DE69009068T2

DE69009068T2 - Methoden und materialien zur expression von varianten von menschlichem plasminogen.

Info

Publication number: DE69009068T2
Application number: DE69009068T
Authority: DE
Inventors: Francis J. Granger In 46530 Castellino; Deborah L. San Carlos Ca 94070 Higgins
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1989-12-01
Filing date: 1990-10-31
Publication date: 1994-10-27
Anticipated expiration: 2010-11-01
Also published as: FI905919A0; PL288034A1; CA2072649A1; DK0502872T3; EP0502872A1; DE69009068D1; AU641449B2; WO1991008297A1; NO905211L; IE904332A1; FI102617B1; AU6721290A; CA2072649C; FI102617B; EP0502872B1; NO307305B1; US5087572A; FI905919A; PT96041A; ATE105862T1

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Anmeldung betrifft im allgemeinen Verfahren und Materialien zur Expression eines Gens, das fur eine Plasminogenvariante kodiert, und insbesondere Verfahren und Materialien zur Expression einer Variante von menschlichem Plasminogen in einem Säugetierzellsystem und Produkte davon.

Beschreibung verwandter Gebiete

Schädliche Anhäufungen des Klumpen- bzw. Gerinnselproteins Fibrin in Blutgefäßen werden durch proteolytischen Abbau (Fibrinolyse) von Fibrin oder seines Vorläuferfibrinogens durch Enzymplasmin (Pm) verhindert. Bei einer Vielzahl an Störungen werden pathologische Fibrinablagerungen nicht spontan bzw. von selbst abgebaut, was zur Thrombose führt, dem Vorhandensein eines Blutgerinnsels (Thrombus) in einem Blutgefäß. In vielen Fällen ist thrombolytische Therapie, d.h. die Auflösung des Blutgerinnsels durch Pm, die einzig durchführbare Behandlung.
Pm wird im Kreislauf durch Aktivierung eines Vorläufers, des "Proenzyms " oder "Zymogens" mit der Bezeichnung Plasminogen (Pg) hergestellt. Thrombolytische Therapie erfolgt durch Verabreichung eines Plasminogenaktivators. Beispiele von Plasminogenaktivatoren sind Streptokinase (SK ), Urokinase (UK) und Gewebsplasminogenaktivator (t-PA).
Menschliches Pg (HPg) ist im Kreislauf als einkettiges Glykoprotein vorhanden, das 791 Aminosäuren mit einer aminoterminalen Aminosäure von Glu enthält (im Kreislauf befindliches HPg kann daher als (Glu¹) Plasminogen bezeichnet werden). [Forsgren et al., FEBS Lett., 213: 254-260 (1987); Malinowski et al., Biochem., 23: 4243-4250 (1984); McLean et al., Nature, 330: 132-137 (1987); Sottrup-Jensen et al., Prog.Chem.Fibrinolysis Thrombolysis, 3: 191-209 (1978); Wiman, Eur.J.Biochem., 39: 1-9 (1973); und Wiman, Eur.J.Biochem., 76: 129-137 (1977)].
Eine Analyse der Kohlehydratsequenz von HPg zeigt, daß es zwei Glykosylierungsvarianten gibt, eine erste mit zwei Glykosylierungsstellen (Asn²&sup8;&sup9; und Thr³&sup4;&sup6;) und eine zweite mit einer Glykosylierungsstelle (Thr³&sup4;&sup6;), wobei Unterformen eine unvollständige Sialation aufweisen [Castellino, Chem.Rev., 81: 431-446 (1981)]. Diese Formen und Unterformen sind Beispiele posttranslationaler Modifikationen, die das im kreislauf befindliche Plasminogen aufweist.
HPg wird durch Spaltung einer Arg&sup5;&sup6;¹-Val&sup5;&sup6;²-Peptidbindung aktiviert, um die zweikettige, Disulfid-verbundene Serinprotease [Lys&sup7;&sup8;]-Pm herzustellen. Dieses Molekül weist auch einen Mangel an aminoterminalen 77 Aminosäuren aufgrund der Autolyse durch menschliches Pm (HPm) auf, das während der Aktivierung gebildet wird [(Violand und Castellino, J.Biol.Chem., 251: 3906-3912 (1976)]. Die Spaltung kann durch eine Vielzahl an Aktivatoren, unter ihnen SK, UL und t-PA, aktiviert werden [Ein Überblick befindet sich bei Castellino, Bioscience, 33: 647-650 (1983)]. Während die letzteren beiden Proteine Enzyme sind, welche die Spaltung der geeigneten Peptidbindung in HPg direkt katalysieren und HPm ergeben, weist SK keine derartige inhärente Aktivität auf, und ihre Plasminogenaktivatoraktivität beruht auf ihrer Fähigkeit, Komplexe mit HPg und HPm zu bilden und die tatsächlichen oder latenten plasminaktiven Stellen dieser letzteren zwei Moleküle zu verwenden, um als Aktivator zu funktionieren (Castellino, siehe oben).
(Glu¹)Pg ist in Plasma in Form von zwei Hauptvarianten vorhanden, die sich in ihrem Glykosylierungsausmaß an Asn²&sup8;&sup9; unterscheiden [Hayes und Castellino, J.Biol.Chem., 254: 8768-8780 (1979)]; Castellino, siehe oben. In (Glu¹)Pg enthält die latente schwere Plasminkette, die Reste 1-561 enthält, fünf äußerst homologe Bereiche, die als "Kringles" bezeichnet werden (Sottrup-Jensen et al, oben), wobei jedes etwa 80 Aminosäuren enthält. Diese Kringles bestehen höchstwahrscheinlich als unabhängige Domänen [Castellino et al., J.Biol.Chem., 256 4778-4782 (1981)] und sind für die funktionalen Eigenschaften von HPg und HPm von Bedeutung. Beispielsweise kann die Kringle 1 Domäne (Aminosäurereste 84-162) bei der Wechselwirkung von Plasmin oder Plasminogen mit Fibrin und Fibrinogen [Lucas et al., J.Biol.Chem., 258: 4249-4256 (1983)], mit dem negativen Aktivierungseffektor (Cl&supmin;) [Urano et al., J.Biol.Chem., 262: 15959-15964 (1987)] und mit dem positiven Aktivierungseffektor Epsilon-Aminocapronsäure (EACA) wichtig sein [Markus et al., J.Biol.Chem. 253: 727-732 (1978)]. Zusätzlich ist dieses selbe Segment für die anfängliche rasche Bindung von HPm an seinen Haupt-Plasmainhibitor, α&sub2;-Antiplasmin, verantwortlich [Moroi und Aoki, J.Biol.Chem., 251: 5956-5965 (1976)]. Der Kringle 4 Bereich (Reste 358-435) scheint, (eine) schwache EACA bindende Stelle(n) auf (Glu¹)Pg zu enthalten, die bei der sehr großen ligandeninduzierten Konformationsänderung von (Glu¹)Pg EVioland et al., Arch.Biochem.Bioohys., 170: 300-305 (1975)] und in einer gleichzeitigen Zunahme der Aktivierungsrate des Zymogens in Gegenwart des positiven Effektors EACA beteiligt sein kann LClaeys und Vermyelin, Biochem.Biophys.Acta, 342: 351-359 (1974)].
Obwohl die thrombolytische Therapie nützlich ist, ist ihr therapeutisches Potential durch die Verfügbarkeit von Plasminogen an der Stelle des Thrombus eingeschränkt. Die Konzentration von Plasminogen kann aufgrund des Plasminogen-Verbrauchs als Ergebnis der thrombolytischen Therapie, aufgrund einer unzureichend in den Thromben vorhandenen Menge an Plasminogen oder aufgrund eines lokalen Plasminogenschwunds eingeschränkt sein, der mit dem Alter des Thrombus und Ischämie in Zusammenhang steht (einer lokalisierten Anämie aufgrund einer Verringerung des Blutflusses). [Anderle et al., Haemostasis, 18: (Suppl.1), 165-175 (1988)]. Aus diesem Grund ist eine Ergänzung der lokal zur Verfügung stehenden Plasminogen-Menge wünschenswert.
Obwohl die Expression von großen Mengen an Plasminogen in einem rekombinanten Expressionssystem ein geeigneter Weg, um Plasminogen zur Verwendung in der thrombolytischen Therapie zu erhalten ist, traten aufgrund des fast allgegenwärtigen Vorhandenseins von intrazellularen Plasminogenaktivatoren unter Säugetierzelltypen bei der Expression von intaktem HPg in Säugetierexpressionssystemen große Schwierigkeiten auf. Das Vorhandensein dieser Aktivatoren führt zum Auftreten einer abgebauten Form von HPg in konditionierten Zellmedien solcher Expressionssysteme, möglicherweise durch Autodigestion von Plasminogen durch das hergestellte HPm [Busby et al., Fibrinolysis, 2: 64 (1988)].
Ein rekombinantes menschliches Plasminogen wurde in Insektenzellen hergestellt (irHPg), das durch aminoterminale Aminosäuresequenzanalyse, Bestimmung des Molekulargewichts auf SDS/PAGE, Sepharose-Lysin- Affinitätschromatograchie-Verhalten, Aktivierungseigenschaften, Antikörper-Reaktivität und Aktivität des resultierenden Plasmins in Bezug auf seine Eigenschaften mit menschlichem Plasma (Glu¹)Pg vergleichbar zu sein scheint [Whitefleet-Smith et al., Arch.Biochem.Biophys., 271: 390-399 (1989)]. Dies ist eine bedeutende Entdeckung, da bis heute noch keine erfolgreiche Expression von rekombinanten HPg des Wildtyps (wt-rHPg) in Säugetierzellen stattfand. Als jedoch die kinetischen Eigenschaften äguimolarer Komplexe verglichen wurden, die aus Streptokinase mit Plasma HPg und mit irHPg gebildet wurden, waren SDS/PAGE-Gels der zeitlichen Abläufe innerhalb der jeweiligen Komplexe mit den durch Bajaj und Castellino, J.Biol.Chem., 252: 492-498 (1977) veröffentlichten Ergebnissen insofern identisch, als eine rasche Umwandlung von HPg zu HPm eintrat. Dies läßt vermuten, daß HPg keine stabile Komponente des Komplexes ist.
Es ist bekannt, daß die Spaltungsstelle von menschlichem t-PA, die die Positionen 270-280 umfaßt, modifiziert werden kann, um eine t-PA-Variante zu erzeugen, die spezifischer enzymatischer Spaltung gegenüber resistent oder immun ist. Es sind z.B. t-PA-Varianten beschrieben (EP Veröffentl. Nr. 199.574), die an den proteolytischen Spaltungsstellen an Positionen 275, 276 und 277 Aminosäuresubstitutionen aufweisen. Diese Varianten, die vorzugsweise als t-PA-Varianten mit einer anderen Aminosäure als Arginin an Position 275 charakterisiert werden, bezeichnet man als protease-resistente einkettige t-PA- Varianten; im Gegensatz zu natürlichem t-PA, der entweder in einer Einketten- oder einer Zweikettenform bestehen kann, sind sie an Position 275 gegenüber Proteasespaltung resistent und werden daher nicht metabolisch in vivo zu einer Zweikettenform umgewandelt. Man nimmt an, daß diese Form von t-PA bestimmte biologische und kommerzielle Vorteile aufweist, da sie stabiler ist und ihre Fibrinbindung und Fibrinstimulation im Verhältnis zu zweikettigem t-PA verstärkt bzw. gesteigert ist. Eine weitere Form von Plasminogenaktivator enthält eine Domäne, die zur Wechselwirkung mit Fibrin fähig ist, und die Proteasedomäne von Urokinase, wobei eine Ausführungsform Urokinase-geändert ist, um sie weniger anfällig zu machen, zweikettige Urokinase zu bilden. Siehe WO 88/05081, veröffentlicht am 14.Juli 1988.
Als weitere Beispiele der Patentliteratur über die Modifizierung der Protease-Spaltungsstelle von t-PA seien angeführt: EPO PSen 241.209, 201.153, veröffentlicht am 12.November 1986; 233.013, veröffentlicht am 19.August 1987; 292.009, veröffentlicht am 23.November 1988; 293.936, veröffentlicht am 7.Dezember 1988 und 293.934, veröffentlicht am 7.Dezember 1988 sowie WO 88/10119.
Ein Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Plasminogenmolekül zu entwickeln, das als solches in einem Komplex mit einem fibrinolytischen Enzym wie z.B. Streptokinase stabil ist und somit aktiver als das natürliche Molekül ist.
Ein weiteres Ziel besteht darin, das Plasminogenmolekül in jedem beliebigen rekombinanten Expressionssystem zu erzeugen, nicht nur in jenen, die einen Mangel eines endogenen, stellenspezifischen Plasminogenaktivators aufweisen (wie z.B. Insektenzellen).
Diese und andere Ziele sind für den Fachmann auf dem Gebiet offenkundig.

Zusammenfassung der Erfindung

Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung eine Nukleinsäuresequenz bereit, die für eine Plasminogenaminosäuresequenz kodiert, die eine Mutation an der Plasminogenzweikettenspaltungsstelle aufweist und gegen proteolytische Spaltung zu ihrer Zweikettenform resistent ist, vorzugsweise von menschlichem Plasminogen und am bevorzugtesten (Glu¹) Plasminogen.
In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung einen Expressionsvektor, der die Nukleinsäuresequenz umfaßt, die operabel mit Steuersequenzen verbunden ist, sowie den Vektor umfassende Wirtszellen, vorzugsweise eukaryotische und am bevorzugtesten Säugetierwirtszellen, bereit.
In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zum Herstellen eines Plasminogens bereit umfassend den Schritt des Kultivierens von Zellen, die obigen Vektor enthalten, und vorzugsweise auch den Schritt des Gewinnens des Plasminogens aus der Zellkultur oder dem Kulturmedium, wenn das Molekül sekretiert wird.
In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung eine Plasminogenaminosäuresequenzvariante bereit, die eine Mutation an einer Plasminogenzweikettenspaltungsstelle aufweist. Diese Variantensequenz ist gegen proteolytische Spaltung zu ihrer Zweikettenform resistent. Vorzugsweise ist das Plasminogen eine einkettige Sequenzvariante, die an ihrer 561-562-Zweikettensoaltungsstelle mutiert ist.
Die vorliegende Erfindung stellt auch eine oharmazeutische Zusammensetzung zur Erzielung von Thrombolyse bereit, die eine wirksame Menge des oben beschriebenen Plasminogens enthält, das in einem pharmazeutisch verträglichen Träger formuliert ist. Die Zusammensetzung enthält auch vorzugsweise fibrinolytisches Enzvm, das mit dem Plasminogen komplexiert ist.
Weiters sieht die vorliegende Erfindung Zusammensetzungen vor, die in einem Verfahren zur thrombolytischen Theraoie Anwendung finden könnten, umfassend den Schritt des Verabreichens einer wirksamen Menge der oben beschriebenen pharmazeutischen Zusammensetzung an ein Säugetier, das thrombolytische Therapie braucht.
In einem noch weiteren Aspekt sieht die Erfindung ein Verfahren zum Herstellen eines binären Komplexes zwischen einem fibrinolytischen Enzym und Plasminogen vor, wobei der Komplex eine katalytische Stelle aufweist, die für fibrinolytische Aktivität wesentlich ist, die durch eine durch Hydrolyse entfernbare Gruppe blockiert ist, umfassend: das Mischen des fibrinolytischen Enzyms mit dem soaltungsresistenten, hierin angeführten Plasminogen zur Bildung eines binären Knmolexes in Gegenwart eines Uberschusses eines Blockierungsmittels der Formel A-B oder E-F, worin A eine hvdrolytisch labile Blockierungsgruppe ist, die für die katalytische Stelle selektiv ist, die für fibrinolytische Aktivität unentbehrlich ist, und die zur übertragung von der Gruppe B zur katalytischen Stelle fähig ist, B eine Gruppe ist, die das Binden von A an das Enzym erleichtert, E eine anordnende Gruppe ist, die das Mittel an der katalytischen Stelle anordnet und F eine hydrolytisch labile Blockierungsgruppe ist, die zur Übertragung von der anordnenden Gruppe zur katalytischen Stelle fähig ist.
Die gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Plasminogenvarianten werden in einem Komplex mit Streptokinase nicht zu Plasmin abgebaut und entwickeln rasch ( ≤ 30 sek.) sowohl eine amidolytische als auch eine Plasminogenaktivatoraktivität.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig.1 ist die Nukleotidsequenz für Vektor pUC119PN127.6, mit der Ausnahme, daß der Vektor an Nukleotidposition 3809 ein T enthält, wohingegen die Sequenz von Fig.1, welche die für natives menschliches Plasminogen kodierende Sequenz widerspiegelt, ein C enthält. Die Sequenz von Fig.1 enthält auch eine abgeleitete Aminosäuresequenz für menschliches Plasminogen mit der Nativsequenz.
Fig.2 zeigt die Konstruktion des Vektors pSVI-tPA.
Fig.3 zeigt die Konstruktion des Vektors pSVI2-tPA.
Fig.4 zeigt die Konstruktion des Vektors pSVI3-tPA.
Fig.5 zeigt die Konstruktion des Vektors pSVI5-tPA.
Fig.6 zeigt die Konstruktion des Vektors pSVI6B-tPA.
Fig.7 zeigt die Konstruktion von pA47sRs6lSPg, der zur Expression einer HPg-Variante gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet wird.
Fig.8 ist ein Flußdiagramm, das die Konstruktion des Baculovirus-Übertragungsvektors pAV6 schematisch darstellt, der zur Expression von Insektenzellen verwendet wird.

