DE69105213T2

DE69105213T2 - Substitutionsvariante des gewebeplasminogenaktivators.

Info

Publication number: DE69105213T2
Application number: DE69105213T
Authority: DE
Inventors: William F. Iii San Mateo Ca 94403 Bennett
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1990-12-18
Filing date: 1991-12-16
Publication date: 1995-05-18
Anticipated expiration: 2011-12-17
Also published as: AU9171491A; CA2096851C; EP0563280B1; GR3015094T3; DE69105213D1; ATE114170T1; ES2067326T3; EP0563280A1; WO1992011377A1; JP2532193B2; DK0563280T3; AU649765B2; JPH06502544A; CA2096851A1

Description

I. Gebiet der Erfindung

Diese Erfindung richtet sich auf eine besondere Variante des Gewebeplasminogenaktivators ("tissue plasminogen activator", t-PA), Verfahren zur Herstellung der Variante und Verfahren und Zusammensetzungen, die diese Variante in pharmazeutischen Zusammensetzungen anwenden.

II. Beschreibung des Hintergrundstands der Technik und des verwandten Stands der Technik

Plasminogenaktivatoren sind Enzyme, die die Peptidbindung von Plasminogen zwischen den Aminosäureresten 561 und 562 spalten, wobei sie es in Plasmin umwandeln. Plasmin ist eine aktive Serin-Protease, die verschiedene Proteine, einschließlich Fibrin, abbaut. Es wurden verschiedene Plasminogenaktivatoren identifiziert, einschließlich Streptokinase (ein bakterielles Protein), Urokinase (in der Niere und anderswo synthetisiert und ursprünglich aus Harn extrahiert) und menschlichen Gewebeplasminogenaktivator, t-PA genannt (von die Blutgefäßwände auskleidenden Zellen produziert).
Die Art der Wirkung jedes dieser Plasminogenaktivatoren ist etwas unterschiedlich. Streptokinase bildet einen Komplex mit Plasminogen oder Plasmin, wobei plasmin-aktivierende Wirkung erzielt wird, Urokinase spaltet Plasmin direkt, und t-PA steht zur optimalen Aktivität sowohl mit Plasminogen als auch mit Fibrin in Wechselwirkung.
Teilweise wegen seiner hohen Fibrinspezifität und starken Fähigkeit, Blutgerinnsel in vivo zu aufzulösen, wurde t-PA als ein wichtiges, neues, biologisches Pharmazeutikum zur Behandlung von vasku lären Erkrankungen, wie Myokardinfarkt, identifiziert.
Eine im wesentlichen reine Form von t-PA wurde zuerst aus einer natürlichen Quelle produziert und auf in vivo-Aktivität von Collen et al., US-A4.752.603, ausgegeben am 21. Juni 1988 (siehe auch Rijken et al., J. Biol. Chem., 256: 7035 [1981]) getestet. Pennica et al. (Nature, 301: 214 [1983]) bestimmten die DNA-Sequenz von t-PA und leiteten die Aminosäuresequenz von dieser DNA-Sequenz ab (siehe US-A- 4.766.075, ausgegeben am 23. August 1988).
Menschlicher, nativer t-PA besitzt potentielle, N-gebundene Glykosylierungsstellen an den Aminosäurepositionen 117, 184, 218 und 448. Ein mannosereiches Oligosaccharid befindet sich an Position 117 und ein komplexes Oligosaccharid an den Positionen 184 und 448. Die Stellen 117 und 448 scheinen immer glykosyliert zu sein, während Stelle 184 vermutlich in etwa 50% der Moleküle glykosyliert ist. Das partielle Glykosylierungsmuster an Position 184 kann daher rühren, daß sich Stelle 184 in keinem exponierten Bereich des Moleküls befindet. Die T-PA- Moleküle, die an Position 184 glykosyliert sind, werden Typ I-t-PA genannt, und jene an Position 184 nicht glykosylierten Typ II-t-PA. Position 218 erwies sich als in nativem t- PA nicht glykosyliert.
Forschungen hinsichtlich der Struktur von t-PA identifizierten fünf Domänen am Molekül. Jede Domäne wurde unter Bezugnahme auf homologe strukturelle oder funktionelle Bereiche in anderen Proteinen, wie Trypsin, Chymotrypsin, Plasminogen, Prothrombin, Fibronectin und epidermalem Wachstumsfaktor ("epidermal growth factor", EGF), definiert. Diese Domänen wurden, beginnend am N-Terminus der Aminosäuresequenz von t-PA, als Finger-Domäne (F) von Aminosäure 1 bis etwa 44, Wachstumsfaktor-Domäne (G), etwa von Aminosäuren 45 - 91 (auf Basis der Homologie zu EGF), Kringle-1-Domäne (K1) etwa von Aminosäure 92 - 173, Kringle-2-Domäne etwa von Aminosäure 180 - 261 und Serinprotease-Domäne (P) etwa von Aminosäure 264 bis zum Carboxylterminus bei Aminosäure 527, bezeichnet. Diese Domänen grenzen im wesentlichen aneinander, und manche sind durch kurze "Linker"-Bereiche verbunden. Diese Linkerbereiche bringen die Aminosäurengesamtanzahl des reifen Polypeptids auf 527, obwohl drei zusätzliche Reste (Gly-Ala-Arg) am Aminoterminus gefunden werden können und wahrscheinlich das Ergebnis unvollständiger Vorläuferverarbeitung des Moleküls sind.
jede Domäne verleiht dem t-PA-Molekül vermutlich gewisse biologisch signifikante Eigenschaften. Die Finger-Domäne wird für wichtig für die hohe Bindungsaffinität von t-PA zu Fibrin gehalten. Strukturdeterminanten für die Plasma- Clearance befinden sich vermutlich an der Finger-, der Wachstumsfaktor- und der Kringle-1-Domäne. Die Kringle-2-Domäne ist verantwortlich für die Bindung an Lysin. Die Serinprotease-Domäne ist verantwortlich für die enzymatische Aktivität von t-PA und die Fibrinspezifität. Der t-PA kann zwischen Position 275 und Position 276 (in der Serinprotease-Domäne) gespalten werden, um die zweikettige Form des Moleküls zu erzeugen.
Es wurden t-PA-Varianten mit verringerter Clearance durch Löschung individueller Aminosäuren, Domänenteile oder vollständiger Domänen aus dem Molekül hergestellt. Beispielsweise ergibt Entfernung eines Teils der oder der gesamten Finger-Domäne von t-PA, wie in US-A4.935.237 (ausgegeben am 19. Juni 1990) beschrieben, ein Molekül mit verringeter Clearance, obwohl es wesentlich verminderte Fibrinbindungseigenschaften aufweist. Browne et al. (J. Biol. Chem., 263:1599 [1988]) löschten den Bereich zwischen den Aminosäuren 57 und 81 und stellten fest, daß die resultierende Variante eine langsamere Clearance aus dem Plasma besaß. Collen et al. (Blood, 71: 216 [1988]) löschten die Aminosäuren 6 - 86 (Teil der Finger- und der Wachstums-Domäne) und entdeckten, daß dieser Mutant eine Halbwertszeit in Hasen von 15 min, im Vergleich zu 5 min für Wildtyp-t-PA, aufwies. In ähnlicher Weise löschten Kaylan et al. (J. Biol. Chem., 263: 3971 [1988]) die Aminosäuren 1 - 89 und entdeckten, daß dieser Mutant eine Halbwertszeit in Mäusen von 15 min, im Vergleich zu 2 min für Wildtyp-t-PA, aufwies. Cambier et al. (J. Cardiovasc. Pharmacol., 11: 468 [1988]) konstruierten eine Variante mit gelöschter Finger- und Wachstums-Domäne und in der die drei Asparagin-Glykosylierungsstellen entfernt waren. Diese Variante besaß bei Tests in Hunden eine längere Halbwertszeit als Wildtyp-t-PA. Bei Varianten mit lediglich gelöschter Wachstumsfaktor- oder Finger-Domäne wurden ebenfalls verminderte Clearance-Raten in Hasen, Meerschweinchen und Ratten aufgezeigt (Higgins und Bennett, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol., 30: 91 [1990] und Verweise darin).
Verschiedene Löschungen im Wachstumsfaktor-Bereich wurden auch in der Patentliteratur berichtet. Siehe EP-A-241.208 (Löschung der Aminosäuren 51 - 87 und 51 - 173). Siehe auch EP-A-240.334, das die Modifikation von reifem, nativem t-PA in Bereich der der Aminosäuren 67 - 69 durch Löschung oder Substitution einer oder mehrerer Aminosäuren beschreibt.
Andere Mittel zur Verbesserung der Clearance-Rate und/oder Halbwertszeit von t-PA bestanden in der Komplexierung des t-PA-Moleküls mit einem zweiten Molekül. Es wurde beispielsweise in EP-A-304.311 (veröffentlicht am 22. Februar 1989) berichtet, daß ein t-PA-Polyethylenglykol-Konjugat die Clearance-Rate von t-PA erhöht. Es wurde berichtet, daß ein monoklonaler Antikörper für t-PA die funktionelle Halbwertszeit von t-PA in vivo erhöht, ohne seine Aktivität zu verringern (siehe EP-A-339.505, veröffentlicht am 2. November 1989).
Es wurde eine Vielzahl von aminosäuresubstituierten t-PA-Varianten auf ihre Fähigkeit, die Clearance-Rate zu vermindern oder die Halbwertszeit von t-PA zu erhöhen, untersucht. Die Variante R275E (wo Arginin an Position 275 von nativem, reifem t-PA durch Glutaminsäure substituiert wurde) zeigte bei Tests in Primaten und Hasen eine etwa halb so schnelle Clearance-Rate als jene von Wildtyp-t-PA (Hotchkiss et al., Thromb. Haemost., 58: 491 [1987]). Substitutionen im Bereich der der Aminosäuren 63 - 72 von reifem, nativem t-PA und besonders an den Positionen 67 und 68 erhöhen die Plasma-Halbwertszeit von t-PA (siehe WO 89/12681, veröffentlicht am 28. Dezember 1989).
Die Produktion anderer Substitutionsvarianten konzentrierte sich auf die Umwandlung der Glykosylierungsstellen von t-PA zu Nicht-Glykosylierungsstellen. Hotchkiss et al. (Thromb. Haemost., 60: 255 [1988]) entfernten selektiv Oligosaccharidreste aus dem t-PA-Molekül und zeigten, daß die Entfernung dieser Reste die Clearance-Rate von t-PA bei Tests in Hasen verminderte. Die Entfernung des mannosereichen Oligosaccharids an Position 117, unter Verwendung von des Enzyms Endo-β-N-acetylglukosaminidase H (Endo-H) führte zu einer etwa 2fach verminderten Clearance-Rate. Die Oxidation beinahe aller Oligosaccharidreste unter Verwendung von Natriumperjodat führte zu einer gegenüber Wildtyp-t-PA etwa 3fach verminderten Clearance-Rate. Diese Forscher erzeugten auch die t-PA-Variante N117Q (worin Asparagin an Position 117 des nativen, reifen t-PAs durch Glutamin ersetzt wurde), um Glykosylierung an Position 117 zu verhindern. Die Clearance-Rate dieser Variante war niedriger als jene von Wildtyp-t-PA. Siehe auch EP-A-238.304, veröffentlicht am 23. September 1987, und EP-A-227.462, veröffentlicht am 1. juli 1987.
Ein zusätzlicher Ansatz, t-PA-Varianten mit verlängerter Halbwertszeit im Kreislauf und langsamerer Clearance zu produzieren, bestand darin, an das Molekül Glykosylierungsstellen zu addieren. Als Beispiele für diesen Ansatz wurden die Positionen 60, 64, 63, 66, 67, 78, 79, 80, 81, 82 und 103 mit geeigneten Aminosäuren substituiert, um Moleküle mit Glykosylierungsstellen an diesen oder nahe mancher dieser Reste zu erzeugen (siehe WO 89/11531, veröffentlicht am 30. November 1989).
Andere Schlüsselpositionen für die Modifikation des menschlichen t-PA-Moleküls befinden sich durchwegs in der Protease-Domäne und umfassen beispielsweise Position 275 (EP-A-233.013, veröffentlicht am 19. August 1987, und WO 87/04722, veröffentlicht am 13. August 1987), Position 277 (EP-A-297.066, veröffentlicht am 28. Dezember 1988; WO 86/01538 (entspricht US-A-4.753.879); und EP-A-201.153, veröffentlicht am 12. November 1986), die Positionen 414 - 433 (EP-A-351.246, veröffentlicht am 17. Jänner 1990) und die Positionen 296 - 299, 416 - 418 und 426, 427, 429, 430 (WO 90/02798, veröffentlicht am 22. März 1990). Obwohl die Mutationen, die den gesamten Bereich 296 - 299 miteinbeziehen, dem t-PA-Molekül gewisse wünschenswerte Eigenschaften, wie Fibrinspezifität und Zymogenität, verleihen, wäre es nützlich, ein Molekül mit noch höherer Fibrinspezifität zu erhalten. Serpin-resistente Mutanten von menschlichem t-PA mit Veränderungen in der Protease- Domäne, einschließlich d296-302 t-PA, R304S t-PA und R304E t-PA, werden in Madison et al., Nature, 339: 721-724 (1989) beschrieben; siehe auch den Begleitartikel von Dagmar Ringe in derselben Ausgabe.
EP-A-253.582 (Wallen) beschreibt einen modifizierten t-PA, der nach Spaltung an einer oder mehreren Positionen von Cys(409) bis Cys(441) zymogene Eigenschaften aufweist. Die Spaltung kann durch proteolytische oder geeignete chemische Behandlung von einkettigem, menschlichem t-PA vorzugsweise durch Chymotrypsin erfolgen. Das gespaltene Molekül ist anschließend in der Lage, in Gegenwart von Plasmin aktiviert zu werden, wobei ein doppelt gespaltenes Produkt gebildet wird.
WO 84/01960 (Smith et al.) richtet sich auf das Blockieren einer katalytischen Stelle, die als wichtig für die fibrinolytische Aktivität eines fibrinolytisch wirksamen Glykoproteins erachtet wird, durch Einbringung gewisser Gruppen, wie z.B. Acyl- Gruppen.
Ein allgemeiner Bericht über Plasminogenaktivatoren und deren Derivate der zweiten Generation findet sich bei Harris, Protein Engineering, 1: 449458 (1987). Andere Berichte über t-PA-Varianten umfassen Pannekoek et al., FibrinoLyse, 2: 123- 132 (1988), Ross et al., in Annual Reports in Medicinal Chemistry, Bd. 23, Kapitel 12 (1988) und Higgins und Bennett, siehe oben.
Es wäre wünschenswert, ein t-PA-Molekül bereitzustellen, das bezogen auf Wildtyp-t-PA eine höhere Gerinnsellyse-Aktivität und gleichzeitig gleiche oder bessere Fibrinspezifität besitzt.
Dementsprechend ist es ein Ziel dieser Erfindung, t-PA-Moleküle bereitzustellen, die drastisch verbesserte therapeutische und pharmazeutische Eigenschaften hinsichtlich Gerinnsellyse-Aktivität und Fibrinselektivität aufweisen.
Dieses und andere Ziele werden dem Fachmann verständlich sein.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Daher sieht diese Erfindung eine t-PA-Aminosäuresequenz-Variante mit einer Substitution von Arginin an Position 299 des Wildtyp-t-PAs durch Asparaginsäure vor.
In anderen Ausführungsformen betrifft die Erfindung eine DNA-Sequenz, die für die eben beschriebene Variante kodiert, replikable Expressionsvektoren, die zum Exprimieren dieser DNA-Sequenz in einer transformierten Wirtszelle fähig sind, transformierte Wirtszellen und ein Verfahren, umfassend das Kultivieren der Wirtszellen, um die für die t-PA-Variante kodierende DNA zu exprimieren.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung eine Zusammensetzung zur Behandlung eines vaskulären Zustands oder Erkrankung, umfassend eine therapeutisch wirksame Menge der t-PA-Variante in Mischung mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger.
In noch einer weiteren Ausführungsform beschreibt die Erfindung eine t-PA- Variante zur Verwendung in einem Behandlungsverfahren. In einer weiteren Ausführungsform beschreibt die Erfindung die Verwendung einer t-PA-Variante bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines vaskulären Zustands oder Erkrankung bei einem Säugetier.
In noch einer weiteren Ausführungsform sieht die Erfindung eine Zusammensetzung zum Verhindern von Fibrinablagerung oder Adhäsionsbildung oder - wiederbildung, umfassend eine therapeutisch wirksame Menge der t-PA-Variante in Mischung mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger, vor.
In einer anderen Ausführungsform beschreibt die Erfindung die Verwendung einer t-PA-Variante bei der Herstellung eines Medikaments zum Verhindern von Fibrinablagerung oder Adhäsionsbildung oder -wiederbildung in einem Säugetier.

