagenizáló oligonukleotidot alkalmazva:
5'-GACCAAGAAGACCAAGTAGGCCCGCGGCTCATTGATG-3'.
A hely-specifikus mutagenezisből kialakult mutagenizált fágot Ml3mpl8-HE4-nek nevezzük.
A pLPC167G plazmid végső megalkotása analóg módon megy végbe, mint a pLAPC plazmid megalkotása, amelyet az IC. példában írtunk le. A pLAPC plazmidot azonban két, a pLPC plazmidból eredő restrikciós fragmentumot alkalmazva alkottuk meg. A pLPC-167G plazmid megalkotásában viszont ugyanez a két fragmentum a pLAPC plazmidból kapott fragmentumokkal van helyettesítve. Annak oka, hogy a fragmentumok fonásaként pLAPC plazmidot alkalmazunk pLPC plazmid helyett, az, hogy így megkönnyítjük a restrikciós elemzést a pLPC-167G plazmidos transzformánsok azonosításában. Mivel a pLPC és pLPC-167G plazmidok nagyon szorosan közeli méretűek, nagyon nehéz lenne megkülönböztetni a „szülőket” (pLPC plazmid) a pLPC-167G plazmidtól. Ezek a szülők jelen lehetnek a ligálásban alkalmazott fragmentumok tisztítása ellenére is a tényezők sokféleségek miatt. Mivel azonban a pLAPC plazmid kisebb, mint a pLPC-167G plazmid, a két fragmentumot a pLAPC plazmidból kapva könnyen meg lehet különböztetni a szülőket (pLAPC) a kívánt pLPC-167G
HU 210 863 B plazmidtól. így abból a célból, hogy a pLPC-167G plazmidot megalkossuk, az M13mpl8-HE4 fág ~0,7 kb-s Sstl-Sall restrikciós fragmentumát ligáljuk a pLAPC plazmid -3,76 kb-s EcoRI-Sall restrikciós fragmentumához és a pLAPC plazmid -2,0 kb-s ECORl-Sstl restrikciós fragmentumához. A ligáit DNS alkotja a kívánt pLPC-167G plazmidot, amelyet E. coli KI2 RV308-ba transzformálunk. Az így létrejött E. coli K12 RV308/pLPC-167G transzformánsokat alkalmazzuk a pLPC-167G plazmid DNS nagy léptékű előállításához eukarióta sejtek transzformálásában való felhasználásra.
4. példa
A pLPC-167F plazmid megalkotása
A pLPC-167F plazmidot lényegében a pLAPC plazmid megalkotásában alkalmazott, az 1. példában leírt hely-specifikus mutagenezis és más megalkotási munkamenetek szerint alkotjuk meg. A pLPC-167F plazmid megalkotásában alkalmazott pufferok és öszszeforrasztási körülmények azonban, amelyeket Zoller és Smith leírtak [DNA, 3, 479-489 (1984)].
A pLPC-167F plazmid megalkotásában az M13mpl8-HE1 fágot (lásd IB. példa) hely-specifikus mutagenezisnek vetjük alá az alábbi mutagenizáló oligonukleotidot alkalmazva.
5'-GACCAAGAAGACCAAGTATTCCCGCGGCTCATTGATG-3'.
A hely-specifikus mutagenezisből eredő mutagenizált fágot M13mpl 8-HE5-nek nevezzük.
