DE3852625T2

DE3852625T2 - Vektoren und Verbindungen zur Expression von Zymogen-Formen von menschlichem Protein C.

Info

Publication number: DE3852625T2
Application number: DE3852625T
Authority: DE
Inventors: Nils Ulrik Bang; Hartmut Josef Ehrlich; Brian William Grinnell; Sau-Chi Betty Yan
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 1987-12-28
Filing date: 1988-12-22
Publication date: 1995-05-24
Anticipated expiration: 2008-12-23
Also published as: HUT50499A; GR3015609T3; CA1340111C; DK723488D0; DK723488A; NZ227434A; ES2065341T3; ATE116368T1; AU2732988A; ZA889497B; PT89285A; IE66337B1; KR890010202A; AR244804A1; EP0323149A2; EP0323149B1; JPH022376A; AU609919B2; CN1035526A; IE883849L

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue DNA Verbindungen und rekombinante DNA Klonierungsvektoren, die neue Zymogenformen von humanem Protein C kodieren. Diese Zymogene können in vivo alleine durch Thrombin mit einer Geschwindigkeit mit klinischer Bedeutung aktiviert werden und sind für die Aktivierung durch Thrombin/Thrombomudulin viel leichter zugänglich, als das native Protein C Zymogen. Die Expressionsvektoren liefern ein einfaches und effizientes Mittel zur Expression dieser humanen Protein C Zymogene in rekombinanten Wirtszellen. Native humane Protein C Zymogene erfordern eine Behandlung mit großen Mengen an Thrombin, oder Thrombin und Thrombomodulin oder anderen teuren Enzymen für die Aktivierung. Die vorliegende Erfindung liefert ein Mittel zur Herstellung von Zymogenformen von humanem Protein C, die für Thrombin viel bessere Substrate sind, so daß sie Gegenwart von geringeren Mengen an Thrombin oder Thrombin/Thrombomodulin oder anderen Enzymen aktiviert werden können. Am bedeutendsten ist, daß die erfindungsgernäßen Zymogenformen von humanem Protein C sogar in Gegenwart von physiologischem Ca²&spplus; aktiviert werden können, das die Aktivierung von nativem Protein C Zymogen durch Thrombin hemmt. Die neuen Zymogenformen von humanem Protein C unterscheiden sich von den in der Technik bekannten in der Aminosäuresequenz des Aktivierungspeptids, das von den Zymogenformen unter Bildung von aktiviertem humanem Protein C entfernt wird. Diese neuen Zymogenformen von Protein C bieten spezielle Vorteile bei der Behandlung von Blutstörungen, die mit der Koagulation zusammenhängen.
Das Protein C, ein Vitamin K abhängiges Plasmaprotein, ist für die Kontrolle der Hämostase von wesentlicher physiologischer Bedeutung und spielt eine wesentliche Rolle bei der Regulation der Blutgerinnung. Das Protein C wird als inaktives Molekül synthetisiert, das hierin unreifes Protein C genannt wird. Unreifes Protein C durchläuft eine komplexe Prozessierung, die zu vielen verschiedenen inaktiven Molekülen führt, wie es unten ausführlicher beschrieben ist. Inaktive, sekretierte Formen von Protein C werden hierin als Protein C Zymogen bezeichnet. Die Aktivierung von Protein C findet im Blut durch eine einen Thrombomodulin- Thrombin-Komplex beinhaltende Reaktion statt. Aktiviertes Protein C ist zusammen mit dessen Cofaktor Protein S ein Antikoagulans mit wichtiger physiologischer Bedeutung. Aktiviertes Protein C kann intravaskuläre Thrombose verhindern und die Ausbreitung von vorhandenen Pfropfen kontrollieren. Der Wirkmechanismus der aktivierten Form von Protein C und der Aktivierungsmechanismus des inaktiven Zymogens in die aktive Protease wurden in den letzten Jahren aufgeklärt (Zusammenfassung siehe J. E. Gardiner und J. H. Griffin, Progress in Hematology, Band XIII, Seiten 265-278, Herausgeber Elmer B. Brown, Grune and Stratton, Inc., 1983).
Die Aktivierung von Protein C bezieht Thrombin mit ein, die letzte Serinprotease in der Gerinnungskaskade und ein membranassoziiertes Glycoprotein von Endothelzellen, Thrombomodulin genannt. Thrombomodulin bildet einen engen, stöchiometrischen Komplex mit Thrombin. Thrombomodulin wechselt vollkommen die funktionellen Eigenschaften von Thrombin, wenn es mit Thrombin komplexiert ist. Thrombin verklumpt normalerweise Fibrinogen, aktiviert Blutplättchen und wandelt die Gerinnungscofaktoren V und VIII in ihre aktivierten Formen Va und VIIIa um. Schließlich aktiviert Thrombin Protein C, aber nur sehr langsam und ineffizient und die Aktivierung ist ferner durch physiologisches Ca²&spplus; gehemmt. Im Gegensatz dazu verklumpt mit Thrombomodulin komplexiertes Thrombin Fibrinogen nicht, aktiviert die Blutplättchen nicht oder wandelt die Gerinnungsfaktoren V und VIII nicht in ihre aktivierten Gegenspieler Va und VIIIa um, sondern wird zu einem sehr effizienten Aktivator von Protein C Zymogen in Gegenwart von physiologischem Ca²&spplus;. Die Geschwindigkeitskonstante der Protein C Zymogen Aktivierung durch Thrombomodulin-Thrombin ist über 1 000 fach höher als die Geschwindigkeitskonstante von Thrombin alleine.
Um zu verstehen, wie aktiviertes Protein C die Blutgerinnung herunterreguliert, wird im folgenden eine kurze Beschreibung des Gerinnungsenzymsystems bereitgestellt. Das Gerinnungssystem betrachtet man am besten als eine Kettenreaktion , die die sequentielle Aktivierung von Zymogenen in aktive Serinproteasen beinhaltet. Diese Kettenreaktion bildet schließlich das Enzym Thrombin, das durch limitierte Proteolyse Plasmafibrinogen in das unlösliche Gel Fibrin umwandelt. Die zwei Schlüsselereignisse in der Gerinnungskaskade sind die Umwandlung von Gerinnungsfaktor X in Xa durch den Gerinnungsfaktor IXa und die Umwandlung von Prothrombin in Thrombin durch den Gerinnungsfaktor Xa. Beide Reaktionen laufen an Zelloberflächen ab, die bedeutendste ist die Blutplättchenoberfläche, und beide Reaktionen benötigen Cofaktoren. Die wichtigsten Cofaktoren des Systems, die Faktoren V und VIII, zirkulieren als relativ inaktive Vorläufer, aber wenn die ersten wenigen Moleküle Thrombin gebildet sind, wirkt Thrombin zurück und aktiviert die Cofaktoren durch limitierte Proteolyse. Die aktivierten Cofaktoren Va und VIIIa beschleunigen sowohl die Umwandlung von Prothrombin in Thrombin als auch die Umwandlung von Faktor X in Faktor Xa um etwa fünf Größenordnungen. Aktiviertes Protein C wirkt vorzugsweise auf die Gerinnungscofaktoren Va und VIIIa, die aktivierten Formen der inaktiven Gerinnungscofaktoren V und VIII, um sie proteolytisch abzubauen, zu hydrolysieren und unwiederbringlich zu zerstören. Die Gerinnungsfaktoren V und VIII sind im Gegensatz dazu in vivo sehr schlechte Substrate für aktiviertes Protein C.
Ein wichtiger Cofaktor für aktiviertes Protein C ist Protein S, ein weiteres Vitamin K abhängiges Plasmaprotein. Das Protein S steigert die durch aktiviertes Protein C vermittelte Hydrolyse der Faktoren Va und VIIIa im wesentlichen 25fach.
Das Protein C ist als ein wertvolles therapeutisches Mittel anerkannt (siehe beispielsweise EP-A 0 215 548 und EP- A 0 191 606). Aktiviertes Protein C ist ein neues antithrombotisches Mittel mit einem breiteren therapeutischen Index, als erhältliche Antikoagulantien, wie Heparin und die oralen Antikoagulantien vom Hydroxycumarin-Typ. Weder Protein C Zymogen noch aktiviertes Protein C ist wirksam, bevor Thrombin gebildet wird, da Thrombin zur Umwandlung der Gerinnungsfaktoren V zu Va und VIII zu VIIIa benötigt wird, und die aktivierten Formen dieser zwei Cofaktoren sind das bevorzugte Substrat für aktiviertes Protein C. Thrombin wird ebenfalls zur Aktivierung von Protein C Zymogen benötigt, da ohne dem Thrombomodulin-Thrombin-Komplex das Protein C Zymogen nicht in dessen aktives Gegenstück umgewandelt wird.
Aktiviertes Protein C ist ein Antikoagulans auf Abruf, da aktiviertes Protein C durch Inaktivierung der Cofaktoren Va und VIIIa arbeitet. Da Thrombin benötigt wird, um die Faktoren V und VIII in ihre aktivierten Gegenstücke Va und VIIIa umzuwandeln, wirkt Protein C nur als Antikoagulans nachdem Thrombin gebildet wurde. Herkömmliche Antikoagulantien behalten im Gegensatz zu aktiviertem Protein C einen konstanten Antikoagulationszustand während der Zirkulation solange bei, wie sie dem Patienten gegeben werden, wobei das Risiko für Blutungskomplikationen stark gegenüber dem von Protein C oder aktiviertem Protein C erhöht ist. Aktiviertes Protein C ist daher ein Antikoagulans auf Abruf mit breiter klinischer Anwendbarkeit zur Verwendung als Alternative zu Heparin und den Hydroxycumarinen.
Bei manchen Krankheitszuständen, wie der erblichen Protein C Defizienz, besitzt das Protein C Zymogen eine große therapeutische Bedeutung. Bei congenitaler homozygoter Protein C Defizienz sterben betroffene Personen in der frühen Kindheit an Purpura fulminans, einer oft tödlichen Form der disseminierten intravaskulären Koagulation. Bei heterozygoter Protein C Defizienz leiden betroffene Personen an schweren wiederkehrenden thromboembolischen Vorfällen. Es ist klinisch allgemein anerkannt, daß Plasmaproteinkonzentrate, die für die Behandlung der Hämophilie B oder Faktor IX Defizienz entwickelt sind und die Protein C als Verunreinigung enthalten, in der Vorbeugung und der Behandlung von intravaskulärer Gerinnung bei heterozygoter Protein C Defizienz wirksam sind. Anormal niedrige Protein C Mengen sind ebenfalls bei thrombotischen Zuständen, wie disseminierter intravaskulärer Koagulation, und bei Krankheitszuständen mit Disposition zur Thrombose, wie schwererem Trauma größeren chirurgischen Eingriffen und Krebs, festgestellt worden.
Um die Aktivierung von Protein C und die Erfindung zu verstehen, wird im folgenden die kodierende Sequenz und die entsprechende Aminosäuresequenz für unreifes humanes Protein C gezeigt. Diese Aminosäuresequenz und bestimmte Teile hiervon werden zum Zweck der Erfindung auch als "natives humanes Protein C" bezeichnet.
worin A für Desoxyadenyl steht, G für Desoxyguanyl steht, C für Desoxycytidyl steht, T für Thymidyl steht, ALA für Alanin steht, ARG für Arginin steht, ASN für Asparagin steht, ASP für Asparaginsäure steht, -COOH für den Carboxyterminus steht, CYS für Cystein steht, GLN für Glutamin steht, GLU für Glutaminsäure steht, GLY für Glycin steht, H&sub2;N für den Aminoterminus steht, HIS für Histidin steht, ILE für Isoleucin steht, LEU für Leucin steht, LYS für Lysin steht, MET für Methionin steht, PHE für Phenylalanin steht, PRO für Prolin steht, SER für Serin steht, THR für Threonin steht, TRP für Tryptophan steht, TYR für Tyrosin steht und VAL für Valin steht.
Die oben angegebene DNA Sequenz wurde aus cDNA Klonen abgeleitet, die aus Protein C kodierender humaner Leber mRNA hergestellt wurden. Der Fachmann erkennt, daß die degenerierte Art des genetischen Codes die Konstruktion vieler verschiedener DNA Sequenzen ermöglicht, die für die gleiche Aminosäuresequenz kodieren. Die oben angegebene cDNA Sequenz für unreifes humanes Portein C ist daher nur eine von vielen möglichen unreifes humanes Protein C kodierenden Sequenzen. Bei der Herstellung der cDNA Klone werden eine 5'Poly-G-Sequenz, eine 3'-Poly-C-Sequenz und sowohl 5' als auch 3' PstI Restriktionsschnittstellen an den Enden der Protein C kodierenden cDNA konstruiert. Zwei dieser cDNA Klone werden zur Konstruktion eines DNA Moleküls verändert, das sowohl die kodierende Sequenz für unreifes humanes Protein C als auch Teile der für die untranslatierte mRNA an den 5' und 3' Enden der kodierenden Region kodierende DNA enthält. Dieses DNA Molekül wird zur Herstellung von Plasmid pHC7 in die PstI Schnittstelle von Plasmid pBR322 inseriert. Das Plasmid pHC7 enthält daher die obige kodierende Sequenz und, erneut nur einen Strang des Moleküls darstellend, diese zusätzlichen Sequenzen:
an den 5' und 3' Enden des kodierenden Strangs der für unreifes humanes Protein C kodierenden Sequenz. Aufgrund der komplementären Art der DNA Basenpaarung ist die Sequenz eines Stranges eines doppelsträngigen DNA Moleküls ausreichend, um die Sequenz des Gegenstranges festlegen zu können. Das Plasmid pHC7 kann herkömmlich aus E. coli K12 RR1/pHC7 isoliert werden, einem Stamm, der hinterlegt und so zum Teil der ständigen Kulturensammlung des Northern Regional Research Laboratory (NRRL), Peoria, Illinois, wurde. Eine Kultur von F coli K12 RR1/pHC7 kann vom NRRL unter der Hinterlegungsnummer NRRL B-15926 frei bezogen werden, Eine Restriktionsschnittstellen- und Funktionskarte von Plasmid pHC7 ist in Figur 2 der Zeichnungen dargestellt.
Unreifes Protein C kann auch schematisch, wie im folgenden gezeigt, daraestellt werden.
prä-pro - die Aminosäurereste 1-42 von unreifem humanem Protein C kodieren das Signalpeptid und das Propeptid von humanem Protein C, welche zur Sekretionssteuerung und gamma-Carboxylierung von Protein C wichtig sind.
LC - die Aminosäurereste 43-197 von unreifem Protein C, einmal posttranslational modifiziert, bilden die leichte Kette (LC) sowohl des zweikettigen Zymogens (gebildet aus dem einkettigen Zymogen durch Entfernen des KR Dipeptids, wie unten erläutert) als auch von aktivierten Protein C Formen.
KR - die Aminosäurereste 198-199 von unreifem humanem Protein C. Diese Reste dürften entfernt werden (aus Homologiegründen zu Protein C vom Rind), möglicherweise durch einen zweistufigen Prozeß, der eine erste Spaltung (entweder zwischen den Resten 197-198 oder 199-200) gefolgt durch einen Angriff einer Carboxypeptidase oder Aminopeptidase unter Bildung von zweikettigem Protein C umfaßt.
AP - die Aminosäurereste 200-211 von unreifem Protein C bilden das Aktivierungspeptid, das von den Zymogenformen entfernt wird, um aktiviertes Protein C zu erhalten.
AHC - die Aminosäurereste 212-461 von unreifem Protein C, einmal posttranslational modifiziert, bilden die aktivierte schwere Kette (AHC) von aktivem Protein C.
HC - die schwere Kette der zweikettigen Protein C Zymogenform, die, einmal posttranslational modifiziert, stellt die Aminosäurereste 200-461, das Ap und die AHC dar.
Humanes Protein C Zymogen ist ein Serinproteasevorläufer, der in der Leber synthetisiert wird und im Blut vorkommt. Zur Entfaltung der vollständigen biologischen Aktivität benötigt Protein C posttranslationale Modifikationen, die Vitamin K abhängig sind. Das reife, zweikettige, durch Disulfidbrücken verbundene Protein C Zymogen entsteht aus einem einkettigen Zymogen durch limitierte Proteolyse. Diese limitierte Proteolyse dürfte die Abspaltung und Entfernung der Aminosäurereste 198 und 199 beinhalten. Die Aktivierung des zweikettigen Zymogens in die aktive Serinprotease beinhaltet die proteolytische Spaltung einer ARG-LEU Peptidbindung (Reste 211 und 212). Diese letztere Spaltung entläßt ein Dodecapeptid (Reste 200-211), das Aktivierungspeptid, das den Aminoterminus der größeren (schwereren) Kette des zweikettigen Zymogenmoleküls bildet. Das Protein C ist signifikant glykosyliert. Das reife Enzym enthält 23 % Kohlenhydrate. Das Protein C enthält auch einige ungewöhnliche Aminosäuren, einschließlich gamma-Carboxyglutaminsäure und β-Hydroxyasparaginsäure (Erythro-L-β-hydroxyaspartat). Gamma-Carboxyglutaminsäure (Gla) wird durch gamma- Glutamylcarboxylierung aus Glutaminsäureresten mit Hilfe der mikrosomalen Carboxylase der Leber hergestellt, wozu Vitamin K als Cofaktor benötigt wird.
Die Aktivierung von humanem Protein C kann auch schematisch dargestellt werden und ist im folgenden gezeigt. Der Fachmann erkennt, daß die Reihenfolge der Schritte im Schema nicht notwendigerweise den Weg in vivo widerspiegelt. posttranslationale Modifikation, das heißt gamma-Carboxylierung von bestimmten Glutaminsäureresten, ß-Hydroxylierung eines Asparaginsäurerests und Glycosylierung Sekretion, Entfernung der Reste 1-42, was mehr als eine proteolytische Spaltung erfordern könnte Entfernung der Reste 198-199, etwa 90 % des im humanen Blut gefundenen Protein C Zymogens ist die zweikettige Form (S-S = Disulfidbrücke) Aktivierung durch Thrombin-Thrombomodulin unreifes Protein C einkettiges Zymogen zweikettiges Zymogen aktiviertes Protein C
Die vorliegende Erfindung liefert neue Verbindungen, Vektoren, Transformanden und Verfahren zur rekombinanten Expression von neuen Protein C Zymogenen.
Zum Zweck der hierin beschriebenen und beanspruchten Erfindung werden die folgenden Ausdrücke folgendermaßen definiert.
Ad2LP - der hauptsächliche späte Promotor des Adenovirus Typ 2
Aminosäurereste in hierin beschriebenen Proteinen oder Peptiden werden folgendermaßen abgekürzt: Drei-Buchstaben Abkürzung Aminosäurerest Ein-Buchstaben Abkürzung Phenylalanin Leucin Isoleucin Methionin Valin Serin Prolin Threonin Alanin Tyrosin Histidin Glutamin Asparagin Lysin Asparaginsäure Glutaminsäure Cystein Tryptophan Arginin Glycin
ApR - der ampicillinresistente Phänotyp oder das diesen verleihende Gen
BK - DNA des BK Virus
CAT - das Chloramphenicolacetyltransferasegen
Enh oder Enhancer - der Enhancer des BK Virus
ep oder SV40ep- ein DNA Segment, das den frühen SV40 Promotor des T-Antigen-Gens, die T-Antigenbindungsstellen, den SV40 Enhancer und den SV40 Replikationsursprung enthält
gamma-Carboxylierung - eine Reaktion, die eine Carboxylgruppe an das gamma-Kohlenstoffatom von Glutaminsäuren anhängt
gamma-carboxyliertes Protein - ein Protein, in dem einige Glutaminsäurereste einer gamma-Carboxylierung unterzogen wurden
IVS - eine ein Intron kodierende DNA, auch intervenierende Sequenz genannt
MMTpro - der Promotor des Metallothionin-I-Gens der Maus
unreifes Protein - nach Translation eines mRNA Transkripts gebildetes Polypeptid vor jeglichen posttranslationalen Modifikationen. Posttranslationale Modifikationen, wie gamma-Carboxylierung von Glutaminsäureresten und Hydroxylierung von Asparaginsäureresten können jedoch stattfinden, bevor ein Protein vollständig von einem mRNA Transkript translatiert ist.
NeoR - das Neomycinresistenz verleihende Gen, das auch zur Resistenzvermittlung gegenüber dem Antibiotikum G418 verwendet werden kann
pA - eine ein Polyadenylierungssignal kodierende DNA Sequenz
Promotor - eine DNA Sequenz, die die Transkription von DNA in RNA steuert
Protein C Aktivität - jede Eigenschaft von humanem Protein C, die für proteolytische, amidolytische, esterolytische und biologische (gerinnungshemmende oder profibrinolytische) Aktivitäten verantwortlich ist. Verfahren zur Austestung einer gerinnungshemmenden Aktivität eines Proteins sind in der Technik gut bekannt, das heißt siehe Grinnell et al., 1987, Biotechnology 5:1189.
Rekombinanter DNA Klonierungsvektor - jedes Agens, einschließlich aber nicht nur beschränkt auf chromosomal integrierende Agentien, autonom replizierende Plasmide und Phagen, das ein DNA Molekül umfaßt, in das ein oder mehrere zusätzliche DNA Segmente eingesetzt werden können oder wurden.
Rekombinanter DNA Expressionsvektor - jeder rekombinante DNA Klonierungsvektor, in den ein Promotor eingebaut und zur Expressionssteuerung eines Genprodukts positioniert wurde.
Rekombinanter DNA Vektor - jeder rekombinante DNA Klonierungs- oder Expressionsvektor.
Replikon - eine DNA Sequenz, die die autonome Replikation eines Plasmids oder eines anderen Vektors kontrolliert und erlaubt.
Restriktionsfragment - jede lineare DNA Sequenz, die durch die Wirkung einer oder mehrerer Restriktionsendonukleasen entstanden ist.
sensitive Wirtszelle - eine Wirtszelle, die nicht in Gegenwart eines verabreichten Antibiotikums oder einer anderen toxischen Verbindung ohne einem DNA Segment wachsen kann, das dagegen Resistenz verleiht
TcR - der tetracyclinresistente Phänotyp oder das diesen verleihende Gen
Transformation - die Einführung von DNA in eine Empfängerwirtszelle, die den Genotyp der Empfängerzelle ändert.
Transformand - eine Empfängerwirtszelle, die einer Transformation unterzogen wurde.
Translationsaktivierungssequenz - jede DNA Sequenz, einschließlich der, die eine Ribosomenbindungsstelle und ein Translationsstartcodon , wie 5'-ATG-3', kodiert, die für die Translation eines mRNA Transkripts in ein Peptid oder Polypeptid sorgt
Zymogen - ein enzymatisch inaktiver Vorläufer eines proteolytischen Enzyms. Das hierin verwendete Protein C Zymogen betrifft sekretierte, inaktive Formen, ob einkettig oder zweikettig, von Protein C.
Die Figur 1 besteht aus vier Teilen und zeigt schematisch das Konstruktionsprotokoll für Plasmid pLPC, ein zur Konstruktion des Ausgangsplasmids pLAPC verwendetes Ausgangsmaterial.
Der Teil A der Figur 1 schildert die Konstruktion von Plasmid pBKneo1 aus dem BK Virus und dem Plasmid pdBPV-MMTneo.
Der Teil E der Figur 1 schildert die Konstruktion von Plasmid pLPcat aus dem Adenovirus 2 und dem Plasmid pSV2cat.
Der Teil C der Figur 1 schildert die Konstruktion von Plasmid pBLcat aus dem Plasmid pBKneo1 und dem Plasmid pLPcat.
