NO307305B1

NO307305B1 - Fremgangsmåter og materialer for ekspresjon av en variant av humant plasminogen

Info

Publication number: NO307305B1
Application number: NO905211A
Authority: NO
Inventors: Francis J Castellino; Deborah L Higgins
Original assignee: Genentech Inc
Priority date: 1989-12-01
Filing date: 1990-11-30
Publication date: 2000-03-13
Also published as: JPH05502373A; FI905919A0; DE69009068T2; AU641449B2; CA2072649A1; FI102617B; EP0502872A1; PT96041A; PL288034A1; NO905211D0; DK0502872T3; DE69009068D1; FI905919A; IE62832B1; IE904332A1; ATE105862T1; CA2072649C; AU6721290A; JP3043403B2; EP0502872B1

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører nukleinsyresekvens kodende for en variant av humant plasminogen og fremgangsmåte for fremstilling av en variant av humant plasminogen.

Skadelige akkumuleringer i blodårer av koagulert protein-fibrin blir forhindret ved proteolytisk degradering (fibrinolyse) av fibrin eller av dennes forløper fibrinogen av enzymet plasmin (Pm). I en stor mengde av forstyrrelser blir patologiske fibrinavleiringer ikke degradert spontant, resulterende i trombose, tilstedeværelse av en blodkoagel (trombe) i en blodåre. I mange tilfeller er trombolittisk terapi, dvs. oppløsning av blodkoagulen ved Pm, den eneste mulige behandlingen.

Pm blir produsert i sirkulasjonen ved aktivering av en forløper, "proenzymet" eller "zymogen" betegnet plasminogen (Pg). Trombolytisk terapi blir utført ved administrering av en plasminogenaktivator. Blandt slike plasminogenaktivatorer er streptokinase (SK), urokinase (UK) og vevsplasminogenaktivator (t-PA).

Humant Pg (HPg) eksisterer i sirkulasjonen som et enkelt-kjede glykoprotein inneholdende 791 aminosyrer med en amino-terminal aminosyre som er Glu (sirkulerende HPg kan dermed bli betegnet som [Glu<1>] plasminogen) [Forsgren et al., FEBS Lett., 213: 254-260 (1987); Malinowski et al., Biochem., 23: 4243-4250 (1984); McLean et al., Nature, 330: 132-137 (1987); Sottrup-Jensen et al., Prog. Chem. Fibrinolysis Thrombolysis, 3: 191-209 (1978); Wiman, Eur. J. Biochem., 39: 1-9 (1973); og Wiman, Eur. J. Biochem., 76: 129-137 (1977)].

Analyse av karbohydratsekvensen til HPg viser at det er to glykosyleringsvarianter, en første som har to glykosylerings-seter (Asn289 og Thr^4^) og en an(}re som har et glykosyler-ingssete (Thr^<4>^), med underformer som utviser ufullstendig sialering (Castellino, CHem. Rev., 81; 431-446 (1981)). Disse formene og underformene er eksempler på post-translasjonelle modifikasjoner tilveiebragt av sirkulerende plasminogen.

HPg blir aktivert ved spaltning av en Arg<5>°<9->Val<5o2>peptid-binding for å produsere to-kjede, disulfid-bundet serin-protease (Lys<78>) Pm. Dette molekylet mangler også de amino-terminale 77 aminosyrene som et resultat av autolyse av human Pm (HPm) dannet i løpet av aktiveringen ((Violand og Castellino, J. Biol. Chem., 251: 3906-3912 (1976)). Spaltningen kan bli katalysert av forskjellige aktivatorer, som kan være SK, UK og t-PA. (For en oversikt se Castellino, Bioscience, 33: 647-650 (1983)). Mens sistnevnte to proteiner er enzymer som direkte katalyserer spaltning av den hensiktsmessige peptid-bindingen i HPg, som tilveiebringer HPm, har SK ingen slik iboende aktivitet og dennes plasminogenaktivator er basert på evnen til dannelse av komplekser med HPg og HPm og anvender det virkelige eller latente plasminaktive setet til disse sistnevnte to molekyler for å virke som en aktivator (Castellino, supra).

[Glu<1>]Pg eksisterer i plasma i form av to hovedvarianter som er forskjellige i glykosyleringsgrad ved Asn<289>(Hayes og Castellino, J. Biol. Chem., 254: 8768-8780 (1979); Castellino, supra). I [Glu<*>]Pg inneholder den latente plasmin-tunge kjeden, som innbefatter residiene 1-561, fem sterkt homologe regioner betegnet "kringler" (Sottrup-Jensen et al, supra), som hver inneholder omtrent 80 aminosyrer. Disse kringlene eksisterer mest sannsynlig som uavhengige domener (Castellino et al., J. Biol. Chem., 256 4778-4782 (1981) og er av viktighet for de funksjonelle egenskapene til HPg og HPm. Som eksempler kan kringle I domene (aminosyreresidiene 84-162) være viktig ved interaksjon av plasmin eller plasminogen med fibrin og fibrinogen (Lucas et al., J. Biol.Chem. 258: 4249-4256 (1983)), med den negative aktiveringseffektoren (Cl-)

(Urano et al., J. Biol. Chem., 258: 4249-4256 (1983)), og med den positive aktiveringseffektoren epsilon-aminokapronsyre (EACA) (Markus et al., J. Biol. Chem., 253: 727-732 (1978)).

Dette samme segmentet er i tillegg ansvarlig for den opprinnelige hurtige bindingen av HPm til dets hovedplasma-inhibitor, ag-antiplasmin (Moroi og Aoki, J. Biol. Chem., 251-5956-5965 (1976)). Kringle 4 regionen (residiene 358-435) ser ut til å inneholde svak EACA bindingssete(r) tilstede på

[Glu<l>]Pg, som kan være involvert i den meget store ligand-induserte konformasjonelle altereringen av [Glu^JPg (Violand et al., Arch. Biochem. Biophys., 170: 300-305 (1975)) og i en medfølgende økning i aktiveringshastigheten til zymogenet i nærvær av den positive effektoren EACA (Claeys og Vermyelin, Biochem. Biophys., 342, 351-359 (1974)).

Til tross for at trombolytisk terapi er nyttig er dennes terapeutiske potensiale bundet av tilgjengeligheten av plasminogen ved trombestedet. Konsentrasjonen av plasminogen kan være begrenset på grunn av forbruk av plasminogen som et resultat av trombolytisk terapi, forårsaket av en utilstrek-kelig mengde plasminogen som er tilstede i tromber, eller på grunn av en lokal plasminogentapping knyttet til alderen på tromben og ischemi (en lokalisert anemi forårsaket av en reduksjon i blodstrømning). (Anderle et al., Haemostasis, 18: (Suppl. 1), 165-175 (1988)). Supplementering av den lokalt tilgjengelige mengden av plasminogen er dermed ønskelig.

Til tross for at ekspresjon av store mengder plasminogen i et rekombinant ekspresjonssystem er en hensiktsmessig måte å tilveiebringe plasminogen for anvendelse i trombolytisk terapi har det vært meget vanskelig å uttrykke intakt HPg i pattedyr ekspresjonssystemer på grunn av den nesten alle-stedsnærværende tilstedeværelsen av intracellulære plasminogenaktivatorer blandt pattedyrcelletyper. Tilstedeværelse av disse aktivatorene resulterer i tilsynekomst av en degradert form av HPg i kondisjonert cellemedia fra slike ekspresjonssystemer, muligens fra autofordøyning av plasminogen ved produsert HPm (Busby et al., Fibrinolysis, 2, 64

(1988)).

Et rekombinant humant plasminogen er blitt produsert i insektceller (irEPg) som ved amino-terminal aminosyresekvensanalyse, molekylvektsberegning på SDS/PAGE, Sepharose-lysin affinitetskromatografiadferd, aktiveringskaraktertrekk, antistoff-reaktivitet og aktivitet til resulterende plasmin, ser ut til å være sammenlignbar i egenskaper med human plasma [Glu^jPg. (Whitefleet-Smith et al., Arch. Biochem. Biophys., 271: 390-399 (1989)). Dette er et signifikant funn på grunn av at det inntil nå ikke har blitt foretatt vellykket ekspresjon av vill-type rekombinant HPg (wt-rHPg) i pattedyrceller. Når derimot kinetiske egenskaper til ekvimolare komplekser dannet fra streptokinase med plasma HPg og med irHPg ble sammenlignet var SDS/PAGE-gelene til de tidsmessige hendelsene innenfor de respektive kompleksene identisk med resultatene publisert av Bajaj og Castellino, J. Biol. Chem., 252: 492-498 (1977) ved at en hurtig omdanning av HPg til HPm oppstod. Dette tyder på at HPg ikke er en stabil komponent av komplekset.

Det er kjent at spaltningssetet til human t-PA omfattende posisjonene 270-280 kan bli modifisert for å danne en t-Pa-variant som er resistent eller immun overfor spesifikk enzymatisk spaltning. t-PA-varianter er for eksempel beskrevet (EP Pat. Publ. No. 199,574) med aminosyresubstitusj oner ved proteolytiske spaltningsseter i posisjonene 275, 276, 277. Disse variantene, fortrinnsviskarakterisertsom t-PA-varianter med en aminosyre forskjellig fra arginin i posisjon 275, blir betegnet som protease-resistente en-kjede t-PA-varianter, ulikt naturlig t-PA, som kan eksistere i enten en en-kjede eller to-kjede form, er resistente overfor protease-spaltning i posisjon 275 og blir derfor ikke omdannet metabolsk in vivo til en to-kjede-form. Denne formen av t-PA antas å ha visse fordeler biologisk og kommersielt, på grunn av at den er mere stabil og f ibrin-bindingen og fibrin-stimuleringen derav er øket relativt til to-kjede t-PA. En annen form for plasminogenaktivator inneholder et domene som kan reagere med fibrin og protease-domenet til urokinase, idet en utførelsesform er urokinase endret for å gjøre den mindre mottagelig for dannelsen av to-kjede urokinase. Se WO 88/05081 publisert 14. juli 1988.

For ytterligere patentlitteratur vedrørerende modifikasjon av proteasespaltningssetet til t-PA, se for eksempel EPO pat. nr. 241,209; 201,153 publisert 12. november, 1986; 233,013 publisert 19. august, 1987; 292,009 publisert 23. november, 1988; 293,936 publisert 7. desember, 1988og 293,934 publisert 7. desember, 1988 og WO 88/10119.

En hensikt med foreliggende oppfinnelse er å frembringe et plasminogenmolekyl som er stabilt i et kompleks med et fibrinolytisk enzym såsom streptokinase og som dermed er mere aktivt enn det naturlige molekylet.

En annen hensikt er å fremstille plasminogen-molekylet i et hvilket som helst rekombinant ekspresjonssystem, ikke bare i de som mangler en endogen, sete-spesifikk plasminogenaktivator (så som insektceller).

Disse og andre hensikter vil fremkomme for fagfolk innenfor dette området.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en nukleinsyresekvens kodende for en variant av human plasminogen med aminosyresekvensen ifølge figur 1, kjennetegnet ved at argininresidiet i posisjon 561 er erstattet med en annen aminosyre.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også en fremgangsmåte for fremstilling av en variant av humant plasminogen med aminosyresekvens ifølge figur 1, hvor argininresidiet i posisjon 561 er erstattet med en annen aminosyre, kjennetegnet ved å transformere en egnet vertscelle med en ekspresjonsvektor som inneholder DNA-sekvensen som koder for nevnte protein i kombinasjon med transkripsjons- og translasjonsregulerende sekvenser som er i stand til å dirigere ekspresjonen av nevnte DNA-sekvens, samt en seleksjonsmarkør kodende sekvens, hvorpå proteinet isoleres og renses.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer videre en ekspresjonsvektor, kjennetegnet ved at den omfatter nukleinsyresekvensen som nevnt ovenfor operabelt koblet til kontrollsekvensene.

Videre tilveiebringer foreliggende oppfinnnelse en vertscelle, kjennetegnet ved at den inneholder vektoren som tidligere omtalt.

Figur 1 er nukleotidsekvensen til vektor pUC119PN127.6, med unntagelse av at i nukleotidposisjon 3809 inneholder vektoren en T, mens sekvensen ifølge fig. 1, som angir sekvensen kodende for nativt humant plasminogen, inneholder en C. Fig. 1 sekvensen omfatter også en avledet aminosyresekvens for human plasminogen som har den native sekvensen.

Figur 2 viser konstruksjon av vektor pSVI-tPA.

Figur 3 viser konstruksjon av vektor pSVI2-tPA.

Figur 4 viser konstruksjon av vektor pSVI3-tPA.

Figur 5 viser konstruksjon av vektor pSVI5-tPA.

Figur 6 viser konstruksjon av vektor pSVI6B-tPA.

Figur 7 viser konstruksjon av pA475R561SPg anvendt for ekspresjon av en HPg-variant i henhold til foreliggende oppf innelse. Figur 8 er et arbeidsskjema som skjematisk angir konstruksjon av bakulovirus overføringsvektor pAV6 anvendt for insekt-celleekspresjon.

A. Definisjoner.

Som anvendt heri betegner "plasminogen" eller "Pg" plasmino-gent humant plasminogen med aminosyresekvensen vist i figur 1, forutsatt at det har biologisk aktivitet til nativt Pg, dvs. kan bli spaltet av en plasminogenaktivator (f.eks. streptokinase, urokinase eller vevsplasminogenaktivator) for å produsere plasmin, eller har en immunepitope som er immunologisk kryss-reaktiv med et antistoff dannet mot minst en epitope av nativt Pg.

Plasminogen-varianter er definert som molekyler der aminosyresekvensen til nativt Pg er blitt modifisert, vanligvis ved en forutbestemt mutasjon, der minst en modifikasjon gjør plasminogen resistent overfor proteolytisk spaltning til dets to-kjedeform. Aminosyresekvensvariantene til Pg omfatter f.eks. delesjoner fra, eller innskudd eller substitusjoner av, residier innenfor aminosyre Pg-sekvensen vist i figur 1. En hvilken som helst kombinasjon av delesjon, innskudd og subsitusjon kan også bli dannet for å oppnå den endelige konstruksjonen, forutsatt at den endelige konstruksjonen har ønsket motstand overfor spaltning og biologisk aktivitet. Det er innlysende at det er foretrukket at mutasjonene dannet i DNA kodende for variant Pg ikke plasserer sekvensen ut av leserammen og det er videre foretrukket at de ikke danner komplementære regioner som ville dannet en sekundær mRNA-struktur (se for eksempel Eurpeisk Patent-publikasjon nr. 075 ,444 ).

Et "to-kjede spaltningssete" i Pg og setet for "proteolytisk spaltning til dets to-kjedeform" omfatter minst argininresidiet i posisjon 561 til HPg. Forskjellige aminosyrer ved siden av eller innenfor flere residier i posisjon 561 antas også å være en del av domenet gjenkjent av enzymer som omdanner plasminogen til dets to-kjedeform. Erstatning av aminosyrer i posisjoner forskjellig fra 561 innenfor domenet kan derfor resultere i mutante plasminogener som er resistente overfor omdanning til to-kjedeformen.

I den bestemte utførelsesformen er "enkel-kjede plasminogenvarianten" et plasminogen som er resistent overfor omdanning til to-kjedeformen ved 561-562 spaltningssetet. Det er kjennetegnet ved enkel eller multiple aminosyresubstitusjoner ved to-kjede aktiveringssetet. Som modifisert, blir et slikt aktiveringssete ikke gjenkjent enzymatisk, og derfor ikke hydrolysert av enzymer som normalt omdanner plasminogen til dets to-kjede form.

Analogt med trypsin og kymotrypsin antas det at viktigheten av dannelsen av to-kjede formen av en hvilken som helst serin-protease er den derav følgende tilstedeværelsen av den frie a-aminogruppen i HPg i posisjon 562. I denne sammenlig-ningen vil, ved spaltning ved arg561, a-aminogruppe 562 være fri til å reagere med polypeptidkjeden i området av aktivt seteserin til plasminogen. Foreliggende oppfinnelse dekker dermed en hvilken som helst mutasjon som vil interferere med interaksjonen til en slik a-aminogruppe med proteaseaktive setet uten å redusere den helhetlige aktiviteten til molekylet .