Ausführliche Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen

A.Definitionen

Der hierin angeführte Ausdruck "Plasminogen" oder "Pg" bezieht sich auf Plasminogen jeder beliebigen Spezies, einschließlich Rinder-, Pferde-, Schweine-, Ei-, Hunde-, Mäuse-, und Katzenplasminogen, sowie menschliches Plasminogen, das die in Fig.1 dargestellte Aminosäuresequenz aufweist, mit der Maßgabe, daß es die biologische Aktivität von nativem Pg hat, d.h. fähig ist, durch einen Plasminogenaktivator gespalten zu werden (z.B. Streptokinase, Urokinase oder Gewebsplasminogenaktivator), um Plasmin zu erzeugen, oder ein immunes Epitop besitzt, das immunologisch mit einem gegen zumindest ein Epitop von nativem Pg gebildeten Antikörper kreuzreaktiv ist.
Plasminogenvarianten sind als Moleküle definiert, in denen die Aminosäuresequenz von nativem Pg, typischerweise durch eine vorbestimmte Mutation, modifiziert wurde, worin zumindest eine Modifikation das Plasminogen gegenüber einer proteolytischen Spaltung zu seiner Zweikettenform resistent macht. Aminosäuresequenzvarianten von Pg umfassen z.B. Löschungen von oder Einfügungen oder Substitutionen von Resten innerhalb der in Fig.1 dargestellten Aminosäure Pg-Sequenz. Es kann jede beliebige Kombination von Löschung, Einfügung und Substitution vorgenommen werden, um zum Endkonstrukt zu gelangen, mit der Maßgabe, daß das Endkonstrukt die gewünschte Resistenz gegenüber Spaltung und biologische Aktivität aufweist. Offensichtlich ist es vorzuziehen, daß die Mutationen in der für das Varianten-Pg kodierenden DNA die Sequenz nicht außerhalb des Leserahmens setzen, und weiters ist vorzuziehen, daß sie keine Komplementärbereiche schaffen, die eine sekundäre mRNA-Struktur erzeugen könnten (siehe z.B. europäische Patentveröffentlichung Nr. 075.444).
Eine "Zweiketten-Spaltungsstelle" in Pg und die Stelle "proteolytischer Spaltung zu seiner Zweikettenform" umfaßt zumindest den Argininrest an Position 561 von HPg. Man nimmt jedoch an, daß zahlreiche Aminosäuren, die an mehrere Reste von Position 561 angrenzen oder darin liegen, ein Teil der Domäne sind, die durch Enzyme erkannt wird, die Plasminogen zu seiner Zweikettenform umwandeln. Somit könnte die Ersetzung von Aminosäuren an anderen Positionen als 561 innerhalb der Domäne zu Mutantenplasminogenen führen, die gegen Umwandlung zur Zweikettenform resistent sind.
In der speziellen Ausführungsform ist eine "Einkettenplasminogenvariante" ein Plasminogen, das gegen Umwandlung zur Zweikettenform an der 561-562-Spaltungsstelle resistent ist. Sie ist durch einfache oder mehrfache Aminosäuresubstitutionen an der Zweikettenaktivierungsstelle charakterisiert. Eine solche Aktivierungsstelle wird in modifizierter Form enzymatisch nicht erkannt und daher durch Enzyme nicht hydrolysiert, die normalerweise Plasminogen zu seiner Zweikettenform umwandeln.
In Analogie zu Trypsin und Chymotrypsin nimmt man an, daß die Bedeutung der Bildung der Zweikettenform jeder beliebigen Serinprotease die logisch folgende Gegenwart der freien α-Aminogruppe in HPg an Position 562 ist. In diesem Vergleich wäre die α-Aminogruppe 562 bei Spaltung an arg561 frei, um mit der Polypeptidkette im Bereich der aktiven Stelle Serin von Plasminogen in Wechselwirkung zu treten. Die vorliegende Erfindung betrifft daher jede Mutation, welche die Wechselwirkung einer solchen α-Aminogruppe mit der Protease-aktiven Stelle beeinflussen würde, ohne die Gesamtaktivität des Moleküls zu verringern.
"Operabel verbunden" bezieht sich hierin auf eine Juxtaposition, die eine Durchführung der normalen Funktion der Komponenten ermöglicht. Somit bezieht sich eine Kodiersequenz, die zur Steuerung der Sequenzen "operabel verbunden" ist, auf eine Konfiguration, worin die Kodierungssequenz unter der Steuerung dieser Sequenzen exprimiert werden kann, und worin die DNA-Sequenzen die verbunden werden benachbart sind und im Falle eines Sekretionsleaders benachbart und in Lesephase sind. Beispielsweise ist DNA für eine Präsequenz oder einen Sekretionsleader operabel mit DNA für ein Polypeptid verbunden, wenn sie als Präprotein exprimiert wird, das an der Ausscheidung des Polypeptids teilnimmt; ein Promotor oder Verstärker ist operabel mit einer Kodierungssequenz verbunden, wenn er die Transkription der Sequenz beeinflußt; oder eine Ribosomenbindungsstelle ist operabel mit einer Kodierungssequenz verbunden, wenn sie angeordnet ist, um die Translation der Kodierungssequenz zu erleichtern. Das Verbinden erfolgt durch Ligieren an geeigneten Restriktionsstellen. Wenn es keine solche Stellen gibt, können gemäß herkömmlicher Verfahren synthetische Oligonukleotidadaptoren oder -linker verwendet werden.
Die hierin verwendeten Ausdrücke "Zelle", "Zellinie" und "Zellkultur" sind untereinander austauschbar und beziehen sich alle auf Nachkommenschaft. Somit umfaßt der Ausdruck "Transformanten" oder "transformierte Zellen" die primäre gegenständliche Zelle und daraus abgeleitete Kulturen ungeachtet der Anzahl von Übertragungen. Man beachte auch, daß aufgrund beabsichtigter oder unbeabsichtigter Mutationen nicht die gesamte Nachkommenschaft hinsichtlich des DNA-Gehalts identisch ist. Diese Ausdrücke umfassen auch die Mutanten-Nachkommenschaft, welche dieselbe Funktion aufweist, für die eine primäre gegenständliche Zelle gescreent wurde. Dort wo unterschiedliche Bezeichnungen beabsichtigt sind, geht die jeweilige Bedeutung aus dem Zusammenhang hervor.
"Steuersequenzen" bezieht sich auf DNA-Sequenzen, die für die Expression einer operabel verbundenen Kodierungssequenz in einem speziellen Wirtsorganismus notwendig sind. Die Steuersequenzen, die sich z.B. für Prokaryoten eignen, umfassen einen Promotor, wahlweise eine Operatorsequenz, eine Ribosomenbindungsstelle und möglicherweise Sequenzen, über die man heute noch wenig weiß. Es ist bekannt, daß eukaryotische Zellen Promotoren, Polyadenylierungssignale und Verstärker verwenden.
Der Ausdruck "Expressionssystem" bezieht sich auf DNA, die eine gewünschte Kodierungssequenz und Steuersequenz in operabler Verbindung enthält, sodaß die mit diesen Sequenzen transformierten Wirte die kodierten Proteine herstellen können. Zur Transformation kann das Expressionssystem auf einem Vektor enthalten sein, der hierin als "Expressionsvektor" bezeichnet wird. Die entsprechende DNA kann aber auch in das Wirtschromosom integriert sein.

