DE69105121T2

DE69105121T2 - Gewebeplasminogenaktivator mit fibrin-spezifischen eigenschaften.

Info

Publication number: DE69105121T2
Application number: DE69105121T
Authority: DE
Inventors: John F. Redwood City Ca 94062 Gill; Leonard G. San Francisco Ca 94109 Presta; Mark J. San Francisco Ca 94115 Zoller
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1990-03-01
Filing date: 1991-02-14
Publication date: 1995-05-04
Anticipated expiration: 2011-02-15
Also published as: AU642984B2; JP3081238B2; ES2067221T3; EP0517756A1; AU7339891A; DK0517756T3; CA2075901C; JPH05504685A; EP0517756B1; CA2075901A1; US5156969A; DE69105121D1; WO1991013149A1; ATE113983T1

Description

Hintergrund der Erfindung

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft bestimmte Gewebeplasminogenaktivator- (t-PA) Varianten mit einer modifizierten Struktur, in der Aminosäuren innerhalb der Proteasedomäne von t-PA gelöscht sind, welche Modifizierung die Variante mehr fibrinspezifisch (oder Plasmagerinnsel-spezifisch) als den Wildtyp- (wt) t-PA macht.

Beschreibung des Hintergrunds und verwandter Gebiete

Plasminogenaktivatoren sind Enzyme, die das Zymogenplasminogen aktivieren, um das Serinproteaseplasmin (durch Spaltung an Arg561-Val562) zu erzeugen, das verschiedene Proteine, darunter Fibrin, abbaut. Unter den untersuchten Plasminogenaktivatoren befinden sich Streptokinase, ein bakterielles Protein, Urokinase, ein Enzym, das in der Niere und anderswo synthetisiert und ursprünglich aus Harn extrahiert wird, und der menschliche Gewebeplasminogenaktivator (t-PA), ein Enzym, das durch die die Blutgefäßwände auskleidenden Zellen erzeugt wird.
Der Wirkungsmechanismus jeder dieser Plasminogenaktivatoren ist unterschiedlich: Streptokinase bildet einen Komplex mit Plasminogen oder Plasmin, wodurch Plasminogen-aktivierende Aktivität erzeugt wird, Urokinase spaltet Plasminogen direkt, und t-PA, Fibrin und Plasminogen treten alle in Wechselwirkung, um die maximale Aktivität zu erzielen.
t-PA wurde als besonders bedeutender und wirksamer neuer biologisch- pharmazeutischer Wirkstoff identifiziert und beschrieben, der bei der Behandlung von Gefäßerkrankungen, wie z.B. beim Myokardinfarkt, teilweise aufgrund seiner hohen Fibrinspezifität und seiner wirkungsvollen Fähigkeit, Blutgerinnsel in vivo aufzulösen, außerordentliche Ergebnisse zeigte.
Obwohl das Vorhandensein von t-PA zahlreiche Untersuchungen durch mehrere wissenschaftliche Gruppen veranlaßte, wurde er zuerst als ein im wesentlichen reines Isolat aus einer natürlichen Quelle identifiziert und durch Collen et al., US PS 4.752.603, veröffentlicht am 21. Juni 1988, hinsichtlich erforderlicher in vivo Plasminogenaktivatoraktivität geprüft. Siehe auch Rijken et al., J.Biol.Chem., 256: 7035 (1981).
Anschließend wurde t-PA durch die zugrundeliegende DNA-Sequenz und die abgeleitete Aminosäuresequenz auf der Grundlage erfolgreicher Arbeiten vollständig identifiziert und charakterisiert, die rekombinante DNA-Technologie anwenden, die zu großen Mengen an t-PA in einem bestimmten Milieu führen. Von diesen Arbeiten berichteten Pennica et al., Nature, 301: 214 (1983) und in der US PS Nr. 4.766.075, veröffentlicht am 23.August 1988.
Ausgehend von diesen Offenbarungen scheint es klar zu sein, daß das t-PA-Molekül fünf Domänen enthält, die in Bezug auf homologe oder auf andere Art ähnliche Strukturen identifiziert wurden, die in verschiedenen anderen Proteinen, wie z.B. Trypsin, Chymotrypsin, Plasminogen, Prothrombin, Fibronectin und dem epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) identifiziert wurden. Diese Domänen wurden ausgehend am N- Terminus der Aminosäuresequenz von t-PA als 1) Fingerbereich (F), der mehrfach definiert wurde, Aminosäuren 1 bis etwa 44 zu enthalten, 2) als Wachstumsfaktorbereich (G), der mehrfach definiert wurde, sich von etwa Aminosäuren 45 bis 91 zu erstrecken (auf der Grundlage der Homologie mit EGF), 3) als Kringle-eins (K1), das definiert wurde, sich von etwa Aminosäure 92 bis etwa Aminosäure 173 zu erstrecken, als 4) Kringle-zwei (K2), das definiert wurde, sich von etwa Aminosäure 180 bis etwa Aminosäure 261 zu erstrecken, und 5) als sogenannte Serinproteasedomäne (P) bezeichnet, die im allgemeinen definiert wurde, sich von etwa Aminosäure 264 zum C- terminalen Ende des Moleküls zu erstrecken. Diese Domänen, die im allgemeinen angrenzend zueinander angeordnet sind, oder durch kurze "Linker"-Bereiche voneinander getrennt sind, machen die gesamte Aminosäuresequenz von 1 bis 527 Aminosäuren der mutmaßlichen reifen Form von t-PA aus.
Jede Domäne wurde mehrfach beschrieben, bestimmte biologisch bedeutsame Eigenschaften bereitzustellen. Die Fingerdomäne wurde charakterisiert, eine Sequenz von zumindest großer Bedeutung für die hohe Bindungsaffinität zu Fibrin zu enthalten. (Diese Aktivität gilt für die hohe Spezifität als wichtig, die t-PA hinsichtlich der Gerinnsellyse an der Stelle eines fibrinreichen Thrombus zeigt.) Der Wachstumsfaktorähnliche Bereich wurde in ähnlicher Weise mit der Zelloberflächen-Bindungsaktivität in Zusammenhang gebracht. Der Kringle 2-Bereich wurde ebenfalls mit der Fibrinbindung und der Fähigkeit von Fibrin, die t-PA-Aktivität zu stimulieren, in engen Zusammenhang gebracht. Die Serinproteasedomäne ist für das enzymatische Spalten von Plasminogen zur Erzeugung von Plasmin verantwortlich.
Trotz der großen Vorteile in Zusammenhang mit natürlichem, doppelkettigem t-PA als gerinnselauflösendem Wirkstoff und des Vorteils von natürlichem, einkettigem pro-t-PA, von dem in der EP Veröffentl. Nr. 112.1 22 berichtet wird, ist man nicht der Ansicht, daß das natürliche Protein notwendigerweise unter allen Umständen den optimalen t-PA- Wirkstoff darstellt. Daher wurden verschiedene Varianten vorgeschlagen oder entwickelt, um spezifische Eigenschaften von t-PA zu verbessern. Bestimmte dieser Varianten betreffen Nachteile in Zusammenhang mit der Verwendung von natürlichem t-PA in Situationen, wo ein Wirkstoff mit einer längeren Halbwertszeit oder langsameren Clearancerate vorzuziehen wäre, z.B. bei der Behandlung von Tiefvenenthrombose und nach der Reperfusion eines Infarktopfers, oder wenn ein einkettiger Wirkstoff vorzuziehen ist.
Beispielsweise führt die Entfernung eines beträchtlichen Anteils oder der Gesamtheit der Fingerdomäne zu einem Molekül mit im wesentlichen verringerten Fibrinbindungseigenschaften, wenn auch im Gegenzug eine Abnahme der Gesamt- Clearancerate des resultierenden Gebildes festzustellen ist. Siehe WO 89/00197, veröffentlicht am 12. Januar 1989.
Varianten sind in der EPA Patentveröffentl. Nr. 199.574 beschrieben, die Aminosäuresubstitutionen an den proteolytischen Spaltungsstellen an Positionen 275, 276 und 277 aufweisen. Diese Varianten, vorzugsweise als t-PA-Varianten mit einer anderen Aminosäure als Arginin an Position 275 gekennzeichnet, werden als Protease- resistente einkettige t-PA-Varianten bezeichnet, da sie im Gegensatz zu natürlichem t- PA, der entweder in einkettiger oder zweikettiger Form bestehen kann, an Position 275 gegenüber Proteasespaltung resistent sind und daher metabolisch in vivo nicht zu einer zweikettigen Form umgewandelt werden. Man ist der Ansicht, daß diese Form insofern bestimmte biologische und kommerzielle Vorteile aufweist, als sie stabiler ist, während die Fibrinbindung und Fibrinstimulierung im Vergleich zum zweikettigen t-PA verstärkt sind. Weiters sind Plasminogenaktivatoren beschrieben, die eine Domäne, die mit Fibrin in Wechselwirkung treten kann, und die Proteasedomäne von Urokinase umfassen, wobei eine Ausführungsform Urokinase-geändert ist, um sie weniger anfällig zu machen, zweikettige Urokinase zu bilden. Siehe WO 88/05081, veröffentlicht am 14. Juli 1988.
Für weitere Patentliteratur bezüglich der Modifizierung der Proteasespaltungsstelle von t-PA sei z.B. auf EPA 241.209; EPA 201.153, veröffentlicht am 12. November 1986; EPA 233.013, veröffentlicht am 19. August 1987; EPA 292.009, veröffentlicht am 23. November 1988; EPA 293.936, veröffentlicht am 7. Dezember 1988; und EPA 293.934, veröffentlicht am 7. Dezember 1988; sowie auf WO 88/10119 verwiesen.
Glykosylierungsmutanten an 117-119, 184-186 und 448-450 wiesen mit verringertem Molprozent-Kohlenhydrat eine höhere spezifische Aktivität auf. Siehe EPA Nr. 227.462, veröffentlicht am 1. Juli 1987. Diese Patentanmeldung offenbart zusätzlich die Verwendung eines Assays von Fibrin/Fibrinabbauprodukten und lehrt, daß man auch das t-PA-Molekül an Positionen 272-280 modifizieren oder bis zu 25 Aminosäuren aus dem C-Terminus löschen kann. Weiters stellte sich heraus, daß die t-PA-Mutanten mit Asn119, Ala186 und Asn450, deren N-Glykosylierungsstellen durch DNA- Modifizierung selektiv entfernt sind, die aber restliches O-gebundenes Kohlenhydrat enthalten, etwa zweimal wirksamer als Melanom-t-PA in einem in vitro Lyseassay waren. Siehe EPA Nr. 225.286, veröffentlicht am 10. Juni 1987.
Die Ersetzung der Aminosäure an 449 von t-PA mit jeder beliebigen Aminosäure außer Arginin zur Modifizierung der Glykosylierungsstelle, sowie die Modifizierung von Arg275 oder Löschung des -3 bis 91-Bereiches, wird auch gelehrt. Siehe WO 87/04722, veröffentlicht am 13. August 1987. Eine Aminosäurensubstitution an Position 448 von t- PA wird als wünschenswert geoffenbart, um die Glykosylierung zu entfernen. Siehe EPA Nr. 297.066, veröffentlicht am 28. Dezember 1988. Die Kombination von Modifizierungen an Positionen 448-450 und die Löschung der N-terminalen 1-82 Aminosäuren ist durch WO 89/00191, veröffentlicht am 12. Januar 1989, geoffenbart. Außerdem wurde Urokinase im Bereich von Asp302-Ser303-Thr304 modifiziert, um Glykosylierung zu verhindern. Siehe EPA Nr. 299.706, veröffentlicht am 18. Januar 1989. Es scheint jedoch die Änderung der Glykosylierungsstellen, und insbesondere jener bei Aminosäure 117, unweigerlich zu einem Molekül zu führen, das beeinträchtigte Löslichkeitseigenschaften aufweist, die zusätzlich zu einem geänderten Kreislauf-Halbwertszeitmuster und/oder Fibrinbindungseigenschaften führen können. Siehe EPA Nr. 238.304, veröffentlicht am 23. September 1987.
Wenn die Wachstumsfaktordomäne von t-PA gelöscht wird, ist die resultierende Variante nach wie vor aktiv und bindet sich an Fibrin, wie dies durch A.J. van Zonneveld et al., Thrombos.Haemostas., 54 (1) 4 (1985) berichtet wird. Verschiedene Löschungen in der Wachstumsfaktordomäne wurden auch in der Patentliteratur berichtet. Siehe EPA Nr. 207.589 (Substitutionen und Löschungen zwischen 51 und 87), EPA Nr. 241.209 (des-51-87), EPA Nr. 241.208 (des-51-87 und des-51-173), PCT 87/04722 (Löschung der Gesamtheit oder Teils des N-Terminals 1-91), EPA Nr. 231.624 (die gesamte Wachstumsfaktordomäne gelöscht), und EPA Nr. 242.836 und die japanische Patentanmeldung Kokai Nr. 62-269688 (ein Teil oder die Gesamtheit der Wachstumsfaktordomäne gelöscht).
Weiters wurde gezeigt, daß t-PA sowohl im Bereich der ersten Kringle-Domäne als auch in der Wachstumsfaktordomäne modifiziert werden kann, was zu einer erhöhten Kreislauf-Halbwertszeit führt. Siehe EPA Nr. 241.208, veröffentlicht am 14. Oktober 1987. Der Bereich zwischen Aminosäuren 51 und einschließlich 87 können aus t-PA gelöscht werden, um eine Variante zu ergeben, die eine langsamere Clearance aus Plasma aufweist. Browne et al., J.Biol.Chem., 263: 1599-1602 (1988). Weiters kann t-PA ohne negative biologische Auswirkungen im Bereich von Aminosäuren 67 bis 69 des reifen, nativen t-PA durch Löschung bestimmter Aminosäurereste oder Ersetzung einer oder mehrerer Aminosäuren durch andere Aminosäuren modifiziert werden. Siehe EPA Nr. 240.334, veröffentlicht am 7. Oktober 1987. Siehe auch WO 89/12681, veröffentlicht am 28. Dezember 1989 über Substitutionen an Resten zwischen 63-72, besonders 66 und 67 von Wildtyp-t-PA.
Ein Hybrid von t-PA/Urokinase unter Verwendung des Bereichs von t-PA umfassend die Aminosäuren 273-527 ist auch geoffenbart. Siehe EPA 290.118, veröffentlicht am 9. November 1988.
Serpinresistente Mutanten von menschlichem t-PA mit Änderungen in der Proteasedomäne, einschließlich d296-302 t-PA, R304S t-PA und R304E t-PA, sind in Madison et al., Nature, 339: 721-724 (1989) geoffenbart: siehe auch den begleitenden Artikel von Dagmar Ringe in der gleichen Ausgabe.
Eine allgemeine Übersicht über Plasminogenaktivatoren und deren Derivate der zweiten Generation findet sich in Harris, Protein Engineering, 1: 449-458 (1987). Andere Überblicke über t-PA-Varianten bieten Pannekoek et al., Fibrinolysis, 2:123-132 (1988) und Ross et al., Annual Reports in Medicinal Chemistry, Bd. 23, Kapitel 12 (1988).
Es wäre wünschenswert, ein t-PA-Molekül bereitzustellen, das in bezug auf Wildtyp-t-PA eine höhere fibrinstimulierte (oder Plasmagerinnsel-stimulierte) Aktivität als fibrinogenstimulierte (oder plasmastimulierte) Aktivität aufweist, d.h. fibrin- (oder Plasmagerinnsel-)spezifisch ist, sodaß es nur an der Stelle des Gerinnsels und nicht systemisch wirkt.
Demzufolge besteht ein erfindungsgemäßes Ziel darin, fibrinspezifische t-PA-Moleküle bereitzustellen, die verbesserte therapeutische und pharmazeutische Eigenschaften aufweisen.
Es ist ein weiteres Ziel, die Behandlung von Krankheiten zu ermöglichen, bei denen gerinnselauflösende Wirkstoffe verwendet werden können, die nur an der Stelle des Gerinnsels aktiv sind und in höheren Mengen als andere solche Wirkstoffe geeignet sind.
Diese und andere Ziele sind für den Fachmann auf dem Gebiet offenkundig.

