DD231372A5 - Herstellung funktioneller menschlicher urokinaseproteine - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Mikroorganismus. Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung eines neuartigen Verfahrens mit dem auf einfache und wirtschaftliche Weise Mikroorganismen und Zellkulturen, insbesondere funktionelle menschliche Urokinase-Proteine hergestellt werden koennen. Erfindungsgemaess ist das Verfahren zum Herstellen eines Mikroorganismus oder einer Zellkultur insbesondere dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismus oder die Zellkultur genetisch in der Weise geaendert sind, dass sie die Herstellung eines Proteins steuern, das den enzymatischen Teil der menschlichen Urokinase enthaelt. Die Erfindung ist weiterhin dadurch charakterisiert, dass der Mikroorganismus oder die Zellkultur mit einem Vektor transformiert ist, der in dem transformierten Mikroorganismus oder der transformierten Zellkultur faehig ist, eine DNA-Sequenz zu exprimieren, die fuer ein Protein codiert, das den enzymatischen Teil der menschlichen Urokinase enthaelt.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Herstellen eines Mikroorganismus oder einer Zellkultur, wobei der Mikroorganismus oder die Zellkultur genetisch in der Weise geändert sind, daß sie die Herstellung eines Proteins steuern, das den enzymatischen Teil der menschlichen Urokinase enthält.

Die vorliegende Erfindung beruht teilweise auf der Entdeckung der DNA-Sequenz und der von dieser abgeleiteten Aminosäuresequenz nativer Urokinase und darauf, daß mit dem Urokinase-Molekül assoziierte Teile als die funktionelleh bioaktiven Teile erkannt wurden. Diese Entdeckung ermöglichte die Herstellung von Urokinase in verschiedenen Formen via rekombinanter DNA-Technologie und infolge davon die Herstellung von Materialien ausreichender Qualität und Quantität, mit denen die erforderlichen biologischen Versuche zur Identifizierung der biologisch-funktionellen, und daher nützlichen Teile des Moleküis durchgeführt werden konnten. Nachdem diese bestimmt waren, war es möglich, maßgeschneiderte funktionell Arten der Urokinase via genetischer Manipulation und in vitro-Verfahren herzustellen, wodurch es gelang, bisher nicht erreichbare, kommerziell verwertbare Mengen aktiver Produkte effizient herzustellen. Die vorliegende Erfindung beschreibt die Herstellung von Urokinase in verschiedenen Formen durch genetisch geänderte Mikroorganismen oder Zellkulturen.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Veröffentlichungen und andere Hinweise in dieser Anmeldung, die dazu dienen, den Hintergrund der Erfindung zu erläutern und in besonderen Fällen, um zusätzliche Einzelheiten bezüglich der praktischen Durchführung anzugeben, werden hiermit durch Bezugnahme einbezogen. Der besseren Übersichtlichkeit halber wurden die Veröffentlichungen im folgenden Text mit Zahlen angegeben und entsprechend im bibliographischen Anhang aufgelistet. A. Menschliche Urokinase

Das fibrinolytische System ist in dynamischem Gleichgewicht mit dem Koagulations-System, wodurch die Gefäßöffnung intakt und freigehalten wird. Das koagulierende System lagert Fibrin als Matrix ab, die dazu dient, eine blutstillende Bedingung wiederherzustellen. Das fibrinolytische System entfernt das Fibrin-Netzwerk, nachdem die blutstillende Bedingung erreicht ist. Der fibrinolytische Prozeß wird durch das proteolytische Enzym Plasmin bewerkstelligt, das aus einem Plasma-Protein-Vorläufer, Plasminogen, entsteht.

Plasminogen wird in Plasmin durch Aktivierung mittels eines Aktivators umgewandelt.

Ein derartiger Aktivator ist Urokinase. Diese und ein weiterer Aktivator, Streptokinase, sind seit kurzem kommerziell erhältlich. Beide sind indiziert für die Behandlung akuter Gefäßkrankheiten, beispielsweise Herzinfarkt, Schlaganfall, Thrombosen tiefliegender Venen, Verschluß peripherer Arterien und anderer Aderthrombose. Diesen Krankheiten ist gemeinsam, daß sie gravierende Gefahren und Risiken für die Gesundheit darstellen.

Die diesen Krankheiten zugrundeliegende äthiologische Basis deutet entweder auf einen teilweisen, oder, in ernsten Fällen, totalen Verschluß einer Blutader durch einen Blutklumpen hin -einen Thrombus oder Thromboembolus. Die traditionelle antikoagulierende Therapie, beispielsweise mit Heparin und Cumarin, trägt nicht dazu bei, um unmittelbar das Auflösen der Thromben oderThromboembolien zu intensivieren.

Streptokinase und Urokinase sind von praktischem und wirksamem Nutzen als thrombolytische Mittel. Beide Substanzen leiden jedoch bis jetzt unter ernsthaften Einschränkungen. Keine von beiden hat eine hohe Affinität für Fibrin gezeigt und folglich aktivieren beide zirkulierendes und fibringebundenes Plasminogen verhältnismäßig wahllos. Das Plasmin, das in zirkulierendem Blut gebildet wird, wird verhältnismäßig schnell neutralisiert und geht somit für eine geeignete Thrombolyse verloren. Restliches Plasmin baut verschiedene Gerinnungsfaktor-Proteine ab, beispielsweise Fibrinogen, Faktor V und Faktor VIII, wodurch ein hämorrhadisches Potential entsteht. Streptokinase ist zusätzlich ein starkes Antigen und bei Patienten mit einem hohen Antikörpertiter ist die Antwort auf die Behandlung unergiebig und diese Patienten können nicht auf diese Weise fortdauernd behandelt werden. Die Urokinase-Therapie ist teuer, da Urokinase aus menschlichem Urin oder Zellgewebe isoliert wird und wird daher in der klinischen Praxis nicht allgemein akzeptiert. Urokinase war Gegenstand zahlreicher Untersuchungen -siehe beispielsweise die Literaturstellen 1-9 im Anhang. Die derzeit erhältliche Urokinase wird, wie erwähnt, aus menschlichem Urin oder menschlicher Zellkultur, beispielsweise Nierenzellen isoliert (9 A, 9B). Das Urokinasenmolekül existiert in verschiedenen biologisch aktiven Formen -von hohem Molekulargewicht (ca. 54000 Daltons) und niedrigem Molekulargewicht (ca. 33000 Daltons), wobei jede aus einer einzelnen Kette oder Zwei-Kettenmaterial zusammengesetzt ist. Die Form mit niedrigem Molekulargewicht ist aus der hochmolekularen Form durch enzymatisches Spalten abgeleitet. Biologisch aktives Material enthält den sogenannten Serin-Protease-Teil, der, in aktiver Form, mit einer zweiten Kette via einer Disulfidbindung verbunden ist. Jegliche Aktivität, die dem hochmolekularen Material zugeschrieben wird, wird vermutlich

durch die ähnliche Gestalt dieser beiden miteinander verbundenen Ketten und die strategische Disulfidbindung verursacht und Störungen in der Sequenz wurden zweifelsfrei im Serin-Protease-Teil des Gesamtmoleküls lokalisiert (siehe Fig. A).