"Operabelt bundet" som anvendt heri betegner samstilling slik at den normale funksjonen til komponentene kan bli utført. Dermed refererer en kodende sekvens "operabelt bundet" til kontrollsekvenser en konfigurasjon der den kodende sekvensen kan bli uttrykt under kontroll av disse sekvensene, og hvori DNA-sekvensene som blir koblet er tilgrensende og i tilfelle med en sekretorisk leder, tilgrensende og i leseramme. For eksempel der DNA for en presekvens eller sekretorisk leder er operabelt bundet til DNA for et polypeptid dersom det blir uttrykt som et preprotein som deltar i utskilling av polypeptidet; en promoter eller enhancer er operabelt bundet til den kodende sekvens dersom den påvirker transkripsjonen av sekvensen; eller et ribosombindingssete er operabelt bundet til en kodende sekvens dersom det er plassert slik at det letter translasjon av den kodende sekvensen. Kobling blir

oppnådd ved ligering ved hensiktsmessig restriksjonssete. Dersom slike seter ikke eksisterer kan syntetiske oligonukle-otidadaptorer eller linkere bli anvendt i henhold til konven-sjonell praksis.

"Celle", "cellelinje" og "cellekultur" blir anvendt om hverandre heri og alle slike betegnelser innbefatter avkom. Betegnelsen "transformanter" eller "transformerte celler" omfatter dermed den primære subjektcellen og kulturer avledet derfra uten hensyn til antall overføringer. Det er også inneforstått at alle avkom ikke behøver å være nøyaktig identiske i DNA-innhold på grunn av tilsiktede eller util-siktede mutasjoner. Også innbefattet i disse betegnelsene er mutantavkom som har samme funksjon for hvilket en primær hovedcelle er screenet. Når bestemte betegnelser er antatt vil dette komme frem fra sammenhengen.

"Kontrollsekvenser" betegner DNA-sekvenser nødvendige for ekspresjon av en operabelt koblet kodende sekvens i en bestemt vertsorganisme. Kontrollsekvensene som er egnede for prokaryoter omfatter f.eks. en promoter, eventuelt en operator-sekvens, et ribosombindingssete og muligens, andre inntil nå dårlig forklarte sekvenser. Eukaryote celler er kjent for å anvende promotere, polyadenyleringssignaler og enhancere.

Betegnelsen "ekspresjonssystem" betegner DNA inneholdende en ønsket kodende sekvens og kontrollsekvens operabelt bundet, slik at verter transformert med disse sekvenser kan danne de kodete proteinene. For transformasjon kan ekspresjonssystemet være innbefattet på en vektor betegnet heri "ekspresjonsvektor". Men relevant DNA kan også bli integrert i verts-kromosomet.

B. Utførelsesformer for utførelse av oppfinnelsen.

I foreliggende oppfinnelse er variant av humant plasminogen det som er resistent overfor proteolytisk spaltning til dets to-kjedeform, generelt av plasmin. Slike varianter kan bli fremstilt på forskjellige måter, både rekombinant og syntetisk eller delvis syntetisk, variantene er fortrinnsvis de hvori en av aminosyreresidiene, fortrinnsvis arginin i posisjon 561, beliggende ved det kritiske spaltningssetet ved omdanning av HPg til HPm, blir erstattet med en annen aminosyre, fortrinnsvis ikke et lysinresidie, og mest foretrukket er en dikarboksylinneholdende aminosyre eller serin. De mest foretrukne variantene er dermed R561S-HPg, R561E-HPg og R561G-HPg, ved anvendelse av nomenklaturen angitt nedenfor. ("A475"-betegnelsen til HPg refererer til den naturlige sekvensen HPg med et alaninresidie i posisjon i 475, i motsetning til sekvensen i pUC119PN127.6, som har en valin i posisjon i 475. Betegnelsene R561S-HPg, R561E-HPg og R561G-HPg anvendt nedenfor og i kravene refererer, dersom ikke annet er angitt, til HPg med en alanin i posisjon 475.

Variantene kan bli fremstilt ved sete-rettet mutagenese av nukleotidene i DNA kodende for Pg, for derved å produsere DNA kodende for varianten, og påfølgende ekspresjon av DNA i den hensiktsmessige vertscellen.

DNA kodende for proteolytisk resistent Pg kan også bli syntetisert kjemisk og oppstilt ved hvilke som helst av et antall teknikker, før ekspresjon i en vertscelle. (Se f.eks. Caruthers, US Patent nr. 4,500,707; Balland et al., Bio-chimie, 67; 725-736 (1985); Edge et al., Nature, 292: 756-762

(1982)).

I andre utførelsesformer kan varianten være uglykosylert, som oppnådd ved behandling av plasminogen uttrykt i en eukaryot vert med et egnet enzym for slike hensikter så som glykopeptidase F. Varianten kan også inneholde andre mutasjoner, spesielt de som er fordelaktige for dets aktivitet.

For forkortelse av betegnelsen på HPg-variantene beskrevet heri er det å bemerke at tallene refererer til aminosyre- residiet/posisjonen langs aminosyresekvensene til antatt modent Pg. Aminosyreidenfikasjonen anvender enkelt-bokstav alfabetet til aminosyrene, dvs.

Betegnelsen for en substitusjonsvariant heri består av en bokstav etterfulgt av et tall etterfulgt av en bokstav. Den første (venstre) bokstaven betegner aminosyren i vill-type, moden Pg. Tallet refererer til aminosyreposisjonen der aminosubstitusj onen er blitt utført, og andre (høyre-hånd) bokstav angir aminosyren som blir anvendt for å erstatte vill-type aminosyren. Betegnelsen for en innskuddsvariant består av bokstaven i etterfulgt av et tall som angir posisjonen til residiet i vill-typen. Modent Pg før innskuddet starter, etterfulgt av en eller flere store bokstaver som angir, inklusivt, innskuddet som skal bli utført. Betegnelsen for en delesjonsvariant består av bokstaven d etterfulgt av tallet på startposisjonen til delesjonen til tallet på sluttposisjonen av delesjonen, der posisjonene er basert på vill-type, modent Pg. Multiple mutasjoner er separert av et komma i betegnelsen for å lette avlesning av disse.

Eksempler på nomenklaturen er som følger: en substitusjonsvariant der arginin i posisjon 561 til vill-type Pg er erstattet med et glutaminsyreresidie er betegnet R561E. En substitusjonsvariant med multiple substitusjoner ved påfølg-ende posisjoner 561-562 av EE for RV er betegnet R561E.V562E. en innskuddsvariant der cystein og valin blir skutt inn etter posisjon 560 til vill-type Pg er betegnet 1560CV. En delesjonsvariant der aminosyrene i posisjonene 561 til 562 er deletert fra vill-type, modent Pg er betegnet d561-562. Betegnelsen "HPg" følger etter hver mutant.

De fleste delesjonene og innskuddene, og substitusjonene spesielt, ventes ikke å danne radikale forandringer i karaktertrekkene til det rekombinante Pg-molekylet. Når det derimot er vanskelig å forutsi den nøyaktige virkningen av substitusjonen, delesjonen eller innskuddet på forhånd, for eksempel, ved modifisering av det aktive setet til Pg eller en immun epitope, vil fagfolk dra nytte av at virkningen kan bli vurdert ved rutinemessige screeningsanalyser. En variant kan for eksempel vanligvis bli dannet ved sete-spesifikk mutagenese av det native Pg-kodende nukleinsyren, ekspresjon av variantnukleinsyren i rekombinant cellekultur og eventuelt rensing fra cellekulturen, for eksempel, ved immunoaffini-tetsabsorbsjon på en kanin polyklonal anti-Pg kolonne.

Varianten kan deretter bli screenet i en egnet screenings-analyse for de ønskede karaktertrekkene. For eksempel kan en forandring i immunologisk karakter til Pg, så som affinitet for et gitt antistoff, bli målt ved konkurrerende immunana-lyse. Forandringer i aktiveringsnivåer blir målt ved den hesiktsmessige analysen. Modifikasjoner av slike proteinegen-skaper som redoks eller termisk stabilitet, hydrofobisitet, mottagelighet for proteolytisk degradering, eller tendens til aggregering med bærere eller til multimerer blir analysert ved fremgangsmåter som er velkjent for fagfolk.

Vektorene og fremgangsmåtene beskrevet heri er egnede for anvendelse i vertsceller i et stort område av prokaryotiske og eukaryotiske organismer, fortrinnsvis eukaryotiske, og mest foretrukket er pattedyrverter.

Prokaryoter er generelt foretrukket for begynnende kloning, amplifisering, eller lagring av vektorene av interesse. Vektor DNA blir lett oppnådd fra visse prokaryoter. E. coli K12 stamme MM 294 (ATCC nr. 31,446) er spesielt nyttig for dette. Andre mikrobielle verter som kan bli anvendt omfatter E. coli stammene så som E. coli B og E. coli X1776 (ATCC nr. 31,357). Disse eksemplene er selvfølgelig illustrerende og ikke begrensende.

Plasmidvektorer inneholdende replikon og kontrollsekvenser som er avledet fra arter kompatible med vertscellene blir generelt anvendt i sammenheng med disse prokaryote vertene. Vektoren bærer vanligvis et replikasjonssete, samt marker-ingssekvenser som kan tilveiebringe fenotypisk seleksjon i transformerte celler. E. coli blir for eksempel vanligvis transformert ved anvendelse av pBR322, et plasmid avledet fra en E. coli art (se f.eks. Bolivar et al., Gene, 2: 95/1977)). pBR322 inneholder gener for ampicillin og tetracyklinresis-tens og tilveiebringer derfor enkle fremgangsmåter for identifisering av transformerte celler. pBR322-plasmid, eller annet mikrobielt plasmid eller annen fag, må også inneholde, eller bli modifisert til å inneholde, promotere som kan bli anvendt av mikrobielle organismer for ekspresjon av selekterbare markørgener.

Promotere som vanligvis blir anvendt i rekombinant DNA-konstruksjon for prokaryote verter omfatter p<->laktamase (penicillinase) og laktose promotersystemer (Chang et al., Nature, 375: 615 (1978); Itakura et al., Science, 198: (1056

(1977); Goeddel et al., Nature, 281: 544(1979) og et tryptofan (trp) promotersystem (Goeddel et al., Nucleic Acids Res., 8: 4057 (1980); EPO Appl. Publ. Nr. 0036,776). Disse blir vanligvis anvendt, men andre mikrobielle promotere er blitt oppdaget og anvendt, og detaljer vedrørende deres nukleotidsekvenser er blitt publisert og dette muliggjør at fagfolk kan ligere dem funksjonelt med plasmidvektorer (se for eksempel Siebenlist et al., Cell, 20: 269(1980)). For ekspresjon blir eukaryote mikrober, så som gjærkulturer, anvendt. Saccharomyces cerevisiae, eller vanlig bakergjær, blir som oftest anvendt sammen med eukaryote mikroorganismer, til tross for at et antall andre stammer vanligvis er tilgjengelig. For ekspresjons i Saccharomyces blir plasmid YRp7, for eksempel (Stinchcomb et al., Nature, 282: 39(1979); Kingsman et al., Gene, 7: 141(1979); Tschemper et al., Gene, 10: 157(1980) vanligvis anvendt. Dette plasmidet inneholder allerede trpl-genet som tilveiebringer en seleksjonsmarkør for en mutant gjaerstamme som mangler evnen til å vokse tryptofan, for eksempel, ATTC nr. 44,076 eller PEP4-1 (Jones, Genetics, 85: 12 (1977)). Tilstedeværelse av trpl-lesjonen som et karaktertrekk til gjærvertscellegenomet tilveiebringer dermed et effektivt miljø for deteksjon av transformasjon ved vekst i fravær i tryptofan.

Egnede promotersekvenser i gjærvektorer omfatter promoterene for 3-fosfoglyceratkinase (Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255: 2073 (1980)) eller andre glykolytiske enzymer (Hess et al., J. Adv. Enzyme REg. , 7: 149 (1968); Holland et al., Biochemistry, 17:4900(1978), så so enolase, glyceraldehyd-3-fosfatdehydrogenase, heksokinase, pyruvatdekarboksylase, fosfofruktokinase, glukose-6-fosfat isomerase, 3-fosfo-glyceratmutase, pyruvatkinase, triosefosfatisomerase, fosfoglukoseisomerase, og glukokinase. Andre promotere, som har den ytterligere fordelen av at transkripsjonen er kontrollert av vekstbetingelsene, er promoterregionen for alkoholdehydrogenase 2, isocytokrom C, sur fosfatase, degraderende enzymer assosiert med nitrogenmetabolisme og ovennevnte glyceraldehyd-3-fosfat dehydrogenase, og enzymer ansvarlig for maltose og galaktoseanvendelse. En hvilken som helst plasmidvektor inneholdende gjær-kompatibel promoter, replikasjonsorigo og termineringssekvenser er egnet.

I tillegg til mikroorganismer kan kulturer av celler avledet fra multicellulære organismer også bli anvendt som verter. I prinsippet er hvilke som helst av slike cellekulturer egnede, enten de er fra vertebrat- eller invertebratkulturen. . For ekspresjon i invertebrate verter, er mange bakulovirale stammer og varianter og tilsvarende permissive insektsverts-celler fra verter så som Åedes aegypti (mosquito), Åedes albopictus (mosquito), Drosphila melanogaster (fruitfly), og Bombyx mori vertsceller, blitt identifisert. (Se f.eks. Luckow et al., Bio/Technology, 6:47-55 (1988); og Maeda et al., Nature, 315: 592-594 (1985)). Forskjellige slike virale stammer er offentlig tilgjengelige, f.eks. L-l varianten til Autographa californica NPV og Bm-5 stammen til Bombyx mori NPV, og slike virus kan bli anvendt som virus heri ifølge foreliggende oppfinnelse, spesielt for transfeksjon av Spdoptera frugiperda celler.

Interessen har derimot vært størst i vertebratceller, og propagering av vertebratceller i kultur (vevskultur) har blitt en rutinemessig prosedyre i de senere årene (Tissue Culture, Academic Press, Kruse og Patterson, editors (1973)).

Eksempler på slike nyttige vertebratvertscellelinjer omfatter apenyre CVI-linje transformert med SV40-sekvensene (COS-7, ATCC CRL 1651); human embryonisk nyrelinje (293, Graham et al., J. Gen. Virol., 36: 59 (1977)); baby hamster nyreceller (BEK, ATCC CCL 10); kinesisk hamster ovarieceller (Urlaub og Chasin, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 77: 4216 (1980); muse-sertoliceller (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23: 243-251

(1980)); ape nyreceller (CVI, ATCC CCL 70); Afrikansk grønn

apenyreceller (VER0-76, ATCC CRL-1587), humane cervikalkar-sinomaceller (HELA, ATCC CCL 2); kanin-nyreceller (MDCK, ATCC CCL 34); buffalorotteleverceller (BRL 3A, ATCC CRL 1442 );

humane lungeceller (W138, ATCC CCL 75); humane leverceller (Hep G2, HB 8065); musebrysttumorceller (MMT 060562, ATCC CCL51); rottehepatomceller (HTC, Ml.54, Baumann et al., J. Cell. Biol., 85: 1-8 (1980)); og TRI-celler (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sei., 383: 44-68 (1982)). Den mest fore-

trukne eukaryote verten heri for stabil ekspresjon er en kinesisk hamsterovariecellelinje.