B. Durchführungsarten der Erfindung

Zum Zwecke der vorliegenden Erfindung ist Variantenplasminogen jenes, das gegen proteolytische Spaltung zu seiner Zweikettenform, im allgemeinen durch Plasmin, resistent ist. Vorzugsweise basiert die Variantensequenz auf menschlichem Plasminogen. Während solche Varianten durch jedes beliebige Mittel, nämlich sowohl durch rekombinante als auch synthetische oder teilweise synthetische Mittel, hergestellt werden können, sind die Varianten vorzugsweise jene, in denen einer der Aminosäurereste, vorzugsweise Arginin an Position 561, das an der entscheidenden Spaltungsstelle bei der Umwandlung von HPg zu HPm angeordnet ist, durch eine andere Aminosäure ersetzt wird, vorzugsweise mit keinem Lysinrest und am bevorzugtesten mit einer Dikarboxyl enthaltenden Aminosäure oder Serin. Die bevorzugtesten Varianten sind demzufolge R561S-HPg, R561E-HPg und R561G-HPg unter Verwendung der unten angegebenen Nomenklatur. (Die Bezeichnung "A475" für HPg bezieht sich auf HPg der natürlichen Sequenz mit einem Alaninrest an Position 475 im Gegensatz zur Sequenz in pUC119PN127.6, die ein Valin an Position 475 aufweist. Die weiter unten und in den Patentansprüchen verwendeten Bezeichnungen R561S-HPg, R561E-HPg und R561G-HPg beziehen sich - soferne nicht anders angegeben - auf das HPg mit einem Alanin an Position 475).
Die Varianten können durch stellengerichtete Mutagenese von Nukleotiden in der für das Pg kodierenden DNA, wodurch für die Variante kodierende DNA entsteht, und durch anschließende Expression der DNA in der geeigneten Wirtszelle hergestellt werden.
Für proteolytisch resistentes Pg kodierende DNA kann auch vor der Expression in einer Wirtszelle durch jegliche Anzahl an Verfahren chemisch synthetisiert und zusammengesetzt werden. [Siehe z.B. Caruthers, US PS 4.500.707;Balland et al., Biochimie, 67: 725 ... (1985); Edge et al., Nature, 292: 756-762 (1982)].
In anderen Ausführungsformen kann die Variante unglykosyliert sein, wie dies z.B. durch Behandeln des in einem eukaryotischen Wirten exprimierten Plasminogens mit einem für einen solchen Zweck geeigneten Enzym, wie z.B. Glykopeptidase F, erreicht wird. Die Variante kann auch andere Mutationen enthalten, insbesondere alle jene, die für ihre Aktivität von Vorteil sind.
Hinsichtlich der Kurzbezeichnungen der hierin beschriebenen HPg-Varianten ist zu beachten, daß sich die Zahlen auf den/die Aminosäurerest/Position entlang der Aminosäuresequenzen von mutmaßlich reifem Pg beziehen. Die Aminosäureidentifizierung verwendet ein aus Einzelbuchstaben bestehendes Alphabet von Aminosäuren, d.h.
Asp D Asparaginsäure
Thr T Threonin
Ser S Serin
Glu E Glutaminsäure
Pro P Prolin
Gly G Glycin
Ala A Alanin
Cys C Cystein
Val V Valin
Met M Methionin
Ile I Isoleucin
Leu L Leucin
Tyr Y Tyrosin
Phe F Phenylala.
His H Histidin
Lys K Lysin
Arg R Arginin
Trp W Tryptophan
Gln Q Glutamin
Asn N Asparagin
Die Bezeichnung für eine hier angeführte Substitutionsvariante besteht aus einem Buchstaben, an den sich eine Zahl und darauffolgend ein Buchstabe anschließen. Der erste (ganz linke) Buchstabe bezeichnet die Aminosäure im reifen Pg des Wildtyps. Die Zahl bezieht sich auf die Aminosäureposition, an der die Aminosäuresubstitution erfolgt, und der zweite (rechte) Buchstabe bezeichnet die Aminosäure, die zur Ersetzung der Wildtyp-Aminosäure verwendet wird. Die Bezeichnung für eine Einfügungsvariante besteht aus dem Buchstaben i mit einer anschließenden Zahl, welche die Position des Rests in reifem Pg des Wildtyps kennzeichnet, vor dem/vor der die Einfügung beginnt, und einem oder mehreren daran anschließenden Großbuchstaben, die einschließend die durchzuführende Einfügung kennzeichnen. Die Bezeichnung für eine Löschungsvariante besteht aus dem Buchstaben d gefolgt von der Zahl der Startposition der Löschung zur Zahl der Endposition der Löschung, wobei die Positionen auf reifem Pg des Wildtyps beruhen. Mehrfachmutationen sind zur besseren Lesbarkeit in der Notierung durch einen Bei strich getrennt.
Beispiele der Nomenklatur sind wie folgt: eine Substitutionsvariante, worin Arginin an Position 561 des Wildtyp-Pg durch einen Glutaminsäurerest ersetzt ist, wird als R561E bezeichnet. Eine Substitutionsvariante mit Mehrfachsubstitutionen an aufeinanderfolgenden Positionen 561-562 von EE für RV wird als R561E, V562E bezeichnet. Eine Einfügungsvariante, worin Cystein und Valin nach Position 560 von Wildtyp-Pg eingefügt sind, wird als i560CV bezeichnet. Eine Löschungsvariante, worin die Aminosäuren an Positionen 561 bis 562 aus dem reifen Pg des Wildtyps gelöscht sind, wird als d561-562 bezeichnet. Die Notierung "HPg" folgt nach jedem Mutanten.
Von den meisten Löschungen und Einfügungen, und insbesondere den Substitutionen, wird nicht erwartet, daß sie einschneidende Veränderungen der Eigenschaften des rekombinanten Pg-Moleküls bewirken. Wenn es jedoch schwierig ist, die genaue Auswirkung der Substitution, Löschung oder Einfügung vor deren Durchführung vorauszusagen, z.B. beim Modifizieren der aktiven Stelle von Pg oder eines immunen Epitops, werden es Fachleute auf dem Gebiet zu schätzen wissen, daß die Auswirkung durch routinemäßige Screenassays ermittelt werden kann. Beispielsweise kann eine Variante typischerweise durch stellenspezifische Mutagenese der nativen für Pg kodierenden Nukleinsäure, Expression der Variantennukleinsäure in rekombinanter Zellkultur und wahlweise durch Reinigung aus der Zellkultur z.B. durch Immunoaffinitätsadsorption auf einer Kaninchen-polyklonalen-anti-Pg- Säule hergestellt werden.
Die Variante kann dann in einem geeigneten Screenassay hinsichtlich des gewünschten Merkmals gescreent werden. Beispielsweise kann eine Veränderung der immunologischen Eigenschaft des Pg, wie z.B. die Affinität für einen bestimmten Antikörper, durch kompetitive Immunassays gemessen werden. Veränderungen der Aktivierungswerte werden durch den geeigneten Assay gemessen. Modifikationen von solchen Proteineigenschaften wie Redox- oder Wärmestabilität, Hydrophobie, Anfälligkeit für proteolytischen Abbau oder die Neigung, mit Trägern oder zu Multimeren zu aggregieren, werden durch Verfahren geprüft, die für den Fachmann auf dem Gebiet wohlbekannt sind.
Die hierin geoffenbarten Vektoren und Verfahren eignen sich zur Verwendung in Wirtszellen in einem weiten Bereich von prokaryotischen und eukaryotischen Organismen, bevorzugter in Eukaryoten und am bevorzugtesten in Säugetierwirten.
Im allgemeinen sind Prokaryoten für anfängliches Klonen, Amplifizieren oder Lagern der interessierenden Vektoren vorzuziehen. Vektor-DNA kann man leicht aus bestimmten Prokaryoten erhalten. E.Coli K12 Stamm MM 294 (ATCC Nr.31.446) ist für diesen Zweck besonders geeignet. Andere geeignete Mikrobenstämme umfassen E.coli Stämme wie z.B. E.coli B und E.coli X1776 (ATCC Nr. 31.537). Diese Beispiele sind selbstverständlich nur veranschaulichend und nicht einschränkend.
Im allgemeinen werden Plasmidvektoren, die Replikon- und Steuersequenzen enthalten, die von mit der Wirtszelle kompatiblen Spezien abgeleitet sind, in Verbindung mit diesen prokaryotischen Wirten verwendet. Der Vektor trägt üblicherweise eine Replikationsstelle sowie Markierungssequenzen, die in transformierten Zellen für phänotypische Selektion sorgen können. Beispielsweise wird E.coli typischerweise unter Verwendung von pBR322, einem aus einer E.coli Spezies abgeleiteten Plasmid, transformiert (siehe z.B. Bolivar et al., Gene, 2: 95 [1977]). pBR322 enthält Gene für Ampicillin- und Tetracyclinresistenz und stellt somit ein einfaches Mittel zur Identifizierung transformierter Zellen dar. Das pBR322-Plasmid oder ein anderes mikrobielles Plasmid oder Phage muß auch Promotoren enthalten oder modifiziert werden, um diese zu enthalten, die durch den Mikrobenorganismus zur Expression der auswählbaren Markergene verwendet werden können.
Diese Promotoren, die am häufigsten in rekombinanter DNA-Konstruktion für prokaryotische Wirte verwendet werden, umfassen die ß-Lactamase- (Penicillinase) und Lactose-Promotorsysteme (Chang et al., Nature, 375: 615 [1978]; Itakura et al., Science, 198: 1056 [1977]; Goeddel et al., Nature, 281: 544 [1979]) und ein Tryptophan (trp) Promotorsystem (Goeddel et al., Nucleic Acids Res., 8: 4057 [1980]; EPO Anmeldungsveröff. Nr. 0036.776). Während diese die am häufigsten verwendeten sind wurden auch andere mikrobielle Promotoren entdeckt und verwendet und Details über ihre Nukleotidsequenzen sind veröffentlicht worden, wodurch ein Fachmann auf dem Gebiet in der Lage ist, sie funktionell mit Plasmidvektoren zu ligieren (siehe z.B. Siebenlist et al., Cell, 20: 269 [1980]).
Zur Expression werden eukaryotische Mikroben, wie z.B. Hefekulturen, verwendet. Saccharomyces cerevisiae oder herkömmliche Backhefe ist der am häufigsten verwendete eukaryotische Mikroorganismus, obwohl auch eine Anzahl anderer Stämme üblicherweise verfügbar ist. Zur Expression in Saccharomyces wird z.B. das Plasmid YRp7 (Stinchcomb et al., Nature, 282: 39 [1979]; Kingsman et al.,Gene, 7: 141 [1979]; Tschemper et al., Gene, 10: 157 [1980]) üblicherweise verwendet. Dieses Plasmid enthält bereits das trpl-Gen, das einen Selektionsmarker für einen Mutantenstamm von Hefe bereitstellt, der z.B. nicht in Tryptophan wachsen kann, ATCC Nr. 44.076 oder PEP4-1 (Jones, Genetics, 85: 12 [1977]). Die Gegenwart der trp1-Läsion als Eigenschaft des Hefewirtszellengenoms schafft dann eine wirksame Umgebung zum Nachweis von Transformation durch Wachstum in Abwesenheit von Tryptophan.
Geeignete Promotorsequenzen in Hefevektoren umfassen die Promotoren für 3-Phosphoglyceratkinase (Hitzeman et al., J.Biol.Chem., 255: 2073 [1980]) oder andere glykolytische Enzyme (Hess et al., J.Adv.Enzyme Reg., 7: 149 [1968]; Holland et al., Biochemistry, 17: 4900 [1978]), wie z.B. Enolase, Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase, Hexokinase, Pyruvatdecarboxylase, Phosphofructokinase, Glukose-6-phosphatisomerase, 3-Phosphoglyceratmutase, Pyruvatkinase, Triosephosphatisomerase, Phosphoglukoseisomerase und Glukokinase. Andere Promotoren, die den zusätzlichen Vorteil der durch Wachstumsbedingungen gesteuerten Transkription aufweisen, sind der Promotorbereich für Alkoholdehydrogenase 2, Isocytochrom C, Säurephosphatase, mit dem Stickstoffmetabolismus assoziierte Abbauenzyme und die oben erwähnte Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase sowie Enzyme, die für Maltoseund Galactoseverwendung verantwortlich sind. Es eignet sich jeder beliebige Plasmidvektor, der den hefekompatiblen Promotor, Replikationsursprung und Terminationssequenzen enthält.
Neben Mikroorganismen können auch aus multizellularen Organismen abgeleitete Zellkulturen als Wirte verwendet werden. Im Prinzip ist jede derartige Zellkultur anwendbar, ob sie aus einer Wirbeltier- oder einer Wirbellostier-Kultur stammt.
Zur Expression in wirbellosen Wirten wurden zahlreiche Baculovirenstämme und Varianten und entsprechende zulässige Insekten-Wirtszellen aus Wirten wie z.B. Aedes aegypti-, (Moskito), Aedes albopictus-(Moskito), Drosophilia melanogaster-, (Fruchtfliege) und Bombyx mori-Wirtszellen identifiziert. (Siehe z.B. Luckow et al., Bio/Technology, 6: 47-55 (1988); und Maeda et al., Nature, 315: 592-594 (1985)). Eine Vielzahl solcher Virenstämme ist öffentlich verfügbar, z.B. die L-1 Variante von Autographa californica NPV und der Bm-5 Stamm von Bombyx mori NPV, und solche Viren können hierin als Virus gemäß der vorliegenden Erfindung insbesondere für die Transfektion von Spodoptera frugiperda-Zellen verwendet werden.
Das Hauptaugenmerk lag jedoch auf Wirbeltierzellen, und die Vermehrung von Wirbeltierzellen in Kultur (Gewebekultur) wurde in den letzten Jahren zu einem Routineverfahren [Tissue Culture, Academic Press, Kruse und Patterson, Hrsg (1973)].
Beispiele solcher geeigneter Wirbeltierzellinien umfassen die Affennieren CVI-Linie, die durch die SV40-Sequenzen transformiert ist (COS-7, ATCC CRL 1651); menschliche Embryonennierenlinie (293, Graham et al., J.Gen.Virol., 36: 59 (1977); Babyhamsternierenzellen (BHK, ATCC CCL 10); chinesische Hamstereierstockzellen (Urlaub und Chasin,Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 77: 4216 (1980)); Mäuse-Sertolizellen (TM4, Mather, Biol.Reprod., 23: 243-251 (1980)); Affennierenzellen (CVI, ATCC CCL 70); Nierenzellen der afrikanischen Grünen Meerkatze (VERO-76, ATCC CRL-1587); menschliche Gebärmutterhalskrebszellen (HELA, ATCC CCL 2); Hundenierenzellen (MDCK, ATCC CCL 34); Büffelrattenleberzellen (BRL, 3A, ATCC CRL 1442); menschliche Lungenzellen (W138, ATCC CCL 75); menschliche Leberzellen (Hep G2, HB 8065); Mäusebrusttumorzellen (MMT 060562, ATCC CCLSI); Rattenhepatomzellen (HTC, MI.54, Baumann et al., J.Cell.Biol., 85: 1-8 (1980)); und TRI-Zellen (Mather et al., Annals N.-Y. Acad.Sci., 383: 44-68 (1982)). Der bevorzugteste eukaryotische Wirt zur stabilen Expression ist eine chinesische Hamstereierstockzellinie.
Zur Verwendung in Säugetierzellen werden die Steuerungsfunktionen auf den Expressionsvektoren oft durch Virenmaterial bereitgestellt. Häufig verwendete Promotoren sind z.B. aus den Genomen von Polyoma, Adenovirus2, Retroviren, Cytomegalovirus und am häufigsten vom Affenvirus 40 (SV 40) abgeleitet. Andere Promotoren sind jene aus heterologen Quellen, z.B. der β-Actinpromotor. Die frühen und späten Promotoren des SV 40-Virus sind besonders geeignet, da beide leicht aus dem Virus als Fragment gewonnen werden können, das auch den SV 40-Virenreplikationsursprung enhält [Fiers et al., Nature, 273: 113 (1978)]. Kleinere oder größere SV4O-Fragmente können auch verwendet werden, mit der Maßgabe, daß die Sequenz von etwa 250 bp enthalten ist, die sich von der HindIII-Stelle zur im Virenreplikationsursprung liegenden BgII-Stelle erstreckt. Der unmittelbare frühe Promotor des menschlichen Cytomegalovirus wird zweckmäßig als ein HindIII- Restriktionsfragment gewonnen. Greenaway et al., Gene, 18: 355-360 (1982). Weiters ist es auch möglich und oft wünschenswert, Promotor- oder Steuersequenzen zu verwenden, die normalerweise mit der gewünschten Gensequenz assoziiert sind, mit der Maßgabe, daß solche Steuersequenzen mit den Wirtszellsystemen kompatibel sind.
Die Transkription einer für das Pg kodierenden DNA durch höhere Eukaryoten wird durch Einfügen einer Verstärkersequenz in den Vektor gesteigert. Der Verstärker ist ein cis-wirkendes DNA-Element von üblicherweise etwa 10 bis 300 bp, das auf einen Promotor einwirkt, um seine Transkriptionsaktivität zu verstärken. Verstärker sind relativ ausrichtungs- und anordnungsunabhängig, wobei man feststellte, daß sie sich 5' (Laimins et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 78: 993 (1981)) und 3' (Lusky et al., Mol.Cell Bio., 3: 1108 (1983)) zur Transkriptionseinheit innerhalb eines Introns (Banerji et al., Cell, 33: 729 (1983)) als auch innerhalb der Kodierungssequenz selbst befinden (Osborne et al., Mol.Cell Bio., 4: 1293 (1984)). Vorzugsweise ist das Verstärkerelement jedoch stromaufwärts von der erfindungsgemäßen Promotorsequenz angeordnet. Es sind viele Verstärkersequenzen aus Säugetiergenen bekannt (Globin, Elastase, Albumin, α-Fetoprotein und Insulin). Typischerweise verwendet man jedoch einen Verstärker aus einem eukaryotischen Zellvirus. Beispiele sind der SV40-Verstärker auf der späten Seite des Replikationsursprungs (bp 100-270), der Cytomegalovirus-Frühpromotorverstärker, der Polyomaverstärker auf der späten Seite des Replikationsursprungs und Adenovirusverstärker. Am bevorzugtesten ist hierin der SV40-Verstärkerbereich.
In Säugetierwirtszellen verwendete Expressionsvektoren enthalten auch Polyadenylierungsstellen. Beispiele von Polyadenylierungsbereichen sind jene, die aus Viren wie z.B. dem SV40 (früh oder spät) oder HBV abgeleitet sind.
Ein Replikationsursprung kann entweder durch Konstruieren des Vektors zum Einschließen eines exogenen Ursprungs, wie er z.B. aus SV40 oder einer anderen viralen (z.B. Polyoma, Adeno, VSV, BPV) Quelle abgeleitet werden kann, oder durch die Wirtszelle vorgesehen sein. Wenn der Vektor in das Wirtszellenchromosom integriert ist, ist das letztere oft ausreichend.
Die Expressionsvektoren können geeigneterweise ein Selektionsgen enthalten, das auch als auswählbarer Marker bezeichnet wird. Ein Selektionsgen kodiert für ein Protein, das für das überleben oder Wachstum einer mit dem Vektor transformierten Wirtszelle erforderlich ist. Beispiele geeigneter auswählbarer Marker für Säugetierzellen umfassen Dihydrofolatreductase (DHFR), Thymidinkinase (TK) oder Neomycin. Wenn solche auswählbaren Marker erfolgreich in eine Säugetierwirtszelle übertragen werden, kann die transformierte Säugetierwirtszelle überleben, wenn sie selektivem Druck ausgesetzt wird.
Es gibt zwei weitverbreitet verwendete und unterschiedliche Kategorien von selektiven Systemen. Die erste Kategorie beruht auf dem Metabolismus einer Zelle und der Verwendung einer Mutantenzellinie, der es an der Fähigkeit mangelt, unabhängig von einem ergänzenden Medium zu wachsen. Zwei Beispiele sind CHO DHFR-Zellen und Mäuse-LTK-Zellen. Diesen Zellen mangelt es an der Fähigkeit, ohne die Zugabe von solchen Nährstoffen die Thymidin oder Hypoxanthin zu wachsen. Da bei diesen Zellen bestimmte Gene fehlen, die für einen vollständigen Nukleotidsyntheseweg erforderlich sind, können sie nur dann überleben, wenn die fehlenden Nukleotide in einem ergänzenden Medium bereitgestellt werden. Eine Alternative zum Ergänzen des Mediums ist die Einführung eines intakten DHFR- oder TF-Gens in die Zellen, die einen Mangel der jeweiligen Gene aufweisen, wodurch ihre Wachstumsanforderungen geändert werden. Einzelne Zellen, die mit dem DHFR- oder TK-Gen nicht transformiert wurden, sind in einem nicht ergänzten Medium nicht überlebensfähig. Daher erfordert die direkte Auswahl dieser Zellen Zellwachstum in Abwesenheit von Ergänzungsnährstoffen.
Die zweite Kategorie ist die dominante Auswahl, die sich auf ein Selektionsschema bezieht, das keine Verwendung einer Mutantenzellinie erfordert. Bei diesem Verfahren wird typischerweise ein Arzneimittel zum Abbruch des Wachstums einer Wirtszelle verwendet. Jene Zellen, die ein neues Gen aufweisen, würden ein Arzneimittelresistenz verleihendes Protein exprimieren und die Auswahl überleben. Beispiele von in dominanter Auswahl verwendeten Arzneimitteln umfassen Neomycin (Southern und Berg, J.Molec.Appl.Genet., 1: 327 (1982)), Mycophenolsäure (Mulligan und Berg, Science, 209: 1422 (1980)) oder Hygromycin (Sugden et al., Mol.Cell.Biol., 5: 410-413 (1985)). Die drei oben angeführten Beispiele sehen die Verwendung von bakteriellen Genen unter eukaryotischer Steuerung vor, um Resistenz gegen das entsprechende Arzneimittel, d.h. Neomycin (G418 oder Geneticin), xgpt (Mycophenolsäure) bzw. Hygromycin, zu verleihen.
Es werden durch Zellkulturen unter Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens äußerst zufriedenstellende Mengen an Polypeptid erzeugt; Verfeinerungen unter Verwendung einer sekundären Kodierungssequenz dienen jedoch dazu, die Produktionswerte noch zu steigern. Eine sekundäre Kodierungssequenz umfaßt Dihydrofolatreductase (DHFR), die durch einen von außen gesteuerten Parameter beeinflußt wird, wie z.B. Methotrexat (MTX), wodurch eine Expressionssteuerung durch Steuerung der Methotrexatkonzentration ermöglicht wird.
Bei der Auswahl einer bevorzugten Wirtszellinie zur Transfektion durch die erfindungsgemäßen Vektoren, die DNA-Sequenzen enthalten, die sowohl für das interessierende Gen als auch das DHFR-Protein kodieren, ist zweckmäßig, den Wirt gemäß dem Typ des verwendeten DHFR-Proteins auszuwählen. Wenn Wildtyp-DHFR-Protein verwendet wird, ist vorzuziehen, eine Wirtszelle auszuwählen, die einen Mangel an DHFR aufweist, wodurch die Verwendung der DHFR-Kodierungssequenz als Marker zur erfolgreichen Transfektion in selektivem Medium ermöglicht wird, das einen Mangel an Hypoxanthin, Glycin und Thymidin aufweist. Eine für diesen Fall geeignete Wirtszelle ist die chinesische Hamstereierstock- (CHO) Zellinie, die einen Mangel an DHFR-Aktivität aufweist und wie von Urlaub und Chasin, Proc.Natl.Acad.Sci. (USA) 77: 4216 (1980) beschrieben hergestellt und vermehrt wird.
Wird hingegen DHFR-Protein mit niedriger Bindungsaffinität für MTX als Steuersequenz verwendet, ist es nicht erforderlich, DHFR-arme Zellen zu verwenden. Da die Mutanten-DHFR gegen Methotrexat resistent ist, können MTX-hältige Medien als Selektionsmittel verwendet werden, mit der Maßgabe, daß die Wirtszellen selbst Methotrexat-empfindlich sind. Die meisten eukaryotischen Zellen, die MTX absorbieren bzw. aufnehmen können, scheinen Methotrexat-empfindlich zu sein. Eine solche geeignete Zellinie ist eine CHO-Linie, CHO-K1 (ATCC Nr. CCL 61).
Die Konstruktion von geeigneten Vektoren, welche die gewünschten Kodierungs- und Steuersequenzen enthalten, sieht die Verwendung von Standard-Ligationsverfahren vor. Isolierte Plasmide oder DNA-Fragmente werden gespalten, zurechtgeschnitten und erneut in der gewünschten Form ligiert, um die erforderlichen Plasmide herzustellen.
Wenn abgestumpfte Enden erforderlich sind, kann das Präparat 15 Minuten lang bei 15ºC mit 10 Einheiten Polymerase I (Klenow), Phenol- Chloroform-extrahiert und äthanolgefällt werden.
Die Trennung der gespaltenen Fragmente nach Größe kann unter Verwendung von 6% Polyacrylamidgel erfolgen, wie dies durch Goeddel et al., Nucleic Acids Res., 8: 4057 (1980) beschrieben ist.
Für die Analyse zur Bestätigung korrekter Sequenzen in konstruierten Plasmiden werden die Ligationsmischungen typischerweise verwendet, um E.coli K12 Stamm 294 (ATCC 31.446) oder andere geeignete E.coli-Stämme zu transformieren, und erfolgreiche Transformanten im Bedarfsfall durch Ampicillin- oder Tetracyclinresistenz ausgewählt. Plasmide aus den Transformanten werden durch Restriktionskartieren und/oder DNA-Sequenzieren mittels des Verfahrens von Messing et al., Nucleic Acids Res., 9: 309 (1981) oder mittels des Verfahrens von Maxam et al., Methods of Enzymology, 65: 499 (1980) hergestellt und analysiert.
Nach der Einführung der DNA in den Säugetierzellwirten und der Auswahl im Medium hinsichtlich stabiler Transfektanten erfolgt die Verstärkung der DHFR-Proteinkodierungssequenzen durch Züchten von Wirtszellkulturen in Gegenwart von etwa 200-500 nM Konzentrationen von Methotrexat, einem kompetitiven Inhibitor der DHFR-Aktivität. Der wirksame Konzentrationsbereich hängt natürlich in hohem Maße von der Beschaffenheit des DHFR-Gens und den Eigenschaften des Wirten ab. Selbstverständlich können allgemein definierte Ober- und Untergrenzen nicht festgelegt werden. Geeignete Konzentrationen anderer Folsäureanaloge oder anderer DHFR hemmender Verbindungen können auch verwendet werden. MTX selbst ist jedoch geeignet, leicht verfügbar und wirksam.
Zwischen fibrinolytischen Enzymen und Plasminogen gebildete Komplexe können als thrombolytische Mittel verwendet werden, wie dies ausführlich durch Smith et al., US PS 4.808.405, die in Beispiel 5 weiter unten dargestellt ist, beschrieben wird. Kurz gesagt kann ein Enzymderivat hergestellt werden, das einen binären Komplex zwischen Streptokinase und Plasminogen umfaßt, welcher Komplex eine für fibrinolytische Aktivität unentbehrliche katalytische Stelle aufweist, die durch eine Gruppe blockiert wird, die durch Hydrolyse solcherart entfernbar ist, daß die Ratenkonstante Pseudo erster Ordnung für die Hydrolyse des Derivats im Bereich von 10&supmin;&sup6; sek&supmin;¹ bis 10&supmin;³ sek&supmin;¹ in isotonischen wässerigen Medien bei einem pH-Wert von 7,4 bei 37ºC liegt, mit der Maßgabe, daß die Gruppe, welche die katalytische Stelle blockiert, keine p-Guanidinobenzoylgruppe ist. Beispiele solcher geeigneter Gruppen umfassen Acylgruppen wie z.B. Benzoyl, substituiertes Benzoyl, Acryloyl oder substituierte Acryloylgruppen.
Ein Verfahren zum Herstellen der Komplexe umfaßt das Vermischen von Streptokinase mit Plasminogen in Gegenwart eines Überschusses eines Blockierungsmittels der Formel A-B oder E-F, worin A eine Gruppe ist, welche für die für fibrinolytische Aktivität unentbehrliche katalytische Stelle selektiv ist und die zur Übertragung von der Gruppe B zur katalytischen Stelle fähig ist, und B eine Gruppe ist, die das Binden von A an das Enzym erleichtert; E eine anordnende Gruppe ist, die das Mittel in der katalytischen Stelle anordnet und F eine Gruppe ist, die zur Übertragung von der anordnendrn Gruppe zur katalytischen Stelle und zum wahlweisen Isolieren der so gebildeten Derivate fähig ist. Vorzugsweise ist die durch Hydrolyse entfernbare Gruppe eine Acylgruppe, am bevorzugtesten eine Benzoyl-, substituierte Benzoyl-, Acryloyl- oder substituierte Acryloylgruppe, z.B. Benzoyl substituiert mit Halogen, C&sub1;&submin;&sub6;-Alkyl, C&sub1;&submin;&sub6;-Alkoxy, C&sub1;&submin;&sub6;-Alkanoyloxy oder C&sub1;&submin;&sub6;-Alkanoylamino oder Acryloyl substituiert mit C&sub1;&submin;&sub6; Alkyl, Furyl, Phenyl oder C&sub1;&submin;&sub6; Alkylphenyl. Weiters ist AB vorzugsweise p-Nitrophenyl-p'-guanidinbenzoat, Gruppe E p-Amidinophenyl oder p-Acetamidophenyl und Gruppe F eine Benzoyl- oder Acryloylgruppe.
Als Teil der vorliegenden Erfindung wird auch eine pharmazeutische Zusammensetzung angesehen, die eine menschliche Plasminogenvariante enthält. Vorzugsweise umfaßt eine solche Zusammensetzung einen pharmazeutisch verträglichen Träger wie z.B. einen isotonischen wässerigen Puffer oder "Wasser zur Injektion" pharmazeutischer Qualität. Weiters umfaßt die Erfindung eine pharmazeutische Formulierung umfassend einen pharmazeutisch verträglichen Träger gemeinsam mit einem fibrinolytischen Enzym, vorzugsweise einem Enzymkomplex mit der Plasminogenvariante, noch bevorzugter einem binären Komplex der Streptokinase- und Plasminogenvariante und am bevorzugtesten einem p-Anisoylstreptokinase/Plasminogenkomplex ohne innere Peptidbindungsspaltung, wie dies bei Smith et al., US PS 4.808.405, oben, beschrieben ist. In einer weiteren Ausführungsform ist die aktive Stelle des für fibrinolytische Aktivität verantwortlichen Komplexes durch eine Gruppe blockiert, die durch Hydrolyse entfernbar ist, sodaß die Ratenkonstante pseudo erster Ordnung für die Hydrolyse des Komplexes im Bereich von 10&supmin;&sup6; sek&supmin;¹ bis 10&supmin;³ sek&supmin;¹ in isotonischen wässerigen Medien bei einem pH-Wert von 7,4 bei 37ºC liegt.
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen werden gemäß der auf die parenterale Verabreichung beim Menschen anzupassenden Standardverfahren formuliert.
Typischerweise sind die Zusammensetzungen zur intravenösen Verabreichung Lösungen des sterilen Derivats in einem sterilen isotonischen wässerigen Puffer. Falls erforderlich enthält die Zusammensetzung auch ein Solubilisierungsmittel für den Komplex. Im allgemeinen wird der Komplex in Form von Dosierungseinheiten, z.B. als Trockenpulver oder wasserfreies Konzentrat in einem dicht verschlossenen Behälter wie z.B. einer Ampulle geliefert. Zur Verabreichung durch Infusion wird der Komplex aus einer Infusionsflasche ausgegeben, die steriles Wasser für Injektionszwecke pharmazeutischer Qualität enthält. Zur Verabreichung durch Injektion wird der Komplex aus einem Fläschchen mit sterilem Wasser für Injektionszwecke ausgegeben. Die injizierbare oder infundierbare Zusammensetzung wird durch Vermischen der Ingredienzien vor der Verabreichung angefertigt.
Die wirksame Menge des verabreichten Komplexes hängt von vielen Faktoren ab, darunter der Menge an erforderlicher Fibrinolyse und der Geschwindigkeit, mit der sie erforderlich ist, dem Ausmaß von Thromboembolismus und der Position und Größe des Gerinnsels, doch die Menge wird im allgemeinen durch das zu erzielende Ergebnis, d.h. die Lyse des Gerinnsels, bestimmt. Bei einem Patienten mit einer Lungenembolie oder einem lebensbedrohenden Thrombus beispielsweise ist die Verabreichung eines Bolus rasch wirkenden Materials erforderlich. Wo es hingegen erwünscht ist, die Bildung von Thromben nach einer Operation zu verhindern, ist eine geringe Menge an langsam wirkendem Material besonders nützlich. Die präzise jeweils zu verabreichende Dosis und die Verabreichungsweise können aufgrund der durch den Arzt festgestellten Umstände bestimmt werden. Im allgemeinen jedoch erhält ein wegen eines Thrombus mittlerer Größe behandelter Patient eine Dosis von 0,10 bis 1,0 mg/kg Körpergewicht täglich, und zwar entweder durch Injektion (in bis zu acht Dosen) oder durch Infusion.
Um die Beispiele und Patentansprüche zu vereinfachen, wird auf einige häufig auftretende Verfahren mit Kurzbezeichnungen Bezug genommen.
"Transfektion" bezieht sich auf die Aufnahme eines Expressionsvektors durch eine Wirtszelle, ob irgendwelche Kodierungssequenzen tatsächlich exprimiert werden oder nicht. Zahlreiche Transfektionsverfahren sind dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt, z.B. CaPO&sub4; oder Elektroporation. Eine erfolgreiche Transfektion erkennt man im allgemeinen daran, daß irgendein Anzeichen der Funktion dieses Vektors innerhalb der Wirtszelle auftritt.
"Transformation" bedeutet das Einführen von DNA in einen Organismus, sodaß die DNA entweder als extrachromosomales Element oder durch einen chromosomalen Integranten replizierbar ist. Je nach verwendeter Wirtszelle erfolgt die Transformation unter Verwendung von Standardverfahren, die sich für solche Zellen eignen. Die Kalziumbehandlung unter Verwendung von Kalziumchlorid, wie sie durch Cohen, S.N. Proc.Natl.Acad.Sci. (USA), 69: 2110 (1972); Mandel et al., J.Mol.Biol.53:154 (1970); und vor ganz kurzem Liljestrom et al., Gene, 40:241-246 (1985) beschrieben ist, wird im allgemeinen für Prokaryoten oder andere Zellen angewendet, die substantielle Zellwandbarrieren enthalten. Für Säugetierzellen ohne solche Zellwände ist das Kalziumphosphat-Ausfällungsverfahren [Graham, F. und van der Eb, A., Virology, 52: 456-457 (1978); Kingston, in Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, et al., Hrsg., (John Wiley & Sons, New York, 1987), 1.8.1.-1.8.3.] vorzuziehen. Allgemeine Aspekte von Säugetierzellwirtssystem-Transformationen wurden durch Axel in der US PS 4.399.216 vom 16.August 1983 beschrieben. Transformationen zu Hefe werden typischerweise gemäß dem Verfahren von Van Solingen, P., et al., J.Bact., 130: 946 (1977) und Hsiao, C.L., et al., Proc.Natl.Acad.Sci. (USA) 76: 3829 (1979) durchgeführt. Es können jedoch auch andere Verfahren zum Einführen von DNA in die Zellen wie z.B. durch Kerninjektion oder durch Protoplastfusion verwendet werden.
"Plasmide" werden durch ein kleingeschriebenes p gekennzeichnet, vor und/oder hinter dem Großbuchstaben und/oder Zahlen stehen. Die hierin angeführten Ausgangsplasmide sind im Handel erhältlich und uneingeschränkt öffentlich verfügbar oder können gemäß veröffentlichter Verfahrensweisen aus solchen verfügbaren Plasmiden konstruiert werden. Weiters sind andere äquivalente Plasmide auf dem Gebiet bekannt, wie dies für den Fachmann offenkundig ist.
Der hierin angeführte Ausdruck der "PCR"-Technik bedeutet folgendes: Geringe Mengen eines speziellen DNA-Stücks können unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion (PCR) verstärkt werden, wie in der US PS 4.683.195 vom 28.Juli 1987 beschrieben ist. Im allgemeinen muß Sequenzinformation von den Enden des interessierenden Abschnitts oder darüber hinaus verfügbar sein, sodaß Oligonukleotidprimer konstruiert werden können; diese Primer zeigen zueinander und sind gegenüberliegenden Strängen der zu amplifizierenden Schablone hinsichtlich der Sequenz identisch oder ähnlich. Die 5'-terminalen Nukleotide der zwei Primer fallen mit den Enden des amplifizierten Materials zusammen. Mithilfe von PCR können spezifische DNA-Sequenzen aus Gesamt-Genom-DNA, aus zellularer Gesamt-RNA transkribierter cDNA, Bakteriophage oder Plasmidsequenzen, usw. amplifiziert werden. Für allgemeine Informationen siehe H.Erlich, Hrsg., PCR Technology, Stockton Press, N.Y, 1989.
Der hierin verwendete Ausdruck der "PCR-Mutagenese" bezieht sich auf das folgende Verfahren (siehe Erlich, oben, Kapitel von R.Higuchi, S.61-70): Wenn kleine Mengen an Schablonen-DNA als Ausgangsmaterial in einer PCR verwendet werden, können Primer, deren Sequenz sich vom entsprechenden Bereich in einer Schablonen-DNA geringfügig unterscheidet zur Erzeugung relativ großer Mengen eines soezifischen DNA-Fragments verwendet werden, das sich nur an jenen Positionen von der Schablonensequenz unterscheidet, wo sich die Primer von der Schablone unterscheiden. Zur Einführung einer Mutation in eine Plasmid-DNA wird einer der Primer konstruiert, um die Position der Mutation zu überlappen und die Mutation zu enthalten; die Sequenz des anderen Primers muß mit einem Sequenzabschnitt des gegenüberliegenden Strangs des Plasmids identisch sein, doch diese Sequenz kann Überall auf der Plasmid-DNA angeordnet sein. Es ist jedoch vorzuziehen, daß die Sequenz des zweiten Primers innerhalb von 200 Nukleotiden von jener des ersten angeordnet ist, sodaß am Schluß der gesamte amplifizierte durch die Primer begrenzte DNA-Bereich leicht sequenziert werden kann. PCR-Amplifikation unter Verwendung eines Primerpaars wie soeben beschrieben führt zu einer Population von DNA-Fragmenten, die sich an der Position der durch den Primer bestimmten Mutation und möglicherweise an anderen Positionen unterscheiden, da das Schablonenkopieren etwas fehleranfällig ist.
Im weiter unten ausführlich beschriebenen Verfahren ist das Verhältnis von Schablone zum Produktmaterial äußerst gering, und als Ergebnis enthält die große Mehrheit von Produkt DNA-Fragmenten die gewünschte(n) Mutation(en). Dieses Produktmaterial wird verwendet, um den entsprechenden Bereich im Plasmid, das als PCR-Schablone diente, unter Verwendung von DNA-Technologie zu ersetzen. Mutationen an getrennten Positionen können entweder unter Verwendung eines zweiten Mutantenprimers oder mittels Durchführung einer zweiten PCR mit unterschiedlichen Mutantenprimern sowie durch gleichzeitiges Ligieren der zwei resultierenden PCR-Fragmente mit dem Vektorfragment in einer drei- oder mehrteiligen Ligation gleichzeitig eingeführt werden.
Das in den unten angeführten Beispielen angewendete PCR-Mutageneseverfahren war wie folgt: Schablonenplasmid-DNA (1 ug) wurde durch Digestion mit einer Restriktionsendonuklease linearisiert, die eine einzige Erkennungsstelle in der Plasmid-DNA außerhalb des zu amplifizierenden Bereichs aufweist. Von diesem Material wurden 1-5 ng zu einer PCR-Mischung hinzugefügt, die 16,6 mM (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, 67 mM Tris.HCI (pH-Wert 8,8), 6,7 mM MgCl&sub2;, 6,7 uM EDTA, 10 mM 2-Mercaptoäthanol, 1 mM von jeweils dATP, dCTP, dGTP und TTP, 170 ug/ml Rinderserumalbumin 25 omol jedes Oligonukleotidorimers und 1 ul Thermus aquaticus (Taq) DNA-Polymerase (5 Einheiten/ul, gekauft bei Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT und Emeryville, CA) in einem Endvolumen von 50 ul in einem 0,5 ml Reaktionsfläschchen enthielt. Die Reaktionsmischung wurde mit 35ul Mineralo uberschichtet und in einen DNA-Thermal Cycler gefüllt (gekauft bei Perkin-Elmer Cetus), der folgendermaßen programmiert war:
Zeitverzugsdatei 12 Min 94CC
Wärmezyklusdatei 1 Min 50ºC
2-3 Min 68-72ºC
1 Min 94ºC
20 Zyklen
Zeitverzugsdatei 4 Min 50ºC
Zeitverzugsdatei 12 Min 68ºC
Einweichdatei 4ºC
Jede dargestellte Datei wurde mit der auf der nächsten Zeile verbunden. Am Ende des Programms wurde das Reaktionsfläschchen aus dem Wärmecycler entfernt und die wässerige Phase auf ein neues Fläschchen übertragen, mit Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (50:50:1 vol) extrahiert und mit Äthanol ausgefällt und die DNA mittels Standardverfahren gewonnen. Dieses Material wurde anschließend den geeigneten Behandlungen zum Einsetzen in einen Vektor ausgesetzt.
"Digestion" von DNA bezieht sich auf das katalytische Spalten der DNA mit einem Enzym, das nur an speziellen Nukleotidsequenzen in der DNA wirkt. Solche Enzyme nennt man Restriktionsenzyme und die Sequenz, für die jedes soezifisch ist, Restriktionsstelle. Die verschiedenen hierin verwendeten Restriktionsenzyme sind im Handel erhältlich, und es werden ihre von den Enzymlieferfirmen angegebenen Reaktionsbedingungen, Cofaktoren und anderen Anforderungen verwendet. Restriktionsenzyme werden üblicherweise durch Abkürzungen gekennzeichnet, die aus einem Großbuchstaben und nachfolgenden anderen Buchstaben, die den Mikroorganismus bezeichnen, aus dem jedes Restriktionsenzym ursprünglich gewonnen wurde, sowie einer das spezielle Enzym kennzeichnenden Zahl bestehen. Im allgemeinen wird etwa 1 ug Plasmid oder DNA-Fragment mit etwa 1-2 Enzymeinheiten in etwa 20 ul Pufferlösung verwendet. Geeignete Puffer und Substratmengen für bestimmte Restriktionsenzyme sind vom Hersteller angegeben. Üblicherweise erfolgt eine Inkubation von etwa 1 Stunde bei 37ºC, kann jedoch je nach den Anweisungen des Herstellers variieren. Nach der Inkubation wird Protein durch Extraktion mit Phenol und Chloroform entfernt und die digerierte Nukleinsäure durch Ausfällen mit Äthanol aus der wässerigen Fraktion entfernt. Im Bedarfsfall schließt sich an die Digestion mit einem Restriktionsenzym bakterielle alkalische Phosphatase-vermittelte Hydrolyse der terminalen 5'-Phosphate, um ein "Ringschließen" oder Bilden einer geschlossenen Schleife der beiden Enden eines DNA-Fragments zu verhindern, was das Einfügen eines weiteren DNA-Fragments an der Restriktionsstelle behindern würde. Soferne nicht anders angegeben, schließt sich an die Digestion von Plasmiden keine 5'-terminale Dephosphorylierung an. Verfahrensweisen und Reagentien für die Deohosphorylierung sind herkömmlich (T.Maniatis et al., 1982: Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory, 1982) S. 133-134).
"Gewinnung" oder "Isolierung" eines bestimmten DNA-Fragments aus einem Restriktionsdigest bedeutet die Trennung des Digests auf Polyacrylamid- oder Agarosegel durch Elektrophorese, Identifizierung des interessierenden Fragments durch Vergleich seiner Mobilität im Vergleich zu jener der Marker-DNA-Fragmente eines bekannten Molekulargewichts, Entfernen des Gelabschnitts, der das gewünschte Fragment enthält und Trennung des Gels von DNA. Diese Verfahrensweise ist allgemein bekannt. Siehe z.B. R.Lawn et al., Nucleic Acids Res. 9: 6103-6114 (1981) und D.Goeddel et al., Nucleic Acids Res. 8: 4057 (1980).
"Ligation" bezieht sich auf das Verfahren zum Bilden von Phosphodiesterbindungen zwischen den Doppelstrang-Nukleinsäurefragmenten (T.Maniatis et al., 1982, oben, S.146). Soferne nicht anders angegeben kann Ligation unter Verwendung bekannter Puffer und Bedingungen mit 10 Einheiten T4 DNA-Ligase ("Ligase") pro 0,5 ug etwa äquimolarer Mengen der zu ligierenden DNA-Fragmente durchgeführt werden.
"Herstellung" von DNA aus Transformanten bedeutet das Isolieren von Plasmid-DNA aus mikrobieller Kultur. Soferne nicht anders angegeben kann das alkalische SDS-Verfahren nach Maniatis et al, 1982, siehe oben, S.90, verwendet werden.
"Oligonukleotide" sind Einzel- oder Doppelstrangpolydesoxynukleotide kurzer Länge, die durch bekannte Verfahren chemisch synthetisiert werden (wie z.B. Phosphotriester-, Phosphit- oder Phosphoramiditchemie unter Verwendung von Festphasenverfahren wie z.B. in EP Patentveröffentlichung Nr. 266.032, veröffentlicht am 4.Mai 1988, beschrieben oder über Desoxynukleosid H-Phosphonat-Zwischenprodukte, wie z.B. durch Froehler et al., Nucl.Acids Res., 14: 5399-5407 [1986] beschrieben ist). Danach werden sie auf Polyacrylamidgels gereinigt.
"Stellengerichtete Mutagenese" ist ein Standardverfahren auf dem Gebiet und wird unter Verwendung eines synthetischen Oligonukleotidprimers durchgeführt, der zu einer zu mutagenisierenden Einzelstrangphage-DNA komplementär ist, abgesehen von beschränkter fehlender Übereinstimmung, welche die gewünschte Mutation darstellt. Kurz gesagt wird das synthetische Oligonukleotid als Primer zur Lenkung der S.ynthese eines zum Phage komplementären Strangs verwendet, und die resultierende Doppelstrang-DNA wird zu einem Phage-tragenden Wirtsbakterium transformiert. Kulturen transformierter Bakterien werden in Top Agar plattiert, wodurch die Plaquebildung aus einzelnen, den Phagen beherbergenden Zellen ermöglicht wird. Theoretisch enthalten 50% der neuen Plaques den Phagen, der als Einzelstrang die mutierte Form aufweist; 50% weisen die ursprüngliche Sequenz auf. Die Plaques werden mit kinasebehandeltem synthetischen Primer bei einer Temperatur hybridisiert, die eine Hybridisierung einer genauen Übereinstimmung ermöglicht, bei welcher Temperatur jedoch die fehlenden Übereinstimmungen mit dem ursprünglichen Strang ausreichen, um Hybridisierung zu verhindern. Plaques, die mit der Sonde hybridisieren, werden dann ausgewählt und kultiviert und die DNA gewonnen.
Die folgenden Beispiele sollen die beste nun bekannte Durchführungsart der Erfindung darstellen, die jedoch nicht darauf beschränkt ist.