A pLPC-167F plazmid végső megalkotása analóg módon megy végbe, mint a pLAPC plazmid megalkotása, amelyet az IC. példában írtunk le. A pLAPC plazmidot azonban két, a pLPC plazmidból eredő restrikciós fragmentumot alkalmazva alkottuk meg. A pLPC-167F plazmid megalkotásában viszont ugyanez a két fragmentum a pLAPC plazmidból kapott fragmentumokkal van helyettesítve. Annak oka, hogy a fragmentumok forrásaként pLAPC plazmidot alkalmazunk pLPC plazmid helyett, az, hogy így megkönnyítjük a restrikciós elemzést a pLPC-167F plazmidos transzformánsok azonosításában. Mivel a pLPC és pLPC-167F plazmidok nagyon szorosan közeli méretűek, nagyon nehéz lenne megkülönböztetni a „szülőket” (pLPC plazmid) a pLPC-167F plazmidtól. Mivel azonban a pLAPC plazmid kisebb, mint a pLPC-167F plazmid, a két fragmentumot a pLAPC plazmidból kapva könnyen meg lehet különböztetni a szülőket (pLAPC) a kívánt pLPC-167F plazmidtól. így abból a célból, hogy a pLPC-167F plazmidot megalkossuk, az M13mpl8-HE5 fág -0,7 kb-s Sstl-Sall restrikciós fragmentumot ligáljuk a pLAPC plazmid -3,76 kb-s EcoRl-Sall fragmentumához és a pLAPC plazmid -2,0 kb-s EcoRi-SstI restrikciós fragmentumához. A ligáit DNS alkotja a kívánt pLPC-167F plazmidot, amelyet E. coli K12 RV3O8-ba transzformálunk. Az így létrejött E. coli K12 RV308/pLPC-167F transzformánsokat alkalmazzuk pLPC-167F plazmid DNS nagy léptékű előállításához, eukarióta sejtek transzformálásában való felhasználáshoz.
5. példa
Adenovírussal transzformált 293. humán embrió vesesejtvonal és adenovírussal transzformált AVI2 szíriai hörcsög sejtvonal transzformánsok megalkotása pLPC-167G és pLPC-167F plazmidokat alkalmazva
A 293. humán embrió vesesejtvonal az American Type Culture Collection-nál szerezhető be, ahol ez az ATCC CRL 1573. deponálási számon található. Az AC12 adenovírussal fertőzött szíriai hörcsög sejtvonal szintén az American Type Culture Collectionnál szerezhető be, ahol az ATCC CRL 9595 deponálási számon található. Az alább leírt transzformálási munkamenet a 293. sejtvonalra, mint gazdasejtvonalra vonatkozik; a munkamenet azonban általában alkalmazható a legtöbb eukarióta sejtvonalra, beleértve az AVI2 sejtvonalat is, valamint alkalmazható a találmány szerinti vektorok kifejezésére.
A 293. sejteket az ATCC-től a CRL 1573 deponálási számon kapjuk egy 25 mm2-es lombikban, amely mintegy 5,5 -106 sejt összefolyó egy-rétegét tartalmazza Eagle-féle minimális eszenciális tápközegben (Gibco), amely 10% hővel inaktivált lószérummal van kiegészítve. A lombikot 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk; a tápközeget kétszer cseréljük. A tápközeg 10% boijűembrió szérummal kiegészített DMEM-ból (Gibco), 50 pg/ml gentamicinból és 10 gg/ml AquaMETHYTONfitonadion K, vitaminból (Merck Sharp and Dohme, Merck and Co., Inc., West Point, Pennsylvania 19 486) áll. Asejteket altenyésztésnek vetjük alá (átoltjuk) a tápközeget eltávolítva, Hank-féle kiegyensúlyozott sóoldattal (Gibco) átöblítve, 1-2 percre 0,25%-os tripszint (amely 0,2 g/1 EDTA-t is tartalmaz) hozzáadva, friss tápközeggel átöblítve, leszívatva, és új lombikba áthelyezve 1:5 vagy 1:10 átoltási arányban.
A transzformálás előtt 1 nappal a sejteket átoltjuk 0,7 · 106 sejt/100 mm-es csésze mennyiségben. TE pufferban feloldott steril, etanollal kicsapott plazmid DNS-t alkalmazunk 2xDNS-CaCl2 oldat előállítására, amely 25 μg/ml transzformáló plazmid DNS-t (a pLPC-167F vagy pLPC-167G transzformálásához általában két plazmidot alkalmazunk: a pLPC-167F vagy pLPC-167G plazmidot és egy olyan plazmidot, amely valamilyen szelektálható markert tartalmaz, amint ezt a későbbiekben tárgyaljuk) és 250 mmól/1 CaCl2-t tartalmaz. 2xHBSS-t készítünk, amely 280 mmól/1 NaCl-t, 50 mmól/1 HEPES-t és 1,5 mmól/1 nátrium-foszfátot tartalmaz, a pH-t 7,05-7,15-re beállítva. A 2xDNSCaCl2 oldatot cseppenként adjuk hozzá az azonos térfogatú steril 2xHBSS-hez. Egy 1 ml steril műanyag pipettát, gyapot-dugó véggel, helyezünk be a keverőcsőbe, amely a 2xHBSS-t tartalmazza, és buborékokat vezetünk be fújással, miközben a DNS-t beadjuk. A kalcium-foszfát-DNS csapadékot hagyjuk képződni keverés nélkül 35-40 percig szobahőmérsékleten.