Zusammenfassung der Erfindung

Diese Ziele werden durch das Vorsehen einer menschlichen Gewebeplasminogenaktivator- (t-PA) Variante erreicht, die fähig ist Fibrinspezifität oder Plasmagerinnsel-Spezifität zu zeigen, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Löschung jener Aminosäuren umfaßt, die Positionen 466 bis 470 des korrespondierenden Wildtyp-t-PA umspannen.
In weiteren Ausführungsformen stellt die Erfindung DNA-Sequenzen und replizierbare Vektoren bereit, die für die oben beschriebene Variante und die mit ihnen transformierten Wirtszellen kodieren.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung eine Zusammensetzung zur Behandlung eines vaskulären Leidens oder einer vaskulären Erkrankung, umfassend eine therapeutisch wirksame Menge der Variante, die hierin in Mischung mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger vorhanden ist. Ebenfalls hierin enthalten ist eine Zusammensetzung zur Verhinderung von Fibrinablagerung oder Adhäsionsbildung oder -wiederbildung, umfassend eine therapeutisch wirksame Menge der Variante, die hierin in Mischung mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger vorhanden ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zur Behandlung eines vaskulären Leidens oder einer vaskulären Erkrankung in einem Säugetier bereit, umfassend das Verabreichen einer wirksamen Menge der oben beschriebenen geeigneten Zusammensetzung an das Säugetier.
Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Behandlung eines Säugetiers bereit, um die Fibrinablagerung oder Adhäsionsbildung oder -wiederbildung zu verhindern, umfassend das Verabreichen einer wirksamen Menge der oben beschriebenen geeigneten Zusammensetzung an einer Stelle potentieller Fibrin- oder Adhäsionsbildung am Säugetier.
Die Praxis der Erfindung führt zu einem t-PA-Molekül, das (fibrin- oder Plasmagerinnsel-)spezifischer ist, sodaß es bevorzugter an der Stelle des Gerinnsels als nicht modifizierter t-PA wirkt.

Kurze Beschreibung der Zeichnung

Fig.1 stellt die Primärstruktur von t-PA dar, in der die Stelle bzw. Lage der fünf Domänen, die Disulfidbrücke und die Aktivierungsstelle ersichtlich sind, wo das Molekül in ein zweikettiges Molekül gespalten wird.

Ausführliche Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen

A. Definitionen

Die hierin verwendeten Ausdrücke "menschlicher Gewebeplasminogenaktivator", "menschlicher t-PA" und "t-PA" bezeichnen einen menschlichen extrinsischen Plasminogenaktivator (vom Gewebetyp) mit zwei funktionalen Bereichen bestehend aus einer Proteasedomäne, die fähig ist, Plasminogen zu Plasmin umzuwandeln, und einem N-terminalen Bereich, von dem man annimmt, daß er für die Fibrinbindung verantwortlich ist. Diese drei Ausdrücke umfassen somit Polypeptide, die diese funktionalen Domänen als Teil der Gesamtsequenz enthalten. t-PA wird geeigneterweise z.B. durch rekombinante Zellkultursysteme in bioaktiven Formen erzeugt, umfassend den Proteaseanteil und Anteile von t-PA, die ansonsten zur Quelle des t-PA nativ sind. Man beachte, daß natürliche allelomorphe Variationen bestehen und von Individuum zu Individuum auftreten, was durch (eine) Aminosäuredifferenz(en) in der Gesamtsequenz gezeigt wird.
Der hierin verwendete Ausdruck "Wildtyp-t-PA" bezieht sich auf t-PA, der durch die cDNA kodiert wird, wie dies in der oben angeführten US PS 4.766.075 berichtet wird. Der solcherart kodierte t-PA ist geeigneterweise ein t-PA-Molekül aus jeder beliebigen nativen Quelle oder jedem beliebigen rekombinanten Expressionssystem, einschließlich 293- oder 294-Zellen, chinesischer Hamster-Eierstockzellen, usw.
Der Ausdruck "Fibrinspezifität" bezieht sich auf die Aktivität eines Mutanten, der ein höheres Verhältnis an fibrinabhängiger spezifischer Aktivität zur fibrinogenabhängigen spezifischen Aktivität in einem S-2251 Assay (entweder in einkettiger oder zweikettiger Form) als Wildtyp-rt-PA und vorzugsweise ein Verhältnis von zumindest 1,5 aufweist.
Der Ausdruck "Plasmagerinnsel-Spezifität" bezieht sich auf die Aktivität eines Mutanten, der ein höheres Verhältnis von Plasmagerinnsel-abhängiger-spezifischer Aktivität zu plasmaabhängiger spezifischer Aktivität in einem S-2251 Assay (entweder in einkettiger oder zweikettiger Form) als Wildtyp-rt-PA und vorzugsweise ein Verhältnis von zumindest 1,5 aufweist.
Der hierin verwendete Ausdruck "transientes Expressionssystem" bezeichnet Zellkulturenthaltende Zellen, die mit einem t-PA variantenkodierenden Vektor transfiziert sind, der die DNA-Sequenz exprimiert, die für die Variante transient, d.h. in einer möglicherweise nicht stabilen Weise, kodiert. Solche Zellen gelten als "zur transienten Expression fähig".