Der Teil D der Figur 1 schildert die Konstruktion von Plasmid pLPC aus dem Plasmid pBLcat und dem Plasmid pL133.
Die Figur 2 zeigt schematisch die Konstruktion von Plasmid pL133, einem zur Konstruktion von Plasmid pLPC verwendeten Ausgangsmaterial.
Die vorliegende Erfindung betrifft DNA Verbindungen, die für die Expression von neuen Zymogenformen von humanem Protein C kodieren. Einige Verfahren zur Herstellung von nativem humanem Protein C Zymogen und unreifem humanem Protein C wurden beschrieben (siehe EP-A 0 215 548 und EP-A 0 191 606). Diese dem Stand der Technik entsprechenden Verfahren sorgen für die Expression von Zymogenformen von humanem Protein C, die sich nicht von den Zymogenformen unterscheiden, die in humanem Blut vorkommen. Das durch diese Verfahren hergestellte Protein C Zymogen muß mit Substanzen behandelt werden, wie α-Thrombin, Trypsin oder einem Gemisch aus Thrombin und Thrombomodulin (ob in vivo oder in vitro), um aktiviertes Protein C zu erhalten. Zusätzlich wird eine durch rekombinante DNA Technologie hergestellte Zymogenform des humanen Protein C, die zu natürlicherweise im humanen Blut gefundenen Zymogenf ormen von humanem Protein C identisch ist, im Körper nur durch den natürlichen Aktivierungsweg aktiviert, der den Thrombin-Thrombomodulin-Komplex beinhaltet. Natives humanes Protein C Zymogen kann durch Thrombin alleine aktiviert werden, jedoch erfordert die Aktivierung die Abwesenheit von Ca²&spplus; und solch große Mengen an Thrombin und/oder Protein C Zymogen, daß dies kein wesentlicher in vivo Weg zu aktiviertem Protein C ist.
Die vorliegende Erfindung liefert Zymogenformen von humanem Protein C, die in vivo alleine durch Thrombin in einer klinisch bedeutsamen Geschwindigkeit aktiviert werden können. Zusätzlich sind diese Zymogenformen viel empfindlicher gegenüber der Aktivierung durch Thrombin/Thrombomodulin, als natives humanes Protein C Zymogen. Die vorliegende Erfindung liefert auch DNA Verbindungen, rekombinante DNA Expressionsvektoren, transformierte Zellinien und Verfahren zur rekombinanten Expression dieser neuen Zymogenformen von humanem Protein C. Das Verfahren zur Herstellung dieser Zymogenformen von humanem Proteine C ist gekennzeichnet durch (A) Transformation einer eukaryontischen Wirtszelle mit einem rekombinanten DNA Vektor, wobei der Vektor umfaßt
(i) eine DNA Sequenz, die eine Aminosäuresequenz kodiert, welche vom Aminoterminus zum Carboxyterminus umfaßt
a) ein Signalpeptid und ein Propeptid eines gamma-carboxylierten, sekretierten Proteins,
b) die leichte Kette von humanem Protein C,
c) ein aus der aus LYS-ARG, ARG-LYS, LYS-LYS oder ARG-ARG bestehenden Gruppe ausgewähltes Dipeptid, und
d) folgende Aminosäuresequenz
worin R&sub1; aus der aus PHE, GLY, TYR oder TRP bestehenden Gruppe ausgewählt ist, R&sub2; aus der aus VAL oder PRO bestehenden Gruppe ausgewählt ist, R&sub3; aus der aus ASP oder ASN bestehenden Gruppe ausgewählt ist, ARG für Arginin steht, ASN für Asparagin steht, ASP für Asparaginsäure steht, -COOH für den Carboxyterminus steht, CYS für Cystein steht, GLN für Glutamin steht, GLU für Glutaminsäure steht, GLY für Glycin steht, HIS für Histidin steht, ILE für Isoleucin steht, LEU für Leucin steht, LYS für Lysin steht, MET für Methionin steht, PHE für Phenylalanin steht, PRO für Prolin steht, SER tür Serin steht, THR für Threonin steht, TRP für Tryptophan steht, TYR tür Tyrosin steht und VAL für Valin steht, und
(ii) einen Promotor, der zur Expressionssteuerung der DNA Sequenz positioniert ist, und
(B) Kultivierung der in Schritt (A) transformierten Wirtszelle unter Bedingungen, die die Expression der DNA Sequenz erlauben. Dieses Verfahren und die im Verfahren brauchbaren Verbindungen werden später genauer beschrieben.
Die Erfindung liefert auch DNA Verbindungen zur Verwendung im Herstellungsverfahren dieser neuen Zymogenformen von humanem Protein C. Diese neuen Verbindungen kodieren alle ein Prä-Propeptid, das ein Signalpeptid zur Sekretionsteuerung und ein Propeptid von einem gamma-carboxylierten Protein (durch die Wirkung einer Vitamin K-abhängigen Carboxylase) umfaßt. Solche Propeptidsequenzen sind in der Technik gut bekannt. Siehe beispielsweise Suttie et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. 84: 634-637. Vorzugsweise und zur Konstruktionserleichterung stammen sowohl die Signalpeptid kodierende Sequenz als auch die Propeptid kodierende Sequenz von der Aminosäuresequenz eines Prä-Propeptids eines gamma-carboxylierten Proteins. Beispiele für solche gamma-carboxylierten Proteine sind unter anderem Faktor VII, Faktor IX, Faktor X, Prothrombin, Protein S, Protein Z und Protein C. Eine DNA Sequenz, die das Prä-Propeptid von humanem Proteine C kodiert, ist für die Verwendung in den erfindungsgemäßen Vektoren am meisten bevorzugt.
Die erfindungsgemäßen DNA Verbindungen umfassen ferner die kodierende Sequenz für die leichte Kette von humanem Protein C direkt stromabwärts anschließend positioniert und im Leserahmen mit der das Prä-Propeptid kodierenden Sequenz. Die leichte Kette von humanem Protein C enthält die Aminosäurereste 43 bis einschließlich 197 von unreifem Protein C, wie dies oben im Hintergrundabschnitt gezeigt ist. Die aminoterminalen Teile der Vitamin K abhängigen Plasmaproteine, wie der aminoterminale Teil der leichten Kette von Protein C, sind für die Calcium-bindende Aktivität dieser Proteine verantwortlich. Die Calcium-bindenden Domänen dieser Plasmaproteine, wie Faktor VII, Faktor IX, Faktor X, Prothrombin und Protein S sind untereinander austauschbar (siehe EP-A 0 215 548 auf den Seiten 12 und 13) und äquivalent zur Calciumbindenden Domäne der leichten Kette von humanem Protein C.
Die erfindungsgemäßen DNA Verbindungen umfassen ferner die kodierende Sequenz für das Dipeptid LYS-ARG (KR), das stromabwärts unmittelbar anschließend und im translationalen Leserahmen mit der kodierenden Sequenz der leichten Kette positioniert ist. Ein dibasisches Dipeptid, wie LSY-ARG liegt im unreifen Protein am carboxyterminalen Ende der leichten Kette. Die Orientierung des LYS- ARG Dipeptids im exprimierten Protein ist für die erfindungsgemäßen Zwecke nicht relevant. Dibasische Dipeptide, wie LYS-LYS oder ARG-ARG sind zum LYS-ARG Dipeptid für die Zwecke der vorliegenden Erfindung äquivalent. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung ist jedoch das Dipeptid LYS-ARG, das das Dipeptid des nativen humanen Protein C ist, bevorzugt.
Unmittelbar stromabwärts der Codons für das LYS-ARG Dipeptid liegt die kodierende Sequenz des Aktivierungspeptids. In den erfindungsgemäßen Verbindungen sind Änderungen in der kodierenden Sequenz des Aktivierungspeptids (und der entsprechenden Aminosäuresequenz) primär für die Eigenschaft der erhöhten Thrombinempfindlichkeit dieser neuen Zymogene verantwortlich.
Der Fachmann erkennt, daß die erfindungsgemäßen Zymogentormen sich primär von den nativen Zymogenformen von humanem Protein C, wie im folgenden beschrieben, unterscheiden. Im nativen humanen Protein C ist das Aktivierungspeptid
worin die Nummern sich auf die Position der Aminosäurereste im unreifen humanen Protein C beziehen. Die vorliegende Erfindung zeigt, daß die Änderung des ASP Rests an der Position 209 entweder in einen PHE, GLY, THR oder TRP Rest zu einer größeren Empfindlichkeit der entsprechenden Zymogenform gegenüber einer Spaltung alleine durch Thrombin zusätzlich zu einer größeren Empfindlichkeit gegenüber einer Spaltung durch den Thrombin-Thrombomodulin-Komplex führt.
Andere Aminosäuresubstitutionen können in Zusammenhang mit den Substitutionen an der Position 209 auch die Thrombinempfindlichkeit des entstehenden Zymogens erhöhen. Der Ausdruck "entstehendes Zymogen"wird verwendet, um anzudeuten, daß obwohl die Substitutionen in Bezug auf die Aminosäurepositionen in unreifem humanem Protein C beschrieben sind, das unreife humane Protein C erst sekretiert werden muß (was zur Entfernung der Aminosäurereste 1 bis 42 führt), um eine Zymogenform zu erhalten. Die Substitution des Prolinrestes (im Aktivierungspeptid) an der Position 210 im unreifen humanen Protein C zusätzlich zu einer der oben beschriebenen Substitutionen an der Position 209 gegen einen Valinrest führt daher zu einem neuen Zymogen der vorliegenden Erfindung. Die Substitution des Asparaginsäurerests (in der aktivierten schweren Kette) an Position 214 im unreifen humanen Protein C zusätzlich zu einer der oben beschriebenen vier Substitutionen an der Position 209 und zusätzlich oder nicht zu der oben beschriebenen Substitution an der Position 210 gegen einen Asparaginrest führt ebenfalls zu einem neuen erfindungsgemäßen Zymogen.
Daher entstehen die bevorzugten neuen Zymogenformen von erfindungsgemäßem humanem Protein C durch die Sekretion und Prozessierung von unreifen humanen Protein C Molekülen mit der im folgenden gezeigten Aminosäuresequenz
worin R&sub1; für PHE, GLY, TYR oder TRP steht, R&sub2; für PRO oder VAL steht und R&sub3; für ASP oder ASN steht.
Der Fachmann erkennt, daß aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes eine Vielzahl von DNA Verbindungen das oben dargestellte Polypeptid kodieren können. Daher sind die später und in den begleitenden Beispielen beschriebenen Konstruktionen der bevorzugten erfindungsgemäßen DNA Verbindungen, Vektoren und Transformanden mehr illustrativ und beschränken den Schutzumfang der Erfindung nicht.
Die neuen erfindungsgemäßen kodierenden Sequenzen können einfach ausgehend von einer kodierenden Sequenz für unreifes humanes Protein C konstruiert werden, dessen AP-kodierende Region durch ortsspezifische Mutagenese deletiert wurde. Schematisch gezeigt hat diese kodierende Sequenz die folgende Struktur
Wie in den begleitenden Beispielen beschrieben, wurde diese kodierende Sequenz in einen rekombinanten DNA Expressionsvektor inseriert und der entstehende Vektor wurde als Plasmid pLAPC bezeichnet. Das Plasmid pLAPC dient als brauchbares Ausgangsmaterial für die Konstruktion von beispielsgemäßen Vektoren der Erfindung, die eine rekombinante Expression der neuen erfindungsgemäßen Zymogenformen von humanem Protein C in hohem Maße steuern. Das Konstruktionsprotokoll für das Plasmid pLAPC vom Ausgangsplasmid pHC7 ist in Beispiel 1 beschrieben. Das Pasmid pHC7 ist vom Northern Regional Research Center (NRRL), Peoria, IL 61604 in E coli K12 RR1/pHC7 unter der Hinterlegungsnummer NRRL B-15926 erhältlich.
Das Plasmid pLPC-167G ist ein beispielsgemäßer Expressionsvektor der Erfindung, worin das Codon für Asparaginsäure an der Position 209 in unreifem humanem Protein C gegen ein Glycincodon ausgetauscht wurde. Das Konstruktionsprotokoll für das Plasmid pLPC-167-G ist im Detail im Beispiel 3 beschrieben. Im wesentlichen beinhaltet die Konstruktion die ortsspezifische Mutagenese der für Protein C kodierenden Sequenz. Ein Teil der für Protein C kodierenden Sequenz, der die Aktivierungspeptid-kodierende DNA umfaßt, wurde aus Plasmid pHC7 isoliert, in den Phagen M13mp18 inseriert und dann durch ortsspezifische Mutagenese verändert. Die mutagenisierte kodierende Sequenz wurde dann in einen eukaryontischen Klonierungsvektor unter Bildung eines als pLPC-167G bezeichneten Plasmids kloniert, das zu Plasmid pLAPC identisch ist, außer der Insertion einer für das Aktivierungspeptid kodierenden Sequenz, worin das Codon für Glycin anstelle des Codons für Asparaginsäure an der Postion 209 eingeführt wurde.
Das Plasmid pLPC-167F ist ein beispielsgemäßer Expressionsvektor der Erfindung, worin das Codon für Asparaginsäure an der Position 209 in unreifem humanem Protein C in ein Codon für Phenylalanin umgewandelt wurde. Das Konstruktionsprotokoll für das Plasmid pLPC-167F ist im Detail in Beispiel 4 beschrieben. Bis auf das bei der Konstruktion verwendete unterschiedliche mutagenisierende Oligonukleotid war das Konstruktionsprotokoll für das Plasmid pLPC-167F im wesentlichen dasselbe, wie das Konstruktionsprotokoll für das Plasmid pLPC-167G.
Die in den begleitenden Beispielen beschriebenen Verfahren für die ortsspezifische Mutagenese sind erläuternd und können zur Erzeugung von anderen erfindungsgemäßen Verbindungen und Vektoren verwendet werden. Wie oben dargestellt, beinhalten diese anderen erfindungsgemäßen Verbindungen die unreifen Proteine, die durch die Translation von mRNA Transkripten gebildet werden, welche von den erfindungsgemäßen kodierenden DNA Sequenzen erzeugt wurden. Die erfindungsgemäßen Verbindungen beinhalten auch die Zymogenformen, die nach der Sekretion der erfindungsgemäßen unreifen Proteine erzeuge werden. Zusätzlich ist im Fall der erfindungsgemäßen Verbindungen, bei denen der Asparaginsäurerest an der Position 214 in einen Asparaginrest umgewandelt wurde, das nach Aktivierung der Zymogenform gebildete aktivierte Protein C Derivat ebenfalls eine erfindungsgemäße Verbindung. Daher beinhalten die erfindungsgemäßen Verbindungen kodierende DNA Sequenzen, Expressionsvektoren, die die Expresion dieser Sequenzen steuern, unreife Proteine, die nach Translation von mRNA Transkripten von diesen kodierenden Sequenzen gebildet werden, Zymogene, die nach Sekretion dieser unreifen Proteine gebildet werden und die aktivierten Derivate von bestimmten Zymogenen.
In den bevorzugten erfindungsgemäßen kodierenden Sequenzen (und daher in den bevorzugten unreifen Proteinen, Zymogenen und aktivierten Molekülen) kodiert die kodierende Sequenz eine Aminosäuresequenz, die zu der von unreifem humanem Protein C mit Ausnahme der Substitutionen an den Positionen 209, 210 und 214 identisch ist. Diese Substitutionen sind in der folgenden Tabelle I gezeigt. Tabelle I Aminosäurereste, die an den Positionen 209, 210 und 214 der bevorzugten kodierenden Sequenzen der Erfindung kodiert sind Verbindung
Die erfindungsgemäßen DNA Verbindungen können auch chemisch oder durch Kombination von Restriktionsfragmenten oder durch eine Kombination von bekannten Techniken synthetisiert werden. DNA Synthesegeräte sind ebenfalls erhältlich und können zur Konstruktion der erfindungsgemäßen Verbindungen verwendet werden.
Die beispielsgemäßen Vektoren der Erfindung, die Plasmide pLPC-167G und pLPC-167F, enthalten den BK Enhancer positioniert, um die Transkription der erfindungsgemäßen kodierenden Sequenz vom späten Adenoviruspromotor aus zu stimulieren. Der Fachmann erkennt, daß eine große Anzahl an eukaryontischen Promotoren, Enhancern und Expressionsvektoren in der Technik bekannt sind und im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden können. Der Fachmann erkennt ebenfalls, daß ein eukaryontischer Expressionsvektor auch ohne ein Enhancerelement funktionieren kann. Der Schlüsselaspekt der vorliegenden Erfindung beruht nicht auf dem bestimmten Enhancer, falls einer verwendet wird, oder dem Promotor, der zur Expressionssteuerung des Protein C Zymogens verwendet wird, sondern beruht auf der neuen kodierenden Sequenz und den entsprechenden Proteinen, die aus dieser Sequenz gebildet werden.
Die Auswahl der Vektorelemente, wie Promotoren, Enhancer und Selektionsmarker, können jedoch großen Einfluß auf die schließlichen Proteinmengen haben, die von einer eukaryontischen Wirtszelle gebildet werden. Die EP-A 0 245 949 beschreibt mehrere Expressionsvektoren für natives Protein C Zymogen, die den BK Enhancer zur Stimulation eines eukaryontischen Promotors verwenden, der zur Expressionssteuerung von unreifem humanem Protein C positioniert ist. Diese Vektoren steuern besonders hohe Expressionsmengen, wenn sie in eukaryontische Zellen transformiert werden, die auch ein unmittelbar frühes Genprodukt eines großen DNA Virus exprimieren, wie das E1A Genprodukt des Adenovirus. Wie es aus den hierin beschriebenen beispielsgemäßen Vektoren pLPC- 167G und pLPC-167F ersichtlich ist, ist das BK Enhancer-E1A Genproduktexpressionsverfahren zur Verwendung in den erfindungsgemäßen Vektoren besonders bevorzugt.
Die vorliegende Erfindung ist nicht auf die Verwendung in einer bestimmten eukaryontischen Wirtszelle beschränkt. Eine Vielzahl an eukaryontischen Wirtszellen ist von Sammlungen, wie der American Type Culture Collection (ATCC) Rockville, MD 20852, erhältlich und zur Verwendung mit den erfindungsgemäßen Vektoren geeignet. Die Auswahl einer bestimmten Wirtszelle hängt in gewissem Maße von dem speziellen Expressionsvektor ab, der zur Expressionssteuerung der erfindungsgemäßen kodierenden DNA Verbindungen verwendet wird. Da das unreife humane Protein C und unreife humane Protein C Derivate der Erfindung einer wesentlichen posttranslationalen Modifikation unterzogen werden, sind manche Wirtszellen jedoch stärker zur Verwendung mit den erfindungsgemäßen Vektoren bevorzugt. Grinell et al., 1987, Bio/Technology 5:1189 beschreibt, daß Adenovirus-transformierte, humane embryonale Nierenzellen besonders zur Verwendung bei der rekombinanten Herstellung von gamma-carboxylierten Proteinen , wie humanem Protein C, bevorzugt sind. Eine solche Adenovirus-transformierte, humane embryonale Nierenzellinie ist die 293-Zellinie, die unter der Hinterlegungsnummer ATCC CRL 1573 von der ATCC erhalten werden kann. Die 293- Zellinie ist auch zur Verwendung mit den erfindungsgemäßen Vektoren bevorzugt.
Die Vorteile bei der Herstellung eines gamma-carboxylierten Proteins, wie humanem Protein C Zymogen in einer Adenovirustransformierten Zellinie, sind jedoch nicht auf die Adenovirustransformierten humanen embryonalen Nierenzellen beschränkt Tatsächlich sind Adenovirus-transformierte Zellen im allgemeinen außergewöhnliche Wirte zur Herstellung von gamma-carboxyliertem humanem Protein C. Eine besonders bevorzugte Zellinie dieses Typs ist die AV12-664 (hierin später "AV12") Zellinie, die von der ATCC unter der Hinterlegungsnummer CRL 9595 erhalten werden kann. Die AV12 Zellinie wurde durch Injektion von humanem Adenovirus 12 in das Genick eines syrischen Hamsters und Isolierung von Zellen aus dem entstehenden Tumor hergestellt. Das Beispiel 5 beschreibt später die Transformation sowohl der 293- als auch der AV12 Zellinie mit den beispielsgemäßen Vektoren pLPC-167G und pLPC-167F.
Die erfindungsgemäßen Vektoren können in eine Vielzahl an eukaryontischen, speziell Säugetierwirtszellen transformiert und dort exprimiert werden. Die erfindungsgemäßen Vektoren, die keinen selektionierbaren Marker besitzen, mit dem stabile eukaryontische Transformanden zu isolieren und zu identifizieren sind, sind nicht nur für Versuchsassays, sondern auch zum Zweck der Cotransformation brauchbar, ein Verfahren, das in der US-A 4 399 216 beschrieben wurde. Die erfindungsgemäßen Vektoren können auch Sequenzen enthalten, die die Replikation in E. coli erlauben, da es im allgemeinen effizienter ist, Plasmid DNA aus E. coli zu präparieren, als aus anderen Wirtsorganismen.
Die Expression der in den erfindungsgemäßen Vektoren enthaltenen kodierenden Sequenzen für humanes Protein C tritt in solchen Wirtszellen auf, in denen der bestimmte Promotor zusammen mit dem Strukturgen funktionsfähig ist. Beispielhafte zur erfindungsgemäßen Verwendung geeignete Wirtszellen sind in Tabelle II zusammen mit passenden Bemerkungen aufgeführt. Tabelle II Wirtszelle Herkunft Bezugsquelle Anmerkungen HS-Sultan Humanes Leber-Hepatoblastom Niere von der Meerkatze Rhesusaffenniere Mäuseembryo-Fibroblasten Eierstock vom chinesischen Hamster Humanes Cervixepitheloid Humanes Myelom Hepatom der Ratte Maus-Fibroblasten Humanes Plasmazell-Plasmocytom Niere vom neugeborenen Hamster U.S. Patent Nr. 4393133 beschreibt die Benutzung dieser Zellinie Wächst schneller als ATCC CCL Nr. 7 Prolin-abhängig.Abkömmlinge von CHO-K1, wie z.B. der dhfr-Abkömmling DXB11, können aus dieser Ausgangszellinie gewonnen werden. sekretiert eine leichte IgG Kette vom Lambda-Typ Abkömmlinge, wie z.B. 8-Azaguanin-resistente FAZA Wirtszellen können von dieser Ausgangszellinie gewonnen werden * American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852-1776
Wie in Tabelle II gezeigt, besitzen viele Säugetierwirtszellen die notwendige Zellmaschinerie zur Erkennung und richtigen Prozessierung des Signalpeptids in den erfindungsgemäßen unreifen Proteinen und liefern die posttranslationalen Modifikationen, wie Glycosylierung, gamma-Carboxylierung und β-Hydroxylierung, wie sie bei im Blut vorkommendem humanem Protein C beoachtet werden. Eine große Vielzahl an später diskutierten Vektoren existiert für die Transformation solcher eukaryontischer Wirtszellen, aber die später beispielhaft dargestellten bestimmten Vektoren sollen den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung nicht beschränken.
