JPH05509229A - 減少されたクリアランスを有する組織プラスミノーゲンアクチベーター変異体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明の目的は、生物学的活性を示し、野生型ｔ−ＰＡと比較して減少されたク リアランス速度を有するｔ−ＰＡ変異体を提供することである。

より詳細には、本発明は、９４位又は９５位、又は２３６位、２３８位及び２４ ０位に改変を有するｔ−ＰＡアミノ酸配列変異体であって、生物学的活性を示し 、野生型ｔ−ＰＡと比較して減少されたクリアランス速度を有する変異体を提供 するものである。

他の好ましい態様では、９４位又は９５位の改変、又は２３６位、２３８位及び ２４０位の改変は置換であり、それらの置換されるアミノ酸はアラニン、グリシ ン、セリン又はスレオニンと置き換えるのが好ましい。最も好ましい態様では、 それらをアラニンと置換するか、又は特定の部位をグリシンと置換する。

他の態様では、９４位及び９５位、又は９４位、２３６位、２３８位及び２４０ 位、又は９５位、２３６位、２３８位及び２４０位、又は９４位、９５位、２３ ６位、２３８位及び２４０位などの１つ以上の部位でｔ−ＰＡ変異体を改変する 。

この改変はアミノ酸置換が好ましく、より好ましくはアラニン、グリシン、セリ ン又はスレオニンと置き換え、最も好ましくはアラニンと置き換えるが、又は特 定の部位をグリシンと置き換える。

他の態様は、９４位又は９５位又はその両者、又は２３６位、２３８位及び２４ ０位、又は９４位、２３６位、２３８位及び２４０位、又は９５位、２３６位、 ２３８位及び２４０位、又は９４位、９５位、２３６位、２３８位及び２４０位 が置換された上述のｔ−ＰＡ変異体について、さらにその１０３位及び／又は１ １７位が改変されたものであり、その改変は１０３位をアスパラギンでアミノ酸 置換し、１１７位をアラニン又はセリンで、又は好ましくはグルタミンでアミノ 酸置換するのが好ましい。

他の態様として、本発明は上記の変異体をコードするＤＮＡ配列、このＤＮＡ配 列を形質転換宿主細胞において発現できる複製可能な発現ベクター、及び形質転 換された宿主細胞を提供する。

また別の態様として、本発明は、本発明のｔ−ＰＡ変異体の治療学的有効量を製 薬的に許容され得る担体と共に含有してなる、血管状態又は血管疾患を処置する ための組成物を提供する。

本発明はさらに別の態様として、本発明のｔ−ＰＡ変異体の有効量を哺乳動物に 投与することを特徴とする、哺乳動物の血管状態又は疾患を処置するための方法 を提供する。

また、本発明は、本発明のｔ−ＰＡ変異体の治療学的有効Ｉを製薬的に許容され 得る担体と共に含有してなる、フィブリン沈着又は接着形成もしくは再形成を予 防するための組成物を提供する。

さらに、本発明は、潜在的なフィブリン又は接着形成のある哺乳動物におけるそ の部位に本発明ｔ−ＰＡ変異体の有効量を投与することを特徴とする、フィブリ ン沈着又は接着形成もしくは再形成を予防するための哺乳動物の処置方法を提供 する。

図面の簡単な説明 第１図は、ヒトｔ−ＰＡの成熟形態のアミノ酸配列を示している。このアミノ酸 はアミノ末端から開始して番号付けしている。５つのドメイン、ジスルフィド架 橋、及びｔ−Ｐ、Ａ分子が２本鎖分子に切り取られる活性化部位、の各位置を示 している。

第２図は、ｐＲＫ、ｔ−ＰＡの構築を模式図として表したものである。ヒトｔ− ｐＡのｃＤＮＡをＨｉｎｄｍ及びＢａ１Ｉで消化し、それを真核生物発現ベクタ ーｐＲＫ７のＨｉｎｄｍ及びＳｍａＩ部位間に挿入した。

第３図は、マウスの血流中に残存する放射線標識化ｔ−ＰＡ変異体の残存量（血 液１ｍｌ当たりの毎分の１０００カウントで測定）を時間（分）に対してプロッ トしたものである。放射線標識化ｔ−ＰＡ変異体は通常タンパク質１ナノグラム 当たり１１０００ｃｐであった。検定した各変異体は野生型ｔ−ＰＡと同様に明 示している。

ｒｔ−ＰＡＪ、ｒヒトｔ−ＰＡＪ、及び「ヒト組織プラスミノーゲンアクチベー ター」なる用語は、プラスミノーゲンをプラスミンに変換できるプロテアーゼド メインと、フィブリン結合性に関与していると考えられるＮ−末端領域とからな る２つの機能領域を有するヒト外因性（組織型）プラスミノーゲンアクチベータ ーを意味する。従って、これらの用語は、上記の機能ドメインをポリペプチドの アミノ酸配列の一部として含有している該ポリペプチドを包含する。生物学的に 活性な形態のｔ−ＰＡは、この分子の上記２つの機能領域及びｔ−ＰＡの供給源 本来のそれら以外のｔ−ＰＡの他の部分を含有する形態として組換え細胞培養系 によって生産することができる。各個体のｔ−ＰＡのアミノ酸配列における１つ 又はそれ以上のアミノ酸の相違によって示されるように、個体間毎に自然のまま のアレル変異体が存在し、また生じることは理解されよう。

「野生型ｔ−ＰＡＪ及び「天然ｔ−ＰＡＪなる用語は天然の配列ヒトｔ−ＰＡ、 即ち１９８８年８月２３日発行の米国特許番号第４．７６６、０７５号にて報告 されているｃＤＮＡによってコードされているｔ−ＰＡを意味する。このｔ−Ｐ Ａ分子のアミノ酸部位の番号又は位置は米国特許番号第４．７６６、０７５号（ 前掲）に従って決められる。ｔ−ＰＡは天然起源から得ることができ、ヒトなど の種々の動物の相当するタンパク質が包含される。さらに、ｔ−ＰＡは、例えば チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨ○細胞）又はヒト腎肝２９３細胞などの組換 え発現系から入手することもできる。

「アミノ酸」及び「アミノ酸群」なる用語はすべて天然に存在するし一α−アミ ノ酸を意味する。この定義は、ノルロイシン、オルニチン、及びポモノスティン を包含するものである。アミノ酸は、以下の１文字又は３文字命名法によって特 定される Ａｓｐ　Ｄ　アスパラギン酸　１１ｅＩ　イソロイノンＴｈｒ　Ｔ　スレオニン 　Ｌｅｕ　Ｌ　ロイシンＳｅｒ　Ｓ　セリン　Ｔｙｒ　Ｙ　チロシンＧｌｕ　Ｅ 　グルタミン酸　Ｐｈｅ　Ｆ　フェニルアラニンＰｒｏ　Ｐ　プロリン　Ｈｉｓ 　ＨヒスチジンＧ１ｙ　Ｇ　グリシジ　Ｌｙｓ　Ｋ　リジンＡｌａ　Ａ　アラニ ン　Ａｒｇ　ＲアルギニンＣｙｓ　Ｃシスティン　Ｔｒｐ　Ｗ　トリプトファン Ｖａｌ　Ｖ　バリン　Ｇｌｎ　Ｑ　グルタミンＭｅｔ　Ｍ　メチオニン　Ａｓｎ 　Ｎ　アスパラギンこれらのアミノ酸は化学組成及びそれらの側鎖の性質に応じ て分類することができる。これらのアミノ酸は、帯電及び非帯電アミノ酸と大き く２つのグループに分類される。これらのグループはそれぞれサブグループに分 割され、アミノ酸はさらに厳密に分類できる。

「改変」、「アミノ酸配列改変」、「変異体」及び「アミノ酸配列変異体」なる 用語は、アミノ酸配列が天然ｔ−ＰＡと比較して何等かの相違点を有している１ −ＰＡ分子を意味する。普通、変異体は天然ｔ−ＰＡと少な（とも８０％の相同 性を有しているが、天然ｔ−ＰＡとは少なくとも約９０％相同的であるのが好ま しい。

本発明の範囲内にあるｔ−ＰＡのアミノ酸配列変異体は特定の位置に置換、欠失 、及び／又は挿入を有している。これらの位置は、ｔ−ＰＡのクリアランス速度 を調整するうえで影響を与えるものとして本発明者らが同定した。

置換ｔ−ＰＡ変異体は、天然のｔ−ＰＡ配列中の少な（とも１つのアミノ酸残基 が除去され、その同じ部位に別のアミノ酸が挿入されているものである。この置 換は、分子内のアミノ酸１つだけを置換させる場合は１つでよく、あるいは分子 内の２つ又はそれ以上のアミノ酸を置換する場合は多数であってもよい。

あるアミノ酸を電荷及び／又は構造が元のアミノ酸と有意に異なる側鎖で置換す れば、ｔ−ＰＡ分子の活性を実質的に変動させることができる。このタイプの置 換は、この分子の置換領域のポリペプチド骨格の構造及び／又は電荷又は／）イ ドロホビシティーに影響を与えると期待できる。

ｔ−ＰＡ分子の活性は、元の分子の側鎖と電荷及び／又は構造が類似している側 鎖でアミノ酸を置換すれば、穏やかに変動させることができよう。このタイプの 置換は保存的置換と呼ばれるが、この分子の置換領域のポリペプチド骨格の構造 又は電荷又はハイドロホビシティーのいずれかを実質的に変化させると期待でき る。

挿入ｔ−ＰＡ変異体は、元のｔ−ＰＡ分子の特定の位置にあるアミノ酸のすぐ隣 に１つ又はそれ以上のアミノ酸が挿入されたものである。「アミノ酸のすぐ隣に 」とは、アミノ酸のα−カルボキシ又はα−アミノ官能基のいずれかに連結する ことを意味する。この挿入はアミノ酸１つ又はそれ以上であってもよい。普通、 挿入は１つ又は２つの保存性アミノ酸から構成される。電荷及び／又は構造が挿 入部位に隣接するアミノ酸と類似しているアミノ酸は保存的と規定される。別に 、本発明は、挿入部位に隣接するアミノ酸とは実質的に異なる電荷及び／又は構 造を有するアミノ酸の挿入も包含している。

欠失変異体は、天然ｔ−ＰＡ分子の１つ又はそれ以上のアミノ酸が除去されてい るものである。普通、欠失変異体は、ｔ−ＰＡ分子の特定の部位にある１つ又は ２つのアミノ酸が欠失されている。

ｔ−ＰＡアミノ酸配列変異体を説明するために本明細書全体で使用している命名 法を次に説明する。ｔ−ＰＡのポリペプチド鎖の特定のアミノ酸の位置は数字で 特定している。この数字は、１９８８年８月２３日発行の米国特許番号第４．７ ６６、０７５号に記載されている成熟野生型ヒｈｔ−ＰＡポリペプチドのアミノ 酸配列のアミノ酸位置を意味する。ｔ−ＰＡ変異体の実際の残基番号はその分子 の欠失又は挿入によって上記のような番号の並びではないが、本明細書では、ｔ −ＰＡ変異体内の同様に位置した残基もこれらの数字によって命名している。こ れは例えば、部位特異的な欠失又は挿入変異体に存在する。アミノ酸の特定には １文字コードを使用している。置換アミノ酸は、野生型アミノ酸のポリペプチド 鎖の位置を示す数字の左側に野生型アミノ酸を特定し、そしてその数字の右側に 置換されたアミノ酸を特定することで命名している。

例えば、ｔ−Ｐ、Ａの９４位のアミノ酸グルタミン酸（Ｅ）をアラニン（Ａ）と 置き換えた場合は、Ｅ９４Ａと命名される。９４位のグルタミン酸（Ｅ）をアラ ニンと置き換え、９５位のアスパラギン酸（Ｄ）をアラニンと置き換えた場合は 、Ｅ９４Ａ。

Ｄ９５Ａと示すことができる。欠失変異体は、包括的な欠失のいずれかの端のア ミノ酸残基及び位置を示し、示したアミノ酸の左側にギリシャ文字「△」を配置 することによって特定される。例えば、アミノ酸１００−１０１の欠失を含有す るｔ−ＰＡ変異体は△Ｙ１００−ＲＩＯＩ　［ここにＹ及びＲはそれぞれアミノ 酸チロシン及びアルギニンを示すコと示される。１つのアミノ酸、例えばＹｌｏ ｏが欠失される場合は、△Ｙ１００と示される。挿入ｔ−ＰＡ変異体は、挿入さ れたアミノ酸の回りを括弧「「コ」でくくり、挿入のいずれかの側のアミノ酸位 置を示すことによって挿入の位１を示して命名される。例えば、９４位のグルタ ミン酸と９５位のアスパラギン酸との間にアミノ酸アラニン（Ａ）及びバリン（ Ｖ）が挿入される場合は、Ｅ９４［Ａ、Ｖ］Ｄ９５と示される。読み易くするた めに、カンマ「、」を使用し、１つの分子に存在する多重突然変異を分離して表 し、また幾つかのｔ−ＰＡ変異体分子を同時に挙げる場合には、セミコロン「、 」を使用して、構築された個々のｔ−ＰＡ変異体分子を分離して表す。

