JP2022540865A - 組換えタンパク質を作製するための方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、哺乳類発現系で組換えプラスミノゲンを生産する方法に関する。プラスミノゲンを生産するための方法であって、（ｉ）プラスミノゲンをコードする第１の組換えポリヌクレオチドおよびプラスミノゲン活性化阻害剤をコードする第２の組換えポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供する工程；（ｉｉ）好適な培養培地中で、第１のポリヌクレオチドからプラスミノゲンを、第２のポリヌクレオチドからプラスミノゲン活性化阻害剤を発現させる条件下で、前記宿主細胞を培養する工程を含む、方法。

Description

本発明は、哺乳類発現系で組換えプラスミノゲンを生産する方法に関する。

関連出願
本出願は、その全内容が参照により本明細書に含まれるオーストラリア仮出願ＡＵ２０１９９０２４６８号の優先権を主張する。

大量の比較的純粋なポリペプチドおよびタンパク質の生産は、多くの医薬製剤の製造のために重要である。大量の外因性タンパク質は宿主細胞中で発現させることができるので、多くのタンパク質の生産のために組換えＤＮＡ技術が一部採用されてきた。

プラスミンは、哺乳動物において主要な線維素溶解酵素である。このタンパク質は、血漿中を循環する不活性な酵素原前駆体プラスミノゲンから誘導されるキモトリプシン様ファミリーに属するセリンプロテアーゼである。

プラスミノゲンは、およそ９２ｋＤａの分子量を有する７９１アミノ酸からなる単鎖糖タンパク質である。プラスミノゲンは、主に肝臓中で合成され、ほとんどの細胞外液中で豊富である。血漿中のプラスミノゲンの濃度は、およそ２μＭである。それゆえにプラスミノゲンは、組織および体液において大きな可能性のあるタンパク質分解活性源を構成する。

プラスミノゲンは、２つの分子の形態、すなわちＧｌｕ－プラスミノゲンおよびＬｙｓ－プラスミノゲンの形態で存在する。天然の分泌された切断されていない形態は、アミノ末端（N末端）のグルタミン酸を有することから、Ｇｌｕ－プラスミノゲンと称される。しかしながら、プラスミンの存在下で、Ｇｌｕ－プラスミノゲンはＬｙｓ７６－Ｌｙｓ７７で切断されて、Ｌｙｓ－プラスミノゲンになる。Ｇｌｕ－プラスミノゲンと比較して、Ｌｙｓ－プラスミノゲンは、フィブリンにより高い親和性を有し、プラスミノゲン活性化因子によってより高い速度で活性化されるが、Ｌｙｓ－プラスミノゲンが循環中に見出されているとの証拠はない。

プラスミノゲンは、組織型プラスミノゲン活性化因子（tPA）またはウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子（uPA）のいずれかによるＡｒｇ５６１－Ｖａｌ５６２ペプチド結合の切断によってプラスミンに活性化される。この切断は、１つのｐａｎ－ａｐｐｌｅおよび５つのクリングル領域からなるα－重鎖であって、これらのクリングル領域のうち４つはリシン結合部位を有する、α－重鎖と、触媒三残基、すなわちＨｉｓ６０３、Ａｓｐ６４６、およびＳｅｒ７４１を有するβ軽鎖とをもたらす。活性なプラスミンは、宿主におけるフィブリン血栓の溶解に関与する。フィブリン血栓に結合すると、天然のプラスミノゲン（N末端がグルタミン酸のGlu-プラスミノゲンを含む）のＰａｎ－ａｐｐｌｅドメインは、容易に切断され、Ｎ末端がリシンの改変されたプラスミノゲン（８３ｋＤａ）（Lys-プラスミノゲン）に変換されることが示されている。

ヒト血漿中には、プラスミノゲンの２つの主要なグリコフォーム、すなわち、少なくとも２つのグリコシル化部分（N289へのN-連結およびT346へのO-連結）を含有する１型プラスミノゲン、および少なくとも１つのＯ－連結糖（T346へのO-連結）を含有する２型プラスミノゲンが存在する。２型プラスミノゲンは、細胞表面に優先的に動員され、それに対して１型プラスミノゲンは、血餅により優勢に動員される。

プラスミノゲンは、２つのコンフォメーション：閉鎖型および開放型で存在し得る。循環中の天然のＧｌｕ－プラスミノゲンは、閉鎖形態であり、したがって活性化部位は露出していない。これは、クリングル領域上のリシン結合部位を介してフィブリン血栓または細胞表面受容体などの標的に結合したら、その活性化部位が露出した開放型のコンフォメーションに変化する。これらの２つのコンフォメーション間の分子の寸法は著しく異なる。

プラスミンは、線溶系の基本的な構成要素であり、血餅の溶解および漏出したフィブリンのクリアランスに関与する主要な酵素である。加えて、プラスミンは、基底膜、細胞外マトリックス、細胞受容体、サイトカインおよび補体などの多様な生物学的な標的を切断する。したがってプラスミノゲンは、創傷治癒、細胞移動、組織リモデリング、血管新生および胚形成において生きている。プラスミノゲンは、創傷治癒の全ての相中の複数の細胞プロセス、すなわち炎症、増殖およびリモデリングへの関与が示されている。これらのプロセスとしては、フィブリン分解、血小板活性化、サイトカインおよび増殖因子の放出、アポトーシス細胞のクリアランス、ケラチノサイトの活性化、および線維芽細胞の上皮間葉転換、細胞移動、および細胞外マトリックスの分解が挙げられる。

治療剤としての使用のために組換えプラスミノゲンの十分な量の十分に純粋な調製物を得ることに関連して非常に多くの技術的な困難さがある。全長プラスミノゲン分子の複雑な構造のために、細菌発現系が組換えプラスミノゲン生産に有用であることは証明されていない。プラスミノゲンは、不溶性封入体の形態で生産され、その状況から再フォールディング不可能である。さらに、哺乳類細胞におけるプラスミノゲンの発現は、プラスミノゲンのプラスミンへの細胞内活性化およびそれにより生じた細胞傷害性によって複雑化する。昆虫細胞を使用した十分活性なプラスミノゲンの生産は可能性があるが、この系は、低い収量のためにラージスケールの生産に好適ではない。

組換え系を使用して好適な量および品質の組換えプラスミノゲンを得ることの困難さの結果として、今日の臨床の場面での使用のために生産されたほとんどのプラスミノゲンは、血漿の分画から得られる。プラスミノゲンをヒト血漿から直接得ることは、源材料の十分な提供を頼る必要性およびその病原体汚染のリスクなど、それ自体の問題を呈する。

プラスミノゲン補充を必要とする状態の処置に使用するためのプラスミノゲンを十分な量および十分な活性で得るための新しい方法および組成物への必要性がある。

明細書における全ての先行技術への言及は、いかなる権限の範囲内でもこの先行技術が共通の一般知識の一部を構成すること、またはこの先行技術が、当業者によって先行技術の他の部分と共に理解される、それと関連するとみなされる、および／またはそれと組み合わされると合理的に予想できるという承認または示唆ではない。

一態様において、本発明は、プラスミノゲンを生産するための方法であって、
（ｉ）プラスミノゲンをコードする第１の組換えポリヌクレオチドおよびプラスミノゲン活性化因子阻害剤をコードする第２の組換えポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供する工程；
（ｉｉ）好適な培養培地中で、第１のポリヌクレオチドからプラスミノゲンを、第２のポリヌクレオチドからプラスミノゲン活性化因子阻害剤を発現させる条件下で、前記宿主細胞を培養する工程
を含む、方法を提供する。

好ましくは、本発明は、プラスミノゲンを生産するための方法であって、
（ｉ）プラスミノゲンをコードする第１の組換えポリヌクレオチドおよびプラスミノゲン活性化因子阻害剤－１（PAI-1）またはそのバリアントをコードする第２の組換えポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供する工程；
（ｉｉ）好適な培養培地中で、第１のポリヌクレオチドからプラスミノゲンを、第２のポリヌクレオチドからＰＡＩ－１またはそのバリアントを発現させる条件下で、前記宿主細胞を培養する工程
を含む、方法を提供する。

一態様において、本発明は、組換えプラスミノゲンを生産する方法であって、
（ａ）プラスミノゲンをコードする第１のポリヌクレオチドを提供する工程、
（ｂ）ＰＡＩ－１またはそのバリアントをコードする第２のポリヌクレオチドを提供する工程であって、
第１および第２のポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの発現を可能にするためにプロモーターに作動可能に連結されている、工程、
（ｃ）宿主細胞を提供する工程、
（ｄ）宿主細胞を、ａ）およびｂ）のポリヌクレオチドで形質転換またはトランスフェクトする工程、
（ｅ）細胞培養培地を提供する工程、
（ｆ）細胞培養培地中で、プラスミノゲンおよびＰＡＩ－１またはそのバリアントをコードするポリヌクレオチドの発現に十分な条件下で、形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞を培養する工程、ならびに
任意選択で（ｇ）宿主細胞および／または細胞培養培地からプラスミノゲンを回収または精製する工程
を含む、方法を提供する。

一実施形態において、第１および第２のポリヌクレオチドは、単一のポリヌクレオチド分子中に提供される。代替の実施形態において、第１および第２のポリヌクレオチドは、異なるポリヌクレオチド分子中に提供される。例えば、プラスミノゲンをコードするポリヌクレオチドおよびプラスミノゲン活性化因子阻害剤（好ましくはＰＡＩ－１）またはそのバリアントは、単一のベクター中に提供されていてもよい。代替として、プラスミノゲンをコードするポリヌクレオチドおよびプラスミノゲン活性化因子阻害剤（PAI-1）またはそのバリアントは、別々のベクター構築物中に提供されていてもよく、各ベクターは、他方のベクターと異なるタイプの選択マーカーを有する。

別の態様において、本発明はまた、組換えプラスミノゲンを生産する方法であって、
（ａ）プラスミノゲンをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを提供する工程、
（ｂ）ＰＡＩ－１またはそのバリアントをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを提供する工程；
（ｃ）宿主細胞を提供する工程、
（ｄ）宿主細胞を、工程（ａ）および（ｂ）のベクターで形質転換またはトランスフェクトする工程、
（ｅ）細胞培養培地を提供する工程、
（ｆ）細胞培養培地中で、プラスミノゲンおよびＰＡＩ－１またはそのバリアントをコードするポリヌクレオチドの発現に十分な条件下で、形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞を培養する工程、ならびに
任意選択で（ｇ）宿主細胞および／または細胞培養培地からプラスミノゲンを回収または精製する工程
を含む、方法も提供する。

本発明の方法のいずれの態様においても、本方法は、ＰＡＩ－１またはそのバリアントを培養培地に混合する工程をさらに含む。

別の態様において、本発明は、プラスミノゲンを生産するための方法であって、
（ｉ）プラスミノゲンをコードする組換えポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供する工程；
（ｉｉ）好適な培養培地中で、ポリヌクレオチドからプラスミノゲンを発現させる条件下で、前記宿主細胞を培養する工程
を含み、
培養培地は、ＰＡＩ－１またはそのバリアントを含む、方法を提供する。

別の態様において、本発明は、組換えプラスミノゲンを生産する方法であって、
（ａ）プラスミノゲンをコードするポリヌクレオチドを提供する工程であって、
ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの発現を可能にするためにプロモーターに作動可能に連結されている、工程、
（ｃ）宿主細胞を提供する工程、
（ｄ）宿主細胞を、（ａ）のポリヌクレオチドで形質転換またはトランスフェクトする工程、
（ｅ）ＰＡＩ－１またはそのバリアントを含む細胞培養培地を提供する工程、
（ｆ）細胞培養培地中で、プラスミノゲンをコードするポリヌクレオチドの発現に十分な条件下で、形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞を培養する工程、ならびに
任意選択で（ｇ）宿主細胞および／または細胞培養培地からプラスミノゲンを回収または精製する工程
を含む、方法を提供する。

本発明の方法のいずれの態様においても、本方法は、プラスミノゲンをコードするポリヌクレオチドの一時的または安定な発現、およびＰＡＩ－１またはそのバリアントをコードするポリヌクレオチドの一時的または安定な発現を提供する。

プラスミノゲンは、いずれかの哺乳動物のプラスミノゲン配列に対応するものであり得る。いずれかの実施形態において、プラスミノゲンは、ヒトプラスミノゲン、非ヒト霊長類プラスミノゲン、ブタ、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ウシ、ネコ、イヌ、または他の哺乳類プラスミノゲンである。好ましくは、プラスミノゲンは、ヒトプラスミノゲンである。

本発明のいずれかの実施形態において、プラスミノゲンは、Ｇｌｕ－Ｐｌｇ、Ｌｙｓ－Ｐｌｇ、ミディＰｌｇ（Midi-Pig）、ミニＰｌｇ（Mini-Plg）およびマイクロＰｌｇ（Micro-Plg）からなる群から選択される。

プラスミノゲンは、野生型プラスミノゲン配列を含んでいてもよく、またはそのバリアントまたは改変された配列を含んでいてもよい。本発明のいずれかの実施形態において、プラスミノゲンは、Ｇｌｕ－Ｐｌｇ、Ｌｙｓ－Ｐｌｇ、ミディＰｌｇ、ミニＰｌｇおよびマイクロＰｌｇからなる群から選択される。代替の実施形態において、プラスミノゲンは、プロテアーゼ活性部位、活性化部位、およびそれらの組合せにおけるアミノ酸置換、ならびに／またはプロテアーゼ活性の増加をもたらすアミノ酸置換を含むプラスミノゲン配列を含んでいてもよい。

特定の実施形態において、プラスミノゲンをコードするポリヌクレオチドは、配列番号１、５、６、８、１０、１２または１４のいずれか１つの核酸配列、または配列番号１、５、６、８、１０、１２または１４のいずれか１つに記載の配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。

特定の実施形態において、ポリヌクレオチドによってコードされた、または本明細書に記載されるいずれかの方法に従って生産されたプラスミノゲンは、配列番号２、７、９、１１、１３、１５、１６、１７、１８、１９または２０のいずれか１つに記載のアミノ酸配列、または配列番号２、７、９、１１、１３、１５、１６、１７、１８、１９または２０のいずれかに記載のアミノ酸配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一な配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。一実施形態において、本明細書に記載されるいずれかの方法に従って生産されたプラスミノゲンは、本明細書に記載されるいずれかのシグナル配列を含むシグナル配列を含有しない。

好ましくは、プラスミノゲン活性化因子阻害剤は、ＰＡＩ－１である。より好ましくは、ＰＡＩ－１は、配列番号４に示されるアミノ酸配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。代替として、ＰＡＩ－１配列は、改変されていない（すなわち野生型）ＰＡＩ－１の配列を含んでいてもよく、それからなっていてもよく、またはそれから本質的になっていてもよく、野生型配列は、配列番号４の配列からなり、１９７および３５５位における残基は、それぞれグルタミンおよびグリシンである。

特定の実施形態において、プラスミノゲン活性化因子阻害剤をコードするポリヌクレオチドは、配列番号３の核酸配列、または配列番号３に記載の配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有する核酸配列を含む。

第１および第２のポリヌクレオチド（すなわち、プラスミノゲンおよびプラスミノゲン活性化阻害剤をコードするポリヌクレオチド）が、単一のポリヌクレオチド構築物、例えば単一のベクター構築物中に提供される特定の実施形態において、単一のポリヌクレオチド構築物は、配列番号５に示される核酸配列、または配列番号５に記載の配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。

宿主細胞は、好ましくは哺乳類宿主細胞であり、哺乳類宿主細胞としては、これらに限定されないが、Ｅｘｐｉ２９３、Ｅｘｐｉ２９３のバリアント、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞およびその派生物、ＨｅＬａ（ヒト子宮頸がん）細胞、ＣＯＳおよびＶｅｒｏ細胞からなる群から選択される細胞が挙げられる。

別の態様において、本発明はまた、プラスミノゲンをコードする第１のポリヌクレオチド配列およびＰＡＩ－１またはそのバリアントをコードする第２のポリヌクレオチド配列を含むベクターまたは構築物も提供する。好ましくは、第１および第２のポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの発現を可能にするためにプロモーターに作動可能に連結されている。特定の実施形態において、プラスミノゲンおよびＰＡＩ－１は、バイシストロン性発現を可能にするために、単一のポリヌクレオチド構築物中にコードされている。特定の実施形態において、ベクターまたは構築物は、第１のポリヌクレオチド配列と第２のポリヌクレオチド配列との間に、ｃａｐと無関係に翻訳開始を可能にする内部リボソーム進入部位（IRES）を含む。

典型的には、第１のポリヌクレオチド配列は、Ｇｌｕ－Ｐｌｇ、Ｌｙｓ－Ｐｌｇ、ミディＰｌｇ、ミニＰｌｇおよびマイクロＰｌｇからなる群から選択されるプラスミノゲンをコードする。

特定の実施形態において、第１のポリヌクレオチドは、配列番号１、６、８、１０、１２または１４のいずれか１つに記載の核酸配列、または配列番号１、６、８、１０、１２または１４のいずれか１つに記載の配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。

特定の実施形態において、第２のポリヌクレオチドは、配列番号３の核酸配列、または配列番号３に記載の配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有する核酸配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。

特定の実施形態において、第１のポリヌクレオチドによってコードされるプラスミノゲンは、配列番号２、７、９、１１、１３、１５、１６、１７、１８、１９または２０のいずれか１つに記載のアミノ酸配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一なアミノ酸配列を含む、それからなる、もしくはそれから本質的になる、またはそれを有する。

一実施形態において、第２のポリヌクレオチドによってコードされるプラスミノゲン活性化阻害剤は、プラスミノゲン活性化因子阻害剤－１（PAI-1）またはそのバリアントである。より好ましくは、ＰＡＩ－１は、配列番号４に示されるアミノ酸配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。代替として、ＰＡＩ－１配列は、改変されていない（すなわち野生型）ＰＡＩ－１の配列を含んでいてもよく、それからなっていてもよく、またはそれから本質的になっていてもよく、野生型配列は、配列番号４の配列からなり、１９７および３５５位における残基は、それぞれグルタミンおよびグリシンである。

一実施形態において、ベクターまたは構築物は、配列番号５に示される核酸配列、または配列番号５に記載の配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む。

別の態様において、本発明は、本明細書に記載される発明のベクターまたは構築物を含む宿主細胞を提供する。

別の態様において、本発明は、本明細書に記載される発明の方法によって生産された、単離された、精製された、実質的に精製された、または組換えプラスミノゲンを提供する。プラスミノゲンは、本明細書に記載されるもののいずれか１つであってもよく、例えば、配列番号２、７、９、１１、１３、１５、１６、１７、１８、１９または２０のいずれか１つに記載のアミノ酸配列、または配列番号２、７、９、１１、１３、１５、１６、１７、１８、１９または２０のいずれかに記載のアミノ酸配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一な配列を含んでもよく、それからなっていてもよく、またはそれから本質的になっていてもよい。好ましくは、プラスミノゲンは、本明細書に記載されるいずれかのシグナル配列を含むシグナル配列を含有しない。

