JPH07501946A - フィブリン特異性が改善されたｔ‐ＰＡ置換変異体 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 フィブリン特異性が改善されたｔ−ＰＡ置換変異体発明の背景 ■９発明の分野 本発明は組織プラスミノーゲンアクチベータ−（ｔ−ＰＡ）変異体、その変異体 を製造する方法、及びそれを含有する医薬組成物に関する。

■８発明の背景及び関連分野 プラスミノーゲンアクチベーターは、プラスミノーゲンにおけるアミノ酸残基５ ６１及び５６２間のペプチド結合を開裂して、それをプラスミンに変換させる酵 素である。プラスミンはフィブリンなどの種々のタンパク質を分解する活性なセ リンプロテアーゼである。幾つかのプラスミノーゲンアクチベーター、例えばス トレプトキナーゼ（細菌タンパク１ｌｔ）、ウロキナーゼ（腎及び他の部位にて 合成され、初めは尿から抽出されたもの）、及びｔ−ＰＡと呼ばれるヒト組織プ ラスミノーゲンアクチベーター（血管壁を裏うちする細胞から産生される）など が同定されている。

これらプラスミノーゲンアクチベーターそれぞれの作用機序は若干相違している 。ストレプトキナーゼはプラスミノーゲン又はプラスミンと複合体を形成してプ ラスミノーゲン活性化活性を生じさせるものであり、ウロキナーゼはプラスミノ ーゲンを直接に開裂するものであり、そしてｔ−ＰＡはプラスミノーゲン及びフ ィブリン両者と相互作用して最適な活性を生じさせるものである。

ｔ−ＰＡの１本鎖型は低分子量基質及びインヒビターに対する活性が低いが、フ ィブリンの存在下では、それは本当のチモーゲン（酵素前駆体）ではないにも拘 わらず、２重鎖ｔ−ＰＡと同様のプラスミノーゲンアクチベーター活性を示す点 で、ｔ−ＰＡは変則的なセリンプロテアーゼである［Ｒｉｊｋｅｎら、Ｊ、　Ｂ ｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　２５７．２９２０−５（１９８２）　：　Ｌｉ　ｊｎｅ ｎら、　Ｔｈｒｏｍｂ、Ｈａｅｍｏｓｔ、６４．６ｌ−８（１９９０）コ。野生 型ｔ−ＰＡはフィブリン不存在下では貧弱な酵素であるが、フィブリンが存在す ると、プラスミノーゲンを活性化する能力が著しく増大する。黒色腫（メラノー マ）又は組換えｔ−ｐＡ（＾ｃｔｉｖａｓｅ’）のプラスミノーゲン活性化に関 する触媒効率（触媒速度定数（ｋｃ９．）／ミカエリス定数（Ｋｍ））は刺激が ない状態では約０．　００１　ｕＭ−’５ｅｃ−’テあり、一方フイブリン又は フィブリン分解産物の存在下では、その効率（偽−速度定数）は約１５００倍に 増大する。

ｔ−ＰＡは一部はその高いフィブリン特異性とインビボにおける強力な血餅溶解 能のおかげで、心筋梗塞、肺塞栓症などの血管疾患を処置するための重要かつ新 規な生物学的医薬物質として確定されている。

実質的に純粋な形態のｔ−ＰＡは、最初はＣｏ１１ｅｎらにより天然起源から製 造され、そのインビボ活性が暉験された［１９８８年６月２１日発行の米国特許 第４．７５２．６０３号（さらにＲｉｊｋｅｎら、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、 ２５６．７０３５（１９８１）も参照のこと）〕。Ｐｅｎｎ１ｃａら［Ｎａｔｕ ｒｅ　３０１．２１４（１９８３）］はｔ−ＰＡのＤＮＡ配列を決定し、そのＤ ＮＡ配列からアミノ酸配列を推定した［１９８８年８月２３日発行の米国特許第 ４．７６６．０７５号を参照］。

ヒト天然ｔ−ＰＡはアミノ酸１１７．１８４．２１８及び４４８位に潜在的なＮ 連結グリコジル化部位を有している。高いマンノースオリゴ糖が１１７位に存在 し、複合オリゴ糖が１８４位及び４４８位に存在している。１１７位及び４４８ 位は常にグリコジル化されているようであるが、１８４位は約５０％のｔ−ＰＡ 分子でグリコジル化されていると考えられる。１８４位におけるこの部分的なグ リコジル化のパターンは、ｔ−ＰＡ分子の暴露されていない領域にこの１８４部 位が位置していることに由来すると思われる。１８４位がグリコジル化されてい るｔ−ＰＡ分子は■型ｔ−ＰＡと呼ばれ、１８４位がグリコジル化されていない 分子は■型ｔ−ＰＡと呼ばれる。天然ｔ−ＰＡでは２１８位はグリコジル化され ていないことが見いだされた。Ｉ型及び■型ｔ−ＰＡは同じセルラインから単離 した場合、それらはＡｓｎ−１１７及びＡｓｎ−４４８位が同一の態様でＮ−グ リコジル化されていると報告された。Ａｓｎ−１１７は高いマンノースオリゴ糖 の混合体と主として関連しており、他方ｔ−ＰＡを線維芽細胞から単離した場合 はＡｓｎ−１８４及びＡｓｎ−４４８は複合Ｎ−７セチルラクトサミン型構造に よって特徴付けられ、メラノーマ細胞から単離した場合は複合−及びオリゴマン ノース−型の構造を有してい９８９）を参照のこと。ＣＨＯ細胞における発現に よって産生される組換えｔ−ＰＡ（＾ｃｔｉｖａｓｅ’　ｔＰＡ）は、１１７位 の高いマンノースオリゴ糖及びＡｓｎ−１８４及びＡｓｎ−４４８位の複合オリ ゴ糖から構成される炭水化物を約７重量％で含有していることが報告された［Ｖ ｅｈａｒ、　Ｇ、＾、、”組換えＤＮＡ技法によって産生されたヒト組織プラス ミノーゲンアクチベーターの特性試験’　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂａ ｒ　５ｙｉｐｏｓｉａ　ｏｎ　Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　１１ｉｏ１０ｇｙ　 １９８６；ＬＩ：５５１−５６２］。

ｔ−ＰＡの構造研究により、この分子は５つのドメインを有することが突き止め られた。各ドメインは、トリプシン、キモトリプシン、プラスミノーゲン、プロ トロンビン、フィブロネクチン及び表皮性成長因子（ＥＧＦ）などの他のタンパ ク質中における相同的又は機能的領域に照らして規定されている。これらのドメ インは、ｔ−ＰＡのアミノ酸のＮ−末端から始めて、アミノ酸１から約４４まで のフィンガー（Ｆ）ドメイン、アミノ酸約４５から９１までの成長因子（Ｇ）ド メイン［ＥＧＦとの相同性に基づ（］、アミノ酸約９２−１７３のクリングル− １（Ｋｌ）ドメイン、アミノ酸約１８０から２６１までのクリングル−２（Ｋ２ ）ドメイン、及びアミノ酸約２６４から５２７位アミノ酸のＣ末端までのセリン プロテアーゼ（Ｐ）ドメイン、と命名されている。これらのドメインは本質的に 互いに隣接して位置しており、幾つかは短い「リンカ−」領域によって連結され ている。このリンカ−領域は成熟ポリペプチドのアミノ酸の総数を５２７に導い ているが、３つの付加的な残基（Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｒｇ）がそのアミノ末端に 見いだされる場合があり、これはおそらく分子の不完全な前駆体プロセッシング に由来するものであろう。

上記の各ドメインは、生物学的に意義ある何らかの性質をｔ−ＰＡ分子に付与し ていると考えられる。フィンガードメインは、フィブリンに対するｔ−ＰＡの高 い結合親和性にとって重要であると考えられるが、欠失突然変異体を用いて得ら れる証拠によれば、フィブリンへのｔ−ｐＡの結合がクリングル−２ドメインに よっても媒介されることが示唆されている［Ｖａｎ　Ｚｏｎｎｅｖｅｌｄ、　Ａ 、　Ｊ、ら、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　、　Ｕ、　Ｓ 、　Ａ、　８３．４６７０−４６７７（１９８６）　：　Ｖｅｒｈｅｉ　ｊｅｎ 、　Ｊ、　ｔｌ、ら、ＥＭＢnＪ、　ｊ７．３５２５−３０（１９８ ６）］。血漿クリアランスの構造決定基はフィンガー、成長因子、及びクリング ル−１ドメイン上にあると考えられる。クリングル−２ドメインはリジンとの結 合に関与している。セリンプロテアーゼドメインは、ｔ−ＰＡの酵素活性及びフ ィブリン特異性に関与している。天然ｔ−ＰＡは２７５位及び２７６位間（この セリンプロテアーゼドメイン内に位置している）で開裂され、２鎖形態の分子と なることができる。

天然のヒ）　ｔ−Ｐ　Ａに血餅溶解物質としての充分な利点があるとしても、天 然に存在するこのタンパク質の形態が必ずしも、すべての治療的状況下で最適な ｔ−ｐＡを代表しているとは考えられない。

例えば、深部静脈血栓症を処置する場合、再潅流（ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ）を 行って心筋梗塞を処置する場合、肺塞栓症を処置する場合、又はポーラス注入を 使用して処置する場合など、いつかの場合には、より長い半減期及び／又は減少 されたクリアランスを有するｔ−ＰＡ分子が望ましいことがある。クリアランス が減少されたｔ−ＰＡＡ異体はこの分子から個々のアミノ酸、部分的ドメイン又 は完全なドメインを欠失させることによって製造されている。例えば、米国特許 第４．　９３５゜２３７号（１９９０年６月１９日発行）に記載されているよう にｔ−ＰＡのフィンガードメインの一部又はそのすべてを除去すると、フィブリ ン結合特性は実質的に減少するが、クリアランスは減少した分子が得られる。ブ ラウン（Ｂｒｏ＋ｍｅ）ら［７゜８ｉｏｔ、　Ｃｈｅｔ　２６３：　１５９９− １６０２（１９８Ｂ）］はアミノ酸５１及び８７間の領域（成長因子ドメイン） を除去し、それにより得られる変異体がモルモットモデルにおいて比較的ゆるや かな血漿からのクリアランスを示すことを見いだした。Ｊｏｂ＠ｎｎｅｓｓｅｎ ら［Ｔｈｒｏｍｂ、　Ｈａｅｍｏｓｔａｓ、　６３．５４−５９（１９９０）］ 　も、成長因子ドメインカ吹失されたｔ−ＰＡがラット及びウサギにおいて５− １０倍に長くなった半減期を有することを見いだした。コラン（Ｃｏｌｌｅｎ） ら［Ｂｌｏｏｄ、　７１　：２１６（１９８８）］は］アミノ酸６−８６（フィ ンガー及び成長ドメインの一部）を欠失させ、野生型ｔ−ＰＡが５分の半減期で あるのに対して、得られた突然変異体がウサギにおいて１５分の半減期を有する ことを見いだした。同様に、カイラン（Ｋａｙｌａｎ）ら［Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　 Ｃｈｅｗ、　、　２６３二３９７１（１９８８）］はアミノ酸１−８９を欠失さ せ、野生型ｔ−ＰＡが約２分であるのに対して、この突然変異体のマウスにおけ る半減期が約１５分であることを見いだした。５ｏｂｅｌら［Ｃ１ｒｃｕｌａｔ ｉｏｎ　８１．１３６２−７３（１９９０）］は、成長因子ドメインが欠失する か、又は成長因子−クリングル１ドメインが欠失すると共にクリングル２ドメイ ンが重複し５ているｔ−ＰＡＡ然変異体のイヌ及びウサギにおける半減期が長期 化していることを見いだした。さらに、フィンガー及び成長因子ドメインを欠（ ｔ−ＰＡＡ異体はハムスタニモデルにおいて天然ｔ−ＰＡと比較して１０−２０ 倍減少された血漿クリアランスを有している。この同じ試験にて、重複クリング ル２ドメインを有するｔ−ＰＡ変変体体３−５倍に減少された血漿クリアランス を有していること欠失され、３つのアスパラギングリコジル化部位が完全に破壊 された変異体を構築した。この変異体はイヌで試験した場合、野生型ｔ−ＰＡよ りも長い半減期を有することが示された。成長因子ドメイン又はフィンガードメ インのみが欠失された変異体もウサギ、モルモット及びラットにおいてクリアラ ンス速度が減少していることが証明された［Ｈｊｇｇｉｎｓ及びＢｅｎｎｅｔｔ 、＾ｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、　Ｔｏｘｉｃａｌ、　、　３０　 F ９１（＋９９０）及びそこの引用文献］。フィンガー及びセリンプロテアーゼド メイン（ｔ−ＰＡデル（Ｃ５１−Ｃ２５１））のみから構成されるｔ−ＰＡＡ然 変異体もまた、ラット及びウサギにおいて野生型ｔ−ＰＡよりも４−５倍遅い血 漿クリアランス及びそれよりも長い半減期を有していた。しかし、ウサギの末梢 動脈血栓症モデルでは、この変異体のフィブリン溶解力は天然ｔ−ＰＡのそれの 半分程しかなく、そのフィブリン刺激性は顕著に低かった［Ｔｒｉｌｌ、　Ｊ、 　Ｊ、ら、Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｊｓ　４．１３１−１４０（１９９０）］。

成長因子領域を種々欠失させることが、１９８７年１０月１４日公開のＥＰ−Ａ 第２４１．２０８号などの特許文献にも報告されている（アミノ酸５１−８７の 欠失、及びアミノ酸５１−１７３の欠失）。さらに、１９８７年１０月７日公開 のＥＰ−Ａ第２４０．３３４号を参照すれば、そこには成熟した天然ｔ−ＰＡの アミノ酸領域６７−６９につき、１つ又はそれ以上のアミノ酸を欠失又は置換さ せることによるその修飾が開示されている。

これらの試験はｔ−ＰＡのフィンガー及び成長因子ドメインを欠失させると、そ の血漿クリアランスが顕著に減少することを示している。しかし、同時にこのよ うな変異体の血栓溶解活性は実質的に減少していることが多い。

ｔ−ＰＡのクリアランス速度を遅（させ、及び／又は半減期を長期化させるもう １つの手段は、ｔ−ＰＡ分子を別の分子と複合体化することである。例えば、ｔ −ｐＡ−ポリエチレングリコールコンジュゲート体は、ＥＰ−Ａ第３０４．３１ １号（１９８９年２月２２日公開）に報告されているように、ｔ−ＰＡのクリア ランス速度を増大させると報告された。ｔ−ＰＡに対するモノクローナル抗体は 、その活性を減少させることな（ｔ−ＰＡのインビボにおける機能的な半減期を 増大させると報告された（１９８９年１１月２日公開のＥＰ−Ａ第３３９．５０ ５号を参照のこと）。

ｔ−ＰＡの種々のアミノ酸置換変異体が、ｔ−ＰＡの半減期を増大させたり、そ のクリアランス速度を減少させたりするそれらの能力について評価された。変異 体Ｒ２７５Ｅ　（天然の成熟ｔ−ＰＡにおける２７５位のアルギニンがグルタミ ン酸と置換されている）は、霊長動物及びウサギにおいて試験した場合、野生型 ｔ−ＰＡよりも約２倍遅いクリアランス速度を有していることが示されたｒＨｏ ｔｃｈｋｉｓｓらのＴｈｒｏｗｂ、　Ｉｌｅｗｏｓｔ、　、　５ｇ＋４９１（１ ９８７）］−成熟した天然ｔ−ＰＡのアミノ酸６３−７２の領域における置換、 特に６７位及び６８位の置換は、ｔ−ＰＡの血漿中半減期を増大させると報告さ れている［１９８９年１２月２８日公開のＷＯ３９／１２６８１］。