KURZE BESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN

Figur stellt die Konstruktion von pRK.t-PA grafisch dar. Die menschliche t-PA- cDNA wurde mit HindIII und Ball digeriert und in den eukaryotischen Expressionsvektor pRK7 zwischen den HindIII- und Smal-Stellen eingefügt.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

1. DEFINITIONEN

Die Ausdrücke "t-PA", "menschlicher t-PA" und "menschlicher Gewebeplasminogenaktivator" bezeichnen menschlichen, extrinsischen (Gewebetyp)- Plasminogenaktivator mit fibrinolytischer Aktivität, der typischerweise eine Struktur mit fünf Domänen (Finger-, Wachstumsfaktor-, Kringle-1-, Kringle-2- und Protease-Domäne) besitzt, aber trotzdem auch weniger Domänen aufweisen kann, solange er weiterhin als thrombolytischer Wirkstoff wirkt. Der t-PA besteht zumindest aus zwei funktionellen Bereichen, bestehend aus einer Protease-Domäne, die zur Umwandlung von Plasminogen in Plasmin fähig ist, und einem N-terminalen Bereich, der vermutlich zumindest teilweise für die Fibrinbindung verantwortlich ist. Diese Ausdrücke umfassen daher Polypeptide, die diese funktionellen Domänen als Teil der Aminosäuresequenz des Polypeptids enthalten. Biologisch aktive Formen von t-PA können durch rekombinante Zellkultursysteme in Formen produziert werden, die die beiden funktionellen Bereiche des Moleküls und alle anderen, ansonsten für den Ursprung des t-PAs nativen Abschnitte von t-PA umfassen. Es ist verständlich, daß natürliche, allelische Variationen existieren und bei Individuen vorkommen können, wie durch eine oder mehrere Aminosäurenunterschiede in der Aminosäuresequenz des t-PAs jedes Individuums gezeigt wird.
Die Ausdrücke "Wildtyp-t-PA" und "nativer t-PA" beziehen sich auf menschlichen t-PA mit nativer Sequenz, d.h. jenen, der durch die in US-A-4.766.075, ausgegeben am 23. August 1988, berichtete cDNA-Sequenz kodiert wird. Die Nummern der Aminosäurestellen oder -positionen im t-PA-Molekül sind gemäß US-A- 4.766.075 markiert. Der t-PA kann aus jedem nativen Ursprung stammen und inkludiert die entsprechenden Proteine verschiedener Tiere, wie z.B. Menschen. Außerdem kann der t-PA aus jedem rekombinaten Expressionssystem erhalten werden, z.B. einschließlich Eierstockzellen des chinesischen hamsters ("Chinese hamster ovary", CHO) oder Nierenzellen 293 von menschlichen Embryos.
Die Ausdrücke "Aminosäure" und "Aminosäuren" beziehen sich auf alle natürlich vorkommenden L-α-Aminosäuren. Das heißt, daß diese Definition Norleucin, Ornithin und Homocystein inkludiert. Die Aminosäuren werden entweder durch Einzel- oder Dreibuchstaben-Definitonen identifiziert:
Asp D Asparaginsäure Ile I Isoleucin
Thr T Threonin Leu L Leucin
Ser S Serin Tyr Y Tyrosin
Glu E Glutaminsäure Phe F Phenylalanin
Pro P Prolin His H Histidin
Gly G Glycin Lys K Lysin
Ala A Alanin Arg R Arginin
Cys C Cystein Trp W Tryptophan
Val V Valin Gln Q Glutamin
Met M Methionin Asn N Asparagin
Diese Aminosäuren können nach chemischer Zusammensetzung und Eigenschaften ihrer Seitenketten klassifiziert werden. Sie werden grob in zwei Gruppen eingeteilt, geladene und ungeladene. jede dieser Gruppen wird in Untergruppen unterteilt, um die Aminosäuren genauer zu klassifizieren:

I. Geladene Aminosäuren

Saure Reste: Asparaginsäure, Glutaminsäure
Basische Reste: Lysin, Arginin, Histidin

II. Ungeladene Aminosäuren

Hydrophile Reste: Serin, Threonin, Asparagin, Glutamin
Aliphatische Reste: Glycin, Aianin, Valin, Leucin, Isoleucin
Nichtpolare Reste: Cystein, Methionin, Prolin
Aromatische Reste: Phenylalanin, Tyrosin, Tryptophan
Die Ausdrücke "Änderung", "Aminosäuresequenzänderung", "Variante" und "Aminosäuresequenz-Variante" beziehen sich auf t-PA-Moleküle mit gewissen Unterschieden in ihren Aminosäuresequenzen, im Vergleich zum nativen t-PA. Normalerweise besitzen die Varianten zumindest 80% Homologie mit nativem t-PA, und vorzugsweise sind sie zumindest zu 90% homolog mit nativem t-PA. Die Aminosäuresequenz-Varianten von t-PA, die in den Bereich dieser Erfindung fallen, besitzen eine Substitution an Position 299 und wahlweise auch Substitutionen, Löschungen und/oder Einfügungen an gewissen anderen Positionen.
t-PA-Substitutionsvarianten sind jene, wo zumindest ein Aminosäurerest aus der nativen t-PA-Sequenz entfernt und eine unterschiedliche Aminosäure an seiner Stelle an derselben Position eingefügt wurde. Die Substitutionen können einzeln, falls nur eine Aminosäure im Molekül substituiert wurde, oder mehrfach auftreten, falls zwei oder mehrere Aminosäuren im selben Molekül substituiert wurden.
Wesentliche Änderungen der Aktivität des t-PA-Moleküls können durch Substituieren einer Aminosäure mit einer Seitenkette erzielt werden, die sich in ihrer Ladung und/oder Struktur wesentlich von der nativen Aminosäure unterscheidet. Dieser Substitutionstyp beeinflußt erwartungsgemäß die Struktur des Polypeptid-Rückgrats und/oder die Ladung oder Hydrophobie des Moleküls in der Größenordnung der Substitution.
Mäßige Änderungen der Aktivität des t-PA-Moleküls werden von Substitution einer Aminosäure mit einer Seitenkette, die in Ladung und/oder Struktur ähnlich zu jener des nativen Moleküls ist, erwartet. Dieser Substitutionstyp, als konservative Substitution bezeichnet, ändert erwartungsgemäß weder die Struktur des Polypeptid- Rückgrats noch die Ladung noch die Hydrophobie des Moleküls in der Größenordnung der Substitution wesentlich.
T-PA-Einfügungsvarianten sind jene, wo eine oder mehrere Aminosäuren unmittelbar benachbart zu einer Aminosäure an einer speziellen Position im nativen t- PA-Molekül eingefügt werden. Unmittelbar benachbart zu einer Aminosäure bedeutet entweder mit der funktionellen α-Carboxy- oder α-Aminogruppe der Aminosäure verbunden. Die Einfügung kann eine oder mehrere Aminosäuren umfassen. Normalerweise besteht die Einfügung aus einer oder zwei konservativen Aminosäuren. Aminosäuren, die bezüglich Ladung und/oder Struktur den der Einfügungsstelle benachbarten Aminosäuren ähnlich sind, werden als konservativ definiert. Alternativ umfaßt diese Erfindung das Einfügen einer Aminosäure mit einer Ladung und/oder Struktur, die sich wesentlich von den zur Einfügungsstelle benachbarten Aminosäuren unterscheidet.
Löschungsvarianten sind jene, wo eine oder mehrere Aminosäuren aus dem nativen t-PA-Molekül entfernt wurden. Normalerweise weisen Löschungsvarianten eine oder zwei gelöschte Aminosäuren in einem speziellen Bereich des t-PA-Moleküls auf.
Die in dieser Anmeldung durchwegs verwendeten Bezeichnungen zur Beschreibung von t-PA-Aminosäuresequenz-Varianten werden nachfolgend beschrieben. Die Lage einer speziellen Aminosäure in der Polypeptidkette von t-PA wird durch eine Zahl angegeben. Die Zahl bezieht sich auf die Aminosäureposition in der Aminosäuresequenz des reifen, menschlichen t-PA-Polypeptids, wie in US-A- 4.766.075, ausgegeben am 23. August 1988, beschrieben. In der vorliegenden Anmeldung werden auch gleich positionierte Reste in t-PA-Varianten mit diesen Zahlen bezeichnet, obwohl die tatsächliche Nummer des Restes durch Löschungen oder Einfügungen im Molekül der vorhergehenden nicht mehr entspricht. Dies passiert beispielsweise bei stellen-gerichteten Löschungs- oder Einfügungsvarianten. Die Aminosäuren werden unter Verwendung des Einbuchstaben-Kodes identifiziert. Substituierte Aminosäuren werden durch Anführen der Wildtyp-Aminosäure links von der Zahl, die die Position dieser Aminosäure in der Polypeptidkette angibt, und Anführen der substituierten Aminosäure an der rechten Seite der Zahl bezeichnet.
Beispielsweise wird Ersetzen der Aminosäure Arginin (R) an Position 299 von t- PA durch Asparaginsäure (D) mit R299D bezeichnet. Löschungsvarianten werden identifiziert, indem Aminosäurerest und -position an jedem Ende der Löschung angegeben und der griechische Buchstabe "Δ" links vor die angegebenen Aminosäuren gestellt wird. Beispielsweise wird eine t-PA-Variante, die eine Löschung der Aminosäuren 296-299 aufweist, als AK296-H297-R298-R299-t-PA bezeichnet, wobei K, H und R die Aminosäuren Lysin, Histidin bzw. Argin in sind. Löschung einer einzelnen Aminosäure, beispielsweise K296, wird mit AK296 bezeichnet. t-PA- Einfügungsvarianten werden unter Verwendung von Klammern "[]" um die eingefügten Aminosäuren und die Lage der Einfügung durch Angabe der Position der Aminosäure an beiden Enden der Einfügung bezeichnet. Beispielsweise wird eine Einfügung der Aminosäure Alanin (A) zwischen Glutaminsäure an Position 94 und Asparaginsäure an Position 95 mit E94[A]D95 angegeben. Zum leichteren Lesen wird ein Beistrich "," verwendet, um mehrere in einem einzigen Molekül vorkommende Mutationen zu trennen, und ein Strichpunkt ";", um einzelne Moleküle von konstruierten t-PA- Varianten zu trennen, falls mehrere Moleküle von t-PA-Varianten gemeinsam aufgelistet werden.
Der Ausdruck "Gerinnsellyse-Aktivität" bezieht sich auf die Aktivität eines t-PA- Moleküls zur Lyse eines Gerinnsels, entweder aus gereinigtem Fibrin oder aus Plasma stammend, unter Anwendung des nachfolgend beschriebenen Assays.
Die Ausdrücke "kodierende DNA-Sequenz", "kodierende DNA" und "kodierende Nukleinsäure" beziehen sich auf die Anordnung oder Sequenz von Desoxyribonukleotiden entlang eines Strangs aus Desoxyribonukleinsäure. Die Reihenfolge dieser Desoxyribonukleotide bestimmt die Reihenfolge von Aminosäuren entlang der Polypeptidkette. Die DNA-Sequenz kodiert daher für die Aminosäuresequenz.
Die Ausdrücke "replikabler Expressionsvektor" und "Expressionsvektor" beziehen sich auf ein Stück DNA, üblicherweise doppel-strangig, das in sich eingefügt ein Stück Fremd-DNA enthalten kann. Fremd-DNA wird als heterologe DNA definiert, was einer in der Wirtszelle nicht natürlich enthaltenen DNA entspricht. Der Vektor wird verwendet, um die Fremd- oder heterologe DNA in eine geeignete Wirtszelle zu transportieren. Sobald er sich in der Wirtszelle befindet, kann sich der Vektor unabhängig von der chromosomalen Wirts-DNA replizieren, und es können mehrere Kopien des Vektors und seiner eingefügten (Fremd-) DNA erzeugt werden. Zusätzlich enthält der Vektor die notwendigen Elemente, die die Translation der Fremd-DNA in Polypeptid ermöglichen. So können viele Moleküle des Polypeptids, für das die Fremd- DNA kodiert, rasch synthetisiert werden.
Die Ausdrücke "transformierte Wirtszelle" und "transformiert" beziehen sich auf die Einbringung von DNA in eine Zelle. Die Zelle wird "Wirtszelle" genannt und kann eine prokarvotische oder eukaryotische Zelle sein. Typische prokarvotische Wirtszellen umfassen verschiedene Stämme von E.coli. Typische eukaryotische Wirtszellen sind Säugetierzellen, wie z.B. CHO-Zellen oder Nierenzellen 293 von menschlichen Embryos. Die eingebrachte DNA liegt üblicherweise in Form eines Vektors vor, der ein eingefügtes Stück DNA enthält. Die eingebrachte DNA-Sequenz kann von derselben Spezies wie die Wirtszelle oder von einer von jener verschiedenen Spezies stammen, oder sie kann eine DNA-Hybridsequenz sein, die etwas Fremd- und etwas homologe DNA enthält.