別の態様において、本発明は、本明細書に記載される発明の方法からの培養培地から単離された、精製された、または実質的に精製された、プラスミノゲンおよびプラスミノゲン活性化因子阻害剤、好ましくはＰＡＩ－１またはそのバリアントを含む組成物を提供する。

さらなる態様において、本発明は、本明細書に記載される発明の方法によって生産されるプラスミノゲンから誘導された、またはそれから得られた、単離された、精製された、実質的に精製された、または組換えプラスミンを提供する。

依然としてさらには、本発明は、個体における状態を処置する方法における、単離された、精製された、実質的に精製された、または組換えプラスミノゲンの使用（またはそれから誘導されたプラスミン）であって、状態は、外因性プラスミノゲン（またはプラスミン）の投与を必要とする、使用を提供する。

本明細書で使用される場合、文脈上そうではないことを要する場合を除き、用語「含む（comprise）」およびこの用語の変化形、例えば「含むこと」、「含む（comprises）」および「含んでいた」は、さらなる添加剤、成分、整数または工程を排除することを意図しない。

前の段落に記載される本発明のさらなる態様および態様のさらなる実施形態は、一例として提供された、さらに添付の図面を参照した以下の説明から明らかになるであろう。

アフィニティーカラムから溶出させたタンパク質画分のクーマシー染色された１０％ＳＤＳ－ＰＡＧＥを示す図である。約１００ｋＤａにおけるタンパク質バンドは、溶出したｒＰｌｇを表す。 ｒＰｌｇのイオン交換クロマトグラフィーを示す図である。（Ａ）高塩濃度緩衝液Ｂの勾配を使用した陰イオン交換クロマトグラフィーによるｒＰｌｇの精製（両矢印によって示される）（この場合、ｒＰｌｇは単一のピークとして溶出される）。汚染物質（「ｃ」によって示される）は、親和性によって精製されたｒＰｌｇ（図１を参照）から分離され、後で１００％緩衝液Ｂの存在下で溶出される。（Ｂ）（Ａ）で両矢印によって示されるｒＰｌｇを含有する画分を示すクーマシー染色された１０％ＳＤＳ－ＰＡＧＥ。 ｒＰｌｇのサイズ排除クロマトグラフィーを示す図である。（Ａ）Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラムで精製されたｒＰｌｇのサイズ排除プロファイル。（Ｂ）精製されたｒＰｌｇを示すクーマシー染色された１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥ。 ｔＰＡを使用したｒＰｌｇの活性化によって生成した組換えプラスミン（rPlm）を示すクーマシー染色された１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥを示す図である。還元条件下で、ｒＰｌｍは、重鎖および軽鎖（それぞれ残基Ｇｌｕ_１～Ａｒｇ_５６１およびＶａｌ_５６２～Ａｓｎ_７９１）に分離される。 ＰｌｇのｔＰＡ（５００ｎＭ）によって媒介される活性化を示す進行曲線を示す図である。プラスミン蛍光発生基質Ｈ－Ａｌａ－Ｐｈｅ－Ｌｙｓ－ＡＭＣの加水分解によって測定された、天然のＰｌｇグリコフォームＩおよびＩＩ（Plg GIおよびPlg GII）であるｒＰｌｇの活性化。 １μＭのＥＡＣＡの存在下におけるｔＰＡによるＰｌｇ活性化のミカエリス－メンテン分析を示す図である。天然のＰｌｇ ＧＩ、およびＧＩＩであるｒＰｌｇの活性化からの結果は、ｒＰｌｇが最も容易に活性化可能であることを示す（K_MおよびV_maxによって示される通り）。 天然のＰｌｇ ＧＩ、ＧＩＩおよびｒＰｌｇの回転半径を示す図である。実験は、溶液中の巨大分子の寸法を測定する小角Ｘ線散乱を使用して実行された。それぞれ２０ｍＭのＥＡＣＡの存在または非存在下における閉鎖型および開放型のコンフォメーションを記録した。閉鎖形態において、ＧＩおよびｒＰｌｇのＲ_ｇは、類似している。 ＥＡＣＡに応答するＰｌｇのコンフォメーション変化を研究するためのＳＡＸＳ滴定実験を示す図である。全体として、滴定曲線は、ＧＩ、ＧＩＩおよびｒＰｌｇ間で同等である。Ｋ_ｏｐｅｎは、Ｐｌｇの５０％が開放型のコンフォメーションであるＥＡＣＡ濃度である。 α２－ＡＰへのｒＰｌｇおよび天然のＰｌｇの結合を示す図である。Ｎｉ^２＋－ＮＴＡチップに固定されたα２－ＡＰへのＰｌｇの結合（示した通りの濃度で）を、リアルタイムで測定した。有色のラインは実験曲線を表し、点線は当てはめ曲線を表す。二状態反応モデルを使用して、天然のＰｌｇの結合に関する反応速度および親和定数を計算し（下）、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００評価ソフトウェア（Biacore AB）を使用したｒＰｌｇの結合に関する１：１のラングミュア結合モデルを計算し（上）、反応速度および親和定数を計算するのに使用した。 α２－ＡＰへのｒＰｌｍおよび天然のＰｌｍの結合を示す図である。Ｎｉ^２＋－ＮＴＡチップに固定されたα２－ＡＰへのＰｌｍの結合（示した通りの濃度で）を、リアルタイムで測定した。有色のラインは実験曲線を表し、点線は当てはめ曲線を表す。データを、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００評価ソフトウェア（Biacore AB）を使用した１：１のラングミュア結合モデルを用いてフィッティングし、反応速度および親和定数を計算するのに使用した。 ストレプトキナーゼ（SK）へのｒＰｌｇおよび天然のＰｌｇの結合。リアルタイムで測定された、Ｎｉ^２＋－ＮＴＡチップに固定されたＳＫへの組換えプラスミノゲンおよび天然のプラスミノゲンの結合。有色のラインは実験曲線を表し、点線は当てはめ曲線を表す。データを、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００評価ソフトウェア（Biacore AB）を使用した１：１のラングミュア結合モデルを用いてフィッティングし、反応速度および親和定数を計算するのに使用した。 ＳＫへのｒＰｌｍおよび天然のＰｌｍの結合を示す図である。リアルタイムで測定された、Ｎｉ^２＋－ＮＴＡチップに固定されたストレプトキナーゼへの組換えプラスミンおよび天然のプラスミンの結合。有色のラインは実験曲線を表し、点線は当てはめ曲線を表す。データを、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００評価ソフトウェア（Biacore AB）を使用した１：１のラングミュア結合モデルを用いてフィッティングし、反応速度および親和定数を計算するのに使用した。 細胞受容体（HEK293細胞）へのｒＰｌｇの結合を示す図である。ｒＰＬＧは、哺乳類細胞のＰｌｇ受容体に結合する。 Ａ．ｒＰｌｇ（Alexa Fluor 790で標識された）は骨および筋肉の傷害の部位に蓄積し、傷害後の異栄養性石灰化を低減させることを示す図である。Ａ．上のパネル：ｒＰｌｇは骨折部位に蓄積する。Ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒで標識されたフィブリンおよびｒＰｌｇをＩＰ注射した。画像は、骨折部位におけるフィブリンおよびｒＰｌｇの蓄積を示す。下のパネル：ｒＰｌｇは、筋肉傷害部位に蓄積する。心臓毒を右脚に注射して筋肉傷害を誘発させ、ｒＰｌｇを１ｍｇ／日でＩＰ投与した。画像は、傷害を受けた脚および腎臓におけるｒＰｌｇの蓄積を示すが、傷害を受けていないものでは蓄積していなかった。 Ｂ．上のパネル：筋肉傷害部位におけるｒＰｌｇ蓄積。心臓毒を脚に注射して筋肉傷害を誘発させる。Ａｌｅｘ Ｆｌｕｏｒ色素で標識されたｒＰｌｇを１ｍｇ／日でＩＰ注射し、傷害後１～７日目に画像を記録した。下のパネル：傷害部位におけるｒＰｌｇ蓄積が、Ｐｌｇ＋／－動物において筋肉の石灰化を防止する。心臓毒を脚に注射して筋肉傷害を誘発させる。ｒＰｌｇを１ｍｇ／日でＩＰ注射し、傷害後の７日目に画像を記録した。筋肉の石灰化は、Ｐｌｇ＋／－において明白であるがＷＴ動物ではそうではなく、α２ＡＰアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用したｒＰｌｇまたはアルファ２－抗プラスミン（α２ＡＰ）発現の阻害を使用することによって救済することができる。 α２－ＡＰを使用した共発現試験の結果を示す図である。プラスミノゲンと、ＰＡＩ－１またはα２－ＡＰのいずれかとの共発現の結果を示す代表的なＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル（Ａ）およびウェスタンブロット（Ｂ）。レーン１～３：Ｐｌｇ／ＰＡＩ－１、１、３および５日目；レーン４～６：Ｐｌｇ／α２－ＡＰ、１、３および５日目。 ＰＡＩ－２およびＰＡＩ－３を使用した共発現試験の結果を示す図である。Ａ．プラスミノゲンとＰＡＩ－１、ＰＡＩ－２またはＰＡＩ－３との共発現の結果を示す代表的なウェスタンブロット。レーン１～３：Ｐｌｇ／ＰＡＩ－１_{ｓｔａｂｌｅ}、１、３および５日目。レーン４～６：Ｐｌｇ／ＰＡＩ－１、１、３および５日目；レーン７～９：Ｐｌｇ／ＰＡＩ－２、１、３および５日目；およびレーン１０～１２：Ｐｌｇ／ＰＡＩ－３、１、３および５日目。ＢおよびＣ．ＰＡＩ－１、ＰＡＩ－２またはＰＡＩ－３と共に発現される場合に得られる回収可能な組換えプラスミノゲンのプラスミノゲン活性（RFU/秒）。１６Ｂにおいて、ＲＦＵがほとんどないラインは、Ｐｌｇ＋ＰＡＩ－２およびＰｌｇ＋ＰＡＩ－３であり、それに対して有意なＲＦＵを表示する曲線は、Ｐｌｇ＋ＰＡＩ－１_{ｓｔａｂｌｅ}およびＰｌｇ＋ＰＡＩ－１であることに留意されたい。

本明細書に開示および定義された発明は、本文または図面で言及されるかまたはそれから明白な個々の特色の２またはそれより多くの全ての代替の組合せに及ぶことが理解されるであろう。これらの異なる組合せの全ては、本発明の様々な代替の態様を構成する。

以下、本発明の特定の実施形態について詳細に述べる。本発明を実施形態と併せて記載することとするが、その意図は、本発明をそれらに実施形態に限定するものではないことが理解されるであろう。それとは逆に、本発明は、特許請求の範囲で定義される本発明の範囲内に含まれ得る全ての代替物、改変、および均等物をカバーすることが意図される。

当業者は、本発明の実施で使用可能な本明細書に記載されたものに類似した、または同等な多くの方法および材料を認識しているであろう。本発明は、記載された方法および材料に限定されることは決してない。本明細書に開示および定義された発明は、本文または図面で言及されるかまたはそれから明白な個々の特色の２またはそれより多くの全ての代替の組合せに及ぶことが理解されるであろう。これらの異なる組合せの全ては、本発明の様々な代替の態様を構成する。

本明細書で言及された特許および公報の全ては、参照によりそれら全体が本明細書に組み入れられる。

この明細書を解釈する目的のために、使用される単数形の用語は複数形も含むこととし、逆もまた同様である。

組換え発現系での大量のタンパク質の発現は、臨床用途における使用のためのタンパク質を得るための便利な方法である。しかしながら、様々な発現系で無傷のプラスミノゲンをうまく生産することには、著しい困難があった。その原因は、哺乳類細胞における細胞内プラスミノゲン活性化因子（これは、プラスミノゲンを分解するかまたは細胞中で毒性を引き起こす）の偏在的な存在にあるとされてきた。非哺乳類系における発現も調査されているが、これは、細菌系で発現されると封入体を形成すること、および細菌および非哺乳類の真核生物系における適切なタンパク質フォールディングおよびグリコシル化に関する限定を考慮して、臨床の場面での適用を限定してきた。臨床の場面での使用に必要な純度および活性を有する十分な量のプラスミノゲンを得ることにおける生来の困難さの結果として、今日の臨床の場面での使用のために生産されるほとんどのプラスミノゲンは、ヒト血漿の分画から得られる。

本発明者らは、組換え系でプラスミノゲンを生産するための新しいアプローチを開発した。驚くべきことに、本発明者らは、著しい量の組換えプラスミノゲンを生産するための哺乳類発現系を利用することを可能にした。さらに、本発明者らは、生産された組換えタンパク質が生物学的に活性であり、実際に、血漿から精製されたプラスミノゲンの商業的に入手可能な調製物と比較して優れた効能を有することを実証した。

加えて、本発明者らにより開発された方法は取り扱いが簡単であり、それによる組換えプラスミノゲンは、病原体である汚染物質を含まず、簡単な３工程プロセスで精製することができる。したがって、本発明者らは、機能的で純粋なプラスミノゲンを臨床の場面での使用に十分な量で得るためのロバストで単純な方法を開発した。

本発明者らは、驚くべきことに、プラスミノゲンとプラスミノゲン活性化因子阻害剤（PAI-1）との共発現は、大量の全長の機能的なプラスミノゲンを哺乳類細胞において組換え生産することを可能にすることを見出した。本発明者らにより達成された収量は、プラスミン／線維素溶解経路の他の成分の共発現を含む、プラスミノゲンの組換え発現に関する先行技術の方法を超える著しい改善をもたらす。

プラスミノゲン
プラスミノゲンは、プラスミンの不活性な前駆体型であり、哺乳動物において主要な線維素溶解酵素である。プラスミンはまた、細胞移動、組織リモデリング、および細菌の浸潤においても重要な役割を果たす。プラスミンは、トリプシンより高い選択性でＬｙｓ－ＸａａおよびＡｒｇ－Ｘａａ結合を優先的に切断するセリン（seine）プロテアーゼである。プラスミノゲン活性化因子、例えば組織プラスミノゲン活性化因子（tPA）またはウロキナーゼは、ヒトプラスミノゲン分子をＡｒｇ_５６０－Ｖａｌ_５６１結合で切断して、活性なプラスミンを生産する。その結果得られたプラスミンの２つの鎖は、２つの鎖間ジスルフィド架橋によって一緒に保持される。軽鎖（２５ｋＤａ）は、触媒中心（これは、触媒三残基を含む）を有し、トリプシンおよび他のセリンプロテアーゼとの配列類似性を有する。重鎖（６０ｋＤａ）は、クリングルと呼ばれる５つの高度に類似したトリプルループ構造からなる。クリングルの一部は、フィブリンとのプラスミノゲン／プラスミン相互作用を媒介するリシン結合部位を含有する。プラスミンは、ペプチダーゼファミリーＳｉに属する。

ヒトＧｌｕ－Ｐｌｇのアミノ酸配列は、配列番号２に提供される（配列番号６も参照）。配列番号１６は、「成熟」アミノ酸配列、すなわちシグナルペプチドの切断後のアミノ酸配列を示す。

本発明は、ヒトおよび非ヒト源からのプラスミノゲンの組換え生産を含むことが理解されるであろう。したがって、本発明の方法に従って生産されたプラスミノゲンは、あらゆる哺乳類プラスミノゲンまたはプラスミノゲンバリアントのアミノ酸配列を含んでいてもよく、またはそれからなっていてもよい。いずれかの実施形態において、プラスミノゲンは、ヒトプラスミノゲン、非ヒト霊長類プラスミノゲン、ブタ、マウス、ラット、ハムスター、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ウシ、ネコ、イヌ、または他の哺乳類プラスミノゲンである。好ましくは、プラスミノゲンは、ヒトプラスミノゲンである。

さらに、本発明は、それに限定されないが、本明細書にさらに記載されるものなどのプラスミノゲンの機能的なバリアントの発現を含む。より具体的には、本発明は、Ｇｌｕ－プラスミノゲン（Glu-Plg）、Ｌｙｓ－プラスミノゲン（Lys-Plg）、およびミニ、ミディおよびマイクロプラスミノゲンの組換え生産のための方法を企図する。

Ｌｙｓ－プラスミノゲンは、プラスミンによるＧｌｕ－プラスミノゲンの切断から形成されるＧｌｕ－ＰｌｇのＮ短縮形態である。Ｌｙｓ－プラスミノゲンは、Ｇｌｕ－Ｐｌｇと比較してフィブリンにより高い親和性を呈示し、ｕＰＡおよびｔＰＡによってよりよく活性化される。

ヒトＬｙｓ－プラスミノゲンのアミノ酸配列は、配列番号９に提供される。配列番号１７は、「成熟」アミノ酸配列、すなわちシグナルペプチドの切断後のアミノ酸配列を示す。

ミディプラスミノゲンは、クリングル領域４および５ならびにプラスミノゲンの軽鎖（セリンプロテアーゼドメイン）を含む。これは、Ｇｌｕ－プラスミノゲンからのクリングル領域１～３の切断によって形成される。

ヒトミディプラスミノゲンのアミノ酸配列は、配列番号１１に提供される。
配列番号１８は、「成熟」アミノ酸配列、すなわちシグナルペプチドの切断後のアミノ酸配列を示す。

ミニプラスミノゲン（４４２Ｖａｌ－Ｐｌｇまたはネオプラスミノゲンとしても公知）は、残基４４２（クリングル領域４内に配置された）におけるＧｌｕ－プラスミノゲンへのエラスターゼの作用によって生じる。したがってミニプラスミノゲンは、クリングル領域４、クリングル領域５およびプラスミノゲンのセリンプロテアーゼドメインの一部を含む。ヒトミニプラスミノゲンのアミノ酸配列は、配列番号１３に提供される。配列番号１９は、「成熟」アミノ酸配列、すなわちシグナルペプチドの切断後のアミノ酸配列を示す。

マイクロプラスミノゲンは、ペプチドとそのＮ末端に付着したクリングル５の数残基とを接続するストレッチを有するプラスミノゲンのプロ酵素ドメインからなる。これは、プラスミノゲンへのプラスミンの作用によって生産される。したがって、マイクロプラスミノゲン（plasmingogen）（またはマイクロPlg）は、プラスミノゲン（セリンプロテアーゼドメイン）の軽鎖を含み、クリングル領域を含まない。（例えば、Shi et al. (1980) J Biol. Chem.263:17071-5を参照されたい）。プラスミノゲンのように、マイクロプラスミノゲンは、ｔＰＡおよびウロキナーゼによって活性化されて、タンパク質分解活性を有する分子を形成する。ヒトマイクロプラスミンは、およそ２９ｋＤａの分子量を有し、プラスミンと比較してより低いフィブリンへの親和性を有する。