Die Vektoren vom pSV2 Typ enthalten Segmente des SV40 Genoms, die eine definierte eukaryontische Transkriptionseinheit bilden: Einen Promotor (ep), eine intervenierende Sequenz (IVS) und eine Polyadenylierungsstelle (pA). In Abwesenheit des SV40 T- Antigens transformieren Plasmidvektoren vom pSV2 Typ Säugetier- und andere eukaryontische Wirtszellen durch Integration in die chromosomale DNA der Wirtszelle. Es wurde eine Vielzahl an Plasmidvektoren vom pSV2 Typ konstruiert (siehe Eukaryotic Viral Vektors, herausgegeben von Gluzman, publiziert durch die Cold Spring Harbour Laboratories, Cold Spring Harbour, New York, 1982), wie die Plasmide pSV2-gpt, pSV2-neo, pSV2-dhfr, pSV2-hyg und pSV2-β- Globin, worin der SV40 Promotor die Transkription eines inserierten Gens steuert. Diese Vektoren sind zur Verwendung mit den erfindungsgemäßen kodierenden Sequenzen geeignet und sind entweder von der American Type Culture Collection (ATCC) in Rockville, Maryland oder von dem Northern Regional Research Laboratory (NRRL) in Peoria, Illinois, erhältlich.
Das Plasmid pSV2-dhfr (ATCC 37146) enthält ein Dihydrofolatreduktasegen (dhfr) der Maus unter der Kontrolle des frühen SV40 Promotors. Unter geeigneten Bedingungen ist vom dhfr Gen bekannt, daß es im Wirtschromosom vervielfältigt oder kopiert wird. Diese Vervielfältigung, in einem zusammenfassenden Artikel von Schimke, 1984, Cell 37:705-713 beschrieben, kann direkt an das dhfr Gen anschließende DNA Sequenzen, wie eine erfindungsgemäße, für unreifes humanes Protein C kodierende Sequenz, miteinbeziehen und kann daher zur Produktionssteigerung der erfindungsgemäßen Protein C Zymogene verwendet werden.
Die zur Expression von unreifem Protein C und Protein C Zymogenen der Erfindung in Säugetier- und anderen eukaryontischen Wirtszellen konstruierten Plasmide können eine große Vielzahl an Promotoren verwenden. Die vorliegende Erfindung ist in keinster Weise durch die Verwendung bestimmter, hierin beispielhaft dargestellter erfindungsgemäßer Promotoren beschränkt. Promotoren, wie der späte SV40 Promotor oder die von Bucher et al., 1986, Nuc. Acids Res. 14(24):1009 beschriebenen eukaryontischen Promotoren, oder Promotoren von eukaryontischen Genen, wie beispielsweise das östrogeninduzierbare Hühnerovalbumingen, die Interferongene, das glucocorticoidinduzierbare Tyrosinaminotransferasegen, das Thymidinkinasegen und die hauptsächlichen frühen und späten Adenovirusgene, können leicht isoliert und zur Verwendung in rekombinanten DNA Expressionsvektoren modifiziert werden, die zur Herstellung von humanem Protein C Zymogen in eukaryontischen Wirtszellen entwickelt wurden. Eukaryontische Promotoren können auch in Serie geschaltet zur Expressionssteuerung einer erfindungsgemäßen kodierenden Sequenz verwendet werden. Des weiteren sind sehr viele Retroviren bekannt, die eine große Bandbreite an eukaryontischen Wirtszellen infizieren. Die langen terminalen Sequenzwiederholungen in der Retrovirus DNA kodieren oft eine Promotoraktivität und können daher zur Expressionssteuerung der erfindungsgemäßen kodierenden Sequenzen verwendet werden.
Das Plasmid pRSVcat (ATCC 37152) enthält Teile der langen terminalen Sequenzwiederholungen des Rous Sarcoma Virus (RSV), einem Virus, von dem bekannt ist, daß es Hühnerzellen und andere Wirtszellen infizieren kann. Die langen terminalen Sequenzwiederholungen des RSV können auf einem 0,76 kb NdeI- HindIII Restriktionsfragment von Plasmid pRSVcat isoliert werden. Der Promotor in den langen terminalen Sequenzwiederholungen von RSV (Gorman et al., 1982, P.N.A.S. 79:6777) ist zur Verwendung in den erfindungsgemäßen Vektoren geeignet. Das Plasmid pMSVi (NRRL B-15929) enthält die langen terminalen Sequenzwiederholungen des Maus Sarcoma Virus (MSV), einem Virus, von dem bekannt ist, daß es Mäusezellen und andere Wirtszellen infizieren kann. Diese Wiederholungssequenzen sind zur Verwendung als Promotor in den erfindungsgemäßen Vektoren geeignet. Der Metallothioninpromotor der Maus (MMT) ist auch zur Verwendung in eukaryontischen Wirtszellen gut beschrieben worden und ist zur Verwendung in den erfindungsgemäßen Vektoren geeignet. Der MMT Promotor kommt auf dem 15 kb Plasmid pdBPV-MMTneo (ATCC 37224) vor, das als Ausgangsmaterial zur Konstruktion anderer erfindungsgemäßer Plasmide dienen kann.
Viele Modifikationen und Variationen der vorliegenden beispielsgemäßen DNA Sequenzen und Plasmide sind möglich. Beispielsweise erlaubt die Degeneriertheit des genetischen Codes den Austausch von Nukleotiden innerhalb der Polypeptid-kodierenden Regionen, wie auch im Translationsstopsignal, ohne Veränderung der Polypeptid-kodierenden Sequenz. Solche austauschbaren Sequenzen können aus der bekannten Aminosäure- oder DNA Sequenz von humanem Protein C abgeleitet werden und können durch folgende herkömmliche synthetische Verfahren oder ortsspezifische Mutageneseverfahren hergestellt werden. Synthetische Verfahren können im wesentlichen gemäß den Verfahren von Itakura et al., 1977 Science 198:1056 und Crea et al., 1978, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 75:5765 ausgeführt werden. Daher ist die vorliegende Erfindung in keinster Weise auf die bestimmten beispielhaft dargestellten DNA Sequenzen und Plasmide beschränkt.
Nach der Transformation eines erfindungsgemäßen Vektors in eine eukaryontische Wirtszelle kann man Transformanden auf der Grundlage eines selektionierbaren Phänotyps selektionieren. Dieser selektionierbare Phänotyp kann entweder durch einen auf dem Expressionsvektor oder auf einem anderen, mit dem Expressionsvektor cotransformierten Vektor vorhandenen Selektionsmarker der Wirtszelle verliehen werden. Wenn einmal Transformanden selektiert sind, ist es wünschenswert, die Transformanden zu identifizieren, die die größten Mengen an gewünschten, vom Expressionsvektor kodierten, Protein exprimieren. Eine solche Identifizierung ist besonders nach einem Cotransformationsverfahren wichtig, das eine Anzahl Transformanden erzeugt, die nur das den Selektionsmarker enthaltende Plasmid und somit nicht den Expressionsvektor enthalten. Im späteren Beispiel 6 ist nicht nur ein Protokoll zur Identifizierung von Zellen, die ein gewünschtes Protein exprimieren und sekretieren, sondern auch zur Quantifiztierung der sekretierten Proteinmenge relativ zu den anderen mittels des Verfahrens untersuchten Zellen beschrieben. Das Protokoll erlaubt auch die Isolierung von lebensfähigen Zellen, die die höchsten Mengen eines gewünschten Proteins sekretieren.
Aktiviertes Protein C hat wesentliche antithrombotische Eigenschaften bei der Verhinderung der Ausweitung von intravenösen Thromben, der Verhinderung der Bildung von arteriellen Thromben und bei der Verhinderung von Tod und Organversagen durch gramnegative Sepsis, Endotoxinämie und disseminierter intravaskulärer Koagulation. Bei Tierexperimenten war die infusion von nativem Protein C Zymogen ohne Wirkung bei der Behandlung einer gramnegativen Sepsis mit Schock und disseminierter intravaskulärer Koagulation (DIC). Diese negativen Ergebnisse zeigten, daß bei dieser Form von weitverbreiteter mikrovaskulärer Thrombose mit massiver Thrombinbildung zu wenig Thrombomodulin vorhanden war, um mit Thrombin Komplexe zu bilden und das infundierte Zymogen zu aktivieren.
Der Hauptnachteil von aktiviertem Protein C ist, wie bei vielen aktivierten Serinproteasen, dessen kurze Halbwertszeit (T1/2), verglichen mit dem Zymogenvorläufer. Die T1/2 bei Hunden wurde mit 11 Minuten festgestellt und die T1/2 bei Affen mit 22 bis 26 Minuten. Zum Vergleich wird die T1/2 von nativem Protein C Zymogen beim Menschen auf 6 Stunden geschätzt. Der Grund für die kürzeren biologischen Halbwertszeiten von aktivierten Serinproteasen, einschließlich aktiviertem Protein C, verglichen mit ihren Zymogenen, ist komplex und umfaßt sowohl zelluläre als auch humorale Mechanismen. Aktivierte Serinproteasen bilden auch Komplexe mit Serinproteaseinhibitoren, die normalerweise im Plasma vorkommen. Aktiviertes Protein C (APC) bildet mit einem neu beschriebenen APC Inhibitor, wie auch mit Alpha-2-Macroglobulin Komplexe. Die inaktiven Zymogene, einschließlich der erfindungsgemäßen Protein C Zymogene, reagieren nicht mit Serinproteaseinhibitoren.
Der Vorteil der erfindungsgemäßen Protein C Zymogene ist, daß sie besser als natives Protein C Zymogen durch Thrombin aktiviert werden, da Thrombin nicht mehr unbedingt die Komplexbildung mit Thrombomodulin benötigt, um diese Zymogene in Gegenwart von Ca²&spplus; zu aktivieren. Daraus folgt daß diese Protein C Zymogene bei Verabreichung an Stellen intravaskulärer Thrombinbildung aktiviert werden können, das heißt an jeder Stelle, wo sich ein intravaskulärer Thrombus entwickelt. Daher können diese rekombinanten Protein C Zymogene als Arzneimittelvorstufen verwendet werden und werden nur an den Stellen der Thrombinbildung aktiviert. Da diese Thrombin-empfindlichen Zymogene in der Zymogenform verabreicht werden können, bilden sie keine Komplexe mit Protein C Inhibitoren und zeigen eine biologische Halbwertszeit, die der von nativem Protein C Zymogen entspricht.
Die erfindungsgemäßen rekombinanten Protein C Zymogene sind zur Prävention und Behandlung einer großen Vielzahl an erworbenen Krankheitszuständen brauchbar, welche umfassen intravaskuläre Koagulation, einschließlich Thrombose der tiefen Venen, Lungenembolie, periphere arterielle Thrombose, Embolien, die vom Herzen oder peripheren Arterien ausgehen, akuten Myokardinfarkt, Schlaganfälle und disseminierte intravaskuläre Koagulation. Diese Protein C Derivate können auch zur Behandlung einer wesentlichen Anzahl an Patienten mit heterozygoten Protein C Defizienzen, die eine wiederkehrende Thrombose der tiefen Venen zeigen, und im Fall von homozygot Protein C defizienten Patienten mit Purpura fulminans wirksam verwendet werden.
Experimentelle und klinische Daten legen nahe, daß herkömmliche Antikoagulatien, insbesondere Warfarin, bei der Behandlung von invasiven Krebsarten brauchbar sind und unter Verhindung oder Reduzierung der entfernten metastatischen Schäden dieser Malignitäten wirken. Zusätzlich wurde erkannt, daß Entzündungsreize, wie Endotoxine, Tumornekrosefaktor und Interleukin 1 Thrombomodulin auf der Oberfläche von Endothelzellen erschöpfen, was eine mikrovaskuläre und makrovaskuläre Thrombose auslösen dürfte. Die erfindungsgemäßen rekombinanten Protein C Zymogene stellen eine attraktive Alternative zu herkömmlichen Antikoagulantien in diesen klinischen Studien dar.
Die Dosen an erfindungsgemäßen Protein C Zymogenen können, verglichen mit aktiviertem Protein C, aufgrund ihrer verlängerten T1/2 bei klinischen Fällen wesentlich reduziert werden. Bei homozygoter Protein C Defizienz reicht die Dosis eines erfindungsgemäßen Protein C Zymogens von etwa 5 mg bis 100 mg pro Behandlung und bei heterozygoter Protein C Defizienz von etwa 2,5 mg bis 50 mg pro Behandlung.
Eine attraktive therapeutische Indikation für aktiviertes Protein C ist die Verhinderung der Thrombose tiefer Venen und der Lungenembolie, die derzeit mit niedrigen Heparindosen behandelt werden. Bei Hochrisikopatienten, insbesondere Patienten, die einer Operation unterzogen werden, liegt die Dosis an rekombinantem aktiviertem Protein C zur Prävention der Thrombose tiefer Venen im Bereich von 1-10 mg/Tag. Die Dosis eines erfindungsgemäßen Protein C Zymogens liegt im Bereich von etwa 0,25 bis 5 mg pro Tag. Der zusätzliche Vorteil dieser Zymogene ist, daß sie statt als konstante i.v. Infusionen als Bolusinjektionen verabreicht werden können. Aktiviertes Protein C muß aufgrund der kurzen T1/2 dieses Proteins durch kontinuierliche i.v. Infusion verabreicht werden. Bei festgestellter, objektiv dokumentierter Thrombose tiefer Venen und/oder Lungenembolie, reicht die Dosis an aktiviertem Protein C von 1 - 10 mg als Anfangsdosis, gefolgt von einer kontinuierlichen Infusion in Mengen, die von 3-30 mg Tag reichen. Die erfindungsgemäßen Protein C Zymogene können andererseits durch wiederholte Bolusinjektion in Dosen verabreicht werden, die nicht über 12 mg pro 24 Stunden liegen.
Ähnliche Dosierungspläne sind bei der Behandlung von peripheren arteriellen Thromben anwendbar. Es besteht eine geringere Wahrscheinlichkeit für Blutungskomplikationen durch Infusionen der erfindungsgemäßen Protein C Zymogene. Daher können diese Zymogene Heparin während und nach chirurgischen Eingriffen in Verbindung mit Thrombektomien oder Embolektomien, chirurgischen Verfahren ersetzen, die oft nötig sind, um ischämische Gliedmaßen vor Amputation im Falle eines durch Gerinnung bedingten akuten arteriellen Verschlusses zu bewahren. Aufgrund ihrer langen T1/2 verglichen mit aktiviertem Protein C und ihrer relativ einfachen Verabreichung sind diese Zymogene besser als aktiviertes Protein C zur Behandlung von arteriellen Embolien geeignet, die vom Herzen ausgehen. Die Langzeitverabreichung dieser Zymogene in Dosen, die mit denen zur Behandlung von aufgetretener Thrombose tiefer Venen- Lungenembolie vergleichbar sind, ist bei der Prävention von cardiogenen Embolien sehr nützlich.
Ähnlich können die erfindungsgemäßen Protein C Zymogene zur Behandlung von Embolien verwendet werden, die von Thromben in den peripheren Arterien, ganz besonders den Halsschlagadern, ausgehen, die derzeit unbefriedigend mit den derzeit benutzten Therapien behandelt oder verhindert werden, welche Medikamente, die zur Unterdrückung der Blutplättchenfunktion fähig sind, orale Blutgerinnungshemmstoffe oder Kombinationen davon enthalten. Wie im Fall von kardiogenen Embolien können diese Zymogene in gleicher Weise langzeitverabreicht werden, wie für die cardiogenen Embolien beschrieben, und weisen ein großes Potential zur Prävention von Embolien auf, die von Thromben der Halsschlagader ausgehen und zu embolischen Schlaganfällen führen.
Die erfindungsgemäßen Protein C Zymogene sind ebenfalls für die Behandlung von thrombotischen Schlaganfällen geeignet. Heutzutage werden Schlaganfälle normalerweise nicht mit herkömmlichen Blutgerinnungshemmstoffen behandelt. Die Behandlung von Schlaganfällen entweder mit Heparin oder oralen Blutgerinnungshemmstoffen, wenn auch manchmal nützlich, trägt ein hohes Risiko für Blutungen in den durch den Infarkt betroffenen Gehirnbereich und verschlimmert dabei das mit dem Schlaganfall einhergehende neurologische Defizit. Wegen ihres geringen Blutungskomplikationen verursachenden Potentials und ihrer Selektivität können die erfindungsgemäßen Zymogene Schlaganfallopfern verabreicht werden, und bei der Prävention der lokalen Ausbreitung des arterienverschließenden Thrombus nützlich sein, wobei das vom Schlaganfall herrührende neurologische Defizit reduziert wird. Die zur Behandlung des Schlaganfalls wirksame Zymogenmenge ist verglichen mit aktiviertem Protein C niedriger, die Dosis wird jedoch bei jedem Patienten, abhängig von der Art und Schwere des Schlaganfalls, variieren.
Die erfindungsgemäßen Zymogene sind zur Behandlung des akuten Myokardinfarkts aufgrund ihrer profibrinolytischen Eigenschaften, wenn sie einmal aktiviert sind, brauchbar. Diese Zymogene können mit gewebsspezifischem Plasminogenaktivator während der akuten Phase des Myokardinfarkts verabreicht werden. Nachdem der Herzgefäß-verschließende Thrombus aufgelöst ist, können die Zymogene für weitere Tage verabreicht werden, um einen akuten Myokardreinfarkt zu verhindern. Falls in dieser Situation aktiviertes Protein C verabreicht wird, wird dem Patienten eine Startdosis von 1-10 mg zu dem Zeitpunkt verabreicht, bei dem die Behandlung mit gewebsspezifischem Plasminogenaktivator einsetzt, gefolgt von einer kontinuierlichen Infusion von aktiviertem Protein C, die von 3-30 mg/Tag reicht. Im Gegensatz dazu können die erfindungsgemäßen Zymogene durch Bolusinjektion 3 bis 4 Mal am Tag in Dosen verabreicht werden, die etwa 12 mg/Tag nicht überschreiten.
Aktiviertes Protein C ist für die Behandlung von disseminierter intravaskulärer Koagulation nützlich. In ausgedehnten klinischen Studien wurden Heparin und die oral en Antikoagulantien Patienten mit disseminierter intravaskulärer Koagulation (DIC) verabreicht, aber die Ergebnisse waren enttäuschend. Bei disseminierter intravaskulärer Koagulation haben Protein C, wie auch die erfindungsgemäßen Zymogene, einen deutlichen Vorteil gegenüber herkömmlichen Blutgerinnungshemmstoffen. Wie oben erwähnt, wurde in Tierversuchen festgestellt, daß das Protein C Zymogen bei der Prävention von Tod und Organzerstörung durch gramnegative Sepsis und disseminierte intravaskuläre Koagulation unwirksam ist. Im Gegensatz dazu sind die erfindungsgemäßen Protein C Zymogene, die gegenüber der Aktivierung durch Thrombin äußerst empfindlich sind, bei der Behandlung von disseminierter intravaskulärer Koagulation wirksam. Der geschätzte Bedarf für aktiviertes Protein C zur Behandlung von DIC beträgt etwa 100 mg/Tag, während die Dosen der erfindungsgemäßen Zymogenformen zur Behandlung von DIC etwa 30 mg/Tag durch wiederholte Bolusinjektion verabreicht nicht überschreiten.
Herkömmliche blutgerinnungshemmende Medikamente, speziell Warfarin, sind bei der Behandlung von invasiven malignen Tumoren nützlich. Viele Tumorzellen produzieren Substanzen, die die Aktivierung des Blutgerinnungssystems auslösen, was lokale Fibrinablagerungen zur Folge hat. Diese Fibrinablagerungen wirken als "Nester", in denen sich Krebszellen teilen können, um Metastasen zu bilden. Es ist jedoch nicht möglich, Warfarin oder andere herkömmliche Antikoagulantien in Kombination mit intensiveren und wirksameren Chemotherapieformen zu verabreichen, da eine solche Therapie immer einen starken Abfall in der Anzahl der Blutplättchen hervorruft, und mit Warfarin-Therapie gekoppelte Thrombozytopenie setzt den Patienten einem unakzeptabel hohen Risiko für ernsthafte Blutungskomplikationen aus. Die erfindungsgemäßen Protein C Derivate sind, wie aktiviertes Protein C, selektiver als herkömmliche Antikoagulantien und haben einen weit höheren therapeutischen Index entweder als Heparin oder als die oralen Antikoagulantien und können daher einem thrombozytopenischen Patienten relativ sicher verabreicht werden, was wiederum die Behandlung von Patienten mit invasiven Krebs formen mit effektiver und intensiver Chemotherapie in Kombination mit einem erfindungsgemaßen Protein C Zymogen ermöglicht. Die Behandlung folgt einem Dosierungsschema, das mit dem bei Thrombose tiefer Venen/ Lungenembolie verwendetem vergleichbar ist.
Die erfindungsgemäßen Zymogene und deren aktivierte Entsprechungen können gemäß bekannter Verfahren zu pharmazeutisch brauchbaren Zusammensetzungen formuliert werden, wobei ein humanes Protein C Zymogen oder aktiviertes Protein C der Erfindung im Gemisch mit pharmazeutisch annehmbaren Trägern kombiniert wird. Geeignete Träger und ihre Formulierung, einschließlich anderer Humanproteine, beispielsweise humanes Serumalbumin, sind beispielsweise in Remington's Pharmazeutical Sciences 16. Ausgabe, 1980, Mack Publishing Co., herausgegeben von Osol et al., beschrieben, das hiermit eingeführt wird. Solche Zusammensetzungen enthalten eine wirksame Menge eines Protein C Zymogens oder einer aktivierten Entsprechung zusammen mit einer geeigneten Menge eines Trägers, um pharmazeutisch annehmbare Zusammensetzungen zur wirksamen Verabreichung an den Empfänger herzustellen. Die Protein C Zusammensetzung kann parenteral oder durch andere Verfahren, die ihre Übertragung in einer wirksamen Form in den Blutstrom sicherstellen, verabreicht werden.
Es sollte erwähnt werden, daß die erfindungsgemäßen Zymogene zur Herstellung von aktiviertem Protein C in vitro verwendet werden können. Obwohl rekombinante Verfahren zur Herstellung von aktiviertem Protein C direkt in eukaryontischen Zellen bekannt sind, erfordern diese Verfahren, daß das aktivierte Protein C für lange Zeiträume im Kulturmedium verbleibt. Zusätzlich muß das aktivierte Protein C aus dem Kulturmedium gereinigt werden, ein teueres, mehrstufiges Verfahren. Da aktiviertes Protein C relativ instabil ist, können diese direkten Expressionsverfahren niedrige Mengen an aktiviertem Protein C ergeben. im Gegensatz dazu können die erfindungsgemäßen Zymogene allein durch Thrombin sogar in Gegenwart von Calcium aktiviert werden, und bieten daher deutliche Vorteile gegenüber den bekannten Verfahren zur Herstellung von aktiviertem Protein C.
Die folgenden Beispiele verdeutlichen die Verfahren und beschreiben die Konstruktionsprotokolle für repräsentative Verbindungen, Vektoren und Transformanden der Erfindung ohne diese hierdurch zu beschränken.