A csapadékot azután a műanyag pipettával végzett gyengéd pipettázással összekeverjük és lemezenként 1 ml csapadékot adunk közvetlenül a növesztő tápközeg 10 ml-éhez, amely a befogadó sejteket fedi. 4 órán át, 37 °C hőmérsékleten végzett inkubálás után
HU 210 863 B a tápközeget friss tápközeggel helyettesítjük és a sejteket további 72 órán át hagyjuk inkubálódni, mielőtt a szelekciós kiválasztást elvégeznénk. Azoknál a plazmidoknál, amelyek nem tartalmaznak olyan szelektálható markert, amely eukarióta sejtekben működőképes, tehát pl. a pLPC-167F és pLPC-167G plazmidoknál, a transzformálási eljárás plazmidok keverékét hasznosítja: a jelen találmány kifejező vektorát, amelyből hiányzik egy szelektálható marker; és egy olyan kifejező vektort, amely eukarióta sejtekben működőképes szelektálható markert tartalmaz. Vektorok széles választéka áll rendelkezésre az ilyen együtttranszformálási rendszerekben való felhasználásra, ilyenek pl. a pSV2-dhfr (ATCC 37 146); pSV2-neo (ATCC 37 149); pSV2-gpt (ATCC 37 145); és pSV2hyg (NRRL B-18 039) plazmidok. A pSV2-hyg higromicin B-re ad át rezisztenciát eukarióta gazdasejteknek. Ez az együtt-transzformálási technika lehetővé teszi olyan sejtek szelekcióját, amelyek a szelektálható markénál bíró plazmidot tartalmazzák. Ezeket a sejteket tovább vizsgáljuk, hogy azonosítsuk azokat a sejteket, amelyek tartalmazzák mindkét transzformáló plazmidot. A jelen találmány természetesen magában foglal olyan kifejező vektorokat is, amelyek tartalmaznak szelektálható markert eukarióta sejtekhez, és így nem igénylik az együtt-transzformálási technika alkalmazását.
A higromicin rezisztencia átadó gént tartalmazó plazmidokkal átfertőzött sejtekhez higromicin B-t adunk a növesztő tápközeghez mintegy 200 gg/ml végső koncentrációra. A sejteket azután 37 °C hőmérsékleten 2-4 hétig inkubáljuk 3-4 napos időközönkénti tápközeg-cserével. Az így létrejött higromicinrezisztens telepeket egyedi tenyésztő edényekbe visszük át a jellemzéshez. A pSV2-neo neomicinre való rezisztenciát ad át (G418 is alkalmazható neomicin helyett), és a G418-rezisztens telepek kiválasztását lényegében a higromicin-rezisztens sejtek szelekciós munkamenete szerint hajtjuk végre azzal a kivétellel, hogy G418-at alkalmazunk adalékként 400 μg/ml mennyiségben.
A dihidrofolát reduktáz (dhfr) génnek vagy a dhfr gén metotrexát rezisztencia átadó származékának (dhfr-mtx) alkalmazása szelektálható markerként egy gén vagy plazmid bevitelére egy dhrf-hiányos sejtvonalba, majd a metotrexát ezt követő alkalmazása a plazmid kópiaszámának növelésére az irodalomban jól megalapozott. A 293. sejtek dhfr pozitívak, így a 293. transzformánsok, amelyek tartalmazzák a dhfr gént tartalmazó plazmidot, nem szelektálhatók csupán dhfrpozitív fenotípusuk alapján, amely azt a képességet jelenti, hogy képesek növekedni olyan tápközegen, amelyből hiányzik a hipoxantin és a timin. Azok a sejtvonalak, amelyekből hiányzik egy működőképes dhfr gén, és dhfr-tartalmú plazmidokkal vannak transzformálva, szelektálható a dhfr-fenotípus alapján. Bár a dhfr, mint szelektálható és sokszorozható marker alkalmazása dhfr-termelő sejtekben még nincs kellőképpen tanulmányozva, az irodalomban levő bizonyítékok azt sugallják, hogy a dhrf-t lehet alkalmazni szelektálható markerként és gén-sokszorozáshoz dhfr-termelő sejtekben. A jelen találmány nem korlátozódik a kifejező vektorokban alkalmazott szelektálható markerekre. Sőt, olyan sokszorozó markerek, mint a metallotionein gének, adenozin dezamináz gén, vagy a multigén rezisztencia család tagjai, pl. a P-glikoprotein gén, szintén alkalmazhatók.