II. ALLGEMEINE VERFAHREN

A. Selektion von Varianten

Die Variante dieser Erfindung besitzt notwendigerweise eine Asparaginsäure an Position 299 anstelle von Arginin an dieser Position in Wildtyp-t-PA. Diese Variante kann auch andere Aminosäuresubstitutionen, -löschungen oder -einfügungen aufweisen, falls diese die Aktivität der R299D-Variante nicht wesentlich beeinflussen. Beispiele für diese möglichen Mutationen umfassen eine Substitution von Asparagin statt Threonin an Position 103 oder statt Tyrosin an Position 67, oder statt Serin an Position 105 in Verbindung mit einer Substitution von Serin statt Alanin an Position 107 (siehe WO 89/11531, veröffentlicht am 30. November 1989), und/oder eine Substitution von Alanin oder Serin, oder vorzugsweise Glutamin, statt Asparagin an Position 117 oder 184, um die Clearance des Moleküls potentiell zu vermindern.
Außerdem können die Moleküle dieser Erfindung an gewissen Positionen substituiert oder gelöscht sein, um zusätzliche, gewünschte Eigenschaften, einschließlich Zymogenität, zu verleihen. Diese Positionen in menschlichem t-PA umfassen beispielsweise Substitution von Alanin statt Lysin, Histidin bzw. Glutaminsäure an den Positionen 416 - 418, Substitution von Alanin statt Glutaminsäure an Position 94 und/oder Substitution von Alanin oder Glycin statt Asparaginsäure an Position 95 und Substitution von Alanin statt Glutaminsäure, Arginin, Lysin und Glutaminsäure an den Positionen 426, 427, 429 bzw. 430, wie z.B. in WO 90/02798, veröffentlicht am 22. März 1990, beschrieben.
Beispiele für geeignete Mehrfachmutationen sind:
R299D,T103N t-PA: R299D,Y67N t-PA; R299D.N117A t-PA; R299D.N117S t-PA; R299D.N117Q t-PA; R299D.N184A t-PA; R299D.-N184S t-PA; R299D.N184Q t-PA; R299D,T103W,N117A t-PA; R299D.Y67N,N117A t-PA; R299D,T103N,N117S t-PA; R299D,Y67N,N117S t-PA; R299D,T103N,N117Q t-PA; R299D,Y67N,N117Q t-PA; R299D,T103N.N184A t-PA; R299D.Y67N,N184A t-PA; R299D,T103N,N184S t-PA; R299D,Y67N,N184S t-PA; R299D,T103N,N184Q t-PA; R299D,Y67N,N184Q t-PA; R299D.D95G t-PA; R299D.E94A.D95A t-PA; R299D,S105N,A107S t-PA; R299D.E94A,D95A,T103N t-PA; R299D.E94A,D95A,N117Q t-PA; R299D.S105N,A107S,E94A,D95A t-PA; R299D,S103N,A107S,N117Q t-PA; R299D.D95G.N117Q t-PA; R299D.D95G,T103N t-PA; R299D.D95A,S105N,A107S t-PA; R299D,K416A,H417A,E418A t-PA: R299D.E426A,R427A,K429A. E430A t-PA.

B. Konstruktion von Varianten

Die t-PA-Aminosäuresequenz-Varianten dieser Erfindung werden vorzugsweise durch Mutieren der DNA-Sequenz, die für Wildtyp-t-PA kodiert, konstruiert. Im allgemeinen werden für die Mutagenese spezielle Bereiche oder Stellen der DNA ausgewählt, weshalb die dafür angewandte, allgemeine Methodik stellen-gerichtete Mutagenese genannt wird. Die Mutationen erfolgen unter Verwendung von DNA- modifizierenden Enzymen, wie Restriktions-Endonukleasen (die DNA an speziellen Stellen spalten), Nukleasen (die DNA abbauen) und/oder Polymerasen (die DNA synthetisieren).

1. Einfache Löschungen und Einfügungen

Restriktions-Endonukleasen-Digestion von DNA, gefolgt von Ligation, kann verwendet werden, um Löschungen zu erzeugen, wie in Abschnitt 15.3 von Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, zweite Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York [1989]) beschrieben. Bei der Anwendung dieses Verfahrens wird bevorzugt, die Fremd-DNA in einen Plasmidvektor einzufügen. Es muß eine Restriktionskarte sowohl der Fremd- (eingefügten) DNA als auch der Vektor-DNA verfügbar oder die Sequenz der Fremd-DNA und der Vektor-DNA bekannt sein. Die Fremd-DNA muß einzelne Restriktionsstellen aufweisen, die im Vektor nicht enthalten sind. Anschließend werden Löschungen in der Fremd-DNA vorgenommen, indem sie zwischen diesen einzelnen Restriktionsstellen, unter Verwendung der geeigneten Restriktions-Endonukleasen unter vom Hersteller der Enzyme angegebenen Bedingungen, digeriert wird. Falls die verwendeten Restriktionsenzyme stumpfe Enden oder kompatible Enden erzeugen, können die Enden unter Verwendung einer Ligase, wie Bakteriophagen-T4-DNA-Ligase, und 1 - 4stündiges Inkubieren des Gemisches bei 16ºC in Gegenwart von ATP und Ligasepuffer, wie in Abschnitt 1.68 von Sambrook et al., siehe oben, direkt miteinander ligiert werden. Falls die Enden nicht kompatibel sind, müssen sie zuerst unter Verwendung des Klenow-Fragments von DNA-Polymerase I oder Bakteriophagen-T4-DNA-Polymerase abgestumpft werden, die beide die vier Desoxyribonukleinsäure-Triphosphate erfordern, um die überstehenden, einstrangigen Enden der digerierten DNA aufzufüllen. Als Alternative können die Enden unter Verwendung einer Nuklease abgestumpft werden, wie z.B. Nuklease S1 oder Mungobohnen-Nuklease, die beide so wirken, daß sie die überstehenden einzelnen DNA-Stränge zurückstutzen. Die DNA wird anschließend mittels einer Ligase religiert. Das resultierende Molekül ist eine t-PA-Löschungsvariante.
Eine ähnliche Strategie kann angewandt werden, um Einfügungsvarianten zu konstruieren, wie in Abschnitt 15.3 von Sambrook et al., siehe oben, beschrieben. Nach Digestion der Fremd-DNA an der(n) einzelnen Restriktionsstelle(n) wird ein Oligonukleotid in die Stelle ligiert, wo die Fremd-DNA geschnitten wurde. Das Oligonukleotid wird so konstruiert, daß es für die gewünschten, einzufügenden Aminosäuren kodiert und zusätzlich 5'- und 3'-Enden aufweist, die mit den digerierten Enden der Fremd-DNA kompatibel sind, sodaß direkte Ligation möglich ist.

2. Oligonukleotid-vermittelte Mutagenese

Oligonukleotid-gerichtete Mutagenese ist das bevorzugte Verfahren zur Herstellung der Substitutionsvarianten dieser Erfindung. Es kann auch angewandt werden, um die Löschungs- und Einfügungsvarianten dieser Erfindung auf günstige Weise herzustellen. Diese Vorgangsweise ist nach dem Stand der Technik wohlbekannt, wie von Adelman et al. (DNA, 2: 183 [1983]) beschrieben.
Im allgemeinen werden zumindest 25 Nukleotide lange Oligonukleotide verwendet, um zwei oder mehrere Nukleotide in das/dem t-PA-Molekül einzufügen, zu löschen oder zu substituieren. Ein optimales Oligonukleotid weist 12 - 15 perfekt passende Nukleotide an jeder Seite der für die Mutation kodierenden Nukleotide auf. Das sichert die richtige Hybridisierung des Oligonukleotids an das einstrangige DNA- Schablonenmolekül. Die Oligonukleotide sind leicht unter Anwendung von nach dem Stand der Technik gut bekannten Vorgangsweisen herzustellen, wie z.B. jene beschrieben von Crea et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75: 5765 [1978]).
Das DNA-Schablonenmolekül ist die einstrangige Form des Vektors mit seiner Wild-Typ cDNA-t-PA-Einfügung. Die einstrangige Schablone kann nur von jenen Vektoren, die entweder von Bakteriophagen-M13-Vektoren stammen (die kommerziell erhältlichen Vektoren M13mp18 und M13mp19 sind geeignet), oder jenen Vektoren, die einen einstrangigen Phagen-Replikationsursprung enthalten, wie von Veira et al. (Meth. Enzymol., 153: 3 [1987]) beschrieben, erzeugt werden. So muß der zu mutierende cDNA-t-PA in einen dieser Vektoren eingefügt werden, um eine einstrangige Schablone zu erzeugen. Die Herstellung der einstrangigen Schablone wird in den Abschnitten 4.21 - 4.41 von Sambrook et al., siehe oben, beschrieben.
Um den Wildtyp-t-PA zu mutieren, wird das Oligonukleotid unter geigneten Hybridisierungsbedingungen an das einstrangige DNA-Schablonenmolekül anneliert. Ein DNA-polymerisierendes Enzym, üblicherweise das Klenow-Fragment von E.coli- DNA-Polymerase I, wird anschließend zugefügt. Dieses Enzym verwendet das Oligonukleotid als einen Primer, um die Synthese des mutationstragenden DNA-Strangs zu vervollständigen. So wird ein Heteroduplex-Molekül auf solche Weise gebildet, daß ein DNA-Strang für den in den Vektor eingefügten Wildtyp-t-PA und der zweite DNA- Strang für die in denselben Vektor eingefügte, mutierte Form von t-PA kodiert. Dieses Heteroduplex-Molekül wird anschließend in eine geeignete Wirtszelle transformiert, üblicherweise einen Prokaryoten wie E.coli JM101. Nach Vermehren der Zellen werden diese auf Agaroseplatten plattiert und unter Verwendung des radioaktiv mit ³²P markierten Oligonukleotid-Primers gescreent, um die Kolonien zu identifizieren, die den mutierten t-PA enthalten. Diese Kolonien werden ausgewählt und die DNA sequenziert, um die Gegenwart von Mutationen im t-PA-Molekül zu bestätigen.
Mutanten mit mehr als einer substituierten Aminosäure können auf mehreren Wegen erzeugt werden. Falls die Aminosäuren in der Polypeptidkette nahe beieinander liegen, können sie unter Verwendung eines Oligonukleotids, das für alle gewünschten Aminosäuresubstitutionen kodiert, gleichzeitig mutiert werden. Falls jedoch die Aminosäuren in einiger Entfernung voneinander liegen (beispielsweise durch mehr als 10 Aminosäuren getrennt), ist es schwieriger, ein einziges Oligonukleotid zu erzeugen, das für alle gewünschten Änderungen kodiert. Stattdessen kann eines von zwei Alternativverfahren angewandt werden. Nach dem ersten verfahren wird ein eigenes Oligonukleotid für jede zu substituierende Aminosäure erzeugt. Die Oligonukleotide werden gleichzeitig an die einstrangige Schablonen-DNA anneliert, und der zweite aus der Schablone synthetisierte DNA-Strang kodiert für alle gewünschten Aminosäuresubstitutionen. Das alternative Verfahren umfaßt zwei oder mehrere Mutageneseschritte, um den gewünschten Mutanten herzustellen. Der erste Schritt erfolgt, wie für die einzelnen Mutanten beschrieben: Wildtyp-DNA wird für die Schablone verwendet, ein für die erste(n) Aminosäuresubstitution(en) kodierendes Oligonukleotid wird an diese Schablone anneliert, und danach wird das Heteroduplex- Molekül erzeugt. Der zweite Mutageneseschritt verwendet die im ersten Schritt produzierte, mutierte DNA als Schablone. Diese Schablone enthält daher bereits eine oder mehrere Mutationen. Das für die zusätzliche(n), gewünschte(n) Aminosäuresubstitution(en) kodierende Oligonukleotid wird anschließend an diese Schablone anneliert, und der resultierende DNA-Strang kodiert nun sowohl für Mutationen aus dem ersten als auch aus dem zweiten Mutagenese-Schritt. Diese resultierende DNA kann als Schablone in einem dritten Mutagenese-Schritt verwendet werden, usw.
Um die für die t-PA-Variante kodierende DNA als Polypeptid zu exprimieren, wird diese DNA aus dem Vektor herausgeschnitten und in einen Expressionsvektor eingefügt, der sich zur Expression in eukarvotischen Wirtszellen eignet. CHO-Zellen werden für die stabile Langzeitprodukton von t-PA bevorzugt. Diese Erfindung ist jedoch nicht auf die Expression von t-PA-Varianten in CHO-Zellen beschränkt, da ja bekannterweise zahlreiche andere Zelltypen verwendet werden können, besonders falls, z.B. für Versuchszwecke, nur vorübergehende Expression der t-PA-Varianten notwendig ist.