他の置換変異体の製造方法は、ｔ−ＰＡのグリコジル化部位を非グリコジル化部 位に変換する点に焦点を合わせている。ホッチキス（Ｈｏｔｃｈｋｉｓｓ）ら［ Ｔｈｒ（至）ｂ、　Ｈｅ−〇ｓｔ、、６０：２５５（１９８８）］はｔ−ＰＡ分 子からオリゴ糖残基を選択的に除去し、ウサギにおいて試験した場合、それらの 残基の除去によりｔ−ＰＡのクリアランス速度が減少することを証明した。エン ド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼＨ（Ｅ　ｎｄ。

−Ｈ）酵素を使用して１１７位の高度マンノースオリゴ糖を除去すると、約２倍 に減少したクリアランス速度が得られた。過ヨウ素酸ナトリウムを使用して殆ど すべてのオリゴ糖残基を酸化すると、野生型ｔ−ＰＡと比較して３倍近く低いク リアランス速度となった。これらの研究者は、１１７位のグリコジル化を防止す るため、ｔ−ＰＡ変異体Ｎ１１７Ｑ（天然の成熟ｔ−ＰＡの１１７位のアスパラ ギンがグルタミンと置換している）も創製した。この変異体のクリアランス速度 は野生型ｔ−ＰＡよりも低かった。１９８７年９月２３日公開のＥＰ−Ａ　２３ ８，３０４、及び１９８７年６月１日公開のＥＰ−Ａ　２２７．４６２も参照の こと。クリングル−２及びプロテアーゼドメインから構成されるｔ−ＰＡの非グ リコジル化変異体は、イヌの冠動脈血栓モデルにおいて野生型ｔ−ＰＡよりも９ 倍遅い血漿クリアランス及びそれよりも１２倍高い血栓溶解力を有すると報告さ れた［Ｍａｒｔｉｎら。

Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ　４（補３）：９（要約２６８１９９０）］。

延長された循環系半減期及び比較的ゆっくりしたクリアランスを有するｔ−ＰＡ 変異体を製造するための別のアプローチは、ｔ−ＰＡ分子にグリコジル化部位を 付加することである。このアプローチの例示として、６０．６４．６５．６６． ６７．７８．７９．８０．８１．８２及び１０３位を適当なアミノ酸と置換し、 これらの残基のうち幾つかの残基又はその近（の残基にグリコジル化部位を有す る分子を創製することが挙げられる（１９８９年１１月３０日公開のＷＯ３９／ １１５３１を参照のこと）。

ヒトｔ−ＰＡ分子を修飾するための他の鍵部位はプロテアーゼドメイン内全体に 位置している。Ｓ■ｉｔｈら、（１９８４年５月２４日）のＷｏ　８４１０１９ ６０は、フィブリン溶解活性のある糖タンパク質のフィブリン溶解活性に必須で あると考えられる触Ｉｘ部位をアシル基などの特定のグループを導入することに よりブロックすることに指向している。ｔ−ＰＡの２７５／２７６開裂部位にお けるタンパク質分解的開裂の機能的な帰結を明らかにするため、Ａｒｇ２７５残 基を部位特異的突然変異によって別のアミノ酸、例えばグルタミン酸又はグリシ ンに変換したｃ丁７年８月１９日公開のＥＰ−Ａ２３３．０１３及び１９８７年 ８月１３日公開のｔｏ　８７１０４７２２］。フィブリン（ノーゲン）の不存在 下では、これらの突然変異の活性は２重鎖天然ｔ−ＰＡよりも低いが、フィブリ ンが存在すれば、それらのうちの幾つかは完全なプラスミノーゲン活性能を有す ることが見いだされた。天然ｔ−ＰＡの２７７位の突然変異は例えば、１９８８ 年１２月２８Ｂ公開（７）ＥＰ−Ａ　２９７，０６６、ＷＯ８６１０１５３８（ １９８８年６月２８日発行の米国特許第４．７５３，８７９号に対応）、及び１ ９８６年１１月１２日公開のＥＰ−Ａ　２０１．１５３に開示されている。ｌ１ １ｇｇ１ｎｓら、　Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ　５．４３−９（１９９１）に最 近報告されているように、Ｒ２７５Ｅ、に２７７１ｔ−ＰＡ二重突然変異体はプ ラスミンによる２本鎖を−ＰＡへの変換に完全に耐性であるが、これはフィブリ ンの存在下におけるプラスミノーゲンの活性化能を大きな程度で保持している（ これは野生型ｔ−ＰＡの約２／３の活性を有している）。野生型ｔ−ＰＡの２７ ４−２７７アミノ酸領域に種々の置換を有しているｔ−ＰＡ変異体は１９８８年 １１月２３日公開のＥＰ−Ａ　２９２．００９に開示されている。天然ｔ−ＰＡ の２７５位にグリシンを含有する変異体はプラスミンによる開裂に対する感受性 が１００から１０００倍低く、フィブリンの不存在下ではプラスミノーゲン活性 化活性を殆ど示さず、フィブリンの存在下ではその活性は顕著であるが、天然ｔ −ＰＡと比較すると低いことが記載されている。ｔ−ＰＡの２７６位にプロリン を有する別の変異体はプラスミンによって変換され、この変異体の１本鎖型より も顕著に低い活性しか有していない２本鎖型となることが見いだされた。

ｔ−ＰＡのプロテアーゼドメイン内におけるさらなる既知の修飾は４１４−４３ ３位（１９９０年１月１７日公開のＥＰ−Ａ　３５１．２４６）　、及び２９６ −２９９位、４１６−４１８位、及び４２６位、４２７位、４２９位、４３０位 （１９９０年３月２２日公開のＷｏ　９０１０２７９８）である。ｔ−ＰＡ分子 の２９６−３０２アミノ酸領域はｔ−ＰＡのプロテアーゼ部分に殆どのセリンプ ロテアーゼには存在しないユニークな挿入を含有しているが、これはｔ−ＰＡ分 子の２つの重要な機能に影響することが示されている。Ｍａｄｉｓｏｎら［Ｎａ ｔｕｒｅ　３３９．７２１−７２４（１９８９）及びＰｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　 Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ、　、　Ｕ、　Ｓ、＾、　８７．３５３０−３５３３（１９ ９０）］は、この領域はｔ−oＡと ＦＡＩ−１との相互作用を制御していることを証明した。そのプロテアーゼの２ ９６−２９９領域がｔ−ＰＡとＦＡＩ−１との相互作用に関与していることが確 かめられたことに加え、Ｂｅｎｎｅｔｔら［Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｓ、　２ ６６、５１９１−５２０１（１９９１）］の最近の研究において、この領域がｔ −ＰＡがプラスミノーゲンを活性化できる速度を増大させるフィブリノーゲン及 びフィブリンの能力にも関与していることが証明された。Ｂｅｎｎｅｔｔらは、 テトラ−アラニン置換ＫＨＲＲ（２９６−２９９）ＡＡＡＡｔ−ＰＡ変異体が野 生型ｔ−ＰＡと比較して顕著に改変された酵素特性を有することを観察したので ある。この変異体の親桟基は殆どのセリンプロテアーゼには存在しない挿入ルー プにあるが、これはトリペプチド基質Ｓ−２２８８（Ｈ−Ｄ−インロインルーし 一プロリルーし一アルギニンーｐ−ニトロアニリドニ塩酸塩）に対する正常なア ミド溶解活性を有しているが、刺激物質の不存在下、又は弱い刺激物質フィブリ ノーゲンの存在下におけるヒトＧｌｕ−プラスミノーゲンに対する活性は減少し ている。しかし、フィブリンの存在下では、この変異体は野生型ｔ−ｐＡよりも ３倍近く高い活性を示した。フィブリノーゲンの存在下に減少する活性とフィブ リンの存在下における比較的高い活性とを組み合わせた効果によって、ＫＨＲＲ （２９６−２９９）ＡＡＡＡのフィブリン特異性は野生型のｔ−ＰＡと比較して 殆どマグニチュードのオーダーで高くなる。

吸血コオモリ（Ｄｅｓｍｏｄｕｓ　ｒｏｔｕｎｄｕｓ）の毒液のｔ−ＰＡ　（Ｂ ａｔ−ＰＡ）はフィブリンによって、組換えヒトｔ−ＰＡが２５０倍であるのに 対して、４５．０００倍刺激されることが見いだされた［Ｇａｒｄｅｌｌら、　 Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅ＋＊、２６４．１７９４７−５２（１９８９）］。

これは、ヒトｔ−ＰＡとの相同性の程度が高いにも拘わらずである［ＥＰ−Ａ３ ５２．１１９　（１９９０年１月２４日公開）及びＥＰ−Ａ　３８３．４１７　 （１９９０年８月２２日公開）を参照コ。ＥＰ−Ａ　３５２，１１９によれば、 完全長Ｂａｔ−ＰＡ及びＰｅｎｎ１ｃａら、　Ｎａｔｕｒｅ　３０１，２１４− ２２１（１９８３）に記載されているヒトｔ−ＰＡ間のフィンガー、上皮成長因 子及び第１クリングルドメインにおける配列相同性はそれぞれ、７８％、７５％ 及び６７％である。ヒトｔ−ＰＡでは、第２クリングルドメイン内のリジン結合 部位は活性のフィブリン誘導刺激に重要な役割を果たしていると考えられる。こ のドメインはコオモリｔ−ＰＡ配列に対応のものを有さないので、その顕著なフ ィブリン特異性は、現在まで未確定の１つ又はそれ以上の異なる領域にその原因 をめなければならない。大腿部動脈血栓症を有するウサギでは、コオモリｔ−Ｐ Ａは強力かつフィブリン特異的な血栓溶解物質であるように思われる［５ｈｅｂ ｕｓｋｉら、　Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ　４（補、３）：９７（要約２４８Ｘ １９９０）］。

プラスミノーゲンアクチベーター及び第２世代のその誘導体の概論は、Ｈａｒｒ ｉｓ。

ｔｓ　ｉｎ　Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　２３巻、１２章（１ ９８８）、及びＨｉｇｇｉｎｓ及びＢｅｎｎｅｔｔ、前掲などがある。

より新しいかつ種々の局面で良好なｔ−ＰＡ動物質すぐに用意できる証拠を先の 開示により提示したが、薬理学的特性が改善されたｔ−ｐＡ変異体のさらなる要 求は存在する。より詳細には、２９６−３０２の全領域、特に２９６−２９９が 絡むなどの解く的の突然変異によりフィブリン特異性などの望ましい特性が付与 されるが、フィブリノーゲン刺激（又は血漿−刺激）活性よりもフィブリン刺激 （又は血漿凝血（血餅）刺激）活性のほうが顕著に高い、即ち野生型ヒトｔ−Ｐ Ａよりもフィブリン（又は血漿凝血）特異性が高いｔ−ＰＡ変異体であるため、 凝血の部位においてのみ機能し、全身的には機能しない変異体を提供するのが望 ましいであろう。全身活性が野生型ｔ−ＰＡよりも減じられたこのような分子は 出血傾向合併症及び／又は再梗塞の発症率を減少させると期待される。さらに、 フィブリン特異性が改善されると共に野生型ｔ−ＰＡの血漿凝血溶解活性を本質 的に保持しているｔ−ＰＡ変異体も望まれよう。特に、フィブリン特異性と長期 の半減期又はゆっくりとした血漿からのクリアランスとを併せ持つｔ−ＰＡ変異 体が望まれよう。このようなｔ−ＰＡ変異体が生産できれば、深部静脈血栓の処 置、心筋梗塞後の再還流処置、肺塞栓の処置に有益であろうし、ポーラス注射を 使用する処置も可能となるであろう。

従って、本発明の目的は、治療学的及び製薬的特性が改善されたフィブリン特異 的なヒトｔ−ＰＡ分子を提供することである。

この目的及び他の目的は当業者ならば、明白であろう。

！肌の！！ 上記の目的は、成熟野生型ヒトｔ−ＰＡ分子の２７４　２７７位のアミノ酸のＦ ＲＴＫ配列がＬ　ＨＳ　Ｔに改変されたヒト組織プラスミノーゲンアクチベータ −（ｔ−ＰＡ）変異体を提供することによって達成される。

このように、本発明は、成熟野生型ヒトｔ−ＰＡアミ、／酸配列の２７４−２７ ７位にアミノ酸ＬＨ８Ｔを含有するｔ−ＰＡアミノ酸配列変異体であって、ｔ− ＰＡの生物活性を示し、フィブリン特異性が野生型ヒトｔ−ＰＡと比較して顕著 に増大しており、そのために非折りたたみｔ−ＰＡよりも優先的に血餅の部位に おいて機能する該変異体を提供するものである７本発明の変異体は、１本鎖又は ２本鎖形態いずれでも存在できる天然ｔ−ＰＡとは異なり、２７５及び２７７位 におけるプロテアーゼ開裂に耐性である点からプロテアーゼ耐性であり、従って インビボにて代謝的に２本鎖形態に変換されない。

他の態様として、本発明は上記の変異体をコードするＤＮＡ配列、このＤＮＡ配 列を形質転換宿主細胞において発現できる複製可能な発現ベクター、影貫転換さ れた宿主細胞、及びその宿主細胞を培養し７て該１−ＰＡｉ異体をコードするＤ ＮＡを発現させることを特徴とする方法を提供する。

また別の態様として、本発明は、本発明のｔ−ＰＡ変異体の治療学的有効量を製 薬的に許容される担体と共に含有してなる、血管状態又は血管疾患を処置するた めの組成物を提供する。

本発明はさらに別の態様として、本発明のｔ−ＰＡ変異体の有効量を哺乳動物に 投与することを特徴とする、哺乳動物の血管状態又は疾患を処置するための方法 を提供する。

また、本発明は、本発明のｔ−ＰＡ変異体の治療学的有効量を製薬的に許容され る担体と共に含有してなる、フィブリ二ノ沈着又は接着形成もしくは再形成を予 防するための組成物を提供する。

さらに、本発明は、潜在的なフィブリン又は接着形成のある哺乳動物におけるそ の部位に本発明ｔ−ＰＡ変異体の有効量を投与することを特徴とする、フィブリ ン沈着又は接着形成もしくは再形成を予防するための哺乳動物の処置方法を提供 する。

図面の簡単な説明 第１図はｐＲＫ、ｔ−ＰＡの構築の模式図である。ヒトｔ−ＰＡ　ｃＤＮＡｔ− Ｈｉｎｄｎｌ及びＢａ１ｌで消化し、それを真核生物発現ベクターｐＲＫ７のＨ ｉｎｄｌｌ［及び５ａｔ１部位間に挿入した。

−」なる用語は、通常は５つのドメイン（フィンガー、成長因子、タリングルー １、クリングル−２、及びプロテアーゼドメイン）からなる構造を有しているフ ィブＩ几／溶解活性を有するヒト内因性ｒ組織型）プラスミノーゲンアクチベー ターを意味するが、５つのドメインとはいってもそのうちの幾つかのドメインを 有している、又はそのドメインの幾つかが反復しているｔ−ＰＡでありでもそれ が血栓溶解物質として機能するならば、それらも包含する意味である。ｔ−ＰＡ は、プラスミノーゲンをプラスミンに変換できるプロテアーゼドメイン及びフィ ブリン結合性に少なくとも一部分は関与していると考えられているＮ末端領域か ら構成される２つの機能的な領域を最低限、含んでいる。従って、これらの用語 は、上記の機能ドメインをポリペプチドのアミノ酸配列の一部として含有してい るそのようなポリペプチドをも包含する。生物学的に活性な形態のｔ−ＰＡは、 この分子の上記２つの機能領域及びｔ−ＰＡの供給源本来のそれら以外のｔ−Ｐ Ａの他の部分を含有する形態とじで組換え細胞培養系によって生産することがで きる。各個体のｔ−ＰＡのアミノ酸配列における１つ又はそれ以上のアミノ酸の 相違によって示されるように、個体間毎に天然のアレル変異体が存在し、また生 じ得ることは理解されよう。