BEISPIEL I

Konstruktion von t-PA Zwischenexpressionsvektoren

Verschiedene t-PA Vektoren wurden durch Ändern mehrerer Merkmale der Spleißdonor-Intron-Spleißakzeptor-Einheit aus dem Stammvektor pSVI-tPA abgeleitet, um gezielt die Wirksamkeit der korrekten Entfernung des Introns zu erhöhen.

a. pSVI-tPA

Abschnitte von zwei vorher geoffenbarten Säugetierexpressionsvektoren, pRK-tPA und pE348DHFRUC, wurden kombiniert, um pSVI-tPA zu erzeugen.
Säugetierexpressionsvektor pRK-tPA wurde aus pRK5 (beschrieben in EP 307.247, weiter oben, wo das pCIS2.8c28D-Ausgangsplasmid in EP 278.776, veröffentlicht am 17.August 1988, beschrieben ist) und aus t-PA cDNA hergestellt (Pennica et al., Nature, 301: 214 (1983)). Die cDNA wurde durch Schneiden der Restriktionsendonuklease HindIII (schneidet 49 Basenpaare 5' vom ATG Startcodon) und Restriktionsendonuklease Ball (schneidet 276 Basenpaare stromabwärts vom TGA-Stopcodon) zur Einfügung in pRK5 vorbereitet. Diese cDNA wurde unter Verwendung von Standardligationsverfahren in pRK5 ligiert, der zuvor mit HindIII und SmaI geschnitten wurde (Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1982). Dieses Konstrukt wurde als pRK-tPA bezeichnet und ist in Fig.2 dargestellt.
pRK-tPA treibt die wirkungsvolle Synthese von t-PA bei vorübergehender Transfektion in menschliche 293 Fibroblasten an. Der Vektor enthält den Cytomegalovirus unmittelbaren frühen Genverstärker und -promotor, die CMV-IE-Spleißdonorstelle und einen Abschnitt des assoziierten Introns, den Bakteriophage SP6-Promotor, einen Abschnitt eines IgVH-Introns und den assoziierten Spleißakzeptor, die für t-PA kodierende cDNA, den SV40 frühen Polyadenylierungs- ("polyA") Bereich und den SV40 Replikationsursprung ("ori") in Plasmid pUC118.
Der Vektor pE348DHFRUC (Vannice und Levinson, J.Virology, 62: 1305-1313 (1988), worin er als pE bezeichnet wird, Fig.1) enthält den SV40-Verstärker und frühen Promotorbereich stromaufwärts von der HindIII-Stelle (Position 5171 im Virus), der vor der für Mäuse-Dihydrofolatreduktase (DHFR) kodierenden cDNA liegt, an die sich das 584-bp Hepatitis B Virus (HBV) polyA-Signal in Plasmid pML1 von der BamHI zur BGlII-Stelle von HBV schließt. Dieses Plasmid enthält einen Polylinker unmittelbar stromaufwärts von den SV40-Sequenzen.
Abschnitte von Vektoren pRK-tPA und pE348DHFRUC wurden wie folgt isoliert (Fig.2):
1. Vektor pRK-tPA wurde mit Restriktionsenzym Sacll digeriert und anschließend mit dem großen ("Klenow") Fragment von E.coli DNA-Polymerase I ("pol I") behandelt, um die durch SacII-Spaltung entstandenen 3'-vorstehenden Enden zu entfernen. Daran schloß sich Digestion mit dem Restriktionsenzym SpeI an. Das größere Fragment, das einen Abschnitt der CMV-transkribierten Sequenzen, die Spleißdonor-Intron-Spleißakzeptor-Einheit ("Intron" in Fig.2), die t-PA cDNA, die SV40 polyA und ori-Bereiche und pUC118 einschließlich einiger Nukleotide vom 5'-Ende von CMV enthielt, wurde nach einer elektrophoretischen Trennung der Fragmente aus einem Polyacrylamidgel isoliert ("gelisoliert").
2. Vektor pE348DHFRUC wurde mit dem Enzym ClaI digeriert, und es wurden die resultierenden 5'-hervorstehenden Enden unter Verwendung von Klenow polI in Gegenwart aller vier Desoxyribonukleotide (dNTPs: dATP, dGTP, dCTP, TTP) gefüllt. Nach der anschließenden Digestion mit XbaI wurden die SV40-Transkriptionsregulationssequenzen (Verstärker und früher Promotor, einschließlich der SV40 frühen Stellen der Transkriptionseinleitung), die auf dem kleineren XbaI-Clal-Fragment (360 Nukleotide) vorhanden waren, gelisoliert.
Die isolierten pRK-tPA und pE348DHFRUC-Fragmente wurden ligiert, um Vektor pSVI-tPA zu erzeugen.

b. pSVI2-tPA

Der Vektor pSVI2-tPA wurde wie in Fig.3 gezeigt hergestellt, worin die Spleißdonorstelle von Vektor pSVI-tPA durch Ligation der drei Fragmente mutiert war, deren Herstellung weiter unten beschrieben ist. Nukleotide -3 (G) und -1 (C) relativ zur 5' Exon/Introngrenze von pSVI-tPA wurden zu C bzw. G geändert, um die Spleißdonorsequenz an die Konsenssequenz CAG/GUAAGU anzugleichen. Dies geschah wie folgt:
1. Vektor pSVI-tPA wurde mit HindIII und BglII gespalten, um ein kleines Fragment zu erzeugen, das vor allem die Spleißdonor-Intron-Spleißakzeptor-Einheit zwischen den zwei Hindlll-Stellen an Positionen 381 und 618, ein weiteres kleines Fragment, das einen 5'-Abschnitt der t-PA-cDNA, die zwischen den HindIII und BglII-Stellen an Positionen 618 und 770 angeordnet ist, aufweist, sowie ein großes Fragment enthielt, das den restlichen Teil der pSVI-tPA-DNA aufweist. Nach einer bakteriellen alkalischen Phosphatase- ("BAP") Behandlung wurden die drei Fragmente durch Gelelektrophorese getrennt und das größte gewonnen.
2. Vektor pSVI-tPA wurde getrennt mit RsaI und BglII digeriert und das sich von der RsaI-Stelle an Position 443 zur BglII-Stelle an Position 770 erstreckende Nukleotidfragment gelisoliert. Dieses Fragment umfaßt den 3'-Abschnitt des Introns, den Spleißakzeptor und einen 5'-Abschnitt der t-PA-cDNA.
3. Zwei Oligonukleotide ("Primer" in Figuren 3-7) wurden synthetisiert. Das erste (SVI1379) entsprach Nukleotiden 379 bis 400 (oberer Strang) von pSVI-tPA, mit der Ausnahme, daß eine Änderung von G zu C an Position 390 eingeführt wurde, um die durch Restriktionsendonuklease EagI (CGGCCG) erkannte Sequenz zu erzeugen, und überlappte eine HindIII-Stelle. Es hatte die folgende Sequenz (Position der Veränderung unterstrichen).
Das zweite Oligonukleotid (SVI448) hatte die gleiche Sequenz wie der untere Strang von pSVI-tPA zwischen Positionen 448 und 427, mit der Ausnahme, daß am 11.Nukleotid eine Änderung von G zu C und an Nukleotid -13 eine Veränderung von C zu G vorgenommen wurde. Es umfaßte eine RsaI-Stelle nur 5' von den zwei einzelnen Nukleotidänderungen entfernt. Die Sequenz dieses Oligonukleotids war wie folgt (Unterschiede zum entsprechenden pSVI-tPA-sequenzierten sind unterstrichen):
Die zwei Oligonukleotide wurden verwendet, um den Bereich von pSVI-tPA zwischen Positionen 379 und 448 durch PCR zu amplifizieren, der den Spleißdonor enthält. Die PCR-Produkte wurden mit HindIII und RsaI digeriert und das 62-Nukleotidfragment gelisoliert.
Die drei isolierten Fragmente wurden ligiert und in E.coli MM294 eingeführt. Plasmid-DNA wurde aus verschiedenen Ampicillin-resistenten Kolonien isoliert und die Nukleotidsequenz eines Isolats (pSVI12-tPA), bei dem die drei Fragmente in der gewünschten Ordnung ligiert waren, wurde ermittelt, um die Gegenwart der durch die zwei Primer spezifizierten Nukleotidänderungen und die Integrität des aus dem verstärkten Fragment hergeleiteten Bereichs nachzuprüfen.