「クリアランス速度」及び「クリアランス」なる用語は、ｔ−ＰＡ分子が血流か ら除去される速度を意味する。クリアランスは天然のｔ−ＰＡについて測定され 、その結果、減少されたクリアランスとは天然ｔ−ＰＡよりもゆっくりとｔ−Ｐ Ａ変異体が消失することを意味し、増大したクリアランスとは天然ｔ−ＰＡより も速＜１−ＰＡ変異体が消失することを意味する。

「生物学的活性」、「生物学的に活性」、「活性」、及び「活性な」なる用語は 、血漿凝塊又はフィブリンの存在下のＳ−２２５１検定、Ｓ−２２８８検定、血 漿凝塊溶解検定又は他の適当な検定で測定した場合に、ｔ−ＰＡ分子がプラスミ ノーゲンをプラスミンに変換できるその変換能を意味する。ｔ−ＰＡ分子はその １又は２本鎖形態で検定でき、それらの検定は、フィブリン、フィブリノーゲン 、血漿及び／又は血漿凝塊などの活性の有効な調整物質の存在又は不存在下に行 うことができる。

「コードするＤＮＡ配列」、「コードするＤＮＡＪ及び「コードする核酸」なる 用語は、デオキシリボ核酸に沿ったデオキシリボヌクレオチドの順序又は配列を 意味する。これらデオキシリボヌクレオチドの順序によって、ポリペプチド鎖に 沿ったアミノ酸の順序が決められる。従って、ＤＮＡ配列はアミノ酸配列をコー ドしている。

「複製可能な発現ベクター」及び「発現ベクター」なる用語は、外来ＤＮＡ片を 挿入することのできた、通常は２本鎖であるＤＮＡ片を意味する。外来ＤＮＡは 異種ＤＮＡと規定され、これは宿主細胞内に天然では見いだされないＤＮＡであ る。このベクターを使用し、外来即ち異種ＤＮＡを適当な宿主細胞に輸送する。

ベクターは宿主細胞内に入ったなら、宿主の染色体ＤＮＡとは独立して複製する ことができ、ベクター及びその挿入された（外来）ＤＮＡの幾つかのコピーが創 製される。さらに、このベクターは、外来ＤＮＡをポリペプチドに翻訳させる必 須要素を含有している。外来ＤＮＡによってコードされているポリペプチドの多 くの分子はこのようにして迅速に合成することができる。

「形質転換宿主細胞」及び「形質転換」なる用語は、ＤＮＡを細胞に導入するこ とを意味する。この細胞は「宿主細胞」と呼ばれ、原核生物又は真核生物細胞の いずれでもよい。通常の原核生物宿主細胞としては大腸菌の種々の株が挙げられ る。通常の真核生物宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣細胞又はヒト腎肝 ２９３細胞などの哺乳動物である。導入されるＤＮＡは通常、挿入されたＤＮＡ 片を含有するベクターの形態にある。導入ＤＮＡ配列は宿主細胞と同じ種又は宿 主細胞とは異なる種由来のいずれでもよく、又はある種の外来及びある種の異種 ＤＮＡを含有する雑種ＤＮＡ配列であってもよい。

ｔ−ＰＡ分子のアミノ酸配列を変化させることにより、ｔ−ＰＡのクリアランス 速度を調節することができる。その変化はアミノ酸の挿入、欠失及び／又は置換 のいずれでもよい。好ましくは、この変化はｔ−ＰＡ分子の１つ又はそれ以上の 領域内の少なくとも１つのアミノ酸置換によるものである。置換させるアミノ酸 （群）を選択するための適当な手法は、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ及びＹｅｌｌｓ　 ［５ｃｉｅｎｃｅ　２４４＋１０８１（１９８９）コによって開示されているア ラニン−スキャニング突然変異法のそれである。この手法では、帯電した側鎖を 有する１つ又はそれ以上のアミノ酸を、非帯電側鎖を有するアミノ酸と置換する 。このような変化は、周囲の水性環境とポリペプチドとの相互作用に影響を与え ると考えられる。

アラニン−スキャニング突然変異法では、置換に使用するアミノ酸は、野生型ｔ −ＰＡの周囲のアミノ酸の電荷を中和するものである。疎水性、脂肪族、芳香族 、又は非−極性アミノ酸を使用できる。これらの中では、バリン、ロイシン及び イソロイシンなどの比較的大きな側鎖を有するものよりも、アラニン、セリン及 びスレオニンなどの小さな側鎖を有するアミノ酸が好ましい。置換するために使 用されるアミノ酸としては、グリシン、アラニン、セリン、スレオニン、グルタ ミン、アスパラギンが好ましい。最も好ましい置換のためのアミノ酸はアラニン であり、あるいは特定の部位ではアスパラギン、グリノン又はグルタミンである 。

アラニンはβ−炭素以外の側鎖が排除されており、従って野生型ｔ−ＰＡ分子の 三次元コンホーメーンヨンを変化させ難いので、アラニンがこの目的には最も好 ましいアミノ酸である。さらに、アラニンはタンパク質の埋没された領域及び！ 露された領域の両方に高い頻度で見いだされる［Ｃｈｏｔｈｉａ、　Ｊ、Ｍｏ１ ．Ｂｉｏｌ、、１５０：１（１９７６）コ。

クリアランスが減少され、及び／又は半減期が増大された典型的な変異体は、野 生型ｔ−ＰＡのアミノ酸配列のクリングル−１ドメイン又はクリングル−２ドメ インのいずれかに少なくとも１つの改変（アミノ酸置換、欠失及び／又は挿入） を有している。変異体はさらに、野生型配列の他のドメインに、ｔ−ＰＡ分子の 性質を強化するさらなる改変を含有することができる。例えば、これらの付加的 な改変はｔ−ＰＡ変異体のフィブリン結合特異性、比活性、及び／又はチモーゲ ニシティ−（ｚｙｍｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）を増大させるうえで役立ち得るもので ある。

１つの好ましい態様では、９４位又は９５位のアミノ酸、又は２３６位、２３８ 位及び２４０位のアミノ酸、又はこれらの部位の混合アミノ酸を、好ましくはア ラニン又はグリシンで置換する。これらの分子はそれぞれ、他のアミノ酸の置換 、欠失又は挿入をも含有することができ、好ましくは１０３位のスレオニンをア スパラギンと置換し、及び／又は１１７位のアスパラギンをアラニン又はセリン と、又は好ましくはグルタミンと置換することもできる。本発明の代表的なｔ− ＰＡ変異体は、Ｅ９４Ａ；Ｄ９５Ａ：Ｄ９５Ｇ；Ｅ９４Ａ、Ｄ９５Ａ：Ｄ２３６ Ａ、Ｄ２３８Ａ、に２４０Ａ；Ｅ９４Ａ、Ｄ９５Ａ、Ｎ１１７Ｑ；Ｅ９４Ａ、、 Ｄ９５Ａ、Ｄ２３６Ａ、Ｄ２３８Ａ、に２４０Ａ；Ｔ１０３Ｎ、Ｉ）２３６Ａ、 Ｄ２３８Ａ、に２４ＯＡ＋及びＮ１１７Ｑ、Ｄ２３６Ａ、Ｄ２３８Ａ、’に２４ ＯＡなどである。

さらに、本発明の分子は特定の部位を置換又は欠失させて、増大したフィブリン 特異性又はチモーゲニンティーなどのさらなる所望の性質を付与することができ る。これらの位置は例えば、アミノ酸９２から１７９の欠失、アミノ酸１７４− ２６１領域の欠失、１８４位などのグリコノル化部位の修飾、及び／又はアミノ 酸２４４−２５５領域の修飾などである。修飾のために重要な他の位！はプロテ アーゼドメイン全体にわたって配置しており、それには例えば、２７５位（１９ ８７年８月１９日公開）ＥＰｏ　２３３．０１３、及び１９８７年８月１３日公 開のｗ○８７１０４７２２を参照）、２７７位（１９８８年１２月２８Ｂ公開ｃ ｖ　Ｅ　Ｐ　Ｏ２９７，０６６、及び１９８６年１１月１２日公開（７）　Ｅ　 Ｐ　Ｏ２０１，１５３ヲ参照）、及び１９９０年３月２２日公開のＷ○９０１０ ２７９８ｉニー開示すれている２９６−２９９などがある。

Ｂ、変異体の構築 本発明のｔ−ＰＡアミノ酸配列変異体は好ましくは、野生型ｔ−ＰＡをコードす るＤＮＡ配列を突然変異させることによって構築される。一般には、そのＤＮＡ の特定の領域又は部位を突然変異誘発のために標的化するが、これを行うための 一般的方法は部位特異的突然変異誘発と呼ばれる。この突然変異は、制限エンド ヌクレアーゼ（特定の部位でＤＮＡを開裂する）、ヌクレアーゼ（ＤＮＡを分解 する）、及び／又はポリメラーゼ（１）ＮＡを合成する）などのＤＮＡを改変す る酵素を使用ＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼて消化した後、連結させれば、サ ムプルツク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）らの１５３項［１１ｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏ ｎｉｎｇ、　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　２版、　ＣB １ｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂａｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、ニュー ヨーク（１９８９）］に記載されているように、欠失を生じさせることがてきる 。この方法を使用するためには、外来ＤＮＡをプラスミドベクターに挿入するの が好ましい。外来（挿入）ＤＮＡ及びベクターＤＮＡの両者の制限地図は利用可 能でなければならず、又は外来ＤＮＡ及びベクターＤＮＡの配列が知られていな ければならない。外来ＤＮＡは、ベクターには存在しない唯一の制限部位を有し ていなければならない。次いて、適当な制限エンドマクレアーセをその酵素の製 造元が教示している条件下で使用し、これらの唯一の制限部位間で消化し、外来 ＤＮＡに欠失を施す。使用する制限酵素が平滑末端又は適合する末端を生じさせ るなら、バクテリオファージＴ４　ＤＮＡリカーセなどのリガーゼを使用し、Ａ ＴＰ及びサムプルツクら（前掲）の１６８項に記載されているりカーセ緩衝液の 存在下に１６℃で１−４時間得られた混合物をインキュベートすることにより、 それらの末端は直接に連結させることができる。これらの末端が適合しない場合 は、消化ＤＮＡの突出した１本鎖末端を充填するために４つのデオキシリボヌク レオチド三リン酸が必要であるＤＮＡポリメラーゼｒのクレノー断片又はバクテ リオファージＴ４　ＤＮＡポリメラーゼを使用し、まずそれらを平滑末端とする 。あるいは、これらの末端は、ＤＮＡの突出した１本鎖を切断（カッティング・ バック）することにより共に機能するヌクレアーゼＳ１又はヤエナリ・ヌクレア ーゼ（ｍｕｎｇ−ｂｅａｎ　ｎｕｃｌｅａｓｅ）などのヌクレアーゼを使用して 平滑末端にすることもできる。次いで、得られたＤＮＡをリガーゼを用いて再連 結する。これにより得られた分子がｔ−ＰＡ欠失変異体である。

同様の操作計画を使用すれば、サムプルツクら（前掲）の１５．３項に記載され ているように、挿入変異体を構築することができる。唯一の制限部位（群）にお いて外来ＤＮＡを消化した後、オリゴヌクレオチドを、外来ＤＮＡが切断された 部位に連結する。このオリゴヌクレオチドは、挿入する所望のアミノ酸をコード するように設計し、また直接に連結できるように、消化した外来ＤＮＡの末端と 適合している５°及び３′末端をさらに有している。

２　オリゴヌクレオチド−媒介性突然変異誘発オリゴヌクレオチド特異的突然変 異誘発は本発明の置換変異体を製造するための好ましい方法である。これは、本 発明の欠失及び挿入変異体を簡便に製造するためにも使用できる。この手法は、 アデルマン（Ａｄｅｌｍａｎ）らによって開示されているように［ＤＮＡ　２． １８３（１９８３）］、当業界に周知である。

一般に、少なくとも２５長ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドを使用し、ｔ−Ｐ へ分子の２つ又はそれ以上のヌクレオチドを挿入、欠失又は置換する。最適なオ リゴヌクレオチドは、突然変異をコードするヌクレオチドのいずれかの側のヌク レオチドと完璧に適合する１２から１５のヌクレオチドを有している。これによ り、オリゴヌクレオチドが１本鎖ＤＮＡ鋳型分子と適切にハイブリダイズするよ うになる。このオリゴヌクレオチドは、フレア（Ｃｒｅａ）ら［Ｐｒｏｃ、　Ｎ ａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　、　ＵＳ、　Ａ、　７５．５７６５（１９７ ８）］に記載されている手法などの当業界周知の手法によって容易に合成するこ とができる。ＤＮＡ鋳型分子は、その野生型ｃＤＮＡ　ｔ−ＰＡ挿入体を有する ベクターの１本鎖形態である。この１本鎖の鋳型は、バクテリオファージＭ１３ ベクター（市販されているＭ１３ｍｐ１８及びＭ１３ｍｐ１９が適当である）、 又はベイラ（Ｖｅｉｒａ）ら［Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚｙｙａｏｌ、　１５３．３（１ ９８７）コに記載されている１本鎖−７７一ノ複製起点を含有するそれらのベク ターのいずれかから誘導されるベクターによって作成することができるのみであ る。従って、突然変異しようとするｃＤＮＡ、ｔ−ＰＡは、１本鎖の鋳型を創製 するためにこれらのベクターの１つ１ｍ挿入りなければならない。１本鎖の鋳型 の生産はサムプルツクら（前掲）の４．　２１−４４１項に記載されている。