「野生型ｔ−ＰＡＪ、「天然ｔ−ＰＡＪ、［野生型ヒトｔ−ＰＡＪ及び「天然ヒ トｔ−ＰＡＪなる用語は天然配列のヒトｔ−ＰＡ、即ち１９８８年８月２３日発 行の米国特許番号第４，７６６．０７５号にて報告されているｃＤＮＡによって コードされているｔ−ＰＡを意味する。このｔ−ＰＡ分子のアミノ酸部位の番号 又は位置は米国特許番号第４．７６６．０７５号（前掲）に従って決めている。

ｔ−ＰＡは天然起源から得ることができる。さらに、ｔ−ＰＡは、例えばチャイ ニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）又はヒト腎肝２９３細胞などの組換え発現 系から入手することもできる。

ｒ　（ｔ−ＰＡ）生物活性」、「生物学的に活性なＪ、「活性」及び「活性な」 なる用語は、血漿凝血の存在下、又はフィブリンの存在下の５２２５１検定、５ ２２８８検定、血漿凝血溶解検定、又は他の適当な検定において測定される、ｔ −ｐＡ分子がプラスミノーゲンをプラスミンに変換できる能力を意味する。本発 明のｔ−ＰＡ分子はプラスミンによる２重鎖ｔ−ＰＡへの変換に耐性であるので 、１本鎖として検定される。検定（群）は活性の潜在的な調節物質、例えばフィ ブリン、フィブリノーゲン、血漿及び／又は血漿凝血の存在又は不存在下に実施 すればよい。

「血餅（凝血）溶解活性」なる用語は、上記の検定を使用し、精製フィブリン又 は血漿から誘導されることに無関係な血餅を溶解するｔ−ＰＡ分子の活性を意味 する。

「フィブリン特異性」なる用語は、５２２５１検定におけるフィブリノーゲン依 存性比活性に対するフィブリン依存性比活性の比率が野生型ｒｔ−ＰＡよりも高 い、好ましくは少なくとも１５の比率を示す突然変異体の活性を意味する。

「クリアランス速度」及び「クリアランス」なる用語は、ｔ−ＰＡ分子が血流か ら除去される速度を意味する。クリアランスが減少されていれば、そのｔ−ＰＡ 変異体は天ｆｆ１ｔ−ＰＡよりもゆっくりと消失することを意味し、クリアラン スが増大していれば、そのｔ−ＰＡは天然ｔ−ＰＡよりも迅速に消失するなど、 クリアランスは天ｆｆ１ｔ−ＰＡと比較して測定される。

「アミノ酸」及び「アミノ酸群」なる用語は天然に存在するすべての１２−α− アミノ酸を意味する。この定義は、ノルロイシン、オルニチン、及びホモシステ ィンを包含するものである。アミノ酸は、以下の１文字又は３文字命名法によっ て特定される： Ａｓｐ　Ｄ　アスパラギン酸　１１ｅｌ　イソロイシンＴｈｒ　Ｔ　スレオニン 　Ｌｅｕ　Ｌ　ロイシンＳｅｒ　Ｓ　セリン　Ｔｙｒ　Ｙ　チロシンＧｌｕ　Ｅ 　グルタミン酸　Ｐｈｅ　Ｆ　フェニルアラニンＰｒｏ　Ｐ　プロリン　Ｈｉｓ 　Ｈヒスチジンｃｉｙ　ｃ　グリシン　Ｌｙｓ　Ｋ　リジンＡｌａ　Ａ　アラニ ン　Ａｒｇ　ＲアルギニンＣｙｓ　Ｃンスティン　Ｔｒｐ　Ｗ　トリプトファン Ｖａｌ　Ｖ　バリン　Ｇｉｎ　Ｑ　グルタミンＭｅｔ　Ｍ　メチオニン　Ａｓｎ 　Ｎ　アスパラギンこれらのアミノ酸は化学組成及びそれらの側鎖の性質に応じ て分類することができる。これらのアミノ酸は、帯電及び非帯電アミノ酸と大き く２つのグループに分類される。これらのグループはそれぞれサブグループに分 割され、アミノ酸はさらに厳密に分類できる・ 「改変」、「アミノ酸配列改変」、「変異体」及び「アミノ酸配列変異体」なる 用語は、アミノ酸配列が天然ｔ−ＰＡと比較して幾つがの相違点を有しているｔ −ＰＡ分子を意味する。普通、変異体は天然ｔ−ＰＡと少な（とも８０％の相同 性を有しているが、天然ｔ−ＰＡとは少なくとも約９０％で相同的であるのが好 ましい。

本発明の範囲内にあるｔ−ＰＡのアミノ酸配列変異体は野生型ヒトｔ−ＰＡの２ ７４−２７７位のアミノ酸部位にＬＨ８Ｔの置換を有しており、さらに特定の他 の位置に置換、欠失及び／又は挿入を有している場合もある。

置換ｔ−ＰＡ変異体は、天然ｔ−ＰＡ配列中の少なくとも１つのアミノ酸残基が 除去され、その同じ部位に別のアミノ酸が挿入されているものである。この置換 は、分子内のアミノ酸１つだけを置換させる場合は１つでよ（、あるいは同じ分 子内に２つ又はそれ以上のアミノ酸を置換する場合は多数であってもよい。

電荷及び／又は構造が天然アミノ酸とは有意に異なる側鎖を有するアミノ酸で置 換すれば、ｔ−ＰＡ分子の活性を実質的に変動させることができる。このタイプ の置換を行えば、この分子の置換領域のポリペプチド骨格の構造及び／又は電荷 又はハイドロホビシティーに影響を与えることができると期待される。

ｔ−ＰＡ分子の活性は、天然分子の側鎖と電荷及び／又は構造が類似している側 鎖を有するアミノ酸で置換すれば、穏やかに変動させることができょう。このタ イプの置換は保存的置換と呼ばれるが、この分子の置換領域のポリペプチド骨格 の構造又は電荷又はハイドロホビシティーのいずれかも実質的に変化させないと 期待される。

挿入ｔ−ＰＡ変異体は、天然ｔ−ＰＡ分子の特定の位置にあるアミノ酸のすぐ隣 に１つ又はそれ以上のアミノ酸が挿入されたものである。「アミノ酸のすぐ隣に 」とは、アミノ酸のα−カルボキシ又はα−アミノ官能基のいずれかに連結する ことを意味する。この挿入はアミノ酸１つ又はそれ以上であってよい。普通、挿 入は１つ又は２つの保存的アミノ酸から構成される。電荷及び／又は構造が挿入 部位に隣接するアミノ酸と類似し、ているアミノ酸は保存的と規定される。別に 、本発明は、挿入部位に隣接するアミノ酸とは実質的に異なる電荷及び／又は構 造を有するアミノ酸の挿入も包含している。

欠失変異体は、天Ｍｔ−ＰＡ分子の１つ又はそれ以上のアミノ酸が除去されてい るものである。普通、欠失変異体は、ｔ−ＰＡ分子の特定の領域にある１つ又は ２つのアミノ酸が欠失されている。

ｔ−ＰＡアミノ酸配列変異体を説明するために本明細書全体で使用している命名 法を次に説明する。ｔ−ＰＡのポリペプチド鎖の特定のアミノ酸の位置は数字で 特定している。この数字は、１９８８年８月２３日発行の米国特許番号第４，７ ６６．０７５号に記載されている成熟野生型ヒトｔ−ＰＡポリペプチドのアミノ 酸配列のアミノ酸位置を意味する。ｔ−ＰＡ変異体の実際の残基番号はその分子 の欠失又は挿入によって上記のような番号の並びではないが、本明細書では、ｔ −ＰＡ変異体内の同様に位置した残基もこれらの数字によって命名している。こ れは例えば、部位特異的な欠失又は挿入変異体に存在する。アミノ酸の特定には １文字コードを使用している。置換アミノ酸は、野生型アミノ酸のポリペプチド 鎖の位置を示す数字の左側に野生型アミノ酸を特定し、そしてその数字の右側に 置換されたアミノ酸を特定することで命名している。

例えば、野生型ヒトｔ−ＰＡの２７４．２７５．２７６及び２７７位のアミノ酸 において、フェニルアラニン（Ｆ）、アルギニン（Ｒ）、イソロイシン（Ｉ）及 びリジン（Ｋ）をアミノ酸ロイシン（Ｌ）、ヒスチジン（Ｈ）、セリン（Ｓ）及 びスレオニン（Ｔ）と置き換えると、Ｆ２７４Ｌ、Ｒ２７５Ｈ，Ｉ２７６Ｓ、に ２７７Ｔｔ−ＰＡ、　又はより短＜スれ＋ｆＦＲＩＫ（２７４−２７７）ＬＨ８ Ｔｔ−ＰＡと命名される。

欠失変異体は、包括的な欠失のいずれかの端のアミノ酸残基及び位置を示し、示 したアミノ酸の左側にギリシャ文字「△」を配置することによって特定される。

例えば、アミノ酸２９６−２９９の欠失を存するｔ−ＰＡ変異体はΔに２９６− Ｈ２９７〜Ｒ２９８−Ｒ２９９ｔ−ＰＡ　（ここに、Ｋ、Ｈ及びＲはそれぞれ、 アミノ酸リジン、ヒスチジン及びアルギニンを表す）と示される。１つのアミノ 酸、例えばに２９６が欠失される場合は、Δに２９６と表される。挿入ｔ−ＰＡ 変異体は、挿入されたアミノ酸の回りを括弧「［］」でくくり、挿入のいずれか の側のアミノ酸の位置を示すことによって挿入の位置を示して命名される。例え ば、９４位のグルタミン酸と９５位のアスパラギン酸との間にアミノ酸アラニン （Ａ）が挿入される場合は、Ｆ９４［Ａ］Ｄ９５と表される。読み易くするため に、カンマ「。

」を使用し、１つの分子に存在する多重突然変異を分離して表し、また幾つかの ｔ−ＰＡ変異体分子を同時に挙げる場合には、セミコロン「：」を使用して、構 築された個々のｔ−ＰＡ変異体分子を分離して表す。

「・・・をコードするＤＮＡ配列」、「・・・をコードするＤＮＡＪ及び「・・ ・をコードする核酸」なる用語は、デオキシリボ核酸の鎖に沿ったデオキシリボ ヌクレオチドの順序又は配列を意味する。これらデオキシリボヌクレオチドの順 序によって、ポリペプチド鎖に沿ったアミノ酸の順序が決められる。従って、Ｄ ＮＡ配列はアミノ酸配列をコードしている。

「複製可能な発現ベクター」及び「発現ベクター」なる用語は、外来ＤＮＡ片が 既に挿入することのできた、通常は２本鎖であるＤＮＡ片を意味する。外来ＤＮ Ａは異種ＤＮＡと規定され、これは宿主細胞内に天然では見いだされないＤＮＡ である。このベクターは、外来即ち異１ｉＤＮＡを適当な宿主細胞に輸送するた めに使用される。ベクターは宿生細胞内に入ったなら、宿主の染色体ＤＮＡとは 独立して複製でき、ベクター及びその挿入された（外来）ＤＮＡの幾つかのコピ ーが創製される。さらに、このベクターは、外来ＤＮＡをポリペプチドに翻訳さ せる必須要素を含有している。外来ＤＮＡによってコードされているポリペプチ ドの多くの分子はこのようにして迅速に合成することができる。

「形質転換宿主細胞」及び「形質転換」なる用語は、ＤＮＡを細胞に導入するこ とを意味する。この細胞は「宿主細胞」と呼ばれ、原核生物又は真核生物細胞の いずれでもよい。典型的な原核生物宿主細胞としては大腸菌の種々の株が挙げら れる。典型的な真核生物宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣細胞又はヒト 腎肝２９３細抱などの哺乳動物である。導入されるＤＮＡは通常、挿入されたＤ ＮＡ片を含有するベクターの形態にある。導入ＤＮＡ配列は宿主細胞と同じ種又 は宿主細胞とは異なる種由来のいずれでもよく、又は何等かの外来ＤＮＡ及び何 等かの同種ＤＮＡを含有する雑種ＤＮＡ配列であってもよい。

Ｎ、一般的な方法 本発明の変異体は、野生型ヒトｔ−ＰＡアミノ酸配列の２７４．２７５．２７６ 及び２７７位アミノ酸部位にそれぞれ、アミノ酸ロイシン（Ｌ）、ヒスチジン（ Ｈ）、セリン（Ｓ）、及びスレオニン（Ｔ）を必要不可欠なものとして含有する 。

この改変により、プラスミン開裂部位が喪失され、そのため、得られた変異体は 実質的に１本鎖形態となる。このような変異体はさらに、他のアミノ酸置換、欠 失又は挿入を含有することで、フィブリン特異性がさらに向上でき、及び／又は 血漿半減期の増大又はクリアランスの遅速などの付加的な所望の性質を付与する ことができる。

フィブリン特異性をさらに改善するため、ＦＲＩＫ（２７４−２７７）ＬＨ８Ｔ ｔ−ＰＡ変異体は例えば、セリンプロテアーゼドメインの２９６−３０２アミノ 酸部位、好ましくは２９６−２９９部位でさらに突然変異することができる。好 ましい変異体では、野生型ｔ−ＰＡの２９６−２９９部位のアミノ酸リジン（Ｋ ）、ヒスチジン（Ｈ）、アルギニン（Ｒ）、アルギニン（Ｒ）それぞれがアラニ ンとａ＊換；ｔらｈ、ＦＲＩＫ（２７４−２７７）ＬＨ５Ｔ、ＫＨＲＲ（２９６ −２９９）ＡＡＡＡｔ−ＰＡ変異体となる。野生型ｔ−ＰＡの２９９位のアルギ ニンをアスパラギン酸と置換するのは、フィブリン特異性をさらに改善させる別 の可能性ある手段である。さらに好ましい変異体では、野生型ｔ−ＰＡの２９６ ．２９７及び３０１位アミノ酸のリジン（Ｋ）、ヒスチジン（Ｈ）、及びプロリ ン（Ｐ）がそれぞれ、グルタミン（Ｑ）、アスパラギン（Ｎ）及びセリン（Ｓ） と置き換えられ、ＦＲＩＫ（２７４−２７７）ＬＨ３Ｔ、に２９６Ｑ、Ｈ２９７ Ｎ、Ｐ３０１Ｓｔ−ＰＡ変異体となっている。

分子のクリアランスを減少させ得る、可能性ある付加又は改変突然変異を例示す れば、天然ｔ−ＰＡアミノ酸配列における１０３位スレオニン又は６７位チロシ ンのアスパラギンとの置換、又は１０７位アラニンのセリンとの置換と一緒の１ ０５位セリンのアスパラギンの置換（１９８９年１１月３０日公開のＷＯ３９／ １１５３１Ｌ及び／又は天然ｔ−ＰＡアミノ酸配列における１１７位又は１８４ 位のアスパラギンのアラニン又はセリン、又は好ましくはグルタミンとの置換な どが挙げられる。クリアランス速度及び／又は半減期を改善させる別の手段は、 本発明のＦＲＩＫ（２７４−２７７）ＬＨ３Ｔｔ−ＰＡ変異体からフィンガー及 び／又は成長因子ドメインの一部又はそのすべてを除去することである。あるい は、又はさらに、天然ｔ−ＰＡ分子の例えば６０．６４．６５．６６．６７．７ ８．７９．８０．８１．８２及び１０３位アミノ酸位の１つ又はそれ以上の部位 に、又はそれらの近傍にグリコジル化部位を４−１加することによって、循環半 減期を延長させ、又はクリアランスをゆっくりとさせることができる。