c. pSVI3-tPA

Der Vektor pSVI3-tPA wurde wie in Fig.4 gezeigt hergestellt. Zwei angrenzende Bereiche von pSVI2-tPA wurden unter Verwendung eines Nukleotids, das mit der pSVI2-tPA-Sequenz identisch war, und eines Mutantenoligonukleotids, das die gewünschten Änderungen bestimmte, in jedem Fall durch PCR verstärkt. Diese Fragmente dienten der Ersetzung der entsprechenden Bereiche in pSVI2-tPA. Die Fragmente wurden wie folgt isoliert:
1. Vektor pSVI2-tPA wurde mit HindIII digeriert, das Digest mit BAP behandelt, und die zwei HindIII-Fragmente wurden durch Gelelektrophorese getrennt. Das größere Fragment wurde aus dem Gel gewonnen; es enthielt alle pSVI2-tPA-Sequenzen, mit der Ausnahme des 237-Nukleotid HindIII-Fragments, das die Spleißdonor-Intron-Spleißakzeptor-Einheit enthält.
2. Ein neues Oligonukleotid (SVI525Bam) wurde zur PCR-Mutagenese des ATG-Trinukleotids innerhalb des pSVI2-tPA-Introns synthetisiert. Es war mit der Sequenz des unteren Strangs von pSVI2-tPA von Nukleotid 525 zu Nukleotid 497 mit der Ausnahme einer Änderung von T zu A an Position 516, einer Änderung von A zu C an Position 519 und einer Änderung von T zu G an Position 523 identisch. Die erste Änderung sollte das ATG-Trinukleotid zu TTG umwandeln; die zweite und dritte Änderung sollte die Erkennungssequenz für das Enzym BamHI (GGATCC) schaffen. Die Nukleotidsequenz von SVI525Bam war wie folgt (Unterschiede zur pSVI2-tPA-Sequenz sind unterstrichen):
Oligonukleotide SVI379 (siehe oben) und SVI525Bam wurden verwendet, um den Bereich zwischen Positionen 379 und 525 von pSVI2-tPA durch PCR-Mutagenese zu amplifizieren, während die durch SVI525Bam spezifizierten Änderungen eingebaut wurden. Die Reaktionsprodukte wurden mit HindIII und BamHI digeriert, und das resultierende 137-Nukleotidfragment wurde gelisoliert.
3. Oligonukleotid SV1539Bam wurde zur PCR-Mutagenese des pSVI2-tPA-Verzweigungspunktbereichs synthetisiert. Es entsprach der pSVI2-tPA-Sequenz (oberer Strang) von Position 539 zu Position 573, wies jedoch die folgenden Änderungen auf: ein G anstelle von T an 541; ein T anstelle von C an 544; ein C anstelle von A an 545; ein C anstelle von A an 553 und ein G anstelle von A an 555. Die ersten drei Änderungen schufen eine BamHI-Erkennungsstelle, während die letzten beiden dem Erzeugen eines Signals dienten, das dem Verzweigungspunktsequenz- (BPS) Konsens ähnelte. Die Nukleotidsequenz von SV1539Bam war wie folgt (Änderungen gegenüber der pSVI2-tPA-Sequenz unterstrichen):
Oligonukleotid SVI625 wurde synthetisiert und war mit dem unteren Strang der pSVI2-tPA-Sequenz von Position 625 zu Position 603 mit Ausnahme einer Änderung von A zu C an Position 617 identisch, die eine Erzeugung einer BstBI-Restriktionsstelle (TTCGAA) erzeugen sollte. Die Sequenz von SVI625 war wie folgt (Änderung unterstrichen):
Oligonukleotide SVI539Bam und SVI625 wurden verwendet, um durch PCR den Bereich von pSVI12-tPA zwischen Nukleotiden 539 und 625 zu amplifizieren und um die erwünschten Änderungen gleichzeitig einzubauen. Die PCR-Produkte wurden mit HindIII und BamHI digeriert, und das 77-Nukleotidfragment wurde gelgereinigt.
Die drei Fragmente (Fig.4) wurden ligiert und als solches in E.coli MM294 eingeführt. Plasmid-DNA wurde aus einer Anzahl an Ampicillin-resistenten Kolonien isoliert und durch Digestion mit geeigneten Restriktionsenzymen und Gelelektrophorese auf Vorhandensein aller drei Fragmente in jeweils einer Kopie analysiert. Auch die relative Ausrichtung der Fragmente wurde durch diese Analyse bestimmt. Die Nukleotidsequenz eines rekombinanten Plasmids (pSVI3-tPA), in dem die drei konstituierenden Fragmente in derselben Ordnung wie in pSVI2-tPA angeordnet waren, wurde im Bereich bestimmt, der die drei Rekombinationsstellen (die zwei HindIII-Stellen und die BamHI-Stelle) einschließlich aller Sequenzen zwischen diesen Stellen umfaßte.

d. pSVI5-tPA

Vektor pSVI5-tPA wurde durch Ersetzen eines Abschnitts des Introns und des Spleißakzeptors mit einem durch PCR erzeugten Mutantenfragment (wie aus Fig.5 ersichtlich ist) aus pSVI3-tPA konstruiert. Nukleotid -16 (G) relativ zur 3'-Spleißverbindungsstelle von pSVI3-tPA wurde zum Nukleotid T modifiziert, um eine ununterbrochene, 16 Nukleotide lange Polypyrimidinstrecke als Teil des Spleißakzeptors zu schaffen. Der Vektor wurde auch modifiziert, um ein potentielles Zweigakzeptornukleotid an Position -23 in bezug zur 3'-Spleißverbindungsstelle zu enthalten, die innerhalb der Sequenz GACTT TT eingebettet ist, die zur Spleißdonorsequenz (G/GTAAGT) in diesem Vektor komplementär ist. Diese BPS wird durch eine weitere BPS (TACTG C) überlappt, die sich an den "breiten" BPS-Konsens anpaßt und zur U2 snRNA-Sequenz komplementär ist. Dieses Zweigakzeptornukleotid ist in dieser BPS an Position -27 in bezug zur 3'-Spleißverbindungsstelle angeordnet. Schließlich wird der Vektor durch die Einfügung einer dritten BPS knapp stromaufwärts von den zwei BPS in pSVI3-tPA modifiziert. Diese dritte BPS ist mit der konservierten Hefe-BPS (UACUA C) identisch und paßt sich an den "breiten" Säugetier-BPS-Konsens an (PyNCUPu C). Der Zweigakzeptor ist in dieser BPS an Position -34 in bezug zur 3'-Spleißverbindungsstelle angeordnet.
Die Fragmente zum Erzeugen von pSVI5-tPA wurden wie folgt hergestellt:
1. Vektor pSVI3-tPA wurde mit BamHI digeriert, und die resultierenden 5'-hervorstehenden Enden wurden mit T4 DNA-Polymerase in Gegenwart aller vier dNTPs aufgefüllt. Das Material wurde anschließend mit BstBI digeriert, mit BAP behandelt, und das größere Fragment gelisoliert, das alles bis auf einen Teil des Introns und die Spleißakzeptorsequenz von pSVI3-tPA enthielt.
2. Die zwei neuen Oligonukleotide wurden zur Verwendung in aufeinanderfolgenden PCR Amplifikationen ohne Zwischenproduktisolierung synthetisiert. Man entschied sich für diese Vorgehensweise zur Einführung einer Vielfalt an Mutationen, um die Verwendung eines einzelnen langen Oligonukleotids mit zahlreichen fehlenden Übereinstimmungen gegenüber dem Ziel zu verhindern; längere synthetische Oligonukleotide enthalten oft einen größeren Anteil von Molekülen mit nicht korrekter Sequenz. Außerdem könnte das erste Oligonukleotid alleine in Zukunft zum Erzeugen eines Vektors verwendet werden, der sich von pSVI3-tPA im Verzweigungspunkt und Spleißakzeptorbereichen unterscheidet.
Das erste Oligonukleotid, SVI4, hatte seine 3'-terminalen dreizehn Nukleotide mit pSVI3-tPA gemeinsam (Positionen 545-557). Davor lagen 22 Nukleotide mit Sequenzen, die der pSVI3-tPA-Sequenz zwischen Positionen 523 und 544 ähnlich waren, aber mit ihr nicht identisch waren. Die Unterschiede waren wie folgt (nachstehend unterstrichen): eine Änderung von G zu T an Position 528; eine Änderung von A zu T an 535; C zu A an 537, C zu T an 538, und A zu T an 539; sowie eine Änderung von G zu T an Position 544. Die letzte Veränderung würde eine Verlängerung des Polypyrimidinabschnitts des Spleißakzeptors verursachen; die erste würde die pSVI3-tPA-Sequenz GACTGAC ändern, um sich an die BPS-Konsenssequenz anzupassen, die mit U2 übereinstimmt. Die restlichen vier einzelnen Nukleotidänderungen sollten eine zum Spleißdonor komplementäre Sequenz schaffen. Die Sequenz von SVI4 war wie folgt:
Das zweite Oligonukleotid (SVI5) überlappte den Mittelabschnitt von SVI4. Es unterschied sich in den fünf 5' terminalen Nukleotiden von SVI4 und erstreckte sich in 5'-Richtung, um die Hefe BPS einzubauen (TACTAAC). Seine Sequenz war wie folgt (die Unterschiede zur entsprechenden pSVI3-tPA-Sequenz sind unterstrichen):
Der BPS/Spleißakzeptorbereich von pSVI3-tPA wurde unter Verwendung des Oligonukleotidpaars SVI4/SVI625 durch PCR-Mutagenese amplifiziert und mutiert. Die PCR-Produkte wurden verdünnt und erneut mit Oligonukleotidpaar SVI5/SVI625 amplifiziert. Die Produkte wurden mit T4 DNA-Polymerase und T4 Polynukleotidkinase behandelt und mit Restriktionsenzym BstBI gespalten, und das 71-Nukleotidfragment wurde gelisoliert.
Die zwei isolierten Fragmente (Fig.5) wurden ligiert, und man erhielt Plasmid-DNA aus transformierten (Ampicillin-resistenten) Bakterienkolonien, und analysiert, wie dies oben bezüglich pSVI3-tPA beschrieben ist. Ein Isolat, das alle erwünschten Intronenänderungen aufwies, wurde als pSVI5-tPA bezeichnet.
Die Sequenzbestimmung identifizierte eine zusätzliche unvorhergesehene Änderung außerhalb der Spleißdonor-Intron-Spleißakzeptor-Einheit. Zwei zusätzliche Nukleotide (GC) waren in pSVI5-tPA innerhalb der BstBI-Stelle von pSVI3-tPA (TTCGAA geändert zu TTCGCGAA) vorhanden, welche Stelle daher in pSVI5-tPA nicht vorhanden war. Die zwei zusätzlichen Nukleotide jedoch schufen eine Erkennungsstelle für das Enzym NruI, welches das einzige im Vektor ist. Die zusätzlichen Nukleotide entstanden höchstwahrscheinlich aus einem unvorhergesehenen Auffüllen der BstBI-hervorstehenden Enden der zwei für die Ligation verwendeten konstituierenden Fragmente.

e. pSV16B-tPA

pSVI6B-tPA wurde durch eine ähnliche Vorgehensweise wie oben für pSVI5-tPA beschrieben unter Verwendung zweier aufeinanderfolgender Amplifikationen mit teilweise überlappenden Mutantenoligonukleotiden erzeugt, um die gewünschten Änderungen im Intron-Spleißakzeptorbereich von pSVI3-tPA zu schaffen (wie aus Fig.6 ersichtlich).
Das erste Oligonukleotid (SVI6A) wies die folgende Sequenz auf (Unterschiede gegenüber pSVI3-tPA, Positionen 523-550, unterstrichen):
und das zweite (SVI6B; vergleiche mit Positionen 523-545 von pSVI3-tPA) die folgende:
Nukleotidersetzungen in SVI6A waren: T zu C an 524, T zu G an 526, G zu C an 528 und G zu T an 544. Die durch SVI6B spezifizierten Veränderungen waren: Einfügung eines C zwischen Nukleotiden 525 und 526 von pSVI3-tPA, Einfügen eines G zwischen Nukleotiden 526 und 527, Ersetzung des G an Position 528 durch ein C und die Änderung von G zu T an Position 544. Diese Änderungen sollten die pSVI3-tPA BPS optimieren und eine zweite, sie zur genau 5'-Seite flankierende BPS einführen; diese zwei Verzweigungspunktsequenzen überlappen einander am mittleren C und sind in der SVI6B-Sequenz kursiv dargestellt.
Aufeinanderfolgende Amplifikationen mit Oligonukleotiden SVI6A und SVI6B in Gegenwart von SVI625 wurden durchgeführt, um die pSVI3-tPA Intron-Spleißakzeptoreinheit zu modifizieren, wie dies für pSVI5-tPA beschrieben wurde. Die Enzymbehandlung der PCR-Produkte, Gelisolation und Ligation an das pSVI3-tPA große BamHI-BstBI-Fragment wurden auch für pSVI5-tPA beschrieben. Die Nukleotidsequenzanalyse von Plasmid-DNA aus einer Ampicillin-resistenten Bakterienkultur (dieses Plasmidisolat wurde als pSVI6B-tPA bezeichnet) zeigte zusätzlich zu den durch das SVI6B-Oligonukleotid spezifizierten Modifikationen mehrere unerwartete Veränderungen; Position 545 war ein T und kein C von pSVI3-tPA; Position 550 war ebenfalls ein T und kein C; und das zusätzliche Dinukleotid, das die NruI-Restriktionsstelle in pSVI5-tPA schuf, war auch in der pSVI6B-tPA-Sequenz vorhanden. Man würde nicht erwarten, daß die ersten beiden Veränderungen die t-PA-Expression negativ beeinflussen, und sie wurden auch nicht korrigiert.

Konstruktion des vielfach anwendbaren Stammvektors pSVI6B5

Ein vielfach anwendbarer Stammvektor zur Expression verschiedener Polypeptide wurde aus pSVI6B-tPA abgeleitet. Dieser als pSVI6B5 (transformierter E.coli Stamm ATCC Nr.68.151) bezeichnete Vektor weist Polylinkerbereiche anstelle der t-PA cDNA in pSVI6B-tPA auf. Diese Polylinkerbereiche stellen geeignete einzelne Restriktionsendonukleaseerkennungsstellen bereit, die zur Einführung jeder beliebigen Sequenz verwendet werden können, die für ein interessierendes Polypeptid kodiert.
Vektor pSV16B5 wurde wie weiter unten beschrieben wird in vier Schritten erzeugt. Die ersten drei Schritte umfaßten die Entfernung der BamHI-, HindIII- bzw. SalI-Restriktionsstellen aus pSV16B-tPA; in der Folge waren nach Ersetzung der t-PA cDNA durch den Polylinker im letzten Schritt die Polylinkerstellen für diese Enzyme im resultierenden Stammexpressionsplasmid einzigartig.

a. Konstruktion des ersten Zwischenplasmids pSVI6B-tPAd(b)

Vektor pSVI6B-tPA wurde mit BamHI digeriert (spaltet nur innerhalb des Introns), die resultierenden 5'-hervorstehenden Enden wurden in Gegenwart von dNTPs mit T4 DNA-Polymerase aufgefüllt, und der linearisierte Vektor wurde gelisoliert und zum erneuten Ringschließen mit T4 DNA-Ligase behandelt. Dies bewirkte den Verlust der BamHI-Erkennungssequenz; stattdessen wurde die Erkennungssequenz für das Enzym ClaI geschaffen. Aufgrund von Methylierung ist ClaI jedoch unfähig, diese Sequenz zu spalten, wenn Plasmid-DNA aus dam&spplus; E.coli gewonnen wird.

b. Konstruktion des zweiten Zwischenplasmids pSVI6B-tPAd(bh)

Plasmid pSVI6B-tPAd(b) wurde mit Hindlll digeriert (spaltet an beiden Seiten der Spleißeinheit), die 5'-hervorstehenden Enden wurden in Gegenwart aller vier dNTPs mit T4 DNA-Polymerase aufgefüllt, und ein Teil der Reaktionsmischung wurde mit BAP behandelt. Die zwei sowohl im behandelten als auch im unbehandelten Material vorhandenen Fragmente wurden durch Gelelektrophorese getrennt; das größere Fragment wurde aus dem behandelten Material isoliert und das kleinere Fragment aus dem unbehandelten Material. Die zwei Fragmente wurden ligiert, um Plasmid pSVI6B-tPAd(bh) zu erzeugen. Das Einfüllen der HindIII-Enden beider konstituierender Fragmente bewirkte den Verlust der zwei HindIII-Stellen im resultierenden Plasmid und gleichzeitig die Schaffung zweier neuer Erkennungsstellen für das Enzym NheI.

c. Konstruktion des dritten Zwischenplasmids pSVI6B-tPAd(bhs)

Die einzelne SalI-Erkennungsstelle wurde aus Plasmid pSVI6B-tPAd(bh) durch Digestion mit diesem Enzym, T4 DNA-Polymerasebehandlung in Gegenwart von dNTPs, Gelisolation der linearen Plasmid-DNA und erneutes Ringschließen unter Verwendung von T4 DNA-Ligase entfernt. Dies führte zur Schaffung einer neuen PvuI-Erkennungsstelle.

d. Konstruktion von Plasmid pSVI6B5

Zur Herstellung des endgültigen Mehrfachverwendungs-Stammplasmids wurden zwei Fragmente wie folgt hergestellt:
1. Plasmid pSVI6B-tPAd(bhs) wurde mit PStI und ClaI digeriert. Es gibt drei Erkennungsstellen für ClaI in diesem Plasmid: eine im Intron vor der t-PA-Sequenz, eine an der Grenze der t-PA cDNA und dem SV 40 frühen polyA-Bereich und eine eher am Ende des polyA-Bereichs. Nur eine dieser Stellen, die zweite, ist gegenüber Methylierung unempfindlich. Folglich wurde aus dam&spplus; MM294 hergestellte Plasmid-DNA durch Clal nur an dieser Stelle gespalten. Eine PstI-Erkennungsstelle befindet sich an der Verbindungsstelle der Spleißeinheit und der t-PA cDNA, und zahlreiche andere sind in der t-PA-Sequenz zwischen dieser Position und der gegenüber Methylierung unempfindlichen Clal-Stelle vorhanden. Das Spalten mit PstI und ClaI führte somit zur Freisetzung zahlreicher kleinerer Fragmente, die t-PA-Sequenzen enthielten und eines großen Fragments, das alle pSVI6B-tPAd(bhs)-Sequenzen mit Ausnahme der t-PA cDNA enthielt. Dieses größere Fragment wurde gelisoliert.
2. Zwei Oligonukleotide wurden synthetisiert. Diese waren über die gesamte Länge (47 Nukleotide) des ersten (als SA bezeichnet) komplementär. Das zweite, 5B, wurde an seinem 5'-Ende durch zwei Nukleotide und an seinem 3'-Ende durch vier Nukleotide verlängert (in nachstehender 5B-Sequenz unterstrichen). Das Annelieren dieser komplementären Oligonukleotide führte somit zu einem DNA-Fragment, das ein 5'- und ein 3'-hervorstehendes Ende ("Überhang") aufwies. Die Sequenz des vier-nt 3'-hervorstehenden Endes war TGCA-3', die zum 3'-Überhang komplementär ist, der durch PstI-Spaltung von PstI-Erkennungsstellen geschaffen wurde. Das zwei-nt 5'-hervorstehende Ende bestand aus dem Dinukleotid 5'-CG, das zum 5'-Überhang komplementär ist, der durch ClaI-Spaltung voo ClaI-Restriktionsstellen geschaffen wurde. Die Sequenzen der zwei Oligonukleotide wurden weiter konstruiert, um Erkennungsstellen für eine Anzahl an Restriktionsendonukleasen zu schaffen (einige von ihnen sind unterhalb der Sequenz jedes nachstehend dargestellten Oligonukleotids angegeben). Die Sequenz von Oligonukleotid 5A war wie folgt:
Die Sequenz von Oligonukleotid 5B war wie folgt:
Oligonukleotide 5A und 5B wurden an das isolierte pSV16B-tPAd(bhs)-Fragment anneliert und ligiert, um Plasmid pSV16B5 zu erzeugen. Die Ligation des PstI-Oberhangs an den TGCA-3'-Überhang der annelierten Üligonukleotide führte zu keiner Wiederherstellung einer PstI-Stelle, sondern bildete eine ClaI-Stelle; am anderen Ende des Linkers föhrte die Ligation des ClaI-Überhangs an den 5'-CG-Überhang zu keiner Wiederherstellung einer ClaI-Stelle.