野生型ｔ−ＰＡを突然変異するためには、適当なハイブリダイゼーションの条件 下で１本鎖ＤＮＡの鋳型分子とアニーリングする。次いで、ＤＮＡポリマー化酵 素、通常は大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼエのクレノー断片を加え る。この酵素は、突然変異を有するＤＮＡ鎖を合成するためにプライマーとして オリゴヌクレオチドを使用する。従って、ＤＮＡの１つの鎖がベクターに挿入さ れる野生型ｔ−ＰＡをコードしており、第２のＤＮＡの鎖が同じベクターに挿入 された突然変異形態のｔ−ＰＡをコードしているヘテロ二重うセン分子が形成さ れる。次いで、このへテロ二重ラセン分子を適当な宿主細胞、通常はＥ、ｃｏｌ ｉ　ＪＭｌ　０１などの原核生物に形質転換する。得られた細胞を増殖させた後 、それをアガロース平板にプレー１−Ｌ、３２−Ｐて放射線標識したオリゴヌク レオチドプライマーを使用してスクリーニングし、突然変異ｔ−ＰＡを含存する コロニーを同定する。そのようなコロニーを選択し、ｔ−ＰＡ分子に突然変異が 存在しているかを確認するため、ＤＮＡの配列を決定する。

１つ以上のアミノ酸が置換されている突然変異体は、幾つかの方法の中の１つの 方法によって生成させることができる。ポリペプチド鎖中に数個のアミノ酸を近 接して一緒に配置させる場合は、それら所望のアミノ酸置換のすべてをコードす る１つのオリゴヌクレオチドを使用して同時に突然変異することができる。しか し、アミノ酸が互いに若干距離をおいて位置している場合（例えば、１０アミノ 酸以上で分割されている場合）は、所望の変化をすべてコードしている単一のオ リゴヌクレオチドを生成させるのは比較的困難である。その場合は代わりに、２ つの代替方法のいずれかを使用すればよい。第１方法では、置換させる各アミノ 酸のオリゴヌクレオチドを別々に創製する。次いで、それらのオリゴヌクレオチ ドを１本鎖鋳型ＤＮＡに同時にアニーリングすれば、この鋳型から合成された第 ２のＤＮＡ鎖は所望のアミノ酸置換をすべてコードすることになる。別の方法は 、２つ又はそれ以上の突然変異誘発工程によって所望の突然変異体を生産するこ とに関する。第１工程は単一突然変異体について記載しているとおりの方法であ る・　野生型ｔ−ＰＡ　ＤＮＡを鋳型として使用し、第１の所望のアミノ酸置換 （群）をコードするオリゴヌクレオチドをこの鋳型とアニーリングし、次いでヘ テロ二重ラセンＤＮＡ分子を生成させる。第２の突然変異誘発工程は、突然変異 誘発の第１工程で調製した突然変異ＤＮＡを鋳型として使用する。従って、この 鋳型は既に１つ又はそれ以上の突然変異を含有している。次いで、付加的な所望 のアミノ酸置換（群）をコードしているオリゴヌクレオチドをこの鋳型とアニー リングすると、得られるＤＮＡの鎖は、第１及び第２工程の突然変異誘発の両者 に由来する突然変異を新たにコードしている。この得られたＤＮＡは、第３の突 然変異誘発工程、などにおいて鋳型として使用することができる。

ｔ−ＰＡ変異体をコードするＤＮＡをポリペプチドとして発現させるため、この ＤＮＡをベクターから切り取り、真核生物宿主細胞発現にとって適切な発現ベク ターに挿入する。長期の安定なｔ−ＰＡ生産のためには、チャイニーズハムスタ ー卵巣（ＣＨ○）細胞が好ましい。しかし、本発明はＣＨＯ細胞におけるｔ−Ｐ Ａ変異体の発現に限定されるものでなく、特に、実験目的にｔ−ＰＡ変異体を一 時的にしか発現させる必要がない場合などは、多くの他の細胞型が使用できるこ とが知られている。

Ｃ宿主細胞培養及びベクタ一 本発明の最初のクローニング工程にとっては原核生物が好ましい。原核生物は、 ＤＮＡの迅速な大量生産、部位特異的突然変異に使用される１本鎖ＤＮＡの鋳型 の生産、多くの突然変異体の同時スクリーニング、及び生成される突然変異体の ＤＮＡの配列決定にとって特に有用である。適当な原核生物宿主細胞には、Ｅ、 ｃｏ］１（大腸菌）Ｋ１２株２９４　（ＡＴＣＣＮｏ、　３１．４４６）、Ｅ、 ｃｏｌｉ株Ｗ３１１０　（ＡＴＣＣＮｏ、　２７．３２５）、Ｅ、　ｃｏｌｉ　 Ｘ　１７７６　（ＡＴＣＣＮｏ、　３１．５３７）、及びＥ、ｃｏｌｉ　Ｂなど がある。

しかし、ＨＢｌｏｌ、ＪＭｌｏｌ、ＮＭ５２２、ＮＭ５３８、ＮＭ５３９などの Ｅ、ｃｏｌｉの他の多くの株、並びに他の多くの原核生物の種及び属も同様に使 用することができる。

原核生物はＤ　Ｎ　Ａ配列の発現のためにも宿主として使用できる。上記に挙げ たＥ、ｃｏＨ株の他、パンラス・ズブチリス（Ｂａｃｉ］ｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌ ｉｓ）などのバフラス属、サルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ 　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）又はセラチア・マルセサンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ　 ｍａｒｃｅｓａｎｓ）などの他の腸内細菌、及び種々のシュードモナス（Ｐｓｅ ｕｄｏｍｏｎａｓ）種などもすべて宿主として使用できる。

これらの宿主は、その宿生細胞と適合する種由来のレプリコン及び制御配列を含 有するプラスミドベクターと共に使用する。そのベクターは通常、複製部位、形 質転換された細胞内において表現型の選択性を付与できるマーカー遺伝子、］つ 又はそれ以上のプロモーター、及び外来遺伝子を挿入するための幾つかの制限部 位を含有するポリリンカー領域を含有する。Ｅ、ｃｏｌｉを形質転換するために 通常使用されるプラスミドには例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＵｃ１８、ｐＵｃ１９ 、ｐｔＪｃ　１１８、ｐＵｃ１１９、及びブルースクリプト（Ｂ］ｕｅｓｃｒｉ ｐｔ）Ｍ　１３などがあり、二わらはすべてサムプルツクら（前掲）の１．１２ −１．２０項に記載されティる。しかし、多くの他の適切なベクターも同様に利 用可能である。これらのベクターはアンピシリン及び／又はテトラサイクリン耐 性をコードする遺伝子を含有しており、それによりこれらのベクターによって形 質転換された細胞はそれらの抗生物質の存在下に増殖させることが可能となる。

原核生物ベクターに最も普通に使用されるプロモーターとしては、β−ラクタマ ーゼ（ベニンリナーゼ）及びラクトースプロモーター系［チェンジ（（ｈａｎｇ ）らのＮａター系ＥゴーデルらのＮｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　８． ４０５７（１９８０）　；　Ｅ　Ｐ　Ｏ出願公開第３６．７７６号］、並びにア ルカリホスファターゼ系が挙げられる。これらは最も普通に使用されるものであ るが、他の微生物プロモーターも利用されており、それらのヌクレオチド配列に 関する詳細が開示され、当業者ならば、それらをプラスミドベクターに機能的に 連結することができる［シーベンリスト（Ｓｉｅｂｅｎｌｉｓｔ）らのＣｅ１ｌ 　２０゜２６９（１９８０）を参照］。

２、真核微生物 本発明を実施するには酵母などの真核微生物が使用できる。パン酵母、サツカロ マイセス・セレビ／アエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ）が普通に使用される真核微生物であるが、他の幾つかの株も利用することがで きる。サツカロマイセスにおける発現ベクターとしては、プラスミドＹＲｐ７が 普通に使用される［スチンクコム（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ）らのＮａｔｕｒｅ　 ２８２：３９（１９７９）　；キンゲスマン（Ｋｉｎｇｓｍａｎ）らのＧｅｎｅ 　７：１４１（１９７９）　；　ンエンパー（Ｔｓｃｈｅｍｐｅｒ）らのＧｅｎ ｅ　１０：１５７（１９８０）］。このププラストは、トリプトファン環境下で の増殖能を欠いている酵母の突然変異株、例えばＡＴＣＣＮｏ、　４４．０７６ 株又はＰＥＰ４−１株［（ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）のＧｅｎｅｔｉｃｓ、　８ ５：１２（１９７７））］に選択マーカーを付与できるｔｒｐｌ遺伝子を含有し ている。酵母宿主細胞ゲノムの特徴としてｔｒｐ　ｌ欠損が存在するので、トリ プトファンの不存在下で増殖させれば、形質転換を検出するために有効な環境が 提供される。

酵母ベクターにおける適当なプロモーター配列には、３−ホスホグリセレートキ ナーゼのプロモーター［ヒ・ソ゛ンエマン（Ｈｉｔｚｅｍａｎ）らのＪ、　Ｂｉ ｏｌ、　Ｃｈｅｆｆｉ、　２５５二２０７３（１９８０）］、又はエノラーゼ、 グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカ ルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラー ゼ、３−ホスホグリセレートムターセ、ピルビン酸キナーゼ、トリオセホスフエ ートイソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーセ及びグルコキナーゼなどの他 の解糖系酵素［ヘス（Ｂｅｓｓ）らのＪ、＾ｄｖ、　Ｅｎｚｙｍｅ　Ｒｅｇ、　 ７：１４９（１９６ｇ）　：ホーランド（）ＩＯｌｌａｎｄ）らのＢｉｏｃｈｅ ｍｉｓｔｒｙ　１７．４９００（１９７８）］のプロモーターがある。適当な発 現プラスミドを構築するに当たっては、これらの遺伝子に付随する終止配列も、 発現させようとする配列の３′側で発現ベクターに連結させ、ｍＲＮＡのポリア デニル化及び終止機能を付与する。発育条件によって転写が制御されるという付 加的な利点を有している他のプロモーターには、アルコール脱水素酵素２、イソ チトクロームＣ１酸ホスフアターゼ、窒素代謝に関与する分解酵素、及び上記の グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素及びマルトースとガラクトースの利 用に関与する酵素、にががるプロモーター領域がある。酵母に適合するプロモー ター、複製起点及び終止配列を含有するプラスミドベクターが好適でことができ る。を椎動物又は無を椎動物培養のいずれの由来であっても許容できるが、を椎 動物細胞培養、特に哺乳動物培養が好ましい。適当なセルラインとしては例えば 、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎Ｃｖ１ライン［ＣＯＳ　−７、ＡＴＣ ＣＣＩ？Ｌ　１６５１］　；ヒト腎肝ライン２９３　Ｓ　ＥＧｒａｈａｍら、　 Ｊ、ＧｅｎＪｉｒｏｌ、、３６：５９（１９７７）コ、幼若ハムスター腎細胞［ ＢＨＫ、　ＡＴＣＣＣＣＬ　１０］　；チャイニーズハムスター卵巣細胞［Ｕｒ ｌａｂ　ａｎｄ　Ｃｈａｓｉｎ、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　 、　Ｕ、　Ｓ、　Ａ、　７７：４２１６（１９W０）］　：マウ ス・スルトリ細胞（ｍｏｕｓｅ　５ｅｒｔｏｌｉ）［ＴＭ４．　Ｍａｔｈｅｒ、 　Ｂｉｏｌ、Ｒｅｐｒｏｄ、、２３：２４３（１９８０）］　；サル腎細胞［Ｃ ＶＩ−７６、ＡＴＣＣＣＣＬ　７０１　；アフリカミドリザル腎細胞［ＶＥＲＯ −７６、ＡＴＣＣＣＲＬ　１５８７コ、ヒト子宮癌細胞［ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣＣ ＣＬ　２コ、イヌ腎細胞ＥＭＤ　ＣＫ、　ＡＴＣＣＣＣＬ　３４Ｅ　；バッファ ロー・ラット肝細胞［ＢＲＬ　３Ａ、　ＡＴＣＣＣＲＬ　１４４２］　；ヒト肺 細胞［Ｗ　１３８　、　ＡＴＣＣＣＣＬ　７５］　：ヒト肝細胞［Ｈｅｐ　Ｇ２ ゜［ＩＢ　８０６５］　；マウス哺乳動物腫瘍細胞［ＭＭＴ　０６０５６２．　 ＡＴＣＣＣＣＬ　５１］　；ラット肝癌細胞［ＨＴｃ、Ｍｌ、５４．　ボウ？　 ン（Ｂａｕｍａｎｎ）らのＪ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉａｓ、、　、　８５：１（１９ ８０）］　：及びＴＲＩ細胞［ＭａｔｈｅｒらのＡｎｎａｌｓ　Ｎ、　Ｙ、　Ａ ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　、　３８３：４４（１９８２）］力導げられる。

これらの細胞のための発現ベクターは普通、（要すれば）複製起点、発現すべき 遺伝子の前に位置するプロモーター、リポソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部 位、ポリアデニル化部位、及び転写ターミネータ一部位のＤＮＡ配列を含有し７ ている。

哺乳動物発現ベクターに使用されるプロモーターは、ウィルス起源のものが多い 。これらウィルスプロモーターはポリオーマウィルス、アデノウィルス２、及び 最も頻繁にはアカゲザルウイルス４０（ＳＶ４０）から誘導される。ＳＶ４０ウ ィルスは初期及び後期プロモーターと呼ばれる２つのプロモーターを含有する。