ヒトマイクロプラスミノゲンのアミノ酸配列は、配列番号１５に提供される。配列番号２０は、「成熟」アミノ酸配列、すなわちシグナルペプチドの切断後のアミノ酸配列を示す。

他のバリアント：ｅｇ：クリングル領域に見出されるリシン結合部位に改変または突然変異を含むプラスミノゲンのバリアント。本発明の方法それ自体が、多数のプラスミノゲンバリアントのいずれか、これに限定されないが、１つまたは複数の部位に改変を有する組換えプラスミノゲンなどの発現をもたらすことが理解されるであろう。

ＰＡＩ－１
プラスミノゲン活性化因子阻害剤－１（PAI-1）はまた、内皮プラスミノゲン活性化因子阻害剤またはセルピンＥ１としても公知であり、これは、ヒトではＳＥＲＰＩＮＥ１遺伝子によってコードされるタンパク質である。ＰＡＩ－１は、プラスミノゲンの活性化剤である組織プラスミノゲン活性化因子（tPA）およびウロキナーゼ（uPA）の主要な阻害剤として機能するセリンプロテアーゼ阻害剤（セルピン）である。したがってＰＡＩ－１は、インビボにおいて、線維素溶解の１つのまたは主要な阻害剤である。

他のプラスミノゲン活性化因子阻害剤としては、プラスミノゲン活性化因子阻害剤－２（PAI-2）、プロテインＣ阻害剤（PAI-3）およびプロテアーゼネキシン－１（SERPINE2）が挙げられ、これは、ｔＰＡおよびウロキナーゼの阻害剤として作用する。しかしながら、本発明者らは、本発明の方法が、ＰＡＩ－１またはそのバリアントがプラスミノゲンと共発現される場合に特に有用であることを見出した。

システイン残基を導入するようにＱ１９７およびＧ３５５で配列が改変されているヒトＰＡＩ－１のアミノ酸配列は、配列番号４に提供される。

ＰＡＩ－２およびＰＡＩ－３の例示的な核酸およびアミノ酸配列は、それぞれＮＣＢＩ受託番号ＮＭ＿００２５７５．３およびＮＭ＿０００６２４．６に提供される。

本発明はまた、「野生型」ＰＡＩ－１（すなわち、配列番号４で示されるように残基１９７またはＧ３５５において配列は改変されていない）の使用も企図することが理解されるであろう。

突然変異ポリペプチドまたは突然変異ポリヌクレオチドに関する用語「突然変異体」は、本明細書で使用される場合、「バリアント」と同義的に使用される。所与の参照配列に関するバリアントは、天然に存在する対立遺伝子バリアントを含んでいてもよい。「バリアント」は、野生型と比べて少なくとも１つのアミノ酸突然変異を含むあらゆるタンパク質またはアミノ酸配列を含む。突然変異としては、置換、挿入、および欠失を挙げることができる。好ましくは、バリアントは、野生型と同等かまたは野生型の少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９６％、０４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８５％、または８０％のレベルまでのプラスミノゲン活性化因子を阻害する能力を保持する。例えばＰＡＩ－１バリアントは、野生型ＰＡＩ－１の少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９６％、０４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８５％、または８０％のレベルまでのプラスミノゲン活性化因子を阻害する能力を保持する。野生型ＰＡＩ－１は、配列番号４を含む本明細書に記載されるもののいずれかであり得る。一実施形態において、ＰＡＩ－１のバリアントは、ＰＡＩ－２またはＰＡＩ－３ではない。好ましくは、ＰＡＩ－１バリアントは、ｔＰＡおよび／またはｕＰＡを阻害することにおいて、ＰＡＩ－２、ＰＡＩ－３、またはＰＡＩ－２およびＰＡＩ－３と比較してより大きい効力を有する。

核酸
「単離された」核酸分子は、自然源中に通常付随する少なくとも１種の汚染核酸分子から同定および分離された核酸分子である。単離された核酸分子は、それが天然に見出される形態または場面以外で存在する。それゆえに単離された核酸分子は、それが天然細胞中に存在している状態の核酸分子と区別される。しかしながら、単離された核酸分子は、例えば、核酸分子が天然細胞のものと異なる染色体の配置にある場合、通常例えばプラスミノゲンを発現する細胞に含有される核酸分子を含む。

用語「核酸分子」および「ポリヌクレオチド」は、本明細書において同義的に使用され、あらゆる長さを有するヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドのいずれか、またはそれらのアナログのポリマー形態を指す。ポリヌクレオチドの非限定的な例としては、遺伝子、遺伝子断片、メッセンジャーＲＮＡ（mRNA）、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、あらゆる配列の単離されたＤＮＡ、あらゆる配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマーが挙げられる。本発明のポリヌクレオチドは、単離または精製された形態で提供されてもよい。選択されたポリペプチドを「コードする」核酸配列は、適切な調節配列の制御下に置かれた場合、インビボで転写される（DNAの場合）およびポリペプチドに翻訳される（mRNAの場合）核酸分子である。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端における開始コドンおよび３’（カルボキシ）末端における翻訳停止コドンによって決定される。本発明の目的のために、このような核酸配列としては、これらに限定されないが、ウイルス、原核または真核生物のｍＲＮＡからのｃＤＮＡ、ウイルスまたは原核生物のＤＮＡまたはＲＮＡからのゲノム配列を挙げることができ、さらに、合成ＤＮＡ配列も挙げられる。転写終結配列は、コード配列に対して３’に配置されていてもよい。

本発明のポリヌクレオチドは、当業界において周知の方法に従って、一例としてＳａｍｂｒｏｏｋら（1989, Molecular Cloning-a laboratory manual; Cold Spring Harbor Press）に記載されるように合成することができる。

本発明のポリヌクレオチド分子は、挿入された配列に作動可能に連結した制御配列を含み、それにより標的化された対象においてインビボで本発明のポリペプチドの発現を可能にする発現カセットの形態で提供されてもよい。これらの発現カセットは順に、典型的には、核酸免疫化のための試薬として使用するのに好適なベクター（例えば、プラスミドまたは組換えウイルスベクター）内に提供される。このような発現カセットは、宿主対象に直接投与してもよい。代替として、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターを宿主対象に投与してもよい。好ましくは、ポリヌクレオチドは、遺伝学的なベクターを使用して調製および／または投与される。好適なベクターは、十分な量の遺伝情報を搭載することが可能であり、本発明のポリペプチドの発現を可能にするあらゆるベクターであり得る。

したがって本発明は、このようなポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを含む。

さらに、本発明の組成物および生成物は、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの混合物を含み得ることが理解されるであろう。したがって、本発明は、ポリペプチドのいずれか１つの代わりに、前記ポリペプチドを発現することが可能なポリヌクレオチドが存在する、本明細書で定義した通りの組成物または生成物を提供する。

発現ベクターは、分子生物学分野において慣例的に構築され、例えば、プラスミドＤＮＡおよび適切な開始剤、プロモーター、エンハンサー、ならびに必要な可能性がある、および本発明のペプチドを発現させるために正しい方向で位置する他のエレメント、例えばポリアデニル化シグナルなどの使用を含んでいてもよい。他の好適なベクターは、当業者には明らかであろう。

したがって、本発明の方法は、このようなベクターを細胞に送達する工程、およびベクターからの転写を起こさせる工程を含む。好ましくは、ベクター中の本発明における使用のためのポリヌクレオチドは、宿主細胞によるコード配列の発現をもたらすことが可能な制御配列に作動可能に連結されており、すなわちベクターは、発現ベクターである。

「作動可能に連結した」は、そのように記載された構成要素がそれらの通常の機能を発揮するように設計されているエレメントの配置を指す。したがって、核酸配列に作動可能に連結した所与の調節配列、例えばプロモーターは、適した酵素が存在する場合、その配列を発現させることが可能である。プロモーターは、配列の発現を指示するようにプロモーターが機能する限りは、必ずしも配列と連続していなくてもよい。したがって、プロモーター配列と核酸配列との間に、例えば介在する非翻訳の、ただし転写される配列が存在していてもよく、プロモーター配列は、それでもなおコード配列に「作動可能に連結した」とみなすことができる。

当業界において様々な発現系が説明されており、これらのそれぞれは、典型的には、発現制御配列に作動可能に連結した目的の遺伝子またはヌクレオチド配列を含有するベクターからなる。これらの制御配列としては、転写プロモーター配列ならびに転写開始および終結配列が挙げられる。本発明のベクターは、例えば、プラスミド、ウイルスまたはファージベクターであってもよく、これらは、複製起点、任意選択で前記ポリヌクレオチドの発現のためのプロモーター、および任意選択でプロモーターのレギュレーターと共に提供される。「プラスミド」は、染色体外遺伝学的エレメントの形態のベクターである。ベクターは、細菌プラスミドまたは真菌ベクターのための耐性遺伝子の場合、１つまたは複数の選択可能マーカー遺伝子、例えばアンピシリン耐性遺伝子を含有していてもよい。ベクターは、インビトロで、例えばＤＮＡまたはＲＮＡの生産のために使用してもよく、または宿主細胞、例えば哺乳類宿主細胞をトランスフェクトまたは形質転換するために使用してもよい。ベクターはまた、例えばインビボにおけるポリペプチドの発現を可能にするために、インビボで使用するために適合させることができる。

「プロモーター」は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの転写を開始および制御するヌクレオチド配列である。プロモーターとしては、誘導性プロモーター（プロモーターに作動可能に連結したポリヌクレオチド配列の発現が、分析物、補因子、調節タンパク質などによって誘導される場合）、抑制性プロモーター（プロモーターに作動可能に連結したポリヌクレオチド配列の発現が、分析物、補因子、調節タンパク質などによって抑制される場合）、および構成的プロモーターを挙げることができる。用語「プロモーター」または「制御エレメント」は、全長プロモーター領域およびこれらの領域の機能的な（例えば、転写または翻訳を制御する）セグメントを含むことが意図される。

本明細書で使用される場合、用語「プロモーター」は、その最も広い意味で解釈されるものとし、正確な転写開始に必要なＴＡＴＡボックスまたは開始エレメントを含むゲノム遺伝子の転写調節配列を含み、これらは、例えば発生および／または外来の刺激に応答して、または組織特異的な方式で核酸の発現を変更する追加の調節エレメント（例えば、上流活性化配列、転写因子結合部位、エンハンサーおよびサイレンサー）を有していてもよく、または有していなくてもよい。本発明の状況において、用語「プロモーター」はまた、それが作動可能に連結している核酸を付与する、その発現を活性化または強化する、組換え、合成もしくは融合核酸、または誘導体を記載するためにも使用される。例示的なプロモーターは、発現をさらに強化するため、および／または前記核酸の空間的な発現および／または一時的な発現を変更するために、１つまたは複数の特定の調節エレメントの追加のコピーを含有していてもよい。

哺乳類細胞において活性な例示的なプロモーターとしては、サイトメガロウイルス前初期プロモーター（CMV-IE）、ヒト伸長因子１－αプロモーター（EF1）、核内低分子ＲＮＡプロモーター（U1aおよびU1b）、α－ミオシン重鎖プロモーター、シミアンウイルス４０プロモーター（SV40）、ラウス肉腫ウイルスプロモーター（RSV）、アデノウイルス主要後期プロモーター、β－アクチンプロモーター；ＣＭＶエンハンサー／β－アクチンプロモーターもしくは免疫グロブリンプロモーターを含むハイブリッド調節エレメント、またはそれらの活性な断片が挙げられる。有用な哺乳類宿主細胞株の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（COS-7、ATCC CRL1651）；ヒト胎児腎臓株（懸濁培養での増殖のためにサブクローニングされた２９３または２９３細胞；ベビーハムスター腎臓細胞（BHK、ATCC CCL10）；またはチャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO）である。

本発明によるポリヌクレオチド、発現カセットまたはベクターは、加えて、シグナルペプチド配列を含んでいてもよい。シグナルペプチド配列は、一般的に、プロモーターとの作動可能な連結で挿入されており、それによって、シグナルペプチドが発現され、同様にプロモーターと作動可能に連結されたコード配列によってコードされたポリペプチドの分泌が容易になる。

典型的には、シグナルペプチド配列は、１０～３０アミノ酸、例えば１５～２０アミノ酸のペプチドをコードする。しばしばアミノ酸は、主として疎水性である。典型的な状況において、シグナルペプチドは、シグナルペプチドと結合する成長中のポリペプチド鎖を発現細胞の小胞体に標的化する。シグナルペプチドは、小胞体中で切り離され、ゴルジ装置を介したポリペプチドの分泌が可能になる。したがって、本発明のペプチドは、個体内の細胞からの発現、およびその細胞からの分泌によって個体に供給することができる。

あらゆる適切な発現ベクター（例えば、Pouwels et al., Cloning Vectors: A Laboratory Manual(Elsevier, N.Y.: 1985)に記載された通り）および対応する好適な宿主が組換えポリペプチドの生産のために採用することができる。発現宿主としては、これらに限定されないが、エシェリキア属、バチルス属、シュードモナス属、サルモネラ属における細菌種、哺乳類、またはバキュロウイルス系を含む昆虫宿主細胞系（例えば、Luckow et al., Bio/Technology 6: 47 (1988)によって記載された通り）、ならびにＣＯＳ－７、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、およびＢＨＫ細胞株などの確立された細胞株などが挙げられる。当業者は、発現宿主の選択は、生産されるポリペプチドのタイプにとって波及的影響を有することを認識している。例えば、酵母または哺乳類細胞（例えば、COS-7細胞）で生産されたポリペプチドのグリコシル化は、細菌細胞、例えば大腸菌（Escherichia coli）で生産されたポリペプチドのそれとは異なると予想される。

ポリペプチド
「単離された」は、本明細書で開示される様々なポリペプチドを記載するのに使用される場合、その天然環境の成分から同定および分離された、ならびに／または回収されたポリペプチドを意味する。その天然環境の汚染物質成分は、典型的にはポリペプチドの診断または治療的使用に干渉すると予想される物質であり、その例としては、酵素、ホルモン、および他のタンパク質様または非タンパク質様溶質を挙げることができる。好ましい実施形態において、ポリペプチドは、スピニングカップシークエネーターの使用によってＮ末端または内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに十分な程度に（１）、または（２）クーマシーブルーまたは好ましくは銀染色を使用して、非還元または還元条件下でのＳＤＳ－ＰＡＧＥによって均質になるまで精製されると予想される。単離されたタンパク質は、ポリペプチドの天然環境の少なくとも１つ成分が存在しないと予想されるため、組換え細胞内のインサイチュのポリペプチドを含む。しかしながら通常は、単離されたポリペプチドは、少なくとも１つの精製工程によって調製されると予想される。

「断片」は、本明細書に記載されるアッセイを使用して決定することができる本発明のポリペプチドと実質的に類似した機能的な活性または実質的に同じ生物学的機能もしくは活性を保持する、本発明のポリペプチドの部分である。

ポリペプチド配列、すなわち本明細書において定義された本発明のポリペプチドに対する「アミノ酸配列同一性のパーセント（％）」またはそれに対して「パーセント（％）同一な」は、配列をアライメントし、必要に応じてギャップを導入して、最大のパーセント配列同一性を達成した後の、候補配列中の、本発明の特定のポリペプチドにおけるアミノ酸残基と同一なアミノ酸残基のパーセンテージと定義され、いずれの保存的置換も配列同一性の一部として考慮に入れない。

当業者は、比較される配列の全長にわたり最大のアライメントを達成するのに必要なあらゆるアルゴリズム（非限定的な例は後述する）を含む、アライメントを測定するための適切なパラメーターを決定することができる。アミノ酸配列がアライメントされる場合、所与のアミノ酸配列Ｂへの、それとの、またはそれに対する所与のアミノ酸配列Ａのアミノ酸配列同一性パーセント（これは、代替として、所与のアミノ酸配列Ｂへの、それとの、またはそれに対する特定のアミノ酸配列同一性のパーセントを有するまたは含む所与のアミノ酸配列Ａと称することもできる）は、アミノ酸配列同一性のパーセント＝Ｘ／Ｙ１００のように計算することができ、式中、Ｘは、ＡおよびＢの配列アライメントプログラムまたはアルゴリズムのアライメントによって同一な一致とスコア付けされたアミノ酸残基の数であり、Ｙは、Ｂ中のアミノ酸残基の総数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合、ＡのＢに対するアミノ酸配列同一性のパーセントは、ＢのＡに対するアミノ酸配列同一性のパーセントと等しくないということになる。

同一性パーセントを計算することにおいて、典型的には正確な一致が計数される。２つの配列間の同一性パーセントの決定は、数学アルゴリズムを使用して達成することができる。２つの配列の比較に利用される数学アルゴリズムの非限定的な例は、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３～５８７７に記載の通り改変された、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２２６４のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３のＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＸプログラムに組み込まれている。比較目的でギャップ有りアライメントを得るために、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ（BLAST 2.0における）を、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９に記載された通りに利用してもよい。代替として、ＰＳＩ－Ｂｌａｓｔを使用して、分子間の距離的な関係を検出する反復検索を実行してもよい。Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９７）上記を参照されたい。ＢＬＡＳＴ、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ、およびＰＳＩ－Ｂｌａｓｔプログラムを利用する場合、それぞれのプログラムのデフォルトパラメーター（例えば、BLASTXおよびBLASTN）を使用することができる。アライメントはまた、手動で目視により実行することもできる。配列の比較に利用される数学アルゴリズムの別の非限定的な例は、ＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズム（Higgins et al. (1994) Nucleic Acids Res.22:4673-4680）である。ＣｌｕｓｔａｌＷは、配列を比較し、アミノ酸またはＤＮＡ配列の全体をアライメントすることから、アミノ酸配列全体の配列保存に関するデータを提供することができる。ＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズムは、数々の商業的に入手可能なＤＮＡ／アミノ酸分析ソフトウェアパッケージ、例えばＶｅｃｔｏｒ ＮＴＩ Ｐｒｏｇｒａｍ ＳｕｉｔｅのＡＬＩＧＮＸモジュール（Invitrogen社、Carlsbad、CA）で使用されている。ＣｌｕｓｔａｌＷを用いたアミノ酸配列のアライメントの後、アミノ酸同一性パーセントを評価することができる。ＣｌｕｓｔａｌＷアライメントの分析に有用なソフトウェアプログラムの非限定的な例は、ＧＥＮＥＤＯＣ（商標）またはＪａｌＶｉｅｗ（http://www.jalview.org/）である。ＧＥＮＥＤＯＣ（商標）は、複数のタンパク質間のアミノ酸（またはDNA）の類似性および同一性の評価を可能にする。配列の比較に利用される数学アルゴリズムの別の非限定的な例は、ＭｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒ（１９８８）ＣＡＢＩＯＳ ４：１１～１７のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓソフトウェアパッケージ、バージョン１０（Accelrys, Inc.、9685 Scranton Rd.、San Diego、CA、USAより入手可能）の一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。アミノ酸配列を比較するためにＡＬＩＧＮプログラムを利用する場合、ＰＡＭ１２０重み残基表、１２のギャップ長ペナルティー、および４のギャップペナルティーを使用することができる。