B. Allgemeine Verfahren

1. Aminosäuresequenzvarianten

Um die hierin angeführten Varianten zu besprechen wird auf Fig.1 Bezug genommen, die die Primärstruktur von t-PA darstellt.
In Fig.1 sind die Buchstaben in den Kreisen aus einem Buchstaben bestehende Aminosäurecodes, die Verbindungslinien zwischen Ketten stellen die Disulfidbrücke dar, die offenen Kreise zeigen Glykosylierungsstellen an, und die Bezeichnungen F, GF, K1, K2 und SP stehen jeweils für die Finger-, Wachstumsfaktor-, Kringle 1-, Kringle 2- und Serinproteasedomäne.
Man beachte, daß sich als Kurzbezeichnung der hierin beschriebenen t-PA-Varianten die Zahlen auf die Aminosäurereste/Position entlang der Aminosäuresequenzen von mutmaßlichem reifen t-PA beziehen (EPA Veröffentl. Nr. 93.619). Die Aminosäureidentifizierung verwendet das aus einem Buchstaben bestehende Alphabet von Aminosäuren, d.h.
Asp D Asparaginsäure
Thr T Threonin
Str S Serin
Glu E Glutaminsäure
Pro P Prolin
Gly G Glycin
Ala A Alanin
Cys C Cystein
Val V Valin
Met M Methionin
Ile I Isoleucin
Leu L Leucin
Tyr Y Tyrosin
Phe F Phenylalanin
His H Histidin
Lys K Lysin
Arg R Arginin
Trp W Tryptophan
Gln Q Glutamin
Asn N Asparagin
Die Bezeichnung einer Löschungsvariante besteht aus dem Buchstaben d gefolgt von der Zahl der Startposition der Löschung bis zur Zahl der Endposition der Löschung, wobei die Positionen auf den reifen Wildtyp-t-PA bezogen sind. Die Bezeichnung einer Substitutionsvariante besteht hierin aus einem Buchstaben gefolgt von einer Zahl und anschließend einem Buchstaben. Der erste (ganz linke) Buchstabe bezeichnet die Aminosäure im reifen Wildtyp-t-PA. Die Zahl bezieht sich auf die Aminosäureposition, an der die Aminosäuresubstitution erfolgt; der zweite (rechte) Buchstabe bezeichnet die Aminosäure, die verwendet wird, um die Wildtyp-Aminosäure zu ersetzen. Die Bezeichnung einer Einfügungsvariante besteht aus dem Buchstaben i gefolgt von einer Zahl, welche die Position des Rests im reifen Wildtyp-t-PA angibt, vor dem die Einfügung beginnt, gefolgt von einem oder mehreren Großbuchstaben, die einschließlich die durchzuführende Einfügung anzeigen. Mehrfach-Mutationen sind bei der Bezeichnung zu deren leichteren Lesbarkeit durch einen Beistrich getrennt.
Beispiele dieser Nomenklatur sind wie folgt: die hierin angeführte Löschungsvariante, worin die Aminosäuren an Positionen 466 bis 470 vom reifen Wildtyp-t-PA gelöscht sind, wird als d466-470 bezeichnet. Eine Substitutionsvariante, worin das Phenylalanin an Position 305 des Wildtyp-t-PA durch einen Histidinrest ersetzt ist, wird als F305H bezeichnet. Eine Substitutionsvariante mit Mehrfach-Substitutionen an aufeinanderfolgenden Positionen 296-299 von AAAA für KHRR wird als K296A, H297A, R298A, R299A bezeichnet. Eine Einfügungsvariante, worin Cystein und Valin nach Position 305 von Wildtyp-t-PA eingefügt sind, wird als i305CV bezeichnet. Die Bezeichnung "t-PA" folgt auf jeden Mutanten.
Zusätzlich zur Löschung an Positionen 466-470 kann die erfindungsgemäße t-PA- Variante auch gegenüber der nativen Sequenz an einer oder mehreren Proteasedomänestellen geändert werden, sodaß sie zymogene und/oder Fibrin- (oder Plasmagerinnsel-)spezifische Eigenschaften aufweist, wie dies in der PCT- Veröffentlichung WO 90/02798, veröffentlicht am 22. März 1990, beschrieben ist. Somit kann die Variante zymogene Eigenschaften aufweisen sowie Fibrin- (oder Plasmagerinnsel-)spezifisch sein. Die kleinen geänderten Bereiche der Proteasedomäne können dadurch identifiziert werden, daß sie geladene Aminosäureseitenketten aufweisen, welche Bereiche und/oder daran angrenzende Bereiche für die Wechselwirkung von t-PA mit anderen Substanzen verantwortlich sein können, die seine verschiedenen Aktivitäten beeinflussen können.
Die Bereiche, die für das Untersuchen bezüglich Zymogenizität oder fibrinspezifischer Aktivität durch das in der PCT Veröffentl. WO90/02798, veröffentlicht am 22. März 1990, beschriebene Verfahren identifiziert sind, befinden sich an Restnummern 267, 283-287, 296-299, 303-304, 322, 326-327, 331-332, 339-342, 347-351, 353-356, 360- 362, 364-366, 369-371, 378-383, 387-392, 400-405, 408, 410, 416-418, 426-430, 432- 434, 440, 445-449, 449-453, 460-462, 471-472, 477, 487-489, 505-506, 513, 519-523 und 523-526 des korrespondierenden Wildtyp-t-PA.
Eine oder mehrere dieser Bereiche oder Untereinheiten davon können zusätzlich zur Löschung an Positionen 466-470 geändert werden, um zu bestimmen, ob die erwünschte(n) biologische(n) Eigenschaft(en) erzielt werden. Die geladenen Reste (Arg, Asp, His, Lys und Glu) werden geeigneterweise unter Anwendung eines Verfahrens identifiziert, das als Alanin-Abtastmutagenese (geoffenbart in Cunningham und Wells, Science, 244: 1081-1085 (1989)) bekannt ist und durch eine neutrale oder negativ geladene Aminosäure ersetzt, um die Wechselwirkung der Aminosäuren mit der wässerigen Umgebung in und außerhalb der Zelle zu beeinflussen.
Beispiele solcher Varianten sind jene, worin Aminosäuresubstitutionen an Position(en) 267, 283+287, 296-299, 303-304, 331-332, 339+342, 347-349+351, 364-366, 408, 410, 416-418, 426-427+429-430, 432-434, 440, 445+449, 449+453, 460+462 und/oder 477 des korrespondierenden Wildtyp-t-PA vorgenommen werden, worin "+" Ersetzungen ausschließlich an den gekennzeichneten Positionen und "-" Ersetzungen an allen gekennzeichneten Positionen angibt.
Für die Alanin-Abtastmutagenese ist es vorzuziehen, daß mit einer Aminosäure substituiert wird, welche die Ladung der korrespondierenden Aminosäure des Wildtyp-t- PA neutralisiert und dem Molekül keine entgegengesetzte Ladung verleiht. Jede beliebige hydrophobe, im wesentlichen ungeladene oder entgegengesetzt geladene Aminosäure kann verwendet werden, darunter vorzugsweise Alanin, Glycin, Serin, Threonin, Asparagin, Glutamin, Valin, Leucin, Isoleucin, Phenylalanin oder Tyrosin. Unter diesen sind kleine Aminosäuren, wie z.B. Alanin, Serin und Threonin, gegenüber größeren Aminosäuren, wie z.B. Valin, Leucin und Isoleucin, vorzuziehen. Geladene Aminosäuren, wie z.B. Asparaginsäure oder Glutaminsäure, sind weniger bevorzugt.
Bevorzugter ist die zur Ersetzung verwendete Aminosäure entweder Alanin, Serin,Threonin, Asparagin, Glutamin, Phenylalanin oder Tyrosin, und noch bevorzugter Alanin, Serin oder Threonin. Alanin ist für diese Zwecke die bevorzugteste Aminosäure, da es die Seitenkette über den Beta-Kohlenstoff hinaus eliminiert und weniger wahrscheinlich die Hauptkettenkonformation des Wildtyp-t-PA-Moleküls ändert. Weiters ist Alanin häufig sowohl in verdeckten als auch offenliegenden Positionen vorhanden (Creighton, T.E., in "The Proteins", (Hrsg. W.H.Freeman & Co., N.Y.); Chothia, C. (1976) J.Mol.Biol., 150: 1).
Die bevorzugtesten dieser Substitutionen sind ein Alaninrest anstelle jedes der bestehenden Reste an Positionen 296-299 des Wildtyp-t-PA, d.h. K296A, H297A, R298A, R299A-t-Pa, an Positionen 416-418 des Wildtyp-t-PA, d.h. K416A, H417A, E418A, an Positionen 426-427 und 429-430 des Wildtyp-t-PA, d.h. E426A, R427A, K429A, E430A, an Positionen 339 und 340 von Wild-Typ t-PA, d.h. R339A, R342A und an Positionen 432 und 434 von Wild-Typ t-PA, d.h. H432A, R434A. Daher würden die bevorzugten Doppel-Mutant t-PA-Moleküle K296A, H297A, R298A, R299A, d466-470 t-PA, K416A, H417A, E418A, d466-470 t-PA, E426A, R427A, K429A, E430A, d466-470- t-PA, R339A, R342A, d466-470-t-PA, H432A, R434A, d466-470-t-PA und Kombinationen davon sein, wobei E426A, R427A, K429A, E430A, d466-470-t-PA besonders vorzuziehen sind.
Wahlweise eingefügte Varianten, die eine zymogene oder fibrinspezifische Aktivität aufweisen können, sind jene, worin eine oder mehrere Aminosäuren nach den Aminosäuren an Positionen 296, 297, 298 und/oder 299 eingesetzt sind. Bevorzugt sind jene Proteasedomänevarianten mit einer Einfügung bestehend aus entweder Tyrosin, Asparagin, Lysin, Arginin oder Glutamin zusätzlich zur Löschung an Positionen 466- 470.
Gegebenenfalls kann die Variante Substitutionen, Löschungen oder Einfügungen von Resten in anderen Bereichen der nativen Sequenz enthalten, um bestimmte Eigenschaften des Moleküls zu verbessern, soferne keine Veränderungen erfolgen, die das Spalten der einkettigen Form von t-PA zu seiner zweikettigen Form verhindern oder auf andere Weise die Fibrin- oder Plasmagerinnsel-Spezifität ändern, die dem Molekül durch die Löschungen in der Proteasedomäne der vorliegenden Erfindung verliehen wird. Die bevorzugten Änderungen in diesen anderen Domänen sind unten angeführt.
Zum Beispiel weisen die hierin angeführten Varianten geeigneterweise zumindest einen Abschnitt der Fingerdomäne, der Wachstumsfaktordomäne und/oder der Kringle 1- Domäne nicht auf, und/oder sie weisen an der Glykosylierungsstelle um Aminosäuren 117 oder 184 kein Glykosylierungspotential auf; außerdem enthalten sie geeigneterweise Aminosäuremodifizierungen in der mutmaßlichen Lysinbindungsstelle von Kringle 1 oder 2.
Darüber hinaus kann die Fibrinbindung von t-PA durch geeignete Substitutionen von positiv oder negativ geladenen Aminosäureresten auf den gegenüberliegenden Rändern der mutmaßlichen Ligandenbindungstasche der Kringle 2-Domäne von t-PA moduliert und am bevorzugtesten wiederhergestellt oder erhöht werden. Die hierin angeführten Varianten werden im allgemeinen durch stellengerichtete Mutagenese oder durch Ausschneiden/Ligationstechniken hergestellt, die weiter unten beschrieben sind.
Spezielle Beispiele solcher Varianten umfassen ein Molekül ohne Aminosäuren 1 bis 44 (als d1-44 bezeichnet) und ein Molekül mit Asparaginsäure an Position 184 (als N184D bezeichnet). Varianten ohne Aminosäuren 1 bis 44 sind ausführlicher in WO 89/00197, oben, beschrieben.
Alle der obigen Varianten werden gegebenenfalls in verschiedenen anderen Bereichen des Moleküls modifiziert, wenn solche Modifizierungen nach wie vor die hierin für Fibrin- (oder Plasmagerinnsel-)spezifische Eigenschaften angeführten Kriterien erfüllen. Solche Modifizierungen umfassen beispielsweise:
1. Kringle 1-Modifizierungen, z.B. Löschung von etwa 92 bis 179, und/oder
2. Kringle 2-Modifizierungen, z.B. Löschung von etwa 174-261 oder Modifizierung im Bereich von Aminosäuren etwa 205-215, besonders 210-213, und/oder
3. Aminosäuren etwa 244-255, besonders 252 oder ihre Stelle, und/oder
4. Aminosäuren etwa 233-242, besonders 236-238, und/oder
5. Bekannte Glykosylierungsstellen, wie z.B. Aminosäure 117 oder 184, und/oder
6. Zugabe von potentiellen Glykosylierungsstellen, wie dies in der PCT Veröffentlichung WO 89/11531, veröffentlicht am 30. November 1989 beschrieben ist. Kurz gesagt wird eine potentielle N- oder O-verbundene Glykosylierungsstelle in das t- PA-Molekül z. B. innerhalb seiner Wachstumsfaktordomäne eingesetzt, vorzugsweise an Position 67-69, wo das Tyrosin an Position 67 durch einen Asparaginrest ersetzt wird, um die Halbwertszeit des t-PA-Moleküls zu ändern.
Viele dieser Modifizierungen können die Clearanceraten und die Fibrinbindung im Vergleich zu nativem t-PA merklich ändern. Der Fachmann auf dem Gebiet ist in der Lage, durch den geeigneten Assay zu ermitteln, welches in irgendeinem bestimmten Fall die optimalen Eigenschaften jeder Variante sind.
Die Modifizierung, um die geeignete(n) Aminosäure(n) im nativen Molekül zu löschen, zu ändern oder einzusetzen, um die obigen Sequenzvariationen zu bewirken, erfolgt durch jedes beliebige auf dem Gebiet bekannte Mittel, wie z.B. durch stellengerichtete Mutagenese oder Ligation der geeigneten Sequenz in die für das relevante Protein kodierende DNA, wie dies weiter unten beschrieben ist.