Beispiel 1

Konstruktion von Plasmid pLAPC

Dieses Beispiel liefert ein detalliertes Protokoll zur Konstruktion von Plasmid pLAPC. Kurz gesagt beschreibt das Beispiel 1 A die Isolierung eines DNA Fragments, das einen Teil des Protein C Moleküls von Plasmid pHC7 einschließlich des Aktivierungspeptids kodiert. Das Beispiel 1B beschreibt die Klonierung dieses DNA Fragments in den Phagen M13mp18 und die Entfernung der das Aktivierungspeptid kodierenden DNA von dem entstehenden rekombinanten Phagen durch ortsspezifische Mutagenese. Das Beispiel 1C beschreibt die letzten Schritte der Konstruktion von Plasmid pLAPC, genauergesagt die Isolierung des mutagenisierten Fragments und dessen Ligation mit zwei von Plasmid pLPC stammenden Fragmenten unter Bildung von Plasmid pLAPC. Das Konstruktionsprotokoll für Plasmid pLPC ist in Beispiel 2 beschrieben.

A. Isolierung eines DNA Fragments, das die für das Aktivierungspeptid von humanem Protein C kodierende Sequenz enthält

Das Plasmid pHC7 enthält die vollständige kodierende Sequenz für unreifes humanes Protein C. Ein Liter 15 µg/ml Tetracyclin enthaltendes LB Medium (10 g Pepton, 10 g NaCl und 5 g Hefeextrakt) wird mit einer Kultur von E. coli K12 RR1/pHC7 (NRRL B- 15926) beimpft und in einem belüftenden Schüttler bei 37ºC inkubiert, bis die optische Dichte (O.D.) bei 590 nm 1 Absoptionseinheit beträgt und dann werden 150 mg Chloramphenicol zur Kultur gegeben. Die Inkubation wird für etwa 16 Stunden fortgesetzt, die Chloramphenicolzugabe hemmt die Proteinsynthese und hemmt daher die weitere Zellteilung, aber erlaubt die Fortsetzung der Plasmidreplikation.
Die Kultur wird in einem Sorvall GSA Rotor (Dupont Co., Instrument Produkts, Biomedical Division, Newtown, CN 06470) bei 6 000 Upm für 5 Minuten bei 4ºC zentrifugiert. Der entstehende Überstand wird verworfen und das Zellpellet wird in 40 ml TES Puffer (10 mM Tris-HCl pH = 7,5, 10 mN NaCl und 1 mM EDTA) gewaschen und dann erneut pelletiert. Der Überstand wird erneut verworfen und das Zellpellet wird in einem Trockeneis-Ethanolbad eingefroren und wieder aufgetaut. Das aufgetaute Zellpellet wird in 10 ml einer 25 % Saccharose /50 mM EDTA Lösung resuspendiert. Etwa 1 ml einer 5 mg/ml Lysozymlösung, 3 ml 0,25 M EDTA pH=8,0 und 100 µl 10 mg/ml RNAse A werden zu der Lösung gegeben, die dann auf Eis für 15 Minuten inkubiert wird. Drei ml Lyselösung (hergestellt durch Mischen von 3 ml 10 % Triton-X 100, 75 ml 0,25 M EDTA pH=8,0, 15 ml 1 M Tris-HCl pH=8,0 und 7 ml Wasser) werden zu den Lysozm-behandelten Zellen gegeben, gemischt und die entstehende Lösung wird für weitere 15 Minuten auf Eis inkubiert. Die lysierten Zellen werden in einem Trockeneis-Ethanolbad eingefroren und dann aufgetaut.
Der Zelldebris wird aus der Lösung durch Zentrifugation bei 25 000 Upm für 40 Minuten in einem SW27 Rotor (Beckman, 7360 N. Lincoln Ave., Lincolnwood, IL 60646) entfernt. Etwa 30,44 g CsCl und 1 ml einer 5 mg/ml Ethidiumbromidlösung werden zur Lösung gegeben, deren Volumen dann auf 40 ml gebracht wird. Die Lösung wird in ein Vti50 Ultrazentrifugenröhrchen (Beckman) dekantiert. Das Röhrchen wird zugeschmolzen und in einem Vti50 Rotor bei 42 000 Upm für 16 Stunden zentrifugiert. Die entstehende, mit ultraviolettem Licht sichtbargemachte, Plasmidbande wird isoliert und dann in ein Ti75 Röhrchen und einen Ti75 Rotor (Beckman) gegeben und bei 55 000 Upm für 16 Stunden zentrifugiert. Alle notwendigen Volumenangleichungen werden mittels 0,761 g/ml CsCl enthaltendem TES durchgeführt. Die Plasmidbande wird erneut isoliert, das Ethidiumbromid mit salzgesättigtem Isopropanol extrahiert und schließlich 1:3 mit TES Puffer verdünnt. Zwei Volumen Ethanol werden dann zur Lösung gegeben und das entstehende Gemisch wird dann über Nacht bei -20ºC inkubiert. Die Plasmid DNA wird durch Zentrifugation der Lösung in einem 5534 Rotor (DuPont Co.) für 15 Minuten bei 10 000 Upm pelletiert.
Das 1 mg der durch dieses Verfahren erhaltenen Plasmid pHC7 DNA wird in 1 ml TE Puffer (10 mM Tris-HCI pH=7,6 und 0,1 mM EDTA) gelöst und bei -20ºC gelagert. Eine Restriktions- und Funktionskarte von Plasmid pHC7 ist in Figur 2 der Zeichnungen dargestellt.
Etwa 7 µg (7 µl) Plasmid pHC7 DNA werden zu 25 µl 10fach Core-Puffer (Core-Puffer , BRL, besteht aus 500 mM Tris-HCl, pH=8,0, 500 mM NaCl und 100 mM MgCl&sub2;), 198 µl H&sub2;O und 12 µl Restriktionsenzym SstI ( 60 Einheiten , Bethesda Research Laboratories (BRL), Gaithersburg, MD 20877, alle hierin erwähnten Enzyme sind, falls nicht anders angegeben, von BRL oder New England Biolabs (NEB), Beverly, MA 01915-9990 erhältlich und werden im wesentlichen gemäß den Empfehlungen des Herstellers verwendet) und 8 µl (80 Einheiten) Restriktionsenzym SalI gegeben. Das Reaktionsgemisch wird bei 37ºC für vier Stunden inkubiert, dann wird die SstI-SalI verdaute Plasmid pHC7 DNA zuerst mit Phenol und dann mit Chloroform extrahiert, durch Fällung mit Ethanol und Zentrifugation gesammelt und schließlich in 15 µl TE/10 Puffer (10 mM Tris-Base pH = 7,6 und 0,1 mM EDTA) suspendiert.
Das Reaktionsgemisch wird dann auf einem 0,6 %igen Gel einer bei niedrigen Temperaturen gelierenden Agarose (FMC Corporation, Marine Colloids Division, Rockland, Maine 04841) für 2-3 Stunden bei 130 V und 65 mA in Tris-Acetat-Puffer einer Elektrophorese unterzogen. Das Gel wird in einer verdünnten Lösung Ethidiumbromid gefärbt und die DNA Bande, die aus dem 0,7 kb SstI- SalI Restriktionsfragment besteht, die mittels langwelligem UV Licht sichtbargemacht wird, wird aus dem Gel in einem kleinen Stück ausgeschnitten. Das Volumen des Stücks wird durch das Gewicht und die Dichte des Stücks bestimmt und vier Volumen 0,25 M NaCl enthaltender TE Puffer werden in das das Stück enthaltende Röhrchen gegeben. Das Stück wird dann durch eine Inkubation bei 72ºC geschmolzen. Etwa 0,5 µg des 0,7 kb SstI-SalI Restriktionsfragments von Plasmid pHC7 werden in einem Volumen von 400 µl erhalten. Eine weitere Aufreinigung der DNA wird durch das Durchfließen der Lösung durch eine NACS-prepac Säule (ERL) gemäß den Empfehlungen des Herstellers erreicht und das gereinigte Fragment wird in 15 µl deionisiertem Wasser resuspendiert.

B. Konstruktion des rekombinanten Phagen und Entfernung der das Aktivierungspeptid kodierenden DNA durch ortsspezifische Mutagenese

Etwa 1 µg M13mp18 RF DNA (replikative Form) (erhältlich bei New England Biolabs) wird mit den Restriktionsenzymen SstI und SalI im wesentlichen gemäß dem in Beispiel 1A beschriebenen Verfahren verdaut. Die Reaktion wird durch Extraktion des Reaktionsgemisches mit Phenol und dann mit Chloroform gestoppt, dann wird die DNA gefällt, zentrifugiert und in etwa 15 µl TE Puffer resuspendiert. Die zwei aus dem Verdau entstandenen Fragmente werden auf einem 0,6 %igem Gel aus bei niedrigen Temperaturen gelierender Agarose getrennt und das größere Fragment wird aus dem Gel ausgeschnitten und, wie in Beispiel 1A beschrieben, gereinigt.
Etwa 0,1 µg (in 7 µl H&sub2;O) des 0,7 kb SstI-SalI Restriktionsfragments von Plasmid pHC7 werden zusammen mit 2 µl 10fach Ligasepuffer (0,5 M Tris-HCl pH=7,8, 60 mM MgCl&sub2; und 0,2 M Dithiothreit (DTT)), 2 µl 1 mg/ml RSA, 1 µl 25 mM ATP, l µl ( 400 Einheiten) T4 DNA Ligase (NEB) und 2 µl H&sub2;O zu 5 µl der SstI-SalI- verdauten M13mp18 RF DNA gegeben. Die Ligationsreaktion wird bei 25ºC über Nacht inkubiert und die ligierte DNA bildet die gewünschte Phagen M13mp18-HE1 DNA in doppelsträngiger Form.
Etwa 300 µl einer Übernachtkultur von E. coli K12 JM101(New England Biolabs) werden zur Beimpfung von 30 ml 2fach TY Medium verwendet (TY Medium besteht aus 10 g/l Trypton, 10 g/l NaCl und 5 g/l Hefeextrakt) und die entstehende Kultur wird bei 37ºC unter Belüftung inkubiert, bis die O.D.&sub6;&sub0;&sub0; 0,5 beträgt. Die Kultur wird für 10 Minuten in einem Eiswasserbad gekühlt, zentrifugiert und in 15 ml kaltem 10 mM NaCl resuspendiert. Die Zellen werden erneut zentrifugiert und dann in 15 ml kaltem 30 mM CaCl&sub2; resuspendiert Die Zellen werden für 20 Minuten auf Eis gestellt und zentrifugiert. Die Zellen werden in 1,5 ml kaltem 30 mM CaCl&sub2; resuspendiert, ein 200 µl Teil der Zellen wird entnommen, zu 9 µl der oben hergestellten, ligierten DNA gegeben und für 30 Minuten auf Eis inkubiert. Dann wird das Zellen-DNA-Gemisch bei 42ºC für 2 Minuten inkubiert und dann zu 3 ml Weichagar (TY Medium mit 0,5 % Agar bei 45ºC flüssig gehalten) gegeben, der auch 50 µl 2 % X-Gal ("X-Gal ist 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactapyranosid), 50 µl 100 mM IPTG ("IPTG" ist Isoprapyl-β-D-thiogalactopyranasid) und 100 µl E. coli K12 JY101 in der logarithmischen Wachstumsphase enthält. Das Zellen-Weichagar-Gemisch wird dann auf TY-Agarplatten ausplattiert und die Platten werden bei 37ºC über Nacht inkubiert.
Am folgenden Morgen werden vier klare Plaques einzeln zur Beimpfung von 2 ml 2fach TY Medium verwendet und die entstehenden Kulturen werden bei 37ºC für 6 Stunden mit Belüftung inkubiert. Dann werden die Kulturen zentrifugiert, und 500 µl des entstehenden Überstands (die Zellpellets werden zur Präparation der Phagen DNA zur Restriktionsanalyse verwendet) werden zu 500 µl Kulturen (O.D.&sub5;&sub5;&sub0; = 0,5) von E. coli K12 JM101 und 50 ml 2fach TY Medium gegeben. Diese Kulturen werden über Nacht bei 37ºC inkubiert. Die Phagen RF DNA wird aus den Zellpellets mittels einer im kleineren Maßstab durchgeführten Version des in Beispiel 1A beschriebenen Verfahrens isoliert, auser daß kein Antibiotikum im Kultermedium verwendet wird und die Ultrazentrifugationsschritte durch Phenol- und Chloroformextraktionen ersetzt werden. Die die Phagen M13mp18- HE1 DNA enthaltenden Transformanden werden durch Restriktionsanalyse ihrer Phagen DNA identifiziert.
Die Übernachtkulturen werden zentrifugiert und etwa 1 ml einer Lösung aus 20 % Polyethylenglycal (PEG) 6000 und 2,5 mM NaCl werden zu 5 ml Überstand gegeben, der dann bei Raumtemperatur für 10 Minuten inkubiert wird. Das Gemisch wird für 10 Minuten bei 10 000 Upm zentrifugiert und das entstehende Pellet, das die einzelsträngige Phagen M13mp18-HE1 DNA enthält, wird in 500 µl TES Puffer (20 mM Tris-HCl pH-7,5, 0,1 M EDTA und 10 mM NaCl) resuspendiert. Die DNA Lösung wird zuerst mit Chloroform, dann zweimal mit TE-gesättigtem Phenol und dann erneut mit Chloroform extrahiert. Die einzelsträngige DNA wird dann mittels NaOAc und Ethanol gefällt, zentrifugiert, und das mit 70 %igem Ethanol gewaschene und getrocknete Pellet wird dann in 80 µl H&sub2;O gelöst. Die Phagenpräparation wird im nächsten Schritt, der ortsspezifischen Mutagenese, zur Entfernung der das Aktivierungspeptid kodierenden DNA verwendet.
Das bei der zur Entfernung der das Aktivierungspeptid kodierenden DNA Mutagenese verwendete, einzelsträngige DNA Fragment wird auf einem automatisierten DNA Synthesizer hergestellt und wird im folgenden gezeigt:
Etwa 30 Picomal (1 µl) des oben gezeigten, einzelsträngigen DNA Fragments (das "mutagenisierende Oligonukleotid") und 1,5 µl (7,5 Picomol) des universellen M13 Primers (erhältlich van Boehringer Mannheim Biochemicals (BMB), 7941 Castleway Drive, P.O. Box 50816, Indianapolis, IN 46250) werden jeweils mit 5 Einheiten T4 Polynukleotidkinase (Pharmacia P-L Biochemicals, Inc., 800 Centennial Avenue, Piscataway, NJ 08854) in 10 µl einfachem Kinasepuffer (100 mM Tris-HCl pH = 8,3, 100 mM DTT und 100 mM MgCl&sub2;), der 1 µl 1 mM ATP enthält, für 30 Minuten bei 37ºC behandelt, gefolgt von einer zehnminütigen Inkubation bei 65ºC und anschließendem Einfrieren. Die kinasebehandelten DNAs werden beim folgenden Mutagenisierungsverfahren verwendet.
Im ersten Schritt des Mutagenisierungsverfahrens werden das mutagenisierende Oligonukleotid und der universelle M13 Primer mit der einzelsträngigen Phagen DNA aneliert. Die Anelierungsreaktion wird ausgeführt durch Zugabe von 300 Nanogramm (0,5 µl) einzelsträngiger Phagen M13mp18-HE1 DNA zu einem Picomol (1,2 µl) des Universalprimers, 1 Picomol (0,3 µl) des mutagenisierenden Oligonukleotids, 2 µl 10fach Anelierungspuffer (100 mM Tris-HCl pH = 7,5, 1 mM EDTA und 500 mM NaCl) und 16 µl H&sub2;O, einer Inkubation des Gemisches bei 80ºC für 2 Minuten und dann bei 50ºC für 5 Minuten und schließlich durch Abkühlen des Reaktionsgemisches auf Raumtemperatur.
Nach erfolgter Anelierung der Oligonukleotide wird die Phagen DNA durch Verlängern der Primer mit DNA Polymerase doppelsträngig gemacht. Die Verlängerungsreaktian wird durch Zugabe van 3 µl 10fach Verlängerungspuffer (500 mM Tris-HCl pH = 8, 1 mM EDTA und 120 mM MgCl&sub2;), 3 µl 10fach Ligasepuffer, 1,5 µl 0,2 mM DTT, 3 µl dNTP Mischung (0,5 mM von jedem dNTP), 1,2 µl 25 mM ATP, 0,5 µl Klenowenzym (5 U/µl, BMB), 1 µl T4 DNA Ligase (400 Einheiten, NEB) und 19,8 µl H&sub2;O zum Gemisch der anelierten DNA ausgeführt. Die Verlängerungsreaktion wird bei Raumtemperatur für 30 Minuten, dann bei 37ºC für 4 Stunden und dann über Nacht bei 4ºC inkubiert.
Die Reaktion wird durch eine Phenol-Chloroform-Extraktion und Fällung der DNA mit Ethanol und Natriumacetat (NaOAc) gestoppt. Die DNA wird zentrifugiert und in 40 µl S1 Puffer (0,3 M NaCl, 0,03 M NaOAc pH=4,5 und 0,3 mM ZnCl&sub2;) resuspendiert. Von der unten beschriebenen S1 Behandlung wurde berichtet, daß sie für ortsspezifische Mutagenisierungsverfahren nützlich ist. Die Erfinder fanden jedoch keinen deutlichen Vorteil in der S1 Behandlung und ließen die S1 Behandlung gänzlich in den hierin in den Beispielen beschriebenen Konstruktionsprotokollen heraus.
Die DNA Lösung wird zu gleichen Teilen in zwei Röhrchen gegeben und zu einem Röhrchen werden 100 Einheiten (BMB) S1 Nuklease gegeben. Die S1 Reaktion wird bei Raumtemperatur für 5 Minuten inkubiert und durch einmalige Extraktion des Reaktionsgemisches mit TE-gesättigtem Phenol-Chloroform (50:50) gestoppt. Die DNA wird aus dem Reaktionsgemisch und der nicht mit S1 behandelten Probe mit NaOAc und Ethanol gefällt.
Die DNA Pellets werden in 60 µl H&sub2;O resuspendiert und zur Transformation von E. coli K12 JM101 im wesentlichen gemäß dem während der Konstruktion des Phagen M13mp18-HE1 verwendeten Verfahren transformiert, außer daß kein IPTG oder X-Gal zu den Platten gegeben wird. Die Mutanten werden mittels eines kleinen Teils des mutagenisierenden Oligonukleotids, 5'-TGAAACGACTCATTGA-3' (radioaktiv markiert), als Sonde in Plaque- und Dot-Blot-Hybridisierungen gescreent. Einige in den Hybridisierungen positiv erscheinende Plaques werden gepickt und einzeln in 2 ml einer Kultur von E. coli K12 JM101 in der logarithmischen Wachstumsphase geimpft. Diese Kulturen werden bei 37ºC unter Belüftung für 6 Stunden inkubiert, bis sie dann zur oben für den Phagen M13mp18- HE1 beschriebenen Präparation der einzelsträngigen DNA verwendet werden.
Die einzelsträngige DNA wird mittels der Didesoxy-Sequenzierungsmethade (J.H. Smith, 1980, Methads in Enzymology 65:560- 580) sequenziert. Einige Phagen mit der gewünschten Mutation werden identifiziert. Phagen, in denen die für das Aktivierungspeptid kodierende Sequenz deletiert wurde, werden als Phage M13mp18-HE2 bezeichnet. Die Mutation im Phagen M13mp18-HE2 verursacht eine Abnahme in der Größe van 36 bp verglichen mit der natürlichen kodierenden Sequenz, ein Unterschied, der zur Vereinfachung der Identifizierung von DNA verwendet werden kann, die die mutierte Region enthält. Die RF Form des Phagen M13mp18-HE2 wird zur Verwendung in anschließenden Konstruktionen präpariert.