ポリペプチドは、望ましくは、アミノ末端およびカルボキシル末端を含む。ポリペプチドは、Ｄ－アミノ酸、Ｌ－アミノ酸またはＤ－およびＬ－アミノ酸の混合物を含んでいてもよい。しかしながら、Ｄ－アミノ酸で構成されるポリペプチドは、インビボにおいてその生物学的活性をより高度に保持すると予測されるため、アミノ酸のＤ－形態が特に好ましい。

ポリペプチドは、多数の従来の技術のいずれかによって調製することができる。ポリペプチドは、天然に存在する源から、または組換え源から単離または精製することができる。組換え生産が好ましい。例えば、組換えポリペプチドの場合、望ましいペプチドをコードするＤＮＡ断片は、周知の分子遺伝学的技術を使用して適切なベクターにサブクローニングすることができる（例えば、Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed. (Cold Spring Harbor Laboratory, 1982); Sambrook et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd ed. （Cold Spring Harbor Laboratory, 1989を参照）。インビトロで、断片を転写することができ、その後ポリペプチドに翻訳することができる。商業的に入手可能なキットも採用することができる（例えば、Clontech、Palo Alto、Calif.；Amersham Pharmacia Biotech Inc.、Piscataway、N.J.； InVitrogen、Carlsbad、Calif.などによって製造されたものなど）。ポリメラーゼ連鎖反応は、任意選択で、核酸の操作で採用することができる。

用語「保存的置換」は、本明細書で使用される場合、ペプチドの天然の配列に存在するアミノ酸の、天然に存在するもしくは天然に存在しないアミノ酸または類似の立体的な特性を有するペプチドミメティクスでの置き換えを指す。置き換えようとする天然のアミノ酸の側鎖が、極性または疎水性のいずれかである場合、保存的置換は、天然に存在するアミノ酸、天然に存在しないアミノ酸となされるか、または極性もしくは疎水性でもある（置き換えられたアミノ酸の側鎖と同じ立体的な特性を有することに加えて）ペプチドミメティクス部分となされるべきである。

機能的に類似したアミノ酸を示す保存的アミノ酸置換の表は当業者周知である。以下の６つのグループは、互いに保存的置換とみなすことができるアミノ酸の例である：
１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；および
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。

天然に存在するアミノ酸は、典型的にはそれらの特性に従ってグループ分けされるため、天然に存在するアミノ酸による保存的置換は、荷電アミノ酸の空間配置的に類似した非荷電アミノ酸での置き換えは、保存的置換とみなされるということを踏まえて決定することができる。天然に存在しないアミノ酸による保存的置換を生じさせるために、当業界において周知のアミノ酸アナログ（合成アミノ酸）を使用することも可能である。天然に存在するアミノ酸のペプチドミメティクスは、当業者公知の文献で十分に立証されており、以下に非天然または天然にはないアミノ酸をさらに記載する。保存的置換に影響を及ぼす場合、置換するアミノ酸は、側鎖中に元のアミノ酸と同じまたは類似の官能基を有するべきである。

成句「非保存的置換」または「非保存的残基」は、本明細書で使用される場合、親配列中に存在するアミノ酸の、異なる電気化学的および／または立体的な特性を有する別の天然に存在するまたは天然に存在しないアミノ酸による置き換えを指す。したがって、置換するアミノ酸の側鎖は、置換される天然のアミノ酸の側鎖より著しく大きくてもよく（またはより著しく小さくてもよい）、および／または置換されるアミノ酸と著しく異なる電子特性を有する官能基を有していてもよい。このタイプの非保存的置換の例としては、アラニンの代わりにフェニルアラニンまたはシクロヘキシルメチル（cycohexylmethyl）グリシン、グリシンの代わりにイソロイシン、またはアスパラギン酸の代わりに－ＮＨ－ＣＨ［（－ＣＨ２）５－ＣＯＯＨ］－ＣＯ－での置換が挙げられる。非保存的置換としては、保存的とみなされないあらゆる突然変異が挙げられる。

非保存的アミノ酸置換は、（ａ）置換の領域におけるアミノ酸主鎖の構造；（ｂ）アミノ酸の電荷もしくは疎水性；または（ｃ）アミノ酸側鎖の嵩における変化に起因し得る。一般的にタンパク質特性において最大の変化を生じると予測される置換は、（ａ）親水性残基が、疎水性残基の代わりに置換されるもの（またはその逆）；（ｂ）プロリンが、他の任意の残基の代わりに置換されるもの（またはその逆）；（ｃ）嵩高な側鎖を有する残基、例えばフェニルアラニンが、側鎖を有さない残基、例えばグリシンの代わりに置換されるもの（またはその逆）；または（ｄ）正の電荷を有する側鎖、例えば、リシル、アルギニル、またはヒスチジル（histadyl）を有する残基が、負の電荷を有する残基、例えばグルタミルまたはアスパルチルの代わりに置換されるもの（またはその逆）である。

突然変異ポリペプチドを生じさせるための、例えば挿入、欠失および／または置換による天然のアミノ酸配列の変更は、当業者公知の様々な手段によってなされ得る。例えば、部位特異的突然変異は、発現ベクターに改変された部位を含む合成されたオリゴヌクレオチドをライゲートすることによって導入することができる。代替として（Alternately）、オリゴヌクレオチド指向性の部位特異的突然変異誘発の手順、例えばＷａｌｄｅｒら、Ｇｅｎｅ ４２：１３３（１９８６）；Ｂａｕｅｒら、Ｇｅｎｅ ３７：７３（１９８５）；Ｃｒａｉｋ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１２～１９（１９９５年１月）；ならびに米国特許第４，５１８，５８４号および４，７３７，４６２号に開示されたものを使用してもよい。突然変異を導入するための好ましい手段は、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ部位特異的変異誘発キット（Stratagene、LaJolla、Calif.）である。

用語「Ｎ末端」および「Ｃ末端」は、本明細書において、それらが適用されるあらゆるアミノ酸配列またはポリペプチドドメインまたは構造の相対的な位置を明示するのに使用される。相対的な位置決めは、文脈から明らかであろう。すなわち、「Ｎ末端」の特色は少なくとも、同じ文脈で論じられる別の特色（第１の特色に対して「Ｃ末端」と言及することができる他の特色）よりも、ポリペプチド分子のＮ末端に近くに配置されることとなる。同様に、用語「５’－」および「３’－」は、ポリヌクレオチドの特色の相対的な位置を明示するのに本明細書において使用することができる。

本発明の方法に従って作製された組換えポリペプチドはまた、ポリペプチドの精製を容易にするために、または当業界において公知の方法を使用したイムノアッセイでの使用のために、別の部分によって修飾され、それとコンジュゲートまたは融合していてもよい。例えば、本発明のポリペプチドは、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、公知の保護／ブロッキング基による誘導体化、タンパク質分解による切断などによって修飾されていてもよい。

本明細書において企図される修飾としては、これらに限定されないが、側鎖への修飾、ポリペプチド合成中の天然にはないアミノ酸および／またはその誘導体の取り込み、ならびに本発明のポリペプチドにコンフォメーション上の拘束を課す架橋剤および他の方法の使用が挙げられる。二量体を形成する分子の能力を低減させる翻訳後修飾を含むあらゆる修飾が本明細書において企図される。その例としては、当業界で公知のようにクリックケミストリーによって取り込まれた修飾が挙げられる。例示的な修飾としては、グリコシル化が挙げられる。

本発明によって企図される側鎖修飾の例としては、アミノ基の修飾、例えば、アルデヒドとの反応とそれに続くＮａＢＨ_４での還元による還元アルキル化；メチルアセトイミデート（methylacetimidate）でのアミジン化（amidination）；無水酢酸でのアシル化；シアネートでのアミノ基のカルバモイル化；２，４，６－トリニトロベンゼンスルホン酸（TNBS）でのアミノ基のトリニトロベンジル化；無水コハク酸およびテトラヒドロフタル酸無水物でのアミノ基のアシル化；およびピリドキサール－５－リン酸でのリシンのピリドキシル化とそれに続くＮａＢＨ_４での還元によるアミノ基の修飾が挙げられる。

アルギニン残基のグアニジン基は、２，３－ブタンジオン、フェニルグリオキサールおよびグリオキサールなどの試薬を用いた複素環式の縮合生成物の形成によって修飾されていてもよい。

カルボキシル基は、Ｏ－アシルイソ尿素形成を介したカルボジイミドの活性化とそれに続く例えば対応するアミドへの誘導体化によって修飾されていてもよい。

スルフヒドリル（sulphydryl）基は、ヨード酢酸またはヨードアセトアミドでのカルボキシメチル化；過ギ酸のシステイン酸への酸化；他のチオール化合物での混成のジスルフィドの形成；マレイミド、無水マレイン酸または他の置換マレイミドとの反応；４－クロロ水銀安息香酸塩、４－クロロ水銀フェニルスルホン酸、フェニル水銀塩化物、２－クロロ水銀－４－ニトロフェノールおよび他の水銀剤を使用した水銀誘導体の形成；アルカリ性ｐＨにおけるシアネートでのカルバモイル化などの方法によって修飾されていてもよい。

トリプトファン残基は、例えば、Ｎ－ブロモスクシンイミドでの酸化、または２－ヒドロキシ－５－ニトロ臭化ベンジルもしくはスルフェニルハロゲン化物でのインドール環のアルキル化によって修飾されていてもよい。一方でチロシン残基は、３－ニトロチロシン誘導体を形成するためのテトラニトロメタンでのニトロ化によって変更されてもよい。

ヒスチジン残基のイミダゾール環の修飾は、ヨード酢酸誘導体でのアルキル化またはピロ炭酸ジエチルでのＮ－カルボエトキシ化によって達成されてもよい。

タンパク質合成中に天然にはないアミノ酸および誘導体を取り込むことの例としては、これらに限定されないが、ノルロイシン、４－アミノ酪酸、４－アミノ－３－ヒドロキシ－５－フェニルペンタン酸、６－アミノヘキサン酸、ｔ－ブチルグリシン、ノルバリン、フェニルグリシン、オルニチン、サルコシン、４－アミノ－３－ヒドロキシ－６－メチルヘプタン酸、２－チエニルアラニンおよび／またはアミノ酸のＤ－異性体の使用が挙げられる。表１に、本明細書において企図される天然にはないアミノ酸の一覧を示す。

架橋剤は、例えば、ホモ二官能性架橋剤、例えば（ＣＨ_２）_ｎスペーサー基（式中、ｎ＝１～ｎ＝６である）を有する二官能性イミドエステル、グルタルアルデヒド、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、および通常、アミノ反応性部分、例えばＮ－ヒドロキシスクシンイミドおよび別の基特異的な反応性部分を含有するヘテロ二官能性試薬を使用して、３Ｄコンフォメーションを安定化するのに使用することができる。

本明細書において「天然のヒトプラスミノゲンのクリングル領域に相同な」Ｎ末端ドメインを有するとして言及されるポリペプチドは、プラスミノゲンの天然のクリングル領域に類似した構造的および機能的な特徴を呈示する。さらに、本明細書において「クリングル１に相同な」Ｎ末端ドメインを有するとして言及されるポリペプチドは、少なくともポリペプチドがクリングル５よりｏ－アミノカルボン酸（および機能的なホモログ、例えばトランス－４－アミノメチルシクロヘキサン－１５カルボン酸、環状の酸）により高い親和性を有し得る程度に、天然のクリングル１に類似した特徴を呈示する。単離されたクリングル領域ポリペプチドの、アミノペンタン酸（5-APnA）；イプシロン－アミノカプロン酸（aminocaprioic acid）（EACA）としても公知の６－アミノヘキサン酸（6-AHxA）；７－アミノヘプタン酸（7-AHpA）；およびトランス－４アミノメチルシクロヘキサン－１－カルボン酸（t-AMCHA）への結合を比較するための条件およびプロトコールについては、例えば、参照により本明細書に組み入れられるＣｈａｎｇ，Ｙ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３７：３２５８～３２７１（１９９８）を参照されたい。「クリングル４に相同な」クリングル領域への言及は、成句「クリングル１に相同な」に関して上述した通りに同様に定義される。すなわちそれらは、上記で論じられたように天然のヒトプラスミノゲンのクリングル４に類似した機能的な特徴を呈示する。これらのポリペプチドはまた、上述したように固定されたリシンとも結合する。

本発明の方法に従って作製されたポリペプチドは、固定されたリシンと結合する。成句「固定されたリシンと結合する」は、本明細書で使用される場合、クロマトグラフ媒体としてリシン－セファロースを使用してカラムクロマトグラフィーに供される場合、そのように特徴付けられたポリペプチドは、リシンと結合していないタンパク質と比べてその進行が遅いことを意味する。典型的には、本発明のポリペプチドは、このようなクロマトグラフ媒体（リシン親和性樹脂）から、溶離液として、特異的なリガンド、例えばＥＡＣＡを含有する溶液を使用して溶出させることができる。

細胞培養
当業者は、宿主細胞、例えば哺乳類細胞を核酸ベクターでトランスフェクトすること、およびベクターによってコードされた遺伝子を発現するのに好適な条件下で宿主細胞を培養することに関する標準的な方法について精通しているであろう。哺乳類細胞をトランスフェクションおよび培養して組換えタンパク質を生産するための代表的な方法は、例えばＡｕｓｕｂｅｌら（編集者）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８、現在までの全てのアップデートを含む）、またはＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）に記載される。

単離された核酸、ベクターまたはそれを含む発現構築物を発現のために細胞に導入するための手段は当業者公知である。所与の細胞に使用される技術は、公知の成功した技術に依存する。細胞に組換えＤＮＡを導入するための手段としては、なかでも、マイクロインジェクション、ＤＥＡＥ－デキストランによって媒介されるトランスフェクション、例えばリポフェクトアミン（Gibco、MD、USA）および／またはセルフェクチン（cellfectin）（Gibco、MD、USA）を使用することによるリポソームによって媒介されるトランスフェクション、ＰＥＧによって媒介されるＤＮＡ取り込み、エレクトロポレーション、および例えばＤＮＡでコーティングされたタングステンまたは金粒子（Agracetus Inc.、WI、USA）を使用することによるマイクロパーティクル衝撃が挙げられる。

本発明に従って使用される宿主細胞は、使用される細胞型に応じて様々な培地で培養することができる。商業的に入手可能な培地、例えばＨａｍ’ｓ Ｆ１０（Sigma）、最小必須培地（（MEM）、（Sigma）、RPMl-1640（Sigma）、およびダルベッコ改変イーグル培地（（DMEM）、Sigma）は、哺乳類細胞を培養するのに好適である。本明細書で論じられる他の細胞型を培養するための培地は、当業界において公知である。

さらに、当業者は、サイズ排除およびアフィニティークロマトグラフィー方法、ならびにそれらの組合せを使用することなどの、細胞培養培地から発現された組換えタンパク質を精製するための方法について精通しているであろう。

タンパク質が培養培地に分泌されたら、このような発現系からの上清はまず、商業的に入手可能なタンパク質濃縮フィルター、例えば、ＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外ろ過ユニットを使用して濃縮してもよい。タンパク質分解を阻害するために、プロテアーゼ阻害剤、例えばＰＭＳＦが前述の工程のいずれかに含まれていてもよく、外因性の汚染物質の増殖を防止するために、抗生物質が含まれていてもよい。代替として、または加えて、上清は、例えば連続的な遠心分離を使用して、タンパク質を発現する細胞からろ過および／または分離してもよい。

細胞から調製されたタンパク質は、例えば、イオン交換、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、アフィニティークロマトグラフィー（例えば、リシンアフィニティーカラム）、または前述のもののあらゆる組合せを使用して精製することができる。これらの方法は当業界において公知であり、例えば、ＷＯ９９／５７１３４またはＥｄ ＨａｒｌｏｗおよびＤａｖｉｄ Ｌａｎｅ（編集者）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、（１９８８）に説明されている。

当業者はまた、精製または検出を容易にするためのタグ、例えば、ポリヒスチジンタグ、例えば、ヘキサヒスチジンタグ、またはインフルエンザウイルスヘマグルチニン（HA）タグ、またはシミアンウイルス５（V5）タグ、またはＦＬＡＧタグ、またはグルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（GST）タグを含むようにタンパク質を改変できることも認識しているであろう。得られたタンパク質は次いで、当業界において公知の方法、例えば親和性精製を使用して精製される。例えば、ヘキサｈｉｓタグを含むタンパク質は、タンパク質を含むサンプルを、固体または半固体支持体に固定されたヘキサｈｉｓタグと特異的に結合するニッケル－ニトリロ三酢酸（Ni-NTA）と接触させること、サンプルを洗浄して未結合のタンパク質を除去すること、およびその後、結合したタンパク質を溶出させることによって精製される。代替として、または加えて、タグに結合するリガンドまたは抗体は、親和性精製方法において使用される。

組換えプラスミノゲンの活性のアッセイ
本発明に従って生産された組換えプラスミノゲン（またはそれから誘導された組換えプラスミン）は、当業界において公知の方法や、および後に本明細書の実施例において記載される通り標準的な方法を使用して、生物学的活性に関して評価することができる。

例えば、組換えプラスミノゲンは、標準的な技術を使用して、ｔＰＡまたはｕＰＡでの切断を介してプラスミンに変換することができる。ｔＰＡでの組換えプラスミノゲンの切断は、それぞれ残基Ｇｌｕ_１～Ａｒｇ_５６１およびＶａｌ_５６２～Ａｓｎ_７９１を含む重鎖および軽鎖を生じさせる（プラスミノゲンをプラスミンに変換するための方法の例について、参照により本明細書に組み入れられる、MutchおよびBooth、Hemostasis and Thrombosisの第20章:Victor J. Marder、William C. Aird、Joel S. Bennett、Sam Schulman、およびII Gilbert C. WhiteによるBasic Principles and Clinical Practiceを参照）。

さらに、生理学的な結合標的またはリガンドに結合する組換えプラスミノゲンの能力は、従来の技術を使用して評価することができる。例えば、組換えプラスミノゲン（またはそれから誘導されたプラスミン）への結合は、アルファ２－抗プラスミン（α2-AP）およびストレプトキナーゼへの結合に関して評価することができる。α２－ＡＰおよびストレプトキナーゼへの結合を評価するための方法は、それぞれ、例えば、Ｈｏｒｖａｔｈら、（２０１１）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、５０１：２２３～２３５およびＺｈａｎｇら、（２０１２）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２８７：４２０９３～４２１０３に説明されており、これらの内容は、参照により本明細書に組み入れられる。