For anvendelse i pattedyrceller er kontrollfunksjonene på ekspresjonsvektorene ofte tilveiebragt av virusmateriale. For eksempel er vanlige anvendte promotere avledet fra genomene til polyoma, Adenovirus 2, retrovirus, cytomegalovirus og som oftest Simianvirus 40 (SV40). Andre promotere er de fra heterologe kilder, f.eks. betaaktinpromoter. Tidlig og sene promotere til SV40-virus er spesielt nyttig på grunn av at begge lett kan oppnåes fra viruset som et fragment som også inneholder SV40 viral replikasjonsorigo (Fiers et al., Nature, 273: 113 (1978)). Mindre eller større SV40 fragmenter kan også bli anvendt, forutsatt at det omfatter den omtrente-lige 250-bp sekvensen som rekker fra Hindlll-setet mot Bgll-setet beliggende i viral replikasjonsorigo. Umiddelbar tidlig promoter til human cytomegalovirus blir hensiktsmessig oppnådd som Hindlll-reaksjonsfragment. Greenaway et al., Gene, 18: 355-360 (1982). Det er videre også mulig, og ofte ønskelig, å anvende promoter eller kontrollsekvenser som normalt er knyttet til den ønskede gensekvensen, forutsatt at slike kontrollsekvenser er kompatible med vertscellesystem-ene.

Transkripsjon av et DNA kodende for Pg ved høyere eukaryoter blir øket ved innskudd av en enhancer-sekvens inn i vektoren. Enhanceren er et cis-virkende element av DNA, vanligvis omtrent fra 10 til 300 bp, som virker som en promoter for å forsterke transkripsjonsinitieringsaktiviteten. Enhancere er relativt orienterings- og posisjonsuavhengige, og er blitt funnet 5' (Laimins et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 78: 993 (1981)) og 3' (Lusky et al., Mol. Cell. Bio., 3: 1108

(1983)) for transkripsjonsenheten, med et intron (Banerji et al., Cell, 33: 729 (1983)) samt innenfor selve den kodende sekvensen (Osborne et al., Mol. Cell Bio., 4: 1293 (1984)). Enhancerelementet er derimot fortrinnsvis beliggende opp-strøms for promotersekvensen ifølge foreliggende oppfinnelse. Mange enhancer-sekvenser er nå kjente fra pattedyrgener (globin, elastase, albumin, a-fetoprotein, og insulin). Man vil derimot vanligvis anvende en enhancer fra en eukaryot cellevirus. Eksempler omfatter SV40-enhancer på "late"-siden av replikasjonsorigo (bp 100-270), cytomegalovirus early promoterenhancer, polyoma-enhancer på late-siden av replikasjonsorigo og adenovirusenhancere. Mest egnet er SV40-enhancerregionen.

Ekspresjonsvektorer anvendt i pattedyrvertsceller vil også inneholde polyadenyleringsseter. Eksempler på polyadenyler-ingsregioner er de som er avledet fra virus så som f.eks. SV40 (tidlig og sen) eller HBV.

Et replikasjonsorigo kan bli tilveiebragt enten ved konstruksjon av vektoren slik at den omfatter et eksogent origo, som kan være avledet fra SV40 eller annen viral (f.eks. Polyoma, Adeno, VSV, BPV) kilde, eller kan bli tilveiebragt av vertscellen. Dersom vektoren blir integrert inn i vertscelle-kromosomet er det sistnevnte ofte tilstrekkelig.

Ekspresjonsvektorene kan fortrinnsvis inneholde et selek-sjonsgen, også betegnet en selekterbar markør. Et seleksjons-gen koder for et protein som er nødvendig for overlevelse eller vekst av en vertscelle transformert med vektoren. Eksempler på egnede selekterbare markører for pattedyrceller omfatter dihydrofolatreduktase (DHFR), tymidinkinase (TK) eller neomycin. Når slike selekterbare markører blir vellykket overført i en pattedyrvertscelle, kan den transformerte pattedyrvertscellen overleve dersom den er plassert under selektivt trykk.

Det eksisterer to meget anvendte bestemte kategorier av selektive regimer. Den første kategorien er basert på metabolisme til en celle og anvendelse av en mutant cellelinje som mangler evnen til å vokse uavhengig av et supplementert medium. To eksempler er CHO DHFR-celler og muse LTK- celler. Disse cellene mangler evnen til å vokse uten tilsetning av slike næringsstoffer som tymidin eller hypoxantin. På grunn av at disse cellene mangler visse gener som er nødven-dig for en fullstendig nukleotidsyntesereaksjonsvei, kan disse ikke overleve dersom ikke de manglende nukleotidene er tilveiebragt i et supplementert medium. Et alternativ til supplementering av mediet er innføring av et intakt DHFR eller TK-gen inn i cellene som mangler de respektive genene for derved å endre vekstkravene. Individuelle celler som ikke ble transformert med DHFR eller TK-genet vil ikke kunne overleve i ikke supplementert medium. Direkte seleksjon av disse cellene krever derfor cellevekst i fravær av supplemen-terende næringsstoffer.

Den andre kategorien er dominant seleksjon som refererer til en seleksjonsvei som ikke krever anvendelse av en mutant cellelinje. Denne fremgangsmåten anvender vanligvis et medikament for å hindre veksten av en vertscelle. De cellene som har et nytt gen vil da uttrykke et protein som tilveiebringer medikamentresistens og vil overleve seleksjonen. Eksempler på medikamenter anvendt ved dominant seleksjon omfatter neomycin (Southern og Berg, J. Molec. Appl. Genet., 1: 327 (1982)), mycofenolsyre (Mulligan og Berg, Science, 209: 1422 (1980)), eller hygromycin (Sugden et al., Mol. Cell. Biol., 5: 410-413 (1985)). De tre eksemplene angitt ovenfor anvender bakterielle gener under eukaryot kontroll for å tilveiebringe resistens overfor det hensiktsmessige medikamentet, dvs. neomycin (G418 eller geneticin), xgpt (mycofenolsyre ), eller hygromycin.

Meget høye mengder av polypeptidet blir produsert av cellekulturer som anvender fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen; men forbedringer som anvender en sekundær kodende sekvens øker produksjonsnivåene ytterligere. En sekundær kodende sekvens omfatter dihydrofolat reduktase (DHFR) som blir påvirket av en ytre kontrollert parameter, så som metotreksat (MTX), som dermed muliggjør kontroll av ekspresjon ved kontroll av metotreksatkonsentrasj onen.

Ved valg av en foretrukket vertscellelinje for transfeksjon av vektorene ifølge oppfinnelsen som omfatter DNA-sekvenser kodende for både gen av interesse og DHFR-proteinet, er det hensiktsmessig å velge verten ifølge hvilken type av DHFR-protein som blir anvendt. Dersom vill-type DHFR-protein blir anvendt er det foretrukket å velge en vertscelle som mangler DHFR, for dermed å tillate anvendelse av DHFR-kodende sekvensen som en markør for vellykket transfeksjon i selektivt medium som mangler hypoxantin, glycin og tymidin. En hensiktsmessig vertscelle er i dette tilfellet kinesisk hamsterovarie (CHO) cellelinje som mangler DHFR-aktivitet, fremstilt og propagert som beskrevet av Urlaub og Chasin, Proe. Nati. Acad. Sei. (USA) 77: 4216 (1980).

Dersom derimot DHFR-protein med lav bindingsaffinitet for MTX blir anvendt som kontrollerende sekvens er det ikke nødvendig å anvende DHFR-manglende celler. På grunn av at mutant DHFR er resitent overfor metotreksat, kan MTX-inneholdende media bli anvendt som et middel for seleksjon forutsatt at vertscellene i seg selv er metotreksatfølsomme. De fleste eukaryote cellene som kan absorbere MTX ser ut til å være metotreksat-følsomme. En slik nyttig cellelinje er en CHO-linje, CH0-K1 (ATCC nr. CCL 61).

Konstruksjon av egnede vektorer inneholdende ønskede kodende og kontrollsekvenser kan utføres ved standard ligerings-teknikker. Isolerte plasmider eller DNA-fragmenter blir spaltet, skreddersydd og religert i den formen som er ønsket for å fremstille de nødvendige plasmidene.

Dersom butte ender er nødvendige kan preparatet bli behandlet i 15 minutter ved 15°C med 10 enheter Polymerase I (Klenow), fenol-kloroform ekstrahert og etanolpresipitert. Størrelsesseparasjon av spaltede fragmenter kan bli utført ved anvendelse av 6% polyakrylamidgel beskrevet av Goeddel et al., Nucleic Acids Res., 8: 4057 (1980).

For analyse for å bekrefte riktige sekvenser i konstruerte plasmider blir ligeringsblandingene vanligvis anvendt for å transformere E. coli K12-stamme 294 (ATCC 31,446) eller andre egnede E. coli-stammer, og vellykkede transformanter blir valgt ved ampicillin eller tetracyklin-resistens hvor dette er hensiktsmessig. Plasmidene fra transformantene blir preparert og analysert ved restriksjonskartlegging og/eller DNA-sekvensering ved fremgangsmåten til Messing et al., Nucleic Acids Res., 9: 309 (1981) eller ved fremgangsmåten til Maxam et al., Methods of Enzymology, 65: 499 (1980).

Etter innføring av DNA inn i pattedyrcelleverten og seleksjon i medium for stabile transfektanter blir amplifikasjon av DEFR-protein-kodende sekvenser oppnådd ved dyrking av vertscellekulturer i nærvær av omtrent av omtrent 200-500 nM konsentrasjoner av metotreksat, en konkurrerende inhibitor til DHFR-aktivitet. Det effektive området av konsentrasjonen er selvfølgelig meget avhengig av naturen til DHFR-genet og karaktertrekkene til verten. Generelt definerte øvre og nedre grenser kan selvfølgelig ikke bli bekreftet. Egnede konsentrasjoner av andre folinsyreanaloger eller andre forbindelser som inhiberer DHFR kan også bli anvendt. MTX er derimot i seg selv hensiktsmessig, lett tilgjengelig og effektiv.

Komplekser dannet mellom fibrinolytiske enzymer og plasminogen kan bli anvendt som trombolytiske midler, som ytterligere beskrevet i Smith et al., US patent. 4.808.405 som er illustrert i eksempel 5 nedenfor. Forklart i korte trekk kan et enzymderivat bli preparert som omfatter et binært kompleks mellom streptokinase og plasminogen, der komplekset har et katalytisk sete som er essensielt for fibrinolytisk aktivitet blokkert av en gruppe som kan fjernes ved hydrolyse slik at pseudo-førsteordens hastighetskonstanten for hydrolyse av derivatet er i området 10-° sek-<1>til IO-<3>sek-<1>i isotonisk vandig medium ved pH 7,4 ved 37°C, forutsatt at gruppen blokkerer det katalytiske setet ikke er en p-guanidino-benzo-ylgruppe. Eksempler på egnede grupper omfatter acylgrupper såsom benzoyl, substituert benzoyl, akryloyl, eller sub-stituerte akryloylgrupper.

En fremgangsmåte for fremstilling av kompleksene omfatter blanding av streptokinase med plasminogen i nærvær av et overskudd av et blokkeringsmiddel med formel A-B eller E-F, der A er en gruppe som er selektiv for det katalytiske setet som er essensielt for fibrinolytisk aktivitet og som kan overføres fra gruppe B til det katalytiske setet, og B er en gruppe som letter kobling av A til enzymet; E er en lokal i-seringsgruppe som lokaliserer middelet i det katalytiske setet og F er en gruppe som kan overføres fra lokaliserings-gruppen til det katalytiske setet, og deretter eventuelt isolering av derivatene dannet på denne måten. Gruppen som kan fjernes ved hydrolyse er fortrinnsvis en acylgruppe, mest foretrukket er en benzoyl, substituert benzoyl, akryloyl eller substituert akryloylgruppe, f.eks. benzoyl substituert med halogen,<C>^—^alkyl,<C>]_6alkoksy,<C>i_0alkanoyloksy, eller C^_5alkanoylamino eller akryloyl substituert med C-j_0 alkyl, furyl, fenyl, eller C]_6alkylfenyl. AB er også fortrinnsvis p-nitrofenyl-p'-guanidinobenzoat, gruppe E er p-amidinofenyl eller p-acetamidofenyl og gruppen F er en benzoyl eller akryloylgruppe.

Foreliggende oppfinnelse kan benyttes til en farmasøytisk sammensetning som omfatter human plasminogenvariant. En slik sammensetning omfatter fortrinnsvis en farmasøytisk akseptabel bærer så som isoton vandig buffer eller "vann for injeksjon" med farmasøytisk kvalitet. Foreliggende oppfinnelse kan i tillegg benyttes til en farmasøytisk formuler-ing som omfatter en farmasøytisk akseptabel bærer sammen med et fibrinolytisk enzym, fortrinnsvis et kompleks av enzymet med plasminogenvarianten, mere foretrukket er et binært kompleks av streptokinase og plasminogenvariant, og mest foretrukket er et p-anisoyl streptokinase/plasminogenkompleks uten indre peptidbindingsspaltning, som i Smith et al., U.S. Pat. 4,808,405, supra. I en ytterligere utførelsesform blir det aktive setet til komplekset ansvarlig for fibrinolytisk aktivitet blokkert av en gruppe som kan fjernes ved hydrolyse slik at pseudo-førsteordens hastighetskonstanten for hydrolyse av komplekset er i området 10~° sek-<1>til IO-<3>sek-<1>i isotont vandig media ved pH 7.4 ved 37"C.

Sammensetningene blir formulert i henhold til standard prosedyrer som blir tilpasset for parenteral administrasjon til mennesker.

Sammensetningene for intravenøs administrasjon er vanligvis oppløsninger av det sterile derivatet i steril osoton vandig buffer. Hvor nødvendig omfatter sammensetningen også et oppløsningsmiddel for komplekset. Komplekset blir generelt tilveiebragt i enhetsdoseringsform, for eksempel som et tørt pulver eller vannfritt konsentrat i en forseglet container så som en ampulle. For administrasjon ved infusjon blir komplekset levert fra en infusjonsflaske inneholdende vann for injeksjon med steril farmasøytisk kvalitet. For administrasjon ved injeksjon blir komplekset levert fra en beholder med sterilt vann for injeksjon. Den injiserbare eller infuserbare sammensetningen vil bli dannet ved blanding av ingrediensene før administrasjon.

Den effektive mengden av komplekset som blir administrert vil avhenge avmange faktorer, inkludert mengden av fibrinolyse som er nødvendig og hastigheten som er nødvendig, grad av tromboemboli og posisjon og størrelse til blodklumpen, men mengden er vanligvis diktert av resultatet som blir oppnådd, dvs. lysering av blodklumpen. En pasient med lungeemboli eller en livstruende trombe vil f.eks. kreve administrasjon av en bolus av hurtigvirkende materiale. Hvor det er nødven- dig å forhindre dannelse av tromber etter operasjon er en liten mengde sakte-virkende materiale spesielt nyttig. Den nøyaktige dosen som blir anvendt og administrasjonsmåten kan bestemmes ifølge forholdene bestemt av legen. En pasient som blir behandlet for en trombe med middels størrelse mottar derimot generelt en dose på fra 0,10 til 1,0 mg/kg kroppsvekt daglig enten ved injeksjon (i opp til åtte doser) eller ved infusjon.

For å forenkle eksemplene og kravene vil visse fremgangsmåter som ofte fremkommer bli betegnet ved forkortede angivelser.

"Transfeksjon" betegner opptaket av en ekspresjonsvektor ved en vertscelle enten om kodende sekvenser blir uttrykt eller ikke. Det eksisterer mange fremgangsmåter for transfeksjon som er kjente for fagfolk, f.eks. CaPC«4 og elektroporasjon. Vellykket transfeksjon blir vanligvis oppdaget når en hvilken som helst indikasjon av driften av denne vektoren oppstår innenfor vertscellen.

"Transformasjon" betyr innføring av DNA inn i en organisme slik at DNA er replikerbar, enten som et ekstrakromosomalt element eller ved kromosomal integrering. Avhengig av vertscellen som blir anvendt blir transformasjon utført ved anvendelse av standardteknikker som er hensiktsmessige for slike celler. Kalsiumbehandling ved anvendelse av kalsium-klorid, som beskrevet av Cohen, S.N. Proe. Nati. Acad. Sei.