また、本発明の分子の特定の部位を置換し、又は欠失を含有させることで、チモ ーゲニンティー（ｚｙｍｏｇｅｎｉｃｉ　ｔｙ）などの付加的な所望の性質を付 加させることができる。ヒトｔ−ＰＡにおけるこれらの位置としては例えば、４ １６−４１８位のそれぞれリジン、ヒスチジン及びグルタミン酸のアラニンどの 置換、９４位のグルタミン酸のアラニンとの置換、端び／又は９５位アスパラギ ン酸のアラニン又はグリコジル化との置換、及び４２６．４２７．４２９及び４ ３０位のそれぞれグルタミン酸、アルギニン、リジン及びグルタミン酸のアラニ ンとの置換が挙げられ、これらは例えば１９９０年３月２２日公開のＷＯ９０１ ０２７９８に開示されている。

適当な多重突然変異体としては例えば、以下のものが挙げられる：ＦＲＩＫ（２ ７４−２７７）ＬＨＳＴ、ＫＨＲＲ（２９６−２９９）ＡＡＡＡ　ｔ−ＰＡ；Ｆ ＲＩＫ（２７４−２７７）ＬＨＳＴ、Ｒ２９９Ｄ　ｔ−ＰＡ：ＦＲＩＫ（２７４ −２７７）ＬＨＳＴ、に２９６Ｑ、Ｈ２９７Ｎ、Ｐ３０１Ｓ　ｔ−ＰＡ；ＦＲＩ Ｋ（２７４−２７７）ＬＨＳＴ、Ｔ１０３Ｎ　ｔ−ＰＡ　：　ＦＲＩＫ（２７４ −２７７）ＬＨＳＴ、５１０５Ｎ、Ａ１０７Ｓ　ｔ−ＰＡ　：　ＦＲＩＫ（２７ ４−２７７）ＬＨＳＴ、Ｎ１１７Ｑ　ｔ−ＰＡ　；　ＦＲＩＫ（２７４−２７７ ）ＬＨＳＴ、ＫＨＲＲ（２９６−２９９）ＡＡＡＡ、Ｔ１０３Ｎｉ−ＰＡ：　Ｆ ＲＴＫ（２７４−２７７）ｌＩｌｓＴ、Ｒ２９９Ｄ、Ｔ１０３’Ｎ　ｔ−ＰＡ　 ：ＦＲＩＫ（２７４−２７７）ＬＨＳＴ、に２９６Ｑ、Ｈ２９７Ｎ、Ｐ３０１Ｓ 、Ｔｉ０３Ｎ　ｔ−ＰＡ；　ＦＲＩＫ（２７４−２７７）ＬＨＳＴ、ＫＨＲＲ（ ２９’６−２９９）Ａ、ＡＡＡ、３１０５Ｎ、Ａｌ　０７Ｓ　ｔ−ＰＡ；ＦＲＩ Ｋ（２７４−２７７）ＬＨＳＴ、Ｒ２９９Ｄ、５１０５Ｎ、Ａ１０７Ｓ　ｔ−Ｐ Ａ：ＦＲＩＫ（２７４−２７７）ＬＨＳＴ。

Ｋ２９６Ｑ）、Ｈ２９７Ｎ、Ｐ３０１Ｓ、５１０５Ｎ、Ａ１０７Ｓ　ｔ−ＰＡ； ＦＲＩＫ（２７４−２７７）ＬＨＳＴ、ＫＨＲＲ（２９６−２９９）ＡＡＡＡ、 Ｎ１１７Ｑ　ｔ−ＰＡ；ＦＲＴＫ（２７４−２７７）ＬＨＳＴ、Ｒ２９９Ｄ、Ｎ １１７Ｑ　ｔ−ＰＡ；ＦＲＩＫ（２７４−２７７）ＬＨＳＴ、に２９６Ｑ、Ｈ２ ９７Ｎ、Ｐ３０１Ｓ、Ｎ１１７Ｑ　ｔ−ＰＡ：ＦＲｌＫ（２７４−２７７）ＬＨ ＳＴ、Ｔ１０３Ｎ、Ｎ１１７Ｑ　ｔ−ＰＡ；ＦＲＩＫ（２７４−２７７）ＬＨＳ Ｔ、５１０５Ｎ、Ａ１０７Ｓ、Ｎ１１７Ｑｔ−ｐＡ；ＦＲＩＫ（２７４−２７７ ）ＬＨＳＴ、ＫＨＲＲ（２９６−２９９）ＡＡＡＡ、Ｔｌ０３Ｎ、Ｎ１１７Ｑ　 ｔ−Ｐ、Ａ；ＦＲＩＫ（２７４７２７７）ＬＨＳＴ、ＫＨＲＲ（２９６−２９９ ）ＡＡＡＡ、５１０５Ｎ、Ａ１０７Ｓ、Ｎ１１７Ｑ　ｔ−ＰＡ；ＦＲＩＫ（２７ ４−２７７）ＬＨＳＴ、Ｙ６７Ｎ　ｔ−ＰＡ：ＦＲＩＫ（２７４−２７７）ＬＩ ＳＴ、Ｎ１１７Ａ　ｔ−ＰＡ；ＦＲＩＫ（２７４−２７７）ＬＨＳＴ、Ｎ１１７ Ｓ　ｔ−ＰＡ；ＦＲＩＫ（２７４−２７７）ＬＨＳＴ、Ｎ１８４Ａ　ｔ−ＰＡ； ＦＲＩＫ（２７４−２７７）ＬＨＳＴ、Ｎ１８４Ｓ　ｔ−ＰＡ；ＦＲＩＫ（２７ ４２７７）ＬＨＳＴ、Ｎ１８４Ｑ　ｔ−ＰＡ：ＦＲＩＫ（２７４−２７７）ＬＨ ＳＴ、Ｙ６７Ｎ、Ｎ１１７Ａ　ｔ−ＰＡ；ＦＲＩＫ（２７４−２７７）ＬＨＳＴ 、Ｙ６７Ｎ、Ｎ１１７Ｓ　ｔ−ＰＡ；ＦＲＩＫ（２７４−２７７）ＬＨＳＴ、Ｙ ６７Ｎ、Ｎ１１７Ｑ　ｔ−ＰＡ：ＦＲＩＫ（２７４−２７７）ＬＨＳＴ、丁１０ ３Ｎ、Ｎ１８４Ａ　ｔ−ＰＡ；ＦＲＩＫ（２７４−２７７）ＬＨＳＴ、Ｙ６７Ｎ 、Ｎ１８４Ａ　ｔ−ＰＡ；ＦＲＩＫ（２７４−２７７）ＬＨＳＴ、Ｔ１０３Ｎ、 Ｎ１８４Ｓ　ｔ−Ｐ、Ａ；ＦＲＩＫ（２７４−２７７）ＬＩＳＴ、ＫＨＲＲ（２ ９６−２９９）ＡＡＡＡ、Ｔ１０３ＮＪＪ１８４Ｓ　ｔ−ＰＡ　；　ＦＲＩＫ（ ２７４−２７７）ＬＨＳＴ、Ｙ６７Ｎ、Ｎ１８４Ｓ　ｔ−ＰＡ：ＦＲＩＫ（２７ ４−２７７）ＬＨＳＴ、Ｔ１０３Ｎ、Ｎ１８４Ｑ　ｔ−ＰＡ；ＦＲＩＫ（２７４ −２７７）ＬＨＳＴ、Ｙ６７Ｎ、Ｎ１８４Ｑ　ｔ−ＰＡ；ＦＲＩＫ（２７４−２ ７７）ＬＨＳＴ、Ｄ９５Ｇ　ｔ−ＰＡ；ＦＲＩＫ（２７４−２，７７）ＬＩＳＴ 、Ｅ９４Ａ、Ｄ９５Ａ　ｔ−ＰＡ；ＦＲＩＫ（２７４−２７７）ＬＨＳＴ、Ｅ９ ４Ａ、Ｄ９５Ａ、Ｔ１０３Ｎ　ｔ−ＰＡ；ＦＲＩＫ（２７４−２７７）ＬＩＳＴ 、Ｅ９４Ａ、Ｄ９５Ａ、Ｎ１１７Ｑ　ｔ−ＰＡ；ＦＲＩＫ（２７４−２７７）Ｌ ＨＳＴ、Ｅ９４Ａ、Ｄ９５Ａ、３１０５Ｎ、Ａ１０７ｓ　ｔ−ＰＡ：ＦＲＩＫ（ ２７４−２７７）ＬＨＳＴ、ＫＩ−（ＲＲ（２９６−２９９）ＡＡＡＡ、Ｅ９４ Ａ、Ｄ９５Ａ　ｔ−ＰＡ　：　ＦＲＩＫ（２７４−２７７）ＬＨＳＴ、ＫＨＲＲ （２９６−２９９）ＡＡＡＡ。

Ｅ９４Ａ、Ｄ９５Ａ、Ｔ１０３Ｎ　ｔ−ＰＡ：　ＦＲＩＫ（２７４−２７７）Ｌ ＨＳＴ、ＫＨＲＲ（２９６−２９９）ＡＡＡＡ、Ｅ９４Ａ、Ｄ９５Ａ、Ｎ１１７ Ｑ　ｔ−ＰＡ　：　ＦＲＩＫ（２７４−２７７）ＬＨＳＴ、ＫＨＲＲ（２９６− ２９９）ＡＡＡＡ、Ｅ９４Ａ。

Ｄ９５Ａ、８１０５Ｎ、Ａ１０７Ｓ　ｔ−ＰＡ：ＦＲＩＫ（２７４−２７７）Ｌ ＨＳＴ。

Ｋ４１６Ａ、Ｈ４１７Ａ、Ｅ４］８Ａ　ｔ−ＰＡ；ＦＲＩＫ（２７４−２７７） ＬＨＳＴ、Ｅ４２６Ａ、Ｒ４２７Ａ、に４２９Ａ、Ｅ４３０Ａ　ｔ−ＰＡ：ＦＲ ＩＫ（２７４−２７７）ＬＨＳＴ、に４２９Ｙ　ｔ−ＰＡｏＢ、変異体の構築 本発明のｔ−ＰＡアミノ酸配列変異体は好ましくは、野生型ｔ−ＰＡをコードす るＤＮＡ配列を突然変異させることによって構築される。一般には、ＤＮＡの特 定の領域又は部位を突然変異誘発のために標的化するものであり、従ってこれを 行うための一般的手法は部位特異的突然変異誘発と呼ばれる。このような突然変 異は、制限エンドヌクレアーゼ（特定の部位でＤＮＡを開裂する）、ヌクレアー ゼ（ＤＮＡを分解する）、及び／又はポリメラーゼ（ＤＮＡを合成する）などの ＤＮＡを改変する酵素を使用して行う。

１、単純な欠失及び挿入 ＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼで消化した後、連結させれば、サムプルツク（ Ｓａｍｂｒｏｏｋ　）らの１５．３項［Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、 　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　２版、　b。

ｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂａｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、ニュ ーヨーク（１９８９）］に記載されているように、欠失を生じさせることができ る。この方法を使用するためには、外来ＤＮ、へをプラスミドベクターに挿入す るのが好ましい。外来（挿入）ＤＮＡ及びベクターＤＮＡの両者の制限地図は利 用可能でなければならず、又は外来ＤＮＡ及びベクターＤＮＡの配列は知られて いなければならない。外来ＤＮＡは、ベクターには存在しないユニークな（唯一 の）制限部位を有していなければならない。次いで、適当な制限エンドヌクレア ーゼをその酵素の製造元が教示している条件下で使用し、これらのユニークな制 限部位間で消化し、外来ＤＮＡに欠失を施す。

使用する制限酵素が平滑末端又は適合する末端を生じさせるなら、バクテリオフ ァージＴ４　ＤＮＡリガーゼなどのりガーゼを使用し、ＡＴＰ及びサムプルツク ら（前掲）の１．６８項に記載されているりガーゼ緩衝液の存在下に１６℃で１ −４時間、得られた混合物をインキュベートすることにより、それらの末端は直 接に連結させることかできる。これらの末端が適合しない場合は、消化ＤＮＡの 突出した１本鎖末端を充填するために４つのデオキシリボヌクレオチド三リン酸 が必要であるＤＮＡポリメラーゼ■又はバクテリオファージＴ４　ＤＮＡポリメ ラーゼのクレノー断片を使用し、まず始めにそれらを平滑末端とする。あるいは 、これらの末端は、ＤＮＡの突出した１本鎖を切断（カッティング・バック）す ることにより共に機能するヌクレアーゼＳ１又はヤエナリ・ヌクレアーゼ（■曲 ｇ−ｂｅａｎ　ｎｕｃｌｅａｓｅ）などのヌクレアーゼを使用して平滑末端にす ることもできる。次いで、得られたＤＮＡをリガーゼを用いて再連結する。これ により得られた分子がｔ−ＰＡ欠失変異体である。

同様のストラテジーを使用することによって、サムプルツクら（前掲）の１５゜ ３項に記載されているように、挿入変異体を構築することができる。外来ＤＮＡ をユニークな制限部位（群）において消化した後、オリゴヌクレオチドを、外来 ＤＮＡが切断されたその部位に連結する。このオリゴヌクレオチドは、挿入する 所望のアミノ酸をコードするように設計したものであり、また直接に連結できる ように、消化した外来ＤＮＡの末端と適合する５′及び３°末端をさらに有して いる。

２、すりゴスクレオチド−媒介性突然変異誘発オリゴヌクレオチド特異的突然変 異誘発は本発明の置換変異体を製造するための好ましい方法である。これは、本 発明の欠失及び挿入変異体を簡便に製造するためにも使用できる。この手法は、 アデルマン（＾ｄｅ１ｍａｎ）らによって開示されて一般には、少なくとも２５ ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドを使用し、ｔ−ｐＡ分子の２つ又はそれ以上 のヌクレオチドを挿入、欠失又は置換する。最適なオリゴヌクレオチドは、突然 変異をコードするヌクレオチドのいずれかの側のヌクレオチドと完璧に適合する １２から１５のヌクレオチドを有している。これにより、オリゴヌクレオチドが １本ＭＤＮＡの鋳型分子と適切にハイブリダイズするようになる。このオリゴヌ クレオチドは、フレア（Ｃｒｅａ）ら［Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓ ｅｔ。

、　Ｕ、　Ｓ、＾、　７５．５７６５（１９７ｇ）］に記載されている手法など の当業者に周知の手法によって容易に合成することができる。

ＤＮＡ鋳型分子は、野生型ｃＤＮＡ　ｔ−ＰＡ挿入体を有するベクターの１本鎖 の形態である。この１本鎖の鋳型は、バクテリオファージＭ１３ベクター（市販 されているＭ１３＋ｅｐＬ８及びＭ１３ｍｐ１９が適当である）、又はベイラ（ Ｖｅｉｒａ）ら［１１ｅｔｈ、Ｅｎｚｙｍｏｌ、　１５３．３（１９ｇ？）］に 記載されている１本鎖ファージの複製起点を含有するベクターのいずれかから誘 導されるベクターによって作成することができるのみである。従って、突然変異 しようとするｃＤＮＡ　ｔ−ＰＡは、１本鎖の鋳型を創製するためにこれらのベ クターの１つに挿入しなければならない。１本鎖の鋳型の生産は、サムプルツク ら（前掲）の４．２１−４．４１項に記載されている。

野生型ｔ−ＰＡを突然変異するには、適当なハイブリダイゼーションの条件下で １本鎖ＤＮＡの鋳型分子とアニーリングする。次いで、ＤＮＡポリマー化酵素、 通常は大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片を加える。

この酵素は、突然変異を有するＤＮＡ鎖を合成するために、プライマーとしてオ リゴヌクレオチドを利用する。従って、ＤＮＡの１つの鎖がベクターに挿入され る野生型ｔ−ＰＡをコードしており、第２のＤＮＡの鎖が同じベクターに挿入さ れた突然変異形態のｔ−ＰＡをコードしているヘテロ二重ラセン分子が形成され る。次いで、このヘテロ二重ラセン分子を適当な宿主細胞、通常はＥ、ｃｏｌｉ 　Ｊ　Ｍ　１０１などの原核生物に形質転換する。得られた細胞を発育させた後 、それをアガロース平板にプレートし、３２−Ｐで放射線標識したオリゴヌクレ オチドプライマーを使用してスクリーニングし、突然変異されたｔ−ＰＡを含有 するコロニーを同定する。