A 293. és AVI2 sejtvonalak transzformálása pLPC167F vagy pLPC-167G plazmid és egy hidromicin rezisztencia átadó vektor keverékével, majd az ezt követő szelekció higromicin rezisztens sejtekre egy sor transzformánst termel. (További, más transzformánsokat kapunk a pSV2-neo-t tartalmazva együtt-transzformáló vektorként és kiválasztva a G418 rezisztens sejteket). Ezeket a transzformánsokat elemezzük, amint a 6. példában leírtjuk, hogy meghatározzuk: mely higromicin-rezisztens sejtek tartalmazzák a pLPC-167F vagy pLPC-167G plazmidot.
6. példa
Nagy mennyiségben kiválasztó transzformánsok szelekciója
Az 5. példában kapott higromicin-rezisztens transzformánsokat 100 mm2-es szövettenyésztő edényekben növesztjük néhány száz sejt klón/szövettenyésztő edény sűrűségig. A tápközeget leöntjük, és a sejteket kétszer öblítjük Hank-féle kiegyensúlyozott sóoldat (Gibco) 5 ml-es alikvotjaival. Steril, 0,45%-os agart (Sigma 4. típusú agaróz, katalógusszám: A3643; Sigma Chemical Co., P.O. Box 14 508, St. Louis, Missouri 63 178) készítünk 1 ml 1,8%-os agar (47 °C) összekeverésével 3 ml Dulbecco-féle módosított Eagle (DMS) sóoldattal (Gibco) (37 °C), és ebből a 0,45%-os agar oldatból 2 ml-t rétegezünk a sejtek fölé.
Nitrocellulóz szűrőket (Schleicher és Schuell, Inc., Keene, New Hampshire 03 431) felforralunk, majd autoklávozunk 2 órán át, hogy eltávolítsuk a nedvesítőszert, amely a sejtekre nézve toxikus. A szűrőket azután az agar réteg tetejére helyezzük, és miután a levegőbuborékokat eltávolítottuk, a lemezeket 37 ’C hőmérsékleten inkubáljuk 1-3 órán át. A szűrőket, amelyeket előzetesen megjelöltünk, hogy jelezzük a szűrő eredeti orientációját a lemezen úgy, hogy a telepek későbbi azonosítása könnyű legyen, eltávolítjuk és PBS-be [50 mmól/1 trisz-HCl (pH 7,2) és 150 mmól/1 NaCl] helyezzük.
Abból a célból, hogy a sejteket a lemezen életben tartsuk a szűrők elemzése során, a sejteket felülrétegezzük olyan keverékkel, amely 2 ml 1,8%-os agart (47 ’C), 2 ml DME sót (37 ’C), és 4 ml DME sót 20% borjúembrió szérummal (37 ’C) tartalmaz. A sejteket ezután 37 ’C hőmérsékletű inkubátorba helyezzük. Az összes mosást és reakciót a szűrőn úgy végezzük, hogy a szűrők rázóasztalon vannak. A szűrőket először szobahőmérsékleten 5% tejet tartalmazó PBSben végzett inkubálással blokkoljuk. A szűrőket azután négyszer öblítjük PBS-ben (5 perc/öblítés). 10 pg/ml biotinilezett kecske anti-humán C fehérje poliklonális antitestet (2,5%-os szarvasmarha szérum albuminban) adunk a szűrőhöz (arra elegendő meny27
HU 210 863 Β nyiségben, hogy elfedje a szűrőt), ezt azután 37 °C hőmérsékleten 1 órán át inkubáljuk.