C. Wirtszellenkulturen und Vektoren

1. Prokaryotische Zellen

Prokaryoten sind die bevorzugten Wirtszellen für die anfänglichen Klonungsschritte dieser Erfindung. Sie sind besonders nützlich zur raschen Produktion von großen Mengen an DNA, zur Produktion von einstrangigen DNA-Schablonen zur stellen-gerichteten Mutagenese, zum gleichzeitigen Screenen vieler Mutanten und zur DNA-Sequenzierung der erzeugten Mutanten. Geeignete prokaryotische Wirtszellen umfassen E.coli-K12-Stamm 294 (ATCC-Nr. 31.446), E.coli-Stamm W3110 (ATCC-Nr. 27.325), E.coli X1776 (ATCC-Nr. 31.537) und E.coli B; es können jedoch genauso andere E.coli-Stämme, wie z.B. HB101, JM101, NM522, NM538, NM539, und viele andere Spezien und Gattungen von Prokaryoten verwendet werden.
Prokaryoten können auch als Wirte zur Expression von DNA-Sequenzen verwendet werden. Die zuvor aufgelisteten E.coli-Stämme, Bakterien, wie z.B. Bacillus subtilis, andere Enterobacteriaceae, wie Salmonella typhimurium oder Serratia marcesans, und verschiedene Preudomonas-spezien können alle als Wirte verwendet werden.
Es werden von mit der Wirtszelle kompatiblen Spezies stammende Plasmidvektoren, die Replikon- und Steuer-sequenzen enthalten, in diesen Wirten verwendet. Der Vektor besitzt üblicherweise eine Replikationsstelle, Marker-Gene, die für phenotypische Selektion in den transformierten Zellen sorgen, einen oder mehrere Promoter und einen Polylinker-Bereich, der mehrere Restriktionsstellen zum Einfügen von Fremd-DNA enthält. Typischerweise zur Transformation von E.coli verwendete Plasmide umfassen pBR322, pUC18, pUC19, pUC118, pUC119 und Bluesaipt M13, die allesamt in den Abschnitten 1.12 - 1.20 von Sambrook et al., siehe oben, beschrieben sind. Es sind jedoch auch viele andere geeignete Vektoren verfügbar. Diese Vektoren enthalten für Ampicillin- und/oder Tetracyclin-Resistenz kodierende Gene, was die mit diesen Vektoren transformierten Zellen in die Lage versetzt, sich in Gegenwart dieser Antibiotika zu vermehren.
Die allgemein am häufigsten in prokaryotischen Vektoren verwendeten Promoter umfassen die β-Lactamase- (Penicillinase-) und Lactose-Promotersysteme (Chang et al., Nature, 375: 615 [1978]; Itakura et al., Science, 198: 1056 [1977]; Goeddel et al., Nature, 281: 544 [1979]) und ein Tryptophan(trp)-Promotersystem (Goeddel et al., Nucl. Acids Res., 8: 4057 [1980]; EP-A-36.776) und die alkalischen Phosphatase-Systeme. Obwohl diese die allgemein am häufigsten verwendeten sind, wurden auch andere mikrobielle Promoter verwendet, und es wurden Details hinsichtlich ihrer Nukleotidsequenzen veröffentlicht, was einem Fachmann ermöglicht, sie funktionell in Plasmidvektoren zu ligieren (siehe Siebenlist et al., Cell, 20: 269 [1980]).

2. Eukaryotische Mikroben

Eukaryotische Mikroben, wie z.B. Hefen, können zur praktischen Anwendung dieser Erfindung verwendet werden. Die Backhefe Saccharomyces cerevisiae ist ein allgemein verwendeter, eukaryotischer Mikroorganismus, obwohl auch verschiedene andere Stämme verfügbar sind. Das Plasmid YRp7 (Stinchcomb et al., Nature, 282: 39 [1979]; Kingsman et al., Gene, 7: 141 [1979]; Tschemper et al., Gene, 10: 157 [1980]) wird allgemein als Expressionsvektor in Saccharomyces verwendet. Dieses Plasmid enthält das trp1-Gen, das einen Selektionsmarker für einen mutanten Hefe-Stamm bereitstellt, dem die Fähigkeit zum Wachstum in Tryptophan fehlt, wie z.B. die Stämme ATCC-Nr. 44.076 und PEP4-1 (Jones, Genetics, 85:12 [1977]). Die Gegenwart der trp- Läsion als charakteristisches Merkmal des Hefewirtszellen-Genoms sorgt für eine zum Nachweis von Transformation durch Wachstum in Abwesenheit von Tryptophan wirksame Umgebung.
Geeignete Promoter-Sequenzen in Hefevektoren umfassen die Promoter für 3- Phosphoglyzerat-Kinase (Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255: 2073 [1980]) oder andere glykolytische Enzyme (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg., 7: 149 [1968]; Holland et al., Biochemistry, 17: 4900 [1978]), wie z.B. Enolase, Glyzeraldehyd-3-phosphat- Dehydrogenase, Hexokinase, Pyruvat-Decarboxylase, Phosphofructokinase, Glukos-6- phosphat-Isomerase, 3-Phosphoglyzerat-Mutase, Pyruvat-Kinase, Triosephosphat- Isomerase, Phosphoglukoselsomerase und Glukokinase. Bei der Konstruktion von geeigneten Expressionsplasmiden werden auch die mit diesen Genen verbundenen Terminationssequenzen 3' der gewünschten, zu exprimierenden Sequenz in den Expressionsvektor ligiert, um für Polyadenylierung der mRNA und Termination zu sorgen. Andere Promoter, die den zusätzlichen Vorteil der durch Wachstumsbedingungen gesteuerten Transkription aufweisen, sind der Promoterbereich für Alkohol-Dehydrogenase 2, Isocytochrom C, saure Phosphatase, mit dem Stickstoffmetabolismus assoziierte, abbauende Enzyme und die zuvor erwähnte Glyzeraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase, und Enzyme, die für die Verwertung von Maltose und Galaktose verantwortlich sind. Es eignet sich jeder Plasmidvektor, der einen hefekompatiblen Promoter, Replikationsursprung und Terminationssequenzen enthält.

3. Eukaryotische mehrzellige Organismen

Zellkulturen, die aus mehrzelligen Organismen stammen, können als Wirte zur praktischen Anwendung dieser Erfindung verwendet werden. Obwohl sowohl Invertebraten- als auch Vertebraten-Zellkulturen annehmbar sind, werden Vertebraten- Zellkulturen, besonders Säugetierkulturen, bevorzugt. Beispiele für geeignete Zellinien umfassen die durch SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651) transformierte Affennieren-CVI- Linie; die menschliche Embryonierenlinie 293S (Graham et al.; J. Gen. Virol, 36:59 (1977); Nierenzellen von Hamsterbabys (BHK, ATCC CCL 10); Eierstockzellen des chinesischen Hamsters (CHO-Zellen, Urlaub und Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4216 [1980]); Mäuse-Sertolizellen (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23: 243 [1980]]; Affennierenzellen (CVI-76, ATCC CCL 70); Nierenzellen afrikanischer Grünaffen (VERO- 76, ATCC CRL 1587); menschliche Zervikalkarzinomzellen (HELA, ATCC CCL 2); Hundenierenzellen (MDCK, ATCC CCL 34); Büffelrattenleberzellen (BRL 3A, ATCC CRL 1442); menschliche Lungenzellen (W138, ATCC CCL 75); menschliche Leberzellen (Hep G2, HB 8065); Mäusebrust-Tumorzellen (MMT 060562, ATCC CCL 51); Rattenhepatomzellen (HTC, M1.54, Baumann et al., J. Cell. Biol., 85:1 [1980]) und TRI- Zellen (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci., 383: 44 (1982]). Expressionsvektoren für diese Zellen umfassen normalerweise (falls nötig) DNA-Sequenzen für einen Replikationsursprung, einen vor dem zu exprimierenden Gen liegenden Promoter, eine Ribosombindungsstelle, eine RNA-Spleißstelle, eine Polyadenylierungsstelle und eine Transkriptionsterminationsstelle.
In Säugetierexpressionsvektoren verwendete Promoter sind oft viralen Ursprungs. Diese viralen Promoter stammen im allgemeinen von Polyomavirus, Adenovirus 2 und am häufigsten von Affenvirus 40 ("Simian Virus 40", SV40). Das SV40-Virus enthält zwei Promoter, die früher und später Promoter genannt werden. Diese Promoter sind deshalb besonders nützlich, da sie beide als DNA-Fragment, das auch den viralen Replikationsursprung enthält, leicht aus dem Virus erhalten werden können (Fiers et al., Nature, 273: 113 [1978]). Es können auch kleinere oder größere SV40-DNA-Fragmente verwendet werden, vorausgesetzt daß sie die ungefähr 250-bp-Sequenz, die sich von der HindIII- zur Ball-Stelle im viralen Replikationsursprung erstreckt, enthalten.
Alternativ können Promoter, die mit dem fremden Gen natürlich assoziiert sind (homologe Promoter), verwendet werden, solange sie mit der zur Transformation ausgewählten Wirtszellnie kompatibel sind.
Ein Replikationsursprung kann aus einer exogenen Quelle, wie z.B. SV40 oder einem anderen Virus (z.B. Polyoma, Adeno, VSV, BPV), erhalten und in den klonenden Vektor eingefügt werden. Alternativ kann der Replikationsursprung durch den chromosomalen Replikationsmechanismus der Wirtszelle bereitgestellt werden. Falls der das fremde Gen enthaltende Vektor in das Wirtszellenchromosom integriert wird, reicht letzteres oft aus.
Von transformierten Zellkulturen werden ausreichende Mengen an menschlichem t-PA produziert. Die Verwendung einer sekundärer DNA-Kodiersequenz kann die produzierten Mengen jedoch erhöhen. Die sekundäre Kodiersequenz umfaßt typischerweise das Enzym Dihydrofolat-Reduktase (DHFR). Die Wildtypform von DHFR wird normalerweise durch die Chemikalie Methotrexat (MTX) inhibiert. Die DHFR- Expressionsmenge in einer Zelle variiert je nach den kultivierten Wirtszellen zugefügtem MTX. Ein zusätzliches Merkmal von DHFR, das sie als Sekundärsequenz besonders nützlich macht, liegt darin, daß sie als Selektionsmarker zum Identifizieren von transformierten Zellen verwendet werden kann.
Zur Verwendung als Sekundärsequenz sind zwei Formen von DHFR verfügbar, Wildtyp-DHFR und MTX-resistente DHFR. Der in einer speziellen Wirtszelle verwendete DHFR-Typ hängt davon ab, ob die Wirtszelle einen DHFR-Mangel aufweist (sodaß sie entweder sehr geringe Mengen oder überhaupt keine funktionelle DHFR produziert). Zellinien mit DHFR-Mangel, wie die von Urlaub und Chasin (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4216 [1980]) beschriebene CHO-Zeilinie, werden mit Wildtyp- DHFR-Kodiersequenzen transformiert. Nach der Transformation exprimieren diese Zellinien mit DHFR-Mangel funktionelle DHFR und sind in der Lage, sich in einem Kulturmedium ohne die Nährstoffe Hypoxanthin, Glycin und Thymidin zu vermehren.
Die MTX-resistente Form von DHFR kann als Selektionsmittel für transformierte Wirtszellen in jenen Wirtszellen verwendet werden, die endogen normale Mengen an MTX-empfindlicher, funktioneller DHFR produzieren. Die CHO-K1-Zellinie (ATCC-Nr. CL 61) besitzt diese Eigenschaften und ist daher eine für diesen Zweck geeignete Zellinie. Die Zugabe von MTX zum Zellkulturmedium ermöglicht Wachstum nur für jene Zellen, die mit der für MTX-resistente DHFR kodierenden DNA transformiert wurden. Die nicht-transformierten Zeilen können in diesem Medium nicht überleben.
Die zur Produktion der Varianten dieser Erfindung verwendeten Säugetierwirtszellen können in einer Vielzahl von Medien kultiviert werden. Kommerziell erhältliche Medien, wie Ham's F10 (Sigma), Minimal Essential Medium ([MEM], Sigma), RPMI-1640 (Sigma) und Dulbecco's Modified Eagle's Medium ([DMEM], Sigma) sind zum Kultivieren der Wirtszellen geeignet. Außerdem alle in Ham und Wallace (Meth. Enz., 58: 44 [1979]), Barnes und Sato (Anal. Biochem., 102: 255 [1980]), US-A-4.767.704; 4.657.866; 4.927.762; oder 4.560.655; WO 90/03430; WO 87/001 95; US-A-Re.30.9852 beschriebenen.
Ein zum Kultivieren von Säugetier- und besonders von CHO-Zellen geeignetes Kulturmedium kann beispielsweise die folgenden Komponenten enthalten:
Asparagin 300 - 740 mg/l
Asparaginsäure 300 - 650 mg/l
Glycin 300 - 500mg/l
Isoleucin 300 - 500 mg/l
Leucin 400 - 700 mg/l
Lysin 1000 - 2250 mg/l
Methionin 80 - 350 mg/l
Serin 500 - 750 mg/l
Threonin 550 - 950 mg/l
Tryptophan 75 - 230 mg/l
Tyrosin 175 - 400 mg/l
Valin 240 - 640mg/l
Ein anderes das Wachstum verschiedener Säugetierzellinien unterstützendes Medium enthält die folgenden Hauptkomponenten:
Asparagin 150 - 450 mg/l
Asparaginsäure 150 - 450 mg/l
Lysin 400 - 800 mg/l
Methionin 50 - 200 mg/l
Serin 100 - 300 mg/l
Tryptophan 50 - 200 mg/l
Beide Kulturmedien sind vorzugsweise serumfrei und zum Kultivieren auf hohe Dichte und zur kommerziellen Produktion in großem Maßstab geeignet.
Jedes dieser Medien kann wie benötigt mit Hormonen und/oder anderen Wachstumsfaktoren (wie Insulin, Transferrin oder epidermalem Wachstumsfaktor), Salzen (wie Natriumchlorid, Kalzium, Magnesium und Phosphat), Puffern (wie HEPES), Nukleosiden (wie Adenosin und Thymidin), Antibiotika (wie Gentamycin), Spurenelementen (definiert als üblicherweise mit Endkonzentrationen im mikromolaren Bereich vorliegende anorganische Verbindungen) und Glukose oder einer äquivalenten Energiequelle ergänzt werden. Auch alle anderen notwendigen Ergänzungen können in geeigneten Konzentrationen inkludiert sein, die dem Fachmann bekannt sein werden.

