PT96041A - Processo para a obtencao de plaminogenio resistente a clivagem e de composicoes que o contem - Google Patents

Description

0 presente pedido está relacionada sm geral com métodos s materiais para a expressão de um gene codificador da uma variante do plasminogénio e em particular com métodos s materiais para a expressão de uma variante do plasminogénio humano num sistema de células de mamífero e com os seus produtos»

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Pesericãp,, de_.l.rabaJLho^,.Relacignados A acumulação prejudicial de da proteína dos coágulos fibrina nos vasos sanguíneos é evitada pela degradação p?rotealí-tica Cfibrinólise) da fibrina ou do seu precursor fibrinogénio pela encima plasmina <Pm> = Numa grande variedade de perturbações3. os depósitos patológicos de fibrina não são degradados espontá— neamente, resultando sm trombose» a presença de um coágulo sanguíneo (trombus) num vaso sanguíneo» Em muitos casos,, a terapia trombolítica? i=e=3 a dissolução do coágulo sanguíneo pela Pm» é o único tratamento possível»

J

Pm é produzida em circulação pela activaçlo de um precursor,, a «proenzima» ou «zimogénio» designado plasminogénio (Pg}= A terapia trombolítica é conduzida pela administração de um activador do plasminogénio» Entre tais aetívsdores do plasminogénio estão a estrsptoquinase (SK)3 urocinase (UK) e activador do plasminogénio de tecido Ct-PA).

Pg humano ÍHPg) existe na circulação como uma glicopro-teina de cadeia simples contendo 791 aminioácidos tendo um aminoàcido amino-terminal de Glu ÍHPg circulante pode assim ser

V ' - ί Εΐ Ο Ν ,τ'·’ referida eosno L 61 u ~ 3 plasminogénio) Forsorsn et sl = » FEBS Lette „ 215s 254-260 \1987)s Malinowski et al = , Biachem. » 23s 4243-425Φ <1994>% McLean et al = 5 Nature, 53Qs 132-137 (1987)* Sottrup- -Jensen et al., Proa. Chem. Fibrinolvsis Thromboivsis., 3s 191-209 (1978) ? Wiman5 Eur. J. Biochem. g 59s 1-9 (1973)? e Wiman, Eur. J» Biochem,, Zás 129-137 <1977)3. A análise da sequfncia de açúcares de Hrq revela que existem duas variantes de glicosilaçSo3 uma primeira tendo dois

28^1 ~ xã-A sitios de qlicosilaçSo (Asrt " e lreWi”) e uma segunda tendo um sítio de glicosilaçSo CTrs'- )3 com subformas apresentando sialalação imcompleta ECastellino9 Chemπ Rev =, » 81 = 431-446 (1981)3» Estas formas s subformas slo exemplos de modificacSes pás-tradução apresentadas pelo plasminogénio circulante. HPg é activado por clivagen? de uma ligaçSo psptídica Arg‘J’J,‘“Valw'^J" para produzir a praiease serina CLis' “ 3Pm de duas cadeias ligadas por pontes dissulfureto. Esta molécula tambémnSo possui os 77 aminaáeidos araino-terminais como resultado da autólise por Pm humano (HPm) formado durante a activação CÍVioland e Castellino, J. Biol. Chem.. 251=3906-3912 <1976)3. A clivagem pode ser catalisada por uma variedade ds activadores,, entre os guais estão SK5 UK e t-PA. CPara uma revislo5 ver Castellino., Bioscience, 35 = 647—650 (1983) »3 Enquanto as duas últimas proteínas são enzifiias que catalisam directamente a clivagem da ligsçao peptídica adequada em HPq, na presença de HPm3 SK não tem tal actividade inerente e a sua actividade de activador do plasminogénio baseia-se na sua capacidade para formar complexos com HPg e HPm e utilizam- os sitios activos da plasmina latente destas duas últimas moléculas para funcionar como um activador <Castellino9 supra).

CBlu"3Pg eKiste no plasma na forma de duas variantes principais, as quais diferem no seu grau de glicosilaçSa em fisn*-"' LHayes s Castllino, u* Biol = Chem. = 254s 8768-8784) (1979): Castel Uno, supra u Em EBlu^jpg, a cadeia, pesada da plasmina latente , que inclui os resíduos 1-561, contem cinco regiões altamente homólogas designadas «kringles» rSottrup-úensen et al. supra3 = cada uma contando aprosímadamente 8Θ aminoâcidos. Estas «kringles» provávelmente existem como domínios independentes CCastellino et al., J. Biol. Chem.. 256 4779-4782 (1981)3 a são importantes para as propriedades funcionais de HPg e de HPm. Como exemplos, o domínio «kringle» 1 <resíduos de aminoácidos 84-162) podem ser importantes na interseção da plasmina ou do plasminogé-nio com fibrina e fibrinogénio CLucas st al»? 3 = BioL Chem., 258s 4249-42564 (1983)3, com o efector de activaçlo negativo (Cl) Ctlrano et al., 3, Biol, Chem. ,262; 15959-15964 <1987)3 e com o efector de activação positiva ácido epsilon-aminocapróico (EACA) Markus et al, 3 = Biol. Chsn = 253s 727-732 <1978)3= Em adição, o mesmo segmento é responsável pela ligação inicial rápida do HPm ao seu principal inibidor do plasma, α^-antiplasmina uloroi e Aoki, 3. Biol = Cheia,., 251 s 5956-5965 (1976)3= A região «kringle» 4 (resíduos 358-435) parece conter sítio(s) de ligação a EACA i presentes em LSlu.”jpg, que podem estar envolvidos na alteração conformacional muito grande de LBlui3Pg induzida pelo ligando CVioland st al=, Arch» Biochem= Blaphys.·, 17Ls 30Θ-3Θ5 (1975)3 ε num concomitante -aumento da velocidade de activaçlo do zimogé-nio na presença do efector positivo EACA ÍClasys e vermyslin, Biochem.,.....Bi.ophys, Ac ta, 342, 35Í-359 (1974)3 =

Se bem que a terapia trombolítica seja útil, o seu potencial terapêutico está limitado pela disponibilidade do plasminog-énio no sítio do trombus. A concentração do plasminogé-nio pode estar limitada devido ao consumo do plasminoqénio como resultado da terapia trombolítica, devido à quantidade inadequada

tromfai „ ou à depleção local do a idade do trombos s da isquémia à redução do fluxo sanguíneo). 185 (8upl. í), iè5-175 (1988)3. a quantidade localmente disponível da plasminogénio presente nas plasminogénlo relacionada com (uma anemia localizada devido CAnderle et al., Raemostasis»

Assim, é desejável suplementar do plasminogénio»

Se bem que a expressão de grandes quantidades de plasminogénlo num sistema de expressão recombinante seja uma via conveniente para se obter plasminogénlo para usar na terapia trombolífcica, tem havida grandes dificuldades na expressão de HPg Intacta nos sistemas de expressão de mamíferos devido á presença ubíqua de activadores do plasminogénio intracelulares entre os diferentes tipos de células de mamífero. A presença destes activadores resulta no aparecimento de uma forma degradada da HPg em meio condicionado celular de tais sistemas de expressão, possivelmente devido à auto-digestão do plasminogénlo pelo HPm produzido EBusbv et al», Fibrinolysis„ 2, 64 (1988)3»

Um plasminogénlo recombinante humano foi produzido em células de- insecto íirHPg) que., pela análise da sequência de aminoácitíos amino-terminal, cálculo do peso molecular em SDS-PABE, comportamento em cromatoarafia de afinidade em Sepharose--lisina, características de activação, reactividads de anticorpos e actividade da plasmina resultante, parece ser comparável nas propriedades ao ESlu^3Pg do plasma humano. EWhiteíleet-Smith et al=s Arch. Biochem. Biophys.. 271s 39Θ--399 (1989)3= Este é um resultado importante, uma vez que não se verificou expressão com ‘êxito de HPg recombinante tipo selvagem <wt~rHPg) em células de mamífero. Nd entanto, quando as propriedades cinéticas dos complexos equimolares formados a partir de estrsptaquinase com HPg do plasma e com irHPg foram comparados, oéis de SDS/PA8E dos acontecimentos temporais dentro dos respectivos complexos foram idtnticos aos resultados publicados por tíajai e Casteliino, J. Bisl= Chesn»= 252s492-498 ΐ1977>?par ter ocorrido uma rápida conversão de HPg em HPm. Isto sugere que HPg nSa é um componente estável do complexo.

Sabe-se que o sitio de clivagem do t-PA humano incluindo as posiçSes 27Θ-28Θ pode ser modificado para criar uma variante do t-PA que seja resistente ou imune à clivagem enzimática especifica» Por exemplo, foram descritas variantes do t-PA CEP Pat Publ. N9 199,5743 que t®m substituições de aminoácidos nos sítios de clivagem proteolítica nas posições 275,276 e 277= Estas variantes, caracterizadas preferencialmente como variantes do t-PAtendo um aminoâcido diferente de arginina na posição 275= são referidos como variantes do t-PA de uma cadeia resistentes ès proteases? ao contrário do t-PA natural= que pode existir na forma de uma cadeia ou de duas cadeias, elas são resistentes á clivagem por proteases na posição 275 e não são portanto metabólicamente convertidas in vivo numa forma de duas cadeias.Pensa-se que esta forma uo t-PA tenha certas vantagens biológica e comer-cialmente, por ser mais estável e a sua ligação á flhrina e a estimulação da fibrina estarem aumentadas ralativaments ao t-PA de duas cadeias.Uma outra forma do activatíor do olasminogénio contem um domínio capaz de interactuar com fibrina e o domínio de protease da urocinass, com uma realização prática sendo a uroci-nase alterada para torná-la menos susceptivel á formação de urocinase de duas cadeias» Ver WO 88/&50BÍ publicado em 14 de Julho de 1988=

Para outra literatura de patentes relativa á modificação do sítio de clivagem por proteases do t-PA, ver, por exemplo, EPO Pat. N2 241,209? 201,153 publicado em 12 de Novembro, 1986, 233,013 publicado em 19 de Agosto, 1987? 292,©©9 publicado em 23

ds Novembro5 1988¾ 293,936 publicado sm 7 de Dezembro, Í988p e 293,934 publicado em 7 de Dezembro, 1988¾ e WO 88/19119=

Constitui um objectivo do presente invento projectar uma molécula, de plasminogénio que seja estável como tal num complexo com uma enzima fibrinolítica tal como estreptoquinasee é portanto mais a.ctiva do que a molécula natural

Constitui um outro objectivo do presente invento produzir a molécula do plasminogénio em qualquer sistema de expressão recombinania, não só nos- que não têm um activadordo plasminogénio endógeno específico de sítio í tais como células de ínsecto) =-.

Estes e outros objectivos tornar~se~So aparentes para os familiarizados com a matéria»

Sumário do Invento

Assim, o presente invento proporciona uma sequência ds ácido nuclsico codificadora de um plasminogénio resistente â clivagem proteolítica para a sua forma de duas cadeias, de preferência plasminogénio humana e mais preferencialoisnts E8iu~1-ρ1asro i noqên i o»

Num outro aspecto, o invento proporciona um vector de expressão compreendendo a sequência de ácido rmcleico operacional mente ligada a sequências de controle, assim como células hospedeiras compreendendo o vector, de preferência células hospedeiras eucarióticas e mais preferencialmente de mamífero» f

Ainda num outro aspecto, o invento proporciona um método para. a. produção de um plasminogénio compreendendo o passo de cultura das células contendo o vector atrás descrito e de preferencia também d passo de recuperação do plasminogénio a partir da cultura celular ou do meio de cultura se a molécula for seereiada

Ainda num outro aspecto, o invento proporciona um plasminogénio resistente â clivagem prateaiitica na sua forma de duas cadeias» De preferfncia, o plasminogénio é uma variante de sequência de cadeia simples alterada na seu sitio de clivagem em duas cadeias 561-562.. 0 presente invento também proporciona uma composição farmacêutica para efecfcuar trouihólise compreendendo uma quantidade eficaz do plasminogénio descrito atrás formulado num veículo farmacêuticamente aceitável= A composição também inclui preferencialmente uma encima fibrinolítiea compleKada com o plasminog-é-nio,

J u presente invento ainda proporciona um método para terapia trombeiitica compreendendo o passo de administração a um mamífero necessitado de terapia trombolitica de uma quantidade eficaz da composição farmacêutica atrás descrita»

Ainda num outro aspecto, o invento proporciona um método para a preparação de um complexo binário entre uma enzima fibrinolitica e o plasminogénio, o complexo tendo um sítio catalítico essencial para a actividatíe fibrinolitica bloqueado por um grupo removível por hidrólise, eompreendendoumisiura de uma enzima fibrinolítica com o plasminogénio resistente â clivagem aqui tratado para formar um complexo binário na presença de um excesso de um agente bloqueador da fórmula A-B ou E-Fs em que A é um grupo bloqueador sensível à hidrólise que é selectivo para d sítio catalítico essencial à actividsds fibrínoiítica e é capaz de transferir do grupo B para o sítio catalítico,, B 6 um grupa que facilita a ligação de ft à enzima,, E é um grupo de localização que localiza o agente no sítio catalítico s F é grupo bloqueador sensível à hidrólise que é capaz de transferir do grupo de localização para o sítio catalítico»

As variantes do plasminogénio preparadas de acordo com o processo aqui apresentado não se degradam para plasmina num complexo com estreptoquinase e rápidaments (ί 3© seg«) desenvolvem actividade amidolítica e de activador da plasminogénio»

Brevs Descrição dos Desenhos

Figura 1 é a sequência nucleotídica do vsctor pUCl19ΡΝ127»ό? sxcepto o nucieotídso na posição 3809 do vector conter um T, enquanto a sequência da Fig» i também inclui uma sequência de aminoácidos deduzida para o plasminogénio humano tendo a sequência nativa»

Figura 2 mostra a construção do vector pSVl-tPA»

Figura 3 mostra a construção do vector pSVI2-tPA„

Figura 4 mostra a construção do vector pSVI3—tPA»

Figura 5 mostra a construção do vector pSV I5-~t.Pfí =

Figura 6 mostra a construçãodo vector pSVIóiá-tPA» 10

Figura 7 mostra a construção de pA475R'oóiaPq usada na expressão de uma variante HPg de acordo com este invento,

Figura 8 é um fiuxograma que esquemáticaments descreve a construção do vector de transferência baculovirus pAV6 usado na expressão em células de insecto»

Descrição Detalhada de Realizações Preferidas A» Definições

Conforme aqui é usado, «plasminoqénio» ou «Pg» refere-—se ao piasminogénio de qualquer espécie, incluindo plasminogénio bovino, equino, porcino, ovino, canino, fsurino s felino, assim como plasminogénio humano tendo a sequência de aminoácidas apresentada na Figura 1, desde que tenha a actividade biológica de Pg nativo, 1„ s», é capas de ser clivado por um activador do plasminogénio íestraptoquinase, urocinase ou activador do plasmi-nogânia tipo tecido) para'produzir plasmina, ou possui um epitopo imune que dá reacção imunológica cruzada com um anticorpo induzido contra pelo menos um epítopo do Pg nativo»

As variantes do plasminogénio são definidas como moléculas em que a sequência de aminoácidas da Pg nativa foi modificada, tipicamente por uma mutação predeterminada, em que pelo menos uma modificação torna o plasminogénio resistente á clivagem proteolítica para dar a sua forma de duas cadeias» A sequência de aminoácidos das variantes de Pg incluem, por exemplo, tíeleções ou inserções ou substituições de resíduos dentro da sequência de aminoácidos Pg mostrada bna Figura i« POds ser feita qualquer combinaçaS de deieções, inserções e substituições para se chegar à construção final, desde que a construção final possua a resistSneia. pretendida á clivagem e actividade biológica» óbviamente, é preferido que as mutações feitas no DNA codificador da variante Pg não coloquem a sequência fora da grelha de leitura e ê ainda preferido que nao criem regiões complementares que possam produzir estruturas secundárias ds niRNA (ver, eq= Pedido de Patente Europeia N9 075,444)=

Um «sitio da clivagem para duas cadeias» em Pg e o «sítio de clivagem proteolitica para a sua forma de duas cadeias» compreende pelo menos o resíduo arqinins na posição 561 ds HPg No entanto, pensa-se que vários aminoácidos adjacentes ou dentro de vários resíduos da posição 561 também sejam parte do domínio reconhecido pelas encimas que convertem o plasminogénio na sua forma de duas cadeias» Assim, a substituição de aminoácidos noutras posições que não a 561 dentro do domínio poderá resultar em plasminagénios mutantes que s-So resistentes à conversão na forma de duas cadeias»

Na realização particular, «variante do plasminogénio de cadeia simples» ê um plasminogénio que é resistente á conversão na forma ds duas cadeias no sítio de clivagem 561-562» ή caracte— rizado por por uma ou mais substuições de aminoácidos no sitio de activaçlo de duas cadeias» Tal sítio de activação modificado não é ensimáticamente reconhecido e portanto, não hidrolizado por enzimas que normalmente convertem o plasminogénio na sua forma de duas cadeias»

Por analogia com a tripsina s quimiotripsina, pensa-se que a importância da formação da forma de duas cadeias de qualquer protease serina seja a presença subsequente do grupo a-amina em HPg na posição 562= Nesta comparação, quando da clivagem em aro 561, o grupo a-amina 562 fique livre para interactuar com a cadeia polipeptidics na área. da serina do sítio activo do ί

plasminogénio» 0 presente invento cobre pois qualquer mutação que interfira com a interseção de tal grupo a—amina com o sitio activo da protease sem diminuir a actividade global da molécula, j