これらのプロモーターは共にウィルスの複製起点をも含有する１つのＤＮＡ断片 として該ウィルスから容易に入手されるので、特に有用である［フィールズ（Ｆ ｉｅｒＳ）らのＮａｔｕｒｅ、γυ１１３（１９７ｇ）］。また、このウィルス の複製起点内に位置するＨｉｎｄｍ部位からＢｇｌｒ部位に伸長する約２５０ｂ ｐ配列を含有する限りは、それよりも小さい、又は大きなＳＶ４０　ＤＮＡ断片 を使用することもできる。

さらに、形質転換のために選択する宿主セルラインと適合する限りは、外来遺伝 子に天然で伴われているプロモーター（同種プロモーター）を使用することがで きる。

複製起点は、ＳＶ４０又は他のウィルス（例えば、ポリオーマ、アデノ、ＶＳＶ 、ＢＰＶ）などの外因性供給源から入手することができ、それをクローニングベ クターに挿入すればよい。あるいは、複製起点は宿主細胞の染色体における複製 メカニズムによって付与することができる。外来遺伝子を含有するベクターが宿 主細胞の染色体に組み込まれるなら、後者で十分である場合が多い。

ヒトｔ−ＰＡは形質転換された細胞培養によって満足のいく量で生産される。し かし、第２のコード化配列を使用すれば、さらに生産レベルを同上させることが できる。この第２のコード化配列は通常、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）を 含有している。野生型のＤＨＦＲは正常では化学物質メトトレキサート（ＭＴＸ ）によって阻害される。細胞内のＤＨＦＲ発現レベルは、培養する宿主細胞にＭ ＴＸのある量を加えることで変動する。ＤＨＦＲを東２の配列として特に有用と するさらなる性質は、それが形質転換細胞を同定するための選択マーカーとして 使用できることである。

ＤＨＦＲを第２の配列として使用するには、野生型ＤＨＦＲ及びＭＴＸ−耐性Ｄ ＨＦＲの２つの型が利用できる。個々の宿生細胞に使用するＤＨＦＲの型は、宿 生細胞がＤＨＦＲ欠損であるか否か（例えば、非常に低いレベルでＤＨＦＲを内 生的に産生ずるか、又は機能的ＤＨＦＲを全く産生じないか）によって決定され る。ウルローブ及びチャシン（Ｕｒｌａｕｂ及びＣｈａｓｉｎ）の［Ｐｒｏｃ、 　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　、　Ｕ、　ＳＡ、　７７：４２１６（１ ９８０）］に記載されているＣＨ○セルラインなどのＤＨＦＲＨＦ上ルラインを 野生型ＤＨＦＲコード化配列で形質転換する。形質転換された後では、これらの ＤＨＦＲＨＦ上ルラインは機能的なりＨＦＲを発現し、ヒポキサンチン、グ＋７ ノン及びチミンン栄養素を欠く培養培地中で増殖することができる。形質転換さ れていない細胞はこの培地中では生存しない。

ＭＴＸ耐性型のＤＨＦＲは、ＭＴＸ感受性の機能的ＤＨＦＲの正常量を内生的に 産生ずる宿主細胞中にある形質転換宿主細胞を選択する手段として使用てきる。

ＣＨ○〜Ｋ　１　（ＡＴＣＣＮｏ、　ＣＣＬ　６１）はこの特性を有しており、 従ってこの目的にとって有用なセルラインである。細胞培養培地にＭＴＸを添加 すれば、ＭＴＸ耐性ＤＨＰＲをコードするＤＮＡで形質転換された細胞のみを発 育させることができる。

形質転換されていない細胞はこの培地中で生存することはできない。

４　ａ後玉 細胞から普通分泌される多くの真核生物タンパク質は、そのアミノ酸配列の一部 として内生のシグナル配列を含有している。この配列は小胞体及びゴルノ装置を 介して細胞からタンパク質を輸出させる。このシグナル配列は通常タンパク質の アミノ末端に位置しており、約１３から約３６のアミノ成長の範囲にある。実際 の配Ｊｌｊはタンパク質層に異なっているが、既知のすべての真核生物シグナル 配列は、そのシグナル配列の中心付近に高い疎水性強度の１０−１５アミノ酸（ 通常はロイシン、イソロイシン、アラニン、バリン及びフェニルアラニンに豊富 である）及び少なくとも１つの正に帯電した残基を含有している。このシグナル 配列は、タンパク質が小胞体に移動する際に小胞体上に存在するシグナルペプチ ダーゼによって開裂されるので、分泌形態のタンパク質からは除去されているの が正常である。そのシグナル配列が依然として結合しているタンパク質は、「プ レタンパク質」又はタンパク質の非成熟型と呼ばれることが多い。

しかし、分泌されるタンパク質のすべてが、開裂されるアミン末端シグナル配列 を含有しているわけでない。オバルブミンなどのある種のタンパク質は、タンパ ク質の内部領域に位置するシグナル配列を含有している。この配列は移動時に正 常では開裂されない。

細胞質中に通常見いだされるタンパク質は、そのタンパク質にシグナル配列を連 結させることにより分泌させることができる。これは、シグナル配列をコードす るＤＮＡを、タンパク質をコードするＤＮＡの５°末端に連結し、次いでこの融 合タンパク質を適当な宿主細胞において発現させることにより、容易に実施する ことができる。シグナル配列をコードするＤＮＡは、シグナル配列を有するタン パク質をコードする遺伝子から制限断片として入手できる。従って、本発明を実 施するために利用する宿主細胞の型に応じて、原核生物、酵母、及び真核生物シ グナル配列を本発明では使用できる。遺伝子のシグナル配列部分をコードするＤ ＮＡは適当な制限エンドヌクレアーゼを使用して切除され、次いでそれを分泌さ せようとするタンパク質、即ちｔ−ＰＡをコードするＤＮＡに連結する。

機能的なシグナル配列の選択には、／グナル配列が宿主細胞シグナルペプチダー ゼによって認識される結果、シグナル配列の開裂及びタンパク質の分泌が起こる ことが要件となる。幾つかの真核生物遺伝子のシグナル配列部分をコードするＤ ＮＡ及びアミノ酸配列は既知であり［例えば、ヒト成長因子、プロインスリン、 及びプロアルブミン（ＳｔｒｙｅｒのＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　ｆ、Ｈ，Ｆ ｒｅｅｍａｎ　ａｎｄ　Ｃｏｍｐａｎｙ、　ニューヨーク（１９８８）、　７６ ９頁を参照）コ、これらは適当な真核生物宿主細胞においてシグナル配列として 使用することができる。例えば、酸ホスファターゼ［ＡｒｉｍａらのＮｕｃ。

ターゼなどの酵母シグナル配列は、酵母宿主細胞から分泌させるために使用でき る。例えば、ＬａｍＢ又はＯｍｐＦ　［ｌｏｎｇらのＧｅｎｅ　６８：１９３１ ９８８コ、ＭａｌＥ、ＰｈｏＡ。

又はβ−ラクタマーゼをコードする遺伝子、並びに他の遺伝子由来の原核生物シ グナル配列は、原核生物細胞から培養培地にタンパク質を向かわせるのに使用で きる。

目的のタンパク質が分泌できるようにするためにそれにソゲナル配列を付与する 別の手法は、シグナル配列をコードするＤＮＡを化学的に合成することである。

この方法では、選択したシグナル配列をコードするオリゴヌクレオチドの両鏡を 化学的に合成し、次いで互いにアニーリングさせて二重ラセンを形成させる。次 に、得られた２本鎖オリゴヌクレオチドを、タンパク質をコードするＤＮＡの５ ゛末端に連結させる。

次いで、タンパク質をそれに連結されたシグナル配列と共にコードしているＤＮ Ａを含有する構築物を適当な発現ベクターに連結すればよい。この発現ベクター を適当な宿主細胞に形質転換し、目的のタンパク質を発現させ、分泌させる。

Ｄ　形質転換方法 哺乳動物宿主細胞及び頑強な細胞膜障壁を有していない他の宿主細胞の培養物は 、グラハム（Ｇｒａｈａｍ）及びフォノ・デル（Ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ）［Ｖｉ ｒｏｌｏｇＹ　５２．５４６（１９７ｇ）コに最初に開示され、サムプルツクら （前掲）の１６．３２−１６．３７項にて改変を施されたリン酸カルシウム法に よって普通は形質転換される。しかし、ポリブチン（Ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ）［Ｋ ａｗａｉ及びＮ１５ｈｉｚａｖａ、　Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　、　 ４：１１７２（１９８４）n、プロト プラスト融合［５ｃｈａｆｆｎｅｒ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　 Ｓｃｉ、　、　Ｕ、　Ｓ、　Ａ、　７７：２１６３（１９８O）］、エニレ に導入するための他の方法も使用できる。

酵母宿主細胞は、ハイ不ン（Ｈｉｎｎｅｎ）のＰｒｏｃ、　Ｎａｔｌ＾ｃａｄ、 　Ｓｃｉ、　、　Ｕ、　Ｓ、　Ａ、　、　７５　：１９２９|１ ９３３（１９７８）によって教示されているように、ポリエチレングリコール法 によって形質転換するのが一般的である。

原核生物細胞又は頑強な細胞壁を有する細胞を形質転換するには、サムプルツク ら（前掲）の１．８２項に記載されている塩化カルシウム法によって行うのが好 ましい。また、これらの細胞を形質転換するにはエレクトロポレーションも使用 複製配列、調節配列、表現型選択遺伝子をコードするＤＮＡ及び目的の外来ＤＮ Ａを含有する適当なベクターの構築には、標準的な組換えＤＮＡ手法を使用する 。単離したプラスミド及びＤＮＡ断片を開裂し、仕立て、そして特定の順序で互 いに連結し、所望のベクターを生成させる。

ＤＮＡの開裂は、適当な緩衝液中にて適当な制限酵素又は酵素群を使用して行う 。一般には、緩衝溶液約２０μβ中、適当な制限酵素約１−２単位と共に、プラ スミド又はＤＮＡ断片約０．２−１μｇを使用する（適当な緩衝液、ＤＮＡ濃度 、及びインキュベート時間及び温度は、その制限酵素の製造元によって特定され ている）。一般には、３７℃での約１又は２時間のインキュベート時間が適当で あるが、酵素の中にはそれよりも高い温度が必要であるものがある。インキュベ ートした後に、フェノール及びクロロホルムの混液で消化溶液を抽出することに よって酵素及び他の夾雑物を除去し、次いでエタノール沈殿によってその水性画 分からＤＮＡを回収する。

ＤＮＡ断片を共に連結して機能的ベクターを形成させるためには、それらＤＮＡ 断片の末端は互いに適合していなければならない。ある場合には、エンドヌクレ アーゼ消化後に末端は直接適合になる。しかし、エンドヌクレアーゼ消化によっ て普通に生成される粘着末端を連結適合性にするために、それをまず平滑末端に 変換する必要のある場合がある。平滑末端にするためには、４つのデオキシヌク レオチド三リン酸の存在下、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片（クレノー） １０単位と共に少なくとも１５分間、１５℃において適当な緩衝液中で得られた ＤＮＡを処理する。次いで、それをフェノール−クロロホルム抽出し、エタノー ル沈殿して精製する。

開裂させたＤＮ、Ａ断片は、ＤＮＡゲル電気泳動によってサイズ分離し、選択す ることができる。ＤＮＡはアガロース又はポリアクリルアミドマトリックスのい ずれかによって電気泳動できる。マトリックスの選択は、分離しようとするＤＮ Ａ断片のサイズ（大きさ）に左右される。電気泳動じた後に、電気溶離（ｅｌｅ ｃｔｒｏｅｌｕｔｉｏｎ）によってＤＮＡをマトリックスから抽出するか、ある いは低融解アガロースをマトリックスとして使用した場合は、サムプルツクら（ 前掲）の６．　３０−６３３項に記載されているようにしてアガロースを融解し 、それからＤＮＡを抽出する。

互いに連結させようとするＤＮＡ断片（適当な制限酵素で消化しておき、それぞ れの断片の連結末端を適合させておく）は、等モル量で溶液中に存在させる。

この溶液はＡＴＰ、リガーゼ緩衝液及びリガーゼ、例えばＤＮＡ０．５μｇ当た りＴ　４　Ｄ　Ｎ　Ａリガーゼ約１０単位をさらに含有している。ＤＮＡ断片を ベクターに連結する場合は、適当な制限エンドヌクレアーゼ（群）によってベク ターを切断してまず線状化し、次いで細菌アルカリホスファターゼ又は子牛腸内 アルカリホスファターゼのいずれかでリン酸化する。この操作によって、開裂し たベクターが連結工程の際に自己連結するのを防止できる。