C. Abschließende Konstruktion van Plasmid pLAPC aus dem Phagen M13mp18-HE2 und Plasmid pLPC

Das mutagenisierte SstI-SalI ( 0,7 kb) Restriktionsfragment der RF Form des Phagen M13mp18-HE2 wird aus dem Phagen herausgeschnitten und im wesentlichen gemäß dem Verfahren van Beispiel 1A isoliert. Die 100 µl der Lösung, die 0,1 µg des gewünschten 0,7 kb Fragments in einer 1:2 Verdünnung der niedrig-gelierenden Agarose enthalten, werden jedoch nicht durch eine Reinigungssäule geschickt, sondern direkt zur Ligation unter Bildung des unten beschriebenen Plasmids pLAPC verwendet.
Drei DNA Fragmente werden unter Bildung von Plasmid pLAPC miteinander ligiert: Das oben beschriebene 0,7 kb SstI-SalI Restriktionsfragment des Phagen M13mp18-HE2 und zwei DNA Fragmente von Plasmid pLPC. Das Konstruktionsprotokoll für Plasmid pLPC ist in Beispiel 2 beschrieben. Eine Restriktions- und Funktionskarte von Plasmid pLPC ist in Figur 1 der Zeichnungen dargestellt. Wegen der Lage der SalI, SstI und EcoRI Restriktionsschnittstellen auf Plasmid pLPC müssen die gewünschten EcoRI-SalI und EcoRI-SstI Restriktionsfragmente in zwei separaten Verdaus hergestellt werden.
Um das EcoRI-SstI Fragment herzustellen, werden etwa 40 µg Plasmid pLPC in 25 µl H&sub2;O zu 10 µl 1 mg/ml RSA, 10 µl 10fach Core-Puffer (BRL), 5 µl Restriktionsenzym EcoRI (50 Einheiten, BRL), 5 µl Restriktiansenzym SstI (25 Einheiten, BRL) und 45 µl H&sub2;O gegeben und die entstehende Reaktion wird bei 37ºC für 1,5 Stunden inkubiert. Die SstI-EcoRI-verdaute Plasmid pLPC DNA wird durch Fällung mit Ethanol und Zentrifugation gesammelt. Die SstI-EcoRI verdaute DNA wird in Wasser resuspendiert und dann auf ein 0,6 %iges Gel aus bei niedrigen Temperaturen gelierender Agarose gegeben, um die DNA Fragmente durch Elektrapharese zu trennen.
Um das EcoRI-SalI Fragment herzustellen, werden etwa 15 µg Plasmid pLPC in 9 µl H&sub2;O zuerst mit dem Restriktionsenzym ApaI behandelt, um eine Kontamination durch Restriktiansfragmente mit ähnlicher Größe zu vermeiden. Etwa 10 µl 10fach ApaI Puffer (60 mM NaCl, 60 mM Tris-HCl pH = 7,4, 60 mM MgCl&sub2; und 60 mM DTT), 10 µl 1 mg/ml RSA, 69 µl H&sub2;O und 2 µl Restriktionsenzym ApaI (50 Einheiten, NEB) werden zur Lösung der Plasmid pLPC DNA gegeben und die entstehende Reaktion wird bei 37ºC für eine Stunde inkubiert. Dann werden 15 µl 2 M NaCl, 69 µl H&sub2;O, 8 µl Restriktionsenzym SalI (NEB) und 8 µl Restriktionsenzym EcoRI (NEB) zur Lösung der ApaI- verdauten Plasmid pLPC DNA gegeben und die entstehende Reaktion wird bei 37ºC für eine Stunde inkubiert. Die ApaI-SalI-EcoRI- verdaute Plasmid pLPC DNA wird zuerst mit Phenol und dann mit Chloroform extrahiert, dann durch Fällung mit Ethanol und Zentrifugation gesammelt und schließlich in 25 µl H&sub2;O resuspendiert. Die DNA wird dann auf ein 0,6 %iges Gel aus bei niedrigen Temperaturen gelierender Agarose aufgetragen und die DNA Fragmente werden durch Elektrophorese getrennt.
Das 3,76 kb EcoRI-SalI Restriktionsfragment und das 2,0 kb EcoRI-SstI Restriktionsfragment werden aus den Gelen ausgeschnitten und die Gelfragmente nach der Zugabe gleicher Volumen an 10 mM Tris-HCl pH = 7,6, wie in Beispiel 1A beschrieben, geschmolzen. Etwa 2 µg des 3,76 kb EcoRI-SalI Restriktionsfragments von Plasmid pLPC werden so in 200 µl 10 mM Tris-HCl pH = 7,6 erhalten, die auch die geschmolzene Agarose enthalten. Etwa 2 µg des 2, 0 kb EcoRI-SalI Restriktionsfragments von Plasmid pLPC werden in separaten 200 µl 10 mM Tris-HCl pH = 7,6 , die Agarose enthaltend, erhalten.
Etwa 12,5 µl jeder Lösung der zwei gereinigten Fragmente (das 3,76 kb EcoRI-SalI Restriktionsfragment von Plasmid pLPC und das 2,0 kb EcoRI-SstI Restriktionsfragment von Plasmid pLPC) werden zu 20 µl 0,7 kb SstI-SalI Restriktionsfragment des Phagen M13mp18-HE2, 10 µl 1 mg/ml RSA, 10 µl 10 mM ATP, 10 µl 10fach Ligasepuffer, 2 µl ( 800 Einheiten, NEB) T4 DNA Ligase und 23 µl H&sub2;O gegeben und die entstehende Ligationsreaktion wird bei 15ºC über Nacht inkubiert. Die ligierte DNA besteht aus dem gewünschten Plasmid pLAPC. Das Plasmid pLAPC unterscheidet sich vom Plasmid pLPC (Figur 1) nur in der Deletion der das Aktivierungspeptid kodierenden DNA.
Um die Plasmidstruktur zu kontrollieren und größere Mengen an Plasmid pLAPC für eukaryontische Zelltransformationen und weitere Konstruktionen zu erhalten, wird die das Plasmid pLAPC enthaltende ligierte DNA zur Transformation von E. coli K12 RV308 verwendet, der vom NRRL unter der Hinterlegungsnummer NRRL B-15624 erhalten werden kann.
Eine 50 ml Kultur von E. coli K12 RV308 wird in LB Medium bis zu einer optischen Dichte (O.D.) bei 590 nm von 0,6 gezogen. Die Kultur wird für zehn Minuten auf Eis gekühlt und die Zellen werden durch Zentrifugation geerntet. Das Zellpellet wird in 25 ml kaltem 10 mM NaCl resuspendiert. Die Zellen werden erneut durch Zentrifugation pelletiert, und das Pellet wird in 25 ml kaltem, 30 mM CaCl&sub2; resuspendiert und für 30 Minuten auf Eis inkubiert. Die Zellen werden erneut zentrifugiert und in 2,5 ml kaltem 30 mM CaCl&sub2; resuspendiert.
Zweihundert µl dieser Zellsuspension werden mit der das Plasmid pLAPC enthaltenden, ligierten DNA gemischt und für 60 Minuten auf Eis inkubiert. Das Gemisch wird dann bei 42ºC für 2 Minuten inkubiert, gefolgt von einer zehnminütigen Inkubation bei Raumtemperatur. Etwa 10 ml 2fach TY Medium werden zu dem Zellen- DNA-Gemisch gegeben und dann werden die Zellen auf einem belüftenden Schüttler in 125 ml Kolben bei 37ºC für zwei Stunden inkubiert.
Teile des Zellgemisches werden auf 100 µg/ml Ampicillin enthaltende TY-Agarplatten (TY Medium mit 15 g/l Agar) ausplattiert und dann werden die Platten bei 37ºC über Nacht inkubiert. Die E. coli K12 RV308/pLAPC Transformanden werden durch Restriktionsanalyse ihrer Plasmid DNA verifiziert. Die Plasmid DNA wird aus den E. coli K12 RV308/pLAPC Transformanden im wesentlichen gemäß der Beschreibung von Beispiel 1A erhalten, außer daß 50 g/ml Ampicillin und nicht Tetracyclin als selektives Mittel verwendet wird.

Beispiel 2

Konstruktion van Plasmid pLPC

Das Plasmid pLPC wird als Vektor verwendet, der als Zwischenstufe zur Konstruktion von Plasmid pLAPC benötigt wird (siehe Beispiel 1C) Das Plasmid pLPC enthält ein DNA Segment, das den BK Virus Enhancer und den späten Adenovirus 2 Promotor zur Expressionssteuerung von humanem Protein C positioniert enthält. Das Konstruktionsprotakoll für das Plasmid pLAPC resultiert im wesentlichen aus dem Ersetzen der für humanes Protein C kodierenden Sequenz auf Plasmid pLPC durch eine andere für Protein C kodierende Sequenz, aus der die für das Aktivierungspeptid kodierende DNA entfernt wurde.
Die Expressionskontrollsequenzen bestehend aus BK Enhancer/später Adenoviruspromotor auf den Plasmiden pLPC und pLAPC werden durch die Anwesenheit eines unmittelbar frühen Genprodukts eines großen DNA Virus, das heißt dem E1A Genprodukt des Adenovirus stark in ihrer Aktivität stimuliert.
Das Konstruktionsprotokoll für Plasmid pLPC ist unten erläutert. Das gesamte Konstruktionsprotokoll für Plasmid pLPC ist schematisch in Figur 1 der Zeichnungen gezeigt. Kurz gesagt beschreibt das Beispiel 2A die Isolierung der BK Virus DNA, aus der der BK Enhancer erhalten werden kann. Das Beispiel 2B erläutert das Konstruktionsprotokoll für das Plasmid pBKneo1, ein Plasmid, das aus der Insertion des BK Enhancers in das Plasmid pdBPV-MMTneo hervorgeht. Das Beispiel 20 beschreibt das Konstruktionsprotokoll für das Plasmid pLPcat, ein Plasmid, das aus der Insertion des späten Adenovirus 2 Promotors in Plasmid pSV2cat hervorgeht. Das Beispiel 2D beschreibt das Konstruktionsprotokoll für das Plasmid pBLcat, ein Plasmid, das den BK Enhancer zur Aktivitätsstimulierung des späten Adenoviruspromotors positioniert enthält. Das Beispiel 2E beschreibt das Konstruktionsprotokoll für das Plasmid pL133, einem Protein C Expressionsvektor, wobei das Konstruktionsprotokoll mit dem Plasmid pHC7 als Ausgangsmaterial beginnt und über die Konstruktion des Plasmids pSV2-HPC8 als Zwischenstufe zu der abschließenden Konstruktion van Plasmid pL133 kommt. Schließlich beschreibt das Beispiel 2F das Konstruktionsprotokoll für das Plasmid pLPC, das die Expressionskontrollsequenz aus BK Enhancer/späten Adenoviruspromotor van Plasmid pBLcat zur Expressionssteuerung van humanem Protein C in das Plasmid pL133 inseriert enthält.

A. Präparation der BK Virus DNA

Das BK Virus erhält man von der American Type Culture Collection unter der Hinterlegungsnummer ATCC VR-837. Das Virus wird in gefriergetrockneter Form geliefert und in Hank's ausgeglichener Salzlösung (Gibco, 3175 Staley Raad, Grand Island, NY 14072) in einem Titer von etwa 10&sup5; plaquebildenden Einheiten (PFU)/ml resuspendiert. Als Wirt der Wahl zur Präparation der BK Virus DNA werden primär humane embryonale Nierenzellen (PHEK) verwendet, die von den Flow Laboratories, Inc., 7655 Old Springhouse Raod, McLean, VA 22101 unter der Katalognummer 0-100 oder von M.A. Bioprodukts unter der Katalognummer 70-151 erhalten werden können.
Etwa fünf, eine geschlossene Schicht von etwa 10&sup6; PHEK Zellen enthaltende, 75 mm² Polystyrolflaschen werden zur Viruserzeugung verwendet. Etwa 1 ml des BK Virus wird in einem Titer von 10&sup5; PFU/ml zu jeder Flasche gegeben, die dann bei 37ºC für eine Stunde inkubiert wird, bevor frisches Kulturmedium (Dulbecco's Modified Eagle Medium, Gibco, Grand Island, NY 14072, mit 10 % zugesetztem fetalem Rinderserum) zugegeben wird und die infizierten Zellen werden bei 37ºC für 10-14 Tage, oder bis die volle cytopathogene Wirkung des Virus festgestellt wird, inkubiert. Diese cytopathogene Wirkung ist von Zellinie zu Zellinie und von Virus zu Virus unterschiedlich, aber besteht normalerweise aus sich abkugelnden, verklumpenden und sich vom Boden der Kulturflasche ablösenden Zellen.
Das Virus wird aus den Zellen durch drei Gefrier-Auftau-Zyklen freigesetzt und der Zelldebris wird durch Zentrifugation bei 5 000xg entfernt. Das in einem Liter Überstandflüssigkeit befindliche Virus wird durch die Zugabe von 100 g PEG-6 000, eine Inkubation der Lösung für 24 Stunden bei 400 und eine Zentrifugation bei 5 000xg für 20 Minuten gefällt und geerntet. Das Pellet wird in 1/100stel des ursprünglichen Valumens 0,1fachem 550 Puffer (einfach 550 = 0,15 M NaCl und 0,015 M NaCitrat pH = 7) gelöst. Die Virussuspension wird auf ein, 15 ml einer gesättigten Lösung van KBr enthaltendes, Röhrchen aufgebracht, das dann bei 75 000xg für 3 Stunden zentrifugiert wird. Zwei Banden sind in der KBr Lösung nach der Zentrifugation sichtbar. Die untere Bande, die das vollständige Virion enthält, wird gewonnen und auf einer Sephadex G-50 Säule (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO 63178) mittels TE (10 mM Tris-HCl pH = 7,8 und 1 mM EDTA) als Elutionspuffer entsalzt.
Natriumdodecylsulfat (SDS) wird zu der von der Säule erhaltenen Lösung an gereinigten Virionen in einer Konzentration von 1 % gegeben, Pronase (Sigma) Protease wird in einer Konzentration von 100 µg/ml zugegeben, und die Lösung wird bei 37ºC für 2 Stunden inkubiert. Dann wird Cäsiumchlorid in einer Dichte von 1,56 g/ml zur Lösung gegeben, und Ethidiumbromid wird in einer Endkonzentration von 100 µg/ml zur Lösung gegeben. Die Lösung wird in einem Sarvall 865 Rotor (Dupont Co., Newton, CT 06470) oder ähnlichem Vertikalrotor bei 260 000xg für 24 Stunden zentrifigiert. Nach der Zentrifugation wird die Virus DNA Bande isoliert und fünf Mal mit Isoamylalkohol extrahiert, der mit 100 mM Tris-HCl pH = 7,8 gesättigt ist. Die Lösung der BK Virus DNA wird dann gegen TE Puffer dialysiert, bis das 260 nm/ 280 nm Absorptionsverhältnis der DNA zwischen 1,75 und 1,90 liegt. Die DNA wird durch Einstellen der NaCl Konzentration auf 0,15 M, Zugabe von zwei Volumen Ethanol, Inkubation der Lösung bei -70ºC für mindestens 2 Stunden und Zentrifugation der Lösung bei 12 000xg für 10 Minuten gefällt. Das entstehende Pellet an BK Virus DNA wird in TE Puffer in einer Konzentration von 1 mg/ml suspendiert. Eine Restriktions- und Funktionskarte des BK Virus ist in Figur 1 der Zeichnungen dargestellt.

B. Konstruktion von Plasmid pBKneo1

E. coli K12 HB101/pdBPV-MMTneo Zellen werden in lyophilisierter Form von der American Type Culture Collection unter der Hinterlegungsnummer ATCC 37224 erhalten. Die lyophilisierten Zellen werden auf 100 µg/ml Ampicillin enthaltenden LB-Agarplatten ausplattiert und bei 37ºC inkubiert, um Isolate von Einzelkolonien zu erhalten.
Ein Liter 50 µg/ml Ampicillin enthaltendes LB-Medium (10 g Trypton, 10 g NaCl und 5 g Hefeextrakt pro Liter) wird mit einer Kolonie von E. cali K12 HB101/pdBPV-MMTneo beimpft und in einem belüftenden Schüttler bei 37ºC inkubiert, bis die O.D.&sub5;&sub9;&sub0; 1 Absorptionseinheit beträgt, zu welchem Zeitpunkt dann 150 mg Chloramphenicol zur Kultur gegeben werden. Die Inkubation wird für 16 Stunden fortgesetzt, die Chloramphenicolzugabe hemmt die Proteinsynthese und hemmt daher die weitere Zellteilung, aber erlaubt die Fortsetzung der Plasmidreplikation. Die Plasmid pdBPV-MMTneo DNA wird dann aus der Kultur im wesentlichen gemäß dem in Beispiel 1A beschriebenen Verfahren präpariert.
Das 1 mg der durch dieses Verfahren erhaltenen Plasmid pdBPV-MMTneo DNA wird in 1 ml TE Puffer gelöst und bei -20ºC gelagert. Das in Beispiel 1A beschriebene Plasmidisolierungverfahren wird im allgemeinen verwendet, wenn große Mengen an sehr sauberer Plasmid DNA erwünscht sind. Das Verfahren kann modifiziert werden, um schnell eine kleinere, weniger saubere Menge an DNA zu erhalten, wie sie benötigt wird, wenn Transformanden auf das Vorkommen eines bestimmten Plasmids gescreent werden, durch Verwendung von nur etwa 5 ml kultivierter Zellen, Lysieren der Zellen in einer geeignet verringerten Menge Lysepuffer und Ersetzen der Zentrifugationsschritte durch Phenol- und Chloroformextraktionen.
Etwa 5 µg (5 µl) der oben präparierten Plasmid pdBPV-MMTneo DNA und 5 µg (5 µl) der wie oben beschrieben präparierten BK Virus DNA werden jeweils bei 37ºC für 2 Stunden in einer 2 µl 10fach BamHI Puffer (1,5 M NaCl, 60 mM Tris-HCl pH = 7,9 , 60 mM MgCl&sub2; und 1 mg/ml RSA), 1 µl ( 10 Einheiten) Restriktionsenzym BamHI und 7 µl H&sub2;O enthaltenden Lösung verdaut. Die Reaktion wird durch eine Extraktion mit einem gleichen Volumen Phenol, gefolgt von zwei Extraktionen mit Chloroform gestoppt. Jede BamHI-verdaute DNA wird dann gefällt, zentrifugiert und in 5 µl H&sub2;O resuspendiert.
Etwa 1 µl 10fach Ligasepuffer wird zum Gemisch von BamHI- verdauter Plasmid pdBPV-MMTneo (1 µl) und BamHI-verdauter BK Virus DNA (1 µl) gegeben. Nachdem 1 µl ( 5 Einheiten) T4 DNA Ligase und 6 µl H&sub2;O zu dem DNA Gemisch gegeben wurden, wird die entstehende Reaktion bei 16ºC über Nacht inkubiert. Die ligierte DNA besteht aus den gewünschten Plasmiden pBKneol und pBKneo2, die sich nur in Bezug auf die Orientierung der BK Virus DNA unterscheiden. Eine Restriktions- und Funktionskarte van Plasmid pBKneol ist in Figur 1 der Zeichnungen dargestellt.
Die E. coli K12 HB101 Zellen sind in lyophilisierter Form vom Northern Regional Research Laboratory unter der Hinterlegungsnummer NRRL B-15626 erhältlich. Eine 50 ml Kultur von E. coli K12 HB101 wird in LB-Medium bis zu einer optischen Dichte bei 650 nm (O.D.&sub6;&sub5;&sub0;) von etwa 0,4 Absorptionseinheiten wachsen gelassen. Die Kultur wird für zehn Minuten auf Eis gekühlt und dann werden die Zellen durch Zentrifugation geerntet. Das Zellpellet wird in 25 ml kaltem 100 mM MgCl&sub2; resuspendiert und für 25 Minuten auf Eis inkubiert. Die Zellen werden erneut durch Zentrifugation pelletiert und das Pellet wird in 2,5 ml kaltem 100 mM CaCl&sub2; resuspendiert und für 30 Minuten auf Eis inkubiert. Nach der Inkubation sind die Zellen zur Aufnahme transformierender DNA kompetent.
Zweihundert µl dieser Zellsuspension werden mit der oben hergestellten ligierten DNA gemischt und für 30 Minuten auf Eis inkubiert. Am Ende dieser Zeitspanne werden die Zellen für 2 Minuten in ein Wasserbad bei 42ºC gestellt und dann für weitere 10 Minuten auf das Eis zurückgestellt. Die Zellen werden zentrifugiert und in einem ml LB-Medium resuspendiert und bei 37ºC für 1 Stunde inkubiert. Die transformierten Zellen werden auf 100 µg/ml Ampicillin enthaltende LB-Agarplatten ausplattiert. Die E. coli K12 HB101/pBKneol und E. coli K12 HB101/pBKneo2 Transformanden werden durch ihren ampicillinresistenten Phänotyp und durch Restriktionsanalyse ihrer Plasmid DNA identifiziert. Eine Restriktions- und Funktionskarte von Plasmid pBKneo1 ist in Figur 1 Teil A der Zeichnungen dargestellt.