そのようなコロニーを選択し、ｔ−ＰＡ分子に突然変異が存在しているかを確認 するため、ＤＮＡの配列決定を行う。

１つ以上のアミノ酸が置換されている突然変異体は、幾つかの方法の中の１つの 方法によって生成させることができる。ポリペプチド鎖中に複数のアミノ酸を近 接して一緒に配置させる場合は、所望のアミノ酸置換のすべてをコードする１つ のオリゴヌクレオチドを使用して同時に突然変異させることができる。しかし、 アミノ酸が互いに若干距離をおいて位置している場合（例えば、１ｏアミノ酸以 上で分割されている場合）は、所望の変化をすべてコードする単一のオリゴヌク レオチドを生成させるのは比較的困難である。その場合は代わりに、２つの代替 方法のいずれかを使用すればよい。第１の方法では、置換させる各アミノ酸毎に オリゴヌクレオチドを別々に創製する。次いで、それらのオリゴヌクレオチドを １本鎖鋳型ＤＮＡに同時にアニーリングすれば、この鋳型から合成された第２の ＤＮＡ鎖は所望のアミノ酸置換をすべてコードすることになる。別の方法は、２ つ又はそれ以上の突然変異誘発工程によって所望の突然変異体を生産することに 関する。第１工程は単一突然変異体について記載しているとおりの方法である； 野生型ｔ−ＰＡ　ＤＮＡを鋳型として使用し、第１の所望のアミノ酸置換（群） をコードするオリゴヌクレオチドをこの鋳型とアニーリングし、次いでヘテロ二 重ラセンＤＮＡ分子を生成させる。第２の突然変異誘発工程は、突然変異誘発の 第１工Ｗで調製した突然変異ＤＮＡを鋳型として使用する。従って、この鋳型は 既に１つ又はそれ以上の突然変異を含有している。次いで、付加的な所望のアミ ノ酸置換（群）をコードしているオリゴヌクレオチドをこの鋳型とアニーリング すると、得られるＤＮＡの鎖は、第１及び第２工穆の突然変異誘発の両者に由来 する突然変異を新たにコードすることになる。この得られたＤＮＡは、第３の突 然変異誘発工程、などにおいて鋳型として使用することができる。

ｔ−ＰＡ変異体をコードするＤＮＡをポリペプチドとして発現させるため、この ＤＮＡをベクターから切り取り、真核生物宿主細胞発現にとって適切な発現ベク ターに挿入する。長期の安定なｔ−ＰＡ生産のためには、チャイニーズハムスタ ー卵巣（ＣＨＯ）細胞が好ましい。しかし、本発明はＣＨＯ細胞におけるｔ−Ｐ Ａ変異体の発現に限定されるものでな（、特に、実験目的にｔ−ＰＡ変異体を一 時的にしか発現させる必要がない場合などは、多くの他の細胞型が使用できるこ とが知られている。

原核生物は、本発明の最初のクローニング工程にとって好ましい。原核生物は、 ＤＮＡの迅速な大量生産、部位特異的突然変異に使用される１本ＭＤＮＡの鋳型 の生産、多（の突然変異体の同時スクリーニング、及び生成される突然変異体の ＤＮＡの配列決定にとって特に有用である。適当な原核生物宿主細胞には、Ｅ、 ｃｏｌｉ（大腸菌）Ｋ１２株２９４　（ＡＴＣＣＮｏ、３１．４４６）　、Ｅ、 ｃｏｌｉ株Ｗ３１１０　（ＡＴＣＣＮｏ、２７．３２５）　、Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｘ １７７６　（ＡＴＣＣＮｏ。

３１．５３７）、及びＥ、ｃｏｌｉ　Ｂなどがある。しかし、ＨＢＩＯＩ、ＪＭ ｌｏｌ、ＮＭ５２２、ＮＭ５３８、ＮＭ５３９などのＥ、ｃｏｌｉの他の多くの 株、並びに他の多くの原核生物の種及び属も同様に使用することができる。

原核生物はＤＮＡ配列の発現のためにも宿主として使用できる。上記に挙げたＥ 、ｃｏｌｉ株の他、バフラス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉ ｓ）などのバシラス属、サルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　 ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕ■）又はセラチア・マルセサンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｍ ａｒｃｅｓａｎｓ）などの他の腸内細菌、及び種々のシュードモナス（Ｐｓｅｕ ｄｏｍｏｎａｓ）種などもすべて宿主として使用できる。

これらの宿主は、その宿主細胞と適合する種由来のレプリコン及び制御配列を含 有するプラスミドベクターと共に使用する。そのベクターは通常、複製部位、形 質転換された細胞内において表現型の選択性を付与するマーカー遺伝子、１つ又 はそれ以上のプロモーター、及び外来遺伝子を挿入するための幾つかの制限部位 を含有するポリリンカー領域を含有する。Ｅ、ｃｏｌｉの形質転換に通常使用さ れるプラスミドには例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＵｃ１８、ｐＵｃ１９、ｐＵｃ１ １８、ｐＵｃ１１９、及びブルースクリプト（Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）Ｍ　１３ などがあり、これらはすべてサムプルツクら（前掲）の１．１２−１．２０項に 記載されている。

しかし、多くの他の適切なベクターも同様に利用可能である。これらのベクター はアンピシリン及び／又はテトラサイクリン耐性をコードする遺伝子を含有して おり、それによりこれらのベクターによって形質転換された細胞はそれらの抗生 物質の存在下に発育することが可能となる。

原核生物ベクターに最も普通に使用されるプロモーターとしては、β−ラクタマ ーゼ（ベニンリナーゼ）及びラクトースプロモーター系［チェンジ（Ｃｈａｎｇ ）ら７７６号］、及びアルカリホスファターゼ系が挙げられる。これらは最も普 通に使用　゛ド配列に関する詳細も既に開示されており、当業者ならば、それら をプラスミドベクターに機能的に連結させることができる〔シーベンリスト（Ｓ ｉｅｂｅｎｌｉｓｔ）らの本発明の実施には、原核生物に加え、糸状菌又は酵母 などの真核微生物も適している。下等真核生物宿主の微生物の中では、サツカロ マイセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ）、又は普通のパン酵母が最も普通に使用される。しかし、他の多くの属、種及 び株が市販され、かつそれらは本発明に有用であり、例示すればシゾサッカロｖ イセス・ボムベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ）　［ Ｂｅａｃｈ及びＮｕｒｓｅ、　Ｎａｔｕｒｅ、　２９０：１４０（１９８１）　 ：　１９８５年５月２日公開のＥＰ　１３９゜３８３コ　：クルイベロマイセイ ス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）宿主（米国特許第４．　９４３゜５２９号： 　Ｆｌｅｅｒら、前掲）、例えばに、ラクチス（Ｋ、　１ａｃｔｉｓ）［ＭＷ９ ８−８　Ｃ。

ＣＢ５６８３．ＣＢ５４５７４　：Ｌｏｕｖｅｎｃｏｕｒｔら、Ｊ、Ｂａｃｔｅ ｒｆｏｌ、、７３７（１９８３）］、Ｋ。

フラジリス（Ｋ、ｆｒａｇｉｌｉｓ）　（ＡＴＣＣ１２，４２４）　、Ｋ、　ブ ルガリカス（Ｋ、　ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）（ＡＴＣＣ１６，０４５）、に、ウ ィッケラミイ（Ｋ、ｗｉｃｋｅｒａｍｉｉ）　（ＡＴＣＣ２４，１７８）：に、 ワルチイ（Ｋ、ｖａｌｔｉｉ）（ＡＴＣＣ５６，５００）　、Ｋ。

マルキサヌス（Ｉ［、ｍａｒｘｉａｎｕｓ）＋ｖａｒｒｏｔｉａ　［ＥＰ　４０ ２．　２２６］　：ビシア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ）　 ［Ｅ　Ｐ　１８３．　０７０　；　５ｒｅｅｋｒｆｃｈｎａら、Ｊ、ｈｓｉｃ　 １ｉｅｒｏｂｉｏ１．、２ｇ：２６５−２７７８（１９８ｇ）］　：カンジダ（ Ｃａｎｄｉｄａ）　；　トリコデル？−リエシア（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒ ｅｅｓｊａ）　［ＥＰ　２４４．　２３４］　：ニューロスポラ・クラッサ（Ｎ ｅｕｒｏｓｐｏｒａ　ｃｒａｓｓａ）　［Ｃａ５ｅら、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ 、Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ、　、　Ｕ、　Ｓ、＾、７６：５２５９−５Q６３（１９ ７９）］　＋ ７、ワンニオマイセス・オクシデンタリス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｓｅｓ　ｏ ｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）などのシュワンニオマイセス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｓ ｙｓｅｓ）属［１９９０年１０月３１日公開のＥＰ　３９４，５３８］　；及び 例えばニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ペニシリウム（ＰｅｎｉｃＨ ｌｉｕｍ）、トリボフラジラム（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｉ）などの糸状菌類 ［１９９１年１月１０日公開のＷｏ　９１１００３５７］及びアスペルギルス（ ＾ｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）宿主、例えばＡ、ニデユランス（＾、ｎ１ｄｕｌａｎ ｓ）　［Ｂａ１ｌａｎｃｅら、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ 、　Ｃｏｍｅｕｎ、　、上２：２８４−２８９（１９８３）　ＨＴｉ１ｂｕｒｎ ら、Ｇｅｎｅ、２６：２０５−２２１（１９８３）　；　ＹｅｌｔｏｎらAＰｒ 。

ｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　、　Ｕ、　Ｓ、＾、　８１　：１４７ ０−１４７４（１９８４）コ及びＡ、ニガー（＾、ｎｉｇｅ秩j　［Ｋｅｌｌ ｙ及び取ｎｅｓ、　ＥｉｌＢＯＪ、、　４：４７５−４７９（１９８５）］。

酵母ベクターにおける適当なプロモーター配列には、３−ホスホグリセレートキ ナーゼのプロモーター［ヒッツエマン（Ｈｉｔｚｅｓａｎ）らのＪ、　Ｂｉｏｌ 、　Ｃｈｅｗ、　２５５：２０７３（１９８０）］、又はエノラーゼ、グリセル アルデヒド−３−リン酸脱水素酵素、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシ ラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３− ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオセホスフエートイソ メラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ及び−などがある。適当な発現プラス ミドを構築するに当たっては、これらの遺伝子に付随する終止配列も、発現させ ようとする配列の３′側で発現ベクターに連結させ、５ＲＮＡのポリアデニル化 及び終止機能を付与する。発育条件によって転写が制御されるという付加的な利 点を有している他のプロモーターには、アルコール脱水素酵素２、イソチトクロ ームＣ１酸ホスフアターゼ、窒素代謝に関与する分解酵素、及び上記のグリセル アルデヒド−３−リン酸脱水素酵素、及びマルトースとガラクトースの利用に関 与する酵素、にががるプロモーター領域がある。

酵母に適合するプロモーター、複製起点及び終止配列を含有するプラスミドベク ターが好適である。

３、真核多細胞生物 本発明を実施するためには、多細胞生物由来の細胞培養も宿主として使用するこ とができる。を推動物及び無を推動物培養のいずれの由来であっても許容できる が、を推動物細胞培養、特に哺乳動物培養が好ましい。適当なセルラインとして は例えば、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎ＣＶＩライン［Ｃ０８−７、 ＡＴＣＣＣＲＬ　１６５１１　；ヒト腎肝ライン２９３　Ｓ　［Ｇｒａｈａｓら 、　Ｊ、ＧｅｎＪｉｒｏｌ、、３６：５９（１９７７）］：幼若ハムスター腎細 胞［ＢＨＫ、　ＡＴＣＣＣＣＬ　１０］　；チャイニーズハムスター卵巣細胞［ Ｕｒｌａｂ　ａｎｄ　Ｃｈａｓｉｎ、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　５ｅ ｔ１．　Ｕ、　Ｓ、＾７７：４２１６（１９８０）］@；　７ウス・ セルトリ細胞（ａｒｏｕｓｅ　５ｅｒｔｏＨ）［ＴＭ　４　、蓋ａｔｈｅｒ、　 Ｂｉｏｌ、　Ｒｅｐｒｏｄ、　、　２３：２４３（１９８０j］　： サル腎細胞［ＣＶＩ−７６、ＡＴＣＣＣＣＬ７０］；７フリカミｌ”Ｊｆｚ１４ １１１胞［ＶＥＲＯ−７６，ＡＴＣＣＣＲＬ　１５８７］　；ヒト子宮癌細胞［ ＨＥＬＡ、　ＡＴＣＣＣＣＬ　２］　；　イヌ腎細胞［ＭＤＣＫ、　ＡＴＣＣＣ ＣＬ　３４］　：　／（、ｙ７ｙ□　−・５　ソト肝細胞［ＢＲＬ　３Ａ、　Ａ ＴＣＣＣＲＬ　１４４２］　：　ヒト肺細胞［Ｗｌ　３８．　ＡＴＣＣＣＣＬ　 ７５］　；　Ｉ＝ト肝細胞［Ｈｅｐ　Ｇ　２．　ＦＩＢ　８０６５］、マウス乳 房腫瘍細胞［ＭＭＴ　０６０５６２．ＡＴＣＣＣＣＬ　５１］　；　５　ット肝 癌細胞［ＨＴＣ，Ｍｌ、５４．ボウマン（Ｂａｕ＋ａａｎｎ）らのＪ、　Ｃｅ１ ｌ　Ｂｔｏｌ、　、　８５：１（１９８０）］　；及びＴＲＩ細胞［Ｍａｔｈｅ ｒらの＾ｎｎａｌｓ　Ｎ、　Ｙ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　、　３８３：４４（１ ９８２）］が挙げられる。これらの細胞のための発現ベクターは普通、（要すれ ば）複製起点、発現すべき遺伝子の前に位置するプロモーター、リポソーム結合 部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位、及び転写ターミネータ一部 位のＤＮＡ配列を含有している。

哺乳動物発現ベクターに使用されるプロモーターは、ウィルス起源のものが多い 。これらウィルスプロモーターは普通はポリオーマウィルス、アデノウィルス２ 、及び最も頻繁にはアスペルギルス４０　（ＳＶ４０）から誘導される。ＳＶ４ ０ウィルスは初期及び後期プロモーターと呼ばれる２つのプロモーターを含有す る。これらのプロモーターは共にウィルスの複製起点をも含有する１つのＤＮＡ 断片として該ウィルスから容易に入手されるので、特に有用である［フィールズ （Ｆｉｅｒｓ）らのＮａｔｕｒｅ、２７３：１１３（１９７８）］、また、それ よりも小さな又は大きなＳＶ４０　ＤＮＡ断片も、このウィルスの複製起点内に 位置するＨｉｎｄｌｌ［部位からＢｇ１１部位に伸長する約２５０ｂｐ配列を含 有する限りは、使用することができる。さらに、形質転換のために選択する宿主 セルラインと適合する限りは、外来遺伝子に天然で伴われているプロモーター（ 同種プロモーター）を使用することもできる。

複製起点は、ＳＶ４０又は他のウィルス（例えば、ポリオーマ、アデノ、ＶＳＶ 、ＢＰＶ）などの外因性供給源から入手することができ、それをクローニングベ クターに挿入すればよい。あるいは、複製起点は宿主細胞の染色体の複製メカニ ズムによって付与することができる。外来遺伝子を含有するベクターが宿主細胞 の染色体に組み込まれるなら、後者で十分である場合が多い。