Jedenfalls war bis zur vorliegenden Erfindung die Identität und damit die Funktion des etwa 21000 Dalton-Rests unbekannt und die Zuordnung der Aktivität zu dem einen oder anderen bekannten Bestandteil der Urokinase wurde kontrovers diskutiert.

Kürzlich wurde über eine andere Form des Urokinase-Peptids berichtet, die eine geringe, aber spezifische Aktivität aufweist (10,10A). Man vermutet, daß dieses Material zu nativer Urokinase korrespondiert und eine Vorform der früher isolierten, aktiven, obenbeschriebenen Art ist, die höchstwahrscheinlich aus einer einzelnen Kette besteht.

Frühere Versuche, das für Urokinase erforderliche Gen zu clonen und die damit verbundenen Hoffnungen, Expression in einen mikrowellen Wirt zu erhalten, scheinen nicht erfolgreich gewesen zu sein (11,11A, 6).

Es war verständlich, daß die Anwendung rekombinanter DNA- und damit zusammenhängender Technologien schließlich einen äußerst wirksamen Weg darstellen würden, um die erforderliche große Menge hochqualitativer, bioaktiver menschlicher Urokinase zur Verfügung zu stellen, die im wesentlichen frei von anderen menschlichen Proteinen ist, des weiteren Derivate davon, die die funktionell Bioaktivität behalten haben, so daß auf diese Weise der Nutzen dieses Materials in der klinischen Behandlung verschiedener Gefäßanomalien oder -krankheiten einsetzbar würde.

B. Rekombinante DNA/Protein-Biochemie und -technologie

Die Technologie der rekombinierten DNA ist in ein Stadium getreten, das bereits einige Erfahrung aufweist. Molekularbiologen sind in der Lage, mit einiger Leichtigkeit verschiedene DNA-Sequenzen zu rekombinieren und damit neue DNA-Gebilde zu schaffen, die in der Lage sind, reichliche Mengen eines exogenen Proteinprodukts in transformierten Mikroben und Zellkulturen zu produzieren. Man hat die allgemeinen Mittel, und Methoden für die in vitro-Verbindung verschiedener stumpfendiger oder „sticky"-endiger Fragmente von DNA in der Hand, wodurch fähige Expressionsvektoren hergestellt werden, die geeignet sind, um besondere Organismen zu transformieren und dadurch deren wirksame Synthese des gewünschten exogenen Produkts zu steuern. Für ein einzelnes Produkt bleibt jedoch der Weg immer noch dornig und die Wissenschaft ist noch nicht so weit entwickelt, daß zuverlässige Voraussagen für den Erfolg gemacht werden könnten.

Tatsächlich sind Voraussagen über erfolgreiche Ergebnisse ohne die zugrundeliegende experimentelle Basis mit dem beachtlichen Risiko der Unausführbarkeit behaftet.

DNA-Rekombination der wesentlichen Elemente, d. h. des Origin der Replikation, einer oder mehrerer phänotypischer Selektionscharakteristiken, eines Expressionspromoters, heterologer, inserierter Gene und des übrigen Vektors wird üblicherweise außerhalb der Wirtszelle durchgeführt.

Der resultierende, rekombinante, sich replizierende Expressionsvektor, oder das Plasmid, wird in die Zellen durch Transformation eingeführt und man erhält große Mengen des Rekombinationsvektors durch Züchten der Transformanten. Wo das Gen im Hinblick auf Bestandteile, die die Transkription Und Translation der codierten DNA-Botschaft geeignet inseriert ist, ist der resultierende Expressionsvektor brauchbar, um tatsächlich die Polypeptidsequenz zu produzieren, für die das inserierte Gen codiert, ein Prozeß, der Expression genannt wird. Das Endprodukt kann, falls nötig, durch Lysieren der Wirtszelle im Fall mikrobieller Systeme und anschließendes Herausfinden des Produkts durch geeignete Reinigung von anderen Proteinen erhalten werden.

In der Praxis kann durch die Anwendung rekombinanter DNA-Technologie ein heterologes Polypeptid alleine exprimiert werden -sogenannte direkte Expression- oder, alternativ dazu, kann ein heterologes Polypeptid mit einem Teil einer Aminosäuresequenz eines homologen Polypeptids fusioniert exprimiert werden. In letzterem Fall ist das angestrebte bioaktive Produkt manchmal innerhalb des fusionierten homolog-heterologen Polypeptids bioinaktiv, bis es in extrazellulärer Umgebung gespalten wird. Siehe Veröffentlichungen (12) und (13).

In ähnlicher Weise ist die Fähigkeit der Zeil- oder Gewebekultivierung für das Studium genetischer und zellulärer Physiologie gut entwickelt. Man beherrscht die Mittel und Methoden für das Erhalten permanenter Zellinien, die durch aufeinanderfolgende Reihenübertragungen aus isolierten normalen Zellen hergestellt werden. Für die Anwendung in der Forschung werden Zellinien auf einen festen Träger im flüssigen Medium oder durch Wachstum in einer Suspension, die Nährmittel enthält, erhalten.

Beim Hochziehen großer Präparationen scheint es lediglich mechanische Probleme zu geben. Für weitere Informationen wird auf die Veröffentlichungen (14) und (15) verwiesen.

Auf ähnliche Weise ist die Protein-Biochemie ein nützlicher, ja tatsächlich notwendiger Bestandteil der Biotechnologie. Zellen, die das gewünschte Protein produzieren, stellen auch hunderte anderer Proteine, endogene Produkte des Zellmetabolismus her. Diese kontaminierenden Proteine, ebenso andere Verbindungen, würden sich als giftig bei der Anwendung an einem Tier oder Menschen im Lauf einer therapeutischen Behandlung mit dem gewünschten Protein herausstellen, wenn sie nicht vom gewünschten Protein entfernt werden. Die Technik der Protein-Biochemie ist daher darauf ausgerichtet, Trennverfahren zu entwickeln, die für das besondere System unter den gegebenen Umständen geeignet sind und ein homogenes Produkt liefern, das für den angestrebten Zweck sicher ist. Die Protein-Biochemie stellt außerdem die Identität des gewünschten Produkts durch Charakterisierung sicher, ebenso, ob die Zelle das Produkt genau, d. h. ohne Änderungen oder Mutationen hergestellt hat. Dieser Wissenschaftszweig ist ebenso beteiligt an der Entwicklung von Bioassays, Stabilitätsstudien und anderen Verfahren, die notwendigerweise durchgeführt werden müssen, ehe erfolgreiche klinische Studien und Marktforschungen einsetzen.