C. Konstruktion von Plasmid pLPcat, ein zur Konstruktion von Plasmid pBLcat als Zwischenstufe verwendetes Plasmid

Die Virionen DNA von Adenovirus 2 (Ad2) ist ein doppelsträngiges, lineares Molekül mit einer Größe von etwa 35,94 kb. Der späte Ad2 Promotor kann auf einem 0,32 kb AccI-PvuII Restriktionsfragment des Ad2 Genoms isoliert werden, wobei dieses 0,32 kb Restriktionsfragment der Sequenz zwischen den Nukleotidpositionen 5755 und 6071 des Ad2 Genoms entspricht. Um das gewünschte 0,32 kb AccI-PvuII Restriktionsfragment zu isolieren, wird die Ad2 DNA zuerst mit dem Restriktionsenzym BalI verdaut und das 2,4 kb BalI Restriktionsfragment, das die gesamte Sequenz des 0,32 kb Accl-PvuII Restriktiansfragments enthält, wird isoliert. Dann wird das 2,4 kb Ball Restriktionsfragment mit AccI und PvuII verdaut, um das gewünschte Fragment zu erhalten.
Etwa 50 µg Ad2 DNA (erhältlich von BRL) werden in 80 µl H&sub2;O und 10 µl 10fach BalI Puffer (100 mM Tris-HCl pH = 7,6, 120 mM MgCl&sub2;, 100 mM DTT und 1 mg/ml RSA) gelöst. Etwa 10 µl ( 20 Einheiten) des Restriktiansenzyms BalI werden zu der Ad2 DNA Lösung gegeben und die entstehende Reaktion wird bei 37ºC für 4 Stunden inkubiert.
Die BalI-verdaute DNA wird auf ein Agarosegel aufgetragen und einer Elektropharese unterzogen, bis die Restriktionsfragmente gut getrennt sind. Die Sichtbarmachung der DNA nach der Elektrophorese wird durch Färben des Gels in einer verdünnten Lösung (0,5 g/ml) Ethidiumbromid und durch Aussetzen des angefärbten Gels gegenüber langwelligem, ultraviolettem Licht (UV) erreicht. Ein Verfahren, DNA aus Agarose zu isolieren ist folgendes. Ein kleiner Schlitz wird im Gel vor dem gewünschten Fragment gemacht und ein kleines Stück NA-45 DEAE Membran (Schleicher und Schuell, Keene, NH 03431) wird in jeden Schlitz gesteckt. Nach weiterer Elektrophorese bindet die DNA nicht-kovalent an die DEAE Membran. Nachdem das gewünschte Fragment an die DEAE Membran gebunden ist, wird die Membran entfernt und mit Niedrigsalzpuffer (100 mM KCl, 0,1 mM EDTA und 20 mM Tris-HCl pH = 8,0) gewaschen. Als nächstes wird die Membran in ein kleines Röhrchen gesteckt, in Hochsalzpuffer (1 M NaCl, 0,1 mM EDTA und 20 mM Tris-HCl pH = 8) getaucht und dann bei 65ºC für eine Stunde inkubiert, um die DNA vom DEAE Papier zu entfernen. Nach der 65ºC Inkubation wird der Inkubationspuffer gesammelt, und die Membran wird mit Hochsalzpuffer gewaschen. Die Hochsalzwaschlösung wird mit dem Hochsalzinkubationspuffer vereinigt.
Das Volumen der Hochsalz-DNA-Lösung wird so eingestellt, daß die NaCl Konzentration 0,25 M beträgt und dann werden drei Volumen kalter, absoluter Ethanol zu der Lösung gegeben. Die entstehende Lösung wird gemischt und bei -70ºC für 10-20 Minuten stehengelassen. Die Lösung wird dann bei 15 000 Upm für 15 Minuten zentrifugiert. Nach einer weiteren Fällung zur Entfernung des restlichen Salzes wird das DNA Pellet mit Ethanol gewaschen, getrocknet, in 20 µl TE Puffer resupendiert und enthält etwa 3 µg des gewünschten Restriktionsfragments van Ad2. Das erhaltene gereinigte Fragment wird in 10 µl TE Puffer gelöst.
Etwa 6 µl H&sub2;O und 2 µl 10fach AccI Puffer (60 mM NaCl, 60 mM Tris-HCl pH = 7,5, 60 mM MgCl&sub2;, 60 mM DTT und 1 mg/ml RSA) werden zu der Lösung des 2,4 kb BalI Restriktionsfragments von Ad2 gegeben. Nach der Zugabe von etwa 2 µl ( 10 Einheiten) Restriktionsenzym AccI zu der DNA Lösung wird die Reaktion bei 37ºC für 2 Stunden inkubiert. Nach dem AccI Verdau wird die DNA durch Ethanolfällung gesammelt und in 16 µl H&sub2;O und 2 µl 10fach PvuII Puffer (600 mM NaCl, 60 mM Tris-HCl pH = 7,5, 60 mM MgCl&sub2;, 60 mM DTT und 1 mg/ml RSA) resuspendiert. Nach der Zugabe von etwa 2 µl (etwa 10 Einheiten) Restriktionsenzym PvuII zur DNA Lösung wird die Reaktion bei 37ºC für 2 Stunden inkubiert.
Das AccI-PvuII-verdaute, 2,4 kb BalI Restriktionsfragment von Ad2 wird auf ein 6 %iges Polyacrylamidgel aufgetragen und einer Elektrophorese unterzogen, bis das 0,32 kb AccI-PvuII Restriktionsfragment, das den späten Ad2 Promotor enthält, von den anderen Produkten des Verdaus abgetrennt ist. Das Gel wird mit Ethidiumbromid gefärbt und mittels UV Licht betrachtet, und der Teil des Gels, der das 0,32 kb AccI-PvuII Restriktionsfragment enthält, wird aus dem Gel ausgeschnitten, zerkleinert und über Nacht bei Raumtemperatur in 250 µl Extraktionspuffer (500 mM NH&sub4;OAc, 10 mM MgOAc, 1 mM EDTA und 0,1 % SDS) getränkt. Am folgenden Morgen wird das Gemisch zentrifugiert, und das Pellet wird verworfen. Die DNA im Überstand wird mit Ethanol gefällt, etwa 2 µg tRNA werden zugegeben, um eine vollständige Fällung des gewünschten Fragments sicherzustellen. Etwa 0,2 µg des 0,32 kb AccI-PvuII Restriktiansfragments werden erhalten und in 7 µl H&sub2;O suspendiert.
Um das AccI-PvuII Restriktionsfragment in ein AccI-BclI Restriktionsfragment umzuwandeln, werden BclI Linker an das 0,32 kb AccI-PvuII Restriktionsfragment ligiert. Da die BclI Linker stumpfendig sind, hängen sich die Linker nur an das PvuII Ende des Restriktionsfragments an. Die BclI Linker (New England Biolabs), die die folgende Sequenz aufweisen
werden phosphoryliert und zur Ligation durch das folgende Verfahren vorbereitet. Vier µl Linker ( 2 µg) werden in 20,15 µl H&sub2;O und 5 µl 10fach Kinasepuffer (500 mM Tris-HCl pH = 7,6 und 100 mM MgCl&sub2;) gelöst, bei 90ºC für zwei Minuten inkubiert und dann auf Raumtemperatur abgekühlt. Fünf µl gamma-³²P-ATP ( 20 µCi), 2,5 µl 1 M DTT und 5 µl Polynukleotidkinase ( 10 Einheiten) werden zu dem Gemisch gegeben, das dann bei 37ºC für 30 Minuten inkubiert wird. Dann werden 3,35 µl 0,01 M ATP und 5 µl Kinase zugegeben und die Reaktion wird für weitere 30 Minuten bei 37ºC fortgesetzt. Das radioaktive ATP hilft festzustellen, ob die Linker mit der Ziel-DNA ligiert haben.
Etwa 0,25 µg (in 0,5 µl) der phosphorylierten BclI Linker werden zu der Lösung des 0,32 kb AccI-PvuII Restriktionsfragments gegeben, dann werden 1 µl ( 1 000 Einheiten) T4 DNA Ligase und 1 µl 10fach Ligasepuffer zur DNA Lösung gegeben und die entstehende Reaktion wird bei 16ºC über Nacht inkubiert. Die BclI Linker können nur mit dem PvuII Ende des AccI-PvuII Restriktionsfragments ligieren. Eine DNA Sequenzierung zeigte später, daß vier BclI Linker an das PvuII Ende des AccI-PvuII Restriktionsfragments angehängt wurden. Diese zusätzlichen BclI Linker können durch BclI Verdau und Religation entfernt werden, die zusätzlichen BclI Linker wurden jedoch nicht entfernt, da die Linker das korrekte Funktionieren der die zusätzlichen Linker enthaltenden Vektoren nicht beeinträchtigen.
Die E. coli K12 HB101/pSV2cat Zellen werden in lyophilisierter Form von der ATCC unter der Hinterlegungsnummer ATCC 37155 erhalten und die Plasmid pSV2cat DNA wird aus diesen Zellen im wesentlichen gemäß dem Verfahren von Beispiel 1A isoliert, außer daß 50 µg/ml Ampicillin anstelle von Tetracyclin verwendet werden. Eine Restriktions- und Funktionskarte von Plasmid pSV2cat ist in Figur 1 Teil B der Zeichnungen dargestellt. Etwa 1 mg der Plasmid pSV2cat DNA wird erhalten und in 1 ml TE Puffer gelöst. Etwa 3 µg (3 µl) der Plasmid pSV2cat DNA werden zu 2 µl 10fach AccI Puffer und 16 µl H&sub2;O gegeben und dann werden 3 µl (etwa 9 Einheiten) Restriktionsenzym AccI zur pSV2cat DNA Lösung gegeben und die entstehende Reaktion wird bei 37ºC für 2 Stunden inkubiert. Die AccI- verdaute Plasmid pSV2cat DNA wird dann mit dem Restriktionsenzym StuI durch Zugabe von 3 µl 10fach Stul Puffer (1,0 M NaCl, 100 mM Tris-HCl pH = 8,0, 100 mM MgCl&sub2;, 60 mM DTT und 1 mg/ml RSA), 5 µl H&sub2;O und etwa 2 µl (etwa 10 Einheiten) Restriktionsenzym StuI verdaut. Die entstehende Reaktion wird bei 37ºC für 2 Stunden inkubiert. Die Reaktion wird durch Extraktion des Reaktionsgemisches einmal mit Phenol und dann zweimal mit Chloroform beendet. Etwa 0,5 µg des gewünschten Fragments werden erhalten und in 20 µl TE Puffer gelöst.
Etwa 4 µl der AccI-StuI-verdauten Plasmid pSV2cat DNA werden mit etwa 7 µl des 0,32 kb AccI-PvuII Restriktionsfragments von Ad2 (mit angehängten BclI Linkern) gemischt und nach der Zugabe von 3 µl 10fach Ligasepuffer, 15 µl H&sub2;O und 2 µl (etwa 1 000 Einheiten) T4 DNA Ligase wird die Ligationsreaktion bei 16ºC über Nacht inkubiert. Die ligierte DNA besteht aus dem gewünschten Plasmid pLPcat, einem Plasmid, das den späten Ad2 Promator zur Transkriptionssteuerung und daher zur Expression des Chloramphenicol-Acetyltransferasegens positioniert enthält. Eine Restriktions- und Funktionskarte von Plasmid pLPcat ist in Figur 1 Teil B der Zeichnungen dargestellt.
Die ligierte DNA wird zur Transformation von E. coli K12 HB101 Zellen im wesentlichen gemäß dem Verfahren von Beispiel 2B verwendet. Die transformierten Zellen werden auf 50 µg/ml Ampicillin enthaltende LB-Agarplatten ausplattiert, und die Restriktionsanalyse der Plasmid DNA wird zur Identifizierung der E. coli K12 HB101/pLPcat Transformanden verwendet. Die Plasmid pLPcat DNA wird dann von den Transformanden für anschließende Konstruktionen im wesentlichen gemäß dem in Beispiel 1A beschriebenen Plasmidisolierungsverfahren isoliert, außer daß Ampicillin als selektives Mittel anstelle von Tetracyclin verwendet wird.

D. Konstruktion von Plasmid pBLcat

Etwa 88 µg Plasmid pBKneo1 DNA in 50 µl TE Puffer werden zu 7,5 µl 10fach AccI Puffer, 30 µl H&sub2;O und 15 µl (etwa 75 Einheiten) Restriktionsenzym AccI gegeben und die entstehende Reaktion wird bei 37ºC für 2 Stunden inkubiert. Die AccI-verdaute Plasmid pB- Kneo1 DNA wird auf ein Agarosegel aufgetragen und das 1,4 kb Fragment, das den BK Enhancer enthält, wird von den anderen Produkten des Verdaus abgetrennt. Das 1,4 kb AccI Restriktionsfragment wird dann aus dem Gel isoliert und gereinigt. Etwa 5 µg des Fragments werden in 5 µl 10fach PvuII Puffer, 45 µl H&sub2;O und 5 µl (etwa 25 Einheiten) Restriktionsenzym PvuII resuspendiert und die entstehende Reaktion wird bei 37ºC für 2 Stunden inkubiert. Die PvuII-verdaute DNA wird dann isoliert, gereinigt und zur Ligation vorbereitet. Etwa 2 µg des gewünschten 1,28 kb AccI-PvuII Fragments werden erhalten und in 5 µl TE Puffer gelöst.
Etwa 1 µg Plasmid pLPcat DNA wird in 5 µl 10fach AccI Puffer und 40 µl H&sub2;O gelöst. Etwa 5 µl ( 25 Einheiten) Restriktionsenzym AccI werden zur Plasmid pLPcat DNA Lösung gegeben und die entstehende Reaktion wird bei 37ºC inkubiert. Die AccI-verdaute Plasmid pLPcat DNA wird mit Ethanol gefällt und in 5 µl 10fach StuI Puffer, 40 µl H&sub2;O und 5 µl (etwa 25 Einheiten) Restriktionsenzym StuI resuspendiert und die entstehende Reaktion wird bei 37ºC für 2 Stunden inkubiert. Die AccI-StuI-verdaute Plasmid pLPcat DNA wird einige Male mit Ethanol gefällt, um das 4,81 kb AccI-StuI Restriktionsfragment, das den E. coli Replikationsursprung und den späten Ad2 Promotor enthält, von dem anderen Produkt des Verdaus, einem etwa 16 bp großen Restriktionsfragment zu trennen. Etwa 1 µg des gewünschten 4,81 kb Restriktionsfragments wird erhalten und in 20 µl TE Puffer gelöst.
Die 5 µl des 4,81 kb AccI-StuI Restriktionsfragments von Plasmid pLPcat werden zu 5 µl des 1,28 kb AccI-PvuII Restriktionsfragments des Plasmids pBKneo1 gegeben. Nach der Zugabe von 3 µl 10fach Ligasepuffer, 15 µl H&sub2;O und 2 µl (etwa 10 Einheiten) T4 DNA Ligase zum DNA Gemisch wird die entstehende Ligationsreaktion über Nacht bei 16ºC inkubiert. Die ligierte DNA besteht aus dem gewünschten Plasmid pBLcat. Eine Restriktions- und Funktionskarte von Plasmid pBLcat ist in Figur 1 Teil C der Zeichnungen dargestellt.
Die ligierte DNA wird zur Transformation von E. coli K12 HB101 Zellen im wesentlichen gemäß dem in Beispiel 2B beschriebenen Verfahren verwendet. Die E. coli K12 HB101/pBLcat Transformanden werden durch Restriktionsanalyse ihrer Plasmid DNA identifiziert. Die Plasmid pBLcat DNA wird für anschließende Konstruktionen im wesentlichen gemäß dem in Beispiel 1A beschriebenen Verfahren präpariert, außer daß Ampicillin als selektives Mittel anstelle von Tetracyclin verwendet wird.