J «Ligado operacionalmente» como aqui é usado refere-se a uma justaposição tal que a função normal dos componentes possa ser desempenhada. Assim, uma sequência codificadora «operacional-mente ligada» para controlar sequências refere-se a uma configuração em que a sequência codificadora possa ser espressa sob o controle destas sequências e em que as sequências de DMA a ser ligadas sejam contíguas e, no caso de um líder de secreção, contíguas e na mesma grelha de leitura, Por exemplo, o DNA para uma pré-sequência ou líder de secreção é ligado operacionalmente a DNA de um poiipeptíded se ele for expresso como uma prsproteírts que participa na secreção da polipeptídeog um promotor ou potenci-ador é operacionalmente ligado a uma sequência codificadora se ele afectar a transcrição da sequência? ou um sítio de ligação ao ribossoma ê operacionalmente ligado a uma sequência codificadora se ela for posicionada para facilitar a tradução da sequência codificadora, Ã ligação é conseguida por junção em sítios de restrição convenientes. Se tais sítios não exixtirem3 então podem ser usados oligonueleétidos adaptadores sintéticos de acordo com o que á prática convencional,

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Como aqui é usado, «célula», «linha celular» e «cultura celular» são usados- indiferentemente e toadas estas designações incluem progénie, Assim o termo «transformamtes» ou «células transformadas» inclui a célula inicial e as culturas derivadas dela independemtemente do número de passagens. Deve—se também entender que toda a progénie pode nao ser precisamente idêntica no seu teor em DNA devido a mutações deliberadas ou inadvertidas. Também está ineluido nestes termos a progénie mutants que tem a mesma função para a qual a célua inicial é testada. «Sequências de controle» refere—se a sequências tíe DMA necessárias à expressão de uma sequência codificadora operacio-naJ.mente ligada num organismo hospedeiro particular» As sequências de controle que são adequadas para procariotasj por exemplo, incluem um promotor facultativamente uma sequência de operador, um sítio de ligação ao ribossoma e possivelmente outras sequências ainda mal conhecidas» 0 termo «sistema de expressão» refere-se a DMA contendo uma sequência codificadora pretendida e sequência de controle em ligação operacional, de tal forma que os hospedeiros transformados com estas sequências são capazes de produzir as proteínas codificadas» Para transformação, o sistema de expressão pode estar incluído num vector designado aqui como «vector de expressão»» Mo entanto, o DImh importante pode também ser integrado no cromossoma do hospedeiro» B. Maneiras de Kealizar o Invento

Para fins deste invento, o plasminogénia variante é aquele que é resistente à clivagem protsolítica para a sua forma de duas cadeias, geralmente pela plasmina. De preferência, a sequência variante baseia-se no plasminogénio humano» Se hem que tais variantes possam ser preparadas de qualquer forma, tanto recombinante como sintética ou parcialmente sintética, de preferência os variantes são aqueles em que um dos resíduos de aminoá-cidos, de preferência a arginina na posição 561» colocada no sítio de clivagem crítico na conversão de HPg para HPm, é substituída por um outro aminoácido, de preferência não um resíduo lisina e mais preferencialmente uns aminoácido contendo dicarhoxi-lo ou serina» Assim, as variantes mais preferidas são R561S-HPg, / ϊ

! RSàlE-HPg e R5òlG-HPg= usando a nomenclatura indicada abaixo» (A designação «A475» para HPg refere-se è sequência natural de HPg com um resíduo alanina na posição 473, em oposição â sequência encontrada em pUCl19PN127= 6, a qual tem uma valina na posição 475= As designações R561S~HPg, R5éíE-HPg e R5618-HPg usadas abaixo e nas reivindicações referem—se, a menos que de outra forma, seja estabelecido» a HPg com uma alanina na posição 475=)

As variantes podem ser preparadas por mutagénese dirigida de nucleótitíos no DNA codificador ds Pg, produzindo assim DNA codificador da variante e subsequente expressão do DMA na célula hospedeira adequada. 0 DNA codificador de Pg resistente à proteólise pode também ser sintetizado quimicamente s montado através ds uma série de técnicas» antes da expressão numa célula hospedeira. EVer, e = g=5 Caruthers, Patente li = 3= M9 4,5ΘΘ, 7©7;; Balland et al = = Biochimie- 67s 725-736 (1985)s Edge et al« , Nature= 292s 756-762 <1982)1=

Noutras realízaçSes, a variante pode ser çlicosilada, tal como é conseguido por tratamento do plasminogénio expresso num hospedeiro eucariótico com uma enzima adequada para. tais fins como seja gliccspaptida.se F« Também, a variante pode conter outras mutações, especialmente qualquer uma que seja benéfica para a sua actividade= o

Para uma designação abreviada das variantes HPg aqui descritas, deve-se notar que os números se referem ao resíduo de aminoácido/posição ao longo das sequências de aminoácidos do Pg putativo maduro» A identificação dos aminoácidos utiliza o alfabeto de aminoácidos de uma só letra, i=e==

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HSp D Ácido aspártico Ile I Isoleucina Tre T Treonina Leu L Leucina Ser s Serina Tir ¥ Tirosina 61 u E Ácido glutâillico Fen F Fenilala. Pra P Prolina His H Histidina Bii 6 Blicina Lis K Lisina Ala A Alanina Arg Fi Arginina Cis c Cisteina T Γ p W Triptofano Vai V va1ina Sln Q Glutamina net M Metionina Aso N Asparagina -A designação para uma variante de substituição aqui

tratada consiste numa letra seguida de um número seguido de uma letra» A primeira Cmais à esquerda) letra designa d aminoácido no Pg maduro tipo selvagem» Q número refere-se à posição do amino-ácido em que a substituição foi feita e a segunda Cã direita) letra designa o aminoácido que foi usado para substituir o aminoácido tipo selvagem» A designação para uma variante de inserção consiste na letra i seguido de um número designando a posição do resíduo no Pg maduro tipo selvagem antes da qual começa a inserçãos seguido de uma ou mais letras maiusculas indicandos inclusivamente, a inserção a ser feita» fi designação para uma variante de deleção consiste numa letra d seguida do número da posição de iniciação da deleção até -ao número da posição terminal da deleção5 com as posiçSes sendo baseadas no Pg maduro tipo selvagem» Várias mutações sãc? separadas por uma vírgula na notação para facilitar a sua leitura»

Seguem-se exemplos da nomenclaturas uma variante de substituição em que a arginina na posição 561 do Pg tipo selvagem foi substituído por um resíduo de ácido glutlmico è- designada R56-ÍE» Uma variante de substituição com múltiplas substituições em posições consecutivas 561-562 de EE para Rv é designada R561E3V562E= Unia variante de inserção em que císteina s valina foram inseridas a seguir à posição 56® do Pg tipo selvagem â designada Í566CV» Urna variante de delação em que os aminoàcidos nas posições 561 a 562 foram eliminados do Pg maduro tipo selva·" gem5 foi designada dou1-562„ A notação ”HPg" segue-se a cada um dos mutantes» A maior parte das deleções e inserções e substituições em oarticularnSo se espera que producam alterações radicais nas caracteristicas da molécula de Pg recombinante» No entanto, quando é díficil prever com antecedência o efeito eMacto da substituiçaos deleçao ou inserção, por exemplo, quando a modificação do sitio activa de Pg ou de um epítopo imune, alguém fami1iarisado com a matéria apreciará que o efeito pode ser avaliado por ensaios de despiste de rotina* Por exemplo, uma variante tipicamente pode ser feita por nmtagénsss dirigida do ácida nuclsico codificador da Pg nativa, expressão de um ácido nucleico variante numa cultura de células· recombánantes e, facultativaments, purificação a partir da cultura celular, par exemplo por sds-orção de afinidade numa coluna de policlenais de coelho anti~-Pg = A variante pode ser então despistada num ensaio de despiste adequado quanto à caracteristica pretendida» Por exemplo, uma alteração nas caracteristicas imunológicas do Pq, como seja afinidade para um determinado anticorpo» pode ser medida por um imunoensaio competitivo» As alterações dos níveis de activaçlo são medidos pelo ensaio adequado» Modificações de propriedades das proteínas tais como estabilidade redox ou estabilidade térmica, hidrofobicidade, susceptibilidade â degradação oroteolí— tica ou a tendência para agregar com veículos ou em mui timeros serem testados por métodos bem conhecidos dos fami1iaricados com S â Γ S S =

Os vsctores e métodos aqui divulgados são adequados para usar em células hospedeiras numa larga gama ds organismos procariotas e eucariotas, mais preferencialmente eucariotas e ainda mais preferencialmente hospedeiros mamíferos»

Em geral, os procariotas são preferidos para a elonaqem inicial, amplificação ou armazenamento das vsctores· de interesse» 0 DMA vector è fácílmente obtido a partir de certos procariotas» £». coli K12 estirpe HM 294 ÍATCC N2 31,446) é particularmente útil para este fim» Outras estirpes microbianas que podem ser usadas incluem estirpes de E»_ coli tais como E=_ coli S s E»_ coli X1776 ÍATCC ΜΘ 31,537)= Estes enemplos são, certamente, destinados a ilustrar o invento e nãa limítantes do mesmo»

Em geral, os vectores plasmideo contendo reolicão e sequências de controle que são derivadas ds espécies compatíveis com a célula hospedeira são usados em ligação com estes hospedeiros procariotas» 0 vector normalmente ê portador de um sito de replicaçao, assim como de sequências de marcas que são capazes de proporcionar selecção fenotipiea em células transformadas» Por exemplo, E=_ coli é típicamente transformada usando pBR322, um plasmideo derivado de uma espécie de E»_ coli (ver, e»g», Bolivar st al » , Gene = 2;;05 E19773)= pBR322 contem genes para a resistência à ampicilina e á tetraciclina e portanto proporciona meios fáceis para a identificação de células transformadas» 0 plasmideo pBR322s ou. outro plasmideo microbiana ou faga, deve também conter ou ser modificado para conter, promotores que podem ser usados pelo organismo microbiano para expressão de genes de marcas selectivas»

·&· -·

Os promotores reais vuigarmsrsts usados na construção de DMA recombinante para hospedeiros procsrióticos incluem os sistemas de promotores da g-lactamase ípenicilinase) e da lactose (Chang et al = 5 Nature, 575 s 615 E19783; Itakura et a. Ls Sc ienes, 198¾ 1056 C19773 5 Boeddel et al „ f Nature , 281 s544 í 1979 4) e um sistema promotor do triptofano (trp) (Boeddel st ai», Nuc1sic Acids Res.« 8s 4057 C198035 EPO Appl. PUbl. NS 0036,776)= Se bem que estes sejam os ma is vulgarmente usados,, foram descobertos e utilizados outros proíiíofcores microbianos e os detalhes respeitantes às suas sequfncias de nucleétidos foram publicados, permitindo a um trabalhador experiente ligá-los funcionalmente com vectore piasreideos (ver, s = g=, Sisbenlist st al»? Cel 1 , 29r, 269 C1980])=

Para a expressão, são usados microorganismos sucarióii-cos, tais como culturas da levedaras» Saccharomyces cerevisiae ou a vulgar levedura de padeiro, é o micrDorganismo eucariótico mais vulgarmente usado, se bem que existam outras estirpes» Para a expressão em Saccharomvcss, è normabnents usado o plasmideo YRp7 = por exemplo (Stinchcomb et al», Nature-, 282s 39 t197935 Kingsman et al =, Bens, 75 141 C19793; Tschemper et al = ,, Bene= 10¾ 157 C19803).. Este plasmideo já contem o gene trpí que proporciona uma marca sslectiva parauma estirpe mutante de levedura sem capacidade para crescer em triptofano, por exemplo, ATCC NQ 44,976 ou PEP4-1 (Janes, Senstics,, 85;i 12 119773)= A presença da lesão do trpl como característica do genoma da célula bospedeia de levedura proporciona então um ambiente eficaz para a detseção da transformação por crescimento na ausência de triptofano,

Sequfncias de promotores adequados em vedores de leveduras incluem os promotores para a 3—fosfoglicerato—cina.se (Hitzeman et a!== J = Ãdv= Enzvme Reg„= 7s 149 E19683; Holland st al =, Biochemistry, 17; 49ΘΘ 119783), como sejam enola.se, X,

J g 1 icera 1 deído-3-fosfato-desidrogenass, hexoc Inase, pi ru.vato—des— carboxilase, fosfofrutocinase, glucoss-ó-fosíato-isomerase, 3-fQsfogIicerato-mutase, piruvato-cinase, triosefosíato-isomera-3a, fasíog 1 ucose-isDinerass e giucocinase» Outros promotores? que t'§m a vantagem adicional da transcrição controlada pslas condi-çSes de crescimento» são a região do promotor da álcooi-desidro-genase 2, isocitocrómio C, fosfatase ácida, enzimas degradativas associadas ao metabolismo do azoto e a g1icera ldeído-3-f os-fato— desidrogenase e enzimas responsáveis pela utilização da maltose s da galactose» é adequado qualquer vector plasmideo contendo promotor compatível com levedura, origem de rsplic-ação e sequências de terminação»

Para além dos microorganismos, podem também ser usadas como hospedeiros culturas de células derivadas de organismos muiticelulares. Em principio, qualquer uma destas culturas poderá ser usada, quer seja uma cultura de vertebrado quer seja de i n ve r t e h r ad o.

Para a expressão em hospedeiros invertebrados, foram identificados numerosas estirpes de baculovírus e variantes e correspondentes células hospedeiras de insecto permissivas a partir de hospedeiros tais como Aedes aegvpty (mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melanoqaster (mosca da fruta) e Bginbyx mori* (ver, e.g«? Luckow et al», Bio/Technalaav„ 6 5 47-55 (1938)5 e Maeds eta al-, Nature. 3-15s 592-594 (1985))= Uma variedade de tais estirpes virais estão disponíveis ao público, e.g., a variante L-l de Autoqrap-ha caiifornica WPv e a estirpe Bm-5 de Bomhyx moriWPV, e tais vírus podem ser usados de acordo com o presente invento, particularmente para a transfecção de células de Spodoptera frugiperda. ΐ

J

Ho sntanto, q intsrssss tem sida maior em células de vertebrados e a propagação ds células ds vertebrados em cultura ícultura de tecidos) tornou-se um processo de rotina nos últimos anos ETissue Culturs» Acadsmic F'rs=.5;i Kruse e Patterson, editores (1973)1= Exemplos de tais linhas de células hospedeiras de vertebrados úteis incluem a linha de rim de macaco CV1 transformada por sequfncias de SV4® (003-7.. ATCC CEL 1651)=, linha de rim embrionário humano C 293,, Sraham et al., 3= Sen = Vi rol = 56 ϊ 59 (1977)): células de rim de hamster bebé ÍBHK, ATCC CCL 10); células de ovário de hamster chinfs (Urlaub e Chasin, Proc= Natl« Acad- Sci= USA- 77s 4216 (1980)); células de Sertoli de murganho (TM4, Mather, Biol » Reprod=„ 25n 243-251 (198®))? células de rím de macaco verde africano <vEE0-76;; ATCC CRL-1587) ; células de carcinoma cervical humano CHELA, ATCC CCL 2)? células de rim canina (MDCK, ATCC CCL 34); células do fígado ds murganho búfalo (BRL 3A = ATCC CRL 1442)= células de pulmão humano CW138, ATCC CCL 75); células de fígado humano (Hep 82, HB S®65)s células de tumor mamário de murganho (M1TF 060562, ATCC CCL5í)s células de hepatoma de rato (HTC= Ml = 54-;! Baumann et al « , J. Cell. Biol = = 85ã 1—8 (1980))? e células TEI (Mather st al»Annals N.Y, ficad.. Scí»=a 383s 44-68 (1.982))= O hospedeiro sucariótico mais preferido aqui para a expressão estável é uma linha celular de ovário de hamster chin!s=

Para usar em células de mamífero» as funções de controle nos vectorss de expressão s-3o muitas veces proporcionadas por material víral= Por exemplo, promotores vulgamente usados derivam de qenomas de poliama, Adenovírus 2= retrovírus, citomegalovírus e masi frequsntsmsnte Vírus Símio 4® CBv4®>= Outros promotores são os ds fontes heterálogas, e = g=, o promotor da beta-actina= Os promotores precoce e tardio do vírus SV4® são particularmente úteis pois ambos sSo fácilmente obtidas a partir do vírus como um fragmento que também contem a origem de rspIicãçSo virai do SV4® 4

J EFisrs et al, , Naturs, 273s 113 (197853= Fragmentos maiores ou mais pequenos do SV4ô podem também ser usados, desde que seja incluída a sequência de aproximadamente 25Θ ph que vais desde o sitio HindiII até ao sitio BqlI situado na origem de replicaçao virai, 0 promotor precoce imediato do citomegalovirus humano έ convenientsmenle obtido como um fragmento de restrição HindiIIB Sreenanav et al«, Gene18 s 355-3Ó© (1982)= Ainda, á também possivsi s muitas veces desejável utilizar sequências de promotor ou de controle norma Imante associadas & sequência do gene pretendido, desde que tais sequências de controle sejam compatíveis com os sistemas da células hospedeiras» A transcrição de um DNA codificador do Pg por eucsrio-tas superiores à aumentada pela inserção de uma sequência de potenciador no vector» 0 potenciador é um a1emento do DNA que actua em eis, gerslments tendo entre 1Θ e 3ΘΘ pb, que actua sobre o promotor para aumentar a sua actividade de transcrição-iniciação, Os potenciadores sSo relatívamente independentes da orientação e posição, tendo sido encontrados õr „ " U_axm.tns et al=, Fracr

Na ti.» Acad Sei» ...USA., TB^S (1981)) e 3» (Lusky st al., Mal. Cei 1 .·, Biol» „ 3s ϊίΘΘ (1983)) relativamente à unidade de transcrição, dentro de um intrão ÍBsnerji et al,, Cel l, 53 729 (1983)) assim como dentro da própria sequência codificadora (Osborne et a 1 ·, Hoi , Cel 1» Biol» . 4; 1293 (1984)), De preferência., no entanto, d elemento potenciador está situado a montante da sequência do promotor para este invento. São agora conhecidas muitas sequências potenciadoras derivadas de genes de mamíferos (globina, elastase, albumina, <a—fetoproieína e insulina), Tipicamente, no entanto, usar-se-á um potenciador derivado de um vírus de células eucari-óticas. Exemplos incluem o potenciador do 8V4£> no lado tardio da origem de replicaçSo Cpb 1Θ0-27Θ), o potenciador do promotor precoce do citomegalovírus, o potenciador da polioma no lado tardio da origem de replicaçSo e os potenciadores

dos adsnoviruB, Neste caso o mais preferido é a região do poiso-ciador do Sν4Θ,

Os vectores de expressão usados em células hospedeiras de mamíferos conterão também sitias de pol i-adenilaçlo» São exemplos de regiões de poliadenilação as derivadas de vírus tais comor, e.g»r, o SV4ô (precoce e tardio) ou HBV,

J

Uma origem de replicaçlo pode ser proporcionada pele. construção do vector para incluir uma origem exógena. como seja derivada do SV40 ou de outra fonte virai (e.l·, F'olicma, Adeno* VSV3 BPV) ou pode ser proporcionada pela célula hospedeira. Se o vector for integrado no cromossoma da célula hospedeira? esta última é muitas vezes suficiente.