' A C fehérje tisztítását a C fehérje elleni antitestek előállításához való további felhasználáshoz úgy hajthatjuk végre, amint ezt Kisiel leírta [J. Clin. Invest. 64, 761 (1979)]. Poliklonális antitestet készíthetünk azzal a munkamenettel, amelyet Kábát E. A. ismertet a „Structural Concepts in Immunology and Immunochemistry” című kiadványban kiadók: Holt, Rhinehart és Winston (1968). Monoklonális antitesteket, amelyek szintén alkalmasak ebben a vizsgálatban való felhasználásra, úgy állíthatunk elő, amint ezt Kohler és Milsteiin leírták [Natúré, 256, 495 (1975)], vagy amint ezt az alábbi irodalmi helyen ismertetik: 4 696 895 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás; 205 046 számú európai közzétételi irat; Laurell és munkatársai: FEBS 191 (1), 75 (1985); Suzuki és munkatársai: J. Biochem. 97, 127-138 (1985); és 138 222 számú európai szabadalmi közzétételi irat. A vizsgálatban alkalmazott avidin D és biotinilezett torma peroxidáz (HRP) a Vectastain készletben szerezhető be (Vector Laboratories, Inc., 30 Ingold Road, Burlingame, Kalifornia 94 010). A biotin szintén beszerezhető a Vector laboratories, Inc.-től.
A szűrőket négyszer öblítjük PBS-sel 4 “C hőmérsékleten. Ezután az avidin D-t és a torma peroxidázt előkészítjük és hozzáadjuk, amint ezt a gyártó előírja a Vectastain készletben (Vector Laboratories). A szűrőket inkubáljuk a HRP-vel konjugált avidin D-vel 1 órán át 4 °C hőmérsékleten (hosszabb inkubálási időt, pl. egy éjszakát lehet alkalmazni, amikor kis mennyiségű fehérje választódik ki); ezután a szűrőket négyszer mossuk PBS-sel 4 °C hőmérsékleten.
Abból a célból, hogy az indikátor színét a szűrőn kifejlesszük, mintegy 30 mg HRP színkifejlesztő reagenst (4-klór-l-naftol) feloldunk jéghideg 100%-os metanolban, és hozzáadjuk 50 ml PBS-hez és 30 μΐ 30%-os H2O2-hez. Ezt a keveréket hozzáadjuk a nitrocellulóz szűrőhöz, amelyet azután szobahőmérsékleten inkubálunk, amíg a szín kifejeződik. Azok a telepek, amelyek a legtöbb, találmányunk szerinti humán C fehérje zimogént választják ki, nemcsak a szín legkorábbi megjelenésével tűnnek ki, hanem a legsötétebb foltokkal is a szűrőn.
Miután a szűrőket kifejlesztettük a szűrőket ismét hozzáillesztjük az eredeti lemezekhez, hogy meghatározzuk, melyik telepek melyik foltokkal társulnak a szűrőn. A legtöbb, találmányunk szerinti C fehérje zimogént tartalmazó telepeket azután kiválasztjuk és felhasználjuk a zimogén termelésére.
Azok, akik a szakterületen jártasak, tudják, hogy a fenti vizsgálati módszer csunám bemutató jellegű a nagy mennyiséget kiválasztó sejtvonalak azonosítására. Sokféle hasonló jellegű vizsgálati módszer alkalmazható sikeresen. így pl. kettős antitest reakciót lehet alkalmazni, amelyben a biotinilezett kecske anti C fehérje antitestet egy kecske anzi C fehérje antitest (IgG) és egy bioszinilezett anti-kecske IgG antitest helyettesíti.