2. Stellenspezifische Mutagenese

Die Herstellung von t-PA-Varianten gemäß der vorliegenden Erfindung wird vorzugsweise durch stellenspezifische Mutagenese von DNA erreicht, die für eine zuvor hergestellte Variante oder eine Nicht-Variantenversion des Proteins kodiert. Die stellenspezifische Mutagenese ermöglicht die Herstellung von t-PA-Varianten durch die Verwendung spezieller Oligonukleotidsequenzen, die für die DNA-Sequenz der erwünschten Mutation kodieren, sowie einer ausreichenden Anzahl angrenzender Nukleotide, um eine Primersequenz ausreichender Größe und Sequenzkomplexität bereitzustellen, um auf beiden Seiten der überbrückten Verbindungsstelle einen stabilen Duplex zu bilden. Typischerweise ist ein Primer von etwa 20 bis 25 Nukleotiden in der Länge bevorzugt, wobei etwa 5 bis 10 Reste auf beiden Seiten der Verbindungsstelle der Sequenz geändert werden. Im allgemeinen ist das Verfahren der stellenspezifischen Mutagenese auf dem Gebiet wohl bekannt, wie dies durch Veröffentlichungen wie z.B. Adelman et al., DNA, 2:183 (1983) belegt wird.
Man beachte, daß das Verfahren der stellenspezifischen Mutagenese typischerweise einen Phagevektor verwendet, der sowohl in ein- als auch in doppelstrangiger Form besteht. Typische zur stellengerichteten Mutagenese geeignete Vektoren umfassen Vektoren wie beispielsweise M13 Phage, geoffenbart durch Messing et al., Third Cleveland Symposium on Macromolecules and Recombinant DNA, Hrsg. A.Walton, Elsevier, Amsterdam (1981). Diese Phage sind im Handel leicht erhältlich, und ihre Verwendung ist für Fachleute auf dem Gebiet im allgemeinen wohl bekannt. Alternativ dazu können Plasmidvektoren, die einen einstrangigen Phage-Replikationsursprung (Veira et al., Meth.Enzymol., 153: 3 (1987)) enthalten, zur Erzielung von einstrangiger DNA verwendet werden.
Im allgemeinen erfolgt die erfindungsgemäße stellengerichtete Mutagenese zunächst durch Bilden eines einstrangigen Vektors, der innerhalb seiner Sequenz eine DNA- Sequenz enthält, die für den relevanten t-PA kodiert. Ein Oligonukleotidprimer, der die gewünschte mutierte Sequenz trägt, wird im allgemeinen synthetisch hergestellt, beispielsweise durch das Verfahren von Crea et al., Proc.Natl.Acad.Sci (USA), 75: 5765 (1978). Der Primer wird dann mit dem Vektor verschmolzen, der die einstrangige t-PA- Sequenz enthält, und DNA-polymerisierenden Enzymen, wie z.B. einem E.coli- Polymerase I Klenow-Fragment, unterworfen, um die Synthese des mutationstragenden Strangs abzuschließen. Damit wird ein Heteroduplex gebildet, worin ein Strang für die ursprüngliche nicht-mutierte Sequenz kodiert und der zweite Strang die gewünschte Mutation trägt. Dieser Heteroduplex-Vektor wird dann verwendet, um geeignete Zellen wie z.B. JM101-Zellen zu transformieren. Klone werden über Hybridisierung mit einer radioaktiven Sonde bestehend aus dem ³²P-markierten Mutageneseprimer ausgewählt, wobei die Klone rekombinante Vektoren enthalten, welche die mutierte Sequenzanordnung tragen.
Nach der Auswahl eines solchen Klons kann der mutierte t-PA-Bereich entfernt und in einen geeigneten Vektor zur t-PA-Herstellung gesetzt werden, im allgemeinen einen Expressionsvektor des Typs, der typischerweise zur Transformation eines geeigneten eukaryotischen Wirts verwendet wird. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung sind chinesische Hamstereierstock- (CHO) Zellen oder 293- Zellen (menschliche Nierenzellen, die durch Graham et al., J.Gen.Virol., 36: 59 (1977) beschrieben sind) zur Herstellung von langfristig stabilen t-PA-Erzeugern vorzuziehen. Die Erfindung ist jedoch nicht auf die CHO-Herstellung beschränkt, da bekannt ist, daß zahlreiche andere Zelltypen geeigneterweise verwendet werden, insbesondere wenn man nur die transiente Herstellung des Enzyms zu Versuchszwecken wünscht. Weiter unten ist beispielsweise ein transientes 293-Zellen verwendendes System beschrieben, das sich für die Herstellung von t-PA-Varianten für analytische Zwecke eignet.

3. Spaltungs/Ligationsverfahren

Ein weiteres Verfahren zur Bildung von Mutationen in der für den t-PA kodierenden DNA-Sequenz umfaßt das Spalten der den t-PA kodierenden DNA an der geeigneten Position durch Digestion mit Restriktionsenzymen, das Gewinnen der richtig gespaltenen DNA, das Synthetisieren eines Oligonukleotids, das für die erwünschte Aminosäure kodiert, und flankierender Bereiche, wie z.B. Polylinker, mit stumpfen Enden (oder anstelle der Verwendung von Polylinkern das Digerieren des synthetischen Oligonukleotids mit den Restriktionsenzymen, die auch zur Spaltung der für t-PA kodierenden DNA verwendet werden, um dadurch kohäsive Enden zu schaffen), sowie das Ligieren der synthetischen DNA in den Rest des für t-PA kodierenden Strukturgens.

4. Wirtszellenkulturen und Vektoren

Obwohl die chinesische Hamstereierstock- (CHO) Expression letzten Endes für die t-PA- Herstellung vorzuziehen ist, eignen sich die hierin geoffenbarten Vektoren und Verfahren zur Verwendung in Wirtszellen für einen großen Bereich eukaryotischer Organismen.
Im allgemeinen sind natürlich Prokaryoten für das anfängliche Klonen von DNA- Sequenzen und Konstruieren der für die Erfindung brauchbaren Vektoren vorzuziehen. Beispielsweise sind insbesondere E.coli K12 Stamm 294 (ATCC Nr. 31.446) und E.coli Stamm W3110 (ATCC Nr. 27.325) brauchbar. Andere geeignete mikrobielle Stämme umfassen E.coli-Stämme wie z.B. E.coli B und E.coli X1776 (ATCC Nr. 31.537). Diese Beispiele sind natürlich veranschaulichend und nicht einschränkend.
Prokaryoten eignen sich zur Expression. Die oben erwähnten Stämme sowie Bazillen wie z.B. Bacillus subtilis und andere Enterobakteriaceae, wie z.B. Salmonella typhimurium oder Serratia marcesans, und zahlreiche Pseudomonas-Spezien sind Beispiele nützlicher Expressionswirte.
Im allgemeinen werden Plasmidvektoren, die Replikon- und Steuersequenzen enthalten, die von Spezien abgeleitet sind, die mit der Wirtszelle kompatibel sind, in Verbindung mit diesen Wirten verwendet. Der Vektor trägt üblicherweise eine Replikationsstelle sowie Markierungssequenzen, die fähig sind in transformierten Zellen für eine phänotypische Selektion zu sorgen. Beispielsweise wird E.coli typischerweise unter Verwendung von pBR322, einem aus einer E.coli-Spezies abgeleiteten Plasmid transformiert (siehe, z.B. Bolivar et al., Gene, 2: 95 (1977)). pBR322 enthält Gene für Ampicillin- und Tetracyclinresistenz und bietet somit ein leichtes Mittel zur Identifizierung transformierter Zellen. Das pBR322 Plasmid oder ein anderes mikrobielles Plasmid oder mikrobieller Phage muß auch Promotoren enthalten (bzw. muß modifiziert werden, um diese zu enthalten), die durch den mikrobiellen Organismus zur Expression seiner eigenen Proteine verwendet werden können.
Zu den in rekombinanter DNA-Konstruktion am häufigsten verwendeten Promotoren gehören die β-Lactamase- (Penicillinase) und Lactose-Promotorsysteme (Chang et al., Nature, 375: 615 (1978); Itakura et al., Science, 198: 1056 (1977); Goeddel et al., Nature, 281: 544 (1979)) und ein Tryptophan- (trp) Promotorsystem (Goeddel et al., Nucl.Acids Res., 8: 4057 (1980); EPA Nr. 36.776), und die alkalischen Phosphatasesysteme. Dies sind zwar die am häufigsten verwendeten, doch es wurden auch andere mikrobielle Promotoren entdeckt und verwendet und Details über ihre Nukleotidsequenzen wurden veröffentlicht, wodurch ein Fachmann auf dem Gebiet sie funktional mit Plasmidvektoren ligieren kann (siehe z.B. Siebenlist et al., Cell, 20: 269 (1980)).
Zusätzlich zu Prokaryoten eignen sich hierin auch eukaryotische Mikroben, wie z.B. Hefen. Saccharomyces cerevisiae, oder gemeine Backhefe, ist der am häufigsten verwendete eukaryotische Mikroorganismus, obwohl eine Anzahl anderer Stämme ebenso verfügbar ist. Beispielweise wird zur Expression in Saccharomyces das Plasmid YRp7 (Stinchcomb et al., Nature, 282: 39 (1979); Kingsman et al., Gene, 7: 141 (1979); Tschemper et al., Gene, 10: 157 (1980) häufig verwendet. Dieses Plasmid enthält bereits das trp1-Gen, das einen Selektionsmarker für einen Mutantenhefestamm bereitstellt, der nicht die Fähigkeit aufweist, in Tryptophan zu wachsen, z.B. ATCC Nr. 44.076 oder PEP4-1 (Jones, Genetics, 85: 12 (1977)). Die Gegenwart der trp1-Läsion als Merkmal des Hefewirtszellengenoms bietet dann eine wirkungsvolle Umgebung zum Nachweisen der Transformation durch Wachstum in Abwesenheit von Tryptophan.
Geeignete Promotorsequenzen in Hefevektoren sind unter anderem die Promotoren für 3-Phosphoglyzeratkinase (Hitzeman et al., J.Biol.Chem., 255: 2073 (1980)) oder andere glykolytische Enzyme (Hess et al., J.Adv.Enzyme Reg., 7: 149 (1968); Holland et al., Biochemistry, 17: 4900 (1978)), wie z.B. Enolase, Glyceraldehyd-3- phosphatdehydrogenase, Hexokinase, Pyruvatdecarboxylase, Phosphofructokinase, Glukose-6-phosphatisomerase, 3-Phosphoglyzeratmutase, Pyruvatkinase, Triosephosphatisomerase, Phosphoglukoseisomerase und Glukokinase. Bei der Konstruktion geeigneter Expressionsplasmide werden die mit diesen Genen assoziierten Terminationssequenzen ebenfalls in den Expressionsvektor 3' der gewünschten zu exprimierenden Sequenz ligiert, um für die Polyadenylierung der mRNA und Termination zu sorgen. Andere Promotoren, die den zusätzlichen Vorteil der durch die Wachstumsbedingungen gesteuerten Transkription aufweisen, sind der Promotorbereich für Alkoholdehydrogenase 2, Isocytochrom C, saure Phosphatase, mit dem Stickstoffmetabolismus assoziierten Abbauenzyme und die oben erwähnte Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase sowie Enzyme, die für die Maltose- und Galactoseverwendung verantwortlich sind. Jeder beliebige Plasmidvektor ist geeignet, der einen hefekompatiblen Promotor, Replikationsursprung und Terminationssequenzen enthält.
Zusätzlich zu Mikroorganismen können Kulturen von aus multizellularen Organismen gewonnenen Zellen auch als Wirte verwendet werden. Im Prinzip ist jede derartige Zellkultur brauchbar, ob die Zellen nun aus einer Wirbeltier- oder einer Wirbellosenkultur stammen. Das größte Interesse galt jedoch den Wirbeltierzellen, und die Vermehrung von Wirbeltierzellen in Kultur (Gewebekultur) wurde in den letzten Jahren zu einem Routineverfahren (Tissue Culture, Academic Press, Kruse und Patterson, Hrsg (1973)). Beispiele solcher geeigneter Wirtszellinien sind VERO- und HeLa-Zellinien, CHO-Zellinien sowie W138-, BHK-, COS-7-, 293- und MDCK-Zellinien. Expressionsvektoren für solche Zellen umfassen üblicherweise (falls erforderlich) einen Replikationsursprung, einen vor dem zu exprimierenden Gen angeordneten Promotor, sowie jegliche erforderliche Ribosomenbindungsstellen, RNA-Spleißstellen, Polyadenylierungsstellen und transkriptionale Terminatorsequenzen.
Zur Verwendung in Säugetierzellen werden die Steuerungsfunktionen auf den Expressionsvektoren oft durch Virenmaterial bereitgestellt. Beispielsweise sind häufig verwendete Promotoren von Polyoma, Adenovirus2 und am häufigsten vom Affenvirus 40 (SV40) abgeleitet. Die frühen und späten Promotoren des SV40-Virus sind besonders nützlich, da man beide leicht aus dem Virus als Fragment erhalten kann, das auch den SV40-Virenreplikationsursprung enthält. (Fiers et al., Nature, 273: 113 (1978)). Kleinere oder größere SV40-Fragmente eignen sich ebenfalls, vorausgesetzt es ist die Sequenz von etwa 250 bp enthalten, die sich von der HindIII-Stelle hin zur BgII-Stelle im viralen Replikationsursprung erstreckt. Weiters ist es auch möglich und oft wünschenswert, Promotor- oder Steuerungssequenzen zu verwenden, die normalerweise mit der erwünschten Gensequenz assoziiert sind, vorausgesetzt solche Steuerungssequenzen sind mit den Wirtszellsystemen kompatibel.
Einen Replikationsursprung bildet man typischerweise durch Konstruktion des Vektors, um einen exogenen Ursprung zu enthalten, wie er z.B. aus SV40 oder einer anderen viralen Quelle (z.B. Polyoma, Adeno, VSV, BPV) abgeleitet werden kann, oder durch den chromosomalen Wirtszellen-Replikationsmechanismus. Wenn der Vektor in das Wirtszellenchromosom integriert ist, ist das letztere oft ausreichend.
Zufriedenstellende Mengen von menschlichem t-PA werden durch Zellkulturen erzeugt. Verfeinerungen unter Verwendung einer sekundären Kodierungssequenz dienen jedoch dazu, die Produktionswerte noch mehr zu steigern. Die sekundäre Kodierungssequenz umfaßt Dihydrofolatreductase (DHFR), die durch einen von außen gesteuerten Parameter beeinflußt wird, wie z.B. Methotrexat (MTX), wodurch die Expressionssteuerung durch die Steuerung der MTX-Konzentration ermöglicht wird.
Bei der Auswahl einer bevorzugten Wirtszelle zur Transfektion durch die erfindungsgemäßen Vektoren, die sowohl für Varianten-t-PA als auch DHFR-Protein kodierende DNA-Sequenzen enthalten, ist es zweckmäßig, den Typ des verwendeten DHFR-Proteins zu berücksichtigen. Bei Verwendung von Wildtyp-DHFR-Protein ist es vorzuziehen, eine Wirtszelle auszuwählen, die einen Mangel an DHFR aufweist, wodurch die Verwendung der DHFR-Kodierungssequenz als Marker zur erfolgreichen Transfektion im selektiven Medium ermöglicht wird, das einen Mangel an Hypoxanthin, Glycin und Thymidin aufweist. Eine geeignete Wirtszelle ist in diesem Fall die CHO- Zellinie, die keine DHFR-Aktivität aufweist und so hergestellt und vermehrt wird, wie dies durch Urlaub und Chasin, Proc.Natl.Acad.Sci. (USA) 77: 4216 (1980) beschrieben ist.
Wird hingegen ein DHFR-Protein mit niedriger Bindungsaffinität für MTX als Steuerungssequenz verwendet, ist es nicht erforderlich, DHFR-arme Zellen zu verwenden. Da das Mutanten-DHFR gegenüber MTX resistent ist, kann man MTX- hältige Medien als Auswahlmittel verwenden, soferne die Wirtszellen selbst MTX- empfindlich sind. Die meisten eukaryotischen Zellen, die fähig sind, MTX zu absorbieren, scheinen MTX-empfindlich zu sein. Eine solche nützliche Zellinie ist eine CHO-Zellinie, CHO-K1 (ATCC Nr. CCL 61).