4. Sekretionssysteme

Viele normalerweise von der Zelle sekretierte, eukaryotische Proteine enthalten eine endogene Signalsequenz als Teil der Aminosäuresequenz. Diese Sequenz richtet das Protein zum Abtransport aus der Zelle via endoplasmatisches Reticulum und Golgi- Apparat aus. Die Signalsequenz sitzt typischerweise am Aminoterminus des Proteins und erstreckt über eine Länge von etwa 13 bis etwa 36 Aminosäuren. Obwohl die aktuelle Sequenz unter Proteinen variiert, enthalten alle bekannten eukaryotischen Signalsequenzen zumindest einen positiv geladenen Rest und eine stark hydrophobe Strecke von 10 - 15 Aminosäuren (üblicherweise reich an den Aminosäuren Leucin, Isoleucin, Alanin, Valin und Phenylalanin) nahe der Mitte der Signalsequenz. Die Signalsequenz fehlt normalerweise in der sekretierten Form des Proteins, da sie durch eine Signalpeptidase am endoplasmischen Reticulum während der Translokation des Proteins in das endoplasmische Reticulum abgespalten wird. Das Protein mit noch vorhandener Signalsequenz wird oft als "Prä-Protein" oder unreife Form des Proteins bezeichnet.
Nicht alle sekretierten Proteine enthalten jedoch eine aminoterminale Signalsequenz, die abgespalten wird. Manche Proteine, wie z.B. Eialbumin, enthalten eine Signalsequenz, die in einem inneren Bereich des Proteins liegt. Diese Sequenz wird während der Translokation normalerweise nicht abgespalten.
Normalerweise im Cytoplasma gefundene Proteine können zur Sekretion durch Anbinden einer Signalsequenz an das Protein ausgerichtet werden. Dies erfolgt leicht durch Ligieren von für eine Signalsequenz kodierender DNA an das 5'-Ende der für das Protein kodierenden DNA und anschließendes Exprimieren dieses Fusionsproteins in einer geeigneten Wirtszelle. Die für die Signalsequenz kodierende DNA kann als Restriktionsfragment aus jedem für ein Protein mit einer Signalsequenz kodierenden Gen erhalten werden. So können prokaryotische, Hefe- und eukaryotische Signalsequenzen hierin verwendet werden, je nach Typ der für die praktische Anwendung der Erfindung verwendeten Wirtszelle. Die für den Signalsequenzabschnitt des Gens kodierende DNA wird unter Verwendung von geeigneten Restriktionsendonucleasen herausgeschnitten und anschließend an die für das zu sekretierende Protein, z.B. t-PA, kodierende DNA ligiert.
Die Auswahl einer funktionellen Signalsequenz erfordert, daß die Signalsequenz von der Wirtszellen-Signalpeptidase erkannt wird, sodaß es zu Abspaltung dieser Signalsequenz und Sekretion des Proteins kommt. Die DNA und die Aminosäuresequenz, die für den Signalsequenzabschnitt verschiedener eukaryotischer Gene, einschließlich beispielsweise menschliches Wachstumshormon, Proinsulin und Proalbumin, kodieren, sind bekannt (siehe Stryer, Biochemistry, W.H. Freeman and Company, New York [1988], S. 769) und können als Signalsequenzen in geeigneten eukaryotischen Wirtszellen verwendet werden. Hefesignalsequenzen, wie z.B. saure Phosphatase (Arima et al., Nucl. Acids Res., 11: 1657 [1983]), α-Faktor, alkalische Phosphatase und Invertase, können zur Steuerung der Sekretion aus Hefewirtszellen verwendet werden. Prokaryotische Signalsequenzen aus kodierenden Genen, beispielsweise LamB oder OmpF (Wong et al., Gene, 68:193 [1988]), MaIE, PhoA oder β-Lactamase, sowie anderen Genen können dazu verwendet werden, Proteine zum Transport aus prokaryotischen Zellen in das Kulturmedium auszurichten.
Eine alternative Technik, ein interessierendes Protein mit einer Signalsequenz zu versehen, damit es sekretiert werden kann, besteht in der chemischen Synthese der für die Signalsequenz kodierenden DNA. Bei diesem Verfahren werden beide Stränge eines Oligonukleotids, das für die ausgewählte Signalsequenz kodiert, chemisch synthetisiert und anschließend aneinander anneliert, um einen Duplex zu bilden. Das doppelstrangige Oligonukleotid wird danach an das 5'-Ende der für das Protein kodierenden DNA ligiert.
Das Konstrukt, das die DNA, die für das Protein kodiert, mit daran ligierter Signalsequenz enthält, kann anschließend in einen geeigneten Expressionsvektor ligiert werden. Dieser Expressionsvektor wird in eine geeignete Wirtszelle transformiert und das interessierende Protein exprimiert und sekretiert.

D. Transformationsverfahren

Kulturen von Säugetierwirtszellen und anderen Wirtszellen, die keine starren Zellmembranwände besitzen, werden üblicherweise unter Anwendung des Kalziumphosphatverfahrens, wie ursprünglich von Graham und Van der Eb (Virology, 52: 546 [1978]) beschrieben, transformiert und wie in den Abschnitten 16.32 - 16.37 von Sambrook et al., siehe oben, beschrieben modifiziert. Es können jedoch auch andere Verfahren zur Einführung von DNA in Zellen, wie Polybren (Kawai und Nishizawa, Mol. Cell. Biol., 4: 1172 [1984]), Protoplastenfusion (Schaffner, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 2163 [1980]), Elektroporation (Neumann et al., EMBO J., 1: 841 [1982]) und direkte Mikroinjektion in die Zellkerne (Capecchi, Cell, 22: 479 [1980]), verwendet werden.
Hefewirtszelle werden allgemein unter Anwendung des Polyethylenglykol- Verfahrens, wie von Hinnen (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75:1929 [1978]) beschrieben, transformiert. Prokaryotische Wirtszellen oder andere Wirtszellen mit starren Zellwänden werden vorzugsweise unter Anwendung des in Abschnitt 1.82 von Sambrook et al., siehe oben, beschriebenen Kalziumchlorid-Verfahrens transformiert. Als Alternative kann zur Transformation dieser Zellen Elektroporation angewandt werden.

E. Klonungsverfahren

Die Konstruktion von geeigneten Vektoren, die DNA enthalten, die für Replikationssequenzen, Regulatorsequenzen, phenotypische Selektionsgene und die interessierende Fremd-DNA kodiert, erfolgt unter Anwendung rekombinanter DNA- Standardverfahren. Isolierte Plasmide und DNA-Fragmente werden gespalten, maßgeschneidert und miteinander in einer spezifischen Reihenfolge ligiert, um die gewünschten Vektoren zu erzeugen.
Die DNA wird unter Verwendung des(r) geeigneten Restriktionsenzyms(e) in einem passenden Puffer gespalten. Im allgemeinen werden etwa 0,2 - 1 ug Plasmid oder DNA-Fragment mit etwa 1 - 2 Einheiten des geeigneten Restriktionsenzyms in etwa 20 ul Pufferlösung eingesetzt. (Geeignete Puffer, DNA-Konzentrationen und Inkubationszeiten und Temperaturen werden von den Herstellern der Restriktionsenzyme genau angegeben.) Im allgemeinen eignen sich Inkubationszeiten von etwa 1 - 2 h bei 37ºC, obwohl verschiedene Enzyme höhere Temperaturen erfordern. Nach der Inkubation werden die Enzyme und andere Verunreinigungen durch Extraktion des Digestionslösung mit einem Gemisch aus Phenol und Chloroform entfernt und die DNA aus der wäßrigen Fraktion durch Fällung mit Ethanol gewonnen.
Um die DNA-Fragmente miteinander zu einem funktionellen Vektor zu ligieren, müssen die Enden der DNA-Fragmente miteinander kompatibel sein. In manchen Fällen sind die Enden nach der Endonuklease-Digestion direkt kompatibel. Es kann jedoch notwendig sein, die durch die Endonuklease-Digestion normalerweise produzierten klebrigen Enden in stumpfe Enden umzuwandeln, um sie für die Ligation kompatibel zu machen. Zum Abstumpfen der Enden wird die DNA in einem geeigneten Puffer zumindest 15 min lang bei 15ºC mit 10 Einheiten des Klenow-Fragments von DNA- Polymerase I (Klenow) in Gegenwart der vier Desoxynukleotid-Triphosphate behandelt. Anschließend wird sie durch Phenol-Chloroform-Extraktion und Ethanol-Fällung gereinigt.
Die gespaltenen DNA-Fragmente können mittels Gelelektrophorese nach der Größe getrennt und selektiert werden. Die DNA kann entweder über eine Agarose- oder eine Polyacrylamid-Matrix elektrophoretisch aufgetrennt werden. Die Auswahl der Matrix hängt von der Größe der zu trennenden DNA-Fragmente ab. Nach der Elektrophorese wird die DNA durch Elektroelution oder, falls niedrigschmelzende Agarose als Matrix verwendet wurde, durch Schmelzen der Agarose und Herausextrahieren der DNA aus der Matrix extrahiert, wie in den Abschnitten 6.30 - 6.33 von Sambrook et al., siehe oben, beschrieben.
Die miteinander zu ligierenden DNA-Fragmente (die zuvor mit den geeigneten Restriktionsenzymen so digeriert wurden, daß die Enden jedes zu ligierenden Fragments kompatibel sind) liegen in Lösung in etwa äquimolaren Mengen vor. Die Lösung enthält auch ATP, Ligasepuffer und eine Ligase, wie z.B. T4-DNA-Ligase, in etwa 10 Einheiten pro 0,5 ug DNA. Falls das DNA-Fragment in einen Vektor ligiert werden soll, wird der Vektor zuerst durch Schneiden mit der(n) geeigneten Restriktionsendonuklease(n) linearisiert und anschließend entweder mit bakterieller alkalischer Phosphatase oder mit intestinaler alkalischer Kalbsphosphatase "phosphatasiert". Das verhindert die Selbstligation des Vektors während des Ligationsschritts.
Nach der Ligation wird der Vektor mit dem nun eingefügten fremden Gen in eine geeignete Wirtszelle, meistens einen Prokaryoten wie E.coli-K12-Stamm 294 (ATCC-Nr. 31.446) oder einen anderen geeigneten E.coli-Stamm, transformiert. Die transformierten Zellen werden durch Wachstum auf einem Antibiotikum, üblicherweise Tetracyclin (tet) oder Ampicillin (amp), selektiert, gegen das sie durch die Gegenwart von tet- und/oder amp-Resistenzgenen auf dem Vektor resistent gemacht wurden. Wenn das Ligationsgemisch in eine eukaryotische Wirtszelle transformiert wurde, können transformierte Zellen durch das zuvor beschriebene DHFR/MTX-System selektiert werden. Die transformierten Zellen werden in Kultur vermehrt und anschließend die Plasmid-DNA isoliert (Plasmid bezieht sich auf den an das interessierende fremde Gen ligierten Vektor). Diese Plasmid-DNA wird danach durch Restriktionskartierung und/oder DNA-Sequenzierung analysiert. Die DNA-Sequenzierung erfolgt im allgemeinen entweder nach dem Verfahren von Messing et al., Nucleic Acids Res., 9: 309 (1981) oder nach dem Verfahren von Maxam et al., Methods of Enzymology, 65: 499 (1980).
Nachdem Säugetierwirtszellen stabil mit der DNA transformiert wurden, werden die für das DHFR-Protein kodierenden Sequenzen durch Vermehrung der Wirtszellenkulturen in Gegenwart von ungefähr 200 - 500 nM Methotrexat amplifiziert. Der wirksame Konzentrationsbereich von MTX hängt stark von der Art des DHFR-Gens und -Proteins und den Eigenschaften des Wirts ab. Es können natürlich keine allgemein definierten Ober- und Untergrenzen genau angegeben werden. Passende Konzentrationen anderer Folsäureanalogen oder anderer Verbindungen, die DHFR inhibieren, können auch verwendet werden. MTX selbst ist jedoch geeignet, leicht erhältlich und wirksam.
Wie zuvor beschrieben, werden t-PA-Varianten vorzugsweise durch Mutationen produziert, die nach dem Verfahren der stellen-spezifischen Mutagenese erzeugt wurden. Dieses Verfahren erfordert die Synthese und Verwendung von spezifischen Oligonukleotiden, die sowohl für die Sequenz der gewünschten Mutation als auch für eine ausreichende Anzahl an benachbarten Nukleotiden kodieren, um dem Oligonukleotid zu ermöglichen, stabil an die DNA-Schablone zu hybridisieren.