Claims (11)

1) egy gamma-karboxilezett, szekretálódó fehérje szignál- és polipeptidjéből,
1. Eljárás humán C fehérje új, módosított zimogén formájának kifejezésére szolgáló rekombináns expressziós DNS-vektor előállítására, azzal jellemezve, hogy
I) a humán C fehérje egy módosított zimogén formáját kódoló DNS-szekvenciát tartalmazó DMS-molekulát - ahol a nevezett fehérje az amino-terminálistól a karboxi-terminálisig
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy I) DNS-molekulaként az alábbi aminosav-sorrendű, 1)—4) szakaszokból felépülő humán C fehérje zi28
HU 210 863 Β mogént kódoló DNS-szekvenciát tartalmazó DNS-molekulát ligáljuk:
H2N-MET TRP GLN LEU THR SER LEU LEU LEU PHE VAL ALA THR TRP GLY ILE SER GLY THR PRO ALA PRO LEU ASP SER VAL PHE SER SER SER GLU ARG ALA HIS GLN VAL LEU ARG ILE ARG LYS ARG ALA ASN SER PHE LEU GLU GLU LEU ARG HIS SER SER LEU GLU ARG GLU CYS ILE GLU GLU ILE CYS ASP PHE GLU GLU ALA LYS GLU ILE PHE GLN ASN VAL ASP ASP THR LEU ALA PHE TRP SER LYS HIS VAL ASP GLY ASP GLN CYS LEU VAL LEU PRO LEU GLU HIS PRO CYS ALA SER LEU CYS CYS GLY HIS GLY THR CYS ILE ASP GLY ILE GLY SER PHE SER CYS ASP CYS ARG SER GLY TRP GLU GLY ARG PHE CYS GLN ARG GLU VAL SER PHE LEU ASN CYS SER LEU ASP ASN GLY GLY CYS THR HIS TYR CYS LEU GLU GLU VAL GLY TRP ARG ARG CYS SER CYS ALA PRO GLY TYR LYS LEU GLY ASP ASP LEU LEU GLN CYS HIS PRO ALA VAL LYS PHE PRO CYS GLY ARG PRO TRP LYS ARG MET GLU LYS LYS ARG SER HIS LEU LYS ARG ASP THR GLU ASP GLN GLU ASP GLN VAL Rx R2 ARG LEU ILE R3 GLY LYS MET THR ARG ARG GLY ASP SER PRO TRP GLN VAL VAL LEU LEU ASP SER LYS LYS LYS LEU ALA CYS GLY ALA VAL LEU ILE HIS PRO SER TRP VAL LEU THR ALA ALA HIS CYS MET ASP GLU SER LYS LYS LEU LEU VAL ARG LEU GLY GLU TYR ASP LEU ARG ARG TRP GLU LYS TRP GLU LEU ASP LEU ASP ILE LYS GLU VAL PHE VAL HIS PRO ASN TYR SER LYS SER THR THR ASP ASN ASP ILE ALA LEU LEU HIS LEU ALA GLN PRO ALA THR LEU SER GLN THR ILE VAL PRO ILE CYS LEU PRO ASP SER GLY LEU ALA GLU ARG GLU LEU ASN GLN ALA GLY GLN GLU THR LEU VAL THR GLY TRP GLY TYR HIS SER SER ARG GLU LYS GLU ALA LYS ARG ASN ARG THR PHE VAL LEU ASN PHE ILE LYS ILE PRO VAL VAL PRO HIS ASN GLU CYS SER GLU VAL MET SER ASN MET VAL SER GLU ASN
MET LEU CYS ALA GLY ILE LEU GLY ASP ARG GLN ASP ALA CYS GLU GLY ASP SER GLY GLY PRO MET VAL ALA SER PHE HIS GLY THR TRP PHE LEU VAL GLY LEU VAL SER TRP GLU GLU GLY CYS GLY LEU LEU HIS ASN TYR GLY VAL TYR THR LYS VAL SER ARG TYR LEU ASP TRP ILE HIS GLY HIS ILE ARG ASP LYS GLU ALA PRO GLN LYS SER TRP ALA PRO- -COOH
ahol
R] jelentése PHE, GLY, TYR vagy TRP,
R2 jelentése PRO vagy VAL, és
R3 jelentése ASP vagy ASN.
2) a humán C fehérje könnyű láncából,
3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az 1) szignál- és propeptidként a naszcensz humán C fehérje szignál- és propeptidjét építjük be.
3) a lizin-arginin, arginin-lizin, lizin-lizin vagy arginin-arginin dipeptidből, és
4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy rekombináns expressziós DNS-vektorként a pLPC-167F jelű plazmidot állítjuk elő.
4) az alábbi aminosav-szekvenciájú polipeptiddől.