5. Typische geeignete Klonierungs- und Expressionsverfahren

Bei Verwendung von Säugetierzellen als Wirtszellen erfolgt die Transfektion im allgemeinen durch das Kalziumphosphat-Ausfällungsverfahren, wie dies durch Graham und Van der Eb, Virology, 52: 546 (1978) beschrieben ist. Andere Verfahren zum Einsetzen von DNA in Zellen, wie z.B. Kerninjektion, Elektroporation oder Protoplastenfusion, eignen sich ebenfalls.
Bei Verwendung von Hefe als Wirt erfolgt die Transfektion im allgemeinen unter Verwendung von Polyäthylenglykol, wie dies durch Hinnen, Proc.Natl.Acad.Sci., U.S.A. 75: 1929-1933 (1978) gelehrt wird.
Bei Verwendung von prokaryotischen Zellen oder Zellen, die substantielle Zellwandkonstruktionen enthalten, ist das bevorzugte Transfektionsverfahren die Kalziumbehandlung mittels Kalzium, wie dies durch Cohen et al., Proc.Natl.Acad.Sci. (USA) 69: 2110 (1972) beschrieben ist, oder in letzter Zeit die Elektroporation.
Die Konstruktion von geeigneten Vektoren, welche die erwünschten Kodierungs- und Steuersequenzen enthalten, sieht die Anwendung von Standard-Ligationsverfahren vor. Isolierte Plasmide oder DNA-Fragmente werden gespalten, zurechtgeschnitten und in der erwünschten Form erneut ligiert, um die erforderlichen Plasmide zu bilden.
Das Spalten erfolgt durch Behandeln mit einem oder mehreren Restriktionsenzym(en) in einem geeigneten Puffer. Im allgemeinen wird etwa 1 ug Plasmid oder DNA-Fragmente mit etwa 1 Enyzmeinheit in etwa 20 ul Pufferlösung verwendet. (Geeignete Puffer und Substratmengen für bestimmte Restriktionsenzyme werden durch die Hersteller angegeben). Inkubationszeiten von etwa 1 Stunde bei 37ºC sind geeignet. Nach der Inkubation wird Protein durch Extraktion mit Phenol und Chloroform entfernt und die Nukleinsäure durch Ausfällen mit Äthanol aus der wässerigen Fraktion gewonnen.
Sollten stumpfe Enden erforderlich sein, kann das Präparat 15 Minuten lang bei 15ºC mit 10 Einheiten des Klenow-Fragments von DNA Polymerase I (Klenow) behandelt, Phenol-Chloroform-extrahiert und Äthanol-ausgefällt werden.
Die Trennung der gespaltenen Fragmente nach Größe erfolgt unter Verwendung von 6%igem Polyacrylamidgel, wie dies durch Goeddel et al., Nucleic Acids Res., 8: 4057 (1980) beschrieben ist.
Zur Ligation werden etwa äquimolare Mengen der erwünschten Komponenten, die geeigneterweise am Ende zurechtgeschnitten sind, um eine korrekte Übereinstimmung zu erzielen, mit etwa 10 Einheiten T4-DNA-Ligase pro 0,5 ug DNA behandelt. (Bei Verwendung von gespaltenen Vektoren als Komponenten kann es nützlich sein, die erneute Ligation des gespaltenen Vektors durch Vorbehandlung mit bakterieller alkalischer Phosphatase zu verhindern).
Wie bereits erörtert werden t-PA-Varianten vorzugsweise mittels spezifischer Mutation hergestellt. Für die Praxis der vorliegenden Erfindung geeignete Varianten werden am leichtesten durch Verwendung von spezifischen Oligonukleotidsequenzen, die für die DNA-Sequenz der erwünschten Mutation kodieren, sowie durch eine ausreichende Anzahl an angrenzenden Nukleotiden gebildet, um eine Sequenz ausreichender Größe und Sequenzkomplexität bereitzustellen, um einen stabilen Duplex auf beiden Seiten der überbrückten Mutation zu bilden.
Für die Analyse zur Bestätigung korrekter Sequenzen in den konstruierten Plasmiden dienen die Ligationsmischungen typischerweise dazu, E.coli K12 Stamm 294 (ATCC Nr. 31.446) oder andere geeignete E.coli-Stämme zu transformieren, und es werden erfolgreiche Transformanten wenn zweckmäßig durch Ampicillin- oder Tetracyclinresistenz ausgewählt. Plasmide aus den Transformanten werden durch Restriktionsmapping und/oder DNA-Sequenzieren durch das Verfahren von Messing et al., Nucleic Acids Res., 9: 309 (1981) oder durch das Verfahren nach Maxam et al., Methods of Enzymology, 65: 499 (1980) hergestellt und analysiert.
Nach dem Einsetzen der DNA in den Säugetierzellenwirten und der Auswahl stabiler Transformanten im Medium erfolgt die Verstärkung der für das DHFR-Protein kodierenden Sequenzen durch das Züchten von Wirtszellenkulturen in Gegenwart von etwa 200-500 nM Konzentrationen von MTX, einem kompetitiven Inhibitor der DHFR- Aktivität. Der wirksame Konzentrationsbereich hängt natürlich in hohem Maße von der Beschaffenheit des DHFR-Gens und Proteins und den Eigenschaften des Wirts ab. Selbstverständlich können allgemein definierte Ober- und Untergrenzen nicht ermittelt werden. Geeignete Konzentrationen anderer Folsäureanaloge oder anderer Verbindungen, die DHFR hemmen, könnten auch verwendet werden. MTX selbst ist jedoch zweckmäßig, leicht erhältlich und wirkungsvoll.
Zur Vereinfachung der Beispiele werden bestimmte häufig auftretende Verfahren mit Kurzbezeichnungen versehen.
"Plasmide" werden durch ein klein geschriebenes p und eine anschließende alphanumerische Bezeichnung gekennzeichnet. Die hierin angeführten Ausgangsplasmide sind im Handel erhältlich, öffentlich uneingeschränkt erhältlich, oder sie können aus solchen erhältlichen Plasmiden gemäß veröffentlichter Verfahrensweisen konstruiert werden. Zusätzlich sind andere äquivalente Plasmide auf dem Gebiet bekannt und für den Durchschnittsfachmann offenkundig.
"Digestion" von DNA bezieht sich auf das katalytische Spalten der DNA mit einem Enzym, das nur an bestimmten Stellen in der DNA wirkt. Solche Enzyme bezeichnet man als Restriktionsenzyme und die Stellen, für die jedes spezifisch ist, werden Restriktionsstellen genannt. Die verschiedenen hierin verwendeten Restriktionsenzyme sind im Handel erhältlich, und es wurden die von den Enzym-Lieferfirmen angegebenen Reaktionsbedingungen, Cofaktoren und anderen Erfordernisse verwendet. Restriktionsenzyme werden üblicherweise durch Abkürzungen bezeichnet, die aus einem Großbuchstaben und anschließend anderen Buchstaben, die den Mikroorganismus darstellen, aus dem jedes Restriktionsenzym ursprünglich erhalten wurde, und dann einer das spezielle Enzym kennzeichnenden Zahl bestehen. Im allgemeinen wird etwa 1 ug Plasmid oder DNA-Fragment mit etwa 2 Enzymeinheiten in etwa 20 ul Pufferlösung verwendet. Geeignete Puffer und Substratmengen für bestimmte Restriktionsenzyme werden durch die Hersteller angegeben. Inkubationszeiten von etwa 1 Stunde bei 37ºC werden normalerweise angewendet, können aber je nach Anweisungen der Lieferfirmen variieren. Nach der Inkubation wird das Protein durch Extraktion mit Phenol und Chloroform entfernt und die digerierte Nukleinsäure durch Ausfällen mit Äthanol aus der wässerigen Fraktion gewonnen. An die Digestion mit einem Restriktionsenzym schließt sich hin und wieder die Hydrolyse der terminalen 5'- Phosphate mit bakterieller alkalischer Phosphatase an, um die zwei restriktionsgespaltenen Enden eines DNA-Fragments daran zu hindern, sich "ringzuschließen" oder eine geschlossene Schleife zu bilden, die das Einfügen eines anderen DNA-Fragments an der Restriktionsstelle verhindern würde. Soferne nicht anders angegeben schließt sich an die Digestion von Plasmiden keine 5'-terminale Dephosphorylierung an. Die Verfahrensweisen und Reagenzien zur Dephosphorylierung sind herkömmliche (T. Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1982, S.133-134).
"Gewinnung" oder "Isolierung" eines bestimmten DNA-Fragments aus einem Restriktionsdigest bedeutet die Abtrennung des Digests auf Polyacrylamid- oder Agarosegel durch Elektrophorese, die Identifizierung des interessierenden Fragments durch Vergleich seiner Mobilität gegenüber jener von Marker DNA-Fragmenten mit bekanntem Molekulargewicht, die Entfernung des Gelabschnitts, der das gewünschte Fragment enthält, und die Abtrennung des Gels von der DNA. Dieses Verfahren ist allgemein bekannt. Siehe beispielsweise R.Lawn et al., 1981, Nucleic Acids Res. 9: 6103-6114, und D.Goeddel et al., 1980, Nucleic Acids Res. 8: 4057.
"Southern-Analyse" ist ein Verfahren, durch das die Gegenwart von DNA-Sequenzen in einem Digest oder einer DNA-hältigen Zusammensetzung durch Hybridisierung mit einem bekannten, markierten Oligonukleotid oder DNA-Fragment bestätigt wird. Für die Zwecke der vorliegenden Beschreibung bedeutet Southern-Analyse, soferne nicht anders angegeben, die Abtrennung von Digesten auf 1 %iger Agarose, die Denaturierung und den Transfer auf Nitrozellulose durch das Verfahren von E.Southern, 1975, J.Mol.Biol. 98: 503-517, und durch Hybridisierung wie von T.Maniatis et al., 1978, Cell 15: 687-701 beschrieben.
"Transformation" bedeutet das Einsetzen von DNA in einen Organismus, sodaß die DNA entweder als extrachromosomales Element oder chromosomaler Integrant replizierbar ist. Soferne nicht anders angegeben ist das hierin zur Transformation von E.coli angewendete Verfahren das CaCl&sub2;-Verfahren von Mandel et al., 1970, J.Mol.Biol. 53: 154.
"Ligation" bezieht sich auf das Verfahren zum Bilden von Phosphodiesterbindungen zwischen zwei doppelstrangigen Nukleinsäurefragmenten (T.Maniatis et al., ebda., S.146). Soferne nicht anders angegeben kann die Ligation unter Verwendung bekannter Puffer und Bedingungen mit 10 Einheiten T4-DNA-Ligase ("Ligase") pro 0,5 ug etwa äquimolarer Mengen der zu ligierenden DNA-Fragmente erfolgen.
"Herstellung" von DNA aus Transformanten bedeutet das Isolieren von Plasmid-DNA aus mikrobieller Kultur. Soferne nicht anders angegeben eignet sich das alkalische/SDS- Verfahren von Maniatis et al., ebda., S.90.
"Oligonukleotide" sind einzel- oder doppelstrangige Polydesoxynukleotide kurzer Länge, die durch bekannte Verfahren chemisch synthetisiert und dann auf Polyacrylamidgels gereinigt werden.