F. Pharmazeutische Zusammensetzungen

Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können gemäß bekannten Verfahren zur Herstellung von pharmazeutisch brauchbaren Zusammensetzungen formuliert werden, wobei das t-PA-Produkt als Gemisch mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger kombiniert wird. Geeignete Träger und deren Formulierungen werden in Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. Auflage, 1980, Mack Publishing Co., Oslo et al., Hrsg., beschrieben. Diese Zusammensetzungen enthalten typischerweise eine wirksame Menge der t-PA-Variante, beispielsweise in der Größenordnung von etwa 0,5 bis etwa 5 mg/ml, gemeinsam mit einer geeigneten Menge an Träger, um pharmazeutisch annehmbare Zusammensetzungen herzustellen, die sich zur wirksamen Verabreichung an den Patienten eignen. Die t-PA-Variante kann an Patienten, die unter kardiovaskulären Erkrankungen oder Zuständen leiden, parenteral oder durch andere Verfahren verabreicht werden, die ihre Abgabe an den Blutstrom in wirksamer Form sicherstellen.
Besonders gut geeignete Zusammensetzungen für die klinische Verabreichung der t-PA-Varianten als praktische Anwendung dieser Erfindung umfassen sterile, wäßrige Lösungen oder sterile, hydratisierbare Pulver, wie z.B. lyophiliertes Protein. Typischerweise wird auch eine geeignete Menge eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes in der Formulierung verwendet, um die Formulierung isotonisch zu machen. Es ist typischerweise auch ein Puffer, wie z.B. Argininbase in Kombination mit Phosphorsäure, in einer geeigneten Konzentration zur Beibehaltung eines passenden pHs, im allgemeinen von 5,5 bis 7,5, enthalten. Außerdem kann eine Verbindung wie Glyzerin in der Formulierung enthalten sein, um zur Beibehaltung der Lagerbeständigkeit beizutragen.
Dosierungen und gewünschte Wirkstoffkonzentrationen der pharmazeutischen Zusammensetzungen dieser Erfindung können abhängig von der geplanten, speziellen Verwendung variieren. Beispielsweise werden bei der Behandlung von tiefsitzenden Venenthrombosen oder peripheren vaskulären Erkrankungen typischerweise "Bolus"- Dosen in der Größenordnung von etwa 0,05 bis etwa 0,2 mg/kg mit anschließenden Verabreichungen in der Größenordnung von etwa 0,1 bis etwa 0,2 mg/kg bevorzugt, um einen ziemlich konstanten Spiegel im Blut, vorzugsweise in der Größenordnung von etwa 3 ug/ml, beizubehalten.
Zur Verwendung in Verbindung mit medizinischen Notfallsversorgungs- Einrichtungen, wo die Möglichkeit von Infusion im allgemeinen nicht gegeben ist, und wegen der im allgemeinen kritischen Natur der zugrundeliegenden Erkrankung (z.B. Embolie, Infarkt) ist es üblicherweise wünschenswert, höhere Anfangsdosen vorzusehen, wie z.B. einen intravenösen Bolus von etwa 0,3 mg/kg.
Beispielsweise wird die t-PA-Variante geeigneterweise parenteral an Personen verabreicht, die unter kardiovaskulären Erkrankungen oder Zuständen leiden. Dosierung und Dosis-Rate können parallel zu oder höher liegen als jene, die gegenwärtig bei klinischen Untersuchungen anderer kardiovaskulärer, thrombolytischer Wirkstoffe in Verwendung sind, z.B. etwa 1 - 2 mg/kg Körpergewicht als intravenöse oder intraarterielle Dosis über 1,5 - 12 h bei menschlichen Patienten, die unter Myokardinfarkt, Lungenembolie, etc. leiden.
Als ein Beispiel einer geeigneten Dosierungsform werden einer Phiole 50 mg t- PA, Arginin, Phosphorsäure und Polysorbat 80 mit 50 ml sterilen Wasser zur Injektion rekonstituiert und mit einem geeigneten injizierten Volumen von 0,9%-iger Natriumchlorid-Injektionslösung vermischt.
Die t-PA-Varianten dieser Erfindung dienen auch zur Verhinderung von Fibrinablagerung, Adhäsionsbildung oder -wiederbildung. Eine Ausführungsform dieser Anwendung wird in EP-A-297.860, veröffentlicht am 4. Jänner 1989, beschrieben. lm allgemeinen umfaßt diese Behandlungsart die topische Verabreichung einer Zusammensetzung an einer Stelle von potentieller Fibrin- oder Adhäsionsbildung, wobei die Zusammensetzung eine therapeutisch wirksame Menge der t-PA-Variante in einer mäßig löslichen Form enthält, die an dieser Stelle über eine Zeitspanne von etwa 3 Tagen bis zu 2 Wochen lang kontinuierlich freigesetzt wird. Typischerweise wird die t-PA-Variante in einer Dosierung verabreicht, die ausreicht, um Fibrinablagerung oder Adhäsionsbildung nach Operation, Infektion, Trauma oder Entzündung zu verhindern. Üblicherweise beträgt diese Menge 0,02 - 25 mg/g Gel, vorzugsweise etwa 0,20 bis etwa 2,5 mg/g Gel, noch bevorzugter 0,25 bis etwa 1,0 mg/g Gel. Jede zur Verhinderung von Adhäsionsbildung und/oder Fibrinablagerung verwendete t-PA- Variante wird typischerweise in einem halbfesten, schleimigen, pharmazeutisch inerten Träger, zum Positionieren des Enzyms an der Stelle der potentiellen Adhäsionsbildung, formuliert. Der Träger umfaßt langkettige Kohlenwasserstoffe oder Pflanzenöle und Wachse, die aus Gemischen von modifizierten, gesättigten und ungesättigten Fettsäureglyzeriden bestehen, oder Gemische von modifizierten, gesättigten und ungesättigten Fettsäureglyzeriden. Beispiele inkludieren halbfeste Vehikel, wie Petrolatum oder halbsynthetische Glyzeride, Polyhydroxylösungsmittel, wie Glyzerin, langkettige Kohlenwasserstoffe, biologisch abbaubare Polymere oder Liposome.
Um die Beispiele zu vereinfachen, werden gewisse allgemein angewandte Verfahren mit den nachstehenden Phrasen bezeichnet.
"Plasmide" werden durch ein kleingeschriebenes p, gefolgt von einer alphanumerischer Bezeichnung bezeichnet. Die in dieser Erfindung verwendeten Ausgangsplasmide sind entweder im Handel erhältlich, uneingeschränkt für die Allgemeinheit verfügbar, oder sie können nach veröffentlichten Verfahren aus verfügbaren Plasmiden konstruiert werden. Außerdem sind nach dem Stand der Technik zu den beschriebenen äquivalente Plasmide bekannt und werden dem durchschnittlich ausgebildeten Fachmann klar sein.
"Digestion", "Schneiden" oder "Spalten" von DNA bezieht sich auf die katalytische Spaltung der DNA mit einem Enzym, das nur an bestimmten Stellen in der DNA wirkt. Diese Enzyme werden Restriktions-Endonukleasen und die Stelle, wo jedes Enzym spaltet, Restriktionsstelle genannt. Die in dieser Erfindung verwendeten Restriktionsenzme sind im Handel erhältlich und werden so eingesetzt, wie vom Hersteller angegeben. Restriktionsenzyme werden allgemein mit Abkürzungen bezeichnet, die aus einem Großbuchstaben, gefolgt von zwei oder drei Kleinbuchstaben, die den Mikroorganismus darstellen, aus dem jedes Restriktionsenzym erhalten wurde. Diese Buchstaben werden von einer oder mehreren römischen Zahlen gefolgt, die das spezielle Enzym angeben. Im allgemeinen wird etwa 1 ug Plasmid oder DNA-Fragment mit etwa 2 Einheiten Enzym in etwa 20 ul Pufferlösung verwendet. Die geeigneten Puffer, Substratkonzentration, Inkubationstemperatur und Inkubationszeit für jedes Enzym werden vom Hersteller genau angegeben. Nach der Inkubation werden das Enzym und andere Verunreinigungen durch Extraktion mit einer Lösung von Phenol- Chloroform aus der DNA entfernt und die digerierte DNA aus der wäßrigen Fraktion durch Fällung mit Ethanol gewonnen. Auf die Digestion mit einem Restriktionsenzym kann eine Behandlung mit bakterieller, alkalischer Phosphatase oder intestinaler, alkalischer Kalbsphosphatase folgen. Das hindert die beiden restriktionsgespaltenen Enden eines DNA-Fragments am "Zirkularisieren" oder Ausbildung einer geschlossenen Schleife, die die Einfügung eines anderen DNA. Fragments an der Restriktionsstelle behindern würde. Falls nicht anders angegeben, folgt auf Digestion von Plasmiden keine 5'-terminale Dephosphorylierung. Diese Verfahren und Reagentien zur Dephosphorylierung werden in den Abschnitten 1.60 - 1.61 und 3.38 - 3.39 von Sambrook et al., siehe oben, beschrieben.
"Gewinnung" oder "Isolierung" eines gegebenen Fragments von DNA aus einem Restriktionsdigest bedeutet Trennung des resultierenden DNA-Fragments auf einem Polyacrylamid- oder Agarose-Gel durch Elektrophorese, Identifikation des interessierenden Fragments durch Vergleich seiner Mobilität mit jener von Markerfragmenten bekannten Molekulargewichts, Entfernung des Gelabschnitts, der das gewünschte Fragment enthält, und Abtrennung des Gels von der DNA. Diese Vorgangsweise ist allgemein bekannt. Siehe beispielsweise R. Lawn et al., Nucleic Acids Res., 9: 6103-6114 (1981) und D. Goeddel et al., NucleicAcids Res., 8:4057(1980).
"Southern-Analyse" ist ein Verfahren, durch das die Gegenwart von DNA- Sequenzen in einem Digest oder einer DNA-hältigen Zusammensetzung durch Hybridisierung an ein bekanntes, markiertes Oligonukleotid oder DNA-Fragment bestätigt wird. Southern-Analyse bezieht sich auf die Trennung von digerierter DNA auf einem Agarose-Gel, Denaturierung der DNA und Transfer der DNA aus dem Gel auf eine Nitrozellulose- oder Nylonmembran, unter Anwendung von Verfahren, die ursprünglich von Southern (J. Mol. Biol., 98: 503 [1975]) beschrieben und wie in den Abschnitten 9.31 - 9.57 von Sambrook et al., siehe oben, modifiziert wurden.
Mit "Transformation" ist das Einbringen von DNA in einen Organismus gemeint, sodaß die DNA entweder als ein extrachromosomales Element oder als chromosomaler Integrant replizierbar ist. Das zur Transformation verwendete Verfahren hängt davon ab, ob die Wirtszelle eukaryotisch oder prokaryotisch ist. Das Verfahren zum Transformieren von Prokaryoten ist das Kalziumchlorid-Verfahren, beschrieben in Abschnitt 1.82 von Sambrook et al., siehe oben. Eukaryoten werden nach dem Kalziumphosphat-Verfahren transformiert, beschrieben in den Abschnitten 16.32 - 16.37 von Sambrook et al., siehe oben.
"Ligation" bezieht sich auf ein - Verfahren zur Bildung von Phosphodiesterbindungen zwischen zwei doppelstrangigen DNA-Fragmenten unter Verwendung des Enzyms Ligase in einem geeigneten Puffer, der auch ATP enthält. "Oligonukleotid" bezieht sich auf kurze, ein- oder doppelstrangige Sequenzen von über Phosphodiester-Bindungen verbundenen Desoxyribonukleotiden. Die Oligonukleotide werden nach bekannten Verfahren chemisch synthetisiert und auf Polyacrylamid-Gelen gereinigt.
Die folgenden Beispiele illustrieren nur die zu praktischen Anwendung der Erfindung als am besten erachtete Vorgangsweise, sollen die Erfindung jedoch nicht darauf beschränken.