哺乳類プラスミノゲン受容体などの細胞表面受容体への本発明に従って生産された組換えタンパク質の結合は、例えば実施例４に記載された通りに決定することができる。

最終的に、本発明に従って生産された組換えタンパク質の治療効能は、ヒトおよび非ヒト血漿から単離されたプラスミノゲンのおよびプラスミンの品質の評価のために利用される技術を含む標準的な技術に従って使用することができる。

組成物
組換えプラスミノゲン（またはそれから誘導されたプラスミン）は、それを必要とする個体への投与のための医薬的に許容される組成物の形態で提供することができる。例えば、本発明に従って作製された組換えタンパク質は、創傷（例えば、擦過傷およびやけどなどの皮膚創傷、骨折などの骨の創傷、筋肉傷害）の処置、外傷性の傷害の状況でプラスミノゲンの補充を提供すること、プラスミノゲン補充療法、先天性欠損がある場合、異所性骨化および異栄養性石灰化の処置において有用性がある。

一部の例において、本明細書に記載される組換えプラスミノゲン（またはそれから誘導されたプラスミン）は、従来の非毒性の医薬的に許容される担体を含有する投与製剤中に埋め込まれたリザーバーを介して、または他のあらゆる便利な剤形によって、非経口的に、局所的に、心室内に投与することができる。用語「非経口」は、本明細書で使用される場合、皮下、静脈内、筋肉内、腹膜内、髄腔内、心室内、胸骨内、および頭蓋内への注射または輸注技術を含む。

組換えプラスミノゲンを対象への投与に好適な形態（例えば医薬組成物）に調製するための方法は当業界において公知であり、その例としては、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（18th ed.、Mack Publishing Co.、Easton, Pa.、1990）および米国薬局方：国民医薬品集（Mack Publishing Company、Easton、Pa.、1984）に記載されるような方法が挙げられる。

この開示の医薬組成物は、非経口投与、例えば静脈内投与または体腔もしくは臓器もしくは関節の内腔への投与に特に有用である。投与のための組成物は、一般的に、医薬的に許容される担体、例えば水性担体中に溶解させたプラスミノゲンの溶液を含むと予想される。様々な水性担体、例えば緩衝生理食塩水などが使用できる。組成物は、生理学的条件に近づけるために必要に応じて、例えばｐＨ調整剤および緩衝剤、毒性を調整する薬剤など、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムなどの医薬的に許容される補助剤を含有していてもよい。これらの製剤における本発明の開示のプラスミノゲンの濃度は、広く変更することができ、選択された特定の投与様式および患者のニーズに従って、主として流体の体積、粘度、体重などに基づき選択されることとなる。例示的な担体としては、水、生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、および５％ヒト血清アルブミンが挙げられる。非水性ビヒクル、例えば混合油およびオレイン酸エチルも使用することができる。リポソームも担体として使用することができる。ビヒクルは、等張性や化学的安定性を強化する少量の添加剤、例えば、緩衝液および保存剤を含有していてもよい。

製剤化されたら、本発明の開示に従って作製された組換えプラスミノゲンは、投与製剤に適合する方式で、治療的／予防的に有効となる量で投与されると予想される。

実施例１：組換えプラスミノゲンの一過性発現
材料
Ｅｘｐｉ２９３発現培地（カタログ番号A1435101）、エルレンマイヤーフラスコ、リン酸緩衝生理食塩水（１×）、グルコース（３００ｍｇ／ｍＬ）、ポリエチレンイミンＰＥＩ（１ｍｇ／ｍＬ）、ルピン（Lupin）（１２５ｇ／Ｌ）、グルタマックス（Glutamax）（１００×）、ｐｃＤＮＡ３．１Ｐｌｇ（細胞培養物１ｍＬ当たり０．５μｇ）、ｐｃＤＮＡ３．１ＰＡＩ－１（細胞培養物１ｍＬ当たり０．５μｇ）。

方法
１日目：トランスフェクションの前に細胞を希釈する。

２日目：細胞に、ＰＢＳおよびＰＥＩで希釈したＤＮＡを添加する。細胞を、３７℃、５％ＣＯ_２、１１０～１４０ｒｐｍでインキュベートする。

３～７日目：培養培地中のルピンおよびグルコースレベルを調整する。

８日目：培養物を２０００×ｇ、４℃で１５分間遠心分離することによって培地を回収する。

実施例２：組換えプラスミノゲンの安定な発現
材料
４ｇ／Ｌルピンおよび１２５ｍｇ／Ｌゲネチシン（G418）が補充されたＥｘｐｉ２９３発現培地（カタログ番号Ａ１４３５１０１）、エルレンマイヤーフラスコ、グルコース（３００ｍｇ／ｍＬ）、グルタマックス（１００×）。

方法
・Ｅｘｐｉ２９３細胞を、ｐｃＤＮＡ３．１Ｐｌｇ ＩＲＥＳ ＰＡＩ－１でトランスフェクトした。
・次いで細胞を選択抗生物質であるゲネチシンの存在下で継代した。
・ゲネチシン耐性クローンを９６－ウェルプレートに分離した（ウェル当たり１つのコロニー）。
・ストレプトキナーゼを使用して分泌されたＰｌｇの存在を試験した。

一過性発現からの典型的な収量は、細胞培養物１Ｌ当たり３０～５０ｍｇである。安定してトランスフェクトされたＥｘｐｉ２９３細胞（ラージスケール発現に好適な）からの典型的な収量は、細胞培養物１Ｌ当たりおよそ８０～１００ｍｇである。

実施例３：組換えプラスミノゲンの精製
１００ｍＬの透明化した上清毎に、２０ｍＬの０．５ＭのＮａＨ_２ＰＯ_４、５ｇのグリセロールおよび１個のＲｏｃｈｅのプロテアーゼ阻害剤タブレット（アプロチニン、ベスタチン、カルパイン阻害剤IおよびII、キモスタチン、E-64、ロイペプチン、pefabloc SC/PMSF、ペプスタチン、TLCK-HCl、トリプシン阻害剤、アンチパイン二塩酸塩、ホスホラミドン（phopsphoramidon）を含む）を添加し、混合する。

１．リシンアフィニティーカラム
緩衝液Ａ：１００ｍＭのＮａ_２ＨＰＯ_４、ｐＨ８．０、５％グリセロール、０．０２％アジ化物
緩衝液Ｂ：１００ｍＭのＮａ_２ＨＰＯ_４、ｐＨ８．０、２５ｍＭのＥＡＣＡ（イプシロンアミノカプロン酸）、５％グリセロール
ＣＶ＝カラム体積。
ａ）培養上清１００ｍＬ当たり２０ｍＬのＬｙｓｉｎｅ Ｈｙｐｅｒ Ｄ樹脂を使用する。
ｂ）重力流カラムで、２ＣＶのＭＱ Ｈ_２Ｏで樹脂を洗浄し、２ＣＶの緩衝液Ａで平衡化する。
ｃ）平衡化したリシン樹脂を透明化した培地（工程１より）に添加し、４℃で１時間バッチ結合させる。
ｄ）培地を素通りさせ、流出液を収集する。
ｅ）樹脂を２ＣＶの緩衝液Ａで洗浄する。
ｆ）緩衝液Ｂで、典型的には半分の樹脂体積で一度に溶出させる。（例えば、２０ｍＬの樹脂に対して１０ｍＬの画分）。ブラッドフォード試薬を使用して、溶出エンドポイントを決定する。
ｇ）１０％ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分画を行う。
ｈ）次の精製工程のために画分をプールする。

図１は、リシンアフィニティーカラムから溶出した画分の代表的なクーマシー染色された１０％ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルの画像を示す。約１００ｋＤａのバンドは、一過性発現後の溶出したｒＰｌｇを表す。

２．ＨｉＴｒａｐ Ｑ ＦＦ
緩衝液Ａ：５０ｍＭのトリス、ｐＨ９．０、５ｍＭのＥＡＣＡ、１０％グリセロール、３０ｍＭのＮａＣｌ、０．０２％アジ化物
緩衝液Ｂ：５０ｍＭのトリス、ｐＨ９．０、５ｍＭのＥＡＣＡ、１０％グリセロール、１ＭのＮａＣｌ、０．０２％アジ化物。
ａ）サンプルを５ｍｌに濃縮し（５０ＫのＭＷＣＯ）、プレカラムサンプルを維持し、緩衝液Ａを使用して５０ｍｌに希釈する。
ｂ）５ＣＶのＭＱ Ｈ_２Ｏおよび５ＣＶの緩衝液ＡでＨｉＴｒａｐ Ｑを事前に平衡化する。
ｃ）サンプルを１ｍｌ／分でローディングし、流出液を収集する。
ｄ）５ＣＶの緩衝液Ａで洗浄する。
ｅ）溶出勾配：
－ ２０ＣＶ（１００ｍｌ）で０から２５％のＢ
－ ０ＣＶで２０％から１００％のＢ
－ ２ＣＶで１００％。

Ｐｌｇは、典型的には約１０％のＢで優勢なピークとして溶出する。ゲルを泳動して純度を決定し、画分をプールする。

プールした画分を、２５ｍＭのトリス、ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５％グリセロール中で、４℃で一晩透析する。透析をさらに２時間繰り返す。これは、ＥＡＣＡの除去を確実にするためである。

図２は、ｒＰｌｇの陰イオン交換クロマトグラフィーの代表的な結果を示す。

３．ゲルろ過Ｓ２００ １６／６０
緩衝液：２５ｍＭのトリス、ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５％グリセロール、１ｍＭのナトリウムＥＤＴＡ、０．０２％アジ化物、１×Ｒｏｃｈｅプロテアーゼ阻害剤カクテル。（トリスは、ＨｅｐｅｓまたはＮａ_２ＨＰＯ_４で代用することができる）。
ａ）少なくとも５ｍｌに濃縮し、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １６／６０でゲルろ過する。
ｂ）溶出体積は、約７３ｍｌである。
ｃ）ゲルを泳動し、関連画分をプールする。

プラスミノゲンは、５％グリセロールの存在下で、５０ＫのＭＷＣＯの濃縮装置で１５ｍｇ／ｍｌまで濃縮することができる。

プラスミノゲンは、液体Ｎ_２中でのスナップフリージングの後に凍結貯蔵することができる。

図３は、ｒＰｌｇのサイズ排除クロマトグラフィーの代表的な結果を示す。

ミニｐｌｇおよびマイクロ－ｐｌｇも本明細書に記載される方法を使用してうまく発現および精製され、活性であることが示された（データは示されない）。

実施例４：組換えプラスミノゲンの定性的な評価
１．ｒＰｌｇは、プラスミン（rPlm）に活性化することができる
図４は、ｔＰＡによるｒＰｌｇの切断の結果生じるｔＰＡで切断された組換えプラスミン（rPlm）を示すクーマシー染色された１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥを示す。還元条件下で、ｒＰｌｍは、それぞれ残基Ｇｌｕ_１～Ａｒｇ_５６１およびＶａｌ_５６２～Ａｓｎ_７９１で構成される重鎖および軽鎖に分離される。

図５は、プラスミン蛍光発生基質Ｈ－Ａｌａ－Ｐｈｅ－Ｌｙｓ－ＡＭＣの加水分解によって測定された５００ｎＭのｒＰｌｇのｔＰＡ活性化を示す進行曲線を示す。

２．ｒＰｌｇは天然のＰｌｇ ＧＩにより類似している
図６は、天然のＰｌｇグリコフォーム１（GLI）、ＰｌｇグリコフォームＩＩ（GII）およびｒＰｌｇのｔＰＡ活性化を示す。ｒＰｌｇは、本明細書に記載される方法に従って得た。天然のＰｌｇグリコフォームＩおよびＩＩは、標準的な技術を使用して、社内で得て、ヒト血漿から精製した。

結果は、ｒＰｌｇが、試験した３つの形態から最も容易に活性化可能である（最も低いＫ_ｍおよび最も高いＶ_ｍａｘを有する）ことを示す。

図７は、Ｐｌｇの開放型のコンフォメーションが２０ｍＭのＥＡＣＡの存在により誘導されることを示す。閉鎖形態において、グリコフォームＩおよびｒＰｌｇは、グリコフォームＩＩに類似した、それより大きい回転半径（R_g）を有する。（回転軸まわりの本体の回転半径は、本体の質量全体が濃縮されていると仮定される場合、その所与の軸まわりの慣性モーメントがその実際の質量分布の場合と同じになると予想される回転軸からのポイントのラジアル距離と定義される。Ｘ線散乱も、溶液中で回転する巨大分子の過剰寸法を測定するのに使用することができる。Ｐｌｇは、閉鎖型および開放型のコンフォメーションの両方と仮定することができる。開放形態の寸法は、非常に類似している。閉鎖形態において、小さいＲ_ｇは、小さく密集して充填された分子であることを示す。この測定値は、閉鎖形態がどれだけ安定であるか／十分充填されているかの指標として使用される。）。

ＳＡＸＳ滴定研究（図８）は、ＥＡＣＡに応答するＰｌｇのコンフォメーション変化を測定した。滴定曲線は、グリコフォームＩおよびＩＩとｒＰｌｇとで類似している。ｒＰｌｇは、最も容易に開放形態をとる。Ｋ_ｏｐｅｎは、Ｐｌｇの５０％が開放型のコンフォメーションであるＥＡＣＡ濃度である。

３．ｒＰｌｍは、Ｐｌｍ特異的な阻害剤であるアルファ２－抗プラスミン（α2-AP）に結合する
組換えα２－ＡＰをＮｉ２＋－ＮＴＡチップに固定し、天然または組換えＰｌｇおよびＰｌｍの結合をリアルタイムでモニターした。図９および１０は、アルファ２－抗プラスミン（α2-AP）への、ｒＰｌｇおよびｒＰｌｍの結合、加えて天然のＰｌｇおよびＰｌｍを実証するセンサーグラムを示す。

ｒＰｌｇおよびｒＰｌｍを本明細書に記載される方法によって得た。天然のＰｌｇをＭｅｒｃｋから購入し（ヒト血漿から精製したもの）、天然のＰｌｍをＨａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入した。

４．ｒＰｌｇおよびｒＰｌｍは化膿性連鎖球菌（Streptococcus pyrogenes）由来のストレプトキナーゼによって結合する
組換えＳＫをＮｉ２＋－ＮＴＡチップに固定し、天然または組換えＰｌｇおよびＰｌｍの結合をリアルタイムでモニターした。ｒＰｌｇおよびｒＰｌｍを本明細書に記載される方法によって得た。天然のＰｌｇをＭｅｒｃｋから購入し（ヒト血漿から精製した）、天然のＰｌｍをＨａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入した。図１１および１２に結果を示す。

全ての実験を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００評価ソフトウェア（Biacore AB）を使用して、１：１のラングミュア結合モデルを用いてフィッティングした（結合したときのＰｌｇグリコフォームＩＩのコンフォメーション変化を説明するために二状態反応モデルを使用したα２－ＡＰ／天然のＰｌｇの場合を除く）。以下の表に、反応速度（k_aおよびk_d）および親和定数（K_D）をまとめる。

上記の結果は、本発明の方法に従って生産された組換えプラスミノゲン（またはそれから誘導されたプラスミン）が、血漿から精製された天然のプラスミノゲン／プラスミンの商業的に入手可能な調製物と類似した、またはそれより大きい親和性で生理的に適切な結合パートナーに結合することを実証する。

５．ｒＰｌｇは哺乳類Ｐｌｇ受容体に結合する
簡単に言えば、ＨＥＫ２９３細胞をＰＢＳ－ＥＤＴＡ＋２％ＦＣＳに再懸濁した。次いでサンプル当たり細胞５×１０^５個を、５ｕｇ／ｍＬのｎＰｌｇまたはｒＰｌｇと共に、さらに、１０ｕｇ／ｍＬのＡｌｅｘａ－４８８で標識したＰｌｇ抗体と共に、３０分間インキュベートした。少なくとも１０，０００事象の蛍光強度中央値を、ＦＬ１チャネル（４８８ｎｍレーザー励起源）において、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（BD Biosciences）フローサイトメーターで測定した。図１３は、ＨＥＫ２９３細胞におけるプラスミノゲン受容体へのｒＰｌｇの結合を示す。

６．ｒＰｌｇは骨および筋肉の傷害の部位に蓄積し、傷害後の異栄養性石灰化を低減させる
図１４は、骨および筋肉傷害に続くｒＰｌｇ注射後の結果を示す。Ａ．上のパネルは、骨においてｒＰｌｇが骨折部位に蓄積することを示す。Ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒで標識されたフィブリンおよびｒＰｌｇをＩＰ注射した。画像は、骨折部位におけるフィブリンおよびｒＰｌｇの蓄積を示す。下のパネルは、ｒＰｌｇが筋肉傷害の部位に蓄積することを示す。心臓毒を右脚に注射して筋肉傷害を誘発させ、ｒＰｌｇを１ｍｇ／日でＩＰ投与した。画像は、傷害を受けた脚および腎臓におけるｒＰｌｇの蓄積を示すが、傷害を受けていない脚／腎臓では蓄積していなかった。

Ｂ．上のパネルはまた、筋肉傷害の部位におけるｒＰｌｇ蓄積も示す。心臓毒を脚に注射して筋肉傷害を誘発させた。Ａｌｅｘ Ｆｌｕｏｒ色素で標識されたｒＰｌｇを１ｍｇ／日でＩＰ注射し、傷害後１～７日目に画像を記録した。下のパネル：傷害の部位におけるｒＰｌｇ蓄積が、Ｐｌｇ＋／ － 動物において筋肉の石灰化を防止する。心臓毒を脚に注射して筋肉傷害を誘発させた。ｒＰｌｇを１ｍｇ／日でＩＰ注射し、傷害後の７日目に画像を記録した。筋肉の石灰化は、Ｐｌｇ＋／－において明白であるがＷＴ動物ではそうではなく、α２ＡＰアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用したｒＰｌｇまたはアルファ２－抗プラスミン（α2AP）発現の阻害を使用することによって救済することができる。

実施例５：組換えプラスミノゲンと他の阻害剤との共発現
Ｅｘｐｉ２９３細胞を、以下をコードする構築物と共にトランスフェクトした：
・組換えＰｌｇ／α２－ＡＰ；
・組換えＰｌｇ／ＰＡＩ－１_{ｓｔａｂｌｅ}；
・組換えＰｌｇ／ＰＡＩ－１；
・組換えＰｌｇ／ＰＡＩ－２；
・組換えＰｌｇ／ＰＡＩ－３。

トランスフェクションの前に全ての構築物を１：１（w/w）の比率で予備混合した。

トランスフェクションの１、３および５日後におけるＰｌｇの発現レベルを、抗Ｐｌｇ抗体を使用したウェスタンブロットによって決定した。

図１５および１６に示される結果は、組換えＰｌｇの収量が、安定してトランスフェクトされたＰＡＩ－１または一時的にトランスフェクトされたＰＡＩ－１と共に発現される場合、α２－ＡＰ、ＰＡＩ－２またはＰＡＩ－３のいずれかと共に発現される場合と比較して著しく高かったことを実証する。