ASP THR GLU ASP GLN GLU ASP GLN VAL Rx R :2 ARG LEU ILE R3 GLY LYS MET THR ARG ARG GLY ASP SER PRO TRP GLN VAL VAL LEU LEU ASP SER LYS LYS LYS LEU ALA CYS GLY ALA VAL LEU ILE HIS PRO SER TRP VAL LEU THR ALA ALA HIS CYS MET ASP GLU SER LYS LYS LEU LEU VAL ARG LEU GLY GLU TYR ASP LEU ARG ARG TRP GéU LYS TRP GLU LEU ASP LEU ASP ILE LYS GLU VAL PHE VAL HIS PRO ASN TYR SER LYS SER THR THR ASP ASN ASP ILE ALA LEU LEU HIS LEU ALA GLN PRO ALA THR LEU SER GLN THR ILE VAL PRO ILE CYS LEU PRO ASP SER GLY LEU ALA GLU ARG GLU LEU ASN GLN ALA GLY GLN GLU THR LEU VAL THR GLY TRP GLY TYR HIS SER SER ARG GLU LYS GLU ALA LYS ARG ASN ARG THR PHE VAL LEU ASN PHE ILE LYS ILE PRO VAL VAL PRO HIS ASN GLU CYS SER GLU VAL MET SER ASN MET VAL SER GLU ASN MET LEU CYS ALA GLY ILE LEU GLY ASP ARG GLN ASP ALA CYS GLU GLY ASP SER GLY GLY PRO MET VAL ALA SER PHE HIS GLY THR TRP PHE LEU VAL GLY LEU VAL SER TRP GLY GLU GLY CYS GLY LEU LEU HIS ASN TYR GLY VAL TYR THR LYS VAL SER ARG TYR LEU ASP TRP ILE HIS GLY HIS ILE ARG ASP LYS GLU ALA PRO GLN LYS SER TRP ALA PRO- -COOH
épül fel, ahol
R] jelentése PHE, GLY, TYR vagy TRP,
R2 jelentése VAL vagy PRO, és
R3 jelentése ASP vagy ASN és
II) egy, a kódoló DNS-szekvencia kifejezése szempontjából a ligálás után megfelelő helyzetbe kerülő promotort tartalmazó DMS-molekulát ligálunk.
5. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy rekombinánsként expressziós DNS-vektorként a pLPC-167G jelű plazmidot állítjuk elő.
6. Eljárás rekombináns humán C fehérje módosított zimogén formájának eukarióta gazdasejtből szekrécióval történő előállítására, azzal jellemezve, hogy
i) egy eukarióta gazdasejtet transzformálunk egy 1. igénypont szerint előállított rekombináns expressziós DNS-vektorral, és ii) a transzformált gazdasejtet a kódoló DNS-szekvencia kifejeződését lehetővé tevő körülmények között tenyésztjük.
7. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az i) lépésben a pLPC-167F jelű plazmiddal transzformálunk.
8. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az i) lépésben a pLPC-167G jelű plazmiddal transzformálunk.
9. A 6-8. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az i) lépésben gazdasejtként a 293 vagy az AV12 jelű gazdasejtet transzformálunk.
10. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az ii) lépésben transzformált gazdasejtként a 293/a pLPC-167F, 293/pLPC-l67G, AV12/pLPC-167F vagy az AV12/pLPC-167G gazdasejtet tenyésztjük.
11. Eljárás főként véralvadásgátló gyógyszerkészítmények előállításáta, azzal jellemezve, hogy a 6. igénypont szerint előállított módosított zimogén humán C fehérjét a gyógyszerkészítésben szokásos hordozó-, vivő- és segédanyagokkal összekeverve gyógyszerkészítménnyé alakítjuk.