(USA), 69:2110 (1972); Mandel et al., J. Mol. Biol. 53:154

(1970); og nylig Liljestrom et al., Gene 40: 241-246 (1985), blir generelt anvendt for prokaryoter eller andre celler som inneholder vesentlige celle-vegg barrierer. For pattedyrceller uten slike cellevegger er kalsiumfosfatpresipitasjons-metoden (Graham, F. og van der Eb., A., Virology, 52: 456-457

(1978); Kingston, i Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, et al., eds., (John Wiley & Sons, New York: 1987), 1.8.1-1.8.3) foretrukket. Generelle aspekter av pattedyr-cellevertssystemtransformasjoner er blitt beskrevet av Axel i U.S. Pat. nr. 4,399,216 utstedt 16. august, 1983. Transforma-sjoner inn i gjær blir vanligvis utført ifølge fremgangsmåten til Van Solingen, P., et al., J. Bact., 130: 946 (1977) og Hsiao, C.L., et al., Proe. Nati. Acad. Sei. (USA) 76: 3829

(1979). Andre fremgangsmåter for innføring av DNA inn i celler så som ved nukleær injeksjon eller ved protoplastfu-sjon kan derimot også bli anvendt.

"Plasmider" blir angitt med en liten p etterfulgt og/eller begynt med store bokstaver og/eller tall. Utgangsplasmidene heri er kommersielt tilgjengelige, offisielt tilgjengelige på et uhemmet grunnlag eller kan bli konstruert fra slike tilgjengelige plasmider i henhold til publiserte prosedyrer. I tillegg er andre ekvivalente plasmider kjent innenfor fagområdet og være innlysende for fagfolk.

Teknikken "PCR" som anvendt heri refererer generelt til følgende: Små mengder av et spesifikt stykke DNA kan bli amplifisert ved anvendelse av polymerasekjedereaksjonen (PCR) som beskrevet i US Pat. nr. 4,683,195 utstedt 28. juli, 1987. Sekvensinformasjon fra slutten på stykket av interesse eller etter trenger å være tilgjengelig, slik at oligonukleotid-primere kan bli konstruert; disse primere vil peke mot hverandre og vil være identisk eller lik i sekvens med motsatte tråder av templatet som skal bli amplifisert. 5'-terminale nukleotider til de to primerne vil falle sammen med endene til det amplifiserte materialet. PCR kan bli anvendt for å amplifisere spesifikke DNA-sekvenser fra totalt genomisk DNA, cDNA transkribert fra totalt cellulært RNA, bakteriofag eller plasmidsekvenser, o.s.v. Se generelt H. Erlich, ed., PCR Technology, Stockton Press, NY, 1989.

Teknikken "PCR mutagenese" som anvendt heri betegner følgende "se Ehrlich, supra, kapittelet til R. Higuchi, s. 61-70): Når små mengder templat DNA blir anvendt som utgangsmateriale i en PCR kan primere som er noe forskjellig i sekvens fra den korresponderende regionen i et templat DNA bli anvendt for å danne relativt store mengder av et spesifikt DNA-fragment som er forskjellig fra templatsekvensen bare I posisjonene hvor primerne er forskjellige fra templatet. For introduksjon av en mutasjon inn i et plasmid DNA er en av primerne konstruert for å overlappe posisjonen til mutasjonen og inneholde mutasjonen; sekvensen til den andre primeren må være identisk med et område av sekvensen til den motsatte tråden til plasmidet, men denne sekvensen kan være beliggende hvor som helst i plasmid-DNA. Det er derimot foretrukket at sekvensen til den andre primeren er beliggende innenfor 200 nukleotider fra den første, slik at hele den amplifiserte regionen av DNA bundet av primerne til slutt lett kan bli sekvensert. PCR-amplifikasjon ved anvendelse av et primerpar som beskrevet ovenfor resulterer i en populasjon av DNA-fragmenter som er forskjellig ved posisjonen til mutasjonen spesifisert av primeren, og muligens ved andre posisjoner, idet templatkopi-erlng er tilbøyelig for feil.

I fremgangsmåten angitt nedenfor er forholdet mellom templat og produktmateriale meget lavt, og som et resultat har hovedmengden av produkt DNA-fragmenter inkorporert ønsket mutasjon(er). Dette produktmaterialet blir anvendt for å erstatte den tilsvarende regionen i plasmidet som virker som PCR-templat ved anvendelse av standard DNA-teknologi. Mutasjoner ved separate posisjoner kan bli innført samtidig ved enten anvendelse av en mutant annen primer, eller ved utførelse av en annen PCR med forskjellige mutantprimere og ligering av de to resulterende PCR-fragmentene samtidig til vektorfragmentet i en tre (eller mere) -del ligering.

PCR-mutageneseprosedyren anvendt i eksemplene nedenfor var som følger: Templatplasmid DNA (1 >jg) ble linearisert ved spaltning med en restriksjonsendonuklease som har et unikt gjenkjenningssete i plasmid DNA utenfor regionen som skal bli amplifisert. Av dette materialet ble 1-5 ng tilsatt til en PCR-blanding inneholdende 16.6 mM (NH4)2S04, 67 mM Tris.HCl (pH 8.8), 6,7 mM NgCl2, 6.7 uM EDTA, 10 mM 2-merkaptoetanol, ImM hver dATP, dCTP, dGTP og TTP, 170 ug/ml bovlnt serumalbumin, 25 pmol av hver oligonukleotldprimer og 1 ul Thermus aquaticus (Taq) DNA polymerase (5 enheter/ul, fra Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT og Emeryvllle, CA) 1 et sluttvolum på 50 ul 1 en 0.5-ml reaksjonsbeholder. Reaksjonsblandingen

.ble toppet med 35 ul mineralolje og skutt inn i en DNA-termalsykler (fra Perkin-Elmer/Cetus) programmert som følger:

Hver fil vist ovenfor ble koblet til den som står på neste linje. På sluttet av programmet ble reaksjonsbeholderen fjernet fra termalcyklen og den vandige fasen ble overført til en ny beholder, ekstrahert med fenol/kloroform/isoamyl-alkohol (50:50:1 vol), og etanolpresipitert, og DNA ble isolert ved standard prosedyrer. Dette materialet ble deretter utsatt for hensiktsmessige behandlinger for innskudd inn i en vektor.

"Kutting" av DNA betegner katalytisk kutting av DNA med et enzym som bare virker spesifikke nukleotidsekvenser i DNA. Slike enzymer blir betegnet restriksjonsenzymer, og sekvensen som denne er spesifikk for er betegnet et restriksjonssete. De forskjellige restriksjonsenzymene anvendt heri er kommersielt tilgjengelige og reaksjonsbetingelsene, kofaktorene og andre krav bestemt av enzymforhandlerne blir anvendt. Restriksjonsenzymene blir vanligvis betegnet med forkortelser bestående av en stor bokstav etterfulgt av andre bokstaver som representerer mikroorganismen som hvert restriksjonsenzym opprinnelig var oppnådd fra og deretter et tall som betegner

det bestemte enzymet. Generelt blir omtrent et jjg plasmid eller DNA-fragment anvendt med omtrent 1-2 enheter enzym i omtrent 20 ul bufferoppløsning. Hensiktsmessige buffere og substratmengder for bestemte restriksjonsenzymer er spesifisert av forhandleren. Inkubasjon i omtrent 1 time ved 37"C blir vanligvis anvendt, men kan variere i henhold til forhandlerens instruksjoner. Etter inkubasjon blir protein fjernet ved ekstraksjon med fenol og kloroform, og spaltet nukleinsyre blir isolert fra den vandige fraksjonen ved presipitasjon med etanol. Når dette er hensiktsmessig blir spaltning med et restriksjonsenzym etterfulgt av bakteriell alkalisk fosfatase-formidlet hydrolyse av terminale 5'-fosfater for å forhindre at de to endene til et DNA-fragment "sirkulariserer" eller danner en lukket løkke som vil forhindre innskudd av et annet DNA-fragment ved restrik-sjonssetet. Dersom ikke annet er angitt blir spaltning av plasmidene ikke etterfulgt av 5'-terminal defosforilering. Prosedyrer og reagenser for defosforylering er det konven-sjonelle (T. Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory, 1982) s. 133-134).

"Tilveiebringing" eller "isolasjon" av et gitt fragment av DNA fra en restriksjonsspaltning betyr separasjon av spaltningen på polyakrylamid eller agarosegel ved elektroforese, identifikasjon av fragmentet av interesse ved sammenligning av dets mobilitet i forhold til mobiliteten til markør-DNA-fragmenter med'kjent molekylvekt, fjerning av gel-biten som inneholder det ønskede fragmentet og separasjonen av gelen fra DNA. Denne prosedyren er generelt kjent. Se for eksempel R. Lawn et al., Nucleic Acids Res. 9:6103-6114 (1981) og D. Goeddel et al., Nucleic Acids Res. 8:4057 (1980).

"Ligering" betegner fremgangsmåten for dannelse av fosfo-diesterbindinger mellom to dobbelttrådete nukleinsyre-fragmenter (T. Maniatis et al., 1982, supra, s. 146). Dersom det ikke blir oppnådd på annen måte kan ligering oppnåes ved

anvendelse av kjente buffere og betingelser med 10 enheter T4 DNA-ligase ("ligase") per 0.5 ug omtrent ekvimolare mengder av DNA-fragmenter som skal bli ligert.

"Preparering" av DNA fra transformanter betyr isolering av plasmid DNA fra mikrobiell kultur. Dersom ikke annen metode er tilgjengelig kan alkalisk/SDS metoden til Maniatis et al., 1982, ovenfor, s. 90 bli anvendt.

"Oligonukleotider" er polydeoksynukleotider med kort-lengde, enkelt- eller dobbelt-trådete som blir kjemisk syntetisert ved kjente fremgangsmåter (så som fosfotriester, fosfit, eller fosforamiditkjemi, ved anvendelse av fast fase-teknikker som beskrevet i EP Pat. pub. nr. 266,032 publisert 4. mai, 1988, eller via deoksynukleosid H-fosfonatmellomproduk-ter som beskrevet av Froehler et al., Nucl. Acids Res., 14: 5399-5407 (1986)). De blir deretter renset på polyakrylamid-geler.

"Sete-rettet mutagenese" er en teknikk som er standard innenfor fagområdet, og blir utført ved anvendelse av en syntetisk oligonukleotidprimer komplementær til et enkelt-trådet fag-DNA som skal bli mutagenisert med unntagelse av begrenset feilparring som representerer den ønskede mutasjonen. Det syntetiske oligonukleotidet blir anvendt som en primer for å lede syntesen av en tråd komplementær til fagen, og resulterende dobbelt-trådet DNA blir transformert inn i en fag-underholdende vertsbakterie. Kulturer av transformerte bakterier blir sådd ut i toppagar, som muliggjør plaque-dannelse fra enkeltceller som inneholder fagen. Teoretisk vil 50$ av nye plaques inneholde fagen som har, som en enkelt tråd, mutert form; 50$ vil ha opprinnelig sekvens. Plaques blir hybridisert med kianse-behandlet syntetisk primer ved en temperatur som muliggjør hybridisasjon av en nøyaktig parring, men med denne temperaturen er feilparringer med den opprinnelige tråden tilstrekkelig for å forhindre hybridi-

sering. Plaques som hybridiserer med proben blir deretter valgt og dyrket, og DNA isolert.

Følgende eksempler er ment å illustrere den beste fremgangsmåten som nå er kjent for å utføre oppfinnelsen, men oppfinnelsen skal ikke være begrenset av denne.

EKSEMPEL 1

Konstruksjon av t- PA intermediat- ekspresjonsvektorer Forskjellige t-PA-vektorer ble avledet fra opphavsvektor pSVI-tPA ved endring av et antall trekk ved spleisedonor-intron-spleise-akseptorenheten med den spesifikke hensikten av å øke effektiviteten for riktig fjerning av intronet.

a. pSVI- tPA

Porsjoner av to nøyaktig beskrevne pattedyrekspresjonsvekto-rer, pRK-tPA og pE348DHFRUC, ble kombinert for dannelsen av pSVI-tPA.

Pattedyrekspresjonsvektor pRK-tPA ble fremstilt fra pRK5 (beskrevet i EP 307,247, ovenfor, hvor pCIS2.8c28D utgangs-plasmidet er beskrevet i EP 278,776 publisert 17. august, 1988) og fra t-PA cDNA (Pennica et al., Nature, 301: 214

(1983)). cDNA ble preparert for innskudd inn i pRK5 ved spaltning med restriksjonsendonuklease Hindlll (som kutter 49 basepar 5' for ATG-startkodonet) og restriksjonsendonuklease Ball (som kutter 276 basepar nedstrøms for TGA-stoppkodonet). Dette cDNA ble ligert inn i pRK5 på forhånd spaltet med Hindlll og Smal ved anvendelse av standard ligeringsmetodo-logi (Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1982). Denne konstruksjonen ble betegnet pRK-tPA og er vist i figur 2.

pRK-tPA driver den effektive syntesen av t-PA ved transient transfeksjon inn i humane 293 fibroblaster. Vektoren inneholder cytomegalovirus immediate early gen-enhancer og promoter, CMV-IE spleisedonorsetet og en del av det asso-

sierte intronet, bakteriofag SP6 promoter, en del av IgVg intronet og assosiert spleiseakseptor, cDNA kodende t-PA, SV40 tidlig polyadenylerin ("polyA") region, og SV40 replikasjonsorigo ("ori") i plasmid pTJC118.

Vektoren pE348DHFRUC (Vannice og Levinson, J. Virology, 62: 1305-1313 (1988) der den er betegnet pE, figur 1) inneholder SV40 enhancer og tidlig promoterregion oppstrøms for Hindlll-setet (posisjon 5171 i viruset), etterfulgt av cDNA kodende for murin dihydrofolatreduktase (DHFR) som er etterfulgt av 584-bp Hepatitt B-virus (HBV) polyA-signal i plasmid pMLl fra BamHI til Bglll-setene til HBV. Dette plasmidet inneholder en polylinker rett oppstrøms for SV40-sekvensene.

Deler av vektorene pRK-tPA og pE348DHFRUC ble isolert som følger (fig. 2): 1. Vektor pRK-tPA ble kuttet med restriksjonsenzym SacII og deretter behandlet med det store ("Klenow") fragmentet til E. coli DNA polymerase I ("poll") for å fjerne 3'-overhengende ender dannet ved SacII-spaltning. Dette ble etterfulgt av kutting med restriksjonsenzym Spel. Det større fragmentet/- inneholdende en del av CMV-transkriberte sekvenser, spleise-donor-intron-spleise-akseptorenhet ("Intron" i fig. 2), t-PA cDNA, SV40 polyA og ori-regioner, og pUC118, inkludert noen få nukleotider fra 5'-enden av CMV, ble isolert fra en polyakrylamidgel etter elektroforetisk separasjon av fragmentene ("gel-isolert"). 2. Vektor pE348DHFRUC ble kuttet med enzymet Clal og resulterende 5'-overhengende ender ble ifylt ved anvendelse av Klenow poll i nærvær av alle fire deoksyribonukleotidene (dNTPs: dATP, dGTP, dCTP, TTP). Etter påfølgende kutting med Xbal, ble SV40 transkripsjonsregulatoriske sekvenser (enhancer og early-promoter, inkludert SV40 early seter av transkripsjonsinltieringen), tilstede på det mindre Xbal-Clal-fragmentet (360 nukleotider) gelisolert.