BEISPIEL 2

Konstruktion von HPg- und R561SPg-Expressionsvektoren, CHO-Zelltransformation damit, und Reinigung

Allgemeine Verfahren

Die für die Mutagenesen der cDNA für dieses Beispiel und nachfolgende Beispiele verwendeten Oligonukleotide wurden unter Verwendung von entweder (1) Phosphoramiditchemie auf einem Biosearch (San Rafael, CA) Cyclon Zweisäulen DNA-Synthetisierer, wobei bei der Reinigung die Oligonukleotidreinigungskassetten von Applied Biosystems (Foster City, CA) eingesetzt wurden, oder (2) unter Verwendung von H-Phosphonatchemie wie bei Froehler et al., Nucl.Acids.Res., 14: 5399-5407 (1986) beschrieben, synthetisiert.
Zelltransfektionen erfolgten durch das Kalziumphosphat-Verfahren (Kingston, in: Current Protocols in Molecular Biology, oben).
Plasmid-DNAs wurden durch CsCl/Äthidiumbromid- (EtBr) Gradientenzentrifugieren (Moore, in: Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., Hrsg. (John Wiley & Sons, New York, 1987), S. 1.7.1-1.7.4) mit einer Beckman (Palo Alto CA) LS 65 Herstellungsultrazentrifuge gereinigt. Durch vertikales Rotorzentrifugieren (Vti.65.1) über einen Zeitraum von 7 Stunden bei 55.000 U/min und 15ºC wurden die DNA-Bänder getrennt. Nach Erhalten des gewünschten Materials aus dem Zentrifugenröhrchen wurde EtBr durch Extraktion in eine Lösung von mit CsCl gesättigtem Isopropanol aus der Plasmid-DNA entfernt. Die DNA wurde dann gegen einen Puffer von 1 mM Tris-HCl/O,1 mM EDTA, pH-Wert 7,1 vor den Zelltransfektionen dialysiert.

Konstruktion des R 561S Expressionsvektors pA475R561SPg

Ein als pUC119PN127.6 bezeichnetes Plasmid (mit der in Fig.1 dargestellten Sequenz, mit der oben angeführten Ausnahme betreffend Nukleotid 3809) wurde wie folgt hergestellt. Eine erste cDNA wurde aus einer n-Oligo(dT)-geprimten cDNA-Sammlung isoliert, die aus aus fünf Personen isolierter Leber-mRNA konstruiert wurde. [Okyama et al., Mol.Cell.Biol., 2: 161-170 (1982) und Gubler et al., Gene, 25: 263-269) (1983)]. Nach Größe ausgewählte cDNAs (größer als 600 Basenpaare) wurden in λ gt10-Bakteriophagevektoren ligiert (Stratagene, San Diego, Kalifornien) und ohne Amplifikation gescreent [Drayna et al., Nature, 327 632-634 (1987)]. Die cDNA wurde unter Verwendung eines Linkers wie folgt an den λ gt10-Vektor ligiert.
Ein λ gt10 cDNA-Klon wurde mit einer 75-Basen Oligonukleotidsonde (PL.1) gewonnen, die Nukleotiden 1, 306-1.380 von menschlicher Plasminogen cDNA entsprach [Forsgren et al., FEBS Lett., 213: 254-260 (1987)]. Filter wurden in 5 x SSC (150 mM NaCl, 15 mM Trinatriumcitrat), 50 mM Natriumphosphat (pH-Wert 6,7), 5 x Denhardt'scher Lösung, 20% Formamid, 10% Dextransulfat und 20 ug/ml gekochter, ultraschallbehandelter Lachssperma-DNA bei 42ºC über Nacht hybridisiert und eine Stunde lang in 2 x SSC, 0,1% SDS bei 55ºC gewaschen und einem Röntgenfilm ausgesetzt. Ein λ gt10-Klon (als λ gt10:pmgn#127 bezeichnet) wurde mit SstI geschnitten und an SstI-geschnittenes pUC119 ligiert, um pUC119PN127.6, ein Nukleotid und eine abgeleitete Aminosäuresequenz zu ergeben, die mit oben angeführter Ausnahme in Fig.1 dargestellt ist. Die Nukleotidsequenz des (Glu¹)Pg in pUC119PN127.6 zeigte die Gegenwart von Val&sup4;&sup7;&sup5; anstelle von Ala.
Das Klon wurde vollständig sequenziert. DNA-Sequenzanalyse erfolgte durch das Didesoxykettenterminationsverfahren auf beiden Strängen der subgeklonten doppelstrangigen cDNA [Sanger et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 74: 5463-5467 (1977)] entweder direkt auf Doppelstrang-DNA oder Einzelstrang-Schablonen [Chen et al., DNA, 4: 165-170 (1985)] nach dem Subklonen in einen pUC119-Vektor.
Der Vektor pA475R561SPg, der die korrekte Human-Pg-Sequenz mit Ausnahme eines Serins an Position 561 enthielt, wurde wie folgt und wie in Fig.7 dargestellt konstruiert:
pSV16BtPA wurde mit EcoRI digeriert, zum Abstumpfen des Endes der EcoRI-Stelle aufgefüllt und dann mit PstI geschnitten; anschließend wurde das große Fragment isoliert. pUC119PN127.6 wurde mit SphI geschnitten, zum Abstumpfen des Endes der SphI-Stelle aufgefüllt und dann mit EcoRI geschnitten; das kleine, das 3'-Ende von HPg cDNA umfassende Fragment wurde isoliert; pUC119PN127.6 wurde auch mit Pstl und EcoRI geschnitten, und das kleinere Fragment wurde isoliert, welches das volle 5'-Ende von für HPg kodierende cDNA umfaßte. Diese zwei kleinen Fragmente und das große Fragment aus pSVI6BtPA wurden unter Verwendung von T4-Ligase miteinander ligiert, um das Plasmid pSVI6BPlgn zu ergeben. Dieses Plasmid wurde mit PstI und EcoRI gespalten, und das kleine Fragment (248-bp) wurde isoliert (Fragment A). pSVI6BPlgn wurde auch einer stellenspezifischen Mutagenese der cDNA für HPg mittels des Verfahrens von Kunkel et al., Meth.Enzym., 154: 367-382 (1987) und unter Verwendung eines Primers für die R561S-Änderung wie folgt unterworfen:
Die Kolonien wurden durch die Gegenwart der neuen BamHI-Restriktionsendonukleasestelle gescreent, die als Ergebnis dieser Mutationen auch in der cDNA eingefügt war. Das resultierende Plasmid wurde als pSVIR561SPg.C2 bezeichnet. Dieses Plasmid wurde mit SphI geschnitten, zum Abstumpfen des Endes der SphI-Stelle aufgefüllt und mit EcoRI geschnitten; das kleine Fragment (2.32 kb) wurde isoliert (Fragment B). Das dritte Fragment wurde aus pSV16BtPA durch Spalten dieses Plasmids mit EcoRI hergestellt, zum Abstumpfen des Endes der EcoRI-Stelle aufgefüllt und mit PstI geschnitten sowie durch Isolieren des großen Fragments hergestellt (Fragment C).
Fragmente A, B und C wurden mit T4-Ligase ligiert, um das Plasmid pR561SPg zu ergeben, das die Vektorelemente von pSVI6BtPA und das mutagenisierte Plasminogen enthielt.
Andere Expressionsvektoren könnten anstelle von pSVI6BtPA als Vektorquelle verwendet werden. Beispielsweise könnte pE342-tPA (US PS 4.766.075) als Vektorfragment durch Ersetzung der für t-PA kodierenden DNA von pE342-tPA mit der Plasminogen-cDNA aus pUC119PN127.6 verwendet werden. Somit können Regulationselemente aus anderen Expressionsvektoren operabel mit der HPg-cDNA verbunden werden, um einen HPg-Expressionsvektor zu erzeugen, wie dies für Fachleute auf dem Gebiet bekannt ist.
Der Endvektor, pA475R561SPg, wurde wie folgt hergestellt: pR561SPg wurde mit AhaII und EcoRI gespalten, und das kleine mutagenisierte Pg-Fragment (1003 bp) wurde isoliert (Fragment D). Auch pSVI6BPlgn wurde mit SmaI und EcoRI gespalten und das Vektorfragment (4.394 kb) isoliert (Fragment E). Schließlich wurde pSVI6BPlgn einer stellengerichteten Mutagenese der cDNA für HPg unter Verwendung des Verfahrens von Kunkel et al., siehe oben, mit dem folgenden mutagenen Primer (die unterstrichenen Basen stellen die auferlegten Mutationen dar) unterworfen, um die V475A-Mutation zu erzeugen:
Positive Kolonien wurden unter Verwendung eines EcoRI/BstEII- Restriktionsendonukleasedigests gescreent. Klone mit den Fragmenten der richtigen Größe wurden in jenem Bereich sequenziert, der den Aminosäurepositionen 455-502 entspricht.
Der so mutagenisierte pSVI6BP1gn wurde mit SmaI und AhaII geschnitten und das kleine Fragment (1,55 kb) isoliert (Fragment F). Fragmente D, E und F wurden ligiert, um das Endplasmid pA475R561SPg zu erzeugen.

Konstruktion des Plasminogenexpressionsvektors pA475Pg

Ein Plasmid, das die A475-Mutation ohne die R561-Mutation enthält (d.h. das Nativsequenz-Plasminogen enthält), wurde wie folgt hergestellt: pSVI6BP1gn wurde mit AhaII und EcoRI geschnitten und das kleine Fragment isoliert (Fragment G). Fragmente E und F (oben beschrieben) und G wurden ligiert, um Plasmid pA475Pg zu erzeugen.

Konstruktion von PAI-1 Expressionsvektor pRKPAI-1

Ein Expressionsvektor, der für den menschlichen β-wandernden endothelialzellartigen Plasminogenaktivatorinhibitor (PAI-1) kodiert, wurde wie folgt konstruiert: das Klonen und die Sequenz von PAI-1 sind durch Ny et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 83: 6776-6780 (1986); Ginsberg et al., J.Clin.Invest., 78: 1673-1680 (1986); Pannekoek et al., EMBO J., 5: 2539-2544 (1986) beschrieben. Die PAI-1 cDNA wurde aus einer menschlichen Nabelendothelialzellen-cDNA-Sammlung als ein λ-Klon gewonnen und in einen pUCl8-Klonierungsvektor gesetzt, der in E.coli repliziert. Dieses Plasmid wurde mit BglII geschnitten, an den Enden abgestumpft und mit EcoRI geschnitten. Das kleine Fragment (etwa 1430 bp) wurde gelgereinigt. pRK5 wurde auch mit SmaI, danach mit EcoRI geschnitten und ein Vektorfragment von 4712 bp isoliert und gelgereinigt. Diese zwei Fragmente wurden unter Verwendung von T4-Ligase miteinander ligiert, und es wurden Digeste von Minipreps vorgeformt, um die Ausrichtung der Einfügung zu bestätigen. Der Endvektor wird als pRKPAI-1 bezeichnet.

Transformationen mit pA475R561SPg oder pA475Pg

CHO dhfr-Zellen (Urlaub und Chasin, siehe oben) wurden doppelt auf 60 mm Platten zu 5 x 10&sup5; Zellen/Platte gelegt. DNAs wurden durch die Kalziumphosphatvorschrift mit den folgenden Kombinationen von Plasmiden transfi ziert:
(a) pA475R561SPg (50 ul oder 5 ug/Platte), pRKPAI-1 (4,2 ul oder 5 ug/Platte) und pFD11 (ein für DHFR kodierendes Plasmid, das durch Simonsen und Levinson beschrieben ist, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 80: 2495-2499 (1983)), 6 ul oder 0,5 ug/Platte);
(b) pA475R561SPg (50 ul oder 5 ug/Platte) und pFD11 (6 ul oder 0,5 ug/Platte) ;
(c) pA475Pg (50 ul oder 5 ug/Platte), pRKPAI-1 (4,2 ul oder 5 ug/Platte) und pFD11 (6 ul oder 0,5 ug/Platte); oder
(d) pA475Pg (50 ul oder 5 ug/Platte) und pFD11 (6 ul oder 0,5 ug/Platte).
Die Zellen wurden in ein selektives Kulturmedium aufgeteilt, das 7% diagefiltertes fötales Rinderserum bei 0,1, 0,1, 0,1, 0,2, 0,2 und 0,3 ug Plasmid pro 60-mm Platte enthielt. Zwölf Tage später wurde jeweils eine Platte der vier Transformationen (a-d) mit phosphatgepufferter Salzlösung gewaschen und mit selektivem Kulturmedium und 7% Plasminogen-abgereichertem fötalen Rinderserum genährt. In diesem Schritt wurde jedes Plasminogen zur Gänze entfernt, das nicht durch die Zellen erzeugt wurde. Plasminogen erzeugende Klone wurden durch die Expressionsmenge auf den Filtern gescreent. Drei Klone jeder der Transformationen a-d wurden mit Tupfern auf eine 12-Napfplatte gelegt. Diese zwölf Klone wurden in 10 cm-Platten gezüchtet, und das Medium wurde mit einem nichtselektiven Kulturmedium ersetzt.
Das geerntete Medium wurde einer ELISA-Proteinbestimmung unterzogen. Es stellte sich heraus, daß das pA475R561SPg und pRKPAI-1 Klon #2 eine Aktivität von zumindest 1 mg/l ergab. Fünf Rollflaschen des R561S-HPg Materials wurden zur Reinigung hergestellt. R561S-HPg wurde durch Affinitätschromatographie auf Sepharose-Lysin gemäß dem Verfahren von Deutsch und Mertz, Science, 170: 1095-1096 (1970), das durch Brockway und Castellino, Arch.Biochem.Biophys., 151: 194-199 (1972) modifiziert wurde, vom CHO-Kulturüberstand gereinigt.

BEISPIEL 3

Konstruktion des R561EPg Expressionsvektors, Insektenzelltransformation damit und Reinigung

Die allgemeinen in Beispiel 2 beschriebenen Verfahren wurden auch in diesem Beispiel angewendet. Konstruktion von HPg und R561E-HPg Baculovirus-Expressionsvektoren
Die für HPg im Plasmid pUC119PN127.6 (im BamHI/Nael-Fragment) kodierende cDNA wurde wie in Beispiel 2 beschrieben mutagenisiert, um die in Beispiel 2 beschriebene V475A-Änderung zu erzeugen, um Nativsequenz Pg zu schaffen. Das resultierende Plasmid wurde wie in Beispiel 2 beschrieben mutagenisiert, um unter Verwendung des mutagenen Primers:
die R561E-Änderung zu erzeugen.
Positive Kolonien für diese Mutation wurden hinsichtlich der Gegenwart der neu erzeugten SmaI-Restriktionsendonukleasespaltungsstelle gescreent, welche die vorgenommene Änderung begleitet. Der rekombinante Baculovirus-Transfervektor pAV6, in den A475HPg cDNA und A475,R56lEHPg cDNA eingefügt waren, wurde konstruiert, um DNA-Sequenzen zu enthalten, die das AcMNPV Polyhedrin (PH)-Gen umgeben. pAV6 enthält den Polvhedrin-Promotor in 1,8 kb von einer 5' vom PH-Gen angeordneten XboI-Stelle zum Nukleotid -8 vom Polyhedrin-Einleitungscodon (ATG) und enthält auch ein 1,5 kb-Fragment, das sich von einer Kpnl-Stelle innerhalb des Polyhedringens zu einer BamHI-Stelle 3' von diesem selben Gen erstreckt. Die XboI- und BamHI-Stellen wurden während des Klonens dieser Fragmente verloren.
pAV6 wurde wie folgt und in Fig.8 veranschaulicht konstruiert. Ein 7,2 kb-EcoRI-Fragment von Autographa californica-DNA, das als pEcoRI-I bezeichnet wird [Smith et al., J.Virol., 45: 215-225 (1983); Smith et al., J.Virol., 46: 584-593 (1983)] und das Polyhedringen und Flankierungssequenzen enthielt, wurde mit XhoI und BamHI geschnitten (SalI und XhoI-Digestionen erzeugen kompatible Enden). Das resultierende XhoI/BamHI-Fragment wurde in einen SalI- und BamHI-geschnittenen mp19 Vektor (Bethesda Research Laboratories, Gaitherburg, MD) ligiert, um ein als mpl9xho-Bam bezeichnetes Konstrukt zu bilden. Das Plasmid mo19Xho-Bam wurde mit EcoRV und KpnI geschnitten, und ein erstes synthetisches Oligonukleotid (wie alle weiter unten angeführten Oligonukleotide auf einem automatisierten DNA-Synthetisierer des Modells 380A von Applied Biosystems, Foster City, CA konstruiert) wurde in die geschnittene mp19xho-Bam ligiert, um einen als mp19AID bezeichneten Vektor zu bilden. Das erste synthetische Oligonukleotid hatte die folgende Sequenz, einschließlich der angezeigten Restriktions- und Transkriptionseinleitungsstellen. Transcription Initiation
Das erste synthetische Oligonukleotid ersetzte eine Sequenz am 5'-Ende des XhoI/BamHI-Fragments in mp19xho-Bam von einer EcoRV-Stelle zu einer vermeintlichen CAP-Stelle und enthält eine Mehrfachklonierungsstelle mit BamHI-, EcoRI-, SaII- und KpnI-Stellen.
Als nächstes wurde ein pUC12-Vektor (Bethesda Research Laboratories) mit HindIII und SstI geschnitten, mp19AID wurde mit HindIII und KpnI geschnitten, und ein 1,8 kb-Fragment isoliert, das Sequenzen enthielt, die das 5'-Ende des Polyhedringens flankierten. Das Plasmid pEcoRI-I wurde mit BamHI und KpnI geschnitten, und es wurde von den Digestionsprodukten ein 1,5 kb-Fragment isoliert, das sich von der Kpnl-Stelle innerhalb des Polyhedringens zu einer BamHI-Stelle im 3'-Flankierungsbereich davon erstreckt. Diese drei Fragmente (pUCl2, 1,8 kb und 1,5 kb) wurden entlang eines zweiten synthetischen Oligonukleotids ligiert, das die Sequenz 5'-GATCAGCT aufwies, um eine als pAV1 bezeichnete Konstruktion herzustellen.
Nach dem Schneiden von pAV1 mit BamHI und KpnI wurde das resultierende Fragment mit einem dritten synthetischen Oligonukleotid ligiert, um eine als pAV2 bezeichnete Konstruktion herzustellen. Das dritte synthetische Oligonukleotid wies nachstehende Nukleotidsequenz auf:
Ein Plasmid, pDS, wurde durch Schneiden von pBR322 (dem 4,4 kb-Plasmid, das bei Bethesda Research Laboratories erhältlich ist) mit HindIII und SalI, Auffüllen mit Klenow-Fragment und Ligieren konstruiert. Somit weist das Plasmid pDS die Sequenzen zwischen HindIII und SalI nicht auf und verliert die SalI-Stelle, behält aber die HindIII-Stelle.
Das Plasmid pAV2 wurde mit HindIII und BamHI geschnitten und ein 1,5 kb- HindIII/BamHI-Fragment (enthält die 5'-Flankierungssequenz) wurde isoliert. Als nächstes wurde pAV2 mit BamHI und EcoRI geschnitten und ein 1,5 kb-EcoRI/BamHI-Fragment isoliert, das sich von der BamHI-Stelle in der Mehrfachklonierungsstelle zur EcoRI-Stelle angrenzend zur 3'-Flankierungssequenz erstreckt. Das Plasmid pDS wurde mit HindIII und EcoRI geschnitten und an die zwei Fragmente aus pAV2 ligiert. Das resultierende Plasmid wurde als pAV3 bezeichnet.
Das Plasmid pAV3 wurde mit BamHI und SalI geschnitten. Ein Vektor pAC373 [Smith et al., Mol.Cell.Biol., 3: 2156-2165 (1983)] (enthält NPV-Viren- DNA von einer SalI-Stelle etwa 1 kb 5' vom Polyhedringen zu einer BamHI-Stelle, die an Nukleotid -8 eingesetzt ist (das "A" der "ATG"- Einleitungsstelle ist +1) wurde mit BamHI und SalI geschnitten und mit dem BamHI/Sall-geschnittenen pAV3 ligiert, um einen als pAV4 bezeichneten Vektor zu bilden.
Der Vektor pAV4 wurde mit EcoRI geschnitten, und die Enden wurden mit Klenow-Fragment aufgefüllt und ligiert, um den als pAV6 bezeichneten Vektor zu erzeugen (weist keine EcoRI-Stelle von pAV4 auf).
(Der Transfervektor pAV6HPg, der aus der Einfügung eines BamHI/NaeI- Fragments, das für die Nativsequenz HPg kodiert, aus pUC119PN127.6 in die BamHI- und SmaI-Stellen von Plasmid pAV6 besteht, enthält den AcMNPV-Polyhedrin- (PH) Promotor, der mit dem HPg-Signal und reifer (Glu¹)Pg-Kodierungssequenz verbunden ist. Dieses Plasmid wurde im Wirt -E.coli DHSα am 18.April 1989 bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852 unter der Zugriffsnummer 67.929 hinterlegt.
Die oben beschriebenen A475-HPg und A475,R561E-HPg-cDNAs wurden in die BamHI- und SmaI-Stellen von pAV6 eingefügt, um pAVA475Pg bzw. pAVA475R561EPg herzustellen, die verwendet wurden, um das Kulturmedium von Spodoptera frugiperda-Zellen zu infizieren, wie dies weiter unten beschrieben ist.