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung eines neuartigen Verfahrens, mit dem auf einfache und wirtschaftliche Weise Mikroorganismen oder Zellkulturen, insbesondere funktionelle menschliche Urokinase-Proteine hergestellt werden können.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, bekannte rekombinante DNA-Protein-Biochemie-Technologien dafür einzusetzen, um erfolgreich menschliche Urokinase in Form von biologisch funktioneilen, maßgeschneiderten Arten herzustellen. Erfindungsgemäß erfolgt das in der Weise, daß der Mikroorganismus oder die Zellkultur genetisch in der Weise geändert sind, daß sie die Herstellung eines Proteins steuern, das den enzymatischen Teil der menschlichen Urokinase enthält. Das erfindungsgemäße Verfahren ist weiterhin dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus oder die Zellkultur mit einem Vektor transformiert ist, der in dem transformierten Mikroorganismus oder der transformierten Zellkultur fähig ist, eine

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DNA-Sequenz zu exprimieren, die für ein Protein codiert, das den enzymatischen Teil der menschlichen Urokinase enthält. Erfindungsgemäß wird der Mikroorganismus ebenfalls durch Transformation eines E. coli-Stammes hergestellt. Der Mikroorganismus wird erfindungsgemäß ebenfalls durch Transformation mit einem Plasmid hergestellt, das ausgewählt wird aus einer Gruppe, die die Plasmide pUK33trpLE_L, pUK33trpLE_s, pUK33trp103, pUK54trp207-1 und p-preUK54trp207-1 enthält.

Es ist besonders vorteilhaft, daß erfindungsgemäß die DNA-Sequenz wirksam mit einer DNA-Sequenz verbunden ist, die fähig ist, die Expression der erstgenannten DNA-Sequenz zu bewirken.

Die Erfindung stellt aktives Urokinase-Protein zur Verfügung das in all seinen Formen bei der prophylaktischen oder therapeutischen Behandlung menschlicher Wesen bei verschiedenen Gefäßanomalien oder -krankheiten zur Anwendung geeignet ist. Jede dieser Formen weist den bioaktiven Teil auf, d. h. den enzymatischen Teil des nativen Materials, von dem vermutet wird, daß er in einer Zwei-Ketten-Region sitzt, die den Serin-Protease-Teil enthält. Gemäß dieser Erfindung kann eine Reihe von urokinaseaktiven Produkten hergestellt werden, entweder unmittelbar als bioaktive Form oder in einer Form, die erst nach einem in vitro-Verfahren das bioaktive Produkt liefert. Diese Erfindung stellt überdies Mittel und Methoden zur Verfügung, mit denen native Urokinasemoleküle voller Länge hergestellt werden, insbesondere in bioaktiver oder bioaktivierbarer Form, die den zusätzlichen gravierenden Vorteil der spezifischen Affinität zu Fibrin zu haben, wie sie bis heute noch bei keinem Urokinaseprodukt gezeigt werden konnte, das aus natürlichen Quellen isoliert wurde. Ein auf diese Weise ausgebildetes menschliches Urokinaseprodukt hat die schwerwiegende neue Fähigkeit der spezifischen Aktivität gegen spürbai bestehende Blutgerinnsel. Die Produkte werden durch Zellkulturen produziert, die die rekombinante DNA enthalten, die für das entsprechende Gebilde codiert. Es ist nunmehr möglich, menschliche Urokinase auf sehr viel wirksamere Weise herzustellen, als es bisher möglich war und in Formen, die in verstärktem Maße biologisch signifikante Fähigkeiten aufweisen. Zusätzlich kann der erfindungsgemäß hergestellte Urokinaseaktivator gleichzeitig eine Glykosilierung, in, im Vergleich mit nativem Material, mehr oder weniger großem Ausmaß, versehen sein, in Abhängigkeit von der Wirtszelle.

Die vorliegende Erfindung liefert die auf diese Weise hergestellten menschlichen Urokinaseprodukte und Mittel und Methoden ihrer Herstellung. Die vorliegende Erfindung zielt weiter ab auf einen sich replizierenden DNA-Expressionsvektor, der eine Gensequenz trägt, die für den enzymatischen Teil der menschlichen Urokinase in exprimierbarer Form codiert. Die vorliegend« Erfindung stellt weiterhin ab auf Mikroorganismus-Stämme oder Zellkulturen, die mit dem eben beschriebenen Expressionsvektor transformiert wurden, sowie auf mikrobielle oder Zellkulturen solcher transformierten Stämme oder Kulturen, die in der Lage sind, die Herstellung des menschlichen Urokinaseprodukts zu steuern. Weitere Aspekte der vorliegenden Erfindung liegen in dem Zurverfügungstellen von DNA-Expressionsvektoren, von Mikroorganismusstämmen und Zellkulturen sowie spezifischer Ausführungsformen dieser Aspekte. Die Erfindung ist weiterhin auf die Herstellung von Fermentationskulturen der genannten Mikroorganismen und Zellkulturen ausgerichtet.

In der vorliegenden Beschreibung wird mit dem Ausdruck „menschliche Urokinase" ein Polypeptid in bioaktiver Form beschrieben, das durch mikrobielle oder Zellkulturen, oder falls gewünscht, in einem in vitro-Verfahren hergestellt wurde, und den enzymatischen Teil enthält, der zum nativen Material korrespondiert. Menschliche Urokinase gemäß der vorliegenden Erfindung wird daher 1. in voller Länge und somit unterschiedlich zu bisher aus natürlichen Quellen isoliertem Material zur Verfügung gestellt oder 2. in anderen, bioaktiven Formen hergestellt, die die Erkennungsstellen des enzymatischen Teils tragen, von dem bekannt wurde, daß er essentiell für die Plasminogen-Aktivierung ist oder es wird 3. eine menschliche Urokinase zur Verfügung gestellt, die als erste Aminosäure Methionin enthält oder ein Signalpolypeptid oder konjugiertes Polypeptid, das, anders als das Signalpolypeptid, am N-Terminus des enzymatischen Teils fusioniert ist, wobei das Methionin, das Signal- oder konjugierte Polypeptid in einer intra- oder extra-zellulärer Umgebung spezifisch spaltbar ist. (Siehe Veröffentlichung 12). In jedem Fall werden die auf diese Weise hergestellten menschlichen Urokinase Polypeptide in einer Menge wiedergewonnen und gereinigt, die sie für die Anwendung bei der Behandlung verschiedener Herzgefäß-Anomalien oder-krankheiten einsetzbar machen.

Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen

A. Mikroorganismen/Zellkulturen 1. Bakterienstämme/Promoter

Die im folgenden zu beschreibenden Arbeiten wurden unter Verwendung der Mikroorganismen inter alia durchgeführt: E. coli K-12 Stamm GM 48 (thr~, leu~, B₁ ^-, lacY~, gal K12, gal T22, ara 14, ton A31, tsx 78, Sup E44, dam 3, dem 6), hinterlegt bei der American Type Culture Collection am 9. April 1982 unter der Nr. ATCC 39099 und E.coli K-12 Stamm 294 (end A, thi , hsr~, _khsm⁺), beschrieben in der Veröffentlichung (16), hinterlegt bei der American Type Culture Collection, unter der Nummer ATCCC 31446 am 28.Oktober 1978. Es sind jedoch andere mikrobielle Stämme ebenso nützlich, einschließlich bekannter E.coli Stämme, beispielsweise E. coli B, E. coli X 1776 (ATCC 31537, hinterlegt am 3. Juli 1979) und E.coli W 3110 (F~, λ~, protroph) (Hinterlegungsnummer ATCC 27325, hinterlegt am 10. Februar 1972) oder andere mikrobielle Stämme, von denen viele hinterlegt und potentiell von anerkannten Hinterlegungsstellen für Mikroorganismen erhältlich sind, beispielsweise von der

American Type Culture Collection (ATCC) beispielsweise über den ATCC-Katalog, siehe (17). Diese anderen'

Mikroorganismen schließen beispielsweise Bacilli ein, so Bacillus subtilis und andere Enterobakteriaceen, unter denen als Beispiel Salmonella typhimurium, Serratia marcesans und Pseudomonas genannt seien. Diese Mikroorganismen müssen geeignete Plasmide tragen, die heterologe Gensequenzen in der Zelle replizieren und expremieren können. Beispielsweise haben sich Beta-Lactamase und Lactose-Promoter-Systeme als besonders vorteilhaft herausgestellt, um mikrobielle Produktion heterologer Polypeptide zu initiieren und aufrechtzuerhalten. Einzelheiten in Bezug auf die Herstellung und Konstruktion dieser Promotersysteme können aus den Veröffentlichungen (18) und (19) ersehen werden. Kürzlich wurde ein System entwickelt, das auf dem Tryptophan-Syntheseweg basiert, das sogenannte trp-Promoter-System. Einzelheiten bezüglich der Herstellung und Konstruktion dieses Systems können aus den Veröffentlichungen (20) und (21) ersehen werden Es wurden des weiteren zahlreiche andere mikrobielle Promoter entdeckt und nutzbar gemacht. Einzelheiten bezüglich der Nukleotidsequenzen dieser Promoter, die einen Fachmann in die Lage setzen, diese Promotoren funktionell mit Plasmid-Vektoren zu verbinden, wurden ebenfalls publiziert (siehe 22).

2. Hefe-Stämme/Hefe-Promotoren

Das vorliegende Expressionssystem kann sich auch eines Plasmids bedienen, das in der Lage ist, entweder in E. coli und/oder der Hefe Saccharomyces cerevisiae zu selektionieren und replizieren. Für die Selektion in Hefe kann das Plasmid die TRP1-Gene enthalten (23,24,25), die Hefe komplementieren (d. h. Wachstum in Abwesenheit von Tryptophan erlaubt), die Mutationen in diesem Gen enthalten, von denen gefunden wurde, daß sie auf dem Chromosom IV der Hefe liegen (26). Ein brauchbarer Stamm ist der Stamm RH 218(27), der bei der American Type Culture Collection ohne Einschränkung am 8. Dezember 1980 unter der Nummer ATCC 44074 hinterlegt wurde. Es hier jedoch darauf hinzuweisen, daß jeder beliebige Saccharomyces cerevisiae-Stamm, der eine Mutation enthält, die die Zelle trpi macht, eine wirksame Umgebung für die Expression eines Plasmids sein sollte, das das Expressionssystem enthält. Dies ist beispielsweise für den Stamm pep4-1 (28) der Fall. Dieser trypthophanauxotrophe Stamm hat ebenfalls eine Punktmutation im TRP1-Gen.

Die 5'-flankierende DNA-Sequenz (Promoter) eines Hefegens (für Alkoholdehydrogenase 1) kann die Expression eines fremden Gens in Hefe in Gang setzen, wenn es an der 5'-site eines Nicht-Hefe-Gens und in einem Plasmid angeordnet wird, das zur Transformation von Hefe verwendet wird. Außer einem Promoter erfordert ein korrekte Expression eines Nicht-Hefe-Gens in Hefe eine zweite Hefe-Sequenz, die an dem 3'-Ende des Nicht-Hefe-Gens auf dem Plasmid angeordnet ist, um ein korrektes Beenden der Transkription und Polyadenylierung in Hefe zu erlauben. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die 5'-flankierende Sequenz des Hefegens 3-Phosphoglyceratkinase (29) stromaufwärts vom Strukturgen angeordnet, wieder gefolgt von DNA-enthaltendenTerminierungs-Polyadenylierungs-Signale, z. B. dieTRP1-(23—25) Gene oder die PGK-(29) Gene. Da 5'-flankierende Sequenzen in Hefe (in Verbindung mit 3'-Hefe-Terminations-DNA) (infra) in der Lage sind, die Expression fremder Gene in Hefe zu promotieren, erscheint es wahrscheinlich, daß die 5'-flankierende Sequenz jedes beliebigen Hefegens für die Expression wichtiger Genprodukte verwendet werden könnte, beispielsweise für glykolytische Gene wie Enolase, Glyceraldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase, Hexokinase, Pyruvat-Decarboxylase, Phosphofructokinase, Glucose-6-Phosphat-Isomerase, 3-Phosphoglycerat-Mutase, Pyruvat-Kinase, Triosephosphat-Isomerase, Phosphoglucose-Isomerase und Glucokinase. Jede der 3'-flankierenden Sequenzen dieser Gene könnten ebenso für eine korrekte Terminierung und mRNA-Polyadenylierung in derartigen Expressionssystemen verwendet werden.

Schließlich enthalten viele Hefepromotoren auch Kontrollelemente für die Transkription, so daß sie durch ein Variieren der Wachstumsbedingungen an- und ausgeschaltet werden können. Einige Beispiele für derartige Hefepromotoren sind die Gene, die die folgenden Proteine herstellen: Alkoholdehydrogenase II, Säurephosphatase, abbauende Enzyme, die in Zusammenhang stehen mit dem Stickstoff-Metabolismus, Glyceraldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase und Enzyme, die für die Nutzbarmachung von Maltose und Galactose verantwortlich sind (30). Eine derartige Kontrollregion wäre sehr nützlich für die Kontrolle der Expression eines Proteinprodukts — insbesondere, wenn dessen Produktion toxisch für Hefe ist. Es sollte ebenso möglich sein, die Kontrollregion einer 5'-flankierenden Sequenz mit einer 5'-flankierenden Sequenz zu kombinieren, die einen Promoter eines stark exprimierten Gens enthält. Man würde damit einen Hybrid-Promoter erhalten, was möglich sein sollte, da die Kontrollregion und der Promoter anscheinend aus physikalisch unterschiedlichen DNA-Sequenzen besteht.