Isolerte pRK-tPA og pE348DHFRUC-fragmenter ble ligert for å danne vektor pSVI-tPA.

b. pSVI2- tPA

Vektor pSVI2-tPA ble fremstilt som vist i figur 3, der spleisedonorsetet til vektor pSVI-tPA ble mutert ved ligering av tre fragmenter, preparert som beskrevet nedenfor. Nukleotidene -3(G) og -1(C) relativt til 5'-ekson/intron-grensen til pSVI-tPA ble forandret henholdsvis til C og G, for å gjøre spleisedonorsekvensen identisk med consensus-sekvensen CAG/GUAAGU. Dette ble oppnådd som følger: 1. Vektor pSVI-tPA ble kuttet med Hindlll og Bglll for å danne et lite fragment inneholdende hovedsakelig spleise-donor-intron-spleise akseptorenheten mellom de to Hindlll-setene i posisjonene 381 og 618, et annet lite fragment inneholdende en 5'-del av t-PA cDNA beliggende mellom Hindlll og Bglll-setene i posisjonene 618 og 770, og et stort fragment inneholdende det gjenværende av pSVI-tPA DNA. Etter bakteriell alkalisk fosfatase ("BAP") behandling, ble de tre fragmentene separert ved gelelektroforese og det største fragmentet ble isolert. 2. Vektor pSVI-tPA ble separat kuttet med Rsal og Bglll, og 327-nukleotidfragmentet som rekker fra Rsal-setet i posisjon 443 til Bglll-setet i posisjon 770 ble gelisolert. Dette fragmentet inkluderer 3'-delen av intronet, spleiseakseptor og en 5'-del av t-PA cDNA. 3. To oligonukleotider ("primere" i figurene 3-7) ble syntetisert. Det første (SVI379) tilsvarer nukleotidene 379 til 400 (øvre tråd) av pSVI-tPA, med unntagelse av en G til C-forandring i posisjon 390 innført for å danne sekvensen gjenkjent av restriksjonsendonuklease Eagl (CGGCCG), og som overlappet et Hindlll-sete. Det hadde følgende sekvens (posisjon til forandringen er understreket):

Det andre oligonukleotidet (SVI448) hadde identisk sekvens med den nedre tråden av pSVI-tPA mellom posisjonene 448 og 427, med unntagelse av en G til C forandring ved den 11. nukleotiden og en C til G forandring ved nukleotid -13. Det omfatter et Rsal-sete like 5' for de to enkelte nukleotidfor-andringene. Sekvensen til dette oligonukleotidet, der forskjellene fra tilsvarende pSVI-tPA sekvens understreket, var som følger:

De to oligonukleotidene ble anvendt for å amplifisere ved PCR regionen av pSVI-tPA mellom posisjonene 379 og 448, som omfatter spleisedonoren. PCR-produktene ble spaltet med Hindlll og Rsal, og 62-nukleotidfragmentet ble gel-isolert.

De tre isolerte fragmentene ble ligert og ført inn i E. coli MM294. Plasmid DNA ble isolert fra flere ampicillin-resistente kolonier, og nukleotidsekvensen av et isolat (PSVI2-TPA), som hadde de tre fragmentene ligert i ønsket rekke-følge, ble bestemt for å verifisere tilstedeværelsen av nukleotidforandringer spesifisert ved de to primerne og integriteten til regionen avledet fra det amplifiserte fragmentet.

c. pSVI3- tPA

Vektor pSVI3-tPA ble fremstilt som vist i figur 4. To ved siden av liggende regioner av pSVI2-tPA ble amplifisert ved PCR ved anvendelse i hvert tilfelle av et oligonukleotid identisk med pSVI2-tPA-sekvensen og et mutant oligonukleotid som spesifiserer de ønskede forandringene. Disse fragmentene ble anvendt for å erstatte de korresponderende regionene i pSVI2-tPA. Fragmentene som ble isolert var som følger:

1. Vektor pSVI-tPA ble spaltet med Hindlll, spaltningen behandlet med BAP og to HindiII-fragmenter ble separert ved gelelektroforese. Det større fragmentet ble isolert fra gelen; det inneholdt alle pSVI2-tPA-sekvenser, med unntagelse av 237-nukleotid HindIII-fragmentet som innbefatter spleise-donor-intron-spleiseakseptorenheten. 2. Et nytt oligonukleotid (SVI525Bam) ble syntetisert for PCR-mutagenese av ATG-trinukleotidet innenfor pSVI2-tPA intronet. Det hadde indetisk sekvens med den nedre tråden til pSVI2-tPA fra nukleotid 525 til nukleotid 497, med unntagelse av en T til A forandring i posisjon 516, en A til C forandring i posisjon 519 og en T til G forandring i posisjon 523. Den første forandringen ble konstruert for å endre ATG trinukleotidet til TTG; den andre og tredje for å danne gjenkjenningssekvensen for enzym BamHI (GGATCC). Nukleotidsekvensen til SVI525Bam var som følger (forskjeller i forhold til pSVI2-tPA-sekvensen understreket):

01igonukleotidene SVI379 (se ovenfor) og SVI525Bam ble anvendt for å amplifisere ved PCR-mutagenese av regionen mellom posisjonene 379 og 525 av pSVI2-tPA med inkorporering av forandringene spesifisert av SVI525Bam. Reaksjonsprodukt-ene ble spaltet med Hindlll og BamHI og det resulterende 137-nukleotidfragmentet ble gel-isolert. 3. Oligonukleotid SVI539Bam ble syntetisert for PCR-mutagenese av pSVI2-tPA forgreningspunktregionen. Det tilsvarer pSVI2-tPA sekvensen (øvre tråd) fra posisjon 539 til posisjon 573, men hadde følgende forandringer: en G istedenfor T ved 541; en T istedenfor C ved 544; en C istedenfor A ved 545; en C istedenfor A ved 553; og en G istedenfor A ved 555. De første tre forandringene dannet et BamHI-gjenkjenningssete, mens de siste to var ment å danne et signal som ligner forgreningspunktsekvens (BPS) konsensus. Nukleotidsekvensen til SVI539Bam var som følger (forandringer i forhold til pSVI2-tPA-sekvensen er understreket):

Oligonukleotid SVI625 ble syntetisert og var identisk med den nedre tråden til pSVI2-tPA-sekvensen fra posisjon til 625 til posisjon 603, med unntagelse av en A til C forandring i posisjon 617, konstruert for å danne et BstBI-restriksjonssete (TTCGAA). Sekvensen til SVI625 var (forandringer er understreket):

Oligonukleotidene SVI539Bam og SVI625 ble anvendt for å amplifisere ved PCR regionen til pSVI2-tPA mellom nukleotidene 529 og 625 og samtidig inkorporering av ønskede forandringer. PCR-produktene ble spaltet med Hindlll og BamHI, og 77-nukleotidfragmentet ble gelrenset.

De tre fragmentene (fig. 4) ble ligert og ført inn i E. coli MM294. Plasmid DNA ble isolert fra et antall ampicillin-resistente kolonier og analysert ved spaltning med hensiktsmessige restriksjonsenzymer og gelelektroforese for tilstedeværelse av alle tre fragmentene i en kopi hver. Den relative orienteringen av fragmentene ble også bestemt ved denne analysen. Nukleotidsekvensen til et rekombinant plasmid (pSVI3-tPA) som hadde de tre konstituentfragmentene arrangert i samme rekkefølge som i pSVI2-tPA, ble bestemt i regionen som dekker de tre rekombinasjonssetene (to Hindlll-seter og BamHI-setet), inkludert alle sekvenser mellom disse setene.

d. pSVI5- tPA

Vektor pSVI5-tPA ble konstruert fra pSVI3-tPA ved erstatning av en del av intronet og spleiseakseptoren med et PCR-dannet mutant fragment (som vist i figur 5). Nukleotid-16 (G) relativt til 3'-spleisegrensen til pSVI3-tPA ble modifisert til nukleotid T for å danne en uavbrutt 16 nukleotid lang polypyrimidinområde som en del av spleiseakseptoren. Vektorene ble også modifisert å inneholde et potensielt grenaksep-tor-nukleotid i posisjon -23 relativt til 3' splelsegrensen, innbefattet innenfor sekvensen GACTTATT som er komplementær med spleisedonorsekvensen (G/GTAAGT) i denne vektoren. Overlappende denne BPS er en annen BPS (TACTGAC) som svarer til "vid" BPS concensus og er komplementær med U2 snRNA-sekvensen. Grenakseptornukleotidet i denne BPS er beliggende i posisjon -27 relativt til 3'-spleisegrensen. Vektoren blir til slutt modifisert ved innskudd av en tredje BPS like oppstrøms for de to BPS i pSVI3-tPA. Denne tredje BPS er identisk med konservert gjær BPS (UACUAAC) og svarer til "vid" pattedyr BPS consensus (PyNCUPuAC). Grenakseptoren i denne BPS er beliggende i posisjon -34 relativt til 3' splelsegrensen.

Fragmenter for dannelse av pSVI5-tPA ble fremstilt som følger: 1. VektorpSVI3-tPA ble kuttet med BamHI og resulterende 5' overhengende ender ble ifylt med T4 DNA-polymerase i nærvær av alle fire dNTP. Materialet ble deretter kuttet med BstBI, behandlet med BAP, og det større fragmentet inneholdende alle unntatt del av intronet og spleiseakseptorsekvensen til pSVI3-tPA gelisolert. 2. To nye oligonukleotider ble syntetisert for anvendelse i suksessive PCR-amplifikasjoner uten mellomliggende isolering av produkt. Denne tilnærmingen for innføring av forskjellige mutasjoner ble valgt for å unngå anvendelse av et enkelt langt oligonukleotid med mange feilparringer til målforbind-elsen; lengre syntetiske oligonukleotider inneholder ofte et stort antall molekyler med uriktig sekvens. Det første oligonukleotidet alene kan i tillegg i fremtiden bli anvendt for å danne en vektor som er forskjellig fra pSVI3-tPA i grenpunktet og spleiseakseptorregionene.

Det første oligonukleotidet, SVI4, hadde dets 3' terminale tretten nukleotider felles med pSVI3-tPA (posisjonene 545-557). Foran disse var 22 nukleotider av sekvensen lik, men ikke identisk, til pSVI3-tPA sekvensen mellom posisjonene 523 og 544. Forskjellene var som følger (nedenfor understreket): en G til T forandring ved posisjon 528; en A til T ved 535, en C til A ved 537, en C til T ved 538, og en A til T ved 539; og en G til T forandring ved posisjon 544. Den siste forandringen ville forårsake en ekstensjon av polypyrimidin-trakten til spleiseakseptoren; den første ville endre pSVI3-tPA-sekvensen GACTGAC for å være i samsvar med BPS-consensus-sekvensen som parer U2. De gjenværende fire enkelte nukleotid-forandringene ble konstruert for å danne en sekvens komplementær til spleisedonoren. Sekvensen til SVI4 var:

Det andre oligonukleotidet (SVI5) overlappet den sentrale delen av SVI4. Det var forskjellig i de fem 5'-terminale nukleotiden til SVI4 og utstrakt i 5'-retning for inkorporering av gjær BPS (TACTAAC). Sekvensen derav var (understreket er forskjellene i forhold til tilsvarende pSVI3-tPA-sekvens):

BPS/spleiseakseptorregionen til pSVI3-tPA ble amplifisert og mutert ved PCR-mutagenese ved anvendelse av oligonukleotidparet SVI4/SVI625. PCR-produktene ble fortynnet og reamplifi-sert med oligonukleotidparet SVI5/SVI625. Produktene ble behandlet med T4 DNA polymerase og T4 polynukleotidkinase og spaltet med restriksjonsenzym BstBI, og 71-nukleotidfragmentet ble gelisolert.

De to isolerte fragmentene (Fig. 5) ble ligert, og plasmid DNA ble tilveiebragt fra transformerte (ampicillin-resistente) bakterielle kolonier og analysert som beskrevet ovenfor for pSVI3-tPA. Et isolat som inneholdt alle ønskede intronforandringer ble betegnet pSVI5-tPA.

Sekvensbestemmelse identifiserte en ytterligere uforutsatt forandring utenfor spleisedonor-intron-spleiseakseptorenheten. To ytterligere nukleotider (GC) var tilstede i pSVI5-tPA innenfor BstBI-setet til pSVI3-tPA (TTCGAA forandret til TTCGCGAA), der setet derfor var fraværende fra pSVI5-tPA. To ytterligere nukleotider dannet derimot et restriksjonssete for enzym Nrul som er unikt i vektoren. De ytterligere nukleotidene var mest sannsynlig et resultat av en uanti-sipert ifylling av BstBI-overhengende ender til de to konstituentfragmentene anvendt for ligering.

e. pSVIB- tPA

pSVI6B-tPA ble dannet ved en metode som ligner den som er beskrevet ovenfor for pSVI5-tPA, ved anvendelse av to suksessive ampiifikasjoner med delvis overlappende mutant-oligonukleotider for dannelse av de ønskede forandringene i intron-spleiseakseptorregionen til pSVI3-tPA (som vist i fig. 6).

Det første oligonukleotidet (SVI6A) hadde følgende sekvens (forskjeller i forhold til pSVI3-tPA, posisjonene 523-550, understreket): og det andre (SVI6B; sammenlignet med posisjonene 523-545 til pSVI3-tPA):

Nukleotiderstatningene i SVI6A var: T til C ved 524, T til G ved 526, G til C ved 528 og G til T ved 544. Forandringer spesifisert av SVI6B var: innskudd av en C mellom nukleotidene 525 og 526 i pSVI3-tPA, innskudd av en G mellom nukl eo tidene 526 og 527, erstatning av G i posisjon 528 med en C og G til T forandring i posisjon 544. Disse forandringene ble konstruert for å optimalisere pSVI3-tPA BPS og innføre en annen BPS som bare flankerer denne til 5'-siden; idet disse to grenpunktsekvensene overlapper ved den sentrale C og er vist uthevet i SVI6B-sekvensen.

Suksessive amplifikasjoner med oligonukleotidene SVI6A og SVI6B i nærvær av SVI625 ble utført for å modifisere pSVI3-tPA intron-spleiseakseptorenheten som beskrevet for pSVI5-tPA. Enzymatisk behandling av PCR-produktene, gelisolering, og ligering til pSVI3-tPA store BamHI-BstBI fragmentet var også som beskrevet for pSVI5-tPA. Nukleotidsekvensanalyse av plasmid DNA fra en ampicillin-resistent bakteriell koloni (dette plasmidisolatet ble betegnet pSVI6B-tPA) viste flere uforutsatte forandringer i tillegg til modifikasjonene spesifisert ved SVI6B-oligonukleotidet; posisjon 545 var en T istedenfor C i pSVI3-tPA; posisjon 550 var også en T istedenfor en C; og det ytterligere dinukleotidet som danner Nrul-restriksjonssetet i pSVI5-tPA var også tilstede i pSVI6B-tPA sekvensen. De første to forandringene er ikke ventet å påvirke tPA-ekspresjon i negativ retning og ble ikke korri-gert.

Konstruks. ion av meget anvendbar parental vektor pSVI6B5

En meget anvendbar parental vektor for ekspresjon av forskjellige polypeptider ble avledet fra pSVI6B-tPA. Denne vektoren, betegnet pSVI6B5 (transformert E. coli stamme ATCC nr. 68,151) inneholder polylinkerregioner istedenfor tPA cDNA i pSVI6B-tPA. Disse polylinkerregionene tilveiebringer hensiktsmessige, unike restriksjonsendonuklease-gjenkjenningsseter som kan bli anvendt for å innføre en hvilken som helst sekvens som koder for et polypeptid av interesse.