ヒトｔ−ＰＡは形質転換された細胞培養から満足のいく量で生産される。しかし 、第２のコード化配列を使用すれば、さらに生産レベルを向上させることができ る。

この第２のコード化配列は通常、ジヒドロ葉酸還元酵素（Ｄ　ＨＦ　Ｒ）を含有 するものである。野生型のＤＨＦＲは正常では化学物質メトトレキサ−１−（Ｍ ＴＸ）によって阻害される。細胞内のＤＨＦＲ発現レベルは、培養宿主細胞に加 えるＭＴＸの量によって変動する。ＤＨＦＲを第２の配列として特に有用として いるさらなる性質は、それが形質転換細胞を同定するための選択マーカーとして 使用できることである。

ＤＨＦＲを第２の配列として使用するには、野生型ＤＨＦＲ及びＭＴＸ−耐性Ｄ ＨＦＲの２つの型が利用できる。個々の宿主細胞で使用されるＤＨＦＲの型は、 宿主細胞がＤＨＦＲ欠損であるか否か（例えば、非常に低いレベルでしかＤＨＦ Ｒを内生的に産生じないか、又は機能的ＤＨＦＲを全く産生じないか）によって 決定される。ウルローブ及びチャシン（Ｕｒｌａｕｂ及びＣｈａｓｉｎ）の［Ｐ ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、Ｕ、ｓ、＾、　７７：４２１６ （１９８０）］に記載されているＣＨＯセルラインなどのＤＨＦＲＨＦ上ルライ ンを野生型ＤＨＦＲコード化配列で形質転換する。形質転換された後では、これ らのＤＨＦＲＨＦ上ルラインは機能的なりＨＦＲを発現し、ヒポキサンチン、グ リツジ及びチミジン栄養素を欠く培養培地中で増殖することができる。形質転換 されていない細胞はこの培地中では生存しない。

ＭＴＸ耐性型のＤＨＦＲは、ＭＴＸ感受性の機能的ＤＨＦＲを正常な量で内生的 に産生ずる宿主細胞の中から形質転換宿主細胞を選択する手段として使用できる 。ＣＨＯ−Ｋｌセルライン（ＡＴＣＣＮｏ、ＣＬ　６１）はこれらの特性を有し ており、従ってこの目的にとって有用なセルラインである。細胞培養培地にＭＴ Ｘを添加すれば、ＭＴＸ耐性ＤＨＦＲをコードするＤＮＡで形質転換された細胞 のみを発育させることができる。形質転換されていない細胞はこの培地中で生存 することはできない。

本発明の変異体を生産するために使用される哺乳動物宿主細胞は種々の培地中で 培養することができる。この宿主細胞を培養するには、Ｈａｍ’ｓ　Ｆ　１０　 ［シグマ］、最小必須培地（［ＭＥＭ］、ジグ７）　、ＲＰＭ［−１６４０［ジ グ７］、及びダウベッコ改変イーグル培地（［ＤＭＥＭ］　、シグマ）が適当で ある。さらに、Ｆ１ａｆｆ１及びＷａｌｌａｃｅ　［Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚ、、　５ ８：４４（１９７９）］　、Ｂａｒｎｅｓ及び５ａｔｏ　［Ａｎａｌ、aｉｏｃ ｈ ｅｍ、襄：２５５（１９８０月、米国特許第４．７６７．７０４号；第４．　６ ５７．　８６６号：第４．９２７．７６２号；又は第４．５６０．６５５号；Ｗ Ｏ９０１０３４３０：ＷＯ８７１００１９５：米国特許Ｒｅ、３０．９８５；又 は米国特許第５゜１２２．４６９号に記載されているいずれの培地もこの宿主細 胞の培養培地として使用できる。これらの培地にはいずれも、ホルモン及び／又 は他の成長因子（例えば、インスリン、トランスフェリン、又は上皮性成長因子 ）、塩（例えば塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸）、緩衝 液（例えば、ＨＥＰＥＳ）、ヌクレオシド（例えば、アデノシン及びチミジン） 、抗生物質（例えば、ゲンタマイシン）、微量元素（通常は終濃度がマイクロモ ル濃度の範囲で存在する無機化合物と規定されるもの）、及びグルコース又はそ れと等価のエネルギー供給源を、要すれば添加することができる。他の必須の添 加物質であっても、当業者に知られている適当な濃度で含有させることもできる 。

４、分泌系 細胞から２ｉ！常分泌される多くの真核生物タンパク質は、内生のシグナル配列 をそのアミノ酸配列の一部として含有している。この配列は小胞体及びゴルジ装 置を介して細胞からタンパク質を輸出させる。このシグナル配列は通常タンパク 質のアミノ末端に位置しており、約１３から約３６のアミノ成長の範囲にある。

実際の配列はタンパク質毎に異なっているが、既知のすべての真核生物シグナル 配列は、そのシグナル配列の中心付近に高い疎水性強度の１０−１５アミノ酸（ 通常はアミノ酸ロイノン、イソロイシン、アラニン、バリン及びフェニルアラニ ンに豊富である）及び少な（とも１つの正に帯電した残基を含有している。この シグナル配列は、タンパク質が小胞体中に移動する際に小胞体上に存在するシグ ナルペプチダーゼによって開裂されるので、分泌形態のタンパク質からは除去さ れているのが普通である。そのシグナル配列が依然として結合しているタンパク 質は、「プレタンパク質」又は非成熟型のタンパク質と呼ばれることが多い。

しかし、分泌されるタンパク質のすべてが、開裂されるアミノ末端シグナル配列 を含有しているわけでない。オバルブミンなどのある種のタンパク質は、タンパ ク質の内部領域に位置するシグナル配列を含有している。この配列は移動の際に 正常では開裂されない。

細胞質中に通常見いだされるタンパク質は、そのタンパク質にシグナル配列を連 結させることにより分泌させることができる。このことは、シグナル配列をコー ドするＤＮＡを、タンパク質をコードするＤＮＡの５°末端に連結し、次いでこ の融合タンパク質を適当な宿主細胞において発現させることにより、容易に実施 することができる。シグナル配列をコードするＤＮＡは、シグナル配列を有する タンパク質をコードするあらゆる遺伝子から制限断片として入手できる。従って 、本発明を実施するために利用する宿主細胞の型に応じて、原核生物、酵母、及 び真核生物シグナル配列を本発明では使用できる。遺伝子のシグナル配列部分を コードするＤＮＡは適当な制限エンドヌクレアーゼを使用して切除され、次いで それを、分泌させようとするタンパク質、即ちｔ−ＰＡをコードするＤＮＡに連 結する。

機能的なシグナル配列の選択には、シグナル配列が宿主細胞シグナルペプチダー ゼによって認識される結果、シグナル配列の開裂及びタンパク質の分泌が起こる ことが要件となる。幾つかの真核生物遺伝子のシグナル配列部分をコードするＤ ＮＡ及びアミノ酸配列は既知であり［例えば、ヒト成長ホルモン、プロインスリ ン、及びプロアルブミン（ＳｔｒｙｅｒのＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　Ｗ、　 ＨｌＦｒｅｅｍａｎ　ａｎｄ　Ｃｏｍｐａｎｙ。

ニューヨーク（１９８８）、　７６９頁を参ＩＩＱ）］、これらは適当な真核生 物宿主細胞においてシグナル配列として使用することができる。例えば、酸ホス ファターゼ［ＡｒｉｍａらのＮｕｃ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　、　１１：１６５ ７（１９８３月、α−因子、アルカリホスファターゼ及びインベルターゼなどの 酵母シグナル配列は、酵母宿主細胞から直接に分泌させるため使用できる。例え ば、Ｌａａ＋Ｂ又はＯ＋ｉｐＦ　［ｆｏｒ＋ｇらのＧｅｎｅ　６８：１９３１９ ８８］　、ＭａｌＥ、ＰＨｏＡ、又はβ−ラクタマーゼをコードする遺伝子、並 びに他の遺伝子由来の原核生物シグナル配列は、原核生物細胞から培養培地にタ ′７バク賞を向かわせるのに使用できる。

目的のタンパク質が分泌できるようにするたムにそれにシグナル配列を付与する 別の手法は、シグナル配列をコードするＤＮＡを化学的に合成することである。

この方法では、選択したシグナル配列をコードするオリゴヌクレオチドの測鎖を 化学的に合成し、次いで互いにアニーリングさせて二重ラセンを形成させる。次 に、得られた２本鎖オリゴヌクレオチドを、タンパク質をコードするＤＮＡの５ °末端に連結させる。

次いで、タンパク質をそれに連結されたシグナル配列と共にコードしているＤＮ Ａを含有する構築物を適当な発現ベクターに連結すればよい。この発現ベクター を適当な宿主細胞に形質転換し、目的のタンパク質を発現させ、分泌させる。

Ｄ、形質転換方法 哺乳動物宿主細胞及び、頑強な細胞膜障壁を有していない他の宿主細胞の培養物 は、グラハム（Ｇｒａｈａ＋ｍ）及びフォノ・デル（Ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ）　 ［ＶｉｒｏｌｏｇＹ　５２．５４６（１９７８）］に最初に開示され、サムプル ツクら（前掲）の１６．３２−１６．３７項にて改変を施されたリン酸カルシウ ム法によって普通は形質転換される。しかし、ボリブデン（Ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ ）　［Ｋａｗａｉ及びＮｉＮ１５ｈｉＺａ、　Ｍｏ１．　Ｃｅ１ｌ、　Ｂｉｏｌ 、　、　４：１１７２（１９W４）］、 プロトプラスト融合［５ｃｈａｆｆｎｅｒ、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、 　Ｓｃｉ、　、　Ｕ、Ｓ、＾、　７７：２１６３（１９８０j］、 接的マイクロインンエクンヨン［Ｃａｐｅｃｃｈｉ、　Ｃｅ１１．２２：４７９ （１９８０）］などの、ＤＮＡを細胞に導入するための他の方法も使用できる。

酵母宿主細胞は、ハイホン（Ｈｉｎｎｅｎ）のＰｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ 、Ｓｃｉ、　、　Ｕ、　Ｓ、＾、、７５：１９２９−１９３３（＋９７８）に記 載されているように、ポリエチレングリコール法によって形質転換するのが一般 的である。

原核生物細胞又は頑強な細胞膜を有する細胞を形質転換するには、サムプルツク ら（前掲）の１．８２項に記載されている塩化カルシウム法によって行うのが好 ましい。また、これらの細胞を形質転換するにはエレクトロポレーションも使用 できる。

Ｅ、クローニング法 複製配列、調節配列、表現型選択遺伝子をコードするＤＮＡ及び目的の外来ＤＮ Ａを含有する適当なベクターの構築には、標準的な組換えＤＮＡ手法を使用する 。単離したプラスミド及びＤＮＡ断片を開裂し、仕立て、そして特定の順序で互 いに連結し、所望のベクターを生成させる。

ＤＮＡの開裂は、適当な緩衝液中にて適当な制限酵素又は酵素群を使用して行う 。一般には、緩衝溶液約２０μｌ中、適当な制限酵素約１−２単位と共に、プラ スミド又はＤＮＡ断片約０．２−１μｇを使用する（適当な緩衝液、ＤＮＡ濃度 、及びインキュベート時間及び温度は、その制限酵素の製造元によって特定され ている）。一般には、３７℃での約１又は２時間のインキュベート時間が適当で あるが、酵素の中にはそれよりも高い温度が必要なものがある。インキュベート した後に、フェノール及びクロロホルムの混液で消化溶液を抽出することによっ て酵素及び他の夾雑物を除去し、次いでエタノール沈殿によってその水性画分か らＤＮＡを回収する。

ＤＮＡ断片を共に連結して機能的ベクターを形成させるためには、それらＤＮＡ 断片の末端は互いに適合していなければならない。ある場合には、エンドヌクレ アーゼ消化後に末端は直接的に適合性となる。しかし、エンドヌクレアーゼ消化 によって普通に生成される粘着末端を連結適合性にするために、それをまず平滑 末端に変換する必要のある場合がある。末端を平滑末端にするためには、４つの デオキシヌクレオチド三リン酸の存在下、ＤＮＡポリメラーゼ■のクレノー断片 （クレノー）１０単位と共に少な（とも１５分間、１５℃において適当な緩衝液 中でＤＮＡを処理する。次いで、それをフェノール−クロロホルム抽出し、エタ ノール沈殿して精製する。

開裂させたＤＮＡ断片は、ＤＮＡゲル電気泳動によってサイズ分離し、選択する ことができる。ＤＮＡはアガロース又はポリアクリルアミドマトリックスのいず れかによって電気泳動できる。マトリックスの選択は、分離しようとするＤＮＡ 断片のサイズ（大きさ）に左右される。電気泳動した後に、電気溶離（ｅｌｅｃ ｔｒｏｅｌｕｔｊｏｎ）によってＤＮＡをマトリックスから抽出するか、あるい は低融解アガロースをマトリックスとして使用した場合は、サムプルツクら（前 掲）の６．３０−６．３３項に記載されているようにしてアガロースを融解し、 それからＤＮＡを抽出する。

互いに連結させようとするＤＮＡ断片（適当な制限酵素で消化しておき、それぞ れの断片の連結末端を適合させておく）は、等モル量で溶液中に存在させる。

この溶液はＡＴＰ、リガーゼ緩衝液及びリガーゼ、例えばＤＮＡ０．５μｇ当た りＴ４ＤＮＡリガーゼ約１０単位をさらに含有する。ＤＮＡ断片をベクタニに連 結する場合は、適当な制限エンドヌクレアーゼ（群）によってそのベクターを切 断してまず線状化し、次いで細菌アルカリホスファターゼ又は子牛腸内アルカリ ホスファターゼのいずれかでリン酸化する。この操作によって、開裂したベクタ ーが連結工程の際に自己連結するのを防止できる。

連結した後に、新たに外来遺伝子が挿入されたベクターを適当な宿生細胞、最も 普通にはＥ、ｃｏｌｉ　Ｋ　１２株２９４（＾ＴＣＣ番号３１．４４６）又は別 の適当なＥ、ｃｏｌｉ株などの原核生物に導入する。形質転換された細胞は、抗 生物質、普通はテトラサイクリン（ｔｅｔ）又はアンピシリン（ａ＋ａｐ）と共 に増殖させることにより、ベクタ−内のｔｅｔ及び／又はａ■ｐ耐性遺伝子のお かげでそれらに対して耐性になっているものが選択される。連結混合物によって 真核生物宿主細胞を形質転換した場合は、形質転換細胞は上述のＤＨＦＲ／ＭＴ Ｘ系によって選択できる。形質転換細胞は培養物中で増殖させ、次いでプラスミ ドＤＮＡ　（プラスミドは、目的の外来遺伝子に連結されたベクターを意味する ）を単離する。このプラスミドＤＮＡは次に、制限マツピング及び／又はＤＮＡ 配列決定によって分析する。ＤＮＡの配列決定かによって分析される。

哺乳動物宿主細胞をＤＮＡで安定に形質転換した後、その宿主細胞培養をＭＴＸ 約２００−５００ｎＭ濃度の存在下で増殖させ、それによりＤＨＦＲタンパク質 をコードしている配列の増幅を行う。ＭＴＸの有効な濃度範囲は、ＤＨＦＲ遺伝 子及びタンパク質の本質、及び宿主の特性に非常に左右される。一般に規定され る上限及び下限は明瞭には確認することができない。他の葉酸同族体又は、ＤＨ ＦＲを阻害する他の化合物も適当な濃度で使用することができる。しかし、ＭＴ Ｘそれ自体が簡便であり、容易に利用でき、かつ有効である。

上述のように、ｔ−ＰＡ変異体は、部位特異的突然変異の方法を使用し、突然変 異（群）を生成させることによって製造するのが好ましい。この方法では、所望 の突然変異の配列をコードする特定のオリゴヌクレオチド及び、そのオリゴヌク レオチドがＤＮＡの鋳型と安定にハイブリダイズできるほどに十分な数の隣接ヌ クレオチド、を合成し、使用することが必要である。