3. Zellkultur-Systeme/Zellkultur-Vektoren

Das Vermehren von Wirbeltierzellen in Kultur (Gewebekultur) ist in den vergangenen Jahren zu einem Routineverfahren geworden (siehe 31). Ein brauchbarer Wirt für die Herstellung von heterologen Proteinen ist die COS-7 Linie von Nierenfibroblasten von Affen (32). Die vorliegende Erfindung kann jedoch in jeder beliebigen Zellinie durchgeführt werden, die fähig ist zur Replikation und Expression eines kompatiblen Vektors, beispielsweise die Zellinien WI38, BHK, 3T3, CHO, VERO und HeLa. Was zusätzlich von einem Expressionsvektor gefordert werden muß, ist ein Origin der Replikation und ein Promoter, die vor dem zu exprimierenden Gen angeordnet sind, weiterhin mit irgendwelchen notwendigen Ribosom-Bindestellen, Ansatzstellen für die RNA, Stellen für die Polyadenylierung und Sequenzen, die die Transkription terminieren. Es wird darauf hingeweisen, daß diese Erfindung, obwohl sie hier ein bevorzugtes Ausführungsbeispiel beschreibt, nicht auf diese Sequenzen beschränkt werden soll. Beispielsweise kann derReplikationsorigin anderer Virus-Vektoren (beispielsweise Polyoma, Adeno, VSV, BVP, usw.) verwendet werden, ebenso zelluläre Origins der DNA-Replikation, die auch in nichtintegriertem Zustand funktionieren.

In diesen, aus Wirbeltierzellen bestehenden Wirten, mag der genetische Expressionsvektor für ein Urokinaseprodukt-Polypeptid, wie es hier beschrieben ist, ebenso eine zweite genetisch codierte Sequenz unter der Kontrolle desselben Promoters enthalten. Die zweite Sequenz stellt einen üblichen Screeningmarker zur Verfügung, und zwar sowohl für Transformanten allgemein als auch für Transformanten, die eine große Expressionsmenge für die erste Sequenz zeigen. Des weiteren dient die zweite Sequenz als Kontrollmittel, wobei die Expression des gewünschten Urokinase-Polypeptids reguliert und meistens auch noch erhöht werden kann.

Dies ist insbesondere wichtig, wenn die beiden Proteine in reifer Form getrennt hergestellt werden. Während beide DNA-codierenden Sequenzen durch denselben Transkriptionspromoter kontrolliert werden, so daß eine fusionierte messenger-RNA (mRNA) gebildet wird, werden sie doch durch ein Translations-Stopsignal für die erste und ein Startsignal für die zweite Sequenz getrennt, so daß zwei unabhängige Proteine hergestellt werden.

Man hat festgestellt, daß Umgebungsbedingungen oft bei der Kontrolle der Menge bestimmter Enzyme, die von Zellen unter bestimmten Wachstumsbedingungen produziert werden, wirksam sind. In einer bevorzugten Ausführungsform macht man sich die Tatsache zu nutze, daß bestimmte Zellen für Methotrexat (MTX) sensitiv sind, das ein Inhibitor für Dihydrofolatreductase (DHFR) ist. DHFR ist ein Enzym, das indirekt bei Synthesereaktionen erforderlich ist, bei denen eine Kohlenstoffeinheit transferiert wird. Das Fehlen von DHFR-Aktivität äußert sich in der Unfähigkeit von Zellen zu wachsen, es sei denn in Gegenwart solcher Verbindungen, die ansonsten die Übertragung einer Kohlenstoffeinheit für ihre Synthese benötigen. Zellen, denen DHFR fehlt, wachsen jedoch in Gegenwart einer Mischung aus Glycin, Thymidin und Hypoxanthin.

Zellen, die normalerweise DHFR herstellen, sind dafür bekannt, daß sie durch Methotrexat inhibiert werden können. Meistens endet die Zugabe geeigneter Mengen von Methotrexat zu normalen Zellen mit dem Tod der Zelle. Bestimmte Zellen scheinen jedoch die Methotrexatbehandlung zu überleben, indem sie erhöhte Mengen von DHFR herstellen und somit die Fähigkeit des Methotrexats, das Enzym zu inhibieren, übertreffen. Es ist früher gezeigt worden, daß in solchen Fällen eine erhöhte Menge

von messenger-RNA vorliegt, die für die DHFR-Sequenz codiert. Man erklärt das durch die Annahme einer erhöhten Menge von DNA im genetischen Material, das für diese messenger-RNA codiert. Offensichtlich bewirkt die Zugabe von Methotrexat eine Gen-Vervielfältigung des DHFR-Gens. Genetische Sequenzen, die physisch mit der DHFR-Sequenz verbunden sind, obwohl sie nicht durch denselben Promoter reguliert werden, werden ebenso vervielfältigt. Es ist folglich möglich, die Vervielfältigung des DHFR-Gens dazu zu verwenden, durch Methotrexat-Behandlung begleitende Gene, die für ein anderes Protein codieren, zu vervielfältigen, im vorliegenden Fall das Gen für das gewünschte Urokinase-Polypeptid.

Des weiteren dient DHFR als geeigneter Marker für die Selektion von erfolgreich transfezierten Zellen, wenn die Wirtszellen, in die die zweite Sequenz für DHFR eingeführt wird, ihrerseits DHFR-defiziert ist. Wenn die DHFR-Sequenz wirksam an die Sequenz für das gewünschte Peptid angefügt ist, dient diese Fähigkeit als Marker für eine erfolgreiche Transfektion mit der gewünschten Sequenz.

B.Vektorsysteme

1. Expression im bakteriellen System

Expressionsplasmide für die Verwendung in Bakterien, beispielsweise E. coli, werden allgemein erhalten, indem pBR322 als Vektor verwendet wird, in den auf geeignete Weise die heterologe Gensequenz zusammen mit einem Translations-Start- und Stop^Signal in funktionierender Lesephase mit einem funktionierenden Promoter eingefügt wird, wobei Gebrauch gemacht wird von üblichen oder synthetisch hergestellten Restriktionserkennungsstellen. Der Vektor trägt eine oder mehrere phänotypisch charakteristische Selektionsgene und einen Replikationsorigin, um das Vervielfachen innerhalb des Wirts sicherzustellen. Die heterologe Insertion kann wieder so angeordnet werden, daß sie zusammen mit einer fusionierten Vorsequenz expremiert wird, die z. B. von trp-System-Genen ableitbar ist.

2. Expression in Hefe

Um ein heterologes Gen, wie das der cDNAfür menschliche Urokinase in Hefe zu expremieren, ist es nötig, einen Plasmid-Vektor zu konstruieren, der vier Bestandteile enthält. Ein Bestandteil ist der Teil, der die Transformation sowohl in E. coli und Hefe ermöglicht und der deshalb ein selektionierbares Gen von jedem Organismus enthalten muß. Das kann das Gen für Ampicilün-Resistenz aus E. coli und das Gen TRP1 für Hefe sein. Dieser Bestandteil benötigt ebenso einen Replikationsorigin von beiden Organismen, damit er als Plasmid-DNA in beiden Organismen erhalten bleibt. Das kann der E. coli-Origin aus pBR322 und der ars1-Origin aus dem Chromosome III von Hefe sein.