Vektor pSVI6B5 ble dannet i fire trinn, som beskrevet nedenfor. De første tre trinnene omfatter fjerning av BamHI, Hindlll og Sali restriksjonssetene fra pSVI6B-tPA; og som en konsekvens, ved erstatning av t-PA cDNA med polylinkeren i det siste trinnet, var polylinkersetene til disse enzymene unike i det resulterende parentale ekspresjonsplasmidet.

a. Konstruksjon av første intermediærplasmid pSVI6B- tPAd( b)

Vektor pSVI6B-tPA ble spaltet med BamHI som bare spalter innenfor intronet, og resulterende 5'-overhengende ender ble ifylt med T4 DNA-polymerase i nærvær av dNTP, og den linerar-iserte vektoren ble gelisolert og behadlet med T4 DNA-ligase for resirkulering. Dette forårsaket tap av BamHI-gjenkjen-ningssekvens og gjenkjenningssekvensen for enzymet Clal ble dannet istedenfor. På grunn av metylering kan Clal ikke spalte denne sekvensen når plasmid DNA er oppnådd fra dam<+>E. coli.

b. Konstruksjon av andre intermediærplasmid pSVI6B- tPAd( bh) PlasmidpSVI6B-tPAd(b) ble spaltet med Hindlll som spalter ved begge sidene av spleiseenheten, 5'-overhengende ender ble ifylt med T4 DNA-polymerase i nærvær av alle fire dNTP, og en del av reaks jonsb landingen ble behandlet med BAP. De to fragmentene tilstede i både det ubehandlede og behandlede materialet ble separert ved gelelektroforese; det større fragmentet ble isolert fra det behandlede materialet og det mindre fragmentet fra ubehandlet materiale. De to fragmentene ble ligert for å danne plasmid pSVI6B-tPAd(bh). Ifylling av Hindlll-endene til begge konstituentfragmentene forårsaket tap av de to Hindlll-setene i det resulterende plasmidet og dannet to nye gjenkjenningsseter for enzymet Nhel. c. Konstruksjon av tredje intermediærplasmid pSVI6B- tPAd( bhs) Det enkelte Sall-gjenkjenningssetet ble fjernet fra plasmid pSVI6B-tPAd(bh) ved spaltning med dette enzymet, T4 DNA polymerasebehandling i nærvær av dNTP, gelisolering av lineært plasmid-DNA og resirkulering ved anvendelse av T4 DNA-ligase. Dette resulterte dannelse av et nytt Pvul-gjenkjenningssete.

d. Konstruksjon av plasmid pSVI6B5

For dannelse av det endelige, multi-hensikt parentale plasmidet, ble to fragmenter preparert som følger: 1. Plasmid pSVI6B-tPAd(bhs) ble spaltet med Pstl og Clal. Det er tre gjenkjenningsseter for Clal i dette plasmidet: et i intronet foran t-PA-sekvensen, et ved grensen ved t-PA cDNA og SV40 tidlig poly A region og et mot slutten av poly A regionen. Bare et av disse setene, det andre, er ufølsom for metylering. Dermed ble plasmid DNA preparert fra dam<+>MM294 kuttet av Clal ved bare dette setet. Et Pstl gjenkjenningssete er beliggende ved grensen til denne spleiseenheten og t-PA cDNA, og flere er tilstede i t-PA-sekvensen mellom denne posisjonen og det metylerings-ufølsomme Clal-setet. Kutting med Pstl og Clal resulterte dermed i frigjøring av flere mindre fragmenter, inneholdende t-PA-sekvenser, og et stort fragment inneholdende alle pSVI6B-tPAd(bhs) sekvensene med unntagelse av t-PA cDNA. Dette større fragmentet ble gelisolert. 2. To oligonukleotider ble syntetisert. Disse var komplementære over hele lengden (47 nukleotider) av den første (betegnet 5A). Den andre, 5B, ble utvidet ved 5'-enden med to nukleotider, og ved dennes 3'-ende med fire (understreket i 5B-sekvensen nedenfor). Sammensmeltning av disse komplementære oligonukleotidene resulterte dermed i et DNA-fragment med en 5' og en 3' overhengende ende ("overheng"). Sekvensen til fire -nt 3' overhengende ende var TGCA-3', som er komplementær til 3'-overhenget dannet ved Pstl-spaltning av Pstl-gjenkjenningssetene. To-nt 5'-overhengende ende består, av dinukleotidet 5<*->CG, som er komplementær med 5'-overhenget dannet ved Clal-spaltning av Clal-restriksjonssetene. Sekvensene til de to oligonukleotidene ble ytterligere konstruert for å tilveiebringe gjenkjenningssetet for et antall restriksjonsendonukleaser (noen av disse er angitt under sekvensen for hvert oligonukleotid vist nedenfor). Sekvensen til oligonukleotid 5A var:

Sekvensen til oligonukleotid 5B var:

01igonukleotidene 5A og 5B ble sammensmeltet og ligert til det isolerte pSVI6B-tPAd(bhs) fragmentet for å danne plasmid pSVI6B5. Ligering av Pstl-overhenget til TGCA 3 *-overhenget til sammensmeltede oligonukleotider regenererte ikke et Pstl-sete, men dannet et Clal-sete; ved den andre enden av linkeren, ligering av Clal-overhenget til 5'-CG overhenget regenererte ikke et Clal-sete.

EKSEMPEL 2

Konstruksjon av HPg og R561SPg ekspresjonsvektorer.

CHO- celletransformasjon dermed og rensing

Generelle fremgangsmåter

01igonukleotidene anvendt for mutagenese av cDNA for dette eksemplet og påfølgende eksempler ble syntetisert ved anvendelse av enten (1) fosforamiditkjemi på en Biosearch (San Rafael, CA) Cyclone to-kolonne DNA syntesizer, med rensing med anvendelse av Applied Biosystems (Foster City, CA) oligonukleotidrensningsbeholdere, eller (2) H-fosfonat-kjemi som beskrevet av Froehler et al., Nucl. Acids. Res., 14: 5399-5407 (1986).

Celletransfeksjoner ble utført ved kalsiumfosfatmetoden (Kingston, i Current Protocols in Molecular Biology, ovenfor).

Plasmid DNA ble renset ved CsCl/etidiumbromid (EtBr) grad-ientsentrifugering (Moore, i Current Protocols in Molecular

Biology, Ausubel et al., eds. (John Wiley & Sons, New York, 1987), s. 1.7.1.-1.7.4), med en Beckman (Palo Alto, CA) L5 65 preparatlv ultrasentrlfuge. En vertikal rotor (Vti.65.1) sentrifugering ble anvendt i 7 t ved 55.000 rpm, og ved 15°C for å separere DNA-båndene. Etter at det ønskede materialet var tilveiebragt fra sentrifugerøret ble EtBr fjernet fra plasmid DNA ved ekstraksjon inn i en oppløsning av isopropa-nol mettet med CsCl. DNA ble deretter dialysert mot en buffer bestående av 1 mM Tris-HCl/0.1 mM EDTA, pH 7.1, før celle-transf eks j oner.

Konstruksjon av R561S Ekspresjonsvektor pA475R561SPg

Et plasmid betegnet pUC119PN127.6 (sekvensen derav er vist i figur 1 med unntagelsen angitt ovenfor med hensyn på nukleotid 3809) ble fremstilt som følger. Et første cDNA ble isolert fra et n-oligo(dT)primet cDNA-bibliotek konstruert fra lever mRNA isolert fra fem individer. (Okyama et al., Mol. Cell. Biol., 2: 161-170 (1982) og Gubler et al., Gene, 25: 263-269 (1983)). Størrelse-selektert cDNA (større enn 600 basepar ble ligert inn i XgtlO bakteriofagvektorer (Strata-gene, San Diego, California), og screenet uten ampiifikasjon (Drayna et al., Nature, 327:632-634 (1987)). cDNA ble ligert til XgtlO vektoren ved anvendelsen av en linker som følger.

En \gtl0 cDNA-klon ble isolert med en 75-base oligonukleotid-probe (PL.l), tilsvarende nukleotidene 1, 306-1,380 av humant plasminogen cDNA (Forsgren et al, FEBS Lett., 213: 254-260

(1987)). Filtrene ble hybridisert i 5 x SSC (150 mM NaCl, 15 mM trinatriumcitrat), 50 mM natriumfosfat, (pH 6.7), 5 X Denhardts oppløsning, 20$ formamid, 10% dekstransulfat, og 20 ug/ml kokt, sonikert laksesperm DNA ved 42°C overnatt og vasket i en time i 2 X SSC, 0,1S6 SDS ved 55"C og utsatt for røntgenfilm. En XgtlO klon (betegnet XgtlO:pmgn#127) ble spaltet med Sstl og ligert til Sstl-kuttet pUC119 for å tilveiebringe pUC119PN127.6, et nukleotid og en avledet aminosyresekvens som er illustrert i figur 1, med unntagels-ene angitt ovenfor. Nukleotidsekvensen til {Glu^Pg i pUC119PN127.6 viste tilstedeværelse av Val<475>istedenfor Ala.

Klonen ble deretter sekvensert fullstendig. DNA-sekvensana-lyse ble utført ved dideoksykjedetermineringsmetoden på begge trådene til subklonet dobbelt-trådet cDNA (Sanger et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 74: 5463-5467(1977)) enten direkte på dobbelttrådet DNA eller enkelt-trådete templater (Chen et al., DNA, 4: 165-170 (1985 ) etter subkloning inn i en pUC119-vektor.

Vektoren pA475R561SPg inneholdende riktig human Pg-sekvens med unntagelse av en serin i posisjon 561 ble konstruert som følger og som vist i figur 7: pSVI6BtPA ble spaltet med EcoRI, ifylt til butte ender EcoRI-setet og deretter spaltet med Pstl og det store fragmentet ble isolert. pUC119PN127.6 ble spaltet med SphI og ifylt til butt ende Sphl-setet, og deretter spaltet med EcoRI, og det lille fragmentet omfattende 3'-enden av HPg cDNA ble isolert; pUC119PN127.6 ble også spaltet med Pstl og EcoRI og det lille fragmentet ble isolert omfattende hele 5'-enden av cDNA kodende for HPg. Disse to små fragmentene og det store fragmentet fra pSVI6BtPA ble ligert sammen med anvendelse av T4-ligase for å produsere plasmid pSVI6BPlgn. Dette plasmidet ble spaltet med Pstl og EcoRI og det lille fragmentet (258-bp) ble isolert (fragment A). pSVI6BPlgn ble også utsatt for sete-spesifikk mutagenese av cDNA for HPg ved anvendelse av fremgangsmåten til Kunkel et al., Meth. Enzym., 154: 367-382

(1987) og ved anvendelse av en primer for R561S forandring som følger: Kolonier ble screenet ved tilstedeværelse av det nye BamHI-restriksjonsendomikleasesetet også skutt inn i cDNA som et resultat av disse mutasjonene. Det resulterende plasmidet ble betegnet pSVIR561SPg.C2. Dette plasmidet ble kuttet med SphI, og ifylt til butt ende Sphl-setet, og kuttet med EcoRI og det lille fragmentet (2.32 kb) ble isolert (fragment B). Det tredje fragmentet ble preparert fra pSVI6BtPA ved spaltning av dette plasmidet med EcoRI, og ifylt til butt ende EcoRI-setet og kuttet med Pstl, og isolering av det store fragmentet (fragment C).

Fragmentene A, B og C ble ligert med T4 ligase for å tilveiebringe plasmid pR561SPg inneholdende vektorelementene til pSVI6BtPA og mutagenisert plasminogen.

Andre ekspresjonsvektorer kunne bli anvendt istedenfor pSVI6BtPA som vektorkilde. For eksempel kunne pE342-tPA (US pat. nr. 4,766,075) bli anvendt som vektorfragment ved erstatning av t-PA-kodende DNA til pE342-tPA med plasminogen cDNA fra pUC119PN127.6. Dermed kan regulatoriske elementer fra andre ekspresjonsvektorer bli operabelt bundet til HPg cDNA som kjent for fagfolk innenfor dette området for å produsere en HPg ekspresjonsvektor.

Den endelige vektoren, pA475R561SPg, ble preparert som følger: pR561SPg ble kuttet med Ahall og EcoRI og det lille mutageniserte Pg-fragmentet (1003 bp) ble isolert (Fragment D). pSVI6BPlgn ble også kuttet med Smal og EcoRI og vektorfragmentet (4.394 kb) ble isolert) (Fragment E). Til slutt ble pSVI6BPlgn utsatt for sete-rettet mutagenese av cDNA for HPg dannelse av metoden til Kunkel et al., ovenfor, med følgende mutagene primer (understrekede baser representerer mutasjonene) for å tilveiebringe V475A-mutasjonen:

Positive kolonier ble screenet ved anvendelse av en EcoRI/BstEII restriksjonsendonukleasespaltning. Kloner med fragmenter med riktig størrelse ble sekvensert over regionen tilsvarende aminosyreposisjonene 455-502.

Mutagenisert pSVI6BPlgn ble dermed kuttet med Smal og Ahall og det lille fragmentet (1.55 kb) isolert (Fragment F). Fragmentene D, E og F ble ligert for å danne det første plasmidet, pA475R561SPg.

Konstruksjon av plasminogen ekspresjonsvektor pA475Pg

Et plasmid inneholdende A475 mutasjonen uten R561S mutasjonen (dvs. inneholdende nativ-sekvensplasminogen) ble preparert som følger: pSVI6BPlgn ble kuttet med Ahall og EcoRI og det lille fragmentet ble isolert (fragment G). Fragmentene E og F (beskrevet ovenfor) og G ble ligert for å produsere plasmid pA475Pg.

Konstruksjon av PAI- 1 ekspresjonsvektor pRKPAI- 1

En ekspresjonsvektor kodende for human e-migrerende endotel-celletype plasminogenaktivatorinhibitor (PAI-1) ble konstruert som følger: Kloning og sekvensen til PAI-1 er beskrevet av Ny et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 83: 6776-6780

(1986); Ginsberg et al., J. Clin. Invest., 78: 1673-1680

(1986); Pannekoek et al., EMBO J., 5: 2539-2544 (1986). PAI-1 cDNA ble oppnådd fra et humant umbilikal endotelisk celle cDNA-bibliotek som en X klon og plassert i en pUC18 klonings-vektor som replikerer i E. coli. Dette plasmidet ble kuttet med Bglll, gjort butt-endet og kuttet med EcoRI. Det lille fragmentet, omtrent 1430 bp, ble gelrenset. pRK5 ble også kuttet ved Smal, deretter med EcoRI, og et vektorfragment på 4712 bp ble isolert og gelrenset. Disse to fragmentene ble ligert sammen ved anvendelse av T4-ligase og kuttinger av miniprep ble utført for å bekrefte orienteringen av innskuddet. Den endelige vektoren er betegnet pRKPAI-1.

Transformasjon med pA475R561SPg eller pA475Pg

CHO dhfr celler (Urlaub og Chasin, ovenfor) ble satt i 60-mm skåler ved 5 x IO*5 celler/skål, 1 duplikat. DNA ble transfek-tert ved kalsiumfosfatprotokollen med følgende kombinasjoner av plasmider: (a) pA475R561SPg (50 ul eller 5 ug/skål), pRKPAI-1 (4,2 ul eller 5 ug/skål) og pFDll (et DHFR-kodende plasmid beskrevet av Simonsen og Levinson, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 80:2495-2499 (1983)), 6 ul eller 0,5 ug/skål); (b) pA475R561SPg (50 ul eller 5 ug/skål) og pFDll (6 ul eller 0.5 ug/skål); (c) pA475Pg (50 ul eller 5 ug/skål), pRKPAI-1 (4,2 ul eller 5 ug/skål) og pFDll (6 ul eller 0.5 ug/skål); eller (d) pA475Pg (50 ul eller 5 ug/skål) og pFDll (6 ul eller 0.5 ug/skål).

Cellene ble splittet i selektivt kulturmedium inneholdende 1% diafUtrert føtalt bovint serum ved 0.1, 0.1, 0.1, 0.2, 0.2 og 0.3 ug plasmid per 60-mm plate. Tolv dager senere ble en plate av hver av de fire transformasjonene (a-d) vasket med fosfatbufret saltvann og matet med selektivt kulturmedium og 756 plasminogen-tappet føtalt bovint serum. Dette trinnet fjernet plasminogen som ikke var blitt produsert av cellen. Kloner som produserer plasminogen ble screenet med mengden av ekspresjon på filtrene. Tre kloner av hver av transformasjonene a-d ble plukket med vattpinner i en 12-brønn plate. Disse tolv klonene ble dyrket i 10-cm plater og mediet ble byttet med et ikke-selektivt kulturmedium.

Høstet medium ble utsatt for Elisa proteinbestemming. Det ble funnet at pA475R561SPg og pRKPAI-1 klon #2 ga aktivitet på minst 1 mg/l. Fem rulleflasker av R561S-Hpg materiale ble produsert for rensing. R561S-HPg ble renset fra CHO-kultur-supernatanten ved affinitetskromatografi på Sepharose-lysin ifølge fremgangsmåten til Deutsch og Mertz, Science, 170: 1095-1096 (1970) som modifisert av Brockway og Castellino, Arch. Biochem. Biophys., 151: 194-199 (1972).

EKSEMPEL 3

Konstruksjon av R561EPg ekspresjonsvektor.

Insektcelletransformasjon og rensing

De generelle fremgangsmåtene beskrevet i eksempel 2 ble også anvendt i dette eksemplet.