Ｆ、医薬組成物 本発明のｔ−ＰＡ産物を医薬的に許容され得る担体との混合物中で混合すること により、本発明の化合物は医薬的に有用な組成物を調製するための既知の方法に よって製剤化することができる。適当な担体及び製剤化法は、オスロー（Ｏｓｌ ｏ）ら編のＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒａ＋ａｃｅｕｔｉｃａｌ　５ｃｉ ｅｎｃｅｓ　１６版、１９８０　［マック魯パブリッシングラ、〕に記載されて いる。このような組成物は通常、患者に効果的に投与するのに適した医薬的に許 容される組成物が調製されるように適量のビヒクルと共に、本発明のｔ−ＰＡ変 異体を有効量で、例えば約０．　５から約５讃ｇｋｌで含有している。本発明の ｔ−ＰＡ変異体は、心臓血管の疾患又は症状の患者に非経口的に、又はその有効 な型が血流に供給されるような他の方法によって投与することができる。

本発明を実施する上で使用されるｔ−ＰＡ変異体を臨床的に投与するのに特に適 している組成物には、例えば滅菌水溶液剤、又は凍結乾燥タンパク質などの滅菌 水和性の粉末剤などがある。このような製剤中にはさらに、医薬的に許容される 塩を適量使用し、製剤の等強性を変化させるのが通常である。アルギニン塩基な どの緩衝剤も、適当なｐＨ，一般にはｐＨ５，５−７，５を維持するに適当な濃 度でリン酸と共に含有させるのが通常である。さらに又はあるいは、貯蔵寿命を 維持、長引かせるために、グリセリンなどの化合物も含有させることができる。

本発明の医薬組成物の投与量及び望ましい薬物濃度は、目的とする個々の用途に 応じて変動し得る。例えば、深部静脈血栓又は末梢血管疾患の処置に当たっては 、約０．０５から約０．２ｍｇ／ｋｇオーダーの「ポーラス」投与が通常好まし く、その後は、血中レベルがほぼ一定に、好ましくは約３ｔｔｇｈｌのオーダー が維持されるよう約０．１から約０．２ｍｇ／ｋｇの投与を行うのが好ましい。

しかし、一般に潅流（ｉｎｆｕｓｉｏｎ）が行えない場面である緊急医療に関連 して使用するためには、及び処置する疾患が一般に危険性を孕む場合（例えば、 塞栓症、心筋梗塞）には、多めの初期投与量、例えば約０．３麿ｇ／ｋｇオーダ ーの静脈内ポーラス投与が通常望ましい。

例えば、本発明のｔ−ＰＡ変異体は、心臓血管の疾患又は症状に罹患した患者に 非経口的に投与するのが適切である。投与量及び投与速度は、他の心臓血管薬、 血栓溶解薬が臨床試験で通常使用されているものと同等又は高い場合があり、例 えば心筋梗塞、肺塞栓症などに罹患したヒト患者では、約１−２ｍｇ／ｋｇ体重 で１．５−１２時間かけて静脈内又は動脈内投与を行えばよい。

適当な投与剤形の１例として、５Ｑｉｇ　ｔ−ＰＡ、アルギニン、リン酸、及び ポリソルベート８０を含有するバイアルを滅菌水５０ｍ１により注射用に再構成 し、それを適量の０．９％塩化ナトリウム注射液と混合することが挙げられる。

本発明のｔ−ＰＡ変異体はフィブリン沈着又は接着の形成もしくは再形成を防止 するためにも有用である。この用途の１態様は、１９８９年１月４日公開のＥＰ ｏ　２９７．８６０に記載さねている。一般には、このタイプの処置は、可能性 あるフィブリン又は接着形成の部位に治療学的有効量のｔ−ＰＡ変異体がおよそ ３日から２週間にわたって持続的に放出されるような難溶性の形態で含有される 組成物をその部位に局所投与することを包含する。ｔ−ＰＡ変異体は通常、手術 、感染、外傷又は炎症後に形成されるフィブリン沈着又は接着形成を予防するに 充分な投与量で投与する。その量は普通、０．０２露ｇ／ｇのゲルから２５ｍｇ ／ｇのゲルであり、０．２０ｙｓｇ／ｇから約２．５麓ｇ／ｇのゲルが好ましく 、最も好ましくは０．２５＋＋ｇ／ｇから約１．０ｍｇ／ｇのゲルである。接着 形成及び／又はフィブリン沈着を防止するために使用する各ｔ−ＰＡ変異体は、 可能性ある接着形成の部位にｔ−ＰＡ酵素を位置させるための半固形の粘液質の 製薬的に不活性な担体中で製剤化するのが普通である。このような担体には、改 変された飽和及び不飽和脂肪酸グリセリドの混合物又は改変された飽和及び不飽 和脂肪酸グリセリドの混合物から構成される長鎖の炭化水素又は植物油及びワッ クスなどがある。例えば、ワセリン又は半合成グリセリドなどの半固形ビヒクル 、グリセロールなどのポリヒドロキシ溶媒、長鎖炭化水素、生体侵食性ポリマー （ｂｉｏｅｒｏｄａｂｌｅ　ｐｏｌｙｍｅｒｓ）、又はリポソームなどが挙げら れる。

以下に記載する実施例を平易にするため、通常使用される特定の方法は以下の用 語を用いて表現している。

「プラスミド」は、小文字のｐの後ろにアルファベットの名称を付して表してい る。本発明に使用する出発プラスミドは市販されているか、制限無く公に入手可 能となっており、又はそのような入手可能なプラスミドから文献開示の方法によ って構築することができる。さらに、他の同等のプラスミドも当業界で知られて おり、当業者には明らかである。

ＤＮＡの「消化」、「切断」又は「開裂」とは、ＤＮＡ内のある特定の場所での み働く酵素によってそのＤＮＡを触媒的に開裂することを意味する。このような 酵素は制限エンドヌクレアーゼと呼ばれ、各酵素が開裂するＤＮＡ配列に沿った 部位は制限部位と呼ばれる。本発明で使用している制限酵素は市販されており、 その供給元から提示されている教示に従って使用される。制限酵素は、大文字の 後ろに各制限酵素が得られる微生物を表す２又は３つの小文字を付して構成され る略語によって呼称される。これらの文字の後ろには、次に個々の酵素を示す１ 又はそれ以上のローマ数字が付される。一般に、プラスミド又はＤＮＡ断片約１ μｇを緩衝溶液約２０μｌ中、酵素約２単位と共に使用する。個々の制限酵素に とって適当な緩衝液、基質濃度、インキュベート温度、及びインキュベート時間 は製造元が特定している。インキ；ベートした後、フェノール−クロロホルム溶 液による抽出によってＤＮＡから酵素及び他の夾雑物を除去し、エタノール沈殿 によって、消化されたＤＮＡを水性画分から回収する。制限酵素による消化の後 には、細菌アルカリホスファターゼ又は子牛腸内アルカリホスファターゼで処理 する。これは、別のＤＮＡ断片がその制限部位に挿入するのを妨げかねない「環 状化」又は閉じたループの形成から、ＤＮＡ断片の２つの制限開裂末端を護るた めのものである。しかし、特に明記しない限りは、プラスミドの消化後には５゜ 末端の脱リン酸化は行わない。脱リン酸化のためのこれらの操作法及び試薬はサ ムプルツクら（前掲）の１．６０−１．６１項及び３．３８−３．３９項に記載 されている。

特定のＤＮＡ断片を制限消化物から「回収」又は「単離」するとは、ポリアクリ ルアミド又はアガロースゲルを使用する電気泳動法により、得られたＤＮＡ断片 を分離し、目的とする断片を既知の分子量のマーカーＤＮＡ断片の移動度と比較 してその同定を行い、所望の断片を含有するゲル切片を取り出し、そしてＤＮＡ からゲルを分離することを意味する。この操作法は一般に既知である。例えば、 「サザーン分析」とは、既知の櫟識化オリゴヌクレオチド又はＤＮＡ断片とハイ ブリダイズすることにより、消化物又はＤＮＡ含有組成物中のＤＮＡ配列の存在 を確かめる方法である。サザーン分析とは、サザーン（Ｅ、　５ｏｕｔｈｅｒｎ ）のＪ、　１ｌｏ１．　Ｂｉ吐竪：５０３−５１７（１９７５）に記載され、サ ムプルツクら（前掲）の９．　３１−９．５７項に改変された方法により、アガ ロースゲル上にて消化ＤＮＡを分離し、そのＤＮＡを変性させ、そしてそのゲル 由来のＤＮＡをニトロセルロース又はナイロン属に移動させることを意味する。

「形質転換」とは、ＤＮＡが染色体外要素または染色体酸分として複製できるよ うにそのＤＮＡを生物に導入することを意味する。形質転換するために使用する 方法は、宿主細胞が真核生物であるか、又は原核生物であるかによって変わる。

Ｒ核生物を形質転換する方法はサムプルツクら（前掲）のＪ、８２項に記載され ている塩化カルシウム法である。真核生物は、サムプル・ツク（前掲）らの１６ ゜３２−１６　３７項に記載されているリン酸カルシウム法によって形質転換さ れる。

「連結」とは、ＡＴＰをも含有している適当な緩衝液中、リガーゼ酵素を使用し て、２つの２本鎖ＤＮＡ断片間にホスホジエステル結合を生成させる工程を意味 する。

「オリゴヌクレオチド」は、ホスホジエステル結合によって結合されているデオ キシリボヌクレオチドの短い長さの１本鎖又は２重鎖配列を意味する。このオリ ゴヌクレオチドは既知の方法によって化学的に合成され、ポリアクリルアミドゲ ル上にて精製される。

以下に、本発明を実施する上で現在知られている最も最良の方法を説明するため に実施例を挙げるが、これは本発明の限定を意図するものではない。

ｔ−ＰＡ突然変異体を作成するためのベクターとしてプラスミドｐＲＫ７を使用 した。ｐＲＫ７は、Ｃ１ａｌ及びＨｊｎｄｌＩＩ間のポリリンカー領域内のエン ドヌクレアーゼ制限部位の順序が逆である以外はｐＲＫ５　［１９８９年３月１ ５日公開のＥＰ公開番号第３０７．２４７号］と同一である。このベクターに挿 入するためのｔ−ＰＡ　ｃＤＮＡ　［ペニカ（Ｐｅｎｎｉｃａ）らのＮａｔｕｒ ｅ　３０１　：２１４（１９８３）］を、制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄｌｌ ！　（ＡＴＧ開始コドンの５゛側４９６塩基対を切断する）及び制限エンドヌク レアーゼＢａ１ｌ　（ＴＧＡ終止コドンの下流２７６塩基対を切断する）で切断 することにより調製した。このｃＤＮＡを、サムプルツク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ） ら（前掲）の１．６８−１．６９項に記載されている標準的な連結法を使用し、 Ｈｉｎｄｌｌｌｆ及び５ｅａｌで前もって切断しておいたｐＲＫ７に連結した。

得られた構築物をｐＲＫ、ｔ−ＰＡと命名した。第１図を参照。

Ｉｆ、ｐＲＫ７−ｔ−ＰＡの部位特異的突然変異アメルシャン・コーポレーショ ン（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）から入手されるキット（カタ ログ番号ＲＰＮ　１２５３）を使用し、ティラー（Ｔａｙｌｏｒ）らのＮｕｃｌ 、、＾ｃｉｄｓ、　Ｒｅｓ、　、　１３：８７６５（１９８５）の方法によって ｔ−ＰＡ　ｃＤＮＡの部位特異的突然変異を行った。所望の突然変異を生成させ るため、所望のアミノ酸置換をコードする配列を有するオリゴヌクレオチドを合 成し、それをプライマーとして使用した。

デオキシリボアデノシン（ｄＡＴＰ）　、デオキシリボグアノシン（ｄＧＴＰ） 、及びデオキシリボチミジン（ｄＴＴＰ）の３つのデオキシリボヌクレオチドの 混合物を、上記キットの製造元から供されているそのキット中のｄＣＴＰ（ａＳ ）と呼ばれる改変チオ−デオキシリボシトシンと混合し、それを標準的な方法［ Ｖｉｅｒａら。

菖ｅｔｈ、Ｅｎｚ、、　１４影３（１９８７）コによって調製した１重鎖ｐＲＫ ７−ｔ−ＰＡに加えてオリゴヌクレオチドとアニーリングさせた。

この混合物にＤＮＡポリメラーゼを加えると、突然変異された塩基以外はｐＲＫ ７−ｔ−ＰＡと同一のＤＮＡの鎖が生成した。さらに、この新たなりＮＡの鎖は ｄＣＴＰの代わりに、それが制限エンドヌクレアーゼ消化されることから保護す るのに役立つｄＣＴＰ（ａＳ）を含有していた。得られた２本鎖へテロ二重鎖の 鋳型の鎖に適当な制限酵素により切れ目にツク）を作成した後、その鋳型の鎖を 、突然変異オリゴマーを含有している領域を通過するようＥｘａｍヌクレアーゼ によって消化した。次いで、この反応を停止させ、部分的にしか１本鎖でない分 子を残した。次に、４つすべてのチオキシリポヌクレオチド３リン酸、ＡＴＰ、 及びＤＮＡリガーゼの存在下にＤＮＡポリメラーゼにより、完全な２本鎖ＤＮＡ のベテロニ重鎖分子を形成させた。

ＦＲＩＫ（２７４−２７７）ＬＨ５Ｔ　ｔ−ＰＡを製造するために使用したオリ ゴヌクレオチドは次のものである： ５°ＧＧＣＧ＾＾６＾ＧＣＣＣＴＣＣＧＧＴＡＧＡＧＴＧＴＡＡＣＴＧＡＧＧＣ ＴＧＧＣＴＧＴ＾３゜■　細菌形質転換及びＤＮＡ調製 標準的な塩化カルシウム法［Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前掲）の１．７６−１．８４ 項］を使用し、上記プロトコールを使用して作成した突然変異ｔ−ＰＡ構築物を Ｅ、ｃｏｌｉ宿主株ＭＭ　２９４　ｔｏｎＡに導入することにより、コンピーテ ントな細胞を調製し、その形質転換を行った。ＴｎｌＯ）ランスポゾンをｔｏｎ 　Ａ遺伝子に挿入した後、不正確に切除することにより、Ｅ、ｃｏｌｉ株ＭＭ　 ２９４　ｔｏｎＡ　（これはＴ１ファージに耐性である）を調製した。次いで、 この遺伝子をトランスポゾン挿入突然変異［ＫｌｅｃｋｎｅｒらのＪ、　Ｍｏ１ ．　Ｂｉｏｌ、　、　１１６：１２５−１５９（１９７７）］を使用し、）：、 ｃｏｌｉ宿主ＭＭ２９４（＾ＴＴＣＮｏ、　３１．４４６）に挿入した。

Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前掲）の１．２５−１．３１項に記載されている標準的な ミニブレプ法を使用し、個々の細菌形質転換体コロニーからＤＮＡを抽出した。

得られたプラスミドをセファクリルＣＬ６Ｂスピンカラムに通してさらに精製し 、次いでＤＮＡ配列決定並びに制限エンドヌクレアーゼ消化及びアガロースゲル 電気泳動によって分析した。

■、真核生物細胞の形質転換 １０％全ウノつ仔血清を加えた、１ｍＭＨＥＰＥｓ緩衝液、１２９　ｇ／ｌグル タミン、２．４４ｇ／／重炭酸ナトリウム、０．５５ｇ１ｌピルビン酸ナトリウ ム、ｐＨ６，９５を含有するＤＭＥＭ：Ｆ１２　（１：　１）培地中、６ウエル 平板にてヒト腎肝２９３細胞（温度感受性巨大Ｔ抗原遺伝子によってトランスフ ェクトしたサブクローン２９３ＴＳＡ）を７０％全面成長まで増殖させた。トラ ンスフェクションの前日に、細胞を計数し、その培地を吸引除去し、得られた細 胞をトリプシン処理し、リジン含有カラムに通してプラスミノーゲンを除去して おいた１０％全ウシつ仔血清を含有する同じＤＭＥＭ：Ｆ１２　（１：　１）を 基礎とする培地中に再懸濁した。次いで、得られた懸濁液を２６６．０００細胞 ／ｍｌに調整し、６ウエル平板の１ウエル当たり３冨ｌを接種しく８００．００ ０細胞／ウエル）、トランスフェクションを行う日までインキュベートした。