連結した後に、新たに外来遺伝子が挿入されたベクターを適当な宿主細胞、最も 普通にはＥ、ｃｏｌｉ　Ｋ　１２株２９４　（ＡＴＣＣ番号３１．４４６）又は 別の適当なＥ、ｃｏｌｉ株などの原核生物に形質転換する。形質転換された細胞 は、抗生物質、普通はテトラサイクリン（ｔｅＯ又はアンピンリン（ａｍｐ）と 増殖させることにより、ベクター内のｔｅｔ及び／又はａｍｐ耐性遺伝子のおか げでそれらに対して耐性になっているものが選択される。連結混合物によって真 核生物宿生細胞を形質転換した場合は、形質転換細胞は上述のＤＨＦＲ／ＭＴＸ 系によって選択できる。形質転換細胞は培養物中で増殖さ也次いでプラスミドＤ ＮＡ（プラスミドは、目的の外来遺伝子に連結されたベクターを意味する）を単 離する。このプラスミドＤＮＡは次に、制限マツピング及び／又はＤＮＡ配列決 定によって分析する。ＤＮＡの配列決定は、メッノング（ｌｉｅｓｓｉｎｇ）ら のＮｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、９：３０９（１９８１）の方法又は マキサム（Ｍａｘａｍ）らのＭｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、　 ６．５：４９９（１９８０）の方法のいずれかによって分析される。

哺乳動物宿主細胞をＤＮＡで安定に形質転換した後、その宿主細胞培養をＭＴＸ 約２００−５００ｎＭ濃度の存在下で増殖させ、それによりＤＨＦＲタンパク質 をコードしている配列の増幅を行う。ＭＴＸの有効な濃度範囲は、ＤＨＦＲ遺伝 子及びタンパク質の本質、及び宿主の特性に非常に左右される。一般に規定され る上限及び下限は明瞭には確認することができない。他の葉酸同族体又はＤＨＦ Ｒを阻害する他の化合物も適当な濃度で使用することができる。しかし、ＭＴＸ が簡便であり、容易に利用てき、かつ有効である。

上述のように、ｔ−ＰＡ変異体は、部位特異的突然変異の方法を使用して生成さ れる突然変異誘発の手段によって製造するのが好ましい。この方法では、所望の 突然変異の配列をコートする特定のオリゴヌクレオチド及び、そのオリゴヌクレ オチドがＤＮＡの鋳型と安定にハイブリダイズできるほどに十分な数の隣接ヌク レオチド、を合成し、使用することが必要である。

Ｆ　医薬組成物 本発明のｔ−ＰＡ産物を医薬的に許容され得る担体との混合物中で混合すること により、本発明の化合物は医薬的に有用な組成物を調製するための既知の方法に よって製剤化することができる。適当な担体及び製剤化法は、オスロー（Ｏｓｌ ｏ）ら編のＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’　ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　５ｃｉ ｅｎｃｅｓ　１６版、１９８０［フック０パブリツンングＣｏ、　］に記載され ている。このような組成物は通常、患者に効果的に投与するのに適した医薬的に 許容され得る組成物が調製されるように適量のビヒクルと共に、本発明のｔ−Ｐ Ａ変異体を有効量で、例えば約０，５から約５ｘｇｈｌで含有している。本発明 のｔ−ＰＡ変異体は、心臓血管の疾患又は症状の患者に非経口的に、又はその有 効な型が血流に供給されるような他の方法によって投与することができる。

本発明を実施する上て使用されるｔ−ＰＡ変異体を臨床投与するのに特に適して いる組成物には、例えば滅菌水溶液剤、又は凍結乾燥タンパク質などの滅菌永和 性の粉末剤などがある。このような製剤中にはさらに、医薬的に許容され得る塩 を適量使用し、製剤の等張性を変化させるのが通常である。アルギニン塩基など の緩衝剤も、適当なｐＨ，一般にはｐＨ５，５−７，５を維持するに適当な濃度 でリン酸と共に含有させるのが通常である。さらに、貯蔵寿命を維持、長引かせ るために、グリセリンなどの化合物も含有させることができる。

本発明の医薬組成物の投与量及び望ましい薬物濃度は、目的とする個々の用途に 応じて変化し得る。例えば、深部静脈血栓又は末梢血管疾患の処置に当たっては 、約０．０５から約０．２ｍｇ／ｋｇオーダーの「ポーラス」投与が通常好まし く、その後は、血中レベルがほぼ一定に、好ましくは約３μｇ／ｆｆｉ　ｆのオ ーダーが維持されるよう約０．　１から約０．２ｍｇ／ｋｇの投与を行うのが好 ましい。

しかし、一般に潅流（ｉｎｆｕｓｉｏｎ）が行えない場面である緊急医療に関連 して使用するためには、及び処置する疾患が一般に危険性を孕む場合（塞栓症、 心筋梗塞）には、多めの初期投与量、例えば約Ｑ　、３　ｍ　ｇ　／ｋｇオーダ ーの静脈内ホーラス投与が通常望ましい。

例えば、本発明のｔ−ＰＡ変異体は、心臓血管の疾患又は症状に罹患した也者に 非経口的に投与するのが適切である。投与量及び投与速度は、他の心臓血管薬、 血栓溶解薬が臨床試験で通常使用されているものと同等又は高い場合があり、例 えば心筋梗塞、肺塞栓症などに罹患したヒト患者では、約１−２ｍｇ／ｋｇ体重 で１．５−１２時間かけて静脈内又は動脈内投与を行えばよい。

適当な投与剤形の１例として、５０＋ｇ　ｔ−ＰＡ、アルギニン、リン酸、及び ポリソルベート８０を含有するバイアルを滅菌水５０諺ｌにより注射用に再構成 し、それを適量の０９％塩化ナトリウム注射液と混合することが挙げられる。

本発明のｔ−ＰＡ変異体はフィブリン沈着又は接着の形成もしくは再形成を防止 するためにも有用である。この用途の１態様は、１９８９年１月４日公開のＥＰ Ｏ２９７゜８６０に記載されている。一般には、このような処置のタイプは、可 能性あるフィブリン又は接着形成の部位に治療学的有効量のｔ−ＰＡ変異体がお よそ３日から２週間にわたって持続的に放出されるような難溶性の形態で含有さ れる組成物をその部位に局所投与することを包含する。ｔ−ＰＡ変異体は通常、 手術、感染、外傷又は炎症後に形成される接着又はフィブリン沈着を予防するに 充分な投与量で投与する。その量は普通、０．０２ｍｇ／ｇのゲルから２５ｍｇ ／ｇのゲルであり、０．２０＋ｇ／ｇから約２５冨ｇ／ｇのゲルが好ましく、最 も好ましくは０２５ｍｇ／ｇから約１．０ｍｇ／ｇのゲルである。

接着形成及び／又はフィブリン沈着を防止するために使用する各ｔ−ＰＡ変異体 は、可能性ある接着形成の部位にｔ−ＰＡ酵素を配置させるための半固形の粘液 質の製薬的に不活性な担体中で製剤化するのが普通である。このような担体には 、長鎖の炭化水素又は植物油及び、飽和及び不飽和脂肪酸グリセリドの混合物又 は修飾された飽和及び不飽和脂肪酸グリセリドの混合物から構成されるワックス などがある。例えば、ワセリン又は半合成グリセリドなどの半固形ビヒクル、グ リセリンなどのポリヒドロキシ溶媒、長鎖炭化水素、生体侵食性ポリマー（ｂｉ ｏｅｒｏｄａｂｌｅ　ｐｏｌｙｍｅｒｓ）、又はリポソームなどが挙げられる。

本発明のｔ−ＰＡ変異体の減少されたクリアランス速度は、迅速な静脈内注射、 例えば特にポーラス投与に適するように改変できる。これは、ｔ−ＰＡの投与方 法を単純にし、それにより例えば診療補助者が看護する救急車などの、医療設備 が限定されている状況下においてｔ−ＰＡが使用できるようになる。さらに、こ れらｔ−ＰＡ変異体のクリアランス速度が延長されることにより、急性血栓溶解 後の再閉塞を回避するために必須となる場合のある低量初期投与量が投与できる ようになり、及び／又は低量延長療法が可能となり、又は末梢血管閉塞の場合に 必須となる場合のある血栓溶解の延長を行うことができる。

以下に記載する実施例を平易にするため、普通に使用している特定の方法を以下 に説明する。

「プラスミド」は、小文字のｐの後ろにアルファベットの名称を付して表してい る。本発明における出発プラスミドは市販されているか、制限部（公に入手可能 となっており、又はそのような入手可能なプラスミドから文献開示の方法によっ て構築することができる。さらに、他の同等のプラスミドも当業界既知であり、 当業者には明らかである。

ＤＮＡの「消化」、「切断」又は「開裂」とは、ＤＮＡ内のある特定の場所での み働く酵素によってそのＤＮＡを触媒的に開裂することを意味する。このような 酵素は制限エンドヌクレアーゼと呼ばれ、ＤＮＡ配列に沿った各酵素が開裂する 部位は制限部位と呼ばれる。本明細書で使用している制限酵素は市販されており 、その供給元から提示されている教示に従って使用した。制限酵素は、大文字の 後ろに各制限酵素が得られる微生物を表す２又は３つの小文字を付して命名され る。これらの文字は、次に個々の酵素を示す１又はそれ以上のローマ数字を後続 する。一般に、プラスミド又はＤＮＡ断片約１μｇを緩衝溶液約２０μβ中、酵 素約２単位と共に使用する。個々の制限酵素にとって適当な緩衝液、基質濃度、 インキュベート温度、及びインキュベート時間は製造会社によって特定されてい る。インキュベートした後、フェノール−クロロホルム溶液による抽出によって ＤＮＡから酵素及び他の夾雑物を除去し、エタノール沈殿によって、消化された ＤＮＡを水性画分から回収する。制限酵素による消化の後には、細菌アルカリホ スファターゼ又は子牛腸内アルカリホスファターゼで処理する。これは、別のＤ ＮＡ断片が制限部位に挿入するのを妨げかねない「環化」又は閉じたループの形 成からＤＮＡ断片の２つの制限開裂末端を護るためのものである。しかし、特に 明記しない限りは、プラスミドの消化後には５′末端の脱リン酸化は行わない。

脱リン酸化のためのこれらの操作法及び試薬はサムプルツクら（前掲）の１６０ ＝１６１項及び３．３８−３．３９項に記載されている。

特定のＤＮＡ断片を制限消化物から「回収」または「単離」するとは、ポリアク リルアミド又はアガロースゲルを使用して電気泳動法により、得られたＤＮＡ断 片を分離し、目的とする断片を既知の分子量のマーカーＤＮＡ断片の移動度と比 較してその同定を行い、所望の断片を含有するゲル切片を取り出し、そしてＤＮ Ａからゲルを分離することを意味する。この操作法は一般に既知である。例え「 サザーン分析」とは、既知の標識化オリゴヌクレオチド又はＤＮＡ断片とハイブ リダイズすることにより、消化物またはＤＮＡ含有組成物中のＤＮＡ配列の存在 を確かめる方法である。サザーン分析とは、アガロースゲル上にて消化ＤＮＡを 分離し、そのＤＮＡを変性させ、そしてサザーン（Ｅ、　５ｏｕｔｈｅｒｎ）の Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、９８：５０３−５１７（１９７５）に記載され、サ ムプルツクら（前掲）の９．３１−９．５７項に改変された方法により、そのゲ ル由来のＤＮＡをニトロセルロース又はナイロン膜に移動させることを意味する 。

「形質転換」とは、ＤＮＡが染色体外要素または染色体成分として複製できるよ うにそのＤＮＡを生物に導入することを意味する。形質転換するために使用する 方法は、宿主細胞が真核生物であるか、又は原核生物であるかによって変わる。

原核生物を形質転換する方法はサムプルツクら（前掲）の１．８２項に記載され ている塩化カルシウム法である。真核生物は、サムプルツク（前掲）らの１６． 　３２−１６．３７項に記載されているリン酸カルシウム法によって形質転換さ れる。

「連結」とは、ＡＴＰをも含有している適当な緩衝液中、リガーゼ酵素を使用し て、２つの２本鎖ＤＮＡ断片間にホスホジエステル結合を生成させる工程を意味 する。

「オリゴヌクレオチド」は、ホスホンエステル結合によって結合されているデオ キシリボヌクレオチドの短い長さの１本鎖又は２末鎖配列を意味する。このオリ ゴヌクレオチドは既知の方法によって化学的に合成され、ポリアクリルアミドゲ ル上にて精製される。

以下に、本発明を実施する上で現在知られている最も最良の方法を説明するため に実施例を挙げるが、これは本発明の限定を意図するものではない。

実施例Ｉ Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ及びＹｅｌｌｓ（前掲）に記載されているアラニン−スキ ャニング突然変異誘発（ＡＬＡ−スキャン）として知られている方法を使用し、 本発明のｔ−ＰＡ変異体を構築した。この方法は、帯電したアミノ酸側鎖を含有 するｔ−ＦＡ分子の小さな領域を同定することを包含する。１つの理論にとられ れないが、電荷のクラスターを含有するこれらの領域、又はその隣接隣接、又は その両者のいずれがはｔ−ＰＡ分子とその基質及びその活性を調整できる他の種 々の化合物との相互作用に関与していると考えられる。各領域における帯電アミ ノ酸の幾つか（即ち、Ａｒｇ、　ＡｓｐＳＨｉｓ、　Ｌｅｕ及びＧ　ｌｕ）をア ラニンと置換し、ｔ−ＰＡ分子のクリアランス速度全体に対するその特定領域の 重要性を評価した。