Konstruksjon av HPg og R561E- HPg bakulovirus ekspresjonsvektorer

cDNA-kodende HPg i plasmid pUC119PN127.6 (i BamHI/Nael fragmentet) ble mutagenisert som beskrevet i eksempel 2 for å danne V475A forandringen som beskrevet i eksempel 2 for å danne nativ-sekvens Pg. Det resulterende plasmidet ble mutagenisert som beskrevet i eksempel 2 for å danne R561E-forandringen ved anvendelse av den mutagene primeren:

5'-CCCCCCTACAACCCTCCCGGGACATTTCTTCGG-3'.

Positive kolonier for denne mutasjonen ble screenet for tilstedeværelse av nylig dannet Smal restriksjonsendonuklease-spaltningssete som tilsvarer den utførte endringen. Rekombinant baculovirus overføringsvektor pAV6 der A475HPg cDNA og A475,R561EHPg cDNA var skutt inn ble konstruert for å innbefatte DNA-sekvensene som omgir AcMNPV-polyhedrin (PH)-genet. pAV6 inneholder polyhedrinpromoteren i 1.8 kb fra et Xbol-sete beliggende 5' for PH-genet til nukleotid -8 av polyhedrin initieringskodonet (ATG), og omfatter også et 1.5-kb-fragment som rekker fra et Kpnl-séte innenfor polyhedrin-genet til BamHI-setet 3' for dette samme genet. Xbol og BamHI-setene ble tapt i løpet av kloning av disse fragmentene .

pAV6 ble konstruert som følger og som illustrert i figur 8. Et 7.2 kb EcoRI fragment av Autographa californica DNA

betegnet pEcoRI-I (Smith et al., J. Virol., 45: 215-225 81983); Smith et al., J. Virol., 46: 584-593 (1983)), inneholdende polyhedringenet og flankerende sekvenser, ble kuttet med Xhol og BamHI (Sali og Xhol-spaltninger produserer kompatible ender). Det resulterende Xhol/BamHI-fragmentet ble ligert inn i en Sali- og BamHI-kuttet mpl9 vektor (Bethesda Research Laboratories, Gaitherburg, MD) for å danne en konstruksjon betegnet mpl9Xho-Bam. Plasmid mpl9Xho-Bam ble kuttet med EcoRV og Kpnl, og et første syntetisk oligonukleotid (konstruert, som alle oligonukleotider betegnet nedenfor, på en 380 A modell automatisert DNA syntesizer tilgjengelig fra Applied Biosystems, Foster City, CA), ble ligert inn i kuttet mpl9Xho-Bam for å produsere en vektor betegnet mpl9AlD. Det første syntetiske oligonukleotidet hadde følgende sekvens, inkludert angitte restriksjon og transkripsjonsinitieringsseter.

Det første syntetiske oligonukleotidet erstattet en sekvens ved 5<*->enden av Xhol/BamHI fragmentet i mpl9Xho-Bam fra et EcoRV-sete til et antatt CAP-sete og omfatter et multippelt kloningssete med BamHI, EcoRI, Sali og Kpnl-seter.

Deretter ble en pUC12-vektor (Bethesda Research Laboratories) kuttet med Hindlll og Sstl, mpl9AlD ble kuttet med Hindlll go Kpnl, og et 1.8-kb-fragment inneholdende sekvensene som flankerer 5'-enden av polyhedrin-genet ble isolert. Plasmid pEcoRI-I ble kuttet med BamHI og Kpnl og, fra kuttingspro-duktene ble et 1.5-kb fragment, som rekker fra Kpnl-etet innenfor polyhedringenet til et BamHI-sete i 3'-flankerende regionen derav, ble isolert. Disse 3 fragmentene (pUC12, 1.8 kb og 1.5 kb) ble ligert sammen med et annet syntetisk oligonukleotid som har sekvensen 5'-GATCAGCT, for å produsere en konstruksjon betegnet pAVl.

Etter at pAVl ble kuttet med BamHI og Kpnl ble det resulterende fragmentet ligert til et tredje syntetisk oligonukleotid for å produsere en konstruksjon betegnet pAV2. Det tredje syntetiske oligonukleotidet hadde en nukleotidsekvens som følger:

Et plasmid, pDS, ble konstruert ved kutting av pBR322 (4.4-kb plasmidet tilgjengelig fra Bethesda Research Laboratories) med Hindlll og Sali, ifylling med Klenowfragment og ligering. Plasmid pDS mangler dermed sekvensene mellom Hindlll og Sali og taper Sall-setet, men opprettholder Hindlll-setet.

Plasmid pAV2 ble kuttet med Hindlll og BamHI, og et 1.5 kb-Hindlll/BamHI fragment (inneholdende 5'-flankerende sekvens) ble isolert. Deretter ble pAV2 kuttet med BamHI og EcoRI, og et 1.5-kb EcoRI/BamHI fragment som rekker fra BamHI-setet i det multiple kloningssetet til EcoRI-setet ved siden av 3'-flankerende sekvensen ble isolert. Plasmid pDS ble kuttet med Hindlll og EcoRI og ligert til de to fragmentene dannet fra pAV2. Det resulterende ble betegnet pAV3.

Plasmid pAV3 ble kuttet med BamHI og Sali. En vektor pAC373 (Smith et al., Mol. Cell. Biol., 3:2156-2165 (1983)) (inneholdende NPV viral DNA fra et Sall-setet omtrent 1 kb 5' for polyhedringenet til et BamHI-sete innskutt ved nuleotid -8 ("A" til "ATG" initieringssete er +1) ble kuttet med BamHI og Sali og ligert til BamHI/SalI-kuttet pAV3 for å produsere en vektor betegnet pAV4.

Vektor pAV4 ble kuttet med EcoRI og endene ble fylt med Klenow-fragment og ligert for å produsere vektoren betegnet pAV6 (som mangler EcoRI-setet til pAV4).

(Overførings-vektor pAV6HPg, som er dannet fra innskudd av et BamHI/Nael fragment kodende for nativ sekvens HPg fraPUC119PN127.6 inn i BamHI og Smal-setet til plasmid pAV6, Inneholder AcMNPV polyhedrin (PH) promoter koblet til HPg-signalet og moden (Glu^Pg kodende sekvens. Dette plasmidet ble deponert i verten E. coli DH5a 18. april, 1989 til American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852, under aksesjonsnr. 67,929).

A475-HPg og A475,R561E-HPg cDNA beskrevet ovenfor ble skutt inn i BamHI og Smal-setene til pAV6, for å produsere pAVA475Pg og pAVA475R561EPg, som ble anvendt for å infisere kulturmediet til Spodoptera frugiperda celler som beskreven nedenfor.

Transformasjon av insektceller med overføringsvektor Konstruksjonen pAVA475Pg eller pAVA475R561EPg og vill-type viral DNA ble anvendt for å kotransfektere dyrkede Spodoptera frugiperda-celler, som beskrevet av Whitefleet-Smith et al., ovenfor. I en celle, overkrysning mellom homologe polyhedrin-flankerende regioner til overføringsvektor og virus tilveiebringer en full-lengde rekombinant virus inneholdende HPg-genet istedenfor PH-genet.

AcTR-temperatur-inaktiveringsresistens stamme til Autographa californica nukleær polyhedrosisvirus (AcMNPV) ble anvendt som vertsvirus for rekombinante konstruksjoner. En klonet (f.eks. Sf9-celler, tilgjengelig fra American Type Culture Collection, Rockville, MD, under aksesjonsnr. ATCC CRL 1711) eller en uklonet Spodoptera frugiperda-cellelinje kan bli anvendt for å tilveiebringe vertsceller for all virusvekst og manipulasjoner (Vaughn et al., In Vitro, 13: 213-217 (1977)). Fremgangsmåtene anvendt for dyrking av insektceller er beskrevet i Summers et al., Texas Agrlcultural Experiment Station Bulletin No. 1555, (1987), på sidene 10-31 og 38, med unntagelse av at Gibco pulver Grace's Anteraea medium, Hink's medium (istedenfor TNM-KH-medium) og en penicillin/strepto-mycin/amfotericin B antibiotika-blanding ble anvendt i fremgangsmåten på side 38.

Spodoptera frugiperda-celler (3 x IO<6>) i Hink's medium (Hink, Nature, 226: 466-467)(1970) pluss 10% føtalt bovint serum (FBS) (Smith et al., Mol. Cell. Biol., ovenfor), ble latt adherere til en 60-mm kulturskål. Etter to timer ble mediet fjernet og cellene ble inkubert inn i en 0.5 ml suspensjon av vill-type DNA fra AcMNPV (0.1 ug) pluss pAVR561EPg overfør-ingsplasmid DNA (1 ug) i NaCl (0.8 g/l), KC1 (0.37<g>/l)/Na2H2P04,2H20 (0.125 g/l), dekstrose (1 g/l) og Hepes-NaOH (5 g/l) ved pH 7.2. Etter inkubasjon over natten ved omtrent 27°C ble DNA-suspensjonen fjernet og cellene ble inkubert i fem dager i Hink's medium, pluss 1056 FBS.

Spodoptera frugiperda celler kan også bli dyrket i suspensjon ved anvendelse av Corning (New York, New York) sakte-hastighet rørebeholdere på en Cellgro sakte-hastighet magnetisk rører (Thermolyne Corp., Bubuque, Iowa). Til hver 1000 ml rørebeholder ble 300 ml ufullstendig Hink's medium (supplementert med 8. 3% FBS og penicillin/streptomycin/amfotericin B blanding som ovenfor) tilsatt. Beholderen ble deretter inokulert med 5 x IO<6>celler og rørt ved 80 rpm. Cellene blir subdyrket når de oppnår en tetthet på 2-3 x 10° celler/ml ved fjerning av 150-250 ml cellesuspensjonen og erstatning av denne med friskt medium. Suspensjons-dyrkede celler festes på flaskene og kan dermed bli anvendt i prosedyrer som krever monolag.

Cellene kan også bli dyrket i et definert, lav-protein medium EX-CELL 400 produsert av JR. Scientific, Woodland, CA. Dette mediet kan bli anvendt istedenfor fullstendig Hink's medium for dyrking av celler i monolag, i spinnflaskesuspensjonskul- turer eller i luft-hevebioreaktorer (q.v., Maiorella et al., Blotechnology, 6: 1406-1410 (1988)).

Etter vekst ble de rekombinante proteinene A475-HPg og A475,R561E-HPg renset ved affinitetskromatografi som beskrevet for CHO-uttrykte plasminogener ovenfor.

EKSEMPEL 4

Analyser og resultater

A. Generelle fremgangsmåter og analsyer

1. Aminosyresekvensering

Plasminogen og mutanter derav fremstilt i henhold til eksemplene 2 og 3 ble utsatt for aminoterminal aminosyresekvensanalyse på en Porton Instruments gassfase-sekvenator, etter adsorpsjon av proteinet på peptidbærerskivene. PTH-aminosyrene ble separert på en Beckman revers fase ODS-kolonne (5 u, 4.6 mm x 250 mm), ved anvendelse av et Spectra Physics HPLC system. Det sistnevnte består av en Model 8800 ternær HPLC-pumpe, en Model 8480 UV/Vis-detektor, en Model 4270 recording-integrator og en PI2030 Interface for on-line injeksjoner av prøvene på HPLC-kolonnen. Resolusjon av 20 PTH-aminosyrer ble oppnådd ved 55"C, under følgende lineære gradientbetingelser: 88% oppløsning A (1 ml iseddiksyre/20 ml tetrahydrofuran/0.05 ml trietylamin/vann til 500 ml, pH justert til 4.10 med 3 N NaOH)/12# oppløsning B ( 1% tetrahydrofuran i acetonitril) som utgangsoppløsning, til b0% oppløsning A/40# oppløsning B (grenseoppløsning) over en periode på 24.5 min ved en strømningshastighet på 1 ml/min. Oppløsning B ble deretter fortsatt i ytterligere 5.5 min ved samme strømningshastighet hvorpå de siste fire PTH-aminosyrene ble eluert.

2. Western- blottanalyse

Proteinprøvene ifølge eksemplene 2 og 3 ble separert ved SDS/PAGE (Laemmli, Nature, 227: 680-685 (1970)) på 10% (w/v) polyacrylamidgeler under ikke-reduserende betingelser. Separert proteinbånd ble overført til Immobilon-P (Millipore, Bedrord, MA) membraner/ifølge etablerte prosedyrer (Burnette, Anal. Biochem., 112: 195-203 (1981)) og deretter inkubert ved 37°C i en time i en 1% (w/v) gelatin (Biorad EIA kvalitet) I TBS (0.05 M TrisHCl, 0.15 M NaCl, pH 7.4, blokkeringsbuffer). Nøyaktige betingelser for overføring var 4°C i 25 mM Tris-HC1/200 mM glycin/15# (v/v) metanol, pH 8.3 ved 20 volt i 12 timer. Denne oppløsningen ble erstattet med en annen inneholdende 4 ug/ml monoklonal murin anti-HPg (Whitefleet-Smith et al., ovenfor) i blokkeringsbuffer, og inkubert ved romtemperatur i 2 timer med blanding. Filteret ble vasket med tre skift av 0. 05% (v/v) Tween-20 i TBS ved romtemperatur over en 15-min periode. Det ble deretter inkubert med kanin anti-muse IgG-alkalisk fosfatasekonjugat (Sigma) i blokkeringsbuffer i to timer ved romtemperatur, med blanding, og deretter vasket som ovenfor. Positive bånd ble visualisert etter inkubasjone-ne, ved romtemperatur, med substratoppløsningen (16.5 mg nltro blå tetrazolium/0.5 ml 70% (v/v) vandig DMF/8.5 mg bromklorindolylfosfat i 1 ml vann, som ble tilsatt til 50 ml 0.1 M Tris-HCl/0.1 M NaCl/0.005 M MgCl2, pH 9.5).

3. Amidolvtiske analyser av støkiometrlske komplekser av SK-HPg og SK- HPm

En mengde på 0.2 ml av en buffer bestående av 100 mM Hepes-Na0H/10 mM EACA, pH 7.4 ble plassert i en spektrofotometrisk cuvette, holdt ved 25°C. Deretter ble den ønskede konsentrasjonen av det homogene substratet, H-D-Val-L-Leu-L-Lys-pNA (S2251, Helena Laboratories, Beaumont, TX) ble tilsatt, etterfulgt av den nødvendige mengden vann. Hydrolyse av substratet ble akselerert ved tilsetning av ønsket pre-dannet støkiometrisk SK-HPg eller SK-Hpm kompleks (finalkonsehtra-sjon, 6-10 nM). Hastigheten på hydrolysen av S2251 ble registrert kontinuerlig i 2-5 min ved 405 nm. Absorbansene ble omdannet til opprinnelige aktiveringshastigheter som tidligere beskrevet (Urano et al., ovenfor), og hastighets-dataene ble analysert ifølge vanlig Lineweaver-Burk plot. Enzymkompleksene ble dannet ved inkubasjon ved 25°C av støkiometriske mengder streptokinase (SK) (fremstilt ifølge fremgangsmåten publisert av Castellino et al., Meth. Enzymology, 45: 244-257 (1976)) og ønsket plasminogen ifølge eksemplene 2 og 3.

4. Plasminogenaktivatoranalvser av støkiometriske komplekser av SK- HPg og SK- HPm

En mengde på 0.2 ml av en buffer bestående av 100 mM Hepes-NaOH/10 mM EACA, pH 7.4 ble plassert i en spektrofotometer-cuvette, opprettholdt ved 25°C. Deretter ble 0.08 ml S2251 (finalkonsentrasjon, 0,5 mM) tilsatt, etterfulgt av den nødvendige mengden vann, forskjellige konsentrasjoner bovint plasminogen (BPg, renset fra friskt bovint plasma ved anvendelse av den samme fremgangsmåte som anvendt for å rense rekombinant Pg), og til slutt, SK-HPg eller SK-HPm aktivator-kompleks preparert som beskrevet ovenfor (finalkonsentrasjon 0.2 nM). Aktiveringshastigheten til BPg ble registrert i kontinuerlig analyse (Urano et al., ovenfor) ved registrering av frigjøringen av p-nitroanilid resulterende fra hydrolyse av S2251 ved dannet bovint plasmin. Dataene ble analysert ved Lineweaver-Burk plot som publisert for tidligere studier av denne typen (Urano et al., ovenfor). Under disse betingelsene ble BPg ikke aktivert av SK alene.