J

Os vectores de expressão podem adsquadamsnts contar um gene de selseção5 também designado uma marca selectiva, Um gene de selecção codifica uma proteína necessária à sobrevivência ou crescimento de uma célula -hospedeira transformada com a vector. São exemplos de marcas- selectivas adequadas para células de mamíferos a di-hidrofolato-redutase CDHFR}., timídina-cinase CTK) ou neomicina» Quando tais marcas selectivas- são transferidas com dxito para uma célula hospedeira de mamíferor, a célula hospedeira de mamífero tra.nsform.ada pode sobreviver se colocada sob pressão seiestiva.

Existem duas categorias distintas largamente usadas de regimes selectivas. A primeira categoria baseia—se no metabolismo de uma célula e na utilização de uma linha celular mutsnte que nSo possua, capacidade para crescer independentemente de um meio suplementado. Dois exemplas são as células CHO DHFR~ e as células LTK de murganho. Estas células não possuem a capacidade para crescer sem a adição de nutrientes tais coma timidina ou i

X

J hipoxantina» Devida a estas cálulas nSo possuírem certos genes necessários à via completa da síntese de nucleétidos, elas nao podem sobreviver a menos que sejam fornecidos os nucleétidos qus faltam num meio suplementado,, Como alternativa á suplementação de meio é inrodusido um gene intacto DHFR ou TK nas cálulas qus não possuem os respectivos genes, alterando assim as suas necessidades nutritivas» Células individuais que não foram transformadas com o gene DHFR ou TK nSo serio capazes de sobreviver em meio nlo suplementado» Assim, a selecção dirscta daquelas cálulas requere crescimento celular na ausência de suplemento de nutrientes»

A segunda categoria é a selecção dominante, a qual se refere a um esquema de selecção que não requere a utilização de uma linha celular mutanta„ Este método típicamente emprega uma droga para parar o crescimento de uma célula hospedeira» As células que têm um novo gene expressarão uma proteína que confere resistência á droga e sobreviverão à selecção» Exemplos de drogas usadas na selecçSo dominante incluem neomícina (Southern e Berg, J,, Holsc, AdpI » Genetn» Vè 327 (1982)),, ácido micofenólico (Mulligan e Berg, Science» 299s 1422 (198©)) ou higromicina (Sudgan et al , Moí, Cell. Biol.. 5s 419-413 (1985>>. Os trts exemplos dados atrás empregam genes bacterianos sob controle eucariótico para conferir resistência à droga apropriada, i„e„, neomicirsa (8418 ou geneticina), xgpt (ácido micofenólico) ou higromicina, respectivamente»

Quantidades extremamente boas de polipeptídeo são produzidas pelas culturas celulares usando o método deste invento? no entanto, algumas modificações, usando uma sequência codificadora secundária servem para aumentar mais os níveis de produção» Uma sequência codificadora secundária compreende di-hidrofolato-redutase (DHFR) qus é afectada por um parâmetro controlado externamente, como seja metotrexato (MTa), permitindo assim o controle da expressão através do controle da concentração de metotrexato.

Ao seleccionar-se uma linha de célula hospedeira preferida para transfacçSo pelos vectores do invento que compreendem as sequências de DNA çodificadoras do gene com interesse e a proteína DHFR, é adequado seleccionar o hospedeiro de acordo com o tipo de proteína DHFR empregue. Se se empregar DHFR tipo selvagem, è preferível seleccionar uma célula hospedeira que seja deficiente em DHFR, permitindo assim a utilização da sequência codificadora de DHFR como marca da transfecção com ?site em meia selectivo que não possua hipoxantina, glicirta e tímidina. Uma célula hospedeira neste caso é a linha celular de ovário de hamster chinês CCHO) deficiente em actividade DHFR, preparada e propagada como descrito por Lirlaub e Chasin, Proc» NatI» Acad, Sei , (USA) 77s 4216 (1980),

Por outro lado, se a proteína DHFR com baixa afinidade para o metotrexato for usada como sequência de controle, não é necessário usar células deficientes em DHFR, Devido ao DHFR ser resistente ao metotrexato, os meios contendo MTX pode ser usado como meio de selecçlo desde que as células hospedeiras sejam elas próprias sensíveis ao metotrexato» A maior parte das células sucarióticas que são capazes de absorver MTX parecem, ser -sensíveis ao metotrexato, Tal linha celular é uma linha CHD, CH0-K1 ÍATCC m CCL 61). A construção de vectores adequados contendo as sequências codificadoras e de controle pretendidas- utiliza técnicas de ligação convencionais. Os plasmídeos ou fragmentos de DNA isolados -são clivados, adaptados e novamente ligados na. forma pretendida para preparar os- plasmídeos necessários. .-λ'

Se forem necessários extremos eersss, a preparação pode ser tratada durante 15 minutos a 15°C com 1Θ unidades de Polime-rase I CKlsno-i}, extraída com fsnol--clorofórmio e precipitada com stanol„ A separação por tamanho dos fragmentos clivados pode ser efsctuada usando géis de 6 por cento de poliacrilamxda descrita por Goeddel et al„? Nucleic Acids Res»,, Bs 4Θ57 (1980)=,

Para confirmar as sequências corrsctas em plasmideos construídos, as misturas de ligação slo tipicamente usadas para transformar E». ca li !< i 2 estirpe 294 CATCC 315 44&) ou outras estirpes de E»_ coli sdeq uadas, e os transformantes com êxito ssleccionados por resistência á ampicilina ou tetraciclina sempre que adequado» Os plasmídeos dos transformantes foram preparados e analisadas por mapeamento de restrição e/ou sequenci-ação de DMA pelo método de íiessing et al = 5 Nucleic ftcids Res«,· 9s 309 C19B1) ou pelo método de Mexam et al = , nethods of Encymoloqyn ó5s 499 (1980),

Após introdução do DNA nas células hospedeiras de mamífero e selecção em meio para transfectantes estáveis, a amplificação das sequências codificadoras da proteína DHFR é efectuada por crescimento das culturas de células hospedeiras na presença de uma concentração de iiietotrexato de aproximada.mente 200-300 nM, um inihidor competitivo cia actividade de DHFR» A gama concentrações eficazes é pois altamente dependente da natureza do gene DHFR e das caracteristicas do hospedeiro» Claramente, os limites superiores e inferiores definidos de uma forma geral podem não ser acertados» Concentrações adequadas de outros análogos do ácido fálico ou de outros compostos que inibem DHFR podem também ser usadas» Q próprio MTX é, no entanto, conveniente» de fácil obtenção e eficas»

Os complexos formados entre enzimas fibrinoliticas e plasminogênio podem ser usados como agentes tromboliticos, como descrito ainda em Smith et al», Pat, U,S» 4,808,405 que está ilustrado no Exemplo 5 abaixo. Resumidamenis pode-se preparar um derivado de enzima que compreenda um complexo binário entre estreptoquinase e plasminogênio, o qual tem um sitio catalítico essencial à actividade fibrinolítica bloqueada por um grupo que é removível par hidrólise de tal forma que a constante de velocia— dade de pseudo-primeir ordem para a hidrólise do derivada está na gama de 10 ° seg Λ a 10 seg 1 em meio aquoso isctónico a pH 7,4 a 37°C, desde que o grupo que bloqueia o sitio catalítico nSo seja um grupo p—guanidino—benzoílo* Exemplos de tais grupos adequados incluem grupos acilo tais como grupos benzoílo, benzoilo substituído, acriloilo ou acriloilo»

Um método para a preparação dos complexos inclui a mistura de estreptoquinase com plasminogênio na presença, de uns excesso de um agente bloqueador da fórmula A~B ou E-F, em que A é um grupo que -á selectivo para o sitio catalítico essencial para a actividade fibrinolítica e- que é capaz de transferir do grupo B para o sítio catalítico ε B é um grupo que facilita a ligação de A â enzimaj E é um grupo de localização que situa o agente- no sítio catalítico e F é um grupo capaz de transferir da grupo de localização para o sitio catalítico e a seguir facultativamente isolamento dos derivados assim formados» De preferencia o grupo removível por hidrólise é um grupo acilo, m-ais preferencialmente um grupo benzoílo, acriloilo ou acriloilo substituído, e.g» henzoilo substtituido com halogénio, -alquilo alcoxi C, , alcanailoxi Ct_^ ou. alcanoilamina Ci_iti ou -acriloilo ushstituido com alquilo C1_A, f uri lo, fenilo ou -alquil C, _A fenilo» Também, preferencialmente AB á p-nitrofenil-p^-guanidinobenzoato, grupo E ê p-amidínofenilo ou p-acetamidofenilo e o grupo F ê um grupo benzoílo ou acriloilo» È também contemplada coma parte deste invento urna. composição farmacêutica que inclua variante do plasminogênio humano» De preferência tal composição compreende u.m veiculo farmactuticamente aceitável como seja um tampão aquoso isotónico «Agua para injecçSo» de grau. farmacêutico. Em adição, o invento engloba uma formulação farmacêutica compreendendo um veiculo farmaCtuticamente aceitável juntamente com uma enzima fibrinalí-tica, de preferência um complexo da enzima com a variante do plasminogênio, mais preferencialmente um complexo binário de estreptoquinase e variante do plasminogênio e mais preferencial-mente um complexo de p-anisoi1-estrsptoquinass/plasminogénio sem clivagem da ligação peptídica interna, como em Smith et al» , U.S. Pat» 4,808,405, supraNuma outra realização, o sitio activodo complexo responsável pela actividade fibrinolítica é bloqueado por um grupo que é removível por hidrólise ds tal forma que a constante de velocidade de .pseudo-primeira ordem para s hidrólise do complexo está na gama de í€? u seg “ a 1Φ seg A em meios aquosos isotónicos a pH 7,4 a 37°C =

As composições de acordo com este invento são formula-das segundo processos convencionais a -serem adaptados -para administração parenteral em humanos»

Tipicamente, as composições para administração intravenosa são soluções do derivado estéril em tampão aquoso isotónico estéril» Sempre que necessário, a composição também inclui um agente de solubil ização do complexo,, E® geral , o complexo é fornecido numa forma ds dosagem unitária, por exemplo, como pó ou concentrado sem água num recipiente fechado como seja uma ampola» Para administração por infusão, o complexo è administrada a partir de um frasco contendo água para InjecçSo estéril grau de pureza farmac^utico.Para administração -por injecçSo, o complexo é retirado de uma ampola de Agua para InjecçSo estéril» A 28 28

composição injectàvel ou. para infusão será reconstituída misturando os ingredientes antes da administração» A quantidade eficaz do complexo administrado dependerá de muitos factprss; incluindo a quantidade de fibrinólise necessária s a velocidade a que é necessária, do grau de tromboembo— lismo e da posição e tamanho do coágulo, mas a quantidade ê geralmente ditada pelo resultado a ser obtido, i»e=, liss do coágulo» Por exemplo, um doente com uma embolia pulmonar ou com um trombas que ameace a vida necessitará da administração de um holus de um material que actue rápidamente. Pdr outro lado, quando for desejável evitar a formação de trombus após uma operação è útil uma pequena quantidade de material que actue lentamente» A dose precisa a ser empregue e o modo de administração pode ser decidida de acordo com as circunstâncias e opinião do médico» No entanto, em geral, um doente a ser tratado de um trombus de tamanho médio recebe uma dose entre õ,1Θ e i ,© mg/Kg de peso de corpo diáriamentspor injecção \até oito doses) OU por infusão»

Para simplificar os exemplos- e reivindicações, certos-métodos que ocorrem frequsntemente serão referenciados por frases curtas» «Transfecção» refere-se à internaiização de um vector de expressão por uma célula hospedeira quer sejam expressas ou. não quaisquer sequfncias codificadoras» São conhecidos numerosos métodos de transfecção, por exemplo CaPCL, e electroporação» Uma transfecção com @xito é geralmente reconhecida quando há indicias de operacionalidade deste vector dentro da célula hospedeira» «Transformação» significa introdução de DMA num organismo de forma a que o DNA seja repiicável, quer como um elemento ···. -.- .#/ V/ εχtracromossómico quer como parte integrante do croísossoma» Dependendo da célula hospedeira usada, a transformação é feita usando técnicas convencionais adequadas a tais células» 0 tratamento com cálcio empregando cloreto de cálcio, como descrito por Cohen, S.N» Proc.Natl. Acad.-. Sei» (USA), 69; 211© (1972)? Mandei et al., ί^5Ωλ^ΜΜί^ 53; lb4 <1970>j e oais recentemente Liljes-trom et al.} Gene7 46; 241-246 (1985)» é geralmente usada para procarioias ou outras células que possuam substanciais barreiras de parede celular» Para as células de mamífero sem tais paredes celulares, é preferido o método de precipitação por fosfato de cálcio EGraham, F = e van der Έο. A», Viroloay„ 52; 456-457 (1978) ρ Kinqstan„ em Current Protocols in Molecular____Bioloqy,

Ausutael, st al», eds», (dohn Wiley ,¾ Sons, New York; 1978), 1.8=1-1.8.33. Os aspectos gerais das transformações no sistema hospedeiro células de mamífero foram descritos por Αχεί em Pat» U.S» N2 45399,216 publicado em 16 de Agosto, 1983» As transformações em levedura slo tipicamente realizadas de acordo com o método de Van Soligen, P*, et al», u» Bac t. ,, 156s 946 <19775 e Hsiao, C.L., et al», Proc» Natl. Acad. Sei. (USA) 76s 3829 (1979) . No entanto, podem ser usados outros métodos para a introdução de DMA em células como seja por injecçao nuclear ou por fuslo de protoplastos.

Os «plasmídeos» slo designados por uma letra minúscula ρ precedida e/ou seguida de letras maiusculas e/ou números. Os plasmídeos de partida aqui usados podem ser adquiridos comercial-mente, estio disponíveis ao público numa base sem restrições ou podem ser construídos a partir de tais plasmídeos disponíveis segundo processos publicados. Em adição, slo conhecidos outros, plasmídeos equivalentes ε serão óbvios para os familiarizados com a matéria»

mente ao seguintes Quantidades diminutas de um segmento especifico de DMA pode ser amplificado usando a rsacção era cadeia com polímeras® CPCR) coma descrito na Pat» U,S„ MS 4,683,195 publicada em 28 de Julho de 1987= Seralmente, é necessária informação acerca da sequência entre os extremos do segmento de interesse ou para lá deles, de modo a. poder—se proj sctar ο I igormc I só tidos iniciadores; estes iniciadores apontarão um para o outro e tsrSo sequências idênticas ou semelhantes às das cadeias opostas do molde a ser amplificado. Os nuclsétidos 5? terminais dos dais iniciadores coincidirão com os extremos do material amplifiçado,, PCR pode ser usado para amplificar sequências de DMA especificas a partir do DMA genómico total, cDNA transcrito a partir de RMA celular total, sequências de bacteriéfaqos ou de plasmideos, etc, Ver de um modo geral H, Erlich, ed,3 PCR Technology·, Stockton Press, MV, í 989, A técnica de «mutagénsse com PCR» como aqui é usado refere-se ao que se segue (ver Erlich, supra, o capitulo por R, HiquehiP p» 61-70)s Quando sao usadas pequenas quantidades de DMA moldecomo material de partida em PCR, podem ser usados iniciadores que diferem ligeiramente na sequência da correspondente região num DMA molde para gerar quantidades relativamente grandes de um fragmento de DMA especifico que difere da sequência molde apenas nas posições em que os iniciadores diferem do molde, Para a introdução de uma mutação num DMA de plasmídeo, projectou-se um dos iniciadores para se sobrepor na posição da mutação e para conter a mutação; a sequência do outro iniciador deve ser idêntica a um fragmento da sequência da cadeia oposta do plasmideo, mas esta sequência pode estar situada em qualquer sitio ao longo do DMA do plasmideo, Mo entanto é preferido que a. sequência do segundo iniciador esteja situada dentro de 2ΘΘ nucleétidos a partir do primeiro, de forma a que no final toda a região

-amplificada do DNA ligado pelos iniciadores possa ser fácil mente sequenciatía. A amplificação por PCR usando uni par de iniciadores tal como o descrito resulta numa população ds fragmentos de DNA que difere na posição da mutação especificada pelo iniciador e possivelmente noutras posições, uma vez que a cópia de moldes é algo sujeito a erros.