した。ｐＲＫ７は、Ｃ１ａｌ及びＨｉｎｄｌＩＩ間のポリリンカー領域内のエン ドヌクレアーゼ制限部位の順序が逆である以外はｐ　ＲＫ　５　（１９８９年３ 月１５日公開のＥＰ公開番号第３０７．２４７号）と同一である。このベクター に挿入するためのｔ−ＰＡ　ｃＤＮＡ［ペニカ（Ｐｅｎｎｉｃａ）らのＮａｔｕ ｒｅ　３０１：２］４（１９８３）］を、制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄｍ（ ＡＴＧ開始コドンの５′側４９６塩基対を切断する）及び制限エンドヌクレアー ゼＢａ１ｌ（ＴＧＡ終止コドンの下流２７６塩基対を切断する）で切断すること により調製した。このｃＤＮＡを、サムプルツク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら（前掲 ）の１６８−１．６９項に記載されている標準的な連結法を使用し、Ｈｉｎｄｍ 及び５ＩＩｌａＩで前もって切断しておいたｐＲＫ７に連結した。得られた構築 物をｐＲＫ、ｔ−ＰＡとアメルシャン・コーポレーション（Ａｍｅｒｓｈａｍ　 Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）から入手されるキット（カタログ番号ＲＰＮ　１２５ ３）を使用し、ティラー（Ｔａｙｌｏｒ）らのＮｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、 　、　１３：８７６５（１９８５）の方法によってｔ−ＰＡ　ｃＤＮＡの部位特 異的突然変異を行った。所望の突然変異を生成させるため、所望のアミノ酸置換 をコードする配列を有するオリゴヌクレオチドを合成し、それをプライマーとし て使用した。このオリゴヌクレオチドを、標準的な手法［ＶｉｅｒａらのＭｅｔ ｈ、　Ｅｎｚ、　、シ柊：３（１９８７）：ｌにより調製した１末鎖ｐＲＫ７− ｔ−ＰＡとアニーリングさせた。

デオキシリボアデノシン（ｃｌＡＴＰ）、デオキシリボグアノンン（ｄＧＴＰ） 、及びデオキシリボチミジン（ｄＴＴＰ）の３つのデオキシリボヌクレオチドの 混合物を、上記キットの製造元から供されているそのキット中のｄＣＴＰ（ａＳ ）と呼ばれる改変チオーデオキシリポシトンンと混合し、それをオリゴヌクレオ チドとアニーリングさせた１末鎖ｐＲＫ７−ｔ−ＰＡに加えた。

この混合物にＤＮＡポリメラーゼを加えると、突然変異した塩基以外はｐＲＫ７ −ｔ−ＰＡと同一のＤＮＡの鎖が生成した。さらに、この新たなりＮＡの鎖はｄ ＣＴＰの代わりに、それが制限エンドヌクレアーゼ消化されることから保護する のに役立つｄＣＴＰ（ａＳ）を含有していた。得られた２本鎖へテロ二重鎖の鋳 型の鎖に適当な制限酵素により切れ目にツク）を作成した後、その鋳型の鎖を、 突然変異オリゴマーを含有している領域を通過するようＥｘａｍヌクレアーゼに よって消化した。次いで、この反応を停止させ、部分的にしか１本鎖でない分子 を残した。次に、４つすべてのチオキンリボヌクレオチド３リン酸、ＡＴＰ、及 びＤＮＡリガーゼの存在下にＤＮＡポリメラーゼにより、完全な２本鎖ＤＮＡの へテロ二重鎖分子を形成させた。

以下の表Ａに挙げているオリゴヌクレオチドを合成し、上記のＡＬＡ−スキャン 法を使用して、これも表Ａに挙げているｐＲＫ７−ｔ−ＰＡ変異体を作成するた めのプライマーとして使用した・ 本Ｄ９５Ｇ　５’　ＧＡＴＧＣＣＣＴＧＧＣＣＣＴＣＧＴＡＧＣＡＣＧＴ　３’ 木Ｅ９４＾、Ｄ９５Ａ　５’　ＧＡＴＧＣＣＣＴＧＧＧＣＣＧＣＧＴＡＧＣＡＣ ＧＴ　３“本Ｄ２３６Ａ、Ｄ２３８Ａ、に２４０＾　５°　ＧＧＣＡＣＣＡＧＧ ＧＣＧＣＧＧＣＡＧＣＣＣＣＡＧＣＡＧＧＡＴＴＣＣＧ　３’７１．０３Ｎ　５ “　ＴＧＴＧＣＴＣＣＡＡＴＴＧＣＣＣＣＴＧＴＡＧＣＴ　３’Ｎ１１７Ｑ　５ ”　ＣＡＡＣＧＣＧＣＴＧＣＴＴ丁ＧＣＣＡＧＴＴＧＧＴ　３’星印は、本発明 を例示する変異体を示している。変異体、Ｅ９４Ａ、Ｄ９５Ａ及びＤ２３６Ａ、 Ｄ２３８Ａ、、に２４ＯＡは１つ以上のアミノ酸置換を含有しているので、実際 上、多重突然変異体であるが、それらはただ１つのオリゴヌクレオチドを使用し て生成させた。これは、置換アミノ酸がそれぞれポリペプチド鎖上で近接して位 置しているので可能であった。

上記の産生体を若干改変させ、本発明を例示する多重突然変異体をさらに製造し た。以下に説明するこれらの突然変異体では、鋳型ＤＮＡは野生型ｔ−ＰＡ（ｐ ＲＫ、ｔ−ＰＡ）ではない。その代わりに使用した鋳型は、少なくとも単一突然 変異を含有するもの、即ち上記の単一突然変異体を構築するうえで産生されるＤ ＮＡてあった。鋳型として使用するＤＮＡ、及び各多重突然変異体にさらに作成 される突然変異を生成させるために使用するオリゴヌクレオチドを以下の表Ｂに 列記する。各オリゴヌクレオチドのＤＮＡ配列は上記の表Ａに示したものである ・＊Ｅ９４Ａ、　Ｄ９５Ａ、　Ｔ１０３Ｎ　Ｅ９４Ａ、　Ｄ９５Ａ　Ｔ１０３Ｎ ＊Ｅ９４Ａ、　Ｄ９５Ａ、　Ｎ１１７Ｑ　Ｅ９４Ａ、　Ｄ９５Ａ　Ｎ１１７Ｑ本 Ｅ９４人、Ｄ９５Ａ、Ｄ２３６Ａ、　Ｄ２３８＾、に２４０Ａ　Ｄ２３６Ａ、Ｄ ２３８Ａ、に２４０Ａ　Ｅ９４Ａ、Ｅ９５ＡＴ１０３Ｎ、　Ｎ１１７Ｑ　Ｔ１０ ３Ｎ　Ｎ１１７Ｑ零Ｔ１０３Ｎ、Ｄ２３６Ａ、Ｄ２３８Ａ、に２４０Ａ　Ｔ１０ ３Ｎ　Ｄ２３６Ａ、Ｄ２３８Ａ、に２４０Ａ零Ｎ１１７Ｑ、Ｄ２３６Ａ、Ｄ２３ ８Ａ、に２４０Ａ　Ｎ１１７Ｑ　Ｄ２３６Ａ、Ｄ２３８Ａ、に２４０＾星印は、 本発明を例示する変異体を示している。

■　細菌形質転換及びＤＮＡ調製 コンビ−テントな細胞をｖＲ製し、形質転換するための標準的なＣａＣｌ２法［ ５ａＩＩｌｂｒｏｏｋら（前掲）の１７６〜１８４項］を使用し、上記のプロト コールを使用して作成した突然変異ｔ−ＰＡ構築物をＥ、ｃｏｌｉ宿主株ＭＭ　 ２９４　ｔｏｎＡに導入した。

Ｔｎｌｏｌ−ランスポゾンをｔｏｎＡ遺伝子に挿入した後、不正確に切除するこ とにより、Ｅ、ｃｏｌｉ株ＭＭ　２９４　ｔｏｎＡ　（これはＴ１ファーンに耐 性である）を調製した。

次いで、この遺伝子をトランスポゾン挿入突然変異［ＫｌｅｃｋｎｅｒらのＪ、 　１ｉｏ１．　Ｂｉｏｌ、　、　１耳１２５−１５９（１９７７）コを使用し、 Ｅ、ｃｏｌｉ宿主ＭＭ２９４（＾ＴＴＣＮｏ、　３１．４４６）に挿入した。

Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前掲）の１．２５−１．３１項に記載されている標準的な ミニプレブ法を使用し、細菌形質転換体のコロニーそれぞれからＤＮＡを抽出し た。得られたプラスミドをセファクリルＣＬ６Ｂスピンカラムに通してさらに精 製し、次いでＤＮＡ配列決定並びに制限エンドヌクレアーゼ消化及びアガロース ケル電気泳動によって分析した。

■、真核生物細胞の形質転換 ヒト腎肝２９３細胞を６ウエル平板にて７０％全面成長まで増殖させた。ｔ−Ｐ Ａ突然変異体をコードするプラスミド２５μｇを１ｍＭ　トリス−ＨＣＬ　０． １ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．２２７Ｍ　ＣａＣ／２（１５０μｆ）中に溶解した。こ れに、５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７，３５）、２８０ｍＭ　ＮａＣＬ　 １．５ｍＭ　ＮａＰＯ４（１５０μＩ）を加え（旋回下に滴加）、２５℃で１０ 分間沈殿物を形成せしめた。次いで、得られた懸濁沈殿物を６ウエル平板の各ウ ェル中の細胞に加え、インキュベーター中に４時間放置した。次いで、培地を吸 引除去し、ＰＢＳ（リン酸緩衝化食塩水）中２０％のグリセリン１ｍｌを加えた 。細胞をまず血清不含培地３ｍｌで、次いで同培地１４ｆで洗浄することで２回 洗浄した。次に、新たな培地３ｍｌを加え、細胞を５日間インキュベートした。

次いで、培地を採取し、検定した。

１末鎖ｔ−ＰＡが必要な場合の操作は、細胞の増殖期にプラスミノーゲン枯渇血 清を使用する以外は上記のように行う。

野生型ｔ−ＰＡに対して調製したポリクローナル抗体を使用し、ＥＬＩＳＡ（酵 素結合免疫吸着検定）法によって、細胞培養上清中に存在するｔ−ＰＡの濃度を 測定した。以下で説明する各検定に使用したｔ−ＰＡ量はこのＥＬＩ　ＳＡ法の 結果に基づいている。

Ｂ、Ｓ−２２８８検定 Ｓ−２２８８検定を使用し、２本鎖形態の本発明突然変異体のタンパク質分解活 性を測定した。この検定は、ｔ−ＰＡのタンパク質分解活性のための直接的な検 定法である；　ｔ−ＦＡはこの小ペプチドとパラニトロアニリド発色団との間の 結合を開裂させる。

野生型組換えｔ−ＰＡ（ｒｔ−ＰＡ）を細胞培養培地で希釈して標準曲線試料を 調製する。この標準曲線試料及びｒｔ−ＰＡ突然変異体試料をマイクロタイター 平板のウェルに加えた。この検定法を使用して２末鎖ｒｔ−ＰＡの活性を測定す るので、ヒトプラスミンとのインキ；ベーンヨン工程を操作中に包含させる。ヒ トプラスミン（ＫａｂｉＶｉｔｒｕｍ）は終濃度０．１３ＣＵ（カゼイン単位） Ｉｌｌまで加えた。試料を室温で９０分間インキュベートした。

アプロチニン［ングマ、約１４ＴＩＵ（トリプシンインヒビタ一単位）／ｍｇ］ を終濃度７２μｇ７ｔｌまで加えてプラスミン活性を阻害し、得られた試料を室 温で１５分間インキュベートした。Ｓ−２２８８の２．１６ｍＭ溶液をＯＩＭ　 トリス、０．１０６ｎ＋Ｍ　ＮａＣ１，０，０２％アジ化ナトリウム、ｐＨ８， ４を用いて１．４５ｍＭにまで希釈し、この溶液１００μｌをマイクロタイター 平板の各ウェルに加えた（各ウェルにおける最終容量は２００μｌであった）。

４０５ｎｍにおいて発色をモニターした。それぞれの標準及び試料についての吸 光度対時間の曲線勾配を測定した。標準曲線は、ｒｔ−ＰＡ標品についてのｒｔ −ＰＡ濃度の関数として、吸光度対時間の曲線勾配をプロットすることで作成し た。次いで、突然変異体の相対活性濃度を標準曲線から測定した。各突然変異体 の活性濃度をｒｔ−ＰＡ　ＥＬＩＳＡにて得られた突然変異体についての濃度で 除し、得られた比活性を、１０値と帰属される野生型ｔ−ＰＡに相対させて表し た。

Ｃ，Ｓ−２２５１検定 この検定はｔ−ＰＡ活性の間接検定法である。この検定法では、プラスミノーゲ ンをｔ−ＦＡの作用によりプラスミンに変換させるが、そのプラスミンがＳ−２ ２５１基質を開裂してバラニトロアニリド発色団を放出するものである。次いで 、この発色団の発色を経時的に測定する。

１、フィブリン刺激Ｓ−２２５１検定 Ｓ−２２８８検定について記載しているようにして標準曲線試料を調製した。

その試料をプラスミン−セファロースと共にインキュベートすることにより、試 料を２本鎖に変換した。プラスミン−セファロースは、ヒトプラスミン（Ｋａｂ ｉＶｉｔｒｕｍ）約２０．８ＣＵを臭化シアン活性化セファロース（ファルマシ ア月１１とカップリングさせて調製した。このプラスミン−セファロース（５％ スラリー５０μｌ）を試料１５０μｌと共に室温で９０分間撹拌させながらイン キュベートした。