C. Reinigung

Die t-PA-Variante wird vorzugsweise als sekretiertes Protein aus dem Kulturmedium gewonnen, obwohl sie auch aus Wirtszelllysaten gewonnen werden kann, wenn sie direkt ohne ein Sekretionssignal exprimiert wird. Wenn die Variante in einer anderen rekombinanten Zelle als einer des menschlichen Ursprungs exprimiert wird, ist die Variante somit völlig frei von Proteinen menschlichen Ursprungs. Es ist jedoch erforderlich, die Variante aus rekombinanten Zellproteinen zu reinigen, um Präparate zu erhalten, die im wesentlichen hinsichtlich Protein homogen sind. Als erster Schritt wird das Kulturmedium oder Lysat zentrifugiert, um teilchenförmige Zellbruchstücke zu entfernen.
Die Variante wird dann von kontaminierenden löslichen Proteinen gereinigt, z.B. durch Fraktionierung auf Immunoaffinitäts- oder Ionenaustauschsäulen, Ausfällung mit Äthanol; Umkehrphasen-HPLC; Chromatographie auf Silika oder auf einem Kationenaustauschharz wie z.B. DEAE; Chromatofokussieren; SDS-PAGE; Ausfällung mit Ammoniumsulfat; oder Gelelektrophorese unter Verwendung von z.B. Sephadex G-75. Ein Proteaseinhibitor, der die t-PA-Aktivität nicht stört, wie z.B. Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) kann auch nützlich sein, den proteolytischen Abbau während der Reinigung zu hemmen, und es können Antibiotika enthalten sein, um das Wachstum zusätzlicher Verunreiniger zu verhindern. Es ist für den Fachmann auf dem Gebiet offenkundig, daß die für nativen t-PA geeigneten Reinigungsverfahren möglicherweise modifiziert werden müssen, um Veränderungen in der Beschaffenheit von t-PA oder seiner Varianten bei der Expression in rekombinanter Zellkultur zu berücksichtigen.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die t-PA-Variante sekretiert und der Überstand über eine PBS-vorkonditionierte Säule aus Glasperlen geschickt, die an einem anti-t-PA Ziegen-polyklonalen A6-Antikörper gekoppelt sind, die Säule mit einem Puffer äquilibriert und die t-PA-Variante danach eluiert.

D. Pharmazeutische Zusammensetzungen

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können gemäß bekannter Verfahren formuliert werden, um pharmazeutisch nützliche Zusammensetzungen herzustellen, wodurch das t-PA-Produkt davon als Mischung mit einem pharmazeutisch verträglichen Trägervehikel kombiniert wird. Geeignete Trägervehikel und ihre Formulierung, einschließlich anderer menschlicher Proteine, z.B. des menschlichen Serumalbumins, sind beispielsweise in Remington's Pharmaceutical Sciences, 16.Ausg., 1980, Mack Publishing Co, Hrsg. Oslo et al. beschrieben. Solche Zusammensetzungen enthalten typischerweise eine wirksame Menge der hierin angeführten Variante, z.B. von etwa 0,5 bis etwa 5 mg/ml gemeinsam mit einer geeigneten Menge eines Trägervehikels, um pharmazeutisch verträgliche Zusammensetzungen zu bilden, die zur wirkungsvollen Verabreichung an den Wirten geeignet sind. Die erfindungsgemäße t-PA-Variante kann Patienten, die an kardiovaskulären Erkrankungen oder Zuständen leiden, parenteral oder durch andere Verfahren verabreicht werden, die ihre wirkungsvolle Zufuhr zum Blutstrom gewährleisten.
Zusammensetzungen, die für die klinische Verabreichung von in der Praxis der vorliegenden Erfindung verwendeten Varianten-t-PA-Produkten gut geeignet sind, umfassen z.B. sterile wässerige Lösungen oder sterile hydratisierbare Pulver wie z.B. lyophilisiertes Protein. Es ist im allgemeinen wünschenswert, in der Formulierung weiters eine geeignete Menge eines pharmazeutisch verträglichen Salzes, im allgemeinen in einer Menge vorzusehen, die ausreicht, um die Formulierung isotonisch zu machen. Ein pH-Regulator wie z.B. eine Argininbase und Phosphorsäure sind ebenfalls typischerweise in ausreichenden Mengen enthalten, um einen geeigneten pH- Wert aufrechtzuerhalten, im allgemeinen von 5,5 bis 7,5. Zur Verbesserung der Lagerbeständigkeit oder Stabilität von wässerigen Formulierungen kann es auch wünschenswert sein, weitere Wirkstoffe wie z.B. Glyzerin vorzusehen. Auf diese Weise sorgt man dafür, daß sich die t-PA-Formulierungen zur parenteralen Verabreichung und insbesondere zur intravenösen Verabreichung eignen.
Dosierungen und erwünschte Arzneimittelkonzentrationen erfindungsgemäßer pharmazeutischer Zusammensetzungen können je nach der besonderen ins Auge gefaßten Verwendung variieren. Beispielsweise sind bei der Behandlung von Tiefvenenthrombose oder peripherer Gefäßerkrankungen "Bolus"-Dosen in der Größenordnung von etwa 0,05 bis etwa 0,2 mg/kg typischerweise mit nachfolgenden Verabreichungen in der Größenordnung von etwa 0,1 bis etwa 0,2 mg/kg vorzuziehen, die gegeben werden, um einen etwa konstanten Blutspiegel beizubehalten, vorzugsweise in der Größenordnung von etwa 3 ug/ml.
Bei der Verwendung in medizinischen Notfallversorgungseinrichtungen, wo Infusionen im allgemeinen nicht gegeben werden können und aufgrund des Schweregrades der zugrundeliegenden Erkrankungen (z.B. Embolie, Infarkt) ist es im allgemeinen wünschenswert, etwas größere Anfangsdosen vorzusehen, wie z.B. einen intravenösen Bolus in der Größenordnung von etwa 0,3 mg/kg.
Beispielsweise wird die erfindungsgemäße t-PA-Variante an Patienten, die an kardiovaskulären Erkrankungen oder Zuständen leiden, geeigneterweise parenteral verabreicht. Die Dosierungen und Dosisraten können gleich oder höher sein als jene, die derzeit in klinischen Untersuchungen anderer kardiovaskulärer thrombolytischer Wirkstoffe angewendet werden, z.B. etwa 1-2 mg/kg Körpergewicht als eine intravenöse oder intraarterielle Dosis in einem Zeitraum von 1,5 bis 12 Stunden bei menschlichen Patienten, die an Myokardinfarkt, Lungenembolie, usw. leiden. Höhere Dosen können vertragen werden, da die erfindungsgemäßen Varianten geringere Nebenwirkungen als Wildtyp-t-PA aufweisen, was zu einer schnelleren und vollständigeren Gerinnsellyse führt.
Als ein Beispiel einer geeigneten Dosierungsform wird ein Fläschchen mit 50 mg t-PA-, Arginin, Phosphorsäure und Polysorbat 80 mit 50 ml sterilem Injektionswasser rekonstituiert und mit einem geeigneten Volumen einer 0,9%igen Natriumchloridinjektion vermischt.
Die erfindungsgemäße t-PA-Variante eignet sich auch zur Verhinderung der Fibrinablagerung oder Adhäsionsbildung oder -wiederbildung. Eine Ausführungsform dieser Verwendung ist in der PCT WO 89/00049, veröffentlicht am 12. Januar 1989, beschrieben. Im allgemeinen umfaßt eine solche Behandlung die topische Verabreichung einer Zusammensetzung an einer Stelle potentieller Fibrinbildung oder Adhäsionsbildung, worin die Zusammensetzung eine therapeutisch wirksame Menge der t-PA-Variante in einer schwerlöslichen Form umfaßt, die über einen Zeitraum von etwa drei Tagen bis zwei Wochen an dieser Stelle kontinuierlich freigesetzt wird. Typischerweise wird die t-PA-Variante mit einer Dosierung verabreicht, die ausreicht, um die Fibrinablagerung oder Bildung von Adhäsionen im Anschluß an eine Operation, Infektion, ein Trauma oder eine Entzündung zu unterbinden. Typischerweise beträgt diese Menge von 0,02 mg/g Gel bis 25 mg/g Gel, wobei bevorzugte Mengen von 0,20 mg/g Gel bis etwa 2,5 mg/g Gel und am bevorzugtesten von 0,25 mg/g bis etwa 1,0 mg/g Gel betragen.
Das Vehikel, in dem der t-PA zur Verhinderung der Adhäsionsbildung typischerweise formuliert wird, ist ein halbfester, schleimiger, pharmazeutisch inerter Träger zum Positionieren des Enzyms an der Stelle der potentiellen Adhäsionsbildung. Ein solcher Träger umfaßt langkettige Kohlenwasserstoffe oder Pflanzenöle und Wachse aus Mischungen gesättigter und ungesättigter Fettsäureglyzeride oder Mischungen modifizierter gesättiger und ungesättigter Fettsäureglyzeride. Beispiele solcher halbfester Vehikel umfassen Vaseline oder halbsynthetische Glyzeride, Polyhydroxy-Lösungsmittel wie z.B. Glyzerin, langkettige Kohlenwasserstoffe, bioerodierbare bzw. biologisch abbaubare Polymere oder Liposome.
Die folgenden Beispiele sollen lediglich die beste nunmehr bekannte Durchführungsart der Erfindung veranschaulichen; diese ist keinesfalls als darauf beschränkt anzusehen.