No processo detalhado abaixo, a proporção de molde para material produto é sxtremamente baixa s como rssultadodisto a grande maioria dos fragmentos de DNAproduto incorporam aCs) mutaçãoiSss} pretendida(s)„ Este material produto é usado para substituir a correspondente região no plasmídeo que serve como molde de PCR usando tecnologia de DNA convencional= As mutações em posições separadas podem ser introduzidas simultSneamente usando um segundo iniciador mutante ou fazendo uma segunda PCR com diferentes iniciadores mutantes e ligando os dois fragmentos PCR resultantes simultSneamente ao fragmenta vector numa ligação de tr§s <ou mais) partes. C processo ds mutagenese por PCR empregue nos exemplos abaixo foi como se segues D DNA molde de plasmídeo (1 p.g) foi linearizado por digestão com uma endanuclesse ds restrição que tem um único sitio de reconhecimento no DNA de plasmídeo fora da região a ser amplificada. Deste material, 1-5 ng foi adicionado a uma mistura de PCR contendo Í6,è mH (NH^)oS0âS 67 mrl Tris.HCl (pH 8,8), 6,7 «TsM MgCl.-,, 6,7 μΜ EDTA, 1© mfi 2-fliercaptostanol, dATP, dCTP, dBTP e TTP 1. mli cada, 17© μ-g/ml de albumina sèrica bovina, 2S pmoles ds cada oligonucleótido iniciador e Ιμΐ DNA-ροlimersss de Thermus aquaticus (Taq) (5 unidades/μΙ, adquirida â Perkin--Elmsr Cetus, Norwaxk, CT e Emeryvills, CA) num volume final de b© μΐ num tubo de rsacção de ©¥5 ml» A mistura de reacção foi coberta com uma camada de 35 μϊ de óleo mineral e inserida num DNA i hermal Cycler , como se segues {adquirido à Perkin-Elmer Cetus) programada ficheiro tempo de retardamento ficheiro cicio térmico ficheiro tempo de retardamento ficheiro tempo de retardamento ficheiro lavagem

12 min. 94°C

1 min, 50°C

2—3 ssin min, 6S—72°C

1 min, 94 *C 20 ciclos

4 mirs, 50°C

12 min , 68 °C

4*C C-ada um das ficheiros mostrado foi ligado ao outro da linha seguinte. No final do programa, ovaso de rsacçlo foi removido do ciclisador térmico e a fase aquosa transferida para um novo recipiente, extraída com fenol/clorofórmio/álcool isoamí-lico (50s50sl vol)s e precipitado com etanol e o DNA foi recuperado por -processos convencionais. Este material foi subsequente-mente sujeito aos tratamentos adequados para inserção num vector, «Digestão» do DMA refere-se à clivagem catalítica do DNA com uma enzima que actu.a apenas em sequ@rici.as de nucleótiodos específicas no DNA. Tais enzimas são designadas enzimas de restrição s a sequência para a qual ê específica é designada um sítio de restrição. As várias enzimas de restrição aqui usadas podem ser adquiridas comercialmente e as suas condiçSes de reacçMo, cofactorss e outros requisitos são usados conforme estabelecido pelos fornecedores das enzimas.. As enzimas de restrição geralmente são designadas por abreviaturas compostas por uma letra, maiuscula seguido de outras letras representando o microorganismo a partir do qual cada uma das enzimas de restrição

foi originâlsnsnte obtida s depois um número que designa a enzima particular* Em geral,, usa-se cerca de 1 pg de DMA de plasmídeo com cerca de i-2 unidades da enzima em cerca de 2® μΐ de solução tampão» Os tampSss adequados e quantidades de substrato para enzimas de restrição particulares sSd especificadas pelo fabricante» Bera1mente usa-se incubações de aproximadsmsnte 1 hora a 37°CS mas pode variar de acordo com as instruções do fornecedor» Após incubação* a proteína é removida por extração com fenol e clorofórmio e o ácido nucleico digerido é recuperado da fracçSo aquosa por precipitação com etanoi* Sempre que apropriado,, a digestão com uma enzima de restrição é seguido de hidrólise .mediada por fosfatase alcalina bacteriana dos fosfatas 55 terminais para evitar que os dois extremos de um fragmento de DMA «circularizem» ou formem uma ans® fechada que impediria a inserção de um outro fragmento de DMA no sítio de restrição* A menos que de outra forma seja especifiçado? a digestão dos plasmideos não á seguida de desfosforilação terminal 5?» Os processos s reagentes para a desfosforilação são convencionais <T* Maniatis et al*s 1-982. Molecular Cloningg A Laborato-rv Manual (Nsm Yorks Cold Spring Harbor LahoratDry» 1982) ρρ* 133-134)* A «recuperação» ou «isolamento» de um dado fragmento de DMA a partir de uma digestão de restrição significa separação do produto da digestão por electroforese em gel de poliacrilamida ou sgarose5 identificação do fragmento com interesse por comparação da sua mobilidade com a de fragmentos de DMA marcadores de peso molecular conhecido? remoção da secção do gel contendo o fragmento pretendido e separação do gel e DMA» Este processo é conhecido de uma forma geral» ror exemplo^ ver R* Lawn et al_» ? Mucleic Acids Res*. 9g6103-6114 (1981) e D* Soeddel -et al*. Mucleic Acide Res.,, 8 s 4®57 (1980)* «Ligação» refere-se ao processo de formação de ligações fosfotíiéster entre dois fragmentos de ácido nucleico de cadeia dupla (7, Man latis et. al», 19325 supra* p« 146)» A menos que de outra forma seja estabelecido* a ligação pode ser conseguida usando tampões e condições conhecidos com 19 umidadss de DNA~li~ gase de T4 ( «1 iqase» ) por Θ 55 μ-g de quantidades aproKimadamente equimolares dos fragmentos de DMA a serem ligados» «Preparação» de DMA a partir dos transformantes significa isolamento de DMA do plasmideo a partir de cultura microbiana» A menos que de outra forma seja especificado pode ser usado o método tratamento com bases/SDS de Maniatis et al, 1982» supra * ρ» 9Θ. «Oiigonuclsótidos» são polidesoKinucleótidos curtos de cadeia dupla ou simples que são sinteticados qiraicamente por métodos conhecidos (como seja quimica de fosfotriéstsres,, fosfi-tos ou fosforamidetoss usando técnicas de fase sólida tais como as descritas em E»P» Pat» Puh» N2 2fo6»©32 publicado em 4 de Maio .= 1988 ou via intermediários desoxinucIeósido-H-fasfonaio como descrito por Froehler et al»* Nucl» Acids Res»* 14s 5399—5407— 1119363) = Eles sSo purificados em géis de políacrilamida» «nutagénese dirigida» έ uma técnica convencional e é realisada usando um oligonucleótido iniciador sintático complementar de um DMA fágico de cadeia simples a ser mutagenizada exceptuando o desemparelhamento limitadoque representa a mutação pretendida» Rssumidamsnte o oligonucleótido sintético ê usado como iniciador para dirigir a síntese de uma cadeia complementar dcs fago e o DMA de cadeia dupla resultante é usado para transformar uma bactéria hospedeira em que α fago se replique» fís culturas de bactérias transformadas slo.semeadas eín agar de topo* permitindo a foramção de placas a partir de células isoladas que

são portadoras do fago„ Teóricamente, 5Θ% das placas novas contêm o íago tendo, como cadeia simples, a forma mutagenizadat 5®% terá a sequência original» As placas são hibridadas com iniciador sintético fosforilado a uma temperatura que permite a hibridaçlo da um emparelhsnientD exacto, mas que é suficiente para evitar a hibridação de desampareihamentos com a cadeia origina» As placas que hihridam com a sonda são então seleccionadss e cultivadas e o DMA recuperado»

J

Os exemplos que se seguem pretendem ilustrar a melhor maneira de realizar o invento» mas este π 3a lhes está limitado» EXEMPLO i

Construção de vectores intermediários para umpressão ds t-PA

Os vários vectores da t-PA foram derivados a partir de um vector parental pSVI-tPA por alteração de uma série de csrac-ter.ist.icas da unidade dador de «splicing>>~irrfcra.o~aeeitâdor ds «splicing» com a finalidade especifica de aumentar a eficácia da remoção corrscta do intrão* -ϋ a. pSVI-tPft

FracçSes dos dois vectores de expressão em mamífero antsriormente descritos, pRK-tPA e pE348DHFRUC9 foram combinados para. gerar pSVI—tPft. 0 vector de expressão em mamíferos pRK-tPA foi preparado a partir de pRK5 (descrito em EP 307»2475 supra, em que o 36

plasmídeo de partida pCIS2=8c28D está descrito era EP 278,/76 publicado em 17 de Agosto, 1988) e s partir de c-DNA do t-PA (Pennica st a.l =, Nature» 5Θ1 s 214 (1983))» Q cDNA foi preparado para inserção em pRK5 cortando com a endonuclease rfe restrição HindiII (a qual corta 49 pares de bases relativamente ao codao ÃTG) e com a endonuclease de restrição Ba1I ( aqual corta 276 pares de bases a jusante do codão de paragem ISA)* Este cDNA foi ligado a pRK5 préviamente cortado com HindiII e Smal usando metodologia de ligação convencional (Maniatis et al * , riolecuiar Cloninqs A Laboratory manual,, Cold Spring Harbor Lâhoratory, New York, 1982)= Esta construção foi designada pRK-tPA e está a apresentada na Fig= 2= pRK-tPA conduz a síntese eficaz de t-PA quando da transfscção transitória em fibroblastos humanos 293= 0 vector contem o potenciador e o promotor do gene precoce imediato do citomegalovírus, o sítio dador de «splicinq» de Q1V-IE e uma fracção do intrão associado; o promotor do bacteriófago SF'6, uma fracçSo de um intrão IgVu s o aceitador de «splicing» associado, o cDNA codificador de t-PA, a região de poliadenilação precoce do SV46 («poli A») e a origem de replicarão do SV4© («ori») no plasmídeo pUCl18„ 0 vector pE348DHFRUC (Vannice and Levinson, J = Viro-loqv« 62 g 13453—1313 (1988), onde é designado por pE, Figura 1) contem o poenciador a a região do promotor precoce do Bv4® a montante do sítio HindIII (posição 5171 no vírus), precedendo a cDNA codificador da di-hidrofolato rsdutass (DHFR) murina que é seguido do sinal poli A de 584 ph do vírus da hepatite (HBV) no plasmídeo pMLÍ entre os sítios BamHI e Bq111 do HBV = Esta plasmídeo contem um poliadaptador imediatamente a montante das sequências do SV4©= foram i-racçSss dos vectorss pRK-iPA s pto 48uHí-RUC isoladas como se segue <Fig» 2)s 1 » 0 vector pRK-tPA fai digerido com a encima de restrição Sac11 ® subsequenteraente tratado com o fragmento grande («Klenow») da DNA-polimerass I («pai I») para remover os entremos salientes 35 gerados pela clivagem com SacII» Isto foi seguido de digestlo com a enzima de restrição Soei, 0 fragmento maior contendo uma fracçSío das sequências de CMV transcritas» a unidade dador ds «splicing»~intrSo~aceitador de «splicirsg» («IntrSo» na F.xg» 2) 5 d cDNA do t-PA-? as regi-Ses poli A s ori do 8V43 e pUCÍl.83 incluindo alguns nucleótidos do ejítremo 55 do CriV, foi isolado a partir de um gel de poliacrilamida após separaçio electroforética dos fragmentos («isolado em gel»)-. 2» 0 vector pE348DHFRLÍC foi digerido com a enzima Clal e os εκtremos 55 salientes resultantes foram preenchidos usando Klenow poli na presença dos quatro desojíirribonucleótidos ídMTPsn d AIR, dBTP, dCTP., ΪΎΡ) » Quando da subsequente digestão com Xbal as sequências reguladoras da transcrição do SV43 Cpotsnciador a promotor precoce», incluindo os si tios de inciaçSo da transcrição precoce do SV43) presentes no fragmenta Xbal-Cial mais pequeno (363 nucleótidos) foram isolados- em gel»

Os fragmentas de pRK~iPA e pE348DHFRUC isolados foram ligados para gerar o vector pBVI-tPA» 38

V

J b,„,psyi2-.tPft, 0 vector pSVI2~tPA foi preparado como se mostra na Fig.. 3» em que α sitio dador de «splicing» da vector pSVí-tPA foi mutagenizada por ligação de três fragmentos preparados como descrito abaixo» Os nucleétidos -3 CG) s —1 <C> relativamente è. fronteira exlo 5?/intrão do pSVI-tPA foi mudado para C e Bs respectivamsntepara tornar a sequência dadora de «splicing» idêntica à sequência consensos CAB/SUAABU:, Isto foi conseguido como se segues i= O vector pSvI-tPA foi clivado com HindIII e com Bq1I para gerar um fragmento pequeno contendo principaimente a unidade dadora de «splicings-intrao-aceitador de «splicing» entre os dois sitios Hindi1'Inas posições 381 e 618» um outra fragmento pequeno contendo uma fracçSo 5® do cDNA do t-PA situado entre os sítios HindiII e BqIII nas posições 61B e 77Θ e um fragmento grande contendo o restante DMA do pSVI—tPA» Após tratamento com fosfatas© alcalina bacteriana Í«BAP»> os três fragmentos foram separados por electroforese em gel e recuperado o maior» 2» 0 vector pSVí-tPA foi separadamente digerido com Rsal e BqlII e o fragmenta de 327 -nucleótidos estendendo-se desde o sítio Rsal e BqIII na posição 77% foi isolado em gel. Este fragmento inclui a fracção 31 2 3 do intrãof o aceitador de «splicing» e uma fracção 53 do cDNA do t-PA» 1

Sintetizaram-se dois oligonucleótidos <«iniciadores» nas Figs. 3—7). 0 primeiro (SVI379) correspondeu aos ucleótidos 2 379 a (cadeia superior) do p8VI-tPA5 com sxcepçlo de uma 3

alteração de 6 para C na posição 390 introduzida para gerar a sequência reconhecida pela endonucleass de restrição EagT

Ή'- S ?ϋ X r. ÇUtíbCCS) s sobrepondo um sítio Hindiii« ble tinha a seguinte sequência!posição da alteração está sublinhada); 55—AAAAGCTTATCCGGCCSBSAAC—35= 0 segundo oligonucleótido (SVI448) tinha uma. sequência idêntica à cadeia inferior de pSVI-tpA entre as posiçSes 448 e 427s excepio uma mudança de um 6 para C no iiS nuclsótido e uma mudança de C par G na nuclsótido 13« Ele incluiu um sítio RsaI 5S relativamen— te ás duas alterações de nucleótidos isolados» A sequência deste aligonucleótida, com as diferenças da correspondente sequência pSVI—tPA sublinhadas» como se segue; 5? -CBBTACTTACÇTGACTCTTGBC-35«.

Os dis oliqonucleótidas foram usados para amplificar por PCR a região de pSVI-tpA entre as posições 379 e 448 que inclui o dador de «splicing»« Os produtos de PCRforam digeridas com HindiII e Rsal ε o fragmento de 62 nucleótidos foi isolado em gel.