5. Deglvkosylerlng av HPg

Det ønskede HPg-preparatet (i 10 mM natriumfosfat, pH 7.4) ble behandlet med glykopeptidase F (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) i en konsentrasjon på 0.4 enheter enzym/ug HPg. Reaksjonen ble latt forløpe i 24 timer ved 37°C. Disse betingelsene ble funnet å være egnede for fjerning avAsn<289->forbundet karbohydrat fra alle undersøkte prøvene. Blandingen ble deretter utsatt for sentrifugering i molekylvekt 10.000 cut-off (Centricon 10) mikrokonsentratorrør (Amicon, Danvers, MA) for å separere det frigjorte oligosakkaridet fra protein-prøven.

B. Resultater

To rekombinante humane plasminogener ble oppnådd fra Infek-sjon av insektceller med en rekombinant baculovirus inneholdende vill-type A475 [Glu^Pg cDNA t ilveiebringing av wt-irHPg, Whitefleet-Smith et al., ovenfor) og cDNA for vill-type A475 HPg inneholdende en R561E mutasjon i proteinet (R561E-HPg). Et annet rekombinant protein med vill-type (A475 sekvens) inneholdende en R561S mutasjon ble produsert i CHO-cellene (R561S-HPg). Deres elektroforetiske adferd foreslår at alle disse rekombinante proteinene var høyt rensede og hadde molekylvektkaraktertrekkene assosiert med human [Glu<1>]Pg. A475-mutasjonen er ikke nevnt i diskusjonen nedenfor til tross for at den er tilstede i alle HPg-proteinene produsert rekombinant som er nevnt.

Amino-terminal aminosyresekvensanalyse av alle plasminogener rapportert tilveiebringer sekvensen NH2-Glu-Pro-Leu-Asp-Asp, tyder på at alle er blitt riktig prosessert med hensyn på kutting av signalpolypeptidet og tyder også på at de små mobilitetsforskjellene mellom rensede rekombinante proteiner og human plasma HPg kan være refleksjoner av små molekyl-vekts-variasjoner resulterende fra forskjeller i glykosylering blandt plasma-, insektcelle- og CHO-celle-avledete plasminogener.

Amidolytiske aktiviteter til støkiometriske kompleksene til SK ved likevekt med rekombinant vill-type og variant plasmin(ogen)er er angitt i tabell I, og sammenlignet med de til støkiometriske komplekset til SK og human plasma-avledet plasmin(ogen) (dvs. nativ human plasma [Glu<l>]Pg, affinitetskromatografi f orm 1, renset som rekombinant Pg). Fullstendig amidolytisk aktivitet til hver av kompleksene utviklet i 1-5 min. , og 5-min inkubasjonstider ble anvendt for dannelse av enzymene anvendt i denne studien.

I tilfellet av wt-irHPg og human plasma HPg, viste SDS/PAGE-analyse av komponentene til kompleksene ved 5-min. inkuba-sjonstid klart at de var sammensatt av SK og [Lys<78>]HPm, som ventet (Bajaj og Castellino, J. Biol.Chem., 252: 491-498

(1977)). For aktiverings-spaltnings-sete-variantplasminogener besto kompleksene av SK og relevant HPg, som ventet, på grunn av at egenskapen av mutasjonen utelukker omdanning av HPg til HPm innenfor komplekset.

Dataene i tabell I viser at SK-HPm-kompleksene, inneholdende enten human plasma HPm eller wt-irHPm, innehar faktisk identiske like-vektskinetiske konstanter overfor S2251. Likeledes er amidolytisk aktivitet tilstede i de støkio-metriske kompleksene til SK med de to variant HPg-preparat-ene, henholdsvis R561E-HPg og R561S-HPg. Sammenligning av verdiene til de kinetiske konstantene til de to sistnevnte SK-HPg kompleksene med de til de tidligere SK-HPm kompleksene foreslår at det bare eksisterer små forskjeller i amidolytisk likevektsegenskaper til de forskjellige SK-HPg og SK-HPm-kompleksene.

De ekvimolare SK-kompleksene med enten human plasma HPm eller insekts-uttrykt HPm er nesten identiske og dette demonstrerer at insektcellene produserer et protein som er sammenlignbart med human plasma motstykke. Km for SK-komplekset med forskjellige spaltnings-sete-resitent irHPg er noe lavere enn denne verdien for de samme kompleksene med hvilke som helst av plasminene, og dette tyder på mulige kinetiske forskjeller i SK-HPg-komplekset, sammenlignet med SK-HPm-komplekset.

For bestemmelse om Asn<289->bundede karbohydratet til HPg spilte en rolle i de små forskjellene observert i likevekt amidolytiske kinetiske konstantene, ble R561S-HPg (fra CHO-cellene) deglykosylert med glykopeptidase F.Det støkio-metriske komplekset til SK med denne formen av HPg hadde bare en liten høyere Km enn dets glykosylerte motstykke, og dette tyder på at tilstedeværelse av karbohydrat på Asn<289>, i det minste med hensyn på type tilstede på CHO-celle-uttrykt materiale, spiller ingen stor rolle i denne kinetiske egenskapen til SK-R561-HPg-komplekset.

Tabell II tilveiebringer likevekt kinetiske parametere som reflekterer de respektive evnene til de forskjellige fordan-nede støkiometriske SK-HPg og SK-HPm-kompleksene, ved katalytiske nivåer, til å virke som aktivatorer av plasminogen. BPg er blitt valgt som kilden for plasminogen på grunn av at den er ufølsom for aktivering med SK alene. Sammenligning av de kinetiske egenskapene til SK-[Lys<78>]Pm (dannet med plasma HPg) kompleks (3-min. preinkubasjonstid, tabell II) viser at komplekset inneholdende insekt-uttrykt HPm er betraktelig mere aktiv enn det som inneholder humant plasma HPm, forårsaket hovedsakelig av en forskjell i kCat til aktivering. Andre-orden spesifisert konstant for plasmi-nogenaktivering for SK-R561E-HPg-komplekset var omtrent 30-ganger større enn samme verdien for SK-wt-irHPm-komplekset, forårsaket både av en reduksjon i Km og en økning i tal-verdiene .

Ut i fra disse dataene og en sammenligning av dataene tilveiebragt med SK-irHPm-komplekset (3-min. preinkubasjonstid) og SK-R561E-HPg-komplekset, ser det ut som om komplekset inneholdende HPg er betraktelig mere effektiv som en plasminogenaktivator enn samme komplekset inneholdende HPm. Ytterligere bevis for dette synet blir oppnådd fra analyse av virkningen av tid på preinkubasjon av støkiometriske nivåer av SK med både plasma [Glu^Pg og wt-irHPg på evnen som de resulterende kompleksene har til å aktivere BPg.

Ved meget tidlige preinkubasjonstider (<30 sek.), viser SDS/PAGE at komplekset enda inneholder omtrent 80% HPg, i tilfellet av hvert plasminogen og omtrent 20% HPm. Ved tider 1 min., og deretter blir all HPg omdannet til HPm innenfor komplekset. Et mye høyere nivå av BPg-aktivatoraktivitet er tilstede i 30 sek.-prøven enn i prøver preinkubert i > 1 min., som tyder på at SK-HPg-komplekset er mere effektivt enn SK-HPm-komplekset ved aktivering av BPg.

Kinetiske konstanter for aktivering av BPg med SK-kompleksene fremstilt fra human plasma HPg og wt-irHPg ved korte preinkubasjonstider (30 sek.) er angitt i Tabell II. Som det fremgår fra disse data er Km-verdiene dramatisk redusert i forhold til de som blir tilveiebragt med tilsvarende prøver der all HPg blir omdannet til HPm innenfor kompleksene (sammenlign dataene for 30-sek. og 3-min. preinkubasjonstidene i tabell II). Når lignende eksperimenter var utført med R561E-HPg og R561S-HPg ble det ikke observert en slik tidlig tid aktivi- tetstopp; og bare temporært konstante aktivatorer-aktiviteter av kompleksene var observert.

Pattedyr-celleuttrykte varianten HPg(R561S-HPg) 1 støkiomet-risk kompleks med SK, har lignende, men ikke identisk, likevekt-kinetiske verdier overfor BPg-aktivering som det Insekt-uttrykte proteinet (R561E-HPg). kcatfor enzymkomplek-set inneholdende dette sistnevnte proteinet er omtrent 2-ganger høyere enn det for kompleks dannet med tidligere HPg. At forskjeller i glykosylering av variantrekombinant HPg-preparater kan spille en rolle i plasminogen-aktivatoraktivi-teter til SK-kompleksene inneholdende disse plasminogenene kan bli observert fra data i tabell II. kcatfor aktivering av BPg ved SK-R561S-HPg komplekset er omtrent 2.4-ganger lavere og Km omtrent 2-ganger høyere enn tilsvarende verdier for det samme komplekset fremstilt med glykopeptidase F-deglykosylert R561S-HPg. Disse forskjellene kom ikke frem ved analyse av aminolytiske aktiviteter til de samme kompleksene (tabell I). Den deglykosylerte formen av CHO-uttrykt variant HPg, i ekvimolar kompleks med SK, muliggjorde at komplekset ble enda mer effektiv aktivator av BPg.

Det er å bemerke at alle kinetiske analysene inneholdt EACA som en bufferkomponent. Dette middelet var tilstede for å tilveiebringe maksimale aktiveringshastigheter og å eliminere eventuelle vurderinger av mulige forskjeller i aktivérings-hastigheter forårsaket av variable mengder [Glu^jPg og [Lys<78>]Pg i analyseblandingene med hvilke som helst av plasminogener undersøkt heri.

Det er blitt vist at stabilisering av HPg innenfor SK-komplekset resulterer i en meget øket evne som komplekset har for å aktivere plasminogen. Stabile former av plasminogen er nå blitt uttrykt i pattedyrceller og som muliggjør effektiv preparering av plasminogen som er stabil når kompleksbundet til streptokinase. Slik ekspresjon unngår i tillegg anvendelse human plasma som kilde for plasminogen, som bærer en risiko for å inneholde ødeleggende humane virus så som HIV, HTLV-I, hepatitt, inkludert ikke-A, ikke-B hepatittvirus, osv.

EKSEMPEL 5

Komplekser dannet mellom fibrinolytiske enzymer og plasminogen kan bli anvendt som trombolytiske midler. Det katalytiske setet til f ibrinolytiske enzymer kan bli blokkert av en gruppe som kan fjernes ved hydrolyse under visse betingelser. Smith et al., U.S. Pat. 4.808,405, ovenfor, og Smith et al, Nature, 290: 505-508 (1981). Derfor kan R561E-HPg eller R561S-HPg ifølge oppfinnelsen bli anvendt som et trombolytisk middel alene, som et kompleks med et fibrinolytisk enzym, som et kompleks med et acylert fibrinolytisk enzym, som et acylert proenzym eller som et acylert proenzym i et kompleks med et fibrinolytisk enzym eller et acylert fibrinolytisk enzym. Et acylert streptokinase/acylert plasminogenkompleks ifølge foreliggende oppfinnelse kan bli preparert som følger.

Streptokinase (omtrent 451 mg; som tilgjengelig fra AB Kabi, Stockholm, Sverige) kan bli blandet med en lysin/mannitolbuf-fer (omtrent 110 ml) ved pH 7.0 og steril glycerol (omtrent 60 ml) og rørt i 5 min. ved 4°C. En steril filtrert oppløs-ning av p-amidino-fenyl-p'-anisat i DMSO (omtrent 15 ml, omtrent 20 mM) kan bli tilsatt i løpet av 2 minutter og blandingen rørt i 5 min. ved 4°C. R561E-HPg eller R561S-HPg ifølge foreliggende oppfinnelse (omtrent 809 mg) kan bli tilsatt i løpet av to minutter og blandingen rørt i 60 minutter ved 4°C.

En farmasøytisk sammensetning kan bli fremstilt fra ovennevnte som følger: Humant serumalbumin (klinisk kvalitet) (18.9 ml 20% w/v) kan deretter bli tilsatt til blandingen med røring i 2 min. ved 4°C. Lysin/mannitolbuffer kan bli tilsatt for å bringe volumet til omtrent 400 ml. Fluidet kan deretter bli diafUtrert i omtrent 2.5 timer ved 18°C helt til omtrent 2400 ml av diafiltratet er samlet. Fluidet kan deretter bli filtrert gjennom et 0.22 u sterilt filter og overført til en steril beholder hvorifra aliquoter kan bli helt inn i sterile fryse-tørkede beholdere etterfulgt av frysetørking.

Deponering av materiale

Følgende stamme kan bli deponert til American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, USA (ATCC):

Denne deponering ble utført i følge Budapest-avtalen for internasjonal anerkjennelse av deponering av mikroorganismer for patentprosedyrer og reguleringer derunder (Budapest-avtalen). Dette sikrer opprettholdelse av en levedyktig kultur i 30 år fra deponeringsdatoen. Organismen vil bli gjort tilgjengelig av ATCC under betingelsene til Budapest-avtalen, og etter avtale mellom Genentech, Inc. og ATCC, som forsikrer permanent og uhemmet tilgjengelighet av avkom av kulturen til offentligheten ved utstedelse av US-patentet eller ved offentliggjøring for publikum av hvilke som helst av US-søknadene eller patent-søknad i utlandet, den som kommer først, og forsikrer tilgjengelighet av avkom til en som av US Commissioner of Patents and Trademarks blir bestemt å oppnå det ifølge 35 USC §122 og Commissioner's regler hørende dertil (inkludert 37 CFR §1.14 med spesiell referanse til 886 OG 638).

Søkeren av foreliggende oppfinnelse har vært enig at dersom kulturen ved deponering dør eller går tapt eller blir ødelagt når dyrket under egnede betingelser vil den øyeblikkelig bli erstattet med en levedyktig form av samme kultur. Tilgjengelighet av den deponerte kulturen skal ikke bety en lisens for å utføre oppfinnelsen i strid med rettighetene godkjent under myndighetene til en hvilken som helst regjering i henhold til dennes patentregler.

Claims

1. Nukleinsyresekvens kodende for en variant av human plasminogen med aminosyresekvensen ifølge figur 1,karakterisert vedat argininresidiet i posisjon 561 er erstattet med en annen aminosyre.

2. Fremgangsmåte for fremstilling av en variant av human plasminogen med aminosyresekvens ifølge figur 1, hvor argininresidiet i posisjon 561 er erstattet med en annen aminosyre,karakterisert vedå transformere en egnet vertscelle med en ekspresjonsvektor som inneholder DNA-sekvensen som koder for nevnte protein i kombinasjon med transkripsjons- og translasjonsregulerende sekvenser som er i stand til å dirigere ekspresjonen av nevnte DNA-sekvens, samt en seleksjonsmarkør kodende sekvens, hvorpå proteinet Isoleres og renses.

3. Fremgangsmåte for fremstilling av human plasminogen i henhold til krav 2 hvor varianten er R561E-HPg med et glutaminsyreresidie i stedenfor arginin i posisjon 561 til villtype plasminogen, R561G-HPg med et glycinresidie i stedenfor arginin i posisjon 561 til villtype plasminogen, eller R561S-HPg med et serinresidie i stedenfor arginin i posisjon 561 til villtype plasminogen,karakterisertved at tilsvarende ekspresjonssystem anvendes.

4. Ekspresjonsvektor,karakterisert vedat den omfatter nukleinsyresekvensen ifølge krav 1 eller 2 operabelt koblet til kontrollsekvensene.

5. Vertscelle,karakterisert vedat den inneholder vektoren ifølge krav 3.

6. Fremgangsmåte for fremstilling av plasminogen i henhold til krav 2 som er resistent overfor proteolytisk spaltning til to-kjedeformen derav,karakterisert vedat tilsvarende ekspresjonssystem anvendes.

7. Fremgangsmåte for fremstilling av plasminogen ifølge krav 2, hvor det fremstilles R561E, R561S eller R561G,karakterisert vedat tilsvarende ekspresjonssystem anvendes.