インキュベートの後、得られた樹脂を遠心によって除去し、試料ｌＯμｌをマイ クロタイター平板のウェルに加えた。

ヒトトロンビン（４２単位／厘ｌ溶液１０μＩ）を各ウェルに加えた。ヒトＧｌ ｕ−プラスミノーゲン（５，３μＭ）２８μ１１プラスミノーゲン不含のヒトフ ィブリノーゲン（１０μＭ）１０１１Ｌ　３ＩＩＭ　Ｓ−２２５１（ＫａｂｊＶ ｉｔｒｕｍ）３０　Ｉｌｌ、及びＰＢＳ６２μｌから構成される混合物（１３０ μｌ）を加え、各ウェル中の反応を開始させた。４０５ｎｆｆｌにおいて発色を モニターＬ／、４９２ｒ＋ｍの参考波長における吸光度を各時点の吸光度から差 し引いた。吸光度対時間の二乗の曲線勾配を標準及び突然変異体試料について測 定した。標準曲線は、ｒｔ−ＰＡ標品についてのｒｔ−ＰＡ濃度の関数として、 吸光度対時間の二乗の曲線勾配をプロットすることにより作成した。突然変異体 の相対比活性は、Ｓ−２２８８検定について記載したようにして測定した。

２　フィブリノーゲン刺激Ｓ−２２５１検定この検定は、ＰＢＳをトロンビンと 置き換える以外はフィブリン刺激Ｓ−２２５１検定について記載しているように して行った。

３、血漿凝塊Ｓ−２２５１検定 標準曲線試料の調製及び、プラスミン−セファ０−スを使用する１末鎖ｒｔ−Ｐ Ａから２末鎖ｒｔ−Ｐ　Ａへの変換をフィブリン−刺激Ｓ−２２５１検定につい て記載しているようにして行った。ヒトトロンビン（３１Ｎｇ／翼ｌ溶液１０μ ｒ）をマイクロタイター平板の各ウェルに加えた。標準及び突然変異体試料（４ ０μｌ）をその平板に加え、酸クエン酸デキストロースヒト血漿９０μ！及び９ ，１ｍＭ　５−２２５１　（ＫａｂｉＶｉｔｒｕｍ）　１０　μｌの混合物１０ ０１！を加え、反応を開始させた。４Ｑ５ｎｍにおいて発色をモニターし、４９ ２ｎｍの参考波長における吸光度を各時点の吸光度から差し引いた。得られたデ ータの分析は、フィブリン刺激Ｓ−２２５１検定について記載したようにして行 った。

上記のＢ及び０項に記載している検定の結果を以下の第１表に示すが、ここでは 星印が本発明の突然変異体を表している。残りの突然変異体は従来から開示され ていたものであり、これらは比較のために表に加えたものである。

Ｓ−２２８８検定の結果は、本発明の例示変異体が野生型ｔ−ＰＡと同等の、又 はそれ以上の活性を有していることを示している。

フィブリン刺激Ｓ−２２５１検定では、第１表に示している本発明の単一突然変 異体が野生型と同様の活性を有することが示されている。多重突然変異体である Ｅ９４Ａ、Ｄ９５Ａ、Ｎ１１７Ｑ、及びＮ１１７Ｑ、Ｄ２３６Ａ、Ｄ２３８Ａ、 に２４０Ａは野生型ｔ−ＰＡよりも実質的に活性が高い。この活性は驚くべきこ とに、単一突然変異体のいずれよりも高いことが見いだされた。

フィブリノーゲン刺激Ｓ−２２５１検定の結果から、本発明の単一突然変異体の 殆どの活性は野生型ｔ−ＰＡと同等であることが見いだされた。予期せずに、２ つの多重突然変異体、Ｅ９４Ａ、Ｄ９５Ａ、Ｎ１１７Ｑ及びＮ１１７Ｑ、Ｄ２３ ６Ａ、Ｄ２３８Ａ、に２４ＯＡは単一突然変異体よりも実質的に高いことが見い だされた。

血漿凝塊Ｓ−２２５１検定により、本発明の突然変異体の殆どが野生型ｔ−ＰＡ に匹敵する活性を有していることが見いだされた。

第１表 ３２２５１　５２２５１　５２２５］、５２２８８ｔ−Ｐ　Ａ変異体　（ｍＷｉ ｉ壇）　（フィブリンのみ）　（フィブリノーゲン）　！２野生型　１．０　１ ．０　１．０　１．０＊Ｅ９４Ａ　Ｏ，９００，７９０，７４０，７８＊Ｄ９５ Ａ　１．０７　０．８７　０．８５　０．９８＊Ｅ９４Ａ、Ｄ９５Ａ　Ｏ，９１ ０，８６０，８３０，９１７１０３Ｎ　Ｏ，６７０，８００，４７０，９３Ｎ１ １７Ｑ　１．１０　１，０７　１．６２　１．０１本Ｄ２３６Ａ、Ｄ２３８＾、 に２４ＯＡ　１，０１　０．８７　０，８３　０．９７木Ｅ９４Ａ、Ｄ９５Ａ、 Ｔ１０３Ｎ　Ｏ，６３０，８２０，５２１，０９＊Ｅ９４Ａ、Ｄ９５＾、Ｎ１１ ７Ｑ　・　１．２ｆｆ　１．５１　２，２５　１．２５木Ｅ９４Ａ、Ｄ９５Ａ、 Ｄ２３６Ａ、Ｄ２３８Ａ、に２４ＯＡ　Ｏ，６７１，０６０，４０１，９５Ｔ１ ０３Ｎ、Ｎ１１７Ｑ　１．１２　１，２１　１，１３　１．１９木丁１０３Ｎ、 Ｄ２３６Ａ、Ｄ２３８Ａ、に２４０Ａ　Ｏ，６４０，６６０，５２１，１２木Ｎ １１７Ｑ、Ｄ２３６Ａ、Ｄ２３８＾、に２４ＯＡ　１，２３　１，２４　１．５ ５　１．３１本Ｄ９５Ｇ　Ｏ，９９１，３６１，１５０，９５Ｄ、血漿凝塊溶解 検定 上述のフィブリン刺激Ｓ−２２５１検定にて説明したプラスミン−セファロース を使用し、ｔ−ＰＡ変異体のすべての試料を１本鎖から２本鎖形態に変換した。

血漿凝塊溶解検定は以下のようにして行った・　０１５Ｍ塩化カルシウム１０■ ｌをマイクロタイター平板ウェルに加えた。次いで、各ウェルに、遠心し０４５ マイクロン濾過したヒトクエン酸処理血漿プールを加えた。その内容物を完全に 混合し、血漿凝塊を形成させた。ｒｔ−ＰＡの標準試料及び検定すべきｔ−ＰＡ 変異体を、それらの終濃度の２倍（１８−８００ｎｇ／Ｗ）にまで検定緩衝液で 希釈した。希釈緩衝液は０．１Ｍ　ＮａＣ１，０，０３Ｍ重炭酸ナトリウム（実 験の開始直前に新たに加える）、４ｍＭＫ（Ｊ’、１ｍＭ塩化カルシウム、１ｍ Ｍ二塩基性リン酸ナトリウム、０．３ｍＭ塩化マグネシウム、０．４ｍＭ硫酸マ グネシウム、２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ［４−［２−ヒドロキシェチルコー１−ピペ ラジンエタンスルホン酸〕、及び０．０１％ポリソルベート８０．ｐＨ７，４を 含有している。

次いで、各標品又は変異体を１容量の血漿プールと混合した。この混合物１００ μｌ全体を、周囲温度で６−８時間放置して血餅を生じさせた後の血漿凝塊の上 に重層した。次いで、各平板の光学密度を４０５止にて読みとった。次いで、そ の平板を３７℃で約１５時間インキュベートし、光学密度の測定を繰り返した。

各ウェルについて、０から１５時間までの光学密度値の差異を引き算によって計 算した。標品では、光学密度を標品の濃度のｌｏｇの関数としてプロットした。

この標準曲線から未知量を内挿した。同じく処理した野生型ｔ−ＰＡ対照に標準 化した。標準曲線は４つのパラメーター適合プログラムを使用して決定した。使 用した平板解読装置は、５ＬＴ−ラボラトリーズのＥＡＲ３４０ＡＴ型であった （オーストリアン。

得られた結果を以下の第２表に示すが、表中、１印は本発明の変異体を示してい る。

第２表 クリアランス　血漿中 ｔ−ＰＡ変異体　速度　凝塊溶解 野生型　１．０　１．０ 本Ｅ９４八　〇、６１　０．８２ ＊Ｄ９５Ａ　０．３８　０．９７ ＊Ｅ９４＾、　Ｄ９５Ａ　Ｏ，３４０，７４７１０３Ｎ　Ｏ，３６０，８２ Ｎ１１７Ｑ　Ｏ，４４０，６６ 本Ｄ２３６Ａ、Ｄ２３８Ａ、に２４ＯＡ　０．４５　０．５５本Ｅ９４＾、Ｄ９ ５Ａ、Ｔ１０３Ｎ　Ｏ，１７０，５７＊Ｅ９４Ａ、　Ｄ９５＾、　Ｎ１１７Ｑ　 ０．２３　０．７０＊Ｅ９４Ａ、　Ｄ９５Ａ、　Ｄ２３６Ａ、　Ｄ２３８＾、　 Ｋ２４０＾　０．５６　０．４０Ｔ１０３Ｎ、　Ｎ１１７Ｑ　Ｏ，２７０，８６ 木Ｔ１０３Ｎ、Ｄ２３６＾、Ｄ２３８Ａ、に２４ＯＡ　０．２６　０．９１零Ｎ １１７Ｑ、Ｄ２３６Ａ、Ｄ２３８Ａ、に２４ＯＡ　Ｏ，３４０，４５＊０９５Ｇ 　Ｏ，３７Ｎ／＾ Ｎ／Ａは、このデータが入手できなかったことを示している。

本発明の単一変異体は、この検定において野生型ｔ−ＰＡに匹敵する活性、及び Ｎ１１７Ｑよりも良好な活性を有している。　Ｅ９４Ａ、Ｄ９５Ａ、Ｎ１１７Ｑ 。

及びＴ１０３Ｎ、Ｄ２３６Ａ、Ｄ２３８Ａ、に２４ＯＡなどの特定の多重変異体 における凝塊溶解活性は、野生型に匹敵している。

■、クリアランス速度検定 マウスに１２５−Ｉ−標識化ｔ−ＰＡを注入し、その血流中に残存する放射活性 量を経時的にモニターすることで、クリアランスを測定した。１２５−１−標識 化ｔ−ＰＡを製造するには、以下に説明する幾つかの工程が必要であった。

Ａ、　ｔ−ＰＡ変異体の放射線標識化 放射線標識化ｔ−ＰＡ変異体を製造するための第１工程は、Ｄ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ −Ａｒｇ−クロロメチルケトン試薬［ＹＰＲｃｋ、ビーチャム・バイオサイエン ス、　Ｉｎｃ、。

フィラデルフィア、ＰＡから入手したコを１２５−Ｉで標識化することである。

この試薬は、ｔ−ＦＡと不可逆的に結合し、ｔ−ＰＡの自己不活化基質（ｓｕｉ ｃｉｄｅ　５ｕｂｓｔｒａｔｅ）として作用する。従って、ｔ−ＰＡ分子は、こ のＹＰＲｃｋによって形成される共有結合を介して間接的にヨウ素化される。

ＹＰＲｃｋ試薬は、Ｈｕｎｔｅｒ及びＧｒｅｅｎｗｏｏｄ［Ｎａｔｕｒｅ　１９ ４：４９５（１９６２）］に記載されている方法を基礎とする方法を使用し、ク ロラミンＴ触媒ヨウ素化により放射線標識する。通常の反応では、１Ｍトリス− ＨＣ／ｐＨ７，５（５０μｌ）を、栓付き反応容器中のヨウ化ナトリウム−１２ ５［４ミリキユーリー、１．　８ｎＩｌａｌｌ（４０μＩ）に加える。この反応 物に、１２ｍＭ塩酸中、１００μｇ／ＩＩｌの保存溶液として調製しておいたＹ ＰＲｃｋ試薬（０，８３ｕｇ、１゜８ｎｍｏｌ）８．　３　ｕ　ｊ！を加える。

得られた混合物は、ヨウ化ナトリウム及びＹＰＲｃｋの１：１の化学量論混合物 であった。領　１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７，５）中、ｌａｇ／ｍＩ！クロラ ミンＴ（１２゜５μｌ）を添加し、ヨウ素化反応を開始させた。６０秒後、０４ １Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７，５）中、ｌａｇ／ｍｆメタ重亜硫酸ナトリウム ２５μｌを添加し、ヨウ素化反応を停止させた。各添加の後にこの反応容器を旋 回させた。ＹＰＲｃｋのヨウ素化の［１ｉ［後に、０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０ を含有するＰＢ８２ｍｌをその反応容器に加え、旋回させて放射活性標識物を希 釈した。本発明のｔ−ＰＡ変異体をコードするＤＮＡによって６日前に形質転換 しておいた２９３細胞から、細胞培養上清を採取した。これらの細胞は変異体ｔ −ＰＡタンパク質を活動的に分泌しており、その細胞培養培地は通常、約１μｇ ｋｌのｔ−ＰＡを含有している。希釈したＹＰＲｃｋ−１２５−Ｉ試薬２０μｌ を細胞培養上清９００μｌに加えた。この混合物を２５℃で１時間インキュベー トし、次いで０．００３％７　ｖｅｅｎ　−２０を含有するＰＢＳ中、０１％ゼ ラチンで前もって平衡化しておいたセファデックスＧ−２５カラムに適用した。