Os três fragmentos isolados foram ligados e introduzidas em E. coli 1111294= 0 DMA de plasmidea foi isolado a partir de várias colónias resistentes á ampicilins e a sequência de nucleótidos de um isolada Cp8VI2-tPA)s que tinha os três fragmentos ligados na ordem pretendida5 foi determinada para verificar a presença das alterações de nucleótidos especificadas pelos dois iniciadores e a integridade da região derivada do fragmento amp1i fiçado«

C- pSVIS—tPA 0 vsctor pSvI3-tPfífQi preparado como se mostra na Figura 4« Duas regiões adjacentes- do pSVI2-tPA foram ampl if içadas-por PCRusando em cada um dos casos um oligonucleótido idtntico á sequência do pSVX2—tPA e um oligonucleótido mutants especificando as alterações pretendidas» Estes fragmentos foram usados para substituir as regiSes correspondeutss em p8vI2-tPA= Os fragmentas isolados foram como se segues 1= 0 vectoF pSVI2-tPA foi digerido com HindiII5 o produto da digestão tratado com BAP eos dois fragmentos HindiII forams-sparados- por elsctroforese -em gel« 0 fragmento maior foi recuperado do gel % ele contem todas as sequências do pSVΪ2-tpA» SKceptuantío para o fragmenta Hindi II de 237 nucleétidos- que inclui a unidade dador de «spiicIng»“inir!o—aceitador de «s-plicing», 2» Um novo oligonucleótido (VSI525Bam) foi sintetisado-por mutagénese de PCR do trinucleétido ATG dentro do intrSo pSVI 2-tPA» Ele tem uma sequência idêntica à cadeia inferior do pSVI2-tPA desde o nuc1sétido 525 até ao nucleétido 497, excepio uma alteração de T para A na posição 516;| uma alteração de A para C na posição 519 e uma alteração de T para G na posição 523» A primeira alteração foi destinou-se a alterar o trinucleétido ATS para TTG% a segunda destinou-se a alterar o trinucleótido ATG para TTG5 o segundo e o terceiro para criar a sequência de reconhecimento da encima BamHI Í8SATCO» A sequência de nucleóti— dodo SV1525Bam foi a seguinte (diferenças da sequência do pSVI2— —tPA estão sublimhadas)s

X

Os oligonuclsótidos SVí397 íver atrás) e Svl1525Bam foram usados para amplificar por mutagénese de PCR aregiSo entre as posições 379 e 52:5 do pSVI2-tPA ao mesmo tempo que se incorporam as alterações especifiçadas por SVI525Bam, Os produtos de reacção foram digeridos com HindiΪΙ a BamHI e o resultante fragmento de 137 nucleótidos foi isolado em gel,

Sintetizou-se α oligonucleótido SVI539Bacn para rnutaoé-nese de PCR da região de rasnificçaõ do pSVI2-tpft, Ele corresponde à sequfncia da oSV12-tPA (.cadeia inferior) desde a posição 539 até à posição 537, mas com as seguintes alterações; um B em vez do T em 541 f, um T em vez de um C em 544; um C em vez de um A em 5455 um C em vez de um A em 553 s e um G em vez de um A em 555, As três primeiras alterações criaram um sitio de reconhecimsnto BamHI ·, enquanto as duas ultimas destinaram-se a gerar um sinal semelhante á sequência consensus de ramificação (BPS>= A sequência de nucleótidos do BV!S39Bam foi como se segue (as alterações da sequência pSVI2—tPA estão sublinhadas)? 5s-6BÍBATÇCTATABAÇJBACATCCACTTTBCCTTTC-35

0 oligonueleétido 5V1625 foi sintetizado e era idêntico à cadeia inferior da sequência do pSVI2—tPA desde a posição 625 até à posição 603,, excepto a alteração de um ft para C na posição 617, que se destina a gerarum sitio de restrição BstBI ÍTTCGAA), A sequência de 3 V162:5 foi Ca alteração está subiinhada) s 5? —CCAAGCTTÇBAACCGABGTBCAB—35

Os oliqonuclectidos SVX539Bam e SVI625 foram usadas para amplificar por PCR a regiSo do pSVI2-tPft entre os nucleóti-dos 539 e 625 e portanto incorporam as alterações pretendidas, Os produtos de PCh: foram digeridos com Hindi II s tíamHI ao fragmenta de 77 nucleótidos foi purificado em gel*

Os três fragmentos CFiq„45 foram ligados s como tal forma introduzidos em E* coli MM294* O DNA de plasmideo foi isolado a partir de uma. série de colónias resistentes è. ampicili-na e analisado por digestão com as enzimas de restrição adequadas e electroforsse em gel para testar a presença de uma cópia de cada um dos três fragmentos* A orientação relativa dos fragmentos foi também determinada por esta análise* A sequência tíe nucleóti— dos de um plasmideo recombinante CpSVI3~iPA>* que tinha os três fragmentos constituintes arranjados na mesma ardem do pSVí2-tPA* foi determinada na regilo que abrange os três sitios de recomhi-nação íos dois sítios HindiII ε o sítio BamHI)incluindo todas as sequências entre estes sítios* d, pSVIS—tPA

0 vector p8VI5—tPA foi construído a partir do pSVI3—tPA por substituição de uma fracção do intrão s do sitio aceitador de «splicing» com um fragmento mutante gerado por PCR (como se mostra na Figura 5)* 0 nucleótido -ló (8) relativamente à junção de «splicing» 35 do pSVI3-tPA foi modificada para o nucleótido T para criar um segmento de polipirimidina ininterrupto de 1.6 nucleótidos de coffiprimenio» como parte do aceitador de «splicing»* 0 vector foi também modificado para conter um nucleótido potencial aceitador de ramificação na posição -23 relativamente á junção de «splicing» 3% inserido dentro da sequência GACTTATTp que é complementar da sequência dadora de «splicing» *;B/BTAABT)neste vector* Sobrepondo-se a este BPS está está um outro BPS ÍTACTGAC) que eslé. de acordo com o consensus BPS i

«largo» ε è complementar da sequência snRNA U2» 0 nucleétido aceitador de ramificação neste BPS sstá situado na posição -27 relativamente à junção da «splicing», Finalmente., o vector é modificado por inserção de uma terceira BPS imedialamente a montante das duas BPSs em p8VI3“-t,PA, Esta terceira BPS é idêntica á BPS conservada de levedura (UACUAAO e está de acordo com o consertsus BPS «largo» de mamífero CPyNCUPuAC), 0 aceitador de ramificação neste BPS está situado na posição -34 relativamente è junção de «splicing» 3?» '

J

Os fragmentos para gerar pSvI5-tPft foram preparados como se segue s 1= U vector pSVI3-tPA foi digerido com BamHl e os extremos salientes 55 resultantes foram preenchidos com DMA-poii-merase de T4 na presença dos quatro dNTPs» 0 material foi subsequentemente digerido com BstBI, tratado com BAP e o fragmento maior contendo apenas parte do intrão e a sequência aceitadora de «splicing»do pSVI3—tPA isolado em gel»

2= Dois novos oligonacleátidos foram sintetizados para usar em amplificações sucessivas por POR sem isolamento dos produtos intermédios, Esta abordagem para introduzir uma variedade de mutações foi usada para evitar a utilização de um único oligonucleótido longo com desemparelhamenfcos relativamente ao aivop oligonucleátidos sintéticos mais longos muitas vezes contêm uma proporção maior de moléculas com sequência incorrecta. Em adição, o primeiro oligonucleótido sózinho poderá no futuro ser usado para criar um vector diferindo do oSVI3—tPA no ponto de ramificação e nas regiSes aceitadoras de «splicing». 0 primeiro oligonucleótido, tíV14, tinha no seu. extremo 35 treze nuclsótidos em comum com pSVI3~tPA Cposiçoes 545-557), 'ν'.'

Antes destes estavam 22 nucleótidos de sequência semeIhanta5 mas não idêntica, à sequência do pBVI3~-tPA entre as posições 523 e 544, As diferenças foram como se segue (sublinhado abaixo)s um G pare. T na posição 52Bp um A para T em 535? um C para. A em 537 5 um 0 para T em 538 e um A para I em 539? a um 8 para T na posição 544« A última alteração poderá causar uma extensão do segmento de palipxrimidina da aceitador de «splicing»? a primeira alterará a sequência pSVI3-fcPft para BACTBAC para estar de acordo com a sequência eonsensus BP8 que condis com 112, As restantes quatro alterações de nucleótidos isolados destinaram-se a complementar o dador de «splicíng», A sequência da SVI4 eras 5?-CTflTATACTGACTTATTCTTTTCTTTCTCTCCA-55. D segundo oligonueleótido (SVI5) sobrepõe—se à fracção central do SVI4, Ele difere dos cinco nucleótidos terminais 53 da SVI4 s prolonga-se na direeção 5? para incorporar α BPSde levedura (TACTAAC)« A sua sequência foi (estão sublinhadas as diferenças relativamente à correspondente sequência p8VI3-tPA>s 5s —CTACTh ACTACTSACTTATTCTTT—35. 0 BPB/reqiSlo aceitadora de «splicinçs» do pBVI3-tPft foi amplificado e mutagenizado por mufcagénese com PCR usando o par ds oligonueleótidos SVI4/SVI625, Os produtos tíe PCR fioram diluídos e reampl if içados com o par de ol igonue leótidos SVI5/SVI625, Os produtos foram tratados com DMA-poiisterase de T4 e polinucle— ótido-cinase de T4 e clivados com a encima de restrição BstBI, e o fragmento de 7Í nucleótidos foi isolado em gel.

Os dois fragmentos isolados (Fig, 5) foram ligados e o DNA de plasmideo foi obtido a partir das colónias bacterianas transformadas (resistentes à ampicilina) e analisados como Át

descrita atrás para pSVI3~tPA» Um isolado portador das alterações do intrão pretendidas foi designado pBvI5~tpfi»

A determinação da sequfncia identificou mais uma alteração fora da unidade dadora de «splicinq»-intrão--aceitador de «splicing»- No pSVI5~tPA estavam presentes mais dois nucleóti-dos (BC) no pSVI5-tPA dentro do sitio BstBX do pSV13-tPA CTTCBAA mudou para TTC6C0AA)S sitio este que deixou de existir no pSVI5~ ~tPA» Os dois nucleótidos adicionais,* no entanto» criaram um sitio de reconhecimento para a enzima Nru.I« o qual é úunico no vector» Os nucleótidos adicionais provávelmente resultam de um preenchimento não previsto dos extremos salientes BstBI dos dois fragaientos constituintes usados para ligação» e. pSVI&B-tPA pBvIõB-ΐΡΑ foi criado ρο-r uma abordagem semelhante à descrita atrás para pSVI5---tPA, usando duas amplificações sucessivas com oligonucieétidos mutantss parcialmente sobreponíveis parai gerar as alterações pretendidas na região intrão-acsitador de «splicing» dp pSVI3-tPA (como se mostra na Fig» 6>» 0 primeiro oligonucIsótido (SVI6A) tinha a seguinte sequfncia (as diferenças relativamente ao pBVI3~tPA» posições 523—550? estão subiinhadas>s 5 » —CCTBACflCTBACATCCACTTTTCCTTTC-5 -- j e o segundo (SvlóBs comparar as posições 523-545 do pSVX3-tPA>s 5?-CTACTSAChCTGACATCCACTTTTC-3 *»

As substituições de nucleótidos em SVI6 forams T para C em 524, T para S em 52è, G para C sm 528 e G para T em 544» As alterações especificadas por SVIéB forams inserção de um G entre os nucleótidos 52ée 527, substituição do B na posição 52B para um C e a alteraç-So de 8 para T na posição 544» Estas alterações foram destinadas a optimizar a BPB de pBVI3-tPA e introduzir uma segunda BPS imediatamente ao seu lado no extremo 55 p estas duas sequências ds ponto de ramificação sobrepoem no C central e estão apresentadas em itálico na sequência SVIóB=

Amplificações sucessivas com os oligonucleótidos 5VI6A e SVI6B na presença de SVI625 fora realizadas para modificar a unidade intrao-aceitador de «splicinq» pSVI3—tPA como descrito para pSVI5~tPAa 0 trtatamsnto snzimàtico dos produtos de PCRS isolamento em gel e ligação ao fragmento grande BamHI-BstBIdo pSVI3-tPÃ foram também como descrito para pSvI5~tPA» A análise da sequência de nucleótidos do DNA de plasmídeo de uma colónia bacteriana resistente á ampicilina (este plasmídeo isolado foi designado pSVIóB-tPA) apresentou várias alterações não esperadas para alem das modificações especifiçadas peio oligonucleótido SVIóBs a posição 545 foi um I em vez do C do pSVI3-tPAp a posição 559 foi também um T em ver de um C;; e o dinucleótido adicional criando o sítio de restrição Hrul em pSVI5-tPA também estava presente na sequência dopSVIóB-tPA. Não seria de esperar que as duas primeiras alterações afsctassem de forma adversa a expressão do t-PA e não estavam correctas,

Construção......dg_Vectpr_Parental pSVIóbS com uma Sarna Larga de

Aplicações \

Derivou-ss a partir do pSVIóB-tPA um vector parental com uma gama larga ds aplicações para expressão de diferentes polipeptídeos» Este vector? designado pBVIóBS (usado para 47

transformar E= cali estirpe ATCC NQ 68,1515 é portador de regiões de poli-adaptador nc lugar do cDNA do t~-PA em pSVI&B-tPA» Estas regiões de pcli—adaptador proporcionam sities de reconhecimanto por endonuclesses de restrição únicos e convenientes que podem ser usados para introduzir qualquer sequência que codifique um polipeptideo com interesse» 0 vector pSvIéBS foi gerado em quatro passos como descrito abaixo» Os três primeiros passos envolveram a remoção das si tios de restrição BamHIHindi 11 e Sal I , respectivamente? a partir do pBVIòB-tPAe como consequência, quando da substituição do cDNA do t-l-'H pelo poli-adaptador no último passo, os sítios do poli-adaptador para estas enzimas eram únicoss no plasmídeo de expressão parental resultante» a» ConstrliçSo do primeiro plasmídeo intermédio pSVlèB-tPftd(b) 0 vector pSVIéB-tPA foi digerido com BamHI„ a qual cliva apenas dentro do i-ntrão, os extremos salientes 55 resultantes foram preenchidos com DNA-polimerase de T4 na presença de dNTPs e o vector linearizado foi isolado em gel e tratado com DNA-polimerase de T4 para circularizar novamente. Isto provocou a perda da sequência de reconhecimento de BamHI5 em seu lugar foi criada a sequência de reconhecimento da enzima Ciai» Mo entanto, devido à meti 1ação9 Ciai é incapaz de clivar esta sequência quando o DMA de plasmídeo é obtido a partir de E» coli damr.

b- Construção do segundo plasmideo intermédio pHVI6t?-trACbh) 0 plasmideo pBVIòB-tPAd(b) foi digerido com HindiII„ a qual cliva de ambos os lados da unidade de «splicing», os extremos salientes 5? foram preenchidos com DNA-poIimerass de T4 na presença dos quatro dNTPs e parte da mistura de rsacçSo foi tratada com BAP= Os dois fragmentos presentes tanto no material tratado como nao tratado foram separados por electroforese em geli o fragmento maior foi isolado a partir do material tratado e o fragmento mais pequeno a partir do material nlo tratado» Os dois fragmentos foram ligados para criar o plasmideo pSVI&B--tPAd(bh>= 0 preenchimento dos extremos HindiII para ambos os fragmentos constituintes provocou a perda de dois sítios HindiII no plasmideo resultante e ao mesmo tempo criou dois novos sítios s reconhecimento para a enzima Nhel.· c- Construção do terceiro plasmideo intermédio DSvIáB-tHftdCbhs) 0 ânico sitio de reconhecimento Sal I foi removido do plasmideo pSVI6B-tPAd(bh) por digestão com esta enzima? DMA—poli-merase de T4 na presença de dNTPs? isolamento em gel do DMA de plasmideo linear e rscircularisaçSo usando DNA—ligase de T4= Isto resultou na criação de um novo sitio de reconhecimento Pvul„

Construção do plasmideo puvIÒBo

Para a geração do plasmideo parental final de larga aplicação? prepararam-se dois fragmentos como se segues - 49 -

J í =, 0 plasmídeo pSVIèB-tPAdíbhs) foi digerido coni PstI o C1 aI» Existem três sítios de reconhecimento de Clal neste plasmí-deos um no inirSo precedendo a. sequência t~PA,: um na fronteira entre o cDNA do t-PA e a região poli A precoce do SV40 e outro para o fim da região poliA Apenas um destes sítioss o segundo, é insensível à metilação» Consequentemente,, o DNA de píasmídeo preparado a partir de dam MM294 foi clivado por ClaX apenas neste sítio. Um sítio de reconhecimento PstI está situado na junção da unidade de «splicing»e do cDMA do t~PA» e outros estão presentes na sequência do t-PA entre esta posição e o sítioClal insensível á met ilação,, A clivagem com PstI e Ciai resultou assim na libertação de vários fragmentos mais pequenos contendo sequências do ΐ-PA e num fragmento maior contendo todas as sequências do pSVI6B~tPAd(bhs) com excepção do cDNA do t-PA, Este fragmento maior foi isolado em qel,

X

α1igonuc1sétidos mostrada abaixo)» A sequência do oligonucIeótido 5A fois 5*~TCSATTSAATTCCCCSGGGATCCTCTASA6TCSACCTSCA8AAeCTT-35

EcoRI Sisal BamHI Xbal Sall PstI HindiII A sequência de oligonucleótidos oB fois 5 ?-C6AAeCTTCT6CÃ6eTCGHCTCTfl6A66ftTCCCC6ee6HftTTCAftTCSHieCft-55.

HindiII PstI Sall Xbal BamHI Smal EcoRI Ciai

Os ol igonucl-sétidos 5A e 5B foram emparelhados e ligados ao fragmento isolado pSVIéB-tPAdíbhs) para criar o ρ 1 asmícisa pSVIóBS» A ligação do extremo saliente PstI ao extremo saliente 3 5 TBC A dos ol igonuc leótidos- emparelhados não regenerou um sitio PstIs mas criou um sitio Ciais na outro extremo do adaptador, a ligação do extremo saliente Ciai so extremo saliente 53-CB não regenerou um sítio Ciai. EXEMPLO 2

Construção dos vectores de expressão Hrq e KoélSFg^ Transformação de Células CHO com eles. s Purif icacão dos mesmas Métodos Beraís

Os oligonucleótidos usados para a mutagénese do cBNA para este exemplo e exemplos subsequentes foram sintetizados usando Cl) química de fosforamidetos num sintstizador de DMA de duas colunas Biosearch (San Rafael, CA) Cyclone, com purificação usando as cassetes de purificação ds oligonucleótidos Applied

Biasystems íhaster City5 CR) ou <2>quífnica de H-fasfonata coma descrito por Froehler et al=, Nucl, ficlds Res., 14g 5399-54©? < 1986)

As transfecçSes celulares foram realizadas pelo método da fosfata de cálcio CKingston, em Current Protocole in Molecular ΒίοΙοοχ, supra) .