BEISPIEL I

I. Konstruktion des Expressionsvektors pRK.t-PA

Plasmid pRK7 wurde als Vektor zur Erzeugung des t-PA-Mutanten verwendet. PRK7 ist identisch mit pRK5 (EP-A-307.247, veröffentlicht am 15. März 1989), außer daß die Reihenfolge der Endonuklease-Restriktionsstellen im Polylinkerbereich zwischen ClaI und HindIII umgekehrt ist. Die t-PA-cDNA (Pennica et al., Nature, 301: 214 [1983]) wurde zur Einfügung in den Vektor durch Schneiden mit Restriktions- Endonuklease HindIII (die 496 Basenpaare 5' vom ATG-Startkodon schneidet) und Restriktions-Endonuklease Ball (die 276 Basenpaare stromabwärts des TGA-Stopkodons schneidet) hergestellt. Diese cDNA wurde in zuvor mit HindIII und SmaI geschnittenes pRK7, unter Anwendung von Standard-Ligationsvorgangsweisen, beschrieben in den Abschnitten 1.68 - 1.69 von Sambrook et al., siehe oben, ligiert. Dieses Konstrukt wurde pRK.t-PA genannt. Siehe Figur 1.

II. Stellengerichtete Mutagenese von pRK7.t-PA

Die stellengerichtete Mutagenese von t-PA-cDNA erfolgte nach dem Verfahren von Taylor et al. (Nucl. Acids Res., 13: 8765 [1985]) unter Verwendung eines von der Amersham Corporation (Katalog-Nr. RPN 1253) erstandenen Sets. Zur Erzeugung des gewünschten Mutanten wurde ein Oligonukleotid mit für die gewünschte Aminosäuresequenz-Substitution kodierender Sequenz synthetisiert und als Primer verwendet. Dieses Oligonukleotid wurde an einstrangiges pRK7.t-PA anneliert, das nach Standardvorgangsweisen (Viera et al., Meth. Enz., 143: 3 [1987]) hergestellt worden war.
Ein Gemisch aus drei Desoxyribonukleotiden, Desoxyriboadenosin (dATP), Desoxyriboguanosin (dGTP) und Desoxyribothymidin (dTTP), wurde mit einem modifizierten Thio-esoxyribocytosin, genannt dCTP(aS), im Set vom Hersteller vorgesehen, kombiniert und dem einstrangigen pRK7.t-PA, an das das Oligonukleotid anneliert war, zugefügt.
Durch Zugabe von DNA-Polymerase zu diesem Gemisch wurde ein, mit Ausnahme der mutierten Basen, mit pRK7.t-PA identischer DNA-Strang erzeugt. Außerdem enthielt dieser neue Strang dCTP(aS) anstelle von dCTP, was dazu diente, ihn vor Digestion durch Restriktions-Endonuklease zu bewahren. Nachdem der Schablonenstrang des doppelstrangigen Heteroduplex mit einem geeigneten Restriktionsenzym eingeschnitten worden war, wurde der Schablonenstrang mit ExoIII- Nuklease nach dem Bereich, der das mutagene Oligomer enthielt, digeriert. Die Reaktion wurde anschließend gestoppt, um ein nur teilweise einstrangiges Molekül zu ergeben. Danach wurde ein vollständiges Heteroduplex-DNA-Molekül durch DNA- Polymerase in Gegenwart aller vier Desoxyribonukleotid-Triphosphate, ATP, und DNA- Ligase gebildet.
Das zur Herstellung von R299D-t-PA verwendete Oligonukleotid war wie folgt: 5'-TCCGGGCGAGTCCGTGTGCTTGGC (Sequenz mit ID-Nr. 1)
Die zur Herstellung von R299D,S300N-t-PA und R299G,S300T-t-PA verwendeten Oligonukleotide waren wie folgt:
5'-CCGCTCTCCGGGNN(G/C)NN(G/C)CCTGTGCTT (Sequenz mit ID-Nr. 2) wobei N ein beliebiges Nukleotid ist und G/C anzeigt, daß das Nukleotid an dieser Position G oder C sein kann.

III. Bakterielle Transformation und DNA-Präparation

Das mutante, nach vorhergehender Arbeitsvorschrift erzeugte t-PA-Konstrukt wurde unter Anwendung der normalen Kalziumchlorid-Vorgangsweise (Abschnitte 1.76 - 1.84 von Sambrook et al., siehe oben) zur Präparation und Transformation kompetenter Zellen in den Wirt E.coli-Stamm MM294tonA transformiert. Der E.coli- Stamm MM294tonA (der resistent gegen T1-Phagen ist) wurde durch Einfügung und anschließende ungenaue Exzision eines Tn10-Transposons in das tonA-Gen hergestellt.
Dieses Gen wurde danach unter Anwendung von Transposon-Einfügungs-Mutagenese in den E.coli-Wirt MM294 (ATCC 31.446) eingefügt (Kleckner et al., J. Mol. Biol., 116: 125-159 [1977]).
DNA wurde nach der Standard-Miniprep-Vorgangsweise, beschrieben in den Abschnitten 1.25 - 1.31 von Sambrook et al., siehe oben, aus einzelnen Kolonien von bakteriellen Transformanten extrahiert. Das Plasmid wurde durch Laufenlassen über eine Sephacryl-CL6B-Spin-Säule weiter gereinigt und anschließend durch DNA- Sequenzierung, Digestion durch Restriktions-Endonuklease und Agarose- Gelelektrophorese analysiert.

IV. Transformation von eukaryotischen Zellen

Nierenzellen 293 menschlicher Embryos (Subklon 293TSA, transfiziert mit dem temperaturempfindlichen, großen T-Antigen-Gen) wurden bis zur 70%-igen Konfluenz auf Platten mit 6 Näpfen in einem DMEM:F12-Medium (1:1), das 1 mM HEPES-Puffer, 0,29 g/l Glutamin, 2,44 g/l Natriumbicarbonat, 0,55 g/l Natriumpyruvat, pH 6,95, enthielt, ergänzt mit 10% Kalbsföten-Gesamtserum vermehrt. Am Tag vor der Transfektion wurden die Zellen gezählt, das Medium abgesaugt und die Zellen trypsinisiert und in demselben Medium auf DMEM:F12-Basis (1:1) mit 10% Kalbsföten- Gesamtserum, das zur Entfernung von Plasminogen durch eine lysinhältige Säule laufen gelassen worden war, wiederum suspendiert. Anschließend wurde die Suspension auf 266.000 Zellen/ml eingestellt, mit je 3 ml pro Napf auf eine Platte mit 6 Näpfen verteilt (800.000 Zellen/Napf) und bis zum Tag der Transfektion inkubiert.
2,5 ug Plasmid, das für den t-PA-Mutanten kodierte, wurden in 150 ul von 1 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA, 0,227 M CaCl&sub2; gelöst. Dem wurden (tropfenweise unter Rühren) 150 ul 50 mM HEPES-Puffer (pH = 7,35), 280 mM NaCl, 1,5 mM NaPO&sub4; zugefügt und 10 min lang bei 25ºC die Niederschlagsbildung abgewartet. Der suspendierte Niederschlag wurde anschließend zu den Zellen in den einzelnen Näpfen in der Platte mit 6 Näpfen zugegeben und über Nacht im Inkubator absetzen gelassen. Danach wurde das Medium abgesaugt und durch serumfreies Medium auf der Basis von DMEM:F12 (1:1), genannt PS-04, das Insulin, Transferrin, Spurenelemente und Lipide enthielt, beschrieben in US-A-7/592.141 siehe oben, ersetzt. Nach sechstägiger Inkubation wurde das Medium abgenommen und Assays unterzogen.

V. Biologische Assays

A. Quantitative Bestimmung von t-PA

Die Konzentration von t-PA in den Zellkultur-Überständen wurde nach der ELISA-Vorgangsweise ("enzyme linked immunosorbent assay") unter Verwendung von polyklonalen Antikörpern gegen Wildtyp-t-PA bestimmt. Die Menge an in jedem nachfolgend beschriebenen Assay verwendetem t-PA basierte auf den Ergebnissen dieser ELISA-Vorgangsweise.

B. S-2288-Assay

Der S-2288-Assay wurde angewandt, um die proteolytische Aktivität der Mutanten in der zweikettigen Form zu messen. Dieser Assay ist ein direkter Assay auf proteolytische t-PA-Aktivität; t-PA spaltet die Bindung zwischen dem kleinen Peptid und dem Paranitroanilid-Chromophor.
Durch Verdünnen von rekombinantem Wildtyp-t-PA (rt-PA) mit Zellkulturmedium wurden Standardkurvenproben hergestellt. Die Standardkurvenproben und rt-PA-Mutanten-Proben wurden in die Näpfe einer Mikrotiterpiatte eingebracht. Da der Assay zum Messen der Aktivität von zweikettigem rt-PA diente, wurde ein Inkubationsschritt mit menschlichem Plasmin in die Vorgangsweise miteinbezogen. Menschliches Plasmin (KabiVitrum) wurde auf eine Endkonzentration von 0,13 CU ("casein units")/ml zugegeben. Die Proben wurden 90 min lang bei Raumtemperatur inkubiert.
Aprotinin [Sigma, ungefähr 14 TIU ("trypsin inhibitor units")/mg] wurde auf eine Endkonzentration von 72 ug/ml zugegeben, um die Plasminaktivität zu inhibieren, und die Proben wurden bei Raumtemperatur 15 min lang inkubiert. Eine 2,16 mM Lösung von S-2288 wurde mit 0,1 M Tris, 0,106 mM NaCl, 0,02% Natriumazid, pH = 8,4, auf 1,45 mM verdünnt und 100 ul dieser Lösung in jeden Napf der Mikrotiterplatte (mit einem Endvolumen von 200 ul in jedem Napf) eingebracht. Die Farbentwicklung wurde bei 405 nm beobachtet. Es wurde der Anstieg der Absorption/Zeit-Kurve für alle Standards und Proben bestimmt. Eine Standardkurve für die rt-PA-Standards wurde durch Auftragen des Anstiegs der Absorption/Zeit-Kurve als Funktion der rt-PA- Konzentration hergestellt. Die relative Aktivitätskonzentration der Mutanten wurde anschließend aus der Standardkurve bestimmt. Die Aktivitätskonzentration jedes Mutanten wurde durch die im rt-t-PA-ELISA erhaltene Konzentration des Mutanten dividiert und die resultierenden spezifischen Aktivitäten bezogen auf Wildtyp-t-PA ausgedrückt, dem ein Wert 1,0 zugeordnet wurde.

C. S-2251-Assay

Dieser Assay ist ein indirekter Assay auf t-PA-Aktivität. In diesem Assay wird Plasminogen durch Einwirkung von t-pA zu Plasmin umgewandelt, und Plasmin spaltet das S-2251-Substrat, wobei der Paranitroanilid-Chromophor freigesetzt wird. Anschließend wird die Produktion dieses Chromophors über die Zeit gemessen.

1. Fibrinstimulierter S-2251-Assay

Es wurden, wie beim S-2288-Assay beschrieben, Standardkurvenproben hergestellt. Die Umwandlung der Proben in die zweikettige Form erfolgte durch deren Inkubation mit Plasmin-Sepharose. Plasmin-Sepharose wurde durch Koppeln von ungefähr 20,8 CU menschliches Plasmin (KabiVitrum) mit 1 ml cyanogenbromidaktivierter Sepharose (Pharmacia) hergestellt. Die Plasmin-Sepharose (50 ul einer 5 %igen Aufschlämmung) wurde unter Schütteln 90 min lang bei Raumtemperatur mit 150 ul Probe inkubiert. lm Anschluß an die Inkubation wurde das Harz durch Zentrifugieren entfernt und 10 ul der Probe in die Näpfe einer Mikrotiterplatte eingebracht.
Menschliches Thrombin (10 ul einer 42 U/ml-Lösung) wurde zu jedem Napf zugegeben. Die Reaktion in jedem Napf wurde durch Zugabe eines Gemisches (130 ul), bestehend aus 28 ul menschlichem Glu-Plasminogen (5,3 uM); 10 ul plasminogenfreiem menschlichem Fibrinogen (10 uM); 30 ul von 3 mM S-2251 (KabiVitrum); und 62 ul PBS, gestartet. Die Farbentwicklung wurde bei 405 nm beobachtet und die Absorption bei der Referenzwellenlänge von 492 nm von iedem Zeitpunkt abgezogen. Der Anstieg der Absorption/Zeit-Kurve wurde für alle Standard- und Mutantenproben bestimmt. Eine Standardkurve für die rt-PA-Standards wurde durch Auftragen des Anstiegs der Absorption gegenüber dem Quadrat der Zeit als Funktion der rt-PA- Konzentration hergestellt. Die Bestimmung der relativen spezifischen Aktivität der Mutanten erfolgte wie für den S-2288-Assay beschrieben.