Ein zweiter Bestandteil des Plasmids ist eine 5'-flankierende Sequenz eines Hefegens, um die Transkription eines stromabwärts angeordneten Strukturgens zu promotieren. Die 5'-flankierende Sequenz kann die des 3-Phospho-Glycerat (PGK)-Gens der Hefe sein. Das Fragment wird auf die Weise konstruiert, daß das ATG der PGK-Struktursequenz entfernt wird und durch eine Sequenz ersetzt wird, die alternative Restriktionserkennungsstellen, beispielsweise Xbal- und EcoRI-Restriktionserkennungsstellen enthält, um eine geeignete Verbindung dieser 5'-flankierenden Sequenz an das Strukturgen zu ermöglichen.

Eine dritte Komponente des Systems ist ein Strukturgen, das auf die Weise konstruiert wird, daß es sowohl ein ATG-Translations-Start- und ein Translations-Stop-Signal enthält.

Eine vierte Komponente ist eine Hefe-DNA-Sequenz, die die 3'-flankierende Sequenz eines Hefegens enthält, die die nötigen Signale für die Transkriptions-Terminierung und Polyadenylierung enthält.

3. Expression in Zellkulturen von Säugetieren

Die Durchführung der Synthese eines heterologen Peptids in einer Zellkultur eines Säugetiers basiert auf der Entwicklung eines Vektors, fähig sowohl autonom Replikation und Expression eines fremden Gens unter der Kontrolle einer heterologen Transkriptionseinheit durchzuführen. Die Replikation dieses Vektors in Zelikulturen wird vollständig durchgeführt durch Zurverfügungstellen eines DNA-Replikationsorigins (beispielweise aus den SV40-Virus) einer Helferfunktion (T-Antigen) und durch das Einführen des Vektors in eine Zeilinie, wobei dieses Antigen endogen expremiert wird (33,34). Der späte Promoter des SV40-Virus geht den Strukturgenen voran und sichert so die Transkription des Gens.

Ein brauchbarer Vektor, um Expression zu erhalten, besteht aus pBR322-Sequenzen, die einen selektionierbaren Marker für die Selektion in E.coli (Ampicillin-Resistenz) und einen E. coli-Origin der DNA-Replikation zur Verfügung stellt. Diese Sequenzen können von dem Plasmid pML-1 abgeleitet werden. Der SV40-Origin ist ableitbar von einem 342-Basenpaar-Pvull-Hindlll-Fragment, das diese Region umfaßt (35,36) (beide Enden sind in EcoRI-Enden umwandelbar). Die Orientierung der SV40-Origin-Region ist so, daß der Promoter für die spaten Transkriptionseinheiten proximal im Hinblick auf die Interferon kodierenden Gene angeordnet ist.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. A ist ein schematisches Diagramm des Urokinase-Polypeptids. Die Urokinase mit niedrigem Molekulargewicht beginnt bei der Aminosäure 136 und endet bei der Aminosäure 412. Die Urokinase mit hohem Molekulargewicht beginnt mit der Aminosäure 1 und endet mit der Aminosäure 412. Die Umwandlung der Einkettenform sowohl der Urokinase mit hohem als auch der mit niedrigem Molekulargewicht in die bioaktive Zwei kettenform erfolgt durch proteolytisches Spalten zwischen den Aminosäuren 158 und 159. Pre-Urokinase beginnt bei Aminosäure 20. Die zeichnerisch dargestellte Position der Disulfidverbindungen basiert auf Analogie mit anderen Serin-Proteasen.

Die Fig. 1A bis 1C geben zeichnerisch die Nucleotid-Sequenz und Restriktions-Endonucleasenkarte des Plasmids pD2 mit der cDNA-lnsertion für das bioaktive Urokinaseprotein mit niedrigem Molekulargewicht von 33000 Daltons wieder. Der Nucleotidteil der synthetischen Desoxyoligonucleotid-CBeB-Einfügung ist unterstrichen.

Fig. 2 A, B beschreiben die von dercDNA-Sequenzder Fig.1 abgeleitete Aminosäuresequenz, wobei die Aminosäuren des cDNA-inserierten Teils von 1 bis 279 numeriert sind.

Fig.3A bis 3C stellen zeichnerisch die Nucleotidsequenz und Restriktions-Endonucleasenkarte der cDNAfür menschliches Urokinaseprotein voller Länge dar. Die CB6B-Einfügung ist wieder unterstrichen.

Fig.4 A, B zeigen die von der cDNA-Sequenz der Fig. 3 abgeleitete Aminosäuresequenz für Urokinase voller Länge.

Fig.5 illustriert das Herstellen des Plasmids pUK33trpLE_Lfür die Expression des langen, 33000 Daltons-Fusions-Proteins.

Fig.6 illustriert die Konstruktion des Plasmids pUK33trpLE_sfür die Expression des kurzen, 33000 Dalton-Fusions-Proteins.

Fig.7 zeigt die Herstellung des Plasmids für die direkte Expression des 33000 Dalton-Proteins.

Fig. 8 illustriert eine weitere Konstruktion eines Plasmids für die direkte Expression des 33000 Daltpn-Proteins.

Fig. 9 und 10 illustrieren die Konstruktion des Plasmids für die direkte Expression der 54000 Dalton-Urokinase und einer Vorläuferform der 54000 Dalton-Urokinase.

Fig. 1T zeigt die Konstruktion eines Plasmids (p-pEH3-Ba114 preUK54) für die Expression der 54000 Dalton-Urokinase in

eukaryotischen Zellen. _λ ν.

Fig. 12 illustriert die Zeitabhängigkeit der Aktivierung von und das Erfordernis für Plasminogen in einem Plasminassay von Urokinase, die gemäß der vorliegenden Beschreibung hergestellt wurde.

Fig. 13 illustriert die Aktivität eines hier beschriebenen Urokinaseextrakts bezüglich des Aktivierens von Plasminogen und das Inhibieren dieser Aktivität durch Antikörper, die gegen natürliche Urokinase entstanden sind.

Ausführungsbeispiel

Die Erfindung wird nachstehend an einigen Beispielen näher erläutert.

A. Quelle für Urokinade mRNA *

Detroit 562-(menschliche Pharynx-Karzinom)-Zellen (38) (ATCC Nr. CCL 138) werden in Eagle's Minimal-Essential-Medium (39) bis zur Konfluenz kultiviert, wobei das genannte Medium mit 3%igem Natriumbicarbonat (pH7,5) 1%igem L-Glutamin (Irvine), 10%igem fötalem Rinderserum, 1%igem Natriumpyruvat (Irvine), 1%igem nicht-essentieller Aminosäuren (Irvine), 2,4%igem HEPES 6pH7,5), 50/ng/ml Garamycin suplementiert und bei 37⁰C in einer 5%igen CCyAtmosphäre inkubiert. Konfluente Zellen werden durch Zentrifugieren nach Behandlung mit 0,25%igem Trypsin für 15min bei 37⁰C geerntet.