E. Konstruktion von Plasmid pL133

Das Plasmid pL133 ist ein Expressionsvektor von humanem Protein C. Wie unten beschrieben, kann das Plasmid pL133 konstruiert werden, indem man mittels der als Ausgangsvektoren verwendeten Plasmide pSVgpt und pHC7 (die Herstellung von Plasmid pHC7 ist oben in Beispiel 1A beschrieben) das als Zwischenstufe benötigte Plasmid pSV2-HPC8 konstruiert, das dann mit Plasmid pSV2-β-globin unter Bildung von Plasmid pL133 kombiniert wird. Das Konstruktiansprotokoll für das Plasmid pL133 ist unten im Detail beschrieben und schematisch in Figur 2 der Zeichnungen gezeigt.
Fünfzig µl ( 50 µg) Plasmid pHC7 DNA werden mit 5 µl ( 50 Einheiten) Restriktionsenzym BanI, 10 µl 10fach BanI Reaktionspuffer (1,5 M NaCl, 60 mM Tris-HCl pH = 7,9, 60 mM MgCl&sub2; und 1 mg/ml RSA) und 35 µl H&sub2;O gemischt und bis zur Vollständigkeit des Verdaus inkubiert. Die BanI-verdaute Plasmid pHC7 DNA wird dann auf einem 3,5 %igen Polyacrylamidgel (29:1 Acrylamid : Bisacrylamid) einer Elektropharese unterzogen, bis das 1,25 kb BanI Restriktionsfragment von den anderen Produkten des Verdaus abgetrennt ist.
Der das 1,25 kb BanI Restriktionsfragment enthaltende Teil des Gels wird aus dem Gel ausgeschnitten, in ein Probenröhrchen gegeben und in kleine Stücke gebrochen. Ein ml Extraktionspuffer (500 mM NH&sub4;OAc, 10 mM MgOAc, 1 mM EDTA, 1 % SDS und 10 mg/ml tRNA) wird in das die Fragmente enthaltende Röhrchen gegeben. Das Röhrchen wird über Nacht bei 37ºC inkubiert. Der Zelldebris wird durch Zentrifugation pelletiert und der Überstand wird in ein neues Röhrchen überführt. Der Zelldebris wird einmal mit 200 µl Extraktionspuffer gewaschen und der Waschüberstand wird mit dem ersten Überstand der Übernachtextraktion vereinigt. Nachdem der Überstand durch einen Stopfen Glaswolle gedrückt wurde, werden zwei Volumen Ethanol zugegeben und mit dem Überstand vermischt. Die entstehende Lösung wird für 10 Minuten in ein Trockeneis-Ethanolbad gestellt und dann wird die DNA durch Zentrifugation pelletiert.
Ungefähr 8 µg des 1,25 kb BanI Restriktionsfragments werden durch dieses Verfahren erhalten. Das gereinigte Fragment wird in 10 µl TE Puffer suspendiert und bei -20ºC gelagert. Das BanI Restriktionsfragment muß durch die Anfügung eines Linkers modifiziert werden, um das Plasmid pSV2-HPC8 zu konstruieren. Die zur Konstruktion des Linkers verwendeten DNA Fragmente werden entweder mittels eines Systec 1450A DNA Synthesizers (Systec Inc., 3816 Chandler Drive, Minneapolis, MN) oder eines ABS 380A DNA Synthesizers (Applied Biosystems, Inc., 850 Lincoln Centre Drive, Foster City, CA 94404) synthetisiert. Es sind viele DNA synthetisierende Geräte in der Technik bekannt und können zur Herstellung der Fragmente verwendet werden. Zusätzlich können die Fragmente auch herkömmlich im wesentlichen gemäß den Verfahren von Itakura et al., 1977, Science, 198:1056 und Crea et al., 1978 Proc. Nat. Acad. Sci. USA 75:5765 hergestellt werden.
Fünfhundert Picomol jedes Einzelstrangs des Linkers werden in 20 µl Reaktionspuffer phosphoryliert, der 15 Einheiten ( 0,5 µl) T4 Polynukleotidkinase, 2 µl 10fach Ligasepuffer, 10 µl 500 µM ATP und 7,5 µl H&sub2;O enthält. Die Kinasereaktion wird bei 37ºC für 30 Minuten inkubiert und die Reaktion wird durch eine zehnminütige Inkubation bei 100ºC beendet. Um die Vollständigkeit der Phosphorylierung sicherzustellen, wird die Reaktion auf Eis gekühlt, 2 µl 0,2 M Dithiothreit, 2,5 µl 5 mM ATP und 15 Einheiten T4 Polynukleotidkinase werden zum Reaktionsgemisch gegeben und vermischt und das Reaktionsgemisch wird für weitere 30 Minuten bei 37ºC inkubiert. Die Reaktion wird durch eine weitere zehnminütige Inkubation bei 100ºC gestoppt und dann auf Eis gekühlt.
Obwohl sie getrennt phosphoryliert wurden, werden die zwei Einzelstränge des DNA Linkers nach der Phosphorylierungsreaktion zusammengemischt. Um die zwei Stränge zu anelieren, wird das Phosphorylierungsreaktionsgemisch für 10 Minuten in einem Wasserbad mit 150 ml Wasser bei 100ºC inkubiert. Nach dieser Inkubation wird das Wasserbad abgestellt und man läßt es auf Raumtemperatur abkühlen, ein Vorgang, der etwa 3 Stunden dauert. Das Wasserbad, das immer noch das Röhrchen der phosphorylierten DNA enthält, wird dann über Nacht bei 4ºC inkubiert. Dieses Verfahren aneliert die beiden Einzelstränge. Der konstruierte Linker besitzt die folgende Struktur:
Der Linker wird bis zur Verwendung bei -20ºC gelagert.
Die 8 µg des 1,25 kb BanI Fragments werden zu 50 µl Linker ( 500 Picomol), 1 µl T4 DNA Ligase ( 5 Einheiten), 10 µl 10fach Ligasepuffer und 29 µl H&sub2;O gegeben, mit diesen vermischt und die entstehende Reaktion wird bei 4ºC über Nacht inkubiert. Die Ligationsreaktion wird durch eine zehnminütige Inkubation bei 65ºC gestoppt. Die DNA wird durch Zugabe von NaOAc bis zu einer Endkonzentration von 0,3 M, Zugabe von zwei Volumen Ethanol, Kühlung in einem Trockeneis-Ethanolbad und anschließende Zentrifugation der Lösung pelletiert.
Das DNA Pellet wird in 10 µl 10fach ApaI Reaktionspuffer (60 mM NaCl, 60 mM Tris-HCl, pH = 7,µl 60 mM MgCl&sub2; und 60 mM 2-Mercaptoethanol), 5 µl ( 50 Einheiten) Restriktionsenzym ApaI und 85 µl H&sub2;O gelöst und die Reaktion wird bei 37ºC für 2 Stunden stehengelassen. Die Reaktion wird gestoppt und die DNA wie oben pelletiert. Das DNA Pellet wird in 10 µl 10fach HindIII Reaktionspuffer, 5 µl ( 50 Einheiten) Restriktionsenzym HindIII und 85 µl H&sub2;O gelöst und die Reaktion wird bei 37ºC für 2 Stunden stehengelassen. Nach dem HindIII Verdau wird das Reaktionsgemisch auf ein 3,5 %iges Polyacrylamidgel aufgetragen und das gewünschte 1,23 kb HindIII-ApaI Restriktionsfragment wird aus dem Gel isoliert und gereinigt. Ungefähr 5 µg des gewünschten Fragments werden erhalten, in 10 µl TE Puffer suspendiert und bei -20ºC gelagert.
Fünfzig µl ( 50 µg) der Plasmid pHC7 DNA werden mit 5 µl ( 50 Einheiten) Restriktionsenzym PstI, 10 µl 10fach PstI Reaktionspuffer (1,0 M NaCl, 100 mM Tris-HCl pH = 7,5, 100 mM MgCl&sub2; und 1 mg/ml RSA) und 35 µl H&sub2;O gemischt und bei 37ºC für 2 Stunden inkubiert. Die PstI-verdaute Plasmid pHC7 DNA wird dann auf einem 3,5 %igen Polyacrylamidgel einer Elektrophorese unterzogen und das gewünschte 0,88 kb Fragment wird im wesentlichen gemäß dem oben beschriebenen Verfahren gereinigt. Ungefähr 5 µg des gewünschten Fragments werden erhalten, in 10 µl TE Puffer gelöst und bei -20ºC gelagert.
Die 5 µg des 0,88 kb PstI Fragments werden zu 50 µl des folgenden Linkers gegeben und mit diesem vermischt, der auf einem automatisierten DNA Synthesizer hergestellt wurde:
Etwa 1 µl T4 DNA Ligase ( 10 Einheiten), 10 µl 10fach Ligasepuffer und 29 µl H&sub2;O werden zum DNA Gemisch gegeben und die entstehende Ligationsreaktion wird bei 4ºC über Nacht inkubiert.
Die Ligationsreaktion wird durch eine zehnminütige Inkubation bei 65ºC gestoppt. Nach der Fällung der ligierten DNA wird das DNA Pellet in 10 µl 10fach ApaI Reaktionspuffer, 5 µl ( 50 Einheiten) Restriktionsenzym ApaI und 85 µl H&sub2;O gelöst und die Reaktion wird für zwei Stunden bei 37ºC stehengelassen. Die Reaktion wird dann gestoppt und die DNA erneut pelletiert. Das DNA Pellet wird in 10 µl 10fach BglII Reaktionspuffer (1 M NaCl, 100 mM Tris- HCl pH = 7,4, 100 mM MgCl&sub2;, 100 mM 2-Mercaptoethanol und 1 mg/ml RSA), 5 µl ( 50 Einheiten) Restriktionsenzym BglII und 85 µl H&sub2;O gelöst und die Reaktion wird bei 37ºC für 2 Stunden stehengelassen. Nach dem BglII Verdau wird das Reaktionsgemisch auf ein 3,5 %iges Polyacrylamidgel aufgetragen und das gewünschte 0,19 kb ApaI-BgII Restriktionsfragment wird im wesentlichen gemäß dem oben beschriebenen Verfahren isoliert. Ungefähr 1 µg des gewünschten Fragments wird erhalten, in 10 µl TE Puffer suspendiert und bei -20ºC gelagert.
Ungefähr 10 µg Plasmid pSV2gpt DNA (ATCC 37145) werden in 10 µl 10fach HindIII Reaktionspuffer, 5 µl ( 50 Einheiten) Restriktionsenzym HindIII und 85 µl H&sub2;O gelöst und die Reaktion wird für zwei Stunden bei 37ºC stehengelassen. Das Reaktionsgemisch wird dann auf 0,25 M NaOAc gebracht und nach der Zugabe von zwei Volumen Ethanol und einer Inkubation in einem Trockeneis-Ethanolbad wird die DNA durch Zentrifugation pelletiert. Das DNA Pellet wird in 10 µl 10fach BglII Puffer, 5 µl ( 50 Einheiten) Restriktionsenzym BglII und 85 µl H&sub2;O gelöst und die Reaktion wird für 2 Stunden bei 37ºC stehengelassen. Nach dem BglII Verdau wird das Reaktionsgemisch auf ein 1 %iges Agarosegel aufgetragen und die Fragmente werden durch Elektrophorese getrennt. Das Gel wird mit Ethidiumbromid gefärbt, unter ultraviolettem Licht betrachtet und die das gewünschte 5,1 kb HindIII-BglII Fragment enthaltende Bande wird aus dem Gel ausgeschnitten, in einen Dialyseschlauch gebracht und die Elektrophorese wird fortgesetzt, bis die DNA aus der Agarose herausgekommen ist. Der die DNA enthaltende Puffer aus dem Dialyseschlauch wird mit Phenol und CHCl&sub3; extrahiert und dann wird die DNA gefällt. Das Pellet wird in 10 µl TE Puffer suspendiert und besteht aus 5 µg des gewünschten 5,1 kb HindIII-BglII Restriktionsfragments von Plasmid pSV2gpt.
Zwei µl des 1,23 kb HindIII-ApaI Restriktionsfragments, 3 µl des 0,19 kb ApaI-BglII Fragments und 2 µl des 5,1 kb HindIII-BglII Fragments werden zusammengemischt und dann mit 10 µl 10fach Ligasepuffer, 1 µl T4 DNA Ligase ( 500 Einheiten) und 82 µl H&sub2;O bei 16ºC über Nacht inkubiert. Die ligierte DNA besteht aus dem gewünschten Plasmid pSV2-HPC8 und eine Restriktions- und Funktionskarte des Plasmids ist in Figur 2 der Zeichnungen dargestellt.
E. coli K12 RR1 (NRRL B-15210) Zellen werden im wesentlichen gemäß dem für E. coli K12 HB101 in Beispiel 2B beschriebenen Verfahren zur Transformation kompetent gemacht. Die oben präparierte ligierte DNA wird zur Transformation der Zellen verwendet und Teile des Transformationsgemisches werden auf 100 µg/ml Ampicillin enthaltende LB-Agarplatten ausplattiert. Die Platten werden dann bei 37ºC inkubiert. Die E. coli K12 RR1/pSV2-HPCB Transformanden werden durch Restriktionsanalyse ihrer Plasmid DNA verifiziert. Die Plasmid pSV2-HPC8 DNA wird im wesentlichen gemäß dem Verfahren von Beispiel 1A aus den Transformanden präpariert, außer daß Ampicillin und nicht Tetracyclin als selektives Mittel während der Zellkultivierung verwendet wird.
Fünfzig µg von Plasmid pSV2-HPC8 werden in 10 µl 10fach HindIII Reaktionspuffer, 5 µl ( 50 Einheiten) Restriktionsenzym HindIII und 85 µl H&sub2;O gelöst und die Reaktion wird bei 37ºC für zwei Stunden inkubiert. Nach dem HindIII Verdau wird die DNA gefällt und das DNA Pellet wird in 10 µl 10fach SaII Reaktionspuffer (1,5 M NaCl, 60 mM Tris-HCl pH = 7,9, 60 mM MgCl&sub2;, 60 mM 2-Mercaptoethanol und 1 mg/ml RSA), 5 µl ( 50 Einheiten) Restriktionsenzym SalI und 85 µl H&sub2;O gelöst. Die entstehende SalI Reaktionsmischung wird für 2 Stunden bei 37ºC inkubiert. Das HindIII-SalI-verdaute Plasmid pSV2-HPC8 wird auf ein 3,5 %iges Polyacrylamidgel aufgetragen und einer Elektrophorese unterzogen, bis das gewünschte 0,29 kb HindIII-SalI Restriktionsfragment von den anderen Produkten der Reaktion abgetrennt ist. Das gewünschte Fragment wird aus dem Gel isoliert, etwa 2 µg des Fragments werden erhalten und in 10 µl TE Puffer gelöst.
Fünfzig µg Plasmid pSV2-HP08 werden in 10 µl 10fach BglII Reaktionspuffer, 5 µl (50 Einheiten) Restriktionsenzym BglII und 85 µl H&sub2;O gelöst und die Reaktion wird bei 37ºC für 2 Stunden inkubiert. Nach dem BglII Verdau wird die DNA gefällt und das DNA Pellet wird in 10 µl 10fach SalI Reaktionspuffer, 5 µl ( 50 Einheiten) Restriktionsenzym SalI und 85 µl H&sub2;O gelöst. Das entstehende SalI Reaktionsgemisch wird für 2 Stunden bei 37ºC inkubiert. Das SalI-BglII-verdaute Plasmid pSV2-HPC8 wird auf ein 3,5 %iges Polyacrylamidgel aufgetragen und einer Elektrophorese unterzogen, bis das gewünschte 1,15 kb SalI-BglII Restriktionsfragment von den anderen Reaktionsprodukten abgetrennt ist. Das 1,15 kb SalI- BglII Restriktionsfragment wird aus dem Gel isoliert, etwa 8 µg des Fragments werden erhalten und in 10 µl TE Puffer gelöst.
Ungefähr 10 µg der Plasmid pSV2-β-Globin DNA (NRRL B-15928) werden in 10 µl 10fach HindIII Reaktionspuffer, 5 µl ( 50 Einheiten) Restriktionsenzym HindIII und 85 µl H&sub2;O gelöst und die Reaktion wird bei 37ºC für zwei Stunden stehengelassen. Das Reaktionsgemisch wird dann auf 0,25 M NaOAc gebracht und nach der Zugabe von zwei Volumen Ethanol und der Inkubation in einem Trockeneis- Ethanolbad wird die DNA durch Zentrifugation pelletiert. Das HindIII- verdaute Plasmid pSV2-β-Globin wird in 10 µl 10fach BglII Puffer, 5 µl ( 50 Einheiten) Restriktionsenzym BglII und 85 µl H&sub2;O gelöst und die Reaktion wird bei 37ºC für zwei Stunden stehengelassen. Nach dem BglII Verdau wird das Reaktionsgemisch auf ein 1 -%iges Agarosegel aufgetragen und die Fragmente werden durch Elektrophorese getrennt. Das gewünschte 4,2 kb HindIII-BglII Restriktionsfragment wird aus dem Gel isoliert, etwa 5 µg des gewünschten Fragments werden erhalten und in 10 µl TE Puffer suspendiert.
Zwei µl des 0,29 kb HindIII-SalI Fragments von Plasmid pSV2-HPC8, 2 µl des 1,15 kb SalI-BglII Fragments von Plasmid pSV2-HPC8 und 2 µl des 4,2 kb HindIII-BglII Fragments von Plasmid pSV2-β-Globin werden zusammengemischt und mit T4 DNA Ligase ligiert. Die ligierte DNA besteht aus dem gewünschten Plasmid pL133 und eine Restriktions- und Funktionskarte von Plasmid pL133 ist in Figur 2 der Zeichnungen dargestellt. Die ligierte DNA wird zur Transformation von E. coli K12 RR1 verwendet und die gewünschten E. coli K12 RR1/pL133 Transformanden werden durch ihren ampicillinresistenten Phänotyp und durch Restriktionsanalyse ihrer Plasmid DNA identifiziert.

F. Konstruktion von Plasmid DLPC aus den Plasmiden pL133 und pBLcat

Etwa 20 µg Plasmid pBLcat DNA werden in 10 µl 10fach HindIII Puffer und 80 µl H&sub2;O gelöst. Etwa 10 µl ( 100 Einheiten) Restriktionsenzym HindIII werden zu der Plasmid pBLcat DNA Lösung gegeben und die entstehende Reaktion wird bei 37ºC für 2 Stunden inkubiert. Die HindIII-verdaute Plasmid pBLcat DNA wird auf ein Agarosegel aufgetragen und einer Elektraphorese unterzogen, bis das 0,87 kb HindIII Restriktionsfragment, das den BK Enhancer und den späten Ad2 Promator enthält, von den anderen Produkten des Verdaus abgetrennt ist, dann wird das 0,87 kb Fragment isoliert, gereinigt und zur Ligation vorbereitet. Etwa 2 µg des gewünschten Fragments werden erhalten und in 5 µl TE Puffer gelöst.
Etwa 1,5 µg Plasmid pL133 DNA werden in 2 µl 10fach HindIII Puffer und 16 µl H&sub2;O gelöst. Etwa 1 µl ( 10 Einheiten) Restriktionsenzym HindIII wird zur DNA Lösung gegeben und die entstehende Reaktion wird bei 37ºC für 2 Stunden inkubiert. Die DNA wird dann auf 100 µl mit TE Puffer verdünnt und mit 0,06 Einheiten alkalischer Phosphatase aus dem Kälberdarm behandelt und die entstehende Reaktion wird bei 37ºC für 30 Minuten inkubiert. Die Lösung wird auf einfachen SET (5 mM Tris-HCl pH = 7,8, 5 mM EDTA und 150 mM NaCl), 0,3 M NaOAc und 0,5 % SDS gebracht und dann bei 65ºC für 45 Minuten inkubiert. Die HindIII-verdaute Plasmid pL133 DNA wird zwei Mal mit Phenol und einmal mit Chloroform extrahiert, mit Ethanol gefällt und in 10 µl TE Puffer resuspendiert.
Etwa 5 µl des 0,87 kb HindIII Restriktionsfragments von Plasmid pBLcat werden zu den 1,5 µg (10 µl) des HindIII-verdauten Plasmids pL133 gegeben und dann werden 2 µl 10fach Ligasepuffer, 1 µl ( 10 Einheiten) T4 DNA Ligase und 2 µl H&sub2;O zur DNA Lösung gegeben und die entstehende Reaktion wird bei 16ºC über Nacht inkubiert. Die ligierte DNA besteht aus dem gewünschten Plasmid pLPC.
Die ligierte DNA wird im wesentlichen gemäß dem Verfahren von Beispiel 2B zur Transformation von E. coli K12 HB101 verwendet. Die transformierten Zellen werden auf Ampicillin enthaltende LB-Agarplatten ausplattiert und die Plasmid DNA der ampicillinresistenten Transformanden wird durch Restriktionsanalyse untersucht, um die E. coli K12 HB101/pLPC Transformanden zu identifizieren. Das 0,87 kb HindIII Restriktionsfragment, das den BK Enhancer und den späten Ad2 Promotor kodiert, kann in beiden Orientierungen in das HindIII-verdaute Plasmid pL133 inserieren, wobei nur eine davon das Plasmid pLPC ergibt. Eine Restriktions- und Funktionskarte von Plasmid pLPC ist in Figur 1 Teil D der Zeichnungen dargestellt.

Beispiel 3

Die Konstruktion von Plasmid pLPC-167G

Das Plasmid pLPC-167G wird im wesentlichen gemäß dem Protokoll für die ortspezifische Mutagenese und anderer zur Konstruktion von Plasmid pLAPC verwendeter Konstruktionsprotokolle, wie in Beispiel 1 beschrieben, konstruiert. Die zur Konstruktion von Plamid pLPC-167G verwendeten Puffer und Anelierungsbedingungen sind jedoch von Zoller und Smith, 1984, DNA 3:479-489 beschrieben.
Bei der Konstruktion van Plasmid pLPC-167G wird der Phage M13mp18-HE1 (siehe Beispiel 1B) mittels des im folgenden dargestellten mutagenisierenden Oligonukleotids einer ortsspezifischen Mutagenese unterzogen:
Der aus der artspezifischen Mutagenese hervorgehende mutagenisierte Phage wird als M13mp18-HE4 bezeichnet.
Die abschließende Konstruktion van Plasmid pLPC-167G läuft in analoger Weise zur Konstruktion von Plasmid pLAPC ab, die in Beispiel 1C erläutert ist. Das Plasmid pLAPC wird jedoch mittels zweier von Plasmid pLPC stammmender Restriktionsfragmente konstruiert. Bei der Konstruktion von Plasmid pLPC-167G werden die zwei gleichen Fragmente anstelle dessen von Plasmid pLAPC erhalten. Der Grund für die Verwendung von Plasmid pLAPC anstelle von Plasmid pLPC als Fragmentquelle ist, die Restriktionsanalyse zur Identifizierung der Plasmid pLPC-167G Transformanden zu erleichtern. Da die Plasmide pLPC und pLPC-167G fast die gleiche Größe aufweisen, wäre es schwierig geworden, den "Ursprung" (Plasmid pLPC) von Plasmid pLPC-167G zu unterscheiden. Diese Ürsprünge können aufgrund einer Vielzahl an Faktoren trotz der Reinigung der in der Ligation verwendeten Fragmente vorkommen. Da das Plasmid pLAPC jedoch kleiner ist als das Plasmid pLPC-167G, kann man durch Gewinnen der zwei Fragmente van Plasmid pLAPC einfacher den Ursprung (Plasmid pLAPC) von dem gewünschten Plasmid pLPC-167G unterscheiden. Daher wird das 0,7 kb SstI-SalI Restriktionsfragment des Phagen M13mp18-HE4 mit dem 3,76 kb EcoRI-SalI Restriktionsfragment von Plasmid pLAPC und dem 2,0 kb EcoRI-SstI Restriktionsfragment von Plasmid pLAPC ligiert. Die ligierte DNA besteht aus dem gewünschten Plasmid pLPC-167G, die dann in E. coli K12 RV308 transformiert wird. Die entstehenden E. coli K12 RV308/pLPC-167G Transformanden werden verwendet, um eine Präparation im großen Maßstab an Plasmid pLPC-167G DNA zur Verwendung in Transformationen von eukaryontischen Zellen zu erhalten.

Beispiel 4

Die Konstruktion von Plasmid pLPC-167F

Das Plasmid pLPC-167F wird im wesentlichen gemäß dem Protokoll für die ortspezifische Mutagenese und anderer zur Konstruktion von Plasmid pLAPC verwendeter Konstruktionsprotokolle, wie in Beispiel 1 beschrieben, konstruiert. Die zur Konstruktion van Plamid pLPC-167F verwendeten Puffer und Anelierungsbedingungen sind jedoch von Zoller und Smith, 1984, DNA 3:479-489 beschrieben.
Bei der Konstruktion von Plasmid pLPC-167F wird der Phage M13mp18-HE1 (siehe Beispiel 1B) mittels des im folgenden dargestellten mutagenisierenden Oligonukleotids einer ortsspezifischen Mutagenese unterzogen:
Der aus der ortspezifischen Mutagenese hervorgehende mutagenisierte Phage wird als M13mp18-HE5 bezeichnet.
Die abschließende Konstruktion von Plasmid pLPC-167F läuft in analoger Weise zur Konstruktion von Plasmid pLAPC ab, die in Beispiel 10 erläutert ist. Das Plasmid pLAPC wird jedoch mittels zweier von Plasmid pLPC stammmender Restriktionsfragmente konstruiert. Bei der Konstruktion von Plasmid pLPC-167F werden die zwei gleichen Fragmente anstelle dessen von Plasmid pLAPC erhalten. Der Grund für die Verwendung von Plasmid pLAPC anstelle von Plasmid pLPC als Fragmentquelle ist, die Restriktionsanalyse zur Identifizierung der Plasmid pLPC-167F Transformanden zu erleichtern. Da die Plasmide pLPC und pLPC-167F fast die gleiche Größe aufweisen, wäre es schwierig geworden, den "Ursprung" (Plasmid pLPC) von Plasmid pLPC-167F zu unterscheiden. Da das Plasmid pLAPC jedoch kleiner ist als das Plasmid pLPC-167F, kann man durch Gewinnen der zwei Fragmente von Plasmid pLAPC einfacher den Ursprung (Plasmid pLAPC) von dem gewünschten Plasmid pLPC-167F unterscheiden. Daher wird das 0,7 kb SstI-SalI Restriktionsfragment des Phagen M13mp18-HE5 mit dem 3,76 kb EcoRI-SalI Restriktionsfragment von Plasmid pLAPC und dem 2,0 kb EcoRI-SstI Restriktionsfragment von Plasmid pLAPC ligiert, um das Plasmid pLPC-167F zu konstruieren. Die ligierte DNA besteht aus dem gewünschten Plasmid pLPC-167F, die dann in E. coli K12 RV308 transformiert wird. Die entstehenden E. coli K12 RV308/pLPC-167F Transformanden werden verwendet, um eine Präparation im großen Maßstab an Plasmid pLPC-167F DNA zur Verwendung in Transformationen von eukaryontischen Zellen zu erhalten.