結論：ＰＡＩ－１は組換えＰｌｇの発現にとって重要である。α－ＡＰと共に発現される場合のＰｌｇの発現を比較する実験からの結果は、タンパク質収量を最大化するために、Ｐｌｍ活性化の阻害がＰｌｍ活性の阻害より重要であることを示す。

配列情報
ヒトプラスミノゲンの例示的な核酸配列（配列番号１）
ATGGAACACAAAGAAGTGGTGTTGCTCCTGCTGCTGTTCCTGAAGTCCGGCCAGGGCGAGCCCCTGGACGATTACGTGAACACCCAGGGCGCCAGCCTGTTCAGCGTGACCAAGAAACAGCTGGGAGCCGGCAGCATCGAGGAATGCGCCGCCAAGTGCGAAGAGGACGAGGAATTCACCTGTCGGGCCTTCCAGTACCACAGCAAAGAACAGCAGTGCGTGATCATGGCCGAGAACAGAAAGAGCAGCATCATCATCAGAATGCGGGACGTGGTGCTGTTCGAGAAGAAGGTGTACCTGAGCGAGTGCAAGACCGGCAACGGCAAGAACTACCGGGGCACCATGAGCAAGACCAAGAACGGCATCACCTGTCAGAAGTGGTCCAGCACCAGCCCCCACCGGCCTAGATTTTCTCCAGCCACCCACCCTAGCGAGGGCCTGGAAGAGAACTACTGCCGGAACCCCGACAACGACCCTCAGGGCCCTTGGTGCTACACCACCGACCCCGAGAAGAGATACGACTACTGCGACATCCTGGAATGTGAAGAGGAATGCATGCACTGCAGCGGCGAGAACTACGACGGCAAGATCTCCAAGACCATGAGCGGCCTGGAATGCCAGGCTTGGGACAGCCAGTCTCCTCACGCCCACGGCTACATCCCCAGCAAGTTCCCCAACAAGAACCTGAAGAAGAATTACTGCAGAAACCCTGACCGCGAGCTGCGGCCCTGGTGTTTTACCACCGATCCTAACAAGAGATGGGAGCTGTGCGATATCCCCCGGTGCACCACACCTCCACCTAGCAGCGGCCCTACCTACCAGTGTCTGAAGGGCACCGGCGAGAATTACAGGGGCAACGTGGCCGTGACCGTGTCCGGCCATACCTGCCAGCATTGGAGCGCCCAGACCCCCCACACCCACAACAGAACCCCCGAGAACTTCCCCTGCAAGAATCTGGACGAGAATTATTGTCGCAACCCCGATGGCAAGAGGGCCCCCTGGTGTCACACCACCAACAGCCAGGTGCGCTGGGAGTACTGCAAGATCCCCAGCTGCGATAGCAGCCCCGTGTCCACAGAACAGCTGGCCCCTACAGCCCCTCCTGAGCTGACACCTGTGGTGCAGGATTGCTACCACGGCGACGGCCAGAGCTACAGAGGCACCAGCAGCACCACCACAACCGGCAAGAAGTGCCAGAGCTGGTCCTCCATGACCCCTCACCGGCACCAGAAAACCCCTGAGAATTACCCCAACGCCGGCCTGACCATGAACTACTGTAGAAATCCCGACGCCGACAAGGGACCCTGGTGCTTCACAACAGACCCTTCCGTCAGATGGGAATACTGTAATCTGAAGAAGTGCAGCGGCACCGAGGCCAGCGTGGTGGCTCCTCCACCAGTGGTGCTGCTGCCCGATGTGGAAACCCCCTCCGAAGAGGACTGTATGTTCGGCAATGGCAAGGGCTATAGAGGCAAGCGGGCCACCACCGTGACCGGCACACCTTGTCAGGATTGGGCCGCTCAGGAACCCCACAGACACAGCATCTTCACCCCAGAGACAAACCCTCGGGCCGGACTGGAAAAAAACTATTGTCGGAATCCTGACGGCGACGTGGGAGGACCTTGGTGTTATACAACAAACCCACGGAAGCTGTACGATTACTGTGACGTGCCCCAGTGTGCCGCCCCTAGCTTCGATTGTGGCAAGCCCCAGGTGGAACCCAAGAAATGCCCCGGCAGAGTCGTGGGCGGATGTGTGGCCCATCCTCACTCTTGGCCTTGGCAGGTGTCCCTGCGGACCAGATTCGGCATGCACTTTTGCGGCGGCACCCTGATCAGCCCCGAGTGGGTGCTGACAGCCGCCCACTGTCTGGAAAAGTCCCCCAGACCCAGCAGCTACAAAGTGATCCTGGGAGCCCACCAGGAAGTGAACCTGGAACCTCACGTGCAGGAAATCGAGGTGTCCAGACTGTTCCTGGAACCCACCCGGAAGGATATCGCCCTGCTGAAGCTGAGCAGCCCTGCCGTGATCACCGACAAAGTGATTCCCGCCTGCCTGCCCAGCCCCAACTATGTGGTGGCCGACAGAACCGAGTGCTTCATCACCGGCTGGGGCGAGACACAGGGCACATTTGGAGCCGGCCTGCTGAAAGAGGCCCAGCTGCCTGTGATCGAGAACAAAGTGTGCAACCGCTACGAGTTCCTGAACGGCAGAGTGCAGAGCACCGAGCTGTGTGCCGGACATCTGGCTGGCGGCACAGATAGCTGTCAGGGCGATTCTGGCGGCCCTCTCGTGTGCTTCGAGAAGGACAAGTACATCCTGCAGGGCGTGACCAGCTGGGGCCTGGGATGTGCCAGACCTAACAAGCCCGGCGTGTACGTGCGCGTGTCCAGATTTGTGACCTGGATCGAGGGCGTGATGCGGAACAACTGA

シグナルペプチドを下線で示したヒトプラスミノゲンの例示的なアミノ酸配列（配列番号２）。
MEHKEVVLLLLLFLKSGQGEPLDDYVNTQGASLFSVTKKQLGAGSIEECAAKCEEDEEFTCRAFQYHSKEQQCVIMAENRKSSIIIRMRDVVLFEKKVYLSECKTGNGKNYRGTMSKTKNGITCQKWSSTSPHRPRFSPATHPSEGLEENYCRNPDNDPQGPWCYTTDPEKRYDYCDILECEEECMHCSGENYDGKISKTMSGLECQAWDSQSPHAHGYIPSKFPNKNLKKNYCRNPDRELRPWCFTTDPNKRWELCDIPRCTTPPPSSGPTYQCLKGTGENYRGNVAVTVSGHTCQHWSAQTPHTHNRTPENFPCKNLDENYCRNPDGKRAPWCHTTNSQVRWEYCKIPSCDSSPVSTEQLAPTAPPELTPVVQDCYHGDGQSYRGTSSTTTTGKKCQSWSSMTPHRHQKTPENYPNAGLTMNYCRNPDADKGPWCFTTDPSVRWEYCNLKKCSGTEASVVAPPPVVLLPDVETPSEEDCMFGNGKGYRGKRATTVTGTPCQDWAAQEPHRHSIFTPETNPRAGLEKNYCRNPDGDVGGPWCYTTNPRKLYDYCDVPQCAAPSFDCGKPQVEPKKCPGRVVGGCVAHPHSWPWQVSLRTRFGMHFCGGTLISPEWVLTAAHCLEKSPRPSSYKVILGAHQEVNLEPHVQEIEVSRLFLEPTRKDIALLKLSSPAVITDKVIPACLPSPNYVVADRTECFITGWGETQGTFGAGLLKEAQLPVIENKVCNRYEFLNGRVQSTELCAGHLAGGTDSCQGDSGGPLVCFEKDKYILQGVTSWGLGCARPNKPGVYVRVSRFVTWIEGVMRNN

組換えＰＡＩ－１の例示的な核酸配列（配列番号３）。
セルピン安定性を改善させるための突然変異：Ｑ１９７ＣおよびＧ３５５Ｃ（以下の配列では下線で示される）を含む（Chorostowska-Wynimko J et al. (2003) Molecular Cancer Therapeutics. 2003;2(1):19-28. doi: 10.1186/1476-4598-2-19に従う）。
ATGCAGATGTCTCCCGCCCTGACCTGCCTGGTGCTGGGCCTGGCCCTGGTGTTCGGAGAGGGCTCTGCCGTGCACCACCCACCTAGCTACGTGGCACACCTGGCCTCCGACTTCGGCGTGAGGGTGTTTCAGCAGGTGGCCCAGGCCAGCAAGGATCGCAACGTGGTGTTCAGCCCTTATGGCGTGGCCTCCGTGCTGGCCATGCTCCAGCTGACCACAGGAGGAGAGACCCAGCAGCAGATCCAGGCAGCTATGGGCTTCAAGATCGACGATAAGGGAATGGCACCCGCCCTGAGGCACCTGTACAAGGAGCTGATGGGCCCTTGGAATAAGGACGAGATCAGCACCACAGATGCCATCTTTGTGCAGCGCGACCTGAAGCTGGTGCAGGGCTTCATGCCACACTTCTTTCGGCTGTTCCGGAGCACCGTGAAGCAGGTGGACTTCAGCGAGGTGGAGAGGGCCCGCTTTATCATCAACGATTGGGTGAAGACCCACACAAAGGGCATGATCAGCAATCTGCTGGGCAAGGGAGCAGTGGATCAGCTGACCAGGCTGGTGCTGGTGAACGCCCTGTACTTCAATGGCTGCTGGAAGACCCCATTTCCCGACAGCTCCACACACCGGAGACTGTTCCACAAGTCCGATGGCTCTACAGTGAGCGTGCCTATGATGGCCCAGACCAACAAGTTCAATTATACAGAGTTTACCACACCTGACGGCCACTACTATGACATCCTGGAGCTGCCATACCACGGCGACACCCTGAGCATGTTTATCGCCGCCCCTTATGAGAAGGAGGTGCCACTGTCCGCCCTGACAAACATCCTGTCCGCCCAGCTGATCTCTCACTGGAAGGGCAATATGACCAGGCTGCCAAGGCTGCTGGTGCTGCCTAAGTTCTCCCTGGAGACAGAGGTGGACCTGCGGAAGCCTCTGGAGAACCTGGGCATGACCGATATGTTCAGACAGTTTCAGGCCGACTTTACATCTCTGAGCGATCAGGAGCCACTGCACGTGGCACAGGCCCTCCAGAAGGTGAAGATCGAGGTGAACGAGTCCTGTACCGTGGCCTCTAGCTCCACAGCCGTGATCGTGTCTGCCAGGATGGCCCCAGAGGAGATCATCATGGATCGGCCCTTCCTGTTTGTGGTGAGACACAATCCAACCGGCACAGTGCTGTTCATGGGCCAGGTCATGGAGCCCTGA

組換えＰＡＩ－１、Ｑ１９７Ｃ、Ｇ３５５Ｃのアミノ酸配列（配列番号４）
MQMSPALTCLVLGLALVFGEGSAVHHPPSYVAHLASDFGVRVFQQVAQASKDRNVVFSPYGVASVLAMLQLTTGGETQQQIQAAMGFKIDDKGMAPALRHLYKELMGPWNKDEISTTDAIFVQRDLKLVQGFMPHFFRLFRSTVKQVDFSEVERARFIINDWVKTHTKGMISNLLGKGAVDQLTRLVLVNALYFNGCWKTPFPDSSTHRRLFHKSDGSTVSVPMMAQTNKFNYTEFTTPDGHYYDILELPYHGDTLSMFIAAPYEKEVPLSALTNILSAQLISHWKGNMTRLPRLLVLPKFSLETEVDLRKPLENLGMTDMFRQFQADFTSLSDQEPLHVAQALQKVKIEVNESCTVASSSTAVIVSARMAPEEIIMDRPFLFVVRHNPTGTVLFMGQVMEP

ｈＰｌｇ－ＩＲＥＳ２－ＰＡＩ－１発現カセット（安定なプラスミノゲンおよびＰＡＩ－１の発現のための構築物）の核酸配列（配列番号５）
ATGGAACACAAAGAAGTGGTGTTGCTCCTGCTGCTGTTCCTGAAGTCCGGCCAGGGCGAGCCCCTGGACGATTACGTGAACACCCAGGGCGCCAGCCTGTTCAGCGTGACCAAGAAACAGCTGGGAGCCGGCAGCATCGAGGAATGCGCCGCCAAGTGCGAAGAGGACGAGGAATTCACCTGTCGGGCCTTCCAGTACCACAGCAAAGAACAGCAGTGCGTGATCATGGCCGAGAACAGAAAGAGCAGCATCATCATCAGAATGCGGGACGTGGTGCTGTTCGAGAAGAAGGTGTACCTGAGCGAGTGCAAGACCGGCAACGGCAAGAACTACCGGGGCACCATGAGCAAGACCAAGAACGGCATCACCTGTCAGAAGTGGTCCAGCACCAGCCCCCACCGGCCTAGATTTTCTCCAGCCACCCACCCTAGCGAGGGCCTGGAAGAGAACTACTGCCGGAACCCCGACAACGACCCTCAGGGCCCTTGGTGCTACACCACCGACCCCGAGAAGAGATACGACTACTGCGACATCCTGGAATGTGAAGAGGAATGCATGCACTGCAGCGGCGAGAACTACGACGGCAAGATCTCCAAGACCATGAGCGGCCTGGAATGCCAGGCTTGGGACAGCCAGTCTCCTCACGCCCACGGCTACATCCCCAGCAAGTTCCCCAACAAGAACCTGAAGAAGAATTACTGCAGAAACCCTGACCGCGAGCTGCGGCCCTGGTGTTTTACCACCGATCCTAACAAGAGATGGGAGCTGTGCGATATCCCCCGGTGCACCACACCTCCACCTAGCAGCGGCCCTACCTACCAGTGTCTGAAGGGCACCGGCGAGAATTACAGGGGCAACGTGGCCGTGACCGTGTCCGGCCATACCTGCCAGCATTGGAGCGCCCAGACCCCCCACACCCACAACAGAACCCCCGAGAACTTCCCCTGCAAGAATCTGGACGAGAATTATTGTCGCAACCCCGATGGCAAGAGGGCCCCCTGGTGTCACACCACCAACAGCCAGGTGCGCTGGGAGTACTGCAAGATCCCCAGCTGCGATAGCAGCCCCGTGTCCACAGAACAGCTGGCCCCTACAGCCCCTCCTGAGCTGACACCTGTGGTGCAGGATTGCTACCACGGCGACGGCCAGAGCTACAGAGGCACCAGCAGCACCACCACAACCGGCAAGAAGTGCCAGAGCTGGTCCTCCATGACCCCTCACCGGCACCAGAAAACCCCTGAGAATTACCCCAACGCCGGCCTGACCATGAACTACTGTAGAAATCCCGACGCCGACAAGGGACCCTGGTGCTTCACAACAGACCCTTCCGTCAGATGGGAATACTGTAATCTGAAGAAGTGCAGCGGCACCGAGGCCAGCGTGGTGGCTCCTCCACCAGTGGTGCTGCTGCCCGATGTGGAAACCCCCTCCGAAGAGGACTGTATGTTCGGCAATGGCAAGGGCTATAGAGGCAAGCGGGCCACCACCGTGACCGGCACACCTTGTCAGGATTGGGCCGCTCAGGAACCCCACAGACACAGCATCTTCACCCCAGAGACAAACCCTCGGGCCGGACTGGAAAAAAACTATTGTCGGAATCCTGACGGCGACGTGGGAGGACCTTGGTGTTATACAACAAACCCACGGAAGCTGTACGATTACTGTGACGTGCCCCAGTGTGCCGCCCCTAGCTTCGATTGTGGCAAGCCCCAGGTGGAACCCAAGAAATGCCCCGGCAGAGTCGTGGGCGGATGTGTGGCCCATCCTCACTCTTGGCCTTGGCAGGTGTCCCTGCGGACCAGATTCGGCATGCACTTTTGCGGCGGCACCCTGATCAGCCCCGAGTGGGTGCTGACAGCCGCCCACTGTCTGGAAAAGTCCCCCAGACCCAGCAGCTACAAAGTGATCCTGGGAGCCCACCAGGAAGTGAACCTGGAACCTCACGTGCAGGAAATCGAGGTGTCCAGACTGTTCCTGGAACCCACCCGGAAGGATATCGCCCTGCTGAAGCTGAGCAGCCCTGCCGTGATCACCGACAAAGTGATTCCCGCCTGCCTGCCCAGCCCCAACTATGTGGTGGCCGACAGAACCGAGTGCTTCATCACCGGCTGGGGCGAGACACAGGGCACATTTGGAGCCGGCCTGCTGAAAGAGGCCCAGCTGCCTGTGATCGAGAACAAAGTGTGCAACCGCTACGAGTTCCTGAACGGCAGAGTGCAGAGCACCGAGCTGTGTGCCGGACATCTGGCTGGCGGCACAGATAGCTGTCAGGGCGATTCTGGCGGCCCTCTCGTGTGCTTCGAGAAGGACAAGTACATCCTGCAGGGCGTGACCAGCTGGGGCCTGGGATGTGCCAGACCTAACAAGCCCGGCGTGTACGTGCGCGTGTCCAGATTTGTGACCTGGATCGAGGGCGTGATGCGGAACAACTGAAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCCCCCTCTCCCTCCCCCCCCCCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTACACATGCTTTACATGTGTTTAGTCGAGGTTAAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAATATGCAGATGTCTCCCGCCCTGACCTGCCTGGTGCTGGGCCTGGCCCTGGTGTTCGGAGAGGGCTCTGCCGTGCACCACCCACCTAGCTACGTGGCACACCTGGCCTCCGACTTCGGCGTGAGGGTGTTTCAGCAGGTGGCCCAGGCCAGCAAGGATCGCAACGTGGTGTTCAGCCCTTATGGCGTGGCCTCCGTGCTGGCCATGCTCCAGCTGACCACAGGAGGAGAGACCCAGCAGCAGATCCAGGCAGCTATGGGCTTCAAGATCGACGATAAGGGAATGGCACCCGCCCTGAGGCACCTGTACAAGGAGCTGATGGGCCCTTGGAATAAGGACGAGATCAGCACCACAGATGCCATCTTTGTGCAGCGCGACCTGAAGCTGGTGCAGGGCTTCATGCCACACTTCTTTCGGCTGTTCCGGAGCACCGTGAAGCAGGTGGACTTCAGCGAGGTGGAGAGGGCCCGCTTTATCATCAACGATTGGGTGAAGACCCACACAAAGGGCATGATCAGCAATCTGCTGGGCAAGGGAGCAGTGGATCAGCTGACCAGGCTGGTGCTGGTGAACGCCCTGTACTTCAATGGCTGCTGGAAGACCCCATTTCCCGACAGCTCCACACACCGGAGACTGTTCCACAAGTCCGATGGCTCTACAGTGAGCGTGCCTATGATGGCCCAGACCAACAAGTTCAATTATACAGAGTTTACCACACCTGACGGCCACTACTATGACATCCTGGAGCTGCCATACCACGGCGACACCCTGAGCATGTTTATCGCCGCCCCTTATGAGAAGGAGGTGCCACTGTCCGCCCTGACAAACATCCTGTCCGCCCAGCTGATCTCTCACTGGAAGGGCAATATGACCAGGCTGCCAAGGCTGCTGGTGCTGCCTAAGTTCTCCCTGGAGACAGAGGTGGACCTGCGGAAGCCTCTGGAGAACCTGGGCATGACCGATATGTTCAGACAGTTTCAGGCCGACTTTACATCTCTGAGCGATCAGGAGCCACTGCACGTGGCACAGGCCCTCCAGAAGGTGAAGATCGAGGTGAACGAGTCCTGTACCGTGGCCTCTAGCTCCACAGCCGTGATCGTGTCTGCCAGGATGGCCCCAGAGGAGATCATCATGGATCGGCCCTTCCTGTTTGTGGTGAGACACAATCCAACCGGCACAGTGCTGTTCATGGGCCAGGTCATGGAGCCCTGA