ｔ−ＰＡ突然変異体をコードするプラスミド２．５μｇを１１１Ｍトリス−ＨＣ ｌ。

０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．２２７Ｍ　Ｃａ（Ｊ’ｔ　（１５０μｌ）中に溶解 した。これに、５０ａＭ　ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７，３５）　、２８０１Ｍ　 ＮａＣ１，１，５ｍＭＮａＰＯ５（１５０μＩりを加え（旋回下に滴加）、２５ ℃で１０分間沈殿物を形成せしめた。次いで、得られた懸濁沈殿物を６ウエル平 板の各ウェル中の細胞に加え、インキュベーター中に一晩放！した。次いで、培 地を吸引除去し、インスリン、トランスフェリン、微量元素及び脂質を含有する ＰＳ−０４と呼ばれるＤＭＥＭ：Ｆ１２　（１二１）を基礎とする血清不含の培 地と置き換えた。細胞を６日間インキュベートした後、培地を採取し、検定した 。

野生型ｔ−ＰＡに対して調製したポリクローナル抗体を使用し、ＥＬＩＳＡ（酵 素結合免疫吸着検定）法によって、細胞培養上清中に存在するｔ−ＰＡの濃度を 測定した。以下で説明する各検定に使用するｔ−ＰＡの量はこのＥＬＩＳＡ法の 結果に基づいている。

Ｂ、Ｓ−２２８８検定 Ｓ−２２８８検定はｔ−ＰＡタンパク質分解活性を直接検定するものである。１ −ＰＡは、Ｈ−Ｄ−イソロイシル−Ｌ−プロリル−し−アルギニン−ｐ−ニトロ アニリドニ塩酸塩（Ｓ　−２２８８；　ＫａｂｉＶｉｔｒｕｌ）基質中の小ペプ チドとバラニトロアニリド発色団との間の結合を開裂させる。

野生型組換えｔ−ＰＡ（ｒｔ−ＰＡ）を細胞培養培地で希釈して標準曲線試料を 調製する。この標準曲線試料及びｒｔ−ＰＡ突然変異体試料をマイクロタイター 平板のウェルに加えた。この検定法を使用して２重鎖ｒｔ−ＰＡの活性を測定す るので、ヒトプラスミンとのインキュページ碧ンエ種をこの操作中に包含させる 。ヒトプラスミン（ＫａｂｉＶｉｔｒｕ層）は終濃度０．１３ＣＵ（カゼイン単 位）／麿ｌまで加えた。

試料を室温にて９０分間インキュベートした。

アプロチニン［シグマ、約１４ＴＩＵ（トリプシンインヒビタ一単位）／ｇｇ］ を終濃度７２＋ｇ／■ｌまで加えてプラスミン活性を阻害し、得られた試料を室 温にて１５分間インキュベートした。Ｓ−２２８８の２．１６■Ｍ溶液を０．１ Ｍトリス、０．１０６ｍＭ　ＮａＣｌ、０．０２％アジ化ナトリウム、ｐＨ８， ４を用いて１．４５５Ｍにまで希釈し、この溶液１００μｌをマイクロタイター 平板の各ウェルに加えた（各ウェルにおける最終容量は２００μｌであった）。

４０５止において発色をモニターした。それぞれの標準及び試料についての吸光 度対時間の曲線勾配を測定した。標準曲線は、ｒｔ−ＰＡ標品についてのｒｔ− ＰＡ濃度の関数として、吸光度対時間の曲線勾配をプロットすることで作成した 。次いで、突然変異体の相対活性濃度を標準曲線から測定した。各突然変異体の 活性濃度をｒｔ−ＰＡ　ＥＬ　Ｔ　ＳＡにて得られた突然変異体についての濃度 で除し、得られた比活性を、１．０値と帰属される野生型ｔ−ＦＡに相対させて 表した。

ンをｔ−ＰＡの作用によりプラスミンに変換させるが、そのプラスミンはＨ−Ｄ −バリル−し−ロイシル−し−リジン−ｐ−ニトロアニリドニ塩酸塩（Ｓ−２２ ５１；ＫａｂｉＶｉｔｒｕ纜）基質を開裂してバラニトロアニリド発色団を放出 させるものである。次いで、この発色団の発色を経時的に測定する。

１、フィブリン刺激Ｓ−２２５１検定 Ｓ−２２８８検定について記載しているようにして標準曲線試料を調製した。

その試料をプラスミン−セファロースと共にインキュベートすることにより、試 料を２重鎮形態に変換した。プラスミン−セファ０−スは、ヒトプラスミン（Ｋ ａｂｉＶｉｔｒｕｓ）約２０．８ＣＵを臭化シアン活性化セフ１０−ス（ファル マシア）１１Ｚとカップリングさせて調製した。このプラスミン−セファロース （５％スラリー５０μｌ）を試料１５０μｌと共に室温で９０分間撹拌させなが らインキュベートした。インキュベートの後、梼脂を遠心によって除去し、試料 １０μｌをマイクロタイター平板のウェルに加えた。

ヒトトロンビン（４２単位／厘ｌ溶液１０μｌ）を各ウェルに加えた。ヒトＧｌ ｕ−プラスミノーゲン（５３μＭ）２８μＣ、プラスミノーゲン不含のヒトフィ ブリノーゲン（１０μＭ）　１０ｕｔ、　３部Ｍ　Ｓ−２２５１（ＫａｂｉＶｉ ｔｒｕｓ）３Ｑμ／、及びＰＢＳ　６２μｌから構成される混合物（１３０μｌ ）を加え、各ウェル中の反応を開始させた。４０５ｎｍにおいて発色をモニター し、４９２ｎｓの参考波長における吸光度を各時点の吸光度から差し引き、濁度 作用のために補正した。吸光度対時間の二乗の曲線勾配を標準及び突然変異体試 料について測定した。データは、Ａ　Ｓ　Ｔ　Ｐｒｅ＋５ｉｕｓ／２８６　：７ ンビユーターに介在される５ＬＴ５ボラトリースモデルＥＡＲ３４０ＡＴマイク ロタイター平板解読装置を使用して集めた。各標準及び突然変異試料について、 吸光度対時間の二乗曲線の勾配を測定した。標準曲線は、ｒｔ−Ｐ　Ａ　Ｉｆ品 についてのｒｔ−ＰＡ濃度の関数として、吸光度対時間の二乗曲線の勾配をプロ ットすることにより作成した。突然変異体の相対比活性の測定は、Ｓ−２２８８ 検定について記載されている。

２　フィブリノーゲン刺激Ｓ−２２５１検定この検定は、ＰＢＳをトロンビンと 置き換える以外はフィブリン刺激Ｓ−２２５１検定について記載しているように して行った。

３、血漿血餅Ｓ−２２５１検定 これは、ｔ−ＰＡがプラスミノーゲンをプラスミンに活性化し、そのプラスミン が合成基質Ｓ−２２５１を加水分解する連続カップリング検定である。標準曲線 試料の調製及び、プラスミン−セファ０−スを使用する１重鎖ｒｔ−Ｐ　Ａから ２重鎖ｒｔ−ＰＡへの変換は、フィブリン−刺激Ｓ−２２５１検定について記載 しているものである。ヒトトロンビン（３１μｇ／＊ｆｆ溶液１０μｌ）をマイ クロタイター平板の各ウェルに加えた。標準及び突然変異体試料（４０μｌ）を その平板に加え、９、　１　ｍＭ　Ｓ　−２２５１（ＫａｂｉＶｉｔｒｕｍ）　 １部、１００ｍＭ）リス、２００ｍＭＮａＣ（、ｐＨ８，０（２部）及び血漿６ 部の混合物１００μｌを加え、反応を開始さ血餅形成が迅速であった。発色は４ ０５ｎ−においてモニターし、４９２ｎｍの参考波長における吸光度を各時点の 吸光度から差し引き、濁度の作用のために補正した。データは、ＡＳＴ　Ｐｒｅ Ｉｌｉｕ■／２８６コンピユーターに介在されるＳＬＴラボラトリーズモデルＥ ＡＲ３４０ＡＴマイクロタイター平板解読装置を使用して集めた。得られたデー タの分析は、フィブリン刺激Ｓ−２２５１検定について記載しているようにして 行った。

血漿Ｓ−２２５１検定 この検定は、リン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）をトロンビンと置き換え、参考波長 の差し引きを適用しないことを除いて血漿血餅Ｓ−２２５１検定につ（１て記載 しているようにして行った。

得られた結果を以下の第１表−第３表に示す。

ＦＲＩｇ２７４−２７７Ｌ、ＲｓＴ　０．　０２零　０　４０この検定は上述の ようにして行った。得られた値は野生型ヒトｔ−ＰＡとの対比である。変異体は 血清不含の細胞培養土清中にて検定した。＊のＦＲＩＫ２７４−２７７ＬＨ５Ｔ ｔ−ＰＡ変異体は２本鎖型に結合され得なかった。

ＦＲＩＫ２７４−２７７ＬＩＳＴ　Ｏ，１１０，１１１，０６９，４３上記の検 定は既述のようにして行った。すべての値は２重鎖野生型ヒトｔ−ＰＡとの対比 である。Ｆｇ＝フィブリノーゲン、Ｆｎ＝フィブリン。

ＦＲＩＫ２７４−２７７ＬＦＩＳＴ　Ｏ，１１０，１８０，６６３，７６野生型 ｔ−ＰＡに対するＦＲＩＫ２７４−２７７ＬＨＳＴｔ−ＰＡ変異体の血漿血餅溶 解活性は０，７７であった。５Ｏ８−ＰＡＧＥオートラジオグラフィーにより、 試験したｔ−ＰＡ変異体の１００％が１本鎖であることを確認した。

本発明のＦＲＩＫ２７４−２７７ＬＨ５Ｔｔ−ＰＡ変異体は、野生型ヒトｔ−Ｐ Ａと比較して、フィブリン及び血漿血餅特異性が顕著に増大しており、同時にそ の血漿血餅溶解活性は野生型ｔ−ＰＡのそれに近似していた。

これまで、具体的な好ましくは態様を説明してきたが、本発明はそれに限定され ないことは理解されよう。当業者であれば、本発明の概念全体を逸脱することな く、開示した態様に種々の改変を施すことのできる。このような改変もすべて、 本発明の範囲内に包含されるものである。

配列表 （１）一般的情報 （ｉ）　特許出願人、　ジエネンテク、インコーポレイテッド（ｉｉ）　発明の 名称：　フィブリン特異性が改善されたｔ−ＰＡ置換変異体（５）配列の数、　 １ （汁）連絡先： （Ａ）　名宛人、ジェネンテク、インコーポレイテッド（Ｂ）　通り：ポイント ・サン・ブルーノ・ブールバード４６Ｈｔ（Ｃ）　市：サウス・サン・フランシ スコ（Ｄ）　州：カリフォルニア （Ｅ）　国：アメリカ合衆国 （Ｆ）ＺＩＰ：９４０８０ （ｖ）　二】ンビ、−ター解読書式 （Ａ）ｍ体型・５．２ＦＭン＋、３６０Ｋｂ７ｏッピ−ディスク（Ｂ）　コンピ ューター・ＩＢＭＰＣ適合（Ｃ）　オペ１ノー卆イ：ノブ・システム：　ＰＣ− ＤＯ３／ＭＳ−ＤＯ８（Ｄ’ｌ　−ノットウェア　ｐａｌｊｎ　（ンＬネンテク ）（ｖｌ）木出願のデータ： （Ａ）　出願番号 （Ｂ）　出願臼：１９９２年１２月１４日（Ｖ）　優先権主張出願のデータ。

（Ａ）　出願番号・ （Ｂ）　出願日 （４）　弁理士／゛代理人情報 （Ａ）　氏名　ドレジャー、ジンジャ−・アール（Ｂ）　登録番号：３３．０５ ５ （Ｃ）　参照／′整理番号・７４４ （ｉｘ）　電話連絡先情報 （Ａ）　電話番号：　４１５／２６６−２６１４（Ｂ）　ファックス番号＋　４ １Ｆ）、’９５２−９８８１（Ｃ）　テレックス＋９１０／３７１−７１６８（ ２）配列番号１の情報 （ｉ）　配列の特徴： （Ａ）　長さ：４２塩基 （Ｂ）　型：核酸 （Ｃ）　鎖の数、１本鎖 （Ｄン　トポロジー・直鎖状 （ｘｉ）　配列・配列番号１： ＧＧＣＧＡＡＧＡＣ，Ｃ’ＣＣＴＣＣＧＧＴＡＧ　ＡＧＴＧＴＡＡＣＴＧ　ＡＧ ＧＣＴＧＧＣＴＧ　ＴＡ　４２ｆ關　眞　慣　審　輯　牛 フロントベージの続き （５１）　Ｉｎｔ、Ｃ１，’　識別記号　庁内整理番号Ｃ］、２Ｎ　１５１０９ 　ＺＮＡ ／／ＣＣ１２Ｎ　９／６４　Ｚ Ｃ１２Ｒ１：９１） （Ｃ１２Ｎ　５／１０ Ｃ１２Ｒ１：９１） ８３１４−４Ｃ Ｉ Ａ６１Ｋ　３７１５４　ＡＣＢ ／／（Ｃ１２Ｎ　５１００　Ｂ Ｃ１２ＲＬ：９１）

Claims (17)

【特許請求の範囲】
1. １．野生型ヒトｔ−ＰＡの２７４位、２７５位、２７６位及び２７７位がそれぞ れ、フェニルアラニンからロイシンに、アルギニンからヒスチジンに、イソロイ シンからセリンに、そしてリジンからスレオニンに置換されているｔ−ＰＡアミ ノ酸配列変異体。
2. ２．請求項１に記載の変異体をコードするＤＮＡ配列。
3. ３．請求項２に記載のＤＮＡ配列を、形質転換宿主細胞にて発現できる複製可能 な発現ベクター。
4. ４．請求項３に記載のベクターによって形質転換された宿主細胞。
5. ５．真核生物細胞である請求項４に記載の宿主細胞。
6. ６．哺乳動物である請求項４に記載の宿主細胞。
7. ７．ヒト腎胚２９３細胞である請求項６に記載の宿主細胞。
8. ８．チャイニーズハムスター卵巣細胞である請求項６に記載の宿主細胞。
9. ９．請求項４に記載の宿主細胞を培養し、請求項１に記載のｔ−ＰＡ変異体をコ ードするＤＮＡを発現させることを特徴とする方法。
10. １０．宿主細胞が真核生物細胞である請求項９に記載の方法。
11. １１．宿主細胞が哺乳動物細胞である請求項１０に記載の方法。
12. １２．宿主細胞培養物から変異体を回収することをさらに包含する請求項９に記 載の方法。
13. １３．変異体が培養培地から回収される請求項１２に記載の方法。
14. １４．治療学的有効量の請求項１に記載の変異体を製薬的に許容し得る担体と共 に含有してなる、血管症状又は疾患を処置するための組成物。
15. １５．有効量の請求項１４に記載の組成物を哺乳動物に投与することを特徴とす る、哺乳動物の血管症状又は疾患を処置するための方法。
16. １６．治療学的有効量の請求項１に記載の変異体を製薬的に許容し得る担体と共 に含有してなる、フィブリン沈着もしくは接着形成又は再形成を予防するための 組成物。
17. １７．有効量の請求項１６に記載の組成物を、哺乳動物における可能性あるフィ ブリン又は接着形成の部位に投与することを特徴とする、フィブリン沈着もしく は接着形成又は再形成を予防するための哺乳動物の処置方法。