BEISPIEL I

1. Konstruktion von pRK7-t-PA

Plasmid pRK7 wurde als Vektor zur Erzeugung des t-PA-Mutanten verwendet. pRK7 ist identisch mit pRK5 (EP Veröffentl. Nr. 307.247, veröffentlicht am 15. März 1989),. mit der Ausnahme, daß die Reihenfolge der Endonuklease-Restriktionsstellen im Polylinkerbereich zwischen ClaI und HindIII umgekehrt ist. Die t-PA-cDNA (Pennica et al., Nature, 301: 214 (1983)) wurde zum Einsetzen in den Vektor durch Schneiden mit Restriktionsendonuklease-HindIII (schneidet 49 Basenpaare 5' des ATG-Startcodons) und Restriktionsendonuklease BalI (schneidet 276 Basenpaare stromabwärts vom TGA- Stopcodon) gebildet. Diese cDNA wurde in das zuvor mit HindIII und SmaI unter Verwendung von Standardligationsverfahren geschnittene pRK7 ligiert (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausg. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989)). Dieses Konstrukt wurde als pRK7-t-PA bezeichnet.

2. Stellengerichtete Mutagenese von pRK7-t-PA

Die stellengerichtete Mutagenese von t-PA-cDNA erfolgte durch das Verfahren nach Taylor et al., Nucl.Acids Res., 13: 8765 (1985) unter Verwendung eines Satzes, der von der Amersham Corporation käuflich erworben wurde (Katalognummer RPN 1253). Zur Erzeugung des gewünschten Mutanten wurde ein Oligonukleotid mit einer für die erwünschte Aminosäurelöschung kodierenden Sequenz synthetisiert und als Primer verwendet. Dieses Oligonukleotid wurde an einstrangigen pRK7-t-PA angelagert, der durch Standardverfahren hergestellt worden war (Viera et al., Meth.Enz., 143: 3 (1987)).
Eine Mischung dreier Desoxyribonukleotide, Desoxyriboadenosin (dATP), Desoxyriboguanosin (dGTP) und Desoxyribothymidin (dTTP) wurde mit einem modifizierten, durch den Hersteller des Satzes im Satz vorgesehenen Thiodesoxyribocytosin namens dCTP(aS) kombiniert und zum einstrangigen pRK7-t-PA hinzugefügt, an den das Oligonukleotid angelagert wurde.
Beim Hinzufügen von DNA-Polymerase zu dieser Mischung wurde ein DNA-Strang erzeugt, der mit Ausnahme der gelöschten Basen mit pRK7-t-PA identisch war. Außerdem enthielt dieser neue DNA-Strang dCTP(aS) anstelle von dCTP, das dazu diente, ihn vor Restriktionsendonuklease-Digestion zu schützen. Nachdem der Schablonenstrang des doppelstrangigen Heteroduplex mit einem geeigneten Restriktionsenzym eingekerbt wurde, wurde der Schablonenstrang mit ExoIII-Nuklease nach dem Bereich, der das mutagene Oligomer enthält, digeriert. Die Reaktion wurde dann abgebrochen, um ein Molekül zu hinterlassen, das nur teilweise einstrangig war. Ein vollständig doppelstrangiges DNA-Homoduplexmolekül wurde dann in Gegenwart aller vier Desoxyribonukleotidtriphosphate, ATP und DNA-Ligase durch DNA- Polymerase gebildet.
Das folgende Oligonukleotid wurde zur Verwendung als Primer hergestellt, um das pRK7-t-PA-Molekül mit der erwünschten Löschung von P466, Q467, A468, N469 und L470 zu erzeugen:
5'-CTGGCAGGCGTCGTGCCCGCCGCTCCGAGT-3'

3. Bakterielle Transformation und DNA-Herstellung

Das unter Verwendung der obigen Vorschrift erzeugte Mutanten-t-PA-Konstrukt wurde unter Anwendung des Standard-CaCl&sub2;-Verfahrens (Sambrook et al., oben) zur Herstellung und Transformation kompetenter Zellen zu einem E.coli Wirtsstamm MM294tonA transformiert. MM294tonA (der gegenüber T1-Phage resistent ist) wurde durch Einsetzen und anschließendes ungenaues Ausschneiden eines Tn10-Transposons in das tonA-Gen hergestellt. Dieses Gen wurde dann unter Verwendung der Transposoneinsetzungsmutagenese (Kleckner et al., J.Mol.Biol., 116:125-159 (1977)) in den E.coli Wirt MM294 (ATCC Nr. 31.446) eingesetzt.
DNA wurde aus individuellen Kolonien bakterieller Transformanten unter Verwendung des Standard-Miniprep-Verfahrens von Sambrook et al., oben, extrahiert. Die Plasmide wurden durch das Schicken über eine Sephacryl CL6B-Drehsäule weiter gereinigt und anschließend durch Sequenzieren sowie durch Restriktionsendonukleasedigestion und Agarosegelelektrophorese analysiert.

4. Transfektion menschlicher Embyronieren-293-Zellen (Kleinmaßstab)

293-Zellen wurden in 6-Napf-Platten zu 70% Konfluenz gezuchtet. 2,5 ug t-PA Plasmid- DNA-Mutant wurden in 150 ul 1 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA, 0,227 M CaCl&sub2; aufgelöst. Dem wurden (tröpfchenweise unter Verwirbeln) 150 ul 50 mM HEPES Puffer (pH-Wert 7,35), 280 mM NaCl, 1,5 mM NaPO&sub4; hinzugefügt, und man ließ 10 Min. lang bei 25ºC Niederschlag bilden. Der suspendierte Niederschlag wurde dann den Zellen in den einzelnen Näpfen einer 6-Napf-Platte hinzugefügt; man ließ ihn 4 Stunden lang im Inkubator absetzen. Das Medium wurde dann abgesaugt und 1 ml 20% Glyzerin in PBS 30 Sekunden lang hinzugefügt. Die Zellen wurden zweimal gewaschen, zuerst mit 3 ml, dann mit 1 ml serumfreiem Medium. Dann wurden 3 ml frisches Medium hinzugefügt und die Zellen 5 Tage lang inkubiert. Das Medium wurde dann gesammelt und analysiert.
Wenn einkettiger t-PA erforderlich war, war die Vorgangsweise wie oben beschrieben, mit der Ausnahme, daß das plasminogenabgereicherte Serum während der Wachstumsphase der Zellen verwendet wurde.

5. Biologische Assays

A. t-PA-Quantifizierung

Die Menge von im Zellkulturüberstand vorhandenem t-PA wurde durch die ELISA- Verfahrensweise unter Verwendung von polyklonalen Antikörpern bestimmt, die gegen Wildtyp-t-PA hergestellt wurden. Der t-PA stellte sich als homogen heraus.

B. S-2288-Assay

Der S-2288-Assay diente dazu, die proteolytische Aktivität des Mutanten sowohl in einkettiger als auch in zweikettiger Form zu messen. Dieser Assay ist ein direkter Assay zur proteolytischen Aktivität von t-PA; t-PA spaltet die Bindung zwischen dem kleinen Peptid und dem Paranitroanilidchromophor des S-2288-Substrats.
Standardkurvenproben wurden durch Verdünnen von Wildtyp-rt-PA mit Zellkulturmedien gebildet. Die Standardkurvenproben und die rt-PA-Mutantenprobe wurden den Näpfen einer Mikrotiterplatte hinzugefügt. Wenn der Assay zum Messen der Aktivität von zweikettigem rt-PA verwendet wurde, war in der Verfahrensweise ein Inkubationsschritt mit menschlichem Plasmin enthalten. Menschliches Plasmin (KabiVitrum) wurde bis zu einer Endkonzentration von 0,13 CE (Caseineinheiten)/ml hinzugefügt. Die Proben wurden 90 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Zum Analysieren der Proben in einkettiger Form wurde die Plasminlösung durch PBS ersetzt, und es wurde keine 90-minütige Inkubation durchgeführt.
Aprotinin [Sigma, etwa 14 TIU (Trypsininhibitor-Einheit)/(mg)] wurde bis zu einer Endkonzentration von 72 ug/ml hinzugefügt, um die Plasminaktivität zu hemmen, und die Proben wurden 15 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Eine 2,16 mM Lösung aus S-2288 (KabiVitrum) wurde mit 0,1 M Tris, 0,106 mM NaCl, 0,02% Natriumazid, pH-Wert 8,4, auf 1,45 mM verdünnt, und 100 ul dieser Lösung wurden jedem Napf der Mikrotiterplatte zugefügt (das Endvolumen in jedem Napf betrug 200 ul). Die Farbentwicklung wurde bei 405 nm überwacht. Die Neigung der Kurve des dekadischen Absorptionsvermögens gegenüber der Zeit wurde für jeden Standard und die Probe bestimmt. Eine Standardkurve enstand, indem die Neigung der Kurve des dekadischen Absorptionsvermögens gegenüber der Zeit als Funktion der rt-PA- Konzentration für die rt-PA-Standards aufgetragen wurde. Die relative Aktivitätskonzentration des Mutanten wurde dann anhand der Standardkurve bestimmt. Die Aktivitätskonzentration des Mutanten wurde durch die Konzentration des Mutanten dividiert, den man im rt-PA-ELISA erhielt, und die resultierende spezifische Aktivität wurde relativ zum Wildtyp-t-PA ausgedrückt, dem ein Wert von 1,0 zugewiesen wurde.

C. S-2251-Assay

Dieser Assay ist ein indirekter Assay für die t-PA-Aktivität. Bei diesem Assay wird Plasminogen durch das Wirken von t-PA zu Plasmin umgewandelt, und Plasmin spaltet das S-2251-Substrat, um Paranitroanilidchromophor freizusetzen. Die Erzeugung dieses Chromophors wird dann über die Zeit gemessen.