Os DNAs de plasmídeo foram purificadas por centrifugação em gradientes de CsCl/hrometo de etítíio- CEtBr) (Moore, &m

Current Protocols__in Molecular Bioioay. Ausubsl et al.? eds. {John Wiley & Sons, New York3 1987)= p» 1=7=1-1=7=4) com uma ultracentrífuga preparativa Beckman (ralo Alto, CA) L5 65= Einpregou-se um rotor vertical (Vti.óS.l) na centrifugação durante 7 horas a 55 Φ&Θ rpm e a 15°C? para separar as bandas de DMA = Após o material pretendido ser retirado do tubo de centrífuga, removsu-ss o EtBr do DMA de plasmídeo por entracção para uma solução de isopropanol saturado com CsCl= 0 DMA foi então diali-satío contra um tampão de 1 mM Tris-HCl/051 mM EDTA= pH 7=15 antes das transfecçSes celulares.

Construção do Vector tis Expressão R561S pA47bRa6lHFa

Um plasmideo designada pUCl19PMÍ27=6 (a sequência do qual está apresentada na Figura í com sxcepção descrita, atrás relativa ao nucleótido 3809) foi preparado como se segue» Um primeiro cDNA foi isolada a partir de uma biblioteca de cDNA iniciada com n~Qligo(dT> construída a partir de mRNA de fígado isolado a partir de cinco indivíduos. CGkayama et al», Hol, Ce11. Biol.. 2s 161-17© (1982>e Subler st al., Bene» 25; 263-269 (1983)]» Os cDNAs seleccionados de acordo com o tamanho (maiores do que 6©Θ pares de bases) foram ligados aos vectores do bacteri— ófago lambda gtí© (Strtagene, San Diego·, Califórnia) e despistados sem amplificação EDrayna et al., Mature., 327s632-654 (1987)3» 0 cDNA foi ligado ao vector lambda qti© usando um adaptador como se segue»

EcoRI Sac I/ast l Sal I

lambda gtl®s 8AATTCT ' CBAGCTC BTCBACCi cDNA com a

Recuperou-se um clone de cDNA em lambda gtl©eom uma oligonucleótítio sonda de 75 bases (PL.15, correspondendo aos nucleótidos í 3Θ6--i 386 do cDNA de plassninogénio humano LForsqren atai»» FEBS Lett.» 215; 254-26© (1987)1= Os filtros foram hibridados em 5 x SSC (15© mM NaCl, citrato ds sódio 15 mH), fosfato de sódio 5© mH (pH 6=7), solução de Denhardt 5X, 2©% de formamids, l&% de dextran—sulfato e Ξ© μα./ml de DMA de esperma oe salmão soniçado e fervido a 42°C durante a noite s lavado durante uma hora em 2X SSC» 0,1% SDS a 55°C e exposto a filme de raios X. Um clone de lambda gti© (designada lambda gtl©;pmgn#127> foi cortado com Ssfcl s ligado a pUC119 cortado com SstI para dar pUCÍ 19PN127 = 6= na Figura. 1 estão apresentadas uma sequência de nucleótidos e uma sequfncia de amínoácidos deduzida.

excepção descrita atrás* A sequência de nucleófcidos do CBlu~JFg _ 4/7^ és pUC11912/»6 mostrou a presença de Vai''"" em vez da Ala* 0 dons foi totalmente sequenciado» A análise da sequência de DNA foi realizada pala método da terminação de cadeias didescKi em ambas as cadeias do cDNA da cadeia dupla subclonado CSanger et al.s Proc * Watl. Acad» Sei* USA.. 74 5 5463-5467 (1977)3 quer directemente no BNft de cadeia dupla quer em ma Ides de cadeia simples CChen et a.l = ? SrlA, 4s 165-17¾¾ (Í985)3após subclonagem num vector pUC119a 0 vector pA475R561SPg contenda a sequência correria de Pg humano com excepção para a serina na posição 56Í foi construída como se segue e como mostrado na Fig* 7* pSVIôBtPA foi digerido com EeoRI, preenchido o sítio EcoRI e depois cortado com PstI a o fragmento grande isolado» pUCl19PN127=6 foi cortado com Sphl e preenchido para se ter o extrema cerse Sphl e depois cortado com EcoRI e isolado o fragmenta pequeno incluindo a extrema 31 do c DMA de HPgp pUCl19PNi27=6 foi também cortado com PstI e EcoRI e isolado o fragmento pequeno que inclui o extremo 5* do cDNh codificador tíe HPg= Estes dois fragmentos pequenos e o fragmento grande do pSVIóBtPA foram ligados uns aos- outros usando ligase de T4 para produzir α plasmídea pSvIéBPiqn» Este plasmídeo foi clivado com PstI e EcoRI e o fragmento pequeno <248 pb) foi isolado <fragmenta A) * pSvIétíplqn foi também sujeito a mutagênss-e dirigida do cDNA de HPg usando o método de Kunkel et al«s He th. Enzym., 154s 367-382 Í1987) e usando um iniciador para a alteração R5618 como se segues 1 1 —ACCCCCCTACAACGGATCCAGSACATTTCTTC—31. 54

..

As colónias foram despistadas quanto à presença do novo sítio para a sndonuclsase de restrição BamHI também inserido no cDNA como resultado destas mutações» 0 plasmídeo resultante foi designado pSvIRSóiSPg*C2„ Este plasmídeo foi cortado com Sphl e preenchido o sitio Sphl para dar um extremo cerse e cortado com EcoRI e o fragmento pequeno (2,3 Kb> foi isolado (fragmento B> 0 terceiro fragmento foi preparado a partir de pSvIóBtPA clivando este plasmídeo com EcoRI e preenchendo o sítio EcoRI para ficar cerse e cortando com Pst I seguido de isolamento do fragmento grande (Fragmento O»

Os fragmentos A, B e C- foram ligados ligase de T4para dar o plasmídeo pRSélSPg contendo as elementos de vsctar do pSVIòBtPA e o plasminogénio mutagenizado»

J

Como fonte ue vector poderão ser usadas- outras- vectores de expressão em ves de pSVIòBtPA * Por exemplo,, poderá ser empregue pE'342—tPA (Pat. U»S. 45 7έ,ώ3©75) cama fragmenta vector por substituição do DMA codificador de t-PA do pE342~tPA com o cDNA do plasminogénio de pUCl 19PN127.6= Assim» elementos- reguladores de outros vectores de expressão poderio ser operaeionalmen-ts ligados ao cDNA ds HPg para produzir um vector de expressão de HPg. 0 vector final 3 pA47bHbéÍSPg,, foi preparado como ss segues pRõòiSPg foi clivado com Ahal I e EcoRI e o fragmento pequeno Pg mutagenizado (lô®3 pb) foi isolado (Fragmento D)» Também, pSVIfcBFlqn foi clivado com Smal e EcoRI s o fragmenta vector Í4S394 Kb) foi isolado (Fragmento E)« Finalmente? pSVIòBPlgn foi sujeito a mutagéness dirigida da cDNA para HPg usando o método de Kunksl et a 1 „ supracora o seguinte iniciador mutagénico (as bases sublinhadas representam as mutações impostas) para fazer uma mutação V475As

55 —GTAACAAB7B6TT0ÇCCTCTT0CCTC—35 =

As colónias positivas foram despistadas usando uma digestão com endonucleases de restrição EcoRI/BstEII„ Clones com os fragmentos de tamanha adequado fora® ssqusnciados na região correspondente ès posiçSes de aminoácidos 455~-5®2„ 0 pSVIéBPIgn assim mutagenizada foi cortada com SmaI e Ahal1 e o fragmento pequeno (i555 Kb) isolado (Fragmento FK- Ds fragmentos D? E e F foram ligados para produzir o plasmídeo final pA475R561 SPq»

Construção do Vector de E^presslo do Plasminogénio pft4/5Pq

Um plasmídeo contendo a mutação A475 sem a mutação RSóiS contendo a sequência nativa do plasminogénioí foi preparada como se seguias pSVIóBPlgrt foi cortado com AhalI e Eco.RI e isolada o fragmenta pequeno (Fragmento B)„ Os fragmentos E e F (descritos atrás) e 8 foram ligados para produzir a plasmídeo pA475Pg»

Construção do Vector de IzKprsseão pRKrfil-l

Um vector de expressão codificador do inibidor do activador do plasminagánio do tipo células endoteliais migrando na posição js (PAI-l) humano foi construído como ss segues A clonagem e sequência da PAI---1 estão descritos por Ny et al » ? Proc - tiatl» ftcaa, Sci„ USA,. 85s 6776-678® (1986)¾ Binsberg et a 1, ? J. Cliru_Invest. 7Ss 1673—160® í 1986=): Parmekosk et al».,

EMBQ J = , 5s 2539-2544 (1986)=, 0 cDNA do ΡΑΪ--1 foi obtido a partir de uma biblioteca de cDNA de células endoteliaxs umbilicais humanos como um clone de lambda num vector de clonagem pUCi8 que se replica em E.coli„ Este plasmídea foi cortada com BaIII·:-dotada de extremos cersas a cortado com EçoRI» 0 fragmento pequeno, cerca de 143Φ pb, foi. purificado em geL pRK5 foi também cortado com Smal , em sequida com EcoRI e um fragmento vector de 4712 pb foi isolado e purificado em gel,. Estes dois fragínentos foram ligados usando ligase de T4 e as digestões de miniprepara-çSes foram realizadas para confirmar a orientação da inserção» O vector finalfoi designado pRKPAI-í»

Transformações com pA4/oKaPlHpg ou com pA4/5Pg Células dhfr (Urlaub e Chasin, supra) foram semeadas em placas de 6Θ mm a Sxlfir5 celulas/placa, em duplicado» Os DNAs foram transfectados pelo protocolo de fosfato de cálcio com as seguintes combinações de plasmideoss <a> pA475R561SPg (50 μΐ ou 5 μπ/placa), pRKPAI-l (4,2 μΐ ou 5pg/pia.ca) e pFDll (um piasmideo codificador de DHFR descrito por Simonsen é Levinson , Proc, Na ti. Acad. Sei. USA» 8#s 2495-2499 (1983))5 h μΐ ou 0,5 pg/placa); (b) pA475R5òÍSPg (50 μΐ/placa) e pFDil <6 μΐ ou 0,5 μα/placa)5 (c) pA475Pg (5© μΐ ou 5 μα/placa), pRKPAI-í (4,2 μΐ ou 5 μα/~ placa) e pFDll (6 μΐ ou ©,5 μα/placa)ρ ou (d) pA475Pg (5© μΐ ou 5μ9/ρ1ΰ05) e pFDll (6 μΐ ou 0,5pg/placa)»

As células forma divididas por meio de cultura contendo 77 de soro fetal bovino diafiltrado a 0,1. 0?!? ©,1, 0,2, 0,2 e 0,3 μα de piasmideo por placa de Po mm. Doze dias mais tarde uma

* ί'

placa de cada uma das quatro transformações ía-d) íai lavada com tampão de fosfatos salino e fornecido meio de cultura selectivo e 7% ds soro fatal bovino sem plasminogénio* Esta passo removeu qualquer plasminogénio que não tenha sido produzido pelas células* Qs clonas produtores ds plasminogénio foram dasjiíistatíQS pala quantidade de expressão nos filtros* Tris clonas de cada uma das transformações a-d foram colhidas com palitos para uma placa de 12 cavidadeSaEstes doze clones foram cultivados em placas dè 1Φ cm e o meio foi mudado com um maio da cultura não selectivo* 0 meio colhido foi sujeito a determinação de proteína por ELISA* Encontrou-se que o pA475R561SPg e pRKPAI—i clans #2 deram actividade de pelo menos 1 mg/l„ Cinco frascos rolantes do material RSòlS-HPg foram produzidos para purificação* R5613— -Hrgfoi purificado a partir do sobrenadante da cultura de CHO por cromatografia de afinidade em Sepharose-l isina de acordo oocn o método de Dsutsch e Msrtz5 Science* 17¾¾ 1©95-I09ê C197*7 conforme modificado por Brockway e Castellino* Arch* Siachem * Biophvs** 151s 194-199 (1972)»

EXEMPLU S

Construção do Vector de Expressão R561EPgs

Transformação de Células de Insectos com ele e Purificação

Ds métodos gerais descritos no Exemplo 2 foram também empregues neste exemplo*

Construção dos Vsctores dg hKprssslo Baculovirus HPq e RoálE-Hpg 0 cDNA codificador de HPq no piasmideo pUCl19PN127»& (no fragmento BamHI/Nael) foi /nutaqenisado como descrita no Exempla 2 para gerar a alteração V475A como descrito no Exemplo 2 para criar Pg de sequência nativa» 0 plasmídeo resultante fai mutaas-nizado como descrito no Exemplo 2 para gerar a alteração R56ÍE usando o iniciador mutagénico? 55-CCCCCCTACAACCCTÇCCBBGACATTTCTTCGB-35.

As colónias positivas para esta mutação foram despistadas quanto â presença do sitio de clivagem pela endonuclease ds restrição SmaI gerado de novo que acompanha s alteração feita» 0 vector de transferência baculovirus recombinante pAVé no qual foram inseridos o cDNA A475HPy e o cDNA A475,RoólEHPg foi construído para incluir sequências de DNA que rodeiam o gene da políedrina (PH) de AcMNPV» pAV6 contem o promotor da políedrina em 1,8 Kh desde um sítio Xfaol situado 53 relativamente ao gane PH até ao nucleétido -8 do codão de iniciaçãoda polietírina (ATG) a também inclui um fragmento de 1,5 Kb que se estende desde um sitio Kjonl dentro do gene da políedrina até um sitio BamHi 35 do mesmo gene» Os sítios Xbol e BamHI foram perdidos durante a clonagem destes fragmentas» pAVé foi construído conforme ilustrado na Fiqura B„ Um fragmento EcgRI de 7,2 Kb do DNA tie Autoqrapha californica. designado pEcoRI-I ESmith et al., 3» Virol»» 45s 215-225 (1983)3, contendo o gene da políedrina e sequências delimitantes, foi cortado com Xhol s BamHI (as digestões com Sa1I e Xhol produzem extremos compatíveis)» 0 fragmento resultante Xhol/BamHI foi iigsdoa um vector mpl9 cortado com Bell e BamHI (Bethesda ϊ

Research Laboratories, Gaitherburgs MD) para formar uma construção designada mpl9Xha-Baííu 0 plasmídsa mpÍ9Xho-Bam foi cortada com EcoRV e ΚρηI, e um primeira oliganucleótido sintético (construído, tal como foram todos os oligonucleótidos referidos abaixo, num sinteticatíor de DNA automático modelo 38í? A adquirida à Applied BioBystems, Fostter City, CA) foi ligado a mplRXho-Bam para produsir um vector designado mpi9AID« 0 primeiro oligonucle-ótido sintético tinha a sequincia que segus, incluindo os sítios de restrição e iniciaç:ão da transcrição. iniciação da transcrição

55-GATTACATBSABATAATThãAATOATAACCATCTCOCAAAGGATCCSAAT 35 —CTATASTfiCCTCTATTAATTTTACTATTGGTAGABCBTTTCCTAGSCTTA Eco RV - BaaiHI. EcoRI

TCBTCBACBBTACC rGCABCTBCCTABS Sal I Kon I 0 primeiro oligonucleótido sintético substituiu uma sequfncia no extremo 5? do fragmento Xhol/BamHI em mpí9Xho-Bam desde um sitio EcoRV até ucn -sítio CAP putativo tendo um sítio de clonagem múltipla com sítios BamHI, EcoRI„ Sal I e- Kpnl ,

Ei?! seguida, um vector pUC12 (Bethesda Research Laboratories) foi cortado com Hindi1I e SstI, mplRAID foi cortado com Hindi 11 e ΚρηI e um fragmento de 1,8 kb contenda sequ'ências tíelim.itantes do extremo 5? do gene da poliedrina foi isolado, 0 plasmídeo pEcoRI-I foi cortado com BamHI e Kpnl e de entre os produtos de digestão, isolou—se um fragmento de 1,5 !<b estendendo—se desde o sítio Kpnl dentro do gene da poliedrina até um sitio BamHi na sua região delimitante 3?« Estes três fragmentos <pUCí2, 1,8 Kb e 1?5 Kb) foram ligados uns com os outros e com um oligonucleótido sintética tendo a sequência 5?-GATCAGCT? para produzir uma construção designada pAVl.