2. Fibrinogenstimulierter S-2251-Assay

Dieser Assay wurde wie für den fibrinstimulierten S-2251-Assay beschrieben durchgeführt, außer daß Thrombin durch PBS ersetzt und die Farbentwicklung nur bei 405 nm beobachtet wurde.

3. S-2251-Plasmagerinnungs-Assay

Die Herstellung der Standardkurvenprobe und die Umwandlung eines einkettigen rt-PA in zweikettigen rt-PA unter Verwendung von Plasmin-Sepharose erfolgten wie für den fibrinstimulierten S-2251-Assay beschrieben. Menschliches Thrombin (10 ul einer 31 ug/ml Lösung) wurde in jeden Napf der Mikrotiterplatte eingebracht. Die Standard- und Mutantenproben (40 ul) wurden auf die Platte aufgebracht und die Reaktion durch Zugabe von 100 ul eines Gemisches aus 90 ul menschlichen Plasmas mit saurer Zitratdextrose und 10 ul von 9,1 mM S-2251 (KabiVitrum) gestartet. Die Farbentwicklung wurde bei 405 nm beobachtet und die Absorption bei der Referenzwellenlänge von 492 nm von jedem Zeitpunkt abgezogen. Die Analyse der daten erfolgte wie für den fibrinstimulierten S-2251-Assay beschrieben.

S-2251-Plasma-Assay

Dieser Assay wurde wie für den S-2251-Plasmagerinnungs-Assay beschrieben durchgeführt, außer daß Thrombin durch PBS ersetzt und keine Referenzwellenlänge verwendet wurde.
Die Ergebnisse der in den Abschnitten B und C zuvor beschriebenen Assays sind in Tabelle 1 angegeben, wobei R299D-t-PA die Variante dieser Erfindung ist und KHRR296-299AAAA-t-PA (eine in WO 90/02798, veröffentlicht am 22. März 1990, beschriebene Variante), R299D,S300N-t-PA und verschiedene andere Varianten mit Aminosäuresubstitutionen an Position R299 (wie zuvor beschrieben, unter Verwendung von geeigneten Oligonukleotiden hergestellt) zu Vergleichszwecken getestet wurden.
Die Ergebnisse des S-2288-Assays zeigen, daß die Variante dieser Erfindung eine amidolytische Aktivität aufweist, die annähernd vergleichbar mit jener von Wildtyp-t-PA ist. Aktivitätsunterschiede zwischen der R299D-Variante und Wildtyp-t-PA sind bei den S-2251-Assays zu erkennen, wobei das Verhältnis der Plasminogenaktivator-Aktivität von R299D in Gegenwart von Fibrin zu jener in Gegenwart von Fibrinogen anzeigt, daß diese Variante mehr als viermal fibrinspezifischer ist als Wildtp-t-PA in diesem Assay- System. Ein ähnliches Muster wurde beobachtet, als die Plasminogenaktivator-Assays in Gegenwart von menschlichem Plasma und geronnenem menschlichem Plasma durchgeführt wurden. Die Variante dieser Erfindung war in Plasma weniger aktiv als Wildtyp-t-PA, jedoch aktiver in Gegenwart eines Plasmagerinnsels, was zu einer etwa 3,7fachen Erhöhung der Spezifität für Plasmagerinnsel gegenüber Wildtyp-t-PA führte. Tabelle 1 I-PA Variante Fibrinogen (Fg) Fibrin (Fn) Plasma (Pl) Plasmagerinnsel Wild-Typ I-PA

D. Plasmagerinnsel-Lyse-Assay

Die in Tabelle 1 angeführten Proben der t-PA-Varianten plus R299G,S300T-t-PA wurden unter Verwendung von Plasmin-Sepharose, wie zuvor für den fibrinstimulierten S-2251-Assay beschrieben, von der einkettigen in die zweikettige Form umgewandelt.
Der Plasmagerinnsel-Lyse-Assay wurde wie folgt durchgeführt: 10 ul von 0,15 M Kalziumchlorid wurde in die Näpfe der Mikrotiterplatte eingebracht. Jeder Napf erhielt anschließend 90 ul aus einem zentrifugierten und 0,45-u-gefilterten, menschlichen, zitrierten Plasmapool. Der Inhalt wurde sorgfältig vermischt, um das Plasmagerinnsel zu bilden. rt-PA-Standardproben und die zu testenden t-PA-Varianten wurden in Assaypuffer auf das Doppelte ihrer Endkonzentration (18-800 ng/ml) verdünnt. Der Puffer zur Verdünnung bestand aus 0,1 M NaCl, 0,03 M Natriumbicarbonat (kurz vor Beginn des Versuchs zugegeben), 4 mM KCl, 1 mM zweibasiges Natriumphosphat, 0,03 mM Magnesiumchlorid, 0,4 mM Magnesiumsulfat, 20 mM HEPES (4-[2-Hydroxyethyl]- 1-piperazinethansulfonsäure) und 0,01% Polysorbat 80, pH = 7,4. Alle Standards oder Varianten wurden anschließend mit einem Volumsteil des Plasmapools vermischt. Mit insgesamt 100 ul dieses Gemisches wurde danach das Plasmagerinnsel überschichtet, nachdem das Gerinnsel bei Raumtemperatur 6 - 8 h lang absitzen gelassen worden war. Die optische Dichte jeder Platte wurde bei 405 nm abgelesen. Die Platte wurde anschließend bei 37ºC etwa 15 h lang inkubiert und die Messung der optischen Dichte wiederholt. Für jeden Napf wurden die Differenzen der Werte für die optische Dichte von der Zeit 0 - 15 h durch Subtraktion berechnet. Für die Standards wurde die optische Dichte als Funktion des Logarithmus der Konzentration des Standards aufgetragen. Unbekannte wurden aus der Standardkurve interpoliert. Die Normalisierung erfolgte an identisch behandelten Wildtyp-Vergleichsproben. Standardkurven wurden unter Verwendung eines Vier-Parameter-Übereinstimmungsprogramms bestimmt. Der verwendtete Platten-Ableser stammte von den SLT-Laboratorien, Modell EAR340AT (Österreich).
Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt. Tabelle 2 t-PA Variante Gerinnsel-Lyse im Plasma kettig Wild-Typ * Anzahl der Bestimmungen = 3 ** Anzahl der Bestimmungen = 1 *** Anzahl der Bestimmungen = 2
Überraschenderweise weist die Variante dieser Erfindung eine drastisch erhöhte Gerinnsel-Lyse-Aktivität gegenüber jenen von Wildtypt-PA und der KHRR296- 299AAAA-t-PA-Variante auf, ebenso den Mutanten, die an Position 299 mit den meisten anderen Aminosäuren substituiert sind. Sie besitzt auch erhöhte Aktivität gegenüber den Doppelmutanten R299D,S300N- und R299G,S300T-t-PA, was zeigt, daß eine Mutation an der Position 300 die Plasmagerinnsel-Lyse-Aktivität des 299-Mutanten tatsächlich verringert.
Daher besitzt die R299D-Variante eine wesentlich erhöhte Gerinnsel-Lyse- Aktivität, obwohl sie gleichzeitig im Vergleich zu Wildtyp-t-PA erhöhte Fibrin- und Plasmagerinnsel-Spezifität aufweist.

Sequenz-Auflistung

(1) Allgemeine Information:

(i) Anmelder: Genentech, Inc.
(ii) Titel der Erfindung: Substitutionsvariante des Gewebeplasminogenaktivators
(iii) Anzahl der Sequenzen: 2
(iv) Korrespondenzadresse:
(A) Adressat: Genentech, Inc.
(B) Straße: 460 Point San Bruno Blvd.
(C) Stadt: South San Francisco
(D) Staat: Kalifornien
(E) Land: USA
(F) ZIP: 94080
(v) Computerlesbare Form:
(A) Mediumtyp: 5,25 Zoll, 360 kB Floppy-Disk
(B) Computer: IBM-PC-kompatibel
(C) Betriebssystem: PC-DOS/MS-DOS
(D) Software: Patin (Genentech)
(vi) Daten der gegenwärtigen Anmeldung:
(A) Anmeldungsnummer:
(B) Einreichdatum:
(C) Klassifizierung:
(vii) Daten früherer Anmeldungen:
(A) Anmeldungsnummer: 07/629.663
(B) Einreichdatum: 18. Dezember 1990
(viii) Information üder den Anwalt/Agenten:
(A) Name: Dreger, Ginger R.
(B) Zulassungsnummer: 33.055
(C) Referenz/Listen-Nummer: 669
(ix) Telekommunikationsinformation:
(A) Telefon: 415/266-1896
(B) Telefax: 415/952-9881
(C) Telex: 910/371-7168

(2) Information über die Sequenz ID-Nr. 1:

(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 24 Basen
(B) Typ: Nukleinsäure
(C) Strangtyp: einstrangig
(D) Topologie: linear
(iv) Sequenzbeschreibung für die Sequenz ID-Nr. 1: Sonde 1 für R299D
TCCGGGCGAG TCCCTGTGCT TGGC 24

(2) Information über die Sequenz ID-Nr. 2:

(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 27 Basen
(B) Typ: Nukleinsäure
(C) Strangtyp: einstrangig
(D) Topologie: linear
(iv) Sequenzbeschreibung für die Sequenz ID-Nr. 2: Sonde 2 für R299D,S300N und R299G,S300T
CCGCTCTCCG GGNNGNNGCC TGTGCTT 27

Claims

1. t-PA-Aminosäuresequenzvariante, in der Argin in an Position 299 des Widtyp-t-PA durch Asparaginsäure substituiert ist.

2. Variante nach Anspruch 1, in der weiterhin Threonin an Position 103 des Wildtyp-t-PA durch Asparagin substituiert ist.

3. Variante nach Anspruch 1, in der weiterhin Serin an Position 105 durch Asparagin und Alanin an Position 107 des Widtyp-t-PA durch Serin substituiert ist.

4. Variante nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3, in der weiterhin Asparagin an Position 117 des Widtyp-t-PA durcn Glutamin, Alanin oder Serin substituiert ist.

5. R299D t-PA.

6. DNA-Sequenz, die für irgendeine der Varianten nach den Ansprüchen 1 - 5 kodiert.

7. Replizierbarer Expressionsvektor, der in einer transformierten Wirtszelle zum Exprimieren der DNA-Sequenz nach Anspruch 6 fähig ist.

8. Wirtszellen, die mit dem Vektor nach Anspruch 7 transformiert wurden.

9. Wirtszellen nach Anspruch 8, die eukaryotische Zellen sind.

10. Wirtszellen nach Anspruch 8, die Säugetierzeilen sind.

11. Wirtszellen nach Anspruch 10, die menschliche Embryo-Nieren-293-Zellen sind.

12. Wirtszellen nach Anspruch 10, die chinesische Hamstereierstockzellen sind.

13. Verfahren, umfassend Kultivieren der Wirtszellen nach Anspruch 8, um die für die t-PA-Variante kodierende DNA zu exprimieren.

14. Verfahren nach Anspruch 13, worin die Wirtszellen eukarvotische Zellen sind.

15. Verfahren nach Anspruch 14, worin die Wirtszellen Säugetierzellen sind.

16. Verfahren nach Anspruch 13, weiters umfassend die Gewinnung der Variante aus der Wirtszellenkultur.

17. Verfahren nach Anspruch 16, worin die Variante aus dem Kulturmedium gewonnen wird.

18. Zusammensetzung zum Behandeln eines vaskularen Zustands oder Erkrankung, umfassend eine therapeutisch wirksame Menge der nach irgenaeinem der Ansprüche 1 - 5 hergestellten Variante in einem Gemisch mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger.

19. Zusammensetzung zur Verhinderung von Fibrinablagerung oder - adhäsionsbildung oder -wiederbildung, umfassend eine therapeutisch wirksame Menge der nach irgendeinem der Ansprüche 1 - 5 hergestellten Variante in einem Gemisch mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger.

20. Variante nach irgendeinem der Ansprüche 1 - 5 zur Verwendung in einem Behandlungsverfahren.

21. Verwendung einer Variante nach irgendeinem der Ansprüche 1 - 5 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines vaskularen Zustands oder Erkrankung bei einem Säugetier.

22. Verwendung einer Variante nach irgendeinem der Ansprüche 1 - 5 zur Herstellung eines Medikaments zur Verhinderung von Fibrinablagerung oder - adhäsionsbildung oder -wiederbildung in einem Säugetier.