HU886577A 1987-12-28 1988-12-22 Method for expression of zymogen forms of human protein c and for preparation of vectors for these HU210863B (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US13800987A 1987-12-28 1987-12-28

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HUT50499A HUT50499A (en) 1990-02-28
HU210863B true HU210863B (en) 1995-08-28

Family

ID=22480037

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU886577A HU210863B (en) 1987-12-28 1988-12-22 Method for expression of zymogen forms of human protein c and for preparation of vectors for these

Country Status (21)

Country Link
EP (1) EP0323149B1 (hu)
JP (1) JP2851287B2 (hu)
KR (1) KR890010202A (hu)
CN (1) CN1035526A (hu)
AR (1) AR244804A1 (hu)
AT (1) ATE116368T1 (hu)
AU (1) AU609919B2 (hu)
CA (1) CA1340111C (hu)
DE (1) DE3852625T2 (hu)
DK (1) DK723488A (hu)
ES (1) ES2065341T3 (hu)
GR (1) GR3015609T3 (hu)
HU (1) HU210863B (hu)
IE (1) IE66337B1 (hu)
IL (1) IL88758A (hu)
MX (1) MX14312A (hu)
NZ (1) NZ227434A (hu)
PT (1) PT89285B (hu)
RU (1) RU2018535C1 (hu)
SU (1) SU1739854A3 (hu)
ZA (1) ZA889497B (hu)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1989012685A1 (en) * 1987-05-18 1989-12-28 Integrated Genetics, Inc. Improved protein c molecules and method for making and activating same
US4992373A (en) * 1987-12-04 1991-02-12 Eli Lilly And Company Vectors and compounds for direct expression of activated human protein C
GB8927722D0 (en) * 1989-12-07 1990-02-07 British Bio Technology Proteins and nucleic acids
DE69032029T2 (de) * 1989-12-29 1998-08-20 Zymogenetics, Inc., Seattle, Wash. Hybrides protein c
US5358932A (en) * 1989-12-29 1994-10-25 Zymogenetics, Inc. Hybrid protein C
IL97311A0 (en) * 1990-02-23 1992-05-25 Lilly Co Eli Vectors and compounds for expression of glycosylation mutants of human protein c
US5270178A (en) * 1990-02-23 1993-12-14 Eli Lilly And Company Vectors and compounds for expression of zymogen forms of human protein C
MY110664A (en) * 1992-05-21 1999-01-30 Lilly Co Eli Protein c derivatives
US5618714A (en) * 1993-12-15 1997-04-08 Eli Lilly And Company Methods for producing protein C
JP2003514545A (ja) * 1999-11-19 2003-04-22 イーライ・リリー・アンド・カンパニー プロテインｃ誘導体

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4775624A (en) * 1985-02-08 1988-10-04 Eli Lilly And Company Vectors and compounds for expression of human protein C

Also Published As

Publication number Publication date
HUT50499A (en) 1990-02-28
GR3015609T3 (en) 1995-06-30
CA1340111C (en) 1998-11-03
DK723488D0 (da) 1988-12-27
DK723488A (da) 1989-06-29
NZ227434A (en) 1991-03-26
ES2065341T3 (es) 1995-02-16
ATE116368T1 (de) 1995-01-15
AU2732988A (en) 1989-06-29
ZA889497B (en) 1990-08-29
PT89285A (pt) 1989-12-29
IE66337B1 (en) 1995-12-27
KR890010202A (ko) 1989-08-07
AR244804A1 (es) 1993-11-30
EP0323149A2 (en) 1989-07-05
EP0323149B1 (en) 1994-12-28
JPH022376A (ja) 1990-01-08
AU609919B2 (en) 1991-05-09
CN1035526A (zh) 1989-09-13
IE883849L (en) 1989-06-28
RU2018535C1 (ru) 1994-08-30
DE3852625T2 (de) 1995-05-24
JP2851287B2 (ja) 1999-01-27
DE3852625D1 (de) 1995-02-09
SU1739854A3 (ru) 1992-06-07
MX14312A (es) 1994-01-31
PT89285B (pt) 1993-08-31
IL88758A0 (en) 1989-07-31
EP0323149A3 (en) 1990-06-13
IL88758A (en) 1994-02-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US4775624A (en) Vectors and compounds for expression of human protein C
CA1340263C (en) Expression of protein c analogues
EP0319312B1 (en) Vectors and compounds for direct expression of activated human protein C
US5270178A (en) Vectors and compounds for expression of zymogen forms of human protein C
US5358932A (en) Hybrid protein C
US5196322A (en) Vectors and compounds for expression of zymogen forms of human protein C
EP0506821B1 (en) Hybrid protein c
US5460953A (en) Vectors and compounds for expression of glycosylation mutants of human protein C
HU210863B (en) Method for expression of zymogen forms of human protein c and for preparation of vectors for these
US5270040A (en) Vectors and compounds for expression of human protein C
WO1991009951A2 (en) Recombinant protein c with truncated light chain

Legal Events

Date Code Title Description
HMM4 Cancellation of final prot. due to non-payment of fee