1. Fibrinstimulierter S-2251-Assay

Standardkurvenproben wurden so wie für den S-2288-Assay beschrieben gebildet. Für den Assay in zweikettiger Form wurde die Probe mit Plasmin-Sepharose inkubiert. Plasmin-Sepharose wurde durch Koppeln von etwa 20,8 CE menschliches Plasmin (KabiVitrum) mit 1 ml Cyanogenbromid-aktivierte Sepharose (Pharmacia) hergestellt. Die Plasinin-Sepharose (50 ul einer 5%igen Aufschlämmung) wurde bei Raumtemperatur mit 150 ul der Probe 90 Min. lang unter Rütteln inkubiert. Nach der Inkubation wurde das Kunstharz durch Zentrifugieren entfernt und 10 ul der Probe den Näpfen einer Mikrotiterplatte zugegeben.
Für den Assay in einkettiger Form wurden 50 ul Zellkulturmedien anstelle von Kunstharz hinzugefügt und der Inkubationsschritt nicht durchgeführt. Menschliches Thrombin (10 ul einer Lösung mit 42 Einheiten/ml) wurde dem Napf hinzugefügt. Die Reaktion im Napf begann durch die Zugabe einer Mischung (130 ul) aus 28 ul menschlichem Glu-Plasminogen (5,3 uM); 10 ul plasminogenfreiem menschlichen Fibrinogen (10 uM); 30 ul 3 mM S-2251 (KabiVitrum) und 62 ul PBS. Die Farbentwicklung wurde bei 405 nm überwacht und das dekadische Absorptionsvermögen bei der Referenzwellenlänge von 492 nm wurde von jedem Zeitpunkt abgezogen. Die Neigung der Kurve des dekadischen Absorptionsvermögens gegenüber dem Quadrat der Zeit wurde für die Standard- und Mutantenproben bestimmt. Eine Standardkurve entstand, indem die Neigung der Kurve des dekadischen Absorptionsvermögens gegenüber dem Quadrat der Zeit als Funktion der rt-PA- Konzentration für die rt-PA-Standards aufgetragen wurde. Die Bestimmung der relativen spezifischen Aktivität für den Mutanten erfolgte wie für den S-2288-Assay beschrieben.

2. Fibrinogenstimulierter S-2251-Assay

Dieser Assay erfolgte wie der fibrinstimulierte S-2251-Assay, mit der Ausnahme, daß PBS an die Stelle von Thrombin trat.

3. Plasmagerinnsel-S-2251-Assay

Die Bildung der Standardkurvenprobe und die Umwandlung von einkettigem rt-PA zu zweikettigem rt-PA unter Verwendung von Plasmin-Sepharose erfolgten wie für den fibrinstimulierten S-2251-Assay beschrieben. Menschliches Thrombin (10 ul einer 31 ug/ml Lösung) wurde jedem Napf der Mikrotiterplatte zugegeben. Die Standard- und Mutantenproben (40 ul) wurden der Platte zugegeben und die Reaktion durch die Zugabe von 100 ul einer Mischung aus 90 ul saurem Citratdextrose-Humanplasma und 10 ul 9,1 mM S-2251 (KabiVitrum) in Gang gesetzt. Die Farbentwicklung wurde bei 405 nm überwacht und das dekadische Absorptionsvermögen bei der Referenzwellenlänge von 492 nm von jedem Zeitpunkt subtrahiert. Die Analyse der Daten erfolgte wie für den fibrinstimulierten S-2251-Assay beschrieben.

4. Plasma-S-2251-Assay

Dieser Assay erfolgte wie für den Plasmagerinnsel-S-2251Assay beschrieben, mit der Ausnahme, daß PBS an die Stelle von Thrombin trat.

6. Ergebnisse

Der Löschungsmutant wurde hinsichtlich zymogener Eigenschaften und Fibrinspezifität unter Verwendung fibrinabhängiger und Plasmagerinnsel-abhängiger Assays analysiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt. Die Werte sind Durchschnittswerte für zwei Bestimmungen, mit Ausnahme des einkettigen S-2251 fibrinstimulierten und des Plasmagerinnsel-stimulierten Assays, die eine Einzelbestiminung sind. TABELLE I Assay Relative Aktivität zu Wildtyp-t-PA Direkter chromogener Assay (S-2288) (zweikettig) Direkter chromogener Assay (S-2288) (einkettig) Plasminogenaktivator-Assay (S-2251) unstimuliert (zweikettig) Plasininogenaktivator-Assay (S-2251) fibrinogenstimuliert (zweikettig) Plasminogenaktivator-Assay (S-2251) fibrinstimuliert (zweikettig) Plasininogenaktivator-Assay (S-2251) fibrinstimuliert (einkettig) Plasminogenaktivator-Assay (S-2251) in Plasma (zweikettig) Plasminogenaktivator-Assay (S-2251) in einem Plasmagerinnsel (zweikettig) Plasininogenaktivator-Assay (S-2251) in einem Plasmagerinnsel (einkettig) Plasminogenaktivator-Assay (S-2251) Fibrin/Fibrinogenstimulierung (zweikettig) Plasminogenaktivator-Assay (S-2251) Plasmagerinnsel/Plasma (zweikettig)
Die Ergebnisse zeigen, daß die d466-470 t-PA-Variante etwa zehnmal fibrinspezifischer und neunmal Plasmagerinnsel-spezifischer in der Plasminogenaktivierung als Wildtyp-t- PA ist. Das Molekül ist nicht zymogen.

SEQUENZAUFLISTUNG

(1) ALLGEMEINE INFORMATIONEN:

(i) ANMELDER: Genentech, Inc.
(ii) TITEL DER ERFINDUNG: Gewebeplasminogenaktivator mit fibrinspezifischen Eigenschaften
(iii) ZAHL DER SEQUENZEN: 2
(iv) KORRESPONDENZADRESSE:
(A) ADRESSAT: Genentech, Inc.
(B) STRASSE: 460 Point San Bruno Blvd
(C) STADT: South San Francisco
(D) BUNDESSTAAT: Kalifornien
(E) LAND: USA
(F) POSTLEITZAHL: 94080
(v) COMPUTERLESBARE FORM:
(A) TYP DES MEDIUMS: 5,25 Zoll, 369 KB Floppy Disk
(B) COMPUTER: IBM PC-kompatibel
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: patin (Genentech)
(vi) AKTUELLE ANMELDUNGSDATEN:
(A) ANMELDUNGSNUMMER:
(B) EINREICHUNGSDATUM: 14. Februar 1991
(C) KLASSIFlZIERUNG:
(vii) FRÜHERE ANMELDUNGSDATEN:
(A) ANMELDUNGSNUMMER: US Seriennr. 07/486.657
(B) EINREICHUNGSDATUM: 1. März 1990
(viii) ANWALT/VERTRETERINFORMATIONEN:
(A) NAME: Hasak, Janet, E.
(B) REGISTRIERUNGSNUMMER: 28.616
(C) BEZUGS/AKTENZAHL: 454P2
(ix) TELEKOMMUNIKATIONSINFORMATIONEN:
(A) TELEFON: 415/266-1896
(B) TELEFAX: 415/952-9881
(C) TELEX: 910/371-7168

(2) INFORMATIONEN ÜBER SEQUENZ ID. NR.1:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 30 Basen
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRANGIGKEIT: einfach
(D) TOPOLOGIE: linear
(iv) SEQUENZBESCHREIBUNG: 1 Primer für P466Q467A468N469L470
CTGGCAGGCG TCGTGCCCGC CGCTCCGAGT 30

(2) INFORMATIONEN ÜBER SEQUENZ ID. NR.2:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 527 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear (iv) SEQUENZBESCHREIBUNG: 2: Aminosäuresequenz für reifen t-PA

Claims

1. Variante eines menschlichen Gewebeplasminogenaktivators (t-PA), die fähig ist, Fibrin-Spezifität oder Plasmagerinnsel-Spezifität aufzuweisen, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Löschung der die Positionen 466 bis 470 überspannenden Aminosäuren des entsprechenden Wildtyp-t-PA's umfaßt.

2. Variante nach Anspruch 1, die zusätzlich eine Veränderung zumindest eines Restes innerhalb der Positionen 296-299, 416-418, 426-430, 339-342 oder 432-434 des entsprechenden Wildtyp-t-PA's umfaßt.

3. Variante nach Anspruch 2, worin die Veränderung eine Aminosäuresubstitution von zumindest zwei Resten ist.

4. Variante nach Anspruch 3, worin die Substitution durch Alaninreste erfolgt.

5. Variante nach Anspruch 4, die K296A, H297A,R298A,R299A,d466-470 t-PA, K416A,H417A,E418A,d466-470 t-PA, E426A,R427A,K429A,E430A,d466-470 t-PA, R339A,R342A,d466470 t-PA oder H432A,R434A,d466470 t-PA ist.

6. Variante nach Anspruch 5, die E426A,R427A,K429A,E430A,d466-470 t-PA ist.

7. Variante nach Anspruch 1, die frei von zumindest einem Abschnitt der Fingerdomäne des entsprechenden Wildtyp-t-PA's ist.

8. Variante nach Anspruch 1, die frei von funktioneller Kohlenhydratstruktur bei Aminosäure 184 oder 117 ist.

9. Variante nach Anspruch 1, die in bezug zum entsprechenden Wildtyp-t-PA in den Aminosäurebereichen (1) 205-215, (2) 244-255, (3) 233-242 oder (4) in zweien oder mehreren der Bereiche (1), (2) und (3) weiter verändert ist.

10. Variante nach Anspruch 1, die eine zusätzliche, im entsprechenden Wildtyp-t-PA nicht natürlich vorkommende, potentielle Glykosylierungsstelle enthält.

11. Variante nach Anspruch 10, die an Position 67 des entsprechenden Wildtyp-t- PA's ein Asparagin enthält.

12. Variante nach Anspruch 1, die frei von den Aminosäuren 92 bis einschließlich 179 des entsprechenden Wildtyp-t-PA's ist.

13. DNA-Sequenz, die für die Variante nach Anspruch 1 kodiert.

14. Replizierbarer Expressionsvektor, der fähig ist, in einer Transformantenwirtszelle die DNA-Sequenz nach Anspruch 13 zu exprimieren.

15. Replizierbarer Expressionsvektor, der fähig ist, in einer eukaryotischen Transformantenwirtszelle die DNA-Sequenz nach Anspruch 13 zu exprimieren.

16. Mit dem Vektor nach Anspruch 14 transformierte Wirtszellen.

17. Mit dem Vektor nach Anspruch 15 transformierte, eukaryotische Wirtszellen.

18. Zellen nach Anspruch 17, die Hefezellen sind.

19. Zellen nach Anspruch 17, die Säugetierzellen sind.

20. Wirtszellen nach Anspruch 16, die zur transienten Expression der für die Variante kodierenden DNA-Sequenz fähig sind.

21. Zusammensetzung zur Behandlung eines vaskulären Zustands oder einer Vaskularerkrankung, die eine Mischung einer therapeutisch wirksamen Menge der Variante nach einem der Ansprüche 1 bis 12 mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger umfaßt.

22. Verwendung einer Variante nach einem der Ansprüche 1 bis 12 bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines vaskulären Zustands oder einer Vaskularerkrankung.

23. Zusammensetzung zur Verhinderung von Fibrinablagerung oder Adhäsionsbildung oder -wiederbildung, die eine Mischung einer therapeutisch wirksamen Menge der Variante nach einem der Ansprüche 1 bis 12 mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger umfaßt.

24. Verwendung einer Variante nach einem der Ansprüche 1 bis 12 bei der Herstellung eines Medikaments zur Verhinderung von Fibrinablagerung oder Adhäsionsbildung oder -wiederbildung.

25. Variante nach einem der Ansprüche 1 bis 12 zur Verwendung bei einem Verfahren zur pharmazeutischen Behandlung eines vaskulären Zustands oder einer Vaskularerkrankung oder zur Verhinderung von Fibrinablagerung oder Adhäsionsbildung oder -wiederbildung.