Transformation von Insektenzellen mit Transfervektor

Das Konstrukt pAVA475Pg oder pAVA475R561EPg und Wildtyp-virale DNA wurden verwendet, um kultivierte Spodoptera frugiperda-Zellen zu cotransfizieren, wie dies durch Whitefleet-Smith et al., siehe oben, beschrieben ist. In einer Zelle ergibt ein Crossover zwischen homologen Polyhedrin-Flankierungsbereichen des Transfervektors und dem Virus einen rekombinanten Virus mit voller Länge, der das HPg-Gen anstelle des PH-Gens aufweist.
Der AcTR-Temperaturinaktivierungs-resistente Stamm von Autographa californica-Kernpolyhedrosevirus (AcMNPV) wurde für rekombinante Konstruktionen als Wirtsvirus verwendet. Eine geklonte (z.B. Sf9-Zellen, wie sie bei der American Type Culture Collection, Rockville, MD unter der Zugriffsnummer ATCC CRL 1711 verfügbar sind) oder eine ungeklonte Spodoptera frugiperda-Zellinie kann verwendet werden, um Wirtszellen für virales Wachstum und Manipulationen bereitzustellen [Vaughn et al., In Vitro, 13: 213-217 (1977)J. Die zum Kultivieren von Insektenzellen angewendeten Verfahren sind bei Summers et al., Texas Agricultural Experiment Station Bulletin Nr. 1555, (1987) S. 10-31 und 38 beschrieben, mit der Ausnahme, daß Gibco-gepulvertes Grace's Anteraea-Medium, Hink's Medium (anstelle von TNM-KH-Medium) und eine Penicillin/Streptomycin/Amphotericin B antibiotische Mischung im Verfahren auf S.38 davon verwendet wurden.
Genauer gesagt ließ man Spodoptera frugiperda-Zellen (3 x 10&sup6;) in Hink's Medium [Hink, Nature, 226: 466-467 (1979)] plus 10% fötales Rinderserum (FBS) [Smith et al., Mol.Cell.Biol., oben] an einer 60 mm-Kulturschale anhaften. Nach zwei Stunden wurde das Medium entfernt und die Zellen in einer 0,5 ml-Suspension von Wildtyp-DNA aus AcMNPV (0,1 ug) plus pAVR561EPg-Transferplasmid-DNA (1 ug) in NaCl (0,8 g/l), KCl (0,37 g/l) Na&sub2;HPO&sub4;.2H&sub2;O (0, l25 g/l), Dextrose (1 g/l) und Hepes-NaOH (5 g/l) bei einem pH-Wert von 7,2 inkubiert. Nach einer über Nacht erfolgenden Inkubation bei etwa 27ºC wurde die DNA-Suspension entfernt, und die Zellen wurden fünf Tage lang in Hink's Medium plus 10% FBS inkubiert.
Spodoptera frugiperda-Zellen können auch durch Einsatz langsam laufenden Rührgefäßen von Corning (New York, New York) auf einem langsam laufenden Cellgro-Magnetrührer (Thermolyne Corp., Bubuque, Iowa) in Suspension kultiviert werden. Jedem 1000 ml-Rührgefäß wurden 300 ml unvollständiges Hink's Medium (ergänzt mit 8,3% FBS und der oben beschriebenen Penicillin/Streptomycin/Amphotericin B-Mischung) hinzugefügt. Das Gefäß wird dann mit 5 x 106 Zellen beimpft und bei 80 U/min gerührt. Zellen wurden subkultiviert, wenn sie eine Dichte von 2-3 x 10&sup6; Zellen/ml erreichen, indem 150-250 ml Zellsuspension entfernt und durch frisches Medium ersetzt wird. Suspensionswachstumszellen haften an Kolben und können in Monolagen erfordernden Verfahrensweisen verwendet werden.
Zellen können auch in einem definierten, proteinarmen, durch JR. Scientific, Woodland, CA hergestellten Medium EX-CELL 400 gezüchtet werden. Dieses Medium kann anstelle des vollständigen Hink's Medium zum Kultivieren von Zellen in Monolagen, in Schleuderkolben- Suspensionskulturen oder in Luftheber-Bioreaktoren [q.v., Maiorella et al., Biotechnology, 6: 1406-1410 (1988)] verwendet werden.
Nach dem Wachstum wurden die rekombinanten Proteine A475-HPg und A475,R561E-HPg durch Affinitätschromatographie gereinigt, wie dies bezüglich der oben angeführten CHO-exprimierten Plasminogene beschrieben ist.

BEISPIEL 4

Assays und Ergebnisse

A. Allgemeine Verfahren und Assays

1 . Aminosäuresequenzieren

Das Plasminogen und seine Mutanten, die gemäß Beispiele 2 und 3 hergestellt wurden, wurden nach der Adsorotion des Proteins auf den Peptid-Trägerscheiben auf einem Gasphasensequenzierer von Porton Instruments einer aminoterminalen Aminosäuresequenzanalyse unterzogen. PTH-Aminosäuren wurden unter Verwendung eines Spectra Physics HPLC-Systems auf einer Beckman Umkehrphasen-ODS-Säule getrennt (5 u, 4,6 mm x 250 mm). Das System bestand aus einer Ternär-HPLC-Pumpe Modell 8800, einem Modell 8480 UV/Vis-Detektor, einem Modell 4270 Aufzeichnungsintegrator und einer PI2030 Schnittstelle für On-line-Injektionen der Proben auf die HPLC-Säule. Die Auflösung der 20 PTH-Aminosäuren erfolgte bei 55ºC unter den folgenden linearen Gradientenbedingungen: 88% Lösung A (l ml Eisessig/20 ml Tetrahydrofuran/0,05 ml Triäthylamin/Wasser auf 500 ml, pH-Wert eingestellt auf 4,10 mit 3 N NaoH)/12% Lösung B (1% Tetrahydrofuran in Acetonitril) als Anfangslösung zu 60% Lösung A/40% Lösung B (Grenzlösung) über einen Zeitraum von 24,5 min bei einer Fließrate von 1 ml/min. Lösung B wurde dann weitere 5,5 Min lang bei gleicher Fließrate fortgesetzt, während die letzten vier PTH-Aminosäuren eluiert wurden.

2. Western Blot-Analyse

Die Proteinproben der Beispiele 2 und 3 wurden durch SDS/PAGE (Laemmli, Nature, 227: 680-685 (1970) auf 10% (G/v) Polyacrylamidgelen unter nicht reduzierenden Bedingungen getrennt. Die getrennten Proteinbänder wurden auf Immobilon-P (Millipore, Bedford, MA) Membranen gemäß herkömmlicher Verfahren übertragen (Burnette, Anal.Biochem., 112: 195-203 (1981)) und dann bei 37ºC eine Stunde lang in 1% (g/v) Gelatine (Bio-Rad EIA-Qualität) in TBS (0,05 M TrisHCl, 0,15 M NaCl, pH-Wert 7,4, Blockierpuffer) inkubiert. Die genauen übertragungsbedingungen waren 4ºC in 25 mM Tris-HCl/200 mM Glvcin/15% (v/v) Methanol, pH-Wert 8,3 bei 20 Volt 12 Stunden lang. Diese Lösung wurde mit einer weiteren ersetzt, die 4 ug/ml monoklonales Mäuse-Anti-HPg (Whitefleet-Smith et al., oben) in Blockierungspuffer enthielt, und bei Raumtemperatur 2 Stunden lang unter Mischen inkubiert. Der Filter wurde mit drei Änderungen von 0,05% (v/v) Tween-20 in TBS bei Raumtemperatur über einen Zeitraum von 15 Min. gewaschen. Danach wurde er mit Kaninchen-Antimaus IgG-alkalischen Phosphatasekonjugat (Sigma) in einem Blockierungspuffer zwei Stunden lang bei Raumtemperatur unter Mischen inkubiert und anschließend wie oben gewaschen. Positive Bänder wurden nach den Inkubationen bei Raumtemperatur mit der Substratlösung sichtbar gemacht (16,5 mg Nitroblautetrazolium/0,5 ml 70% (v/v) wässeriges DMF/8,5 mg Bromchlorindolylphosphat in 1 ml Wasser, das zu 50 ml 0,1 M Tris HCl/0,1 M NaCl/0,005 M MgCl&sub2;, pH-Wert 9,5 hinzugefügt wurde).

3. Amidolytische Assays von stöchiometrischen Komplexen von SK-HPg und SK-HPm

Eine Menge von 0,2 ml eines aus 100 mM Hepes-NaOH/10 mM EACA, pH-Wert 7,4 bestehenden Puffers wurde in eine bei 25ºC gehaltene Spektrophotometerküvette gefüllt. Danach wurde die gewünschte Konzentration der chromogenen Substanz H-D-Val-L-Leu-L-Lys-pNA (S2251, Helena Laboratories, Beaumont, TX) und anschließend die erforderliche Menge Wasser hinzugefügt. Die Hydrolyse des Substrats wurde durch die Zugabe des gewünschten vorgebildeten stöchiometrischen SK-HPg- oder SK-Hpm-Komplexes (Endkonzentration, 6-10 nM) beschleunigt. Die Hydrolyserate von S2251 wurde 2-5 Min. lang bei 405 nm kontinuierlich aufgezeichnet. Die dekadischen Extinktionen wurden wie oben beschrieben zu Anfangsaktivierungsraten umgewandelt (Urano et al., oben) und die Ratendaten gemaß herkömmlicher Lineweaver-Burk-Plots analysiert. Die Enzymkomplexe wurden durch Inkubation bei 25ºC von stöchiometrischen Mengen von Streptokinase (SK) (hergestellt gemäß dem durch Castellino et al., Meth.Enzymology, 45: 244-257 (1976) veröffentlichten Verfahren) und des gewünschten Plasminogens der Beispiele 2 und 3 gebildet.

4. Plasminogenaktivator-Assays von stöchiometrischen Komplexen von SK-HPg und SK-HPm

Eine Menge von 0,2 ml eines aus 100 mM Hepes-NaOH/10 mM EACA, pH-Wert 7,4 bestehenden Puffers wurde in eine auf 25ºC gehaltene Spektrophotometerküvette gefüllt. Danach wurden 0,08 ml S2251 (Endkonzentration, 0,5 mM) und anschließend die erforderliche Menge Wasser, verschiedene Konzentrationen von Rinderplasminogen (BPg, gereinigt aus frischem Rinderplasma unter Verwendung desselben Verfahrens wie zur Reinigung von rekombinanten Pg) und schließlich der wie oben beschrieben hergestellte SK-HPg- oder SK-HPm- Aktivatorkomplex (Endkonzentration 0,2 nM) hinzugefügt. Die Aktivierungsrate von BPg wurde in einem kontinuierlichen Assay durch Aufzeichnen der Freisetzung von p-Nitroanilid aufgrund der Hydrolyse von S2251 durch das erzeugte Rinderplasmin überwacht (Urano et al., oben). Die Daten wurden durch Lineweaver-Burk-Plots analysiert, wie dies bezüglich früherer Untersuchungen dieser Art veröffentlicht wurde (Urano et al., oben). Unter diesen Bedingungen wurde BPg durch SK alleine nicht aktiviert.

5. Deglykosylierung von HPg

Das gewünschte HPg-Präparat (in 10 mM Natriumphosphat, pH-Wert 7,4) wurde mit Glycopeptidase F (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) bei einer Konzentration von 0,4 Enzymeinheiten/ ug HPg behandelt. Die Reaktion wurde 24 Stunden lang bei 37ºC fortgesetzt. Diese Bedingungen stellten sich für die Entfernung des Asn²&sup8;&sup9;-verbundenen Kohlehydrats aus allen untersuchten Proben als geeignet heraus. Die Mischung wurde dann einer Zentrifugierung in Mikrokonzentratorröhrchen (Amicon, Danvers, MA) Cut-off (Centricon) mit einem Molekulargewicht von 10.000 unterworfen, um das freigesetzte Oligosaccharid aus der Proteinprobe zu trennen.

B. Ergebnisse

Zwei rekombinante menschliche Plasminogene wurden aus der Infektion von Insektenzellen mit einem rekombinanten Baculovirus gewonnen, der die Wildtyp A475(Glu¹)Pg cDNA (stellt wt-irHPg bereit, Whitefleet-Smith et al., oben) und die cDNA von Wildtyp-A475HPg enthielt, das eine R561E-Mutation im Protein enthielt (R561E-HPg). Es wurde ein weiteres rekombinantes Protein mit dem eine R561S-Mutation enthaltendem Wildtyp (A475-Sequenz) in CHO-Zellen (R561S-HPg) hergestellt. Ihr elektrophoretisches Verhalten läßt vermuten, daß all diese rekombinanten Proteine in hohem Maße gereinigt waren und mit menschlichem (Glu1)Pg verbundene Molekulargewichtseigenschaften aufwiesen. Aus Gründen der Kürze ist die A475-Mutation in nachstehender Besprechung nicht erwähnt, obwohl sie in allen angeführten rekombinant hergestellten HPg-Proteinen vorhanden ist.
Die aminoterminale Aminosäuresequenzanalyse aller angeführten Plasminogene liefert die Sequenz NH&sub2;-Glu-Pro-Leu-Asp-Asp, was vermuten läßt, daß hinsichtlich der Spaltung des Signalpolypeptids alle korrekt verarbeitet wurden und daß die geringen Mobilitätsunterschiede zwischen gereinigten rekombinanten Proteinen und menschlichem Plasma-HPg auf geringe Molekulargewichtvariationen aufgrund unterschiedlicher Glykosylierung unter den Plasma-, Insektenzellen- und den von CHO-Zellen abgeleiteten Plasminogenen zurückzuführen sind.
Die amidolytischen Aktivitäten von stöichiometrischen Komplexen von SK des stationären Zustands mit den rekombinanten Wildtyp- und Variantenplasmin(ogen)en sind in Tabelle I aufgelistet und mit jenen des stöchiometrischen Komplexes von SK und des menschlichen Plasma-abgeleiteten Plasmin(ogen)s verglichen (d.h. des nativen menschlichen Plasmas (Glu¹)Pg, Affinitätschromatographieform A, wie die rekombinanten Pg gereinigt). Es entwickelte sich innerhalb von 1-5 Min. die volle amidolytische Aktivität jedes Komplexes, und es wurden zur Erzeugung der in dieser Untersuchung verwendeten Enzyme Inkubationszeiten von 5 Min. angewendet. TABELLE I Kinetische Konstanten des stationären Zustands bei 25ºC für die amidolytische Aktivität zu S-2251 von äquimolaren Komplexen von SK mit Plasminogenen und Plasminen Aktivator Spezien a Plasmin aus menschlichem Plasma b Bei Asn²&sup8;&sup9; deglykosylierte HPg-Variante.
Im Falle von wt-irHPg und menschlichem Plasma-HPg, zeigte die SDS/PAGE- Analyse der Komponenten der Komplexe bei Inkubationszeiten von 5 Min. deutlich, daß sie wie erwartet aus SK und (Lys&sup7;&sup8;)HPm bestanden (Bajaj und Castellino, J.Biol.Chem., 252: 492-498 (1977)). Bezüglich der Aktivierungsspaltungsstellen-Variantenplasminogene bestanden die Komplexe aus SK und dem entsprechenden HPg, wie dies ebenfalls zu erwarten war, da die Beschaffenheit der Mutation die Umwandlung von HPg zu HPm innerhalb des Komplexes ausschließt.
Die Daten von Tabelle I zeigen, daß die SK-HPm-Komplexe, die entweder menschliches Plasma HPm oder wt-irHPm enthalten, nahezu identische kinetische Konstanten des stationären Zustands zu S2251 aufweisen. In ähnlicher Weise ist amidolytische Aktivität in den Stöchiometrischen Komplexen von SK mit den zwei Varianten-HPg-Präparaten, u.z. R561E-HPg und R561S-HPg, vorhanden. Ein Vergleich der Werte der kinetischen Konstanten für diese beiden letztgenannten SK-HPg-Komplexe mit jenen der vorhergehenden SK-HPm-Komplexe läßt vermuten, daß in den amidolytischen Eigenschaften des stationären Zustands der verschiedenen SK-HPg- und SK-HPm-Komplexe nur geringe Unterschiede bestehen.
Die äquimolaren SK-Komplexe entweder mit menschlichem Plasma-HPm oder insektenexprimiertem HPm sind nahezu identisch, was aufzeigt, daß die Insektenzellen ein mit dem menschlichen Plasma-Gegenstück vergleichbares Protein erzeugen. Km für den SK-Komplex mit dem Variantenspaltungsstellenresistenten irHPg ist etwas geringer als dieser Wert für dieselben Komplexe mit einem/jedem der beiden Plasmine; dies läßt vermuten, daß im SK-HPg-Komplex im Vergleich zum SK-HPm-Komplex kinetische Unterschiede möglich sind.
Zur Bestimmung, ob das Asn²&sup8;&sup9;-verbundene Kohlehydrat von HPg bei den geringen Unterschieden, die bei den amidolytischen kinetischen Konstanten des stationären Zustands beobachtet werden, eine Rolle spielte, wurde R561S-HPg (aus CHO-Zellen) mit Glycopeptidase F deglykosyliert. Der stöchiometrische Komplex von SK mit dieser Form von HPg wies nur eine etwas höhere Km auf als sein glykosyliertes Gegenstück auf; dies läßt vermuten, daß das Vorhandensein des Kohlehydrats auf Asn²&sup8;&sup9;, zumindest hinsichtlich der Art, die auf dem CHO-zellenexprimierten Material vorhanden ist, bei dieser kinetischen Eigenschaft des SK-R561S-HPg-Komplexes keine große Rolle spielt.
Tabelle II zeigt kinetische Parameter des stationären Zustands, welche die jeweiligen Fähigkeiten der verschiedenen vorgebildeten stöchiometrischen SK-HPg- und SK-HPm-Komplexe widerspiegeln, auf katalytischen Ebenen, um als Aktivatoren von Plasminogen zu dienen. BPg wurde aufgrund seiner Unempfindlichkeit gegenüber Aktivierung durch SK alleine als Plasminogen-Quelle ausgewählt. TABELLE II Kinetische Konstanten des stationären Zustands bei 25ºC für die Plasminogenaktivatoraktivität zu Rinderplasminogen äquimolarer Komplexe von SK mit Plasminogenen und Plasminen Aktivator Spezien
a Plasminogen aus menschlichem Plasma. Dieser Komplex wurde als Ergebnis der 30 sek dauernden Präinkubation von SK und HPg gebildet. Der relative Prozentsatz des ursprünglichen, zu diesem Zeitpunkt im Komplex verbleibenden HPg betrug etwa 80%. Etwa 20% waren in diesem Komplex als HPm vorhanden.
b Plasmin aus menschlichem Plasma. Dieser Komplex wurde als Ergebnis der dreiminütigen Präinkubation von SK und HPg gebildet. Der relative Prozentsatz von HPm betrug im Komplex mit SK etwa 100%.
c Insektenzellen-exprimiertes Wildtyp-Humanplasminogen. Dieser Komplex wurde als Ergebnis der 30 sek dauernden Präinkubation von SK und wt-irHPg gebildet. Der relative Prozentsatz des zu diesem Zeitpunkt im Komplex verbleibenden ursprünglichen HPg betrug etwa 80%. Etwa 20% waren in diesem Komplex als HPm vorhanden.
d Insektenzellen-exprimiertes Wildtyp-Humanplasmin. Dieser Komplex wurde als Ergebnis der dreiminütigen Präinkubation von SK und wt-ir-HPg gebildet. Der relative Prozentsatz von HPm im Komplex mit SK betrug etwa 100%.
e Stöchiometrischer Komplex von SK mit R561S-HPg, deglykosyliert an Asn289.
Ein Vergleich der kinetischen Eigenschaften des SK-(Lys&sup7;&sup8;)Pm- (erzeugt mit Plasma-HPg) Komplexes (dreiminütige Präinkubationszeit, Tabelle II) zeigt, daß vor allem aufgrund eines Unterschiedes im k cat der Aktivierung der das insektenexprimierte HPm enthaltende Komplex deutlich aktiver als jener das menschliche Plasma HPm enthaltende ist. Außerdem war die Spezifitätskonstante zweiter Ordnung für die Plasminogenaktivierung des SK-R561E-HPg-Komplexes aufgrund sowohl einer Abnahme der Km- als auch einer Zunahme der Kcat-Werte etwa 30mal größer als derselbe Wert für den SK-wt-irHPm-Komplex.
Aus diesen Daten and einem Vergleich der mit dem SK-irHPm-Komplex (dreiminütige Präinkubationszeit) und dem SK-R561E-HPg-Komplex erhaltenen Daten scheint hervorzugehen, daß der HPg enthaltende Komplex als Plasminogenaktivator deutlich wirkungsvoller als derselbe, HPm enthaltende Komplex ist. Zusätzliche Beweise für die Richtigkeit dieser Ansicht liefert eine Analyse über die Auswirkung der Präinkubationszeit von stöchiometrischen Werten von SK sowohl mit Plasma (Glu¹)Pg als auch mit wt-irHPg auf die Fähigkeit der resultierenden Komplexe, BPg zu aktivieren.
In einem sehr frühen Präinkubationsstadium (≤30 sek), zeigt SDS/PAGE, daß der Komplex nach wie vor etwa 80% HPg im Falle jedes Plasminogens und etwa 20% HPm enthält. Nach Ablauf einer Minute und mehr wird im Komplex das gesamte HPg zu HPm umgewandelt. In der 30-sek-Probe ist im Vergleich zu den länger als 1 Min. präinkubierten Proben ein viel höherer Wert an BPg-Aktivatoraktivität festzustellen, was den Schluß sehr nahe legt, daß der SK-HPg-Komplex bei der Aktivierung von BPg wirkungsvoller als der SK-HPm-Komplex ist.
Kinetische Konstanten zur Aktivierung von BPg mit den SK-Komplexen, die bei kurzen Präinkubationszeiten (30 sek) aus menschlichem Plasma HPg und wt-ir-HPg gebildet werden, sind in Tabelle II aufgelistet.
Wie aus diesen Daten ersichtlich ist, nehmen die Km-Werte gegenüber jenen deutlich ab, die aus den entsprechenden Proben gewonnen wurden, worin in den Komplexen das gesamte HPg zu HPm umgewandelt wurde (man vergleiche die Daten für die 30 Sek. und 3 Min. dauernden Vorinkubationszeiten in Tabelle II). Wurden ähnliche Versuche mit R561E-HPg und R561-HPg durchgeführt, stellte man keinen solchen frühzeitigen Aktivitätspeak fest; man beobachtete nur vorübergehend konstante Aktivatoraktivitäten der Komplexe.
Schließlich wies das Säugetierzellen-exprimierte Varianten-HPg (R561S-HPg) im stöchiometrischen Komplex mit SK ähnliche, jedoch keine identischen kinetischen Werte des stationären Zustands zur BPg-Aktivierung als insektenexprimiertes Protein auf (R561E-HPg). Die kc at für den Enzymkomplex, der das letztere Protein enthält, ist etwa zweimal höher als jene des mit dem ersteren HPg gebildeten Komplexes. Daß Unterschiede in der Glykosylierung der Varianten-rekombinanten HPg-Präparate bei den Plasminogenaktivatoraktivitäten der dieselben Plasminogene enthaltenden SK-Komplexe eine Rolle spielen können, geht aus den Daten von Tabelle II hervor. Die kcat für die Aktivierung von BPg durch den SK-R561-HPg-Komplex ist somit etwa 2,4 mal niedriger, und die Km ist etwa zweimal höher als die entsprechenden Werte für denselben Komplex, der mit dem Glycopeptidase F-deglykosylierten R561S-HPg hergestellt wurde. Diese Unterschiede zeigten sich in der Analyse der amidolytischen Aktivitäten derselben Komplexe (Tabelle I) nicht. Demnach ermöglichte es die deglykosylierte Form des CHO-exprimierten Varianten-HPg im äquimolaren Komplex mit SK, daß dieser Komplex ein noch wirkungsvollerer Aktivator von BPg wird.
Man beachte, daß alle kinetischen Assays EACA als Pufferkomponente enthielten. Dieses Mittel war vorhanden, um maximale Aktivierungsraten zu schaffen und jegliche Überlegungen möglicher Unterschiede der Aktivierungsraten überflüssig zu machen, die auf variable Mengen von (Glu¹)Pg und (Lys&sup7;&sup8;)Pg in den Assaymischungen mit jedem beliebigen der hierin untersuchten Plasminogene zurückzuführen sind.
Zusammenfassend wurde gezeigt, daß die Stabilisierung von HPg innerhalb des SK-Komplexes zu einer deutlich gesteigerten Fähigkeit der Plasminogenaktivierung durch den Komplex führt. Weiters wurden nun stabile Formen von Plasminogen in Säugetierzellen exprimiert, was eine wirkungsvolle Herstellung von Plasminogen ermöglicht, das beim Komplexieren mit Streptokinase stabil ist. Zusätzlich dazu vermeidet eine solche Expression die Verwendung menschlichen Plasmas als Plasminoenquelle, welches das Risiko aufweist, schädliche menschliche Viren wie z.B. HIV, HTLV-1, Hepatitis, einschließlich des Nicht-A, Nicht-B-Hepatitisvirus zu enthalten.