Beispiel 5

Herstellung von Transformanden der Adenovirus-transformierten humanen embryonalen Nierenzellinie 293 und von Transformanden der Adenovirus-transformierten syrischen Hamsterzellinie AV12 mittels der Plasmide pLPC-167G und DLPC-167F

Die humane embryonale Nierenzellinie 293 ist von der American Type Culture Collection unter der Hinterlegungsnummer ATCC CRL 1573 erhältlich. Die Adenovirus-transformierte syrische Hamsterzellinie AV12 ist ebenfalls von der American Type Culture Collection unter der Hinterlegungsnummer ATCC CRL 9595 erhältlich. Das unten beschriebene Transformationsverfahren bezieht sich auf 293- Zellen als Wirtszellinie, das Verfahren kann jedoch allgemein auf die meisten eukaryontischen Zellinien, einschließlich der AV12 Zellinie, und auf die erfindungsgemäßen Expressionsektoren angewendet werden.
Die 293-Zellen werden von der ATCC unter der Hinterlegungsnummer CRL 1573 in einer 25 mm² Kulturflasche erhalten, die eine geschlossene Schicht von etwa 5,5x 10&sup6; Zellen in Eagle's Minimum Essentia Medium (Gibco) mit 10 % hitzeinaktiviertem Pferdeserum enthält. Die Kulturflasche wird bei 37ºC inkubiert und das Medium wird zwei Mal wöchentlich gewechselt. Das Medium besteht aus DMEM (Gibco), das mit 10 %igem fetalem Kälberserum, 50 µg/ml Gentamicin und 10 µg/ml AquaMEPHYTON Phytonadion-Vitamin K&sub1; (Merck Sharp and Dome, Merck and Co., Inc., West Point, PA 19486) versetzt ist, Die Zellen werden durch Entfernen des Mediums, Waschen mit Hank's ausgeglichener Salzlösung (Gibco), Zugabe von 0,25 % Trypsin (0,2 g/l EDTA enthaltend) für 1-2 Minuten, Waschen mit frischem Medium, Ansaugen und Verteilen in neue Kulturflaschen in einem Subkultivierungsverhältnis von 1:5 oder 1:10 subkultiviert.
Einen Tag vor der Transformation werden 0,7 x 10&sup6; Zellen pro 100 mm Platte ausgebracht. Sterile, Ethanol-gefällte Plasmid DNA wird, in TE Puffer gelöst, zur Herstellung einer 2fach DNA- CaCl&sub2; Lösung verwendet, die 25 µg/ml der transformierenden Plasmid DNA und 250 mM CaCl&sub2; enthält (für Plasmid pLPC-167F oder pLPC-167G Transformationen werden normalerweise zwei Plasmide verwendet, das Plasmid pLPC-167F oder pLPC-167G und ein Plasmid, das einen selektionierbaren Marker enthält, wie unten erläutert). Es wird 2fach HBSS hergestellt, das 280 mM NaCl, 50 mM Hepes und 1,5 mM Natriumphosphat enthält, wobei der pH auf 7,05-7,15 eingestellt wird. Die 2fach DNA-CaCl&sub2; Lösung wird tropfenweise zu einem gleichen Volumen sterilem 2fach HBSS gegeben. Eine sterile Einmilliliterplastikpipette mit einem Wattestopfen wird in das 2fach HBSS enthaltende Mischungsröhrchen eingebracht und Blasen werden durch Hineinblasen eingebracht während die DNA zugegeben wird. Das Calciumphosphat-DNA Präzipitat kann sich für 30-45 Minuten bei Raumtemperatur ohne Schütteln bilden.
Das Präzipitat wird dann durch vorsichtiges Pipettieren mit einer Plastikpipette gemischt und ein ml (pro Platte) Präzipitat wird direkt in 10 ml des Wachstumsmediums gegeben, das die Empfängerzellen bedeckt. Nach 4 Stunden Inkubation bei 37ºC wird das Medium durch frisches Medium ersetzt und die Zellen werden für weitere 72 Stunden vor Anlegen des Selektionsdrucks inkubiert. Für Plasmide, die keinen in eukaryontischen Zellen funktionsfähigen Marker enthalten, wie entweder das Plasmid pLPC-167F oder pLPC- 167G, verwendet das Transformationsverfahren ein Gemisch von Plasmiden: Den erfindungsgemäßen Expressionsvektor, dem ein selektionierbarer Marker fehlt und den Expressionsvektor, der einen in eukaryontischen Zellen funktionsfähigen selektionierbaren Marker enthält. Eine Vielzahl an Vektoren sind zur Verwendung in solchen Cotransformationssystemen erhältlich und beinhalten die Plasmide pSV2-dhfr (ATCC 37146), pSV2-neo (ATCC 37149), pSV2-gpt (ATCC 37145) und pSV2-hyg (NRRL B18039). Das Plasmid pSV2-hyg verleiht eukaryontischen Wirtszellen Resistenz gegenüber Hygromycin B. Diese Cotransformationstechnik erlaubt die Selektion von Zellen, die das Plasmid mit dem selektionierbaren Marker enthalten. Diese Zellen werden weiter untersucht, um Zellen zu identifizieren, die beide transformierende Plasmide enthalten. Natürlich umfaßt die vorliegende Erfindung auch Expressionsvektoren, die einen selektionierbaren Marker für eukaryontische Zellen enthalten und daher kein Cotransformationsverfahren benötigen.
Für mit Plasmiden transfizierte Zellen, die das Hygromycinresistenz verleihende Gen enthalten, wird Hygromycin B zum Wachstumsmedium in einer Endkonzentration von etwa 200 µg/ml gegeben. Die Zellen werden dann bei 37ºC für 2-4 Wochen mit einem Mediumwechsel in 3 bis 4 Tagesintervallen inkubiert. Die entstehenden hygromycinresistenten Kolonien werden in einzelne Kulturflaschen zur Charakterisierung gegeben. Das Plasmid pSV2-neo verleiht gegenüber Neomycin (G418 wird ebenfalls anstelle von Neomycin verwendet) eine Resistenz und die Selektion von G418-resistenten Kolonien wird im wesentlichen gemäß dem Selektionsverfahren für hygromycinresistente Zellen durchgeführt, außer daß G418 in einer Endkonzentration von 400 µg/ml zugegeben wird.
Die Verwendung des Dihydrofolatreduktase (dhfr) Gens oder des Methotrexatresistenz verleihenden Derivats des dhfr-Gens (dhfr-mtx) als selektionierbarer Marker zur Einführung eines Gens oder Plasmids in eine dhfr-defiziente Zellinie und die anschließende Verwendung von Methotrexat zur Vervielfältigung der Kopiezahl des Plasmids ist in der Literatur gut dokumentiert. 293-Zellen sind dhfr positiv, so daß 293-Transformanden, die Plasmide mit dem dhtr Gen enthalten, nicht allein auf der Grundlage des dhfr- positiven Phänotyps selektioniert werden, welcher die Fähigkeit zum Wachstum in Medien ist, denen Hypoxanthin und Thymin fehlen. Zellinien, denen ein funktionelles dhfr-Gen fehlt und die mit dhfr-enthaltenden Plasmiden transformiert werden, können auf der Grundlage des dhfr positiven Phänotyps selektioniert werden. Obwohl die Verwendung von dhfr als selektionierbarer und amplifizierbarer Marker in dhfr-bildenden Zellen nicht gut untersucht ist, würde der Beleg in der Literatur nahelegen, daß dhfr als selektionierbarer Marker und zur Genvervielfältigung in dhfr-bildenden Zellen verwendet werden kann. Die vorliegende Erfindung ist nicht durch den auf den Expressionsvektoren verwendeten, selektionierbaren Marker beschränkt. Darüberhinaus können amplifizierbare Marker verwendet werden, wie Methallothioningene, Adenosindesaminasegene oder Vertreter der Familie der multigenen Resistenz, beispielhaft vom P-Glycoproteingen vertreten.
Die Transformation der 293- und AV12 Zellinien mit einem Gemisch von Plasmid pLPC-167F oder pLAPC 167G und einem Hygromycinresistenz verleihenden Vektor und anschließende Selektion auf hygromycinresistente Zellen ergibt einige Transformanden. (Andere Transformanden werden durch Verwendung von Plasmid pSV2-neo als cotransformierenden Vektor und Selektion auf G418-resistente Zellen erhalten.) Diese Transformanden werden, wie in Beispiel 6 beschrieben, analysiert, um zu bestimmen, welche hygromycinresistenten Zellen das Plasmid pLPC-167F oder pLPC-167G enthalten.

Beispiel 6

Selektion auf stark sekretierende Transformanden

Die in Beispiel 5 erhaltenen hygromycinresistenten Transformanden werden auf 100 mm² Gewebekulturplatten in einer Dichte von einigen hundert Zellenklonen pro Gewebekulturplatte gezogen. Das Medium wird dekantiert, und die Zellen werden zwei Mal mit 5 ml Teilen von Hank's ausgeglichener Salzlösung (Gibco) gewaschen. Eine Lösung von sterilem 0,45 %igem Agar (Sigma Typ 4 Agarose, Katalognummer A3643, Sigma Chemical Co., P.O. Box 14508, St. Louis, MO 63178) wird durch Mischen von 1 ml 1,8 %igem Agar (47ºC) mit 3 ml Dulbecco's Modified Eagle's (DME) Salzen (Gibco) (37ºC) hergestellt und 2 ml dieser 0,45 %igen Agarlösung werden über die Zellen geschichtet.
Nitrozellulosefilter (Schleicher und Schuell, Inc., Keene NH 03431) werden gekocht und dann 2 Stunden autoklaviert, um das Befeuchtungsmittel zu entfernen, das für die Zellen toxisch ist. Die Filter werden dann auf die Agarschicht gelegt und nachdem Luftblasen entfernt worden sind, werden die Platten bei 37ºC für 1-3 Stunden inkubiert. Die Filter, die vorher zur Erkennung der ursprünglichen Orientierung markiert wurden, um so die spätere Identifizierung der Kolonien zu erleichtern, werden dann entfernt und in PBS (50 mM Tris-HCl pH = 7,2 und 150 mM NaCl) gelegt.
Um die Zellen während der Analyse der Filter lebensfähig zu halten, werden die Zellen mit 8 ml eines 2 ml 1,8 %igen Agar (47ºC), 2 ml DME Salze (37ºC) und 4 ml DME Salze mit 20 % fetalem Rinderserum (37ºC) enthaltenden Gemisches überschichtet. Die Zellen werden dann in einen 37ºC Inkubator gestellt.
Alle Waschschritte und Reaktionen werden an den Filtern ausgeführt, während sich die Filter auf einer schüttelnden Plattform befinden. Die Filter werden zuerst durch eine Inkubation bei Raumtemperatur in 5 % Milch enthaltendem PBS geblockt. Die Filter werden dann viermal in PBS gewaschen (5 Minuten/Waschschritt). Ein 10 µg/ml in 2,5 %igem Rinderserumalbumin polyklonaler biotinylierter Ziege-anti-human-Protein C Antikörper wird auf den Filter gegeben (in ausreichender Menge um den Filter zu bedecken), welcher dann bei 37ºC für 1 Stunde inkubiert wird.
Die Reinigung von Protein C zur anschließenden Herstellung eines Antikörpers gegen Protein C kann, wie bei Kisiel, 1979, J. Clin. Invest. 64:761 beschrieben, ausgeführt werden. Der polyklonale Antikörper kann durch das in Structural Concepts in Immunology and Immunochemistry von E.A. Kabat beschriebene Verfahren, 1968 durch Hold, Rhinehart und Winston veröffentlicht, hergestellt werden. Ein monoklonaler Antikörper, der ebenfalls zur Verwendung im Test geeignet ist, kann, wie von Köhler und Milstein, 1975, Nature 256:495 beschrieben oder wie in US-A 4 696 895 , EP-A 0 205 046, Laurell et al., 1985 Febs 191(1):75, Suzuki et al., 1985, J. Biochem. 97:127-138 und EP-A 0 138 222 beschrieben, hergestellt werden. Das Avidin D und die biotinylierte Meerrettichperoxidase (HRP), die im Test verwendet werden, werden in einem Vectastain Kit (Vector Laboratories, Inc., 30 Ingold Road, Burlingame, CA 94010) bezogen. Das Biotin wird ebenfalls von den Vector Laboratories, Inc. bezogen.
Die Filter werden viermal mit PBS bei 4ºC gewaschen. Dann werden Avidin D und die biotinylierte Meerettichperoxidase vorbereitet und zugegeben, wie durch die Vorschriften des Herstellers im Vectastain (Vector Laboratories) Kit angegeben. Die Filter werden mit dem Meerrettichperoxidase-konjugierten Avidin D für 1 Stunde bei 4ºC inkubiert (längere Inkubationszeit, das heißt über Nacht, kann bei kleinen Mengen an sekretiertem Protein verwendet werden), und dann werden die Filter vier Mal mit PBS bei 4ºC gewaschen.
Um die Indikatorfarbe auf den Filtern zu entwickeln, werden etwa 30 mg Reagenz zur Meerrettichperoxidasefarbentwicklung (4-Chlor-1-naphthol, Sigma) in eiskaltem 100 %igem Methanol gelöst zu 50 ml PBS und 30 µl 30 %igem H&sub2;O&sub2; gegeben. Dieses Gemisch wird zu den Nitrozellulosefiltern gegeben, die bei Raumtemperatur inkubiert werden, bis die Farbe sich entwickelt. Kolonien, die das meiste humane Protein C Zymogen sekretieren, werden auf den Filtern nicht nur durch das früheste Auftreten der Farbe, sondern auch durch dunklere Flecken auf dem Filter sichtbar.
Nachdem die Filter entwickelt wurden, werden die Filter erneut mit den ursprünglichen Platten verglichen, um festzustellen, welche Kolonien zu den Flecken auf dem Filter gehören. Die Klonien, die das meiste erfindungsgemäße humane Protein C Zymogen sekretieren, werden dann ausgewählt und zur Herstellung des Zymogens verwendet.
Der Fachmann erkennt, daß der obige Test vor allem das Identifizierungsverfahren der stark sekretierenden Zellinien verdeutlicht. Eine Vielzahl an Testverfahren kann erfolgreich im Verfahren verwendet werden. Beispielsweise kann eine zweifache Antikörperreaktion verwendet werden, in der der biotinylierte Ziegen-anti-Protein C Antikörper durch einen Ziege-anti-Protein C Antikörper (Ig G) und einen biotinylierten anti-Ziege IgG Antikörper ersetzt wird.

Claims

1. DNA Verbindung, die eine kodierende Sequenz für ein Protein umfaßt, das vom Aminoterminus bis zum Carboxyterminus umfaßt:

a) ein Signalpeptid und Propeptid eines gamma-carboxylierten, sekretierten Proteins,

b) die leichte Kette von humanem Protein C,

c) das Dipeptid Lysin-Arginin, Arginin-Lysin, Lysin-Lysin oder Arginin-Arginin, und

d) folgende Aminosäuresequenz

worin R&sub1; für PHE, GLY, TYR oder TRP steht, R&sub2; für VAL oder PRO steht, R&sub3; für ASP oder ASN steht, ARG für Arginin steht, ASN für Asparagin steht, ASP für Asparaginsäure steht, -COOH für den Carboxyterminus steht, CYS für Cystein steht, GLN für Glutamin steht, GLU für Glutaminsäure steht, GLY für Glycin steht, HIS für Histidin steht, ILE für Isoleucin steht, LEU für Leucin steht, LYS für Lysin steht, MET für Methionin steht, PHE für Phenylalanin steht, PRO für Prolin steht, SER für Serin steht, THR für Threonin steht, TRP für Tryptophan steht, TYR für Tyrosin steht und VAL für Valin steht.

2. DNA Verbindung nach Anspruch 1, worin das Signalpeptid und das Propeptid das Signalpeptid und das Propeptid von unreifem humanem Protein C sind.

3. DNA Verbindung nach Anspruch 1 oder 2, worin das Dipeptid Lysin-Arginin ist.

4. DNA Verbindung nach Anspruch 3, worin das durch die DNA kodierte Polypeptid folgendes ist

worin -H&sub2;N für den Aminoterminus steht, R&sub1; für PHE, GLY, TYR oder TRP steht, R&sub2; für PRO oder VAL steht und R&sub3; für ASP oder ASN steht.

5. Rekombinanter DNA Expressionsvektor, der die DNA Verbindung nach Anspruch 1, 2, 3 oder 4 umfaßt.

6. Vektor nach Anspruch 5, worin R&sub1; für PHE steht, R&sub2; für PRO steht und R&sub3; für ASP steht.

7. Vektor nach Anspruch 6, der das wie in Beispiel 4 beschrieben hergestellte Plasmid pLPC-167F ist.

8. Vektor nach Anspruch 5, worin R&sub1; für GLY steht, R&sub2; für PRO steht und R&sub3; für ASP steht.

9. Vektor nach Anspruch 8, der das wie in Beispiel 3 beschrieben hergestellte Plasmid pLPC-167G ist.

10. Eukaryontische Wirtszelle, die mit einem Vektor nach Anspruch 5 transformiert ist.

11. Eukaryontische Wirtszelle nach Anspruch 10, die 293/pLPC-167F ist, welche durch Transformation der humanen embryonalen Nierenzellinie 293 mit dem Plasmid pLPC-167F nach Anspruch 7 hergestellt ist.

12. Eukaryontische Wirtszelle nach Anspruch 10, die 293/pLPC-167G ist, welche durch Transformation der humanen embryonalen Nierenzellinie 293 mit dem Plasmid pLPC-167G nach Anspruch 9 hergestellt ist.

13. Eukaryontische Wirtszelle nach Anspruch 10, die AV12/pLPC-167F ist, welche durch Transformation der Adenovirus-transformierten syrischen Hamsterzellinie AV12 mit dem Plasmid pLPC-167F nach Anspruch 7 hergestellt ist.

14. Eukaryontische Wirtszelle nach Anspruch 10, die AV12/pLPC-167G ist, welche durch Transformation der Adenovirus-transformierten syrischen Hamsterzellinie AV12 mit dem Plasmid pLPC-167G nach Anspruch 9 hergestellt ist.

15. Verfahren zur rekombinanten Herstellung einer Zymogenform von humanem Protein C durch Sekretion aus einer eukaryontischen Wirtszelle, gekennzeichnet durch

(A) Transformation einer eukaryontischen Wirtszelle mit einem rekombinanten DNA Vektor, der umfaßt

(i) eine DNA Sequenz, die eine Aminosäuresequenz kodiert, welche vom Aminoterminus zum Carboxyterminus umfaßt

a) ein Signalpeptid und ein Propeptid eines gamma-carboxylierten, sekretierten Proteins,

b) die leichte Kette von humanem Protein C,

c) das Dipeptid LYS-ARG, ARG-LYS, LYS-LYS oder ARG-ARG, und

d) folgende Aminosäuresequenz

worin R&sub1; für PHE, GLY, TYR oder TRP steht, R&sub2; für VAL oder PRO steht, R&sub3; für ASP oder ASN steht, ARG für Arginin steht, ASN für Asparagin steht, ASP für Asparaginsäure steht, -COOH für den Carboxyterminus steht, CYS für Cystein steht, GLN für Glutamin steht GLU für Glutaminsäure steht, GLY für Glycin steht, HIS für Histidin steht, ILE für Isoleucin steht, LEU für Leucin steht, LYS für Lysin steht, MET für Methionin steht, PHE für Phenylalanin steht, PRO für Prolin steht, SER für Serin steht, THR für Threonin steht, TRP für Tryptophan steht, TYR für Tyrosin steht und VAL für Valin steht, und

(ii) einen Promotor, der zur Expressionssteuerung der DNA Sequenz positioniert ist, und

(B) Kultivierung der in Schritt (A) transformierten Wirtszelle unter Bedingungen, die die Expression der DNA Sequenz erlauben.

16. Verfahren nach Anspruch 15, worin der rekombinante DNA Expressionsvektor das Plasmid pLPC-167F nach Anspruch 7 ist.

17. Verfahren nach Anspruch 15, worin der rekombinante DNA Expressionsvektor das Plasmid pLPC-167G nach Anspruch 9 ist.

18. Verfahren nach Anspruch 15, worin die Wirtszelle die 293- oder AV12-Wirtszelle ist.

19. Verfahren nach Anspruch 18, worin die in Schritt (B) kultivierte Wirtszelle die 293/pLPC-167F, 293/pLPC-167G, AV12/pLPC-167F oder AV12/pLPC-167G Wirtszelle nach den Ansprüchen 11 bis 14 ist.

20. Protein C Zymogen mit der folgenden Aminosäuresequenz

worin H&sub2;N für den Aminoterminus steht, R&sub1; für PHE, GLY, TYR oder TRP steht, R&sub2; für VAL oder PRO steht, R&sub3; für ASP oder ASN steht, ARG für Arginin steht, ASN für Asparagin steht, ASP für Asparaginsäure steht, -COOH für den Carboxyterminus steht, CYS für Cystein steht, GLN für Glutamin steht, GLU für Glutaminsäure steht, GLY für Glycin steht, HIS für Histidin steht, ILE für Isoleucin steht, LEU für Leucin steht, LYS für Lysin steht, MET für Methionin steht, PHE für Phenylalanin steht, PRO für Prolin steht, SER für Serin steht, THR für Threonin steht, TRP für Tryptophan steht, TYR für Tyrosin steht und VAL für Valin steht

21. Zymogen nach Anspruch 20, worin R&sub1; für PHE steht, R&sub2; für PRO steht und R&sub3; für ASP steht.

22. Zymogen nach Anspruch 20, worin R&sub1; für GLY steht, R&sub2; für PRO steht und R&sub3; für ASP steht.

23. Aktiviertes Protein C Molekül, das die leichte Kette von aktiviert ein humanem Protein C und die folgende schwere Kette umfaßt

worin ALA für Alanin steht, ARG für Arginin steht, ASN für Asparagin steht, ASP für Asparaginsäure steht, -COOH für den Carboxyterminus steht, CYS für Cystein steht, GLN für Glutamin steht, GLU für Glutaminsäure steht, GLY für Glycin steht, H&sub2;N für den Aminoterminus steht, HIS für Histidin steht, ILE für Isoleucin steht, LEU für Leucin steht, LYS für Lysin steht, MET für Methionin steht, PHE für Phenylalanin steht, PRO für Prolin steht, SER für Serin steht, THR für Threonin steht, TRP für Tryptophan steht, TYR für Tyrosin steht und VAL für Valin steht.

24. Pharmazeutische Formulierung, die das Zymogen nach Anspruch 20 zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger hierfür umfaßt.

25. Pharmazeutische Formulierung, die das aktivierte Protein C nach Anspruch 23 zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger hierfür umfaßt.