Após ρΑví ter sido cortado com BamHI e Κρηϊ, o fragmento resultante foi ligado a um terceiro oligonucleótido sintético para produzir uma construção designada pAV2„ 0 terceiro oligonu-cleótido sintético tinha uma sequência de nuc1séticos como se segues

5S-BAT CTA SAT CTB ABC TCB CBA TBG ATO CCB BBT AAC CBG TAC 35-AT CTA BAC TCB ABC BCT ACC TAB BBC CCA TTS BC

Um plasmideo, pDS, foi construído cortando pBR322 ío plasmideo de 4,4 kb adquirido à Bethesda Research Laboratories) com HindIII s Sal I , preenchendo com o fragmento Klenow e ligando. Assim, o plasmideo pDS não possui as sequências entre HindiII e 5a11 e perde o sitio Sa11. mas mantém o sitio Hindir τ„ 0 plasmideo foi cortado com HindIII s BamHi s isolado o fragmento HindIII/BamHi de 1,5 Kb (contendo a sequência delimitar· te 55>„ Em seguida, pAV2 foi cortado com BamHi e EcoRI e isolado um fragmento EcoRI/BamHi de í«5 kb estendendo—se desde o sítio BamHi no sitio de clonagem múltipla atè ao sítio EcoRI adjacente à sequência delimitante 39. O plasmideo pDS foi cortado com HindiII e EcoRI e ligado aos dois fragmentos feitos a partir de pAV2. 0 plasmideo resultante foi designado pAV3. 0 plasmideo pAV3 foi cortado com BamHi e Sal I. Um vector pAC373ESmith et al., Mol. Dell. Biol.. 3s215&-2165 (1983)3

hl (contendo DNA virai de NPV desde um sitio Sa 11 de cerca 1 kb 53 do gene da poliedrina até um sitio BamH! inserido no nucleótitío -8 ίο "A" do sítio de iniciação nAT8” sendo M> foi cortado com BamHI e SalI e ligado ao pAV3 cortado com BamHI/Sal I para produzir um vsctor designado pAV4=

0 vector pAV4 foi cortado com EesRI e os extremos foram preenchidos com o fragmento Klenon e ligado para produzir o vector designado pAVó (sem o sitio EcoRI do pAV4)B

J CO vector de transferência pAVóHPgs que é feito por inserção de um fragmento BamHI/Mae! codificador da sequência nativa de HPg do pUCi19PN127=ò nos sitios BamHI s Smal do plasmí-deo pAVô, contem o promotor da poliedrina (PH) de AcHnPV ligado à sequfncia sinal de HPg e à sequfncia codificadora de L8Iu“jpg maduro» Este plasmídso foi depositado no hospedeiro E, coli DH5a em 18 de Abril? 1989 na American Type Collection» 123Θ1 Parklawn Drives Rockville, MD 2Φ852;J com o N9 de Acesso 67.:,929,,3

Os cDNAs de A475—HPg s de A475;iRÕ6lE~HPg descritos atrás foram inseridos nos sítios BamHI e Smal do pAV&5 para produzir pAVA475Pg e pAVA475R5òlEPg ? respectivamente? que foram usados para infectar os meios de cultura de células de Spodoptera fruqiperda como descrito abaixa» l ransfoniaclo de ..Células de Insecto com o Vector de Transfertncia A construção pAVA475Pg ou pAVA475R561EPg e DMA virai tipo selvagem foram usados na cotransfbcçSd de células de Spodoptera frugiperrfa era cultura, como descritopor i^hitefleet—Sraith st al«s supra,, Numa célula,, a troca cruzada entre regiões homólogas deliraitantes de poliedrina da vector de transferência e o vírus proporciona um vírus recombinante de tamanho completo portador do

é-2 gene HPg eai lugar da gene PH« A estirpe resistente à inactivaçãa pela temperatura AcTR de vírus da poliedros® nuclear de Autogra-pha ca 11.fornica <AcMNPV) foi usado coma vírus hospedeiro para construções recombinantes» Para se obter células hospedeiras para toda a replicaçíso virai s manipulações pode ser empregue uma linha celular de Boodootera fruqiperda clonada <e»g,s células Sf9, conforme se pode adquirir à American Type Cultura Collec-tion, Rockeville, MD com o número de acesso ATCC CRL 1711) ou ria-o clonada EVaughn et al*, In vitro, 15; 213-217 (1977)3= Os processos empregues para a cultura de células de insectos estão descritos em Summers et al., Texas Aqricultural Experiment station Bu. 11 etiη HS 1555 ·,· (1987) nas páginas i€>-31 e 38 excepto ter sido empregue meio em pó Bracess Anteraaa da Bibco5 meio de Hink (em ves ds meio TNM-KH) e uma mistura de antibióticos ds penicilina/-estreptomicina/anfotericina B no processo da sua página 38=

Especificamente, células de Spodoptera fruqiperda (3 x 10^)„ em meio ds Hink tHink, Mature= 226; 466-467 (197Θ)3 mais 10% de soro fetal bovino (FBS) ES/nith et al»., Mo 1« C-e 11 = Bioi „ = supra3 =. aderiram a placas de cultura de 6ô mm» Após duas horas, o meio foi removido e as células foram incubadas numa suspensão de 0,5 ml de DNh tipo selvagem de AcMNPV C&51 μα) mais o DMA do plasmídeo de transferência pAVR5611EPg (1 pg) em NaCI (0,8 g/l), KC1 \Θ537 g/l)/Ma?B^P04=2R_0 (0,125 g/l), dextros® (1 g/1) s Hepes—NaOH (5 g/l) a pH 752= Após incubação durante a noite a cerca de 27°C? a suspensão de DNA foi removida e as células foram incubadas durante cinco dias em meio de Hink mais 10% da FBS»

As células de Spodoptera fruqiperda podem também ser cultivadas em suspensões empregando frascos ds agitação de baixa velocidade da Corning (New York) num agitador magnético de baixa velocidade Cellgro (Thermolyne Corp«9 Bubuque, lowa)» A cada um

dos frascos de agitação de 1©®© ml? adicionou~se 3@© ml de meio incompleto ds Hink (suplementado cora 8,:3% de FB8 e a mistura de psnicilina/sstreptomicina/anfotericina B como atrás)= 0 frasco à foi então inoculado com 5 κ 1©" células e agitado a 8© rpm» As células foram subcultivadss quando atingiram a densidade de 2-3 x i©~ células/mlpor remoção·, de Ι5Θ-Ξ5© ml dai suspensão celular e substituindo-o com meio fresco» As células cultivadas sm suspensão aderiram aos frascos e podem portanto ser usadas em processo que requeiram monocamad&s» -·-^ As células podem também ser cultivadas num meio com poucã proteína EX-CELL 4Θ© producido por JR» 3cientific? iMoodlandy CA» Este meio pode ser usado sm lugar do meio completo de Hink para cultivar as células em monocamadas» em frascos de agitação com culturas em suspensão ou em bio-reactores com entrada de ar Cq.v», Maiorella et al»5 Biotechnolooy, os 1406-1410 í1988)3 »

Depois do crescimento., as proteínas recombínantes A475-HPg e A4755E5fe1E-HPq foram purificadas por cromatografia de afinidade como descrito para os plasminogénios expressos por células CHO atrás»

J

tA £f“ riP! í!

Ensaios- e Resultados -A» Métodos e Ensaios Sarais 1» Sgquenciac-lo de ftmínoàcídos

J

0 plasminogénio e ssus mutantes produzidos de acordo com os Esemplos 2 e 3 foram sujeitos a análise da sequência ds affiinoácidos .amino-terminal nua sequenciador de fase gasosa Portqn ínstrumentsj após adsorçlo da proteína a discos de suporte de pepii.deos* Qs aminoácidos PTH foram separados numa coluna ODS de fase reversa Beckman CS μ, 4?6 mm κ 25Θ mm)? empregando um sistema de HPLC Spectra Physics» Este último consistiu numa bomba ternária de HPLC modelo 88®®? um detector de UV/Vis Modelo 848Θ, um integrador de registos Modelo 427Θ e uma Interface ΡΙ2Θ3Θ para injecçSss em linha das- amostras numa coluna de HPLC» A resolução dos 2Θ aminoácidos PTH foi conseguida a 55°C5 nas seguintes condiçSes de gradiente linears 88% de solução A í1 ml de ácido acético glacial/20 ml de tetra-hidrofurano/® =,@5 ml de trietilami-na/água para 5Θ® mls pH ajustado a 4?i® com NaDH 3 N)/12% solução B C i% tetra—hdrofurano em acetonitrilo) como solução de partida até 6®% solução A/40% solução B (solução limite) durante um período de 24r,5 min» a um flusa ds 1 rol/min» A solução B continuou então durante mais 535 min ao mesmo fluxo» durante esse tempo tendo sido sluidos os quatro últimos aminoácidos PTH»

2. Análise de lraosfsrãncia western

As amostras os proteína dos Exemplos 2 e 3 foram separadas por SDS/PAGE (Lasmm 1 i » Na tare, 227; 68Θ~685 £Í97-ô>> em géis de ΙΦ% de poliacrilamida em condições nSo redutoras* As bandas ide proteína separadas foram transferidas para membranas Iffimobilon—P Cii.il lipore, Bedford, MA) de acordo com processos estabelecidas < Burnetts , An a 1 * B i oc hem * .-. 112¾ 195--223 (1981)) s depois incubado a 37°C durante uma hora em í% Cp/v) de gelatina (grau de pureza Bio—Rad EIA) em TBS £0,€>5 M TrisHCl, 0,15 M, pH 7,4, tampão de bloqueamento). As condições exactas para transis-rtncia foram 4°C em Tris—HC1 25 mrl/gliçina 2ΦΘ mrl/15% Cv/v) metanol, pH 8,3 a 2© volts durante 12 horas* Esta solução foi substituída com uma outra contendo 4 μα/mi de monoclonal murino anti-HPg (Whitefleet-Smith et al=, supra) em tampão de bloques— mento e incubada á temperatura ambiente durante duas horas com agitação» 0 filtra foi lavada com três mudas de Θ,Θ5% (v/v) Tween-20 em TBS à temperatura ambiente» durante um período de 15 min = Ele foi então incubado com snicorpos de coelho -anti—IgG de murganho conjugados com fosfatase alcalina (Sigma>em tampão de bloqueamento durante duas horas à temperatura ambiente, com agitação e depois lavado como atrás» As bandas positivas foram visualizadas após incubações., ã temperatura ambiente, com -a solução de substrato C lè55 mg de "nitro blue tetrazcliunj"/©?5 ml da DMF aquosa a 72% (v/v)/8,5 mg de bromocloroindolilfosfato em 1 ml de água, que foi adicionado a 5© ml de β,Ι M Tris-HCl/β,Ι H NaCI/05©05 M MgCl,9 pH 9,5)= 66

5, Ensaios fimidollticos de UQfítplsKOs tstequioqtétricos ds SK-Hrq e SKrHfírs

Uma quantidade de @,2 ml de um tampão consistindo em 1ΘΦ mH Hepss-NaOH!/1Θ mH EA CA» pH 7,4 foi ca locada, numa cu vate de espectrofotómetro, mantida a 25°C= Em seguida adicionou-se a concentração pretendida do substrato cromogénico = H—D~Val~L~Leu~ -L-Lis-pNft CS2251, Helena Laboratories^ Beaumont, T%>, seguido da quantidade necessária da água* h hidrólise do substrato foi ^ acelerada pela adição da quantidade pretendida do complexo estequiomátrico SK-HPq ou SK-Hpm Cconcantraçao final 6-1Θ nM5 = A velocidade da hidrólise de S2251 foi registada continuaments durante 2~o min a 4Θ5 nm» As absarvSncias foram convertidas em velocidades de aetivaçio iniciais como anteriormente descrito íUrano et al=, supra) e os resultados de velocidades foram analisados de acordo com as representações de Lineneaver-Burk. Os complexos de encima foram gerados por incubação a 25°C de quantidades estequiométricas de estreptoquinase (SK) (preparada de acordo com α método publicado por Castellino e t sl = 5 jlettb-EnzyinoloQv. 45; 244-257 (1976)) e o plasminogénio pretendido dos Exemplos 2 e 3» ) 4» Ensaios do Actívador do Plasminoqénio de Complexos Estsquiomé-tricos de BK-HPq e SK-HPm

Uma quantidade de €j?2 ml de um tampão consistindo em 1Ô@ mH Hepes-NaOH/l€i mM EACA,, pH 7,4 foi. colocada numa cuvete de sspectofotómetro;i mantida a 25 °C, Em seguida adicionou-se @,08 ml de S2251 (concentração final Θ,5 mn), seguido da quantidade necessária de água, várias concentrações de plasminogénio bovino 67

(BPg5 purificada a partir de plasma bovina fresca usando o mesmo método usado para purificar os Pgs recombinantes) e por fim o complexo de SK-HPg ou SK-activador de HPm preparado como descrita atrás (concentração final ©52 nri)* A velocidade de activaçao de BPg foi controlada ecu ensaio continuo (Urano et al=? supra) registando a libertação de p-nitroanileto resultante da hidrólise de S22S1 pela plasmina bovina gerada= Os resultados foram analisados por representações de Lineweaver-Burk como publicado para estudos anteriores deste tipo (Urano et ai»s supra)» Nestas condiçoesj BPg nao foi activado por BK sócinho,, 5» Dssqlicosilacão de HPo A preparação de BPg pretendida (em fosfato de sódio 1© mM? pH 734) foi tratada com glicopeptidase F (Boehringer nannheim,, lndianapoliss IN) numa concentração de unidades de encima/pg de HF· g = Deixou-se a reacçSo decorrer durante 24 horas a 37°C.= Encontrou—se serem estas as condições adequadas para a remoção de açúcar ligado a Αβπ'"1" ' de todas as amostras investigadas,, A mistura foi então sujeita a centrifugação em tubos de miereconcentração com uma exclusão de 1Θ ΘΘ© CCentricon 1Θ) CAmicon? Danvers, MA) para separar o oligossacárido libertado da amostra de proteína„ B._Resultados

Dois plasminogénios humanos recombinantes foram obtidos a. partir da infecção de células de insectos com um baculovirus

recombinante contenda o cDNA de A475CSiu~jpg tipo selvagem (proporcionando wt-irHPgs Whitefleet-Smith et al = 5 supra) e o cDMA de A475 HPg tipo selvagem contendo uma mutação R5èiE-HPg>» Uma outra proteína recombinante com a sequência A475 tipo selvagem contendo uma mutação R561S foi produzida em células CHO <R56iS~HPg). D seu comportamento electroforético sugere que todas estas proteínas recombinantes estavam altamente purificadas e que possuíam os pesos- moleculares característicos associados a IGlu^ipg humano» Por questões de brevidade, a mutação A475 não è referida na discussão abaixo, se bem que esteja presente em todas as proteínas HPg recombinantes produzidas referidas» A análise da sequência de aminoácidos amino-terminal de todos os plasminogénios descritos proporciona a sequência MH^-Glu-Pro-Lsu-Aso-Asp, sugerindo que todos foram correctamente jL ' ~ processados relativamente à clivagem do polipeptídeo sinal e também sugerindo que as pequenas diferenças r?a mobilidade entre proteínas recombinantss purificadas e HPg de plasmai humanopodam refletir as pequenas variações de peso molecular resultantes das diferenças de glicosilação entre os plasminogénios derivados de células de células CHO, células de insecto ou de plasma»

As actividades amidoliticas do estado estacionário de complexos estequiométricos de SK com o(s) plasminogénioCs) recombinante tipo selvagem e variante recombinantes estão apresentadas na Tabela Σ e comparados com as do complexo esiequiomé-trico de 3K e plasminogénio derivado de plasma humano \i»e», lGIu"Jpq nativa de plasma humano, forma 1 de cromatografia de afinidade, purificada como foram os Pgs recombinantes). A activi-darie amidolítica total de cada um dos complexos desenvolveu—se em 1-5 min,»5 e tempos de - incubação da 5 min» foram usados para gerar as enzimas usadas neste estudo» % Λ,

IABbLA

Constantes cinéticas do estado estacionário 'a 25 °C para a actividade amidolitica contra S-2251 da complexos equiuiolares de SK com ρ 1 as®inogénios e plasminas

Espécie de Km CfflM) Kcat írnin ") Kcat/Km CffiM min Activador SK—HPma ©f35±© f©5 312±iò 891 SK-wt-írHPm © = 33±€? 5 Θ4 312+12 945 BK-R561E—HPg 0917±0s05 272±18 16Θ0 SK-Rõ6ÍS-HPg ©5 2S±©5 ©6 3ó8±2© 1314 SK-R561S-HPg#CHOu Θ55Θ±Θ5Θ6 377±18 734 ""Piasmina de plasma humano. ^HPg variante desgIicosi1ada em Aso289»

Ha caso de wt-irHPg e de HPg de plasma humanos a análise por SDS/PABE dos componentes dos complexos em tempos ds incubação de 5 min» mostrou claramente que eles eram compostos

7D por SK e CLis'conforme Ctíajaj e Castellino, J« sioL Chefliπ r. 252;!492-498 (1977))» Para os plasminogénios variantes do sitio de clivagem para activsçlo, os complexos- consistiram em SK e no HPg importante,, como seria de esperar, uma vez que a natureza da mutação prev§ a converslo do HPg para HPm dentro do complexo «

Os resultados da Tabela I mostram que os complexos SK-HPm? contende HPm de plasma humano ou wt—irHPHs possuí virtualmente constantes cinéticas de estada estacionário idênticas contra 5225i„ De modo semelhante, a actividatíe amidolítica está presente nos complexos estequiométricos de SK com as preparações das duas variantes de HPg, viz»? R5èíE-HPg e R56ÍS~HPg» A comparação dos valores das constantes cinéticas para estes dois últimos complexos BK—HPg com os primeiros complexos SK-HPm sugere que existam apenas pequenas diferenças nas propriedades amidolí-ticas do estado estacionário dos vários complexos SK—HPg e SK-HPm*

Os complexos SK equimolares com HPm de plasma humano ou o HPm expresso em células de insecto são práticamente idênticos5 demonstrando que as células de insecto producem uma proteína comparável com a contraparte do plasma humano = 0 í<m para o complexo SK com a variante com sitio de clivagem resistente irHF'g é ligeiramente inferior a este valor para os mesmos complexos com plasminas, sugerindo possíveis diferenças cinéticas no complexo SK-HPQj conforme comparado com o complexo SK-HPm» 9^0

Para se determinar se a açúcar ligado a Asn‘"“‘f do HPg desempenhou um papel nas pequenas diferenças observadas nas constantes cinéticas amidolíticas- do estada estacionárias R5618— --HPg (de células CHD) foi desglicosilado com glicopeptidase F» D complexo estequiomâtrico de SK com esta forma de HPq possuiu a penas um Km ligeiramente msis alto do que a sua contraparte

O O O qlxcosilada3 sugerindo que a presença do açúcar em Aso’-"' % pelo menos relaiivamenie ao tipo presente no material expresso por células CHQj não desempenha um grande papel nesta propriedade cinética do complexo SK—R561S-HPq„ 71