BEISPIEL 5

Zwischen fibrinolytischen Enzymen und Plasminogen gebildete Komplexe können als thrombolytische Mittel verwendet werden. Die katalytische Stelle von fibrinolytischen Enzymen kann durch eine Gruppe blockiert sein, die unter bestimmten Bedingungen durch Hydrolyse entfernbar ist. Smith et al., US PS 4.808.405, oben; und Smith et al., Nature, 290: 505-508 (1981). Daher kann R561E-HPg oder R561S-HPg dieser Erfindung alleine, als Komplex mit einem fibrinolytischen Enzym, als Komplex mit einem acylierten fibrinolytischen Enzym, als acyliertes Proenzym oder als acyliertes Proenzym in einem Komplex mit einem fibrinolytischen Enzym oder einem acylierten fibrinolytischen Enzym als thrombolytisches Mittel verwendet werden. Ein erfindungsgemäßer acylierter Streptokinase/acylierter Plasminogen-Komplex kann wie folgt hergestellt werden.
Streptokinase (etwa 451 mg; erhältlich bei AB Kabi, Stockholm, Schweden) kann mit einem Lysin/Mannitpuffer (etwa 110 ml) bei einem pH-Wert von 7,0 und sterilem Glycerin (etwa 60 ml) vermischt und 5 Minuten lang bei 4ºC gerührt werden. Eine sterile gefilterte Lösung von p-Amidinophenyl-p'-anisat in DMSO (etwa 15 ml, etwa 20 mM) kann 2 Minuten lang hinzugefügt und die Mischung 5 Minuten lang bei 4ºC gerührt werden. Erfindungsgemäßes R561E-HPg oder R561S-HPg (etwa 809 mg) kann 2 Minuten lang hinzugefügt und die Mischung 60 Minuten lang bei 4ºC gerührt werden.
Aus den obigen Substanzen kann eine erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung wie folgt hergestellt werden: Menschliches Serumalbumin (klinische Qualität) (18,9 ml 20% g/v) kann dann unter zweiminütigem Rühren bei 4ºC zur Mischung hinzugefügt werden. Es kann ein Lysin/Mannitpuffer hinzugefügt werden, um das Volumen auf etwa 400 ml zu bringen. Das Fluid kann dann etwa 2,5 Stunden lang bei 18ºC diagefiltert werden, bis etwa 2400 ml Diafiltrat gesammelt sind. Das Fluid kann anschließend durch einen 0,22 u sterilen Filter durchgefiltert und in einen sterilen Behälter gefüllt werden, aus dem aliquote Teile in sterile Gefriertrocknungsfläschchen ausgegeben und danach gefriergetrocknet werden.

Hinterlegung von Materialien

Der folgende Stamm wurde bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, USA (ATCC) hinterlegt: Stamm ATCC Zugriffsnr. Hinterlegungsdatum 25.Oktober 1989
Die Hinterlegung erfolgte in Einklang mit den Bestimmungen des Budapester Vertrages über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen zum Zwecke des Patentverfahrens und der darin enthaltenen Verordnungen (Budapester Vertrag). Dies stellt die Aufrechterhaltung einer lebensfähigen Kultur über einen Zeitraum von 30 Jahren ab dem Datum der Hinterlegung sicher. Der Organismus wird seitens der ATCC gemäß den Bestimmungen des Budapester Vertrags und aufgrund einer Vereinbarung zwischen Genentech, Inc. und ATCC zur Verfügung gestellt; dies gewährleistet die dauerhafte und uneingeschränkte Verfügbarkeit der Nachkommenschaft der Kultur für die Öffentlichkeit in Folge der Ausgabe des betreffenden U.S. Patents oder der Offenlegung einer beliebigen U.S. oder ausländischen Patentanmeldung gegenüber der Öffentlichkeit (gleichgültig, welches Ereignis zuerst eintritt) sowie die Verfügbarkeit der Nachkommenschaft für jemanden, der laut Bestimmung des U.S.Commissioner of Patents and Trademarks dazu gemäß 35 USC §122 und der damit in Einklang stehenden Richtlinien des Commissioners berechtigt ist (einschließlich 37 CFR § 1.14 unter besonderer Bezugnahme auf 886 OG 638).
Der Zessionar der vorliegenden Anmeldung verpflichtete sich, daß im Falle des Absterbens, Verlusts oder der Zerstörung der hinterlegten und unter stabilen Bedingungen gezüchteten Kultur diese unverzüglich bei Benachrichtigung durch eine lebensfähige Probe derselben Kultur ersetzt wird. Die Verfügbarkeit der hinterlegten Kultur darf nicht als Genehmigung angesehen werden, die Erfindung unter Mißachtung der Rechte praktisch anzuwenden, die aufgrund einer Machtbefugnis einer beliebigen Regierung in Einklang mit ihren Patentgesetzen gewährt werden.
Obige schriftliche Beschreibung wird als ausreichend erachtet, die praktische Anwendung der Erfindung durch einen Fachmann auf dem Gebiet zu ermöglichen. Der Schutzbereich der vorliegenden Erfindung ist durch die hinterlegte Kultur nicht eingeschränkt, da die hinterlegten Ausführungsformen als getrennte Veranschaulichung bestimmter Aspekte der Erfindung angesehen werden und jede beliebige funktionell äquivalente Kultur in den Schutzbereich dieser Erfindung fällt. Die hierin angeführte Hinterlegung von Material stellt kein Eingeständnis dar, daß die hierin enthaltene schriftliche Beschreibung nicht ausreichend ist, die praktische Anwendung eines beliebigen Aspekts der Erfindung einschließlich ihrer besten Durchführungsart zu ermöglichen; sie darf auch nicht als Beschränkung des Schutzbereichs der Patentansprüche auf die speziellen Abbildungen, die sie darstellt, angesehen werden. Selbstverständlich sind - wie dies für einen Fachmann auf dem Gebiet auf der Grundlage der obigen Beschreibung offenkundig ist -zusätzlich zu den hierin gezeigten und beschriebenen verschiedene andere Modifizierungen möglich, die in den Schutzbereich der beigelegten Patentansprüche fallen.

Claims

1. Nukleinsäuresequenz, die für eine Plasminogenaminosäuresequenzvariante kodiert, die eine Mutation an einer Plasminogenzweikettenspaltungsstelle aufweist und daher resistent gegen proteolytische Spaltung zu ihrer Zweikettenform ist.

2. Sequenz nach Anspruch 1, worin das Plasminogen menschliches Plasminogen (HPg) ist.

3. Sequenz nach Anspruch 2, worin die Plasminogenaminosäuresequenzvariante eine Variante ist, bei der der Argininrest an Position 561 des Plasminogens mit nativer Sequenz durch eine andere Aminosäure ersetzt ist.

4. Sequenz nach Anspruch 3, worin der Argininrest in irgendeine Aminosäure mit Ausnahme von Lysin geändert ist.

5. Sequenz nach Anspruch 4, worin die Variante R561E-HPg (Arginin an Position 561 des Wildtypplasminogens ist durch einen Glutaminsäurerest ersetzt), R561G-HPg (Arginin an Position 561 des Wildtypplasminogens ist durch einen Glycinrest ersetzt) oder R561S-HPg (Arginin an Position 561 des Wildtypplasminogens ist durch einen Serinrest ersetzt) ist und Alanin an Position 475 aufweist.

6. Sequenz nach Anspruch 1, die einen Promotor umfaßt, der operabel mit der für Plasminogen kodierenden Sequenz verbunden ist.

7. Sequenz nach Anspruch 6, die weiters eine Signalsequenz umfaßt, die operabel mit der für Plasminogen kodierenden Sequenz verbunden ist.

8. Sequenz nach Anspruch 7, worin die Signalsequenz von Säugetierwirtszellen erkannt wird.

9. Sequenz nach Anspruch 1, worin die Plasminogenaminosäuresequenzvariante nicht glykosyliert ist.

10. Expressionsvektor, der die Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 1 umfaßt, die operabel mit Kontrollsequenzen verbunden ist.

11. Vektor nach Anspruch 10, der für R561E-HPg (Arginin an Position 561 des Wildtypplasminogens ist durch einen Glutaminsäurerest ersetzt) mit Alanin an Position 475 kodiert.

12. Wirtszelle, die den Vektor nach Anspruch 10 umfaßt.

13. Wirtszelle nach Anspruch 12, die eukaryotisch ist.

14. Wirtszelle nach Anspruch 13, die eine Säugetierzelle ist.

15. Wirtszelle nach Anspruch 12, die prokaryotisch ist.

16. Einkettenplasminogenaminosäuresequenzvariante, die eine Mutation an einer Plasminogenzweikettenspaltungsstelle aufweist.

17. Plasminogenaminosäuresequenzvariante nach Anspruch 16, die menschliches Plasminogen ist, bei dem das Arginin an Position 561 von Plasminogen mit nativer Sequenz durch eine andere Aminosäure ersetzt ist.

18. Plasminogenaminosäuresequenzvariante nach Anspruch 17, bei der die zum Ersetzen von Arginin verwendete Aminosäure nicht Lysin ist.

19. Plasminogenaminosäuresequenzvariante nach Anspruch 18, die R561E-HPg (Arginin an Position 561 des Wildtypplasminogens ist durch einen Glutaminsäurerest ersetzt), R561S-HPg (Arginin an Position 561 des Wildtypplasminogens ist durch einen Serinrest ersetzt) oder RS6iG-HPg (Arginin an Position 561 des Wildtypplasminogens ist durch einen Glycinrest ersetzt) ist und Alanin an Position 475 aufweist.

20. Pharmazeutische Zusammensetzung zur Bewirkung von Thrombolyse, die eine wirksame Menge der Plasminogenaminosäuresequenzvariante von Anspruch 16 in einem pharmazeutisch akzeptablen Träger umfaßt.

21. Zusammensetzung nach Anspruch 20, die weiters ein fibrinolytisches Enzym umfaßt.

22. Zusammensetzung nach Anspruch 21, worin die aktive Stelle des fibrinolytischen Enzyms acyliert ist.

23. Zusammensetzung nach Anspruch 21, worin das fibrinolytische Enzym mit dem Plasminogen komplexiert ist.

24. Zusammensetzung nach Anspruch 22, worin das fibrinolytische Enzym aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Streptokinase, Urokinase, Gewebeplasminogenaktivator und einer Kombination daraus besteht.

25. Zusammensetzung nach Anspruch 24, worin der Komplex ein p-Anisoylstreptokinase/Plasminogen-Komplex ohne innere Peptidbindungsspaltung ist.

26. Zusammensetzung nach Anspruch 20, die isotonisch ist.

27. Zusammensetzung nach Anspruch 20, die steril filtriert ist.

28. Verwendung einer Zusammensetzung nach Anspruch 20 oder Anspruch 24 bei der Herstellung eines Medikaments zur Verabreichung an ein Säugetier, das thrombolytische Therapie braucht.

29. Verwendung einer Zusammensetzung nach Anspruch 24, die einen p-Anisoylstreptokinase/Plasminogen-Komplex ohne innere Peptidbindungsspaltung umfaßt, bei der Herstellung eines Medikaments zur Verabreichung an ein Säugetier, das thrombolytische Therapie braucht.

30. Verwendung nach Anspruch 28 oder 29, worin das Medikament zur Verabreichung an einen Menschen dient.

31. Verfahren zur Herstellung eines binären Komplexes zwischen einem fibrinolytischen Enzym und Plasminogen, wobei der Komplex eine katalytische Stelle aufweist, die für fibrinolytische Aktivität wesentlich ist, die durch eine durch Hydrolyse entfernbare Gruppe blockiert ist, umfassend: das Mischen eines fibrinolytischen Enzyms mit der Plasminogenaminosäuresequenzvariante nach Anspruch 16, um einen binären Komplex in Gegenwart eines Überschusses eines Blockierungsmittels der Formel A-B oder E-F zu bilden, worin A eine hydrolytisch labile Blockierungsgruppe ist, die für die katalytische Stelle selektiv ist, die für fibrinolytische Aktivität wesentlich ist, und die zur Übertragung von der Gruppe B zur katalytischen Stelle fähig ist, B eine Gruppe ist, die das Anbinden von A an das Enzym erleichtert, E eine Anordnungsgruppe ist, die das Mittel in der katalytischen Stelle anordnet, und F eine hydrolytisch labile Blockierungsgruppe ist, die zur Übertragung von der Anordnungsgruppe zur katalytischen Stelle fähig ist.

32. Verfahren nach Anspruch 31, das weiters den Schritt des Isolierens des binären Komplexes umfaßt.

33. Verfahren nach Anspruch 31, worin das Plasminogen menschliches Plasminogen ist, worin der Argininrest an Position 561 von Plasminogen mit nativer Sequenz durch eine andere Aminosäure ersetzt ist und das fibrinolytische Enzym Streptokinase ist.

34. Verfahren nach Anspruch 33, worin das Plasminogen R561E-HPg (Arginin an Position 561 des Wildtypplasminogens ist durch einen Glutaminsäurerest ersetzt), R561S-HPg (Arginin an Position 561 des Wildtypplasminogens ist durch einen Serinrest ersetzt) oder R561G-HPg (Arginin an Position 561 des Wildtypplasminogens ist durch einen Glycinrest ersetzt) ist.

35. Verfahren nach Anspruch 31, worin die hydrolytisch labile Blockierungsgruppe eine Acylgruppe ist.

36. Verfahren nach Anspruch 35, worin die Acylgruppe eine Benzyl-, substituierte Benzoyl-, Acryloyl- oder substituierte Acryloylgruppe ist.

37. Verfahren nach Anspruch 35, worin A-B p-Nitrophenyl-p'-guanidinobenzoat ist.

38. Verfahren nach Anspruch 35, worin E eine p-Amidinophenyl- oder eine p-Acetamidophenylgruppe ist.

39. Verfahren nach Anspruch 35, worin F eine Benzoyl- oder Acryloylgruppe ist.