B. Isolieren der messenger-RNA

Die totale RNA aus Detroit 562-Zellen wird im wesentlichen so extrahiert, wie es bei Lynch et al. (40) beschrieben ist. Die Zellen werden durch Zentrifugieren pelletiert und etwa 1 g der Zellen wird in 10ml 1OmM NaCI, 1OmM Tris HCI (pH7,4) und 1,5mM MgCI₂ resuspendiert. Die Zellen werden durch Zugabe eines nicht-ionischen Detergens NP-40 mit einer Endkonzentration von 1 % lysiert. Die Zellkerne werden durch Zentrifugieren entfernt und die RNA wird weiterhin durch zwei Phenol (redestilliert)/ Chloroform: Isoamylalcohol-Extraktionen bei 4°C gereinigt. Die wässrige Phase wird 0,2 M NaCI gemacht und die gesamte RNA wird durch Zugabe von zwei Volumeneinheiten eines 100%igen Äthanols präzipitiert und bei -2O⁰C über Nacht gelagert. Nach einer Zentrifugation wird polyA mRNA von der Gesamt-RNA durch Oligo-dT-Zellulose-Chromatographie (41) gereinigt. 1 g-Mengen der Zellen enthalten typischerweise 10-15 mg an Gesamt-RNA und etwa 2% davon war polyA mRNA.

C. Größenfraktionierung der polyA mRNA

Eine Größenfraktionierung von 200/ng polyA mRNA wurde durch Elektrophorese durch ein Säure-Harnstoff-Gel durchgeführt, das aus 1,75%iger Agarose, 25mM Natriumeitrat (pH3,8) und 6M Harnstoff (40, 42) zusammengesetzt ist. Die Elektrophorese wurde 7 Stunden lang bei 25mA und 4°C durchgeführt. Das Gel wurde dann mit der Hand mit einer Rasierklinge fraktioniert. Die einzelnen Gelscheiben wurden bei 70⁰C geschmolzen, in 12ml eines 1OmM NaCI, 1OmM Tris HCI (pH7,4), 1,5mM MgCI₂, und 0,1%igem SDS gelöst und sodann zweimal mit Wasser gesättigtem, redestilliertem Phenol und einmal mit Chloroform extrahiert. Die Fraktionen wurden sodann Äthanol präzipitiert und anschließend in vitro (43) translatiert, um die Größenfraktionierung und Reinheit der polyA mRNA zu bestimmen.

D. Herstellung einer „Bibliothek" aus Oligo-dT-gestarteten Kolonien, die die Urokinase-Sequenzen enthalten

Poly A mRNA wird in Säure-Harnstoffgelen größenfraktioniert. mRNA-Fraktionen, die größer als 12S sind, werden gepooled und als Template für die Oligo-dT-gestartete Herstellung von doppelsträngiger cDNA mittels Standardmethoden (44, 45) verwendet.

Die cDNA wird mit 6%iger Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese größenfraktioniert und 132 ng von doppelsträngiger cDNA, die mehr als 350 Basenpaare lang ist, wird durch Elektroeluierung erhalten. 30ng derdoppelsträngigen (ds)cDNAwird mit Desoxy-C-Resten unter Verwendung einer terminalen Desoxynucleotidyl-Transferase (46) verlängert und mit 200 ng des Plasmids pBR322 (37), das auf ähnliche Weise mit Desoxy-G-Resten an der Pstl-Site (46) verlängert wurde, verschmolzen. Jede Verschmelzungsmischung wurde sodann in E. coli K12, Stamm 294 (ATCC Nr.31446) transformiert. Man erhielt etwa 10000 ampicillinsensitive, tetracyclinresistente Transformanten.

E. Herstellung von synthetischen DNA-Oligomeren zum Screenen von Urokinase

Es wurden acht synthetische, 14 Basen lange DNA-Oligomere hergestellt, die zu mRNA komplementär sind, die von einer Met-Tyr-Asn-Asp-Pro-Aminosäuresequenz eines Gyanbromid-Polypeptidfragments von Urokinase, genannt CB6, abgeleitet wurde. Diese acht Deso xyoligonucleotide werden mit der Phosphotriestermethode (17) zu dem folgenden Zweierpool hergestellt: (CB6A) 5' GGGTCGTTA/GTACAT3', (CB6B) 5' GGATCGTTA/GTACAT3', (CB6C) 5' GGGTCATTA/GTACAT 3', (CB6D) 5' GGATCATTA/GTACAT 3'. Jeder Pool von zwei Oligomeren wird sodann folgendermaßen radioaktiv phosphoryliert: 250ng Desoxyoligonucleotide werden in 25μ.Ι von 6OmM Tris HCI (pH8), 1OmM MgCI₂,15mM Beta-Mercaptoäthapol und '\00μΟ\ (γ³²Ρ) ATP (Amersham, 5000Ci/mMol) vereint. Sodann werden 5 Einheiten von T4-Polynucleotidkinase zugegeben. Die Reaktion läuft sodann bei 37°C 30min lang ab und wird durch Zugabe von 2OmM EDTA beendet.

F. Screenen der Oligo-dT-gestarteten Koloniensammlung für Urokinase-Sequenzen

Etwa 10000 Kolonien werden einzeln in Vertiefungen einer Mikrotiterplatteinoculiert, die LB (48) +5^g/ml Tetracyclin enthalten und nach Zugabe von 7%igen DMSO bei —20°C gelagert. Einzelne Kolonien dieser Sammlung werden auf Schleicher und Schuell BA85/20 Nitrocellulosefilter übertragen und auf Ägarplatten, die LB + 5/xg/ml Tetracyclin enthalten gezüchtet. Nach etwa 10 Stunden Wachstum bei 37 ⁰C werden die Filter mit der Kolonie auf Ägarplatten übertragen, die LB + 5 μg/ml Tetracyclin und 12,5/xg/ml Chloramphenicol enthalten und über Nacht bei 37⁰C bebrütet. Die DNA jeder Kolonie wird sodann denaturiert und mit einem modifizierten Grundstein-Hogness-Verfahren (49) an den Filter fixiert. Jeder Filter wird 3 Minuten lang in 0,5 N NaOH, 1,5 Μ NaCI gespült, um die Kolonien zu lysieren und die DNA zu denaturieren und anschließend durch 15minütiges Spülen in3M NaCl, 0,5M Tris HCI (pH 7,5) neutralisiert. Die Filterwerden anschließend für weitere 15 Minuten in 2XSSC gespült und daraufhin 2 Stunden lang in einem 80°C-Vakuum-Ofen gebacken. Die Filter werden sodann etwa 2 Stunden lang bei ZimmertemperaturvorhybridisiertundzwarinO,9M NaCI, IXDenhardts, 10OmM Tris HCI (pH7,5), 5mM Na-EDTA, 1 mM ATP, 1 M Natriumphosphat (dibasisch), 1 mM Natriumpyrophosphat, 0,5%iges NP-40 sowie 200jug/ml E. coli t-RNA und sodann im wesentlichen nach der bei Wallace et al. beschriebenen Methode (50) in derselben Lösung über Nach hybridisiert, wobei etwa 40 x 10⁶cpm von jedem kinasebehandelten CB6 Desoxyoligonucleotid-Zweierpool verwendet wird. Nach extensivem Waschen bei 37°C in 6XSSC und 0,1%igem SDS, werden die Filter 16 bis 24 Stunden bei -80°C einem KodakXR-5 Röntgenstrahlenfilm mit DuPont Lightning-Plus zum intensivierten Screenen ausgesetzt. Zwei Kolonien zeigten mit der Mischung aus acht Proben Hybridisierung an: UK513dT69D2 (pD2) und UK513dT73D12 (pD12).