A Tabela II proporciona parâmetros cinéticos do estada estacionário reflectindo as respeetivas capacidades dos vários complexos estsquiométricos préformados SK-HPg s δΚ-ΗΡο, em níveis catalíticoss para servirem como activadores do plasminogénio» BPg foi seíeccionado como fonte de plasminogénio devido à sua insensibilidade à activaçSo por BK sósinho»

Constantes cinéticas do estado estacionário a 25 °C para a actividade do activador do plasminogénio contra plasminogénio bovino de complexos equimolarss de SK com plasminogénios e pi asininas

Espécie de Km (mn) Keat íinin “) Kcat/Km (mH min Activador SK—HPqa 1572±®506 1S79±0S®7 1,04 SK-HPmb 7S«®±15Í4 0=,61^0,09 θ,09 SK-^t-irHPgc ®s9S±®,12 4=14±Θ,52 4 s 22 SK—wt—irHPm° 9 s 8©± 1 3 06 2 5 28±€-* = 23 0 3 32 SK—R561E—HPg 0?72±05m7 7 5 0Φ±0s 84 9,72 SK—R5»ó 1S—HPg Θ,9Β±03ΙΘ 3 5 5#±€* = 36 3,61 SK-R561 S-HPg sCmO’" Çj 5 49±@ jli δ=52±15βθ 17,4 “ Plasminogénio de plasma humano« Este complexo foi formado como resultado de pré—incubação de SK ε HPg durante 3€> segundos» A percentagem relativa do HPg originai restante nesta altura no complexo foi de aproxinsadamente ΒΦΥ*. Ãproximadamente 2Φ7 existi-ra«i como HPsn neste complexo.

k Plasmina cia plasma humano» Este amplexo foi formada como resultado de pré-incubação de 8K e HPg durante 3 minutos,A percentagem relativa de HPm no complexo com SK foi de aproximada— mente 1ΘΘ%» u Plasminogénio humano tipo selvagem expresso em células de insecto. Este complexo foi formado como resultado da pré-incubação de SK e wt-irHPg durante 30 segundos, A percentagem relativa do HPg original restante nesta altura na complexo foi de apraxi-madamente 80%, Aproximadamente 20¾ existiu como HPm neste complexa» u Plasmina humana tipo selvagem expressa em células da insecto» Este complexo foi formado como resultado da pré-incubação de SK e wt-irBPg durante 3 min« A percentagem relativa de HPm em complexo com SK foi de aproximadamente 106%,

Asn

Complexo esteouiométrico de SK com RSélB-HPq desqlicosilado 289 em A comparação das propriedades cinéticas do complexo ~7fi_

SK-CLls'~JPm (gerada com HPg de plasma) (3 min» de tempo de pré-incubação5 Tabela II) mostra que o complexo contendo HPm expresso em células ds insecto é consideravelmente mais activa do que o HPm do plasma humano? devido essencialmente a uma diferença no Krde activação» Ainda.. a constante ds especificidade de segunda ordem para a activação do plasminogénio para o complexo SK-R561E-HPg foi de aproximadamente 30 vezes superior ao mesmo valor para o complexo SK—wt-irHPm? devido a um decréscimo no K s a um aumento nos valores de A partir destas resultadas e de uma comparação dos resultados obtidos com o complexo SK-irHPm <3 min, de tempo de 73

pré-incubação) e com o complexo SK-RõòlE-HPg, parece que o complexo contendo HPq é considerávelmente mais éticas como activador do plasminogênio do que o mesmo complexo contendo HPm. Evidência adicional para esta hipótese foi obtida a partir da análise do efeito do tempo de pré-incubçãa de níveis estequiomé-tricos de SK com CSlu/jPg e com wt-irHPg na capacidade dos complexos resultantes para activar BPg»

Nos tempos muito iniciais da pré-incubação íí 3# seg= )3 BDS/PA6E demonstra que o complexo ainda contem aproximadamente 8Θ% de HPq5 no caso de cada um dos plasminagânios e aproximada-mente 2®% de HPm = Nos tempos i min„ e seguintes, todo o HPg foi convertido -era HPm dentro do complexo» Um nível muito superior da actividade de activador de BPg está presente na amostra de 3Θ seg» do que nas amostras pré-incubadas durante >1 min», sugerindcs fortemente que o complexo SK-HPg é mais eficaz do que o complexo SK—HPm na activaçao de BPg»

As constantes cinéticas para a activaçSo de BPg com os complexas SK preparados a partir de HPg de plasma humano e wt-irHPg em tempos de pré-incuhaç§o curtos (3Φ seg») estão apresentadas na Tabela II» Como se pode ver por estes dados, os valores de K estão dramáticamente diminuídos relativamente aos m obtidos com as correspondentes amostras em que todo o HPg foi convertido em HP dentro dos complexas (comparar os dados para os·-tempos de pré-incubacao de 30 seg» e 3 min» na Tabela ϊI)= Quando experiências semelhantes foram realizadas com R561E~HPg e R56ÍS-—HPg, não se observou tal pico de actividade nos tempos iniciaiss foram observadas apenas actividades de activador temporalmente constantes dos complexos»

Final mente., a variante HPg <R5ólS~HPg > expressa em células de mamífero, em complexo estequiométríco com SK, possui

valores cinéticas da estado estacionário contra activação de BPg semelhantes mas não idênticos aos da proteína expressa sin células de insectos 8R5é-iE~HPg) = 0 para o complexo com encima ci«ontendo esta última proteína é aproximadacnente 2 vezes mais alta do que a do complexo formado com o primeiro HPg. Que as diferenças na glicosilação das preparações de variantes de HPg recombinante possam desempenhar um papel nas actividades do activador do plasminogénio dos- complexos SK contendo estes mesmos plasminogénios pode ser observado a partir dos dados da Tabela II. Assim, o K u para'a activação do BPg pelo complexo SK--RÕ61S-~HPg é aproximadamente 2,4 vezes- inferior e o K é aproximadamen-te 2 vezes superior relativamente aos valores correspondentes do mesmo complexo preparado com R5&íS-HPg desqlicosilado com glico— peptidase F. Estas diferenças não foram reveladas em análise das actividades amidoliticas dos mesmos complexos (Tabela I).Assim, a foram desqlicosliada da variante deHPg expressa em células CHO, em complexo equimoiar com SK, permitiu que □ complexo se torne mesmo um activador mais de BPg.

Deve-se notar que todos os ensaios cinéticos continham EACA coma componente do tampão. Este agente estava presente para proporcionar velocidades de activação máximas e paras eliminar qualquer consideração de possíveis diferenças nas velocidades de activação como sendo devidas a quantidades variáveis de D31u.~3F'g 7q e ULis'“3Pgnas misturas de ensaio com qualquer um dos plasminogénios aqui examinados.

Em conclusão, mostrou-se que a estabilização de HPg dentro do complexo SK resulta numa capacidade grandemente aumentada do complexo para activar plasminogénio. Em adição, formas estáveis de plasminogénio foram agora expressas em células de mamífero, permitindo a preparação eficaz de plasminogénio que é estável quando complexado com estreptoquinase. Em adição, tal

expressão evita que a utilização da plasma humano como fonte da plasminogénio, o qual corre o risco de conter vírus humanos prejudiciais tais como HIV, HTLV-I, hepatite, incluindo vírus da hepatite não A — não B, etc= EXtMPLO 5

Ds complexos formados entre encimas fibrinolíticas e plasminogénio pedem ser usados como agentes trombolíticos. 0 sítio catalítico das encimas fibrinolíticas pode ser bloqueado por um grupo que é removível por hidrólise em certas condições» Smith et ai . , Pai* U.S» 4,8Θ84®5, supras; e Smith et al =, , Mature, 29&ΐ 5Θ5-5Φ8 (1981). Portanto, E5ólE-HPg ou R561S-HPg deste invento podem ser emptregu.es como agentes trombolíticos por si sós ou como complexos com uma encima fibrinolítica, como um complexo com uma encima fibrinolitica adiada, como uma proencima acilada ou como uma proencima acilada num complexa com uma enzima fibri-nolítica ou uma enema fibrinolítica acilada» Um complexo de estreptoquinase acilada/plasminogénio acilada de acordo com o presente invento pode ser preparado como se segue» A estreptoquinase (cerca de 451 mgs como adquirida à AB Kabi, Stockholm. Sweden) pode ser misturada com um tampão 1isina/ mani to 1 (cerca de li® ml) a pH 7, o e glicerol estéril (cerca de 6® ml) e agitado durante 5 minutos s 4°C„ Orna solução de p-amidino-fenil—ps-anisato em DMSD (cerca de 15 ml, cerca de 2® mil) esterilizada por filtração em DiiSO (cerca de 15 ml, aproxima-damente 2® mH) pode ser adicionada durante 2 minutos e a mistura agitada durante 5 minutos a 4°C, RSólE-HPg ou RSóíS-HPg de acordo com o presente invento (cerca de ΒΘ9 mg) podem ser adicionados durante 2 minutos e a mistura agitada durante 6® minutos a 4°C« ϊ

Umâ invento pode s ·grau clinico) mistura com a lisina/manitol pr Sp.á raç -3u T arm ac κ u Λ. « ca de a%- Or do c Oíií u prese nte Sr V pr epa Lrada . CQ mo uZi ~-0QU 0 * H .1 bu .mina 00 r XC a hum ana {18 o tj s (lí I 20% p/ V } pud a sar en tão 3 d ! XC ionada à ,qi tsc j6j tíur ant H Ql £? ffii. nu i»_£__ a 4 o r | ampão QS P ode <en ; tSo ser a d 1 d X onad o par a levar o vo 1 ume até cerca de 40φ m1a 0 fluido pode Sgr entSo d iafiltrado durante cerca de 2,5 horas a Í8°C até cer ca de 24ΘΘ ml do diafilti rada ser colhido. 0 fluido pode ser e . Γ-' ^ f i 11 rado at ravés de um *f x 1 iz r o estéri1 de ®s22 μ e transfer * t luu para um rsse rvatorxo es téril 3. partir do ou a I pode ser distribuído cor frascos de liof ilí zsc-So estéreis seguido de liafilisação.

Depõs-i. "lio os ?_^ir 3.-a is 9 A estirpe que se segue foi depositada na American Cultura Collectionp 12301 Farklawn Drive5 Rockvi1 Is 5 !iD; (ATCC)s pe "Οι~1 V.

J

Estirpe N5 de -Acesso A l CC 294/pSVI6B5 68,151

Data do Depósito 25 de Outubro de 1989 feito nas condições do ιratado de ao Reconhecimento Internacional do para t ins d s Pro C BSS D ... .j.. Lite Pat ent .s 0 tsdo de Bud apesti B> = I sto gur •a 5¾ ável durar? izB 30 a nos a. par tir da da ará i □ispon V el na ATC c nos ter mos do ito a um B.C ordo en t Γ 0 5 bwp? ent h, a fl. isponi ui 1 idad e pe r ίπ«?.π0η te 0 n ão

Este depósito foi Budapeste no que respeita Depósito de Microorganismos às suas Regulamentações <Tra iuanutençSío cie uma cultura vi de depósito, 0 organismo fie Tratado de Budapeste e suje Inc. e ATCC, que assegura

restringida da progénie da cultura ao público quando da emissão da patente U»S» ou quando da abertura ao público de qualquer pedida de patente U»S» ou estrangeira^ a que venha em primeiro lugar e assegura a disponibilidade da progénie a alguém determinado pela Comissão U»S» de Patentes e Marcas Registadas que a tal tenha direito de acorda com 35 USC parágrafo 122 e as regras correspondentes do Comissariado (incluindo 37 CFR parágrafo 1=,14 com particular rsTErlncia para SS6 08 638>* 0 procurador do presente pedido concordou que se a cultura depositada morrer ou. se perder ou destruir quando cultivada nas condições adequadas,, será rápidamente substituída em notificação com uma espécie viável da mesma cultura» A disponibilidade da cultura depositada nSo deve ser pensada como uma autorização para a realização do invento contráriamente aos direitos concedidos sob a autoridade de qualquer governo de acordo com as suas leis de patentes» A especificação atrás descrita é considerada como sendo suficiente para permitir a realização do invento por alguém dentro da área,. 0 presente invento não está limitado no seu âmbito pela cultura depositada» uma vez que ss realizações depositadas destinam-se a uma ilustração particular de certos aspectos do invento a quaisquer culturas que sejam funciona1mente equivalentes estão dentro do âmbito do presente invento» 0 depósito do material aqui tratado não constitui uma admissão de que a descrição aqui escrita, seja inadequada para permitir a prática de qualquer aspecto do invento,, incluindo a melhor maneira de o levar a cabo, nem deve ser pensado como limitante do âmbito das reivindicações às ilustrações especificas que ele representa» De facto5 várias modificações do invento além das aqui mostradas a descritas serão aparentes para os familiarizados

Claims (4)

1. REIVINDICAÇÕES lã - Processa para a preparação de uma sequência de ácido rmclexco codificador de um plasminogénia resistente 4 clivagem proteolítica para dar a forma de duas cadeias carac.teri-zado por compreender a alteração da sequência do ácido nucleico codificador de um plasminogénia tipo desordenado pqra conferir resistência ao plasminogénia. 2s - Processo de acordo com a reivindicação 1 caracte— risada por o plasminogénia ser uma variante de plasminogénia humano tendo o resíduo arginina na posição 541 da sequência nativa do plasminogénia suhsttituida por um aminoácido diferente. 3i- - Processo d-s acordo com a reivindicação 1 ou 2 caracterizsdo por a variante ser R561E—HPg? R561G-HPg ou R5éiS~HF’g. 4ã — Vector de expressão caracterizado por compreender a sequência de ácido nucleico da reivindicação í5 2 ou 3 operacionalmente ligado a sequências- de controle» 5-â - Célula hospedeira caracterizada por compreender α vector da reivindicação 4«
2. 61 - Processo para a preparação de um plasminogénia resistente 4 clivagem proteolitica para dar a sua forma de duas cadeias» caracterizado por compreender a transformação da célula hospedeira com um vector de expressão que compreende uma sequência do ácido nucleico codificadora do referido plasminogénia*

   qemo J 8-1 - Processo de acordo com a reivindicação 6 ou 7 caracterizado por o referido plasminogénio ser R561E = R561S ou R56ÍG» Processo para. a preparação de uma composição tractsrizaoo por compreender a mistura de um plasminogénio preparado de acordo com a reivindicação 6, / ou. 8 com um veiculo íarmacêuticamente aceitável » l©s - Processo de acordo com a reivindicação 9 caracte-'içado por se incluir ainda uma enzima fibrinolítica» J 1 a has P&C!1 s i ra tran sformada © recuper ando a forma da cuI TÍJ f" s da c 0 i. u la» 'OCSSSQ -Z ~ us? acor 'do C OfTí a rsi v x π di c sçáo 6 ca racte— rido pia sminc jqéni 0 ser piasminogéni' o huma· no em posx ção 56 í da *ξξ- c 0 u t.’ r*í c x a nstxvà d 0 pia smino- uida c Qffi um DL itro a m i π Gtfic x d o» 1 lã - Processo de acordo com a reivindicação èf 7 ou 8 caracterizado por o referido plasminogénio ser completado com uma enzima fibrinolitica=
3. 121 - Processo de acordo com a reivindicação 11 carac-terisado porm o completo ser um completo de p—anísaiiestreptocjui— nase/plasminogénio sem clivagem de ligação psptídica interna»
4. 131 - Método para a terapia trombo1ítica caracterisado por compreender o passo de administrado a um mamífero necessitado de tal terapia de uma quantidade de <?= 10 até 1,Θ mg/Kg/dia de •ννιί,',^ΙΛί'^ um complexo binário entre a enzima fibrinolitica ε o plasmino-génio preparado de acordo com a reivindicçao 6= 14»- Método para a preparação de um complexo binária entre uma enzima f ibrinol itica e plasminogénio·, o complexo tendo um sítio catalítico essencial para a actividade fibrinolitica bloqueado por um grupo removível por hidrólise, caracterizado por compreender s mistura de uma enzima fibrinolitica com o plasminogénio da reivindicação ó para formar um complexo binário na presença de um excesso de um agente bloqueador da fórmula A-B ou E~F, em que A é um grupo bloqueador sensível á hidrólise que que é selectivo para o sítio catalítico essencial è actividade fibrinolítica e é capaz de transferir do grupo B para o sítio catalítico, B é um grupo que facilita a ligação de A à enzima5E é um grupo de localização que localiza o agente no sítio catalítico e F è um grupo bloqueador sensível à hidrólise que é capaz de transferir do grupo de localização para o sitio catalítico» :15§ - Método dde acordo com a reivindicação Í4 carac terizado por o plasminogénio ser plasminogénio humano onde o resíduo arginina na posição 561 da sequfncia nativa do plasmino-génio foi substituído com um amincácido diferente e a enzima fibri nolitica é a estreptoquina.se* lóé - Método de acorda com a reivindicação 14 ou 15 caracterizado por o plasminogénio ser R5òxE-Hpg? R5óIS~HPg ou R5618-HPg» ” *5fcV * ··, caracter grupo ac 17-1 — Método da acorda com a reivindicação 14? 15 ou. 16 i sacio por o grupo bloqueador sensível à hidrólise ser um : x 1 o« Lisboa, 3@ de Novembro de 199¾ )

   J. PEREIRA DA CRUZ Agente Oficial da Propriedade industrial RUA VICTOR CORDON, 10-A 3.a 1200 LISBOA J