ヒトｇｌｕ－Ｐｌｇの例示的な核酸配列（配列番号６）
ATGGAACACAAAGAAGTGGTGTTGCTCCTGCTGCTGTTCCTGAAGTCCGGCCAGGGCGAGCCCCTGGACGATTACGTGAACACCCAGGGCGCCAGCCTGTTCAGCGTGACCAAGAAACAGCTGGGAGCCGGCAGCATCGAGGAATGCGCCGCCAAGTGCGAAGAGGACGAGGAATTCACCTGTCGGGCCTTCCAGTACCACAGCAAAGAACAGCAGTGCGTGATCATGGCCGAGAACAGAAAGAGCAGCATCATCATCAGAATGCGGGACGTGGTGCTGTTCGAGAAGAAGGTGTACCTGAGCGAGTGCAAGACCGGCAACGGCAAGAACTACCGGGGCACCATGAGCAAGACCAAGAACGGCATCACCTGTCAGAAGTGGTCCAGCACCAGCCCCCACCGGCCTAGATTTTCTCCAGCCACCCACCCTAGCGAGGGCCTGGAAGAGAACTACTGCCGGAACCCCGACAACGACCCTCAGGGCCCTTGGTGCTACACCACCGACCCCGAGAAGAGATACGACTACTGCGACATCCTGGAATGTGAAGAGGAATGCATGCACTGCAGCGGCGAGAACTACGACGGCAAGATCTCCAAGACCATGAGCGGCCTGGAATGCCAGGCTTGGGACAGCCAGTCTCCTCACGCCCACGGCTACATCCCCAGCAAGTTCCCCAACAAGAACCTGAAGAAGAATTACTGCAGAAACCCTGACCGCGAGCTGCGGCCCTGGTGTTTTACCACCGATCCTAACAAGAGATGGGAGCTGTGCGATATCCCCCGGTGCACCACACCTCCACCTAGCAGCGGCCCTACCTACCAGTGTCTGAAGGGCACCGGCGAGAATTACAGGGGCAACGTGGCCGTGACCGTGTCCGGCCATACCTGCCAGCATTGGAGCGCCCAGACCCCCCACACCCACAACAGAACCCCCGAGAACTTCCCCTGCAAGAATCTGGACGAGAATTATTGTCGCAACCCCGATGGCAAGAGGGCCCCCTGGTGTCACACCACCAACAGCCAGGTGCGCTGGGAGTACTGCAAGATCCCCAGCTGCGATAGCAGCCCCGTGTCCACAGAACAGCTGGCCCCTACAGCCCCTCCTGAGCTGACACCTGTGGTGCAGGATTGCTACCACGGCGACGGCCAGAGCTACAGAGGCACCAGCAGCACCACCACAACCGGCAAGAAGTGCCAGAGCTGGTCCTCCATGACCCCTCACCGGCACCAGAAAACCCCTGAGAATTACCCCAACGCCGGCCTGACCATGAACTACTGTAGAAATCCCGACGCCGACAAGGGACCCTGGTGCTTCACAACAGACCCTTCCGTCAGATGGGAATACTGTAATCTGAAGAAGTGCAGCGGCACCGAGGCCAGCGTGGTGGCTCCTCCACCAGTGGTGCTGCTGCCCGATGTGGAAACCCCCTCCGAAGAGGACTGTATGTTCGGCAATGGCAAGGGCTATAGAGGCAAGCGGGCCACCACCGTGACCGGCACACCTTGTCAGGATTGGGCCGCTCAGGAACCCCACAGACACAGCATCTTCACCCCAGAGACAAACCCTCGGGCCGGACTGGAAAAAAACTATTGTCGGAATCCTGACGGCGACGTGGGAGGACCTTGGTGTTATACAACAAACCCACGGAAGCTGTACGATTACTGTGACGTGCCCCAGTGTGCCGCCCCTAGCTTCGATTGTGGCAAGCCCCAGGTGGAACCCAAGAAATGCCCCGGCAGAGTCGTGGGCGGATGTGTGGCCCATCCTCACTCTTGGCCTTGGCAGGTGTCCCTGCGGACCAGATTCGGCATGCACTTTTGCGGCGGCACCCTGATCAGCCCCGAGTGGGTGCTGACAGCCGCCCACTGTCTGGAAAAGTCCCCCAGACCCAGCAGCTACAAAGTGATCCTGGGAGCCCACCAGGAAGTGAACCTGGAACCTCACGTGCAGGAAATCGAGGTGTCCAGACTGTTCCTGGAACCCACCCGGAAGGATATCGCCCTGCTGAAGCTGAGCAGCCCTGCCGTGATCACCGACAAAGTGATTCCCGCCTGCCTGCCCAGCCCCAACTATGTGGTGGCCGACAGAACCGAGTGCTTCATCACCGGCTGGGGCGAGACACAGGGCACATTTGGAGCCGGCCTGCTGAAAGAGGCCCAGCTGCCTGTGATCGAGAACAAAGTGTGCAACCGCTACGAGTTCCTGAACGGCAGAGTGCAGAGCACCGAGCTGTGTGCCGGACATCTGGCTGGCGGCACAGATAGCTGTCAGGGCGATTCTGGCGGCCCTCTCGTGTGCTTCGAGAAGGACAAGTACATCCTGCAGGGCGTGACCAGCTGGGGCCTGGGATGTGCCAGACCTAACAAGCCCGGCGTGTACGTGCGCGTGTCCAGATTTGTGACCTGGATCGAGGGCGTGATGCGGAACAACTGA

シグナルペプチドを下線で示したヒトｇｌｕ－Ｐｌｇの例示的なアミノ酸配列（配列番号７）
MEHKEVVLLLLLFLKSGQGEPLDDYVNTQGASLFSVTKKQLGAGSIEECAAKCEEDEEFTCRAFQYHSKEQQCVIMAENRKSSIIIRMRDVVLFEKKVYLSECKTGNGKNYRGTMSKTKNGITCQKWSSTSPHRPRFSPATHPSEGLEENYCRNPDNDPQGPWCYTTDPEKRYDYCDILECEEECMHCSGENYDGKISKTMSGLECQAWDSQSPHAHGYIPSKFPNKNLKKNYCRNPDRELRPWCFTTDPNKRWELCDIPRCTTPPPSSGPTYQCLKGTGENYRGNVAVTVSGHTCQHWSAQTPHTHNRTPENFPCKNLDENYCRNPDGKRAPWCHTTNSQVRWEYCKIPSCDSSPVSTEQLAPTAPPELTPVVQDCYHGDGQSYRGTSSTTTTGKKCQSWSSMTPHRHQKTPENYPNAGLTMNYCRNPDADKGPWCFTTDPSVRWEYCNLKKCSGTEASVVAPPPVVLLPDVETPSEEDCMFGNGKGYRGKRATTVTGTPCQDWAAQEPHRHSIFTPETNPRAGLEKNYCRNPDGDVGGPWCYTTNPRKLYDYCDVPQCAAPSFDCGKPQVEPKKCPGRVVGGCVAHPHSWPWQVSLRTRFGMHFCGGTLISPEWVLTAAHCLEKSPRPSSYKVILGAHQEVNLEPHVQEIEVSRLFLEPTRKDIALLKLSSPAVITDKVIPACLPSPNYVVADRTECFITGWGETQGTFGAGLLKEAQLPVIENKVCNRYEFLNGRVQSTELCAGHLAGGTDSCQGDSGGPLVCFEKDKYILQGVTSWGLGCARPNKPGVYVRVSRFVTWIEGVMRNN

ヒトＬｙｓ－Ｐｌｇの例示的な核酸配列（配列番号８）
atggaacacaaagaagtggtgttgctcctgctgctgttcctgaagtccggccagggcaaggtgtacctgagcgagtgcaagaccggcaacggcaagaactaccggggcaccatgagcaagaccaagaacggcatcacctgtcagaagtggtccagcaccagcccccaccggcctagattttctccagccacccaccctagcgagggcctggaagagaactactgccggaaccccgacaacgaccctcagggcccttggtgctacaccaccgaccccgagaagagatacgactactgcgacatcctggaatgtgaagaggaatgcatgcactgcagcggcgagaactacgacggcaagatctccaagaccatgagcggcctggaatgccaggcttgggacagccagtctcctcacgcccacggctacatccccagcaagttccccaacaagaacctgaagaagaattactgcagaaaccctgaccgcgagctgcggccctggtgttttaccaccgatcctaacaagagatgggagctgtgcgatatcccccggtgcaccacacctccacctagcagcggccctacctaccagtgtctgaagggcaccggcgagaattacaggggcaacgtggccgtgaccgtgtccggccatacctgccagcattggagcgcccagaccccccacacccacaacagaacccccgagaacttcccctgcaagaatctggacgagaattattgtcgcaaccccgatggcaagagggccccctggtgtcacaccaccaacagccaggtgcgctgggagtactgcaagatccccagctgcgatagcagccccgtgtccacagaacagctggcccctacagcccctcctgagctgacacctgtggtgcaggattgctaccacggcgacggccagagctacagaggcaccagcagcaccaccacaaccggcaagaagtgccagagctggtcctccatgacccctcaccggcaccagaaaacccctgagaattaccccaacgccggcctgaccatgaactactgtagaaatcccgacgccgacaagggaccctggtgcttcacaacagacccttccgtcagatgggaatactgtaatctgaagaagtgcagcggcaccgaggccagcgtggtggctcctccaccagtggtgctgctgcccgatgtggaaaccccctccgaagaggactgtatgttcggcaatggcaagggctatagaggcaagcgggccaccaccgtgaccggcacaccttgtcaggattgggccgctcaggaaccccacagacacagcatcttcaccccagagacaaaccctcgggccggactggaaaaaaactattgtcggaatcctgacggcgacgtgggaggaccttggtgttatacaacaaacccacggaagctgtacgattactgtgacgtgccccagtgtgccgcccctagcttcgattgtggcaagccccaggtggaacccaagaaatgccccggcagagtcgtgggcggatgtgtggcccatcctcactcttggccttggcaggtgtccctgcggaccagattcggcatgcacttttgcggcggcaccctgatcagccccgagtgggtgctgacagccgcccactgtctggaaaagtcccccagacccagcagctacaaagtgatcctgggagcccaccaggaagtgaacctggaacctcacgtgcaggaaatcgaggtgtccagactgttcctggaacccacccggaaggatatcgccctgctgaagctgagcagccctgccgtgatcaccgacaaagtgattcccgcctgcctgcccagccccaactatgtggtggccgacagaaccgagtgcttcatcaccggctggggcgagacacagggcacatttggagccggcctgctgaaagaggcccagctgcctgtgatcgagaacaaagtgtgcaaccgctacgagttcctgaacggcagagtgcagagcaccgagctgtgtgccggacatctggctggcggcacagatagctgtcagggcgattctggcggccctctcgtgtgcttcgagaaggacaagtacatcctgcagggcgtgaccagctggggcctgggatgtgccagacctaacaagcccggcgtgtacgtgcgcgtgtccagatttgtgacctggatcgagggcgtgatgcggaacaactga

シグナルペプチドを下線で示したヒトＬｙｓ－Ｐｌｇの例示的なアミノ酸配列（配列番号９）
MEHKEVVLLLLLFLKSGQGKVYLSECKTGNGKNYRGTMSKTKNGITCQKWSSTSPHRPRFSPATHPSEGLEENYCRNPDNDPQGPWCYTTDPEKRYDYCDILECEEECMHCSGENYDGKISKTMSGLECQAWDSQSPHAHGYIPSKFPNKNLKKNYCRNPDRELRPWCFTTDPNKRWELCDIPRCTTPPPSSGPTYQCLKGTGENYRGNVAVTVSGHTCQHWSAQTPHTHNRTPENFPCKNLDENYCRNPDGKRAPWCHTTNSQVRWEYCKIPSCDSSPVSTEQLAPTAPPELTPVVQDCYHGDGQSYRGTSSTTTTGKKCQSWSSMTPHRHQKTPENYPNAGLTMNYCRNPDADKGPWCFTTDPSVRWEYCNLKKCSGTEASVVAPPPVVLLPDVETPSEEDCMFGNGKGYRGKRATTVTGTPCQDWAAQEPHRHSIFTPETNPRAGLEKNYCRNPDGDVGGPWCYTTNPRKLYDYCDVPQCAAPSFDCGKPQVEPKKCPGRVVGGCVAHPHSWPWQVSLRTRFGMHFCGGTLISPEWVLTAAHCLEKSPRPSSYKVILGAHQEVNLEPHVQEIEVSRLFLEPTRKDIALLKLSSPAVITDKVIPACLPSPNYVVADRTECFITGWGETQGTFGAGLLKEAQLPVIENKVCNRYEFLNGRVQSTELCAGHLAGGTDSCQGDSGGPLVCFEKDKYILQGVTSWGLGCARPNKPGVYVRVSRFVTWIEGVMRNN

ヒトミディＰｌｇの例示的な核酸配列（配列番号１０）
ATGGAACACAAAGAAGTGGTGTTGCTCCTGCTGCTGTTCCTGAAGTCCGGCCAGGGCGATTGCTACCACGGCGACGGCCAGAGCTACAGAGGCACCAGCAGCACCACCACAACCGGCAAGAAGTGCCAGAGCTGGTCCTCCATGACCCCTCACCGGCACCAGAAAACCCCTGAGAATTACCCCAACGCCGGCCTGACCATGAACTACTGTAGAAATCCCGACGCCGACAAGGGACCCTGGTGCTTCACAACAGACCCTTCCGTCAGATGGGAATACTGTAATCTGAAGAAGTGCAGCGGCACCGAGGCCAGCGTGGTGGCTCCTCCACCAGTGGTGCTGCTGCCCGATGTGGAAACCCCCTCCGAAGAGGACTGTATGTTCGGCAATGGCAAGGGCTATAGAGGCAAGCGGGCCACCACCGTGACCGGCACACCTTGTCAGGATTGGGCCGCTCAGGAACCCCACAGACACAGCATCTTCACCCCAGAGACAAACCCTCGGGCCGGACTGGAAAAAAACTATTGTCGGAATCCTGACGGCGACGTGGGAGGACCTTGGTGTTATACAACAAACCCACGGAAGCTGTACGATTACTGTGACGTGCCCCAGTGTGCCGCCCCTAGCTTCGATTGTGGCAAGCCCCAGGTGGAACCCAAGAAATGCCCCGGCAGAGTCGTGGGCGGATGTGTGGCCCATCCTCACTCTTGGCCTTGGCAGGTGTCCCTGCGGACCAGATTCGGCATGCACTTTTGCGGCGGCACCCTGATCAGCCCCGAGTGGGTGCTGACAGCCGCCCACTGTCTGGAAAAGTCCCCCAGACCCAGCAGCTACAAAGTGATCCTGGGAGCCCACCAGGAAGTGAACCTGGAACCTCACGTGCAGGAAATCGAGGTGTCCAGACTGTTCCTGGAACCCACCCGGAAGGATATCGCCCTGCTGAAGCTGAGCAGCCCTGCCGTGATCACCGACAAAGTGATTCCCGCCTGCCTGCCCAGCCCCAACTATGTGGTGGCCGACAGAACCGAGTGCTTCATCACCGGCTGGGGCGAGACACAGGGCACATTTGGAGCCGGCCTGCTGAAAGAGGCCCAGCTGCCTGTGATCGAGAACAAAGTGTGCAACCGCTACGAGTTCCTGAACGGCAGAGTGCAGAGCACCGAGCTGTGTGCCGGACATCTGGCTGGCGGCACAGATAGCTGTCAGGGCGATTCTGGCGGCCCTCTCGTGTGCTTCGAGAAGGACAAGTACATCCTGCAGGGCGTGACCAGCTGGGGCCTGGGATGTGCCAGACCTAACAAGCCCGGCGTGTACGTGCGCGTGTCCAGATTTGTGACCTGGATCGAGGGCGTGATGCGGAACAACTGA

シグナルペプチドを下線で示したヒトミディＰｌｇの例示的なアミノ酸配列（配列番号１１）
MEHKEVVLLLLLFLKSGQGDCYHGDGQSYRGTSSTTTTGKKCQSWSSMTPHRHQKTPENYPNAGLTMNYCRNPDADKGPWCFTTDPSVRWEYCNLKKCSGTEASVVAPPPVVLLPDVETPSEEDCMFGNGKGYRGKRATTVTGTPCQDWAAQEPHRHSIFTPETNPRAGLEKNYCRNPDGDVGGPWCYTTNPRKLYDYCDVPQCAAPSFDCGKPQVEPKKCPGRVVGGCVAHPHSWPWQVSLRTRFGMHFCGGTLISPEWVLTAAHCLEKSPRPSSYKVILGAHQEVNLEPHVQEIEVSRLFLEPTRKDIALLKLSSPAVITDKVIPACLPSPNYVVADRTECFITGWGETQGTFGAGLLKEAQLPVIENKVCNRYEFLNGRVQSTELCAGHLAGGTDSCQGDSGGPLVCFEKDKYILQGVTSWGLGCARPNKPGVYVRVSRFVTWIEGVMRNN