各カラムから画分１ｍｌを採取し、各画分の試料をトリクロロ酢酸沈殿させて測 定すると、通常は４番目の画分が、放射活性結合した総タンパク質の８５％を含 有していた。

Ｂ　薬物動態検定 以下の検定法を使用し、ＹＰＲｃｋ−標識化ｔ−ＰＡ変異体のマウスにおけるク リアランスを計算した。各変異体の評価には、それぞれ４匹のマウスを使用した 。

ＹＰＲｃｋ−標識化ｔ−ＰＡ変異体を濃度１百万ｃｐｍ／ｍｆにまで希釈した。

各マウスの尾に、０５％ＢＳＡ及び０．０１％ＴＷｅｅｎ　２０を含有するＰＢ Ｓの溶液中、ＹＰＲｃｋ−標識化ｔ−ＰＡ１００μＥを注射した。マウスからの 採血は尾から対で行った。第１の対は最初の注射の後１．４．１０，２０及び３ ０分後に採血した。

第２の対は最初の注射の後２．７．１５．２５及び４０分後に採血した。血液７ ０μｌを１０％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）中で沈殿させた。ガンマ・シンチレー ションカウンターを使用し、ＴＣＡ沈殿物質をカウントし、第３図に示すように グラフ上に代表的結果をプロットした。次いで、各マウスについての曲線下面積 （ＡＵＣ）を計算した。次ぎに、式・　クリアランス＝投与量／ＡＵＧ　を使用 し、クリアランス速度を計算した。ｔ−ＰＡ変異体を投与したマウスの血液から 得られたクリアランス速度を野生型ｔ−ＰＡのそれに標準化した（野生型ｔ−Ｐ Ａのクリアランス速度を変異体のクリアランス速度で割る）。

この検定の結果をクリアランス率として表し、それらを上記の第２表に示してい る・例示した本発明のｔ−ＰＡ変異体は、野生型ｔ−ＦＡのそれよりも低いクリ アランス率を有している。このことは、本発明の変異体が野生型ｔ−ＰＡと比較 して減少されたクリアランスを有していることを示している。二重及び三重変異 体の中には単一変異体よりも低いクリアランス率を有しているものがあった。突 然変異変異体、Ｔ１０３Ｎ、Ｄ２３６Ａ、Ｄ２３８Ａ、に２４０Ａ；Ｎ１１７Ｑ 、Ｄ２３６Ａ、Ｄ２３８Ａ、に２４０Ａ；Ｅ９４Ａ、Ｄ９５Ａ、Ｔ１０３Ｎ；及 びＥ９４Ａ。

Ｄ９５Ａ、Ｎ１１７Ｑはすべて、それらの位置のいずれの単一突然変異体よりも 低いクリアランス率を有していた。

さらなるクリアランス速度の結果を以下の第３表に示す。

第３表の１欄に示したｔ−ＰＡ変異体（標準的な命名法を使用）は実質的に既述 のようにして入手し、試験した。番号性した残基のみを挙げているが、これはア ラニンで置換したアミノ酸を意味している。

各変異体をコードするＤＮＡを、一時的発現のためにヒト腎肝ライン２９３ｃ細 胞［ＧｒａｈａｍらのＪ、ＧｅｎＪｉｒｏｌ、　３６：５９（１９７７）］に、 又は安定な発現のためにＣＨＯ−Ｋｌセルライン（ＡＴＣＣ番号ＣＬ　６１）に トランスフェクトした（第３表の２欄に示している）。すべての試料は精製調製 物としてのｒＰＵＲＩＦＪと明示していない限り、非精製細胞培養土清として試 験した。

ｔ−ＰＡの細胞培養上清中濃度を、野生型ｔ−ＰＡに対して調製したポリクロー ナル抗体を使用するＥＬＴ　ＳＡ（酵素連結免疫吸着検定）法によって測定した 。このクリアランス検定に使用した各ｔ−ＰＡ変異体の量は、このＥＬＩＳＡ法 の結果に基づくものである（第３表の３欄に示している）。ＥＬＩＳＡの値はμ ｇ　／　ｍ　ｌとして表している。

ｔ−ＰＡ変異体の放射線標識化試料を用いて、＋ｚｓ■−ＹＰＲｃｋによってク リアランス試験を行った。第３表の４欄に示しているマイクロキューリー／マイ クログラム（μＣｉ／μｇ）のデータは、ｔ−ＰＡ変異体の無傷の活性部位の数 を表示するものである。

５欄は、標準化クリアランスで表した、マウスにおけるインビボ薬物動態検定の 結果を示している。各ｔ−ＰＡ変異体のクリアランスを野生型ｔ−ＰＡのクリア ランスで割り、それを率として表した。薬物動態クリアランスの値が低ければ低 い程、半減期が長いことを意味する。

第３表（続き） 血中ｔ　−ｐ　Ａ　ｆｃｐｍ／ｍｌｌ 要　約　書 野生型ｔ−ＰＡと比較して減少されたクリアランスを有する生物学的に活性な組 織プラスミノーゲンアクチベータ−（ｔ−ＰＡ）、例えばｔ−ＰＡ分子の少なく ともクリングル−１及び／又はクリングル−２ドメイン（群）に１つ又はそれ以 上のアミノ酸の改変を有している変異体を製造するものである。この変異体をコ ードするＤＮＡ配列、並びにそのＤＮＡ配列を含有する発現ベクター及びその発 現ベクターによって形質転換された宿主細胞も製造できる。本発明の変異体は、 血管疾患又は症状を処置し、あるいは哺乳動物におけるフィブリン沈着もしくは 接着の形成又は再形成を予防するために医薬調製物中にて使用することができる 。

国際調査報告 国際調査報告

Claims (50)

【特許請求の範囲】
1. １．生物学的活性を示し、野生型ｔ−ＰＡと比較して減少されたクリアランスを 有する９４位又は９５位、又は２３６位、２３８位及び２４０位に改変を有する ｔ−ＰＡのアミノ酸配列変異体であって、Ｅ９４Ａ，Ｄ９５Ａ：Ｄ９５Ａ，Ｒ１ ０１Ａ；Ｄ２３６Ａ，Ｄ２３８Ａ，Ｋ２４０Ａ変異体とは異なる変異体。
2. ２．改変がアミノ酸置換である請求項１に記載の変異体。
3. ３．９４位がグルタミン酸以外のアミノ酸によって置換されている請求項２に記 載の変異体。
4. ４．９４位がアラニン又はグリシンによって置換されている請求項３に記載の変 異体。
5. ５．９５位がアスパラギン酸以外のアミノ酸によって置換されている請求項２に 記載の変異体。
6. ６．９５位がアラニン又はグリシンによって置換されている請求項５に記載の変 異体。
7. ７．２３６位がアスパラギン酸以外のアミノ酸によって置換され、２３８位がア スパラギン酸以外のアミノ酸によって置換され、そして２４０位がリジン以外の アミノ酸によって置換されている請求項２に記載の変異体。
8. ８．２３６位がアラニン又はグリシンによって置換され、２３８位がアラニン又 はグリシンによって置換され、そして２４０位がアラニン又はグリシンによって 置換されている請求項７に記載の変異体。
9. ９．９４位がグルタミン酸以外のアミノ酸によって置換され、９５位がアスパラ ギン酸以外のアミノ酸によって置換されている請求項２に記載の変異体。
10. １０．９４位がアラニン又はグリシンによって置換され、９５位がアラニン又は グリシンによって置換されている請求項９に記載の変異体。
11. １１．１０３位がアスパラギンによってさらに置換されている請求項３に記載の 変異体。
12. １２．１１７位がアスパラギン以外のアミノ酸によってさらに置換されている請 求項３に記載の変異体。
13. １３．１１７位がアラニン、グルタミン又はセリンによってさらに置換されてい る請求項３に記載の変異体。
14. １４．１０３位がアスパラギンによってさらに置換されている請求項５に記載の 変異体。
15. １５．１１７位がアスパラギン以外のアミノ酸によってさらに置換されている請 求項５に記載の変異体。
16. １６．１１７位がアラニン、グルタミン、又はセリンによってさらに置換されて いる請求項５に記載の変異体。
17. １７．１１７位がアスパラギン以外のアミノ酸によってさらに置換されている請 求項７に記載の変異体。
18. １８．１１７位がアラニン、グルタミン、又はセリンによってさらに置換されて いる請求項７に記載の変異体。
19. １９．１０３位がアスパラギンによってさらに置換されている請求項７に記載の 変異体。
20. ２０．改変が欠失である請求項１に記載の変異体。
21. ２１．改変が、９４位、９５位、２３６位、２３８位又は２４０位に隣接する保 存アミノ酸の挿入である請求項１に記載の変異体。
22. ２２．９４位がアラニン又はグリシンによってさらに置換されている請求項１８ に記載の変異体。
23. ２３．９５位がアラニン又はグリシンによってさらに置換されている請求項１８ に記載の変異体。
24. ２４．９４位がアラニン又はグリシンによって、及び９５位がアラニン又はグリ シンによってさらに置換されている請求項１８に記載の変異体。
25. ２５．９４位がアラニン又はグリシンによってさらに置換されている請求項１９ に記載の変異体。
26. ２６．９５位がアラニン又はグリシンによってさらに置換されている請求項１９ に記載の変異体。
27. ２７．９４位がアラニン又はグリシンによって、及び９５位がアラニン又はグリ シンによってさらに置換されている請求項１９に記載の変異体。
28. ２８．２３６位がアラニン又はグリシンによって、２３８位がアラニン又はグリ シンによって、そして２４０位がアラニン又はグリシンによってさらに置換され ている請求項１０に記載の変異体。
29. ２９．１０３位がアスパラギンによって、そして１１７位がグルタミンによって さらに置換されている請求項１０に記載の変異体。
30. ３０．１１７位がアラニン、グルタミン、又はセリンによってさらに置換されて いる請求項１０に記載の変異体。
31. ３１．１０３位がアスパラギンによってさらに置換されている請求項１０に記載 の変異体。
32. ３２．請求項１に記載の変異体をコードしているＤＮＡ配列。
33. ３３．請求項３に記載の変異体をコードしているＤＮＡ配列。
34. ３４．請求項５に記載の変異体をコードしているＤＮＡ配列。
35. ３５．請求項７に記載の変異体をコードしているＤＮＡ配列。
36. ３６．請求項９に記載の変異体をコードしているＤＮＡ配列。
37. ３７．形質転換宿主細胞において請求項３２に記載のＤＮＡ配列を発現できる複 製可能な発現ベクター。
38. ３８．形質転換宿主細胞において請求項３３に記載のＤＮＡ配列を発現できる複 製可能な発現ベクター。
39. ３９．形質転換宿主細胞において請求項３４に記載のＤＮＡ配列を発現できる複 製可能な発現ベクター。
40. ４０．形質転換宿主細胞において請求項３５に記載のＤＮＡ配列を発現できる複 製可能な発現ベクター。
41. ４１．形質転換宿主細胞において請求項３６に記載のＤＮＡ配列を発現できる複 製可能な発現ベクター。
42. ４２．請求項３７に記載のベクターによって形質転換された宿主細胞。
43. ４３．真核生物細胞である請求項４２に記載の宿主細胞。
44. ４４．哺乳動物である請求項４３に記載の宿主細胞。
45. ４５．ヒト腎胚２９３細胞である請求項４４に記載の宿主細胞。
46. ４６．生物学的活性を示し、野生型ｔ−ＰＡと比較して減少されたクリアランス を有している９４位又は９５位、又は２３６位、２３８位及び２４０位に改変を 有するｔ−ＰＡのアミノ酸配列変異体の治療学的有効量を製薬的に許容され得る 担体と共に含有する、血管状態又は疾患を処置するための組成物。
47. ４７．請求項４６に記載の変異体の有効量を哺乳動物に投与することを特徴とす る、哺乳動物における血管状態又は疾患を処置するための方法。
48. ４８．生物学的活性を示し、野生型ｔ−ＰＡと比較して減少されたクリアランス を有している９４位又は９５位、又は２３６位、２３８位及び２４０位に改変を 有するｔ−ＰＡのアミノ酸変異体の治療学的有効量を製薬的に許容され得る担体 と共に含有する、フィブリン沈着もしくは接着の形成又は再形成を予防するため の組成物。
49. ４９．請求項４８に記載の組成物の有効量を哺乳動物の可能性あるフィブリン又 は接着形成部位に投与することを特徴とする、フィブリン沈着もしくは接着形成 又は再形成を予防するために哺乳動物を処置する方法。
50. ５０．生物学的活性を示し、野生型ｔ−ＰＡと比較して減少されたクリアランス を有しているｔ−ＰＡのアミノ酸配列変異体を製造するための方法であって、（ ａ）９４位又は９５位、又は２３６位、２３８位及び２４０位に改変を有するｔ −ＰＡ変異体を入手し、 （ｂ）得られたｔ−ＰＡ変異体のクリアランス速度を野生型ｔ−ＰＡのそれと比 較し、 （ｃ）好生型ｔ−ＰＡに対して減少されたクリアランスを有するｔ−ＰＡ変異体 を選択すること を特徴とする方法。