ヒトミニＰｌｇの例示的な核酸配列（配列番号１２）
atggaacacaaagaagtggtgttgctcctgctgctgttcctgaagtccggccagggcgaggactgtatgttcggcaatggcaagggctatagaggcaagcgggccaccaccgtgaccggcacaccttgtcaggattgggccgctcaggaaccccacagacacagcatcttcaccccagagacaaaccctcgggccggactggaaaaaaactattgtcggaatcctgacggcgacgtgggaggaccttggtgttatacaacaaacccacggaagctgtacgattactgtgacgtgccccagtgtgccgcccctagcttcgattgtggcaagccccaggtggaacccaagaaatgccccggcagagtcgtgggcggatgtgtggcccatcctcactcttggccttggcaggtgtccctgcggaccagattcggcatgcacttttgcggcggcaccctgatcagccccgagtgggtgctgacagccgcccactgtctggaaaagtcccccagacccagcagctacaaagtgatcctgggagcccaccaggaagtgaacctggaacctcacgtgcaggaaatcgaggtgtccagactgttcctggaacccacccggaaggatatcgccctgctgaagctgagcagccctgccgtgatcaccgacaaagtgattcccgcctgcctgcccagccccaactatgtggtggccgacagaaccgagtgcttcatcaccggctggggcgagacacagggcacatttggagccggcctgctgaaagaggcccagctgcctgtgatcgagaacaaagtgtgcaaccgctacgagttcctgaacggcagagtgcagagcaccgagctgtgtgccggacatctggctggcggcacagatagctgtcagggcgattctggcggccctctcgtgtgcttcgagaaggacaagtacatcctgcagggcgtgaccagctggggcctgggatgtgccagacctaacaagcccggcgtgtacgtgcgcgtgtccagatttgtgacctggatcgagggcgtgatgcggaacaactga

シグナルペプチドを下線で示したヒトミニＰｌｇの例示的なアミノ酸配列（配列番号１３）
MEHKEVVLLLLLFLKSGQGEDCMFGNGKGYRGKRATTVTGTPCQDWAAQEPHRHSIFTPETNPRAGLEKNYCRNPDGDVGGPWCYTTNPRKLYDYCDVPQCAAPSFDCGKPQVEPKKCPGRVVGGCVAHPHSWPWQVSLRTRFGMHFCGGTLISPEWVLTAAHCLEKSPRPSSYKVILGAHQEVNLEPHVQEIEVSRLFLEPTRKDIALLKLSSPAVITDKVIPACLPSPNYVVADRTECFITGWGETQGTFGAGLLKEAQLPVIENKVCNRYEFLNGRVQSTELCAGHLAGGTDSCQGDSGGPLVCFEKDKYILQGVTSWGLGCARPNKPGVYVRVSRFVTWIEGVMRNN

ヒトマイクロＰｌｇの例示的な核酸配列（配列番号１４）
atggaacacaaagaagtggtgttgctcctgctgctgttcctgaagtccggccagggcgcccctagcttcgattgtggcaagccccaggtggaacccaagaaatgccccggcagagtcgtgggcggatgtgtggcccatcctcactcttggccttggcaggtgtccctgcggaccagattcggcatgcacttttgcggcggcaccctgatcagccccgagtgggtgctgacagccgcccactgtctggaaaagtcccccagacccagcagctacaaagtgatcctgggagcccaccaggaagtgaacctggaacctcacgtgcaggaaatcgaggtgtccagactgttcctggaacccacccggaaggatatcgccctgctgaagctgagcagccctgccgtgatcaccgacaaagtgattcccgcctgcctgcccagccccaactatgtggtggccgacagaaccgagtgcttcatcaccggctggggcgagacacagggcacatttggagccggcctgctgaaagaggcccagctgcctgtgatcgagaacaaagtgtgcaaccgctacgagttcctgaacggcagagtgcagagcaccgagctgtgtgccggacatctggctggcggcacagatagctgtcagggcgattctggcggccctctcgtgtgcttcgagaaggacaagtacatcctgcagggcgtgaccagctggggcctgggatgtgccagacctaacaagcccggcgtgtacgtgcgcgtgtccagatttgtgacctggatcgagggcgtgatgcggaacaactga

シグナルペプチドを下線で示したヒトマイクロＰｌｇの例示的なアミノ酸配列（配列番号１５）
MEHKEVVLLLLLFLKSGQGAPSFDCGKPQVEPKKCPGRVVGGCVAHPHSWPWQVSLRTRFGMHFCGGTLISPEWVLTAAHCLEKSPRPSSYKVILGAHQEVNLEPHVQEIEVSRLFLEPTRKDIALLKLSSPAVITDKVIPACLPSPNYVVADRTECFITGWGETQGTFGAGLLKEAQLPVIENKVCNRYEFLNGRVQSTELCAGHLAGGTDSCQGDSGGPLVCFEKDKYILQGVTSWGLGCARPNKPGVYVRVSRFVTWIEGVMRNN

シグナルペプチドが除去されたヒトＧｌｕ－Ｐｌｇの例示的なアミノ酸配列（配列番号１６）
EPLDDYVNTQGASLFSVTKKQLGAGSIEECAAKCEEDEEFTCRAFQYHSKEQQCVIMAENRKSSIIIRMRDVVLFEKKVYLSECKTGNGKNYRGTMSKTKNGITCQKWSSTSPHRPRFSPATHPSEGLEENYCRNPDNDPQGPWCYTTDPEKRYDYCDILECEEECMHCSGENYDGKISKTMSGLECQAWDSQSPHAHGYIPSKFPNKNLKKNYCRNPDRELRPWCFTTDPNKRWELCDIPRCTTPPPSSGPTYQCLKGTGENYRGNVAVTVSGHTCQHWSAQTPHTHNRTPENFPCKNLDENYCRNPDGKRAPWCHTTNSQVRWEYCKIPSCDSSPVSTEQLAPTAPPELTPVVQDCYHGDGQSYRGTSSTTTTGKKCQSWSSMTPHRHQKTPENYPNAGLTMNYCRNPDADKGPWCFTTDPSVRWEYCNLKKCSGTEASVVAPPPVVLLPDVETPSEEDCMFGNGKGYRGKRATTVTGTPCQDWAAQEPHRHSIFTPETNPRAGLEKNYCRNPDGDVGGPWCYTTNPRKLYDYCDVPQCAAPSFDCGKPQVEPKKCPGRVVGGCVAHPHSWPWQVSLRTRFGMHFCGGTLISPEWVLTAAHCLEKSPRPSSYKVILGAHQEVNLEPHVQEIEVSRLFLEPTRKDIALLKLSSPAVITDKVIPACLPSPNYVVADRTECFITGWGETQGTFGAGLLKEAQLPVIENKVCNRYEFLNGRVQSTELCAGHLAGGTDSCQGDSGGPLVCFEKDKYILQGVTSWGLGCARPNKPGVYVRVSRFVTWIEGVMRNN

シグナルペプチドが除去されたヒトＬｙｓ－Ｐｌｇの例示的なアミノ酸配列（配列番号１７）
KVYLSECKTGNGKNYRGTMSKTKNGITCQKWSSTSPHRPRFSPATHPSEGLEENYCRNPDNDPQGPWCYTTDPEKRYDYCDILECEEECMHCSGENYDGKISKTMSGLECQAWDSQSPHAHGYIPSKFPNKNLKKNYCRNPDRELRPWCFTTDPNKRWELCDIPRCTTPPPSSGPTYQCLKGTGENYRGNVAVTVSGHTCQHWSAQTPHTHNRTPENFPCKNLDENYCRNPDGKRAPWCHTTNSQVRWEYCKIPSCDSSPVSTEQLAPTAPPELTPVVQDCYHGDGQSYRGTSSTTTTGKKCQSWSSMTPHRHQKTPENYPNAGLTMNYCRNPDADKGPWCFTTDPSVRWEYCNLKKCSGTEASVVAPPPVVLLPDVETPSEEDCMFGNGKGYRGKRATTVTGTPCQDWAAQEPHRHSIFTPETNPRAGLEKNYCRNPDGDVGGPWCYTTNPRKLYDYCDVPQCAAPSFDCGKPQVEPKKCPGRVVGGCVAHPHSWPWQVSLRTRFGMHFCGGTLISPEWVLTAAHCLEKSPRPSSYKVILGAHQEVNLEPHVQEIEVSRLFLEPTRKDIALLKLSSPAVITDKVIPACLPSPNYVVADRTECFITGWGETQGTFGAGLLKEAQLPVIENKVCNRYEFLNGRVQSTELCAGHLAGGTDSCQGDSGGPLVCFEKDKYILQGVTSWGLGCARPNKPGVYVRVSRFVTWIEGVMRNN

ヒトミディＰｌｇの例示的なアミノ酸配列（配列番号１８）
DCYHGDGQSYRGTSSTTTTGKKCQSWSSMTPHRHQKTPENYPNAGLTMNYCRNPDADKGPWCFTTDPSVRWEYCNLKKCSGTEASVVAPPPVVLLPDVETPSEEDCMFGNGKGYRGKRATTVTGTPCQDWAAQEPHRHSIFTPETNPRAGLEKNYCRNPDGDVGGPWCYTTNPRKLYDYCDVPQCAAPSFDCGKPQVEPKKCPGRVVGGCVAHPHSWPWQVSLRTRFGMHFCGGTLISPEWVLTAAHCLEKSPRPSSYKVILGAHQEVNLEPHVQEIEVSRLFLEPTRKDIALLKLSSPAVITDKVIPACLPSPNYVVADRTECFITGWGETQGTFGAGLLKEAQLPVIENKVCNRYEFLNGRVQSTELCAGHLAGGTDSCQGDSGGPLVCFEKDKYILQGVTSWGLGCARPNKPGVYVRVSRFVTWIEGVMRNN

ヒトミニＰｌｇの例示的なアミノ酸配列（配列番号１９）
EDCMFGNGKGYRGKRATTVTGTPCQDWAAQEPHRHSIFTPETNPRAGLEKNYCRNPDGDVGGPWCYTTNPRKLYDYCDVPQCAAPSFDCGKPQVEPKKCPGRVVGGCVAHPHSWPWQVSLRTRFGMHFCGGTLISPEWVLTAAHCLEKSPRPSSYKVILGAHQEVNLEPHVQEIEVSRLFLEPTRKDIALLKLSSPAVITDKVIPACLPSPNYVVADRTECFITGWGETQGTFGAGLLKEAQLPVIENKVCNRYEFLNGRVQSTELCAGHLAGGTDSCQGDSGGPLVCFEKDKYILQGVTSWGLGCARPNKPGVYVRVSRFVTWIEGVMRNN

ヒトマイクロＰｌｇの例示的なアミノ酸配列（配列番号２０）
APSFDCGKPQVEPKKCPGRVVGGCVAHPHSWPWQVSLRTRFGMHFCGGTLISPEWVLTAAHCLEKSPRPSSYKVILGAHQEVNLEPHVQEIEVSRLFLEPTRKDIALLKLSSPAVITDKVIPACLPSPNYVVADRTECFITGWGETQGTFGAGLLKEAQLPVIENKVCNRYEFLNGRVQSTELCAGHLAGGTDSCQGDSGGPLVCFEKDKYILQGVTSWGLGCARPNKPGVYVRVSRFVTWIEGVMRNN

Claims (34)

1. プラスミノゲンをするための方法であって、
   （ｉ）プラスミノゲンをコードする第１の組換えポリヌクレオチドおよびプラスミノゲン活性化因子阻害剤－１（PAI-1）をコードする第２の組換えポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供する工程；
   （ｉｉ）好適な培養培地中で、第１のポリヌクレオチドからプラスミノゲンを、第２のポリヌクレオチドからＰＡＩ－１を発現させる条件下で、前記宿主細胞を培養する工程
   を含む、方法。
2. 組換えプラスミノゲンを生産する方法であって、
   （ａ）プラスミノゲンをコードする第１のポリヌクレオチドを提供する工程、
   （ｂ）ＰＡＩ－１をコードする第２のポリヌクレオチドを提供する工程であって、
   第１および第２のポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの発現を可能にするためにプロモーターに作動可能に連結されている、工程、
   （ｃ）宿主細胞を提供する工程、
   （ｄ）宿主細胞を、（ａ）および（ｂ）のポリヌクレオチドで形質転換またはトランスフェクトする工程、
   （ｅ）細胞培養培地を提供する工程、
   （ｆ）細胞培養培地中で、プラスミノゲンおよびＰＡＩ－１の発現に十分な条件下で、形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞を培養する工程、ならびに
   任意選択で（ｇ）宿主細胞および／または細胞培養培地からプラスミノゲンを回収または精製する工程
   を含む、方法。
3. 第１および第２のポリヌクレオチドが、単一のベクター中に提供される、請求項１または２に記載の方法。
4. 第１および第２のポリヌクレオチドが、別々のベクター中に提供される、請求項１または２に記載の方法。
5. 各ベクターが、他方のベクターと異なるタイプの選択マーカーを有する、請求項４に記載の方法。
6. ＰＡＩ－１を培養培地に混合する工程をさらに含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
7. プラスミノゲンを生産するための方法であって、
   （ｉ）プラスミノゲンをコードする組換えポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供する工程；
   （ｉｉ）好適な培養培地中で、ポリヌクレオチドからプラスミノゲンを発現させる条件下で、前記宿主細胞を培養する工程
   を含み、
   培養培地は、ＰＡＩ－１を含む、方法。
8. 組換えプラスミノゲンを生産する方法であって、
   （ａ）プラスミノゲンをコードするポリヌクレオチドを提供する工程であって、
   ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの発現を可能にするためにプロモーターに作動可能に連結されている、工程、
   （ｃ）宿主細胞を提供する工程、
   （ｄ）宿主細胞を、（ａ）のポリヌクレオチドで形質転換またはトランスフェクトする工程、
   （ｅ）ＰＡＩ－１を含む細胞培養培地を提供する工程、
   （ｆ）細胞培養培地中で、プラスミノゲンの発現に十分な条件下で、形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞を培養する工程、ならびに
   任意選択で（ｇ）宿主細胞および／または細胞培養培地からプラスミノゲンを回収または精製する工程
   を含む、方法。
9. プラスミノゲンが、本明細書に記載されるＧｌｕ－Ｐｌｇ、Ｌｙｓ－Ｐｌｇ、ミディＰｌｇ、ミニＰｌｇおよびマイクロＰｌｇからなる群から選択される、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
10. プラスミノゲンをコードするポリヌクレオチドが、配列番号１、５、６、８、１０、１２または１４のいずれか１つに記載の核酸配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
11. プラスミノゲンをコードするポリヌクレオチドが、配列番号１、５、６、８、１０、１２または１４のいずれか１つに記載の配列と少なくとも７５％の配列同一性を有する核酸配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
12. プラスミノゲンが、配列番号２、７、９、１１、１３、１５、１６、１７、１８、１９または２０のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含む、それからなる、もしくはそれから本質的になるか、または配列番号２、７、９、１３、１５、１６、１７、１８、１９または２０のいずれか１つに記載のアミノ酸配列と少なくとも７５％同一な配列を有する、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
13. ＰＡＩ－１をコードするポリヌクレオチドが、配列番号３の核酸配列を含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
14. ＰＡＩ－１をコードするポリヌクレオチドが、配列番号３に記載の配列と少なくとも７５％の同一性を有する核酸配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
15. ＰＡＩ－１が、配列番号４に示されるアミノ酸配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
16. 第１および第２のポリヌクレオチド（すなわち、プラスミノゲンおよびＰＡＩ－１をコードするポリヌクレオチド）が、単一のポリヌクレオチド構築物中に提供され、単一のポリヌクレオチド構築物は、配列番号５に示される核酸配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
17. 単一のポリヌクレオチド構築物が、配列番号５に記載の配列と少なくとも７５％の配列同一性を有する核酸配列を含む、請求項１６に記載の方法。
18. 宿主細胞が、哺乳類細胞である、請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法。
19. 哺乳類細胞が、Ｅｘｐｉ２９３、Ｅｘｐｉ２９３のバリアント、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）、ＨｅＬａ、ＣＯＳまたはＶｅｒｏ細胞からなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
20. プラスミノゲンをコードする第１のポリヌクレオチド配列およびＰＡＩ－１をコードする第２のポリヌクレオチド配列を含む、ベクターまたは核酸構築物。
21. 第１および第２のポリヌクレオチドが、ポリヌクレオチドの発現を可能にするためにプロモーターに作動可能に連結されている、請求項２０に記載のベクターまたは核酸構築物。
22. 第１のポリヌクレオチド配列が、Ｇｌｕ－Ｐｌｇ、Ｌｙｓ－Ｐｌｇ、ミディＰｌｇ、ミニＰｌｇおよびマイクロＰｌｇからなる群から選択されるプラスミノゲンをコードする、請求項２０または２１に記載のベクターまたは核酸構築物。
23. プラスミノゲンをコードするポリヌクレオチドが、配列番号１、５、６、８、１０、１２または１４のいずれか１つに記載の核酸配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる、請求項２０から２２のいずれか一項に記載のベクターまたは核酸構築物。
24. プラスミノゲンをコードするポリヌクレオチドが、配列番号１、５、６、８、１０、１２または１４に記載の配列と少なくとも７５％の配列同一性を有する核酸配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる、請求項２０から２３のいずれか一項に記載のベクターまたは核酸構築物。
25. プラスミノゲンが、配列番号２、７、９、１１、１３、１５、１６、１７、１８、１９または２０のいずれか１つに記載のアミノ酸配列と少なくとも７５％同一なアミノ酸配列を含む、それから本質的になる、またはそれを有する、請求項２０から２３のいずれか一項に記載のベクターまたは核酸構築物。
26. ＰＡＩ－１をコードするポリヌクレオチドが、配列番号３の核酸配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる、請求項２０から２５のいずれか一項に記載のベクターまたは核酸構築物。
27. ＰＡＩ－１をコードするポリヌクレオチドが、配列番号３に記載の配列と少なくとも７５％の同一性を有する核酸配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる、請求項２０から２５のいずれか一項に記載のベクターまたは核酸構築物。
28. ベクターが、配列番号４に示されるアミノ酸配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になるＰＡＩ－１をコードする、請求項２７に記載のベクターまたは核酸構築物。
29. ベクターが、配列番号５に示される核酸配列を含む、請求項２０または２１に記載のベクターまたは核酸構築物。
30. ベクターが、配列番号５に記載の配列と少なくとも７５％の配列同一性を有する核酸配列を含む、請求項２０または２１に記載のベクターまたは核酸構築物。
31. 請求項２０から３０のいずれか一項に記載のベクターまたは核酸構築物を含む宿主細胞。
32. 請求項１から１９のいずれか一項に記載の方法によって生産された、単離された、精製された、実質的に精製された、または組換えプラスミノゲン。
33. 請求項１から１９のいずれか一項に記載の方法によって生産された組換えプラスミノゲンから得られた、単離された、精製された、実質的に精製された、または組換えプラスミン。
34. 請求項１から１９のいずれか一項に記載の方法からの培養培地から単離された、精製された、または実質的に精製されたプラスミノゲンおよびプラスミノゲン活性化阻害剤を含む組成物。
    

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