Die aus den E.coli-Kolonien UK513dT69D2 und UK513dT73D12 isolierte Plasmid-DNA wurde mit der schnellen Miniscreen-Methode (51) isoliert und einer Pstl-Restriktionsendcnuclease-Analyse ausgesetzt. Aus dieser Analyse läßt sich mit einiger Sicherheit schließen, daß pD2 und pD12 identisch sind. Jede Plasmid-DNA hat 3Pstl-Restriktionsfragmente, die bei Elektrophorese in einem 6%igen Polyacrylamidgel gleich schnell wandern. Die vollständige Nucleotidsequenz der cDNA-Inserierung im Plasmid pD2 wurde durch die Didesoxynucleotid-Ketten-Terminierungsmethode (52) bestimmt, nachdem die Pstl-Restriktionsfragmente in dem M13-Vektor mp7 (53) subcloniert wurden. Fig. 1 zeigt die Nucleotidsequenz und Fig.2 stellt die translatierte Nucleotidsequenz des cDNA-inserierten Fragments von pD2 dar. Aus diesem einen großen Fragment von pD2 wurde die vollständige codierende Region der Urokinase mit niedrigem Molekulargewicht (33000 Daltons = 33K) isoliert. Wie aus der Karte ersichtlich, schließt die Nucleotidsequenz des CB6B (5' GGATCGTTA/GTACAD-Desoxyoligonucleotids die Nucleotide 466 bis 479 ein. Zwischen den Aminosäuren 222 und 227 liegt eine typische serinprotease-aktive Stelle (Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro). Die codierende Region besteht aus 838 Basenpaaren oder 279 Aminosäuren des carboxy-terminalen Teils der hochmolekularen (54000 Daltons = 54K) Urokinase. DasStopcodon LIGA an der Aminosäureposition 280 beginnt etwa von Nucleotid 935 der 3' untranslatierten Sequenz bis zu der polyA-Sequenz. Da nur 31413 Daltons der Urokinase voller Länge durch die cDNA-lnsertion von pD2 codiert wird, war es nötig, weitere Koloniensammlungen zusätzlich herzustellen, die Urokinasesequenzen enthalten, um Urokinase von hohem Molekulargewicht zu identifizieren. '

H. Herstellung von zwei verschiedenen spezifisch gestarteten Koloniensammlungen für die Aminoterminale Extension des bestehenden Urokinase-Clons

Die erste cDNA-Sammlung mit speziellem Primer verwertet ein 45-Basen-Paar-DNA-Restriktionsendonucleasefragment der Urokinase, das mit einer Haell-Stelle in Position 225 beginnt und mit ACCI in Position 270 endet (Fig. 1) als Primer anstelle eines Oligo-dTi₂_₁₈. Dieses Fragment wurde in Gegenwart von 20 μg unfraktionierter Detroit 562 polyA mRNA denaturiert und diecDNAwird entsprechend den in Abschnitt D beschriebenen Methoden präpariert. 11,5 ng von doppelsträngigercDNA, die größer als 200bp ist, wird aus einem 6%igen Polyacrylamidgel eluiert und dazu verwendet, um annähernd 6000 Clone in E. coli 294 herzustellen.

Eine zweite cDNA-Sammlung mit spezifischem Primer, genannt UK89CB6 mit etwa 4000 Kolonien wird dadurch hergestellt, daß ein Pool von 4p,g polyA mRNA verwendet wird, der aus der Säure-Harnstoffagarosegelfraktion 8 stammt und 4μg polyA mRNA aus der Fraktion 9 verwendet werden (siehe Abschnitt C). Von jedem CB6 Desoxyoligonucleotid-Pools (siehe Abschnitt E) werden 250 ng anstelle von Oligo dti2_i8 als Primer verwendet

I. Screening einer Koloniensammlung, die cDNA der vollen Länge enthält.

Kolonien, die cDNA voller Länge enthalten, werden direkt auf Nitrocellulosefilter übertragen und bei 37°C gezüchtet. Die Kolonien werden lysiert und die DNA denaturiert und an die Filter gebunden, wie es im Abschnitt F (49) beschrieben ist. Von einem 143-Basenpaar Hinfl- bis Haell-Restriktionsendonuclease-Fragments aus der cDNA-lnsertion von pD2 wird ein ³²P-markierte DNA-Probe hergestellt und mit der cDNA voller Länge, die an den Filter gebunden ist, hybridisiert. 8 χ 10⁶CPM der Probe werden 16 Stunden lang hybridisiert, sodann gewaschen, wie beschrieben (55) und einem Röntgenstrahlenfilm ausgesetzt. Zwei Kolonien zeigten starke Hybridisierung: A3 und E9

J. Charakterisierung von Urokinase-cDNA voller Länge pA3 und pE9

Eine Pstl-Restriktionsanalyse der A3-Plasmid DNA zeigt cDNA-lnsertionsfragmente von etwa 360 bp und etwa 50 bp sowie der E9-Plasmid-DNAein Fragment bei etwa 340 bp. Eine Pstl EcoRI-Doppelrestriktion jeder Plasmid-DNA zeigt ein gemeinsames cDNA-lnsertionsfragment von etwa 190 bp, wie vorausgesagt, wo jede Plasmid-DNA-Urokinasesequenzinformation von 5' zu dem Haell Accl-Primer-Fragment codiert. Das Plasmid pA3 hat ein zusätzliches Pstl EcoRI-cDNA-lnsertionsfragment von 185 bp und das Plasmid E9 weist ein zusätzliches 160 bp-Fragment auf. Das größere, etwa 360bp Pstl-cDNA-lnsertionsfragmentvon pA3 wurde dem M13-Vektor mp7 (53) subcloniert und mit der Didesoxynucleotid-Ketten-Terminierungs-Methode (52) sequentiert. Die Urokinase codierende Sequenz von pA3 ist von ungefähr Position 405 bis Position 785 in der cDNA-Sequenz des Urokinaseproteins voller Länge angeordnet (siehe Fig.3)

K. Screening der Urokinase-Koloniensammlung UK89CB6

Die DNA von ungefähr 1900 UK89CB6 cDNA-lnsertionen enthaltenden Kolonien wurde denaturiert und an Nitrocellulosefiiter, wie in Abschnitt F beschrieben, fixiert. Von dem 146bp Pstl Hinfl-Fragment des cDNA-lnsertionsfragments von pA3 wird eine ³²P-markierte DNA-Probe hergestellt (54). 40 x 10⁶CPM werden sodann mit der an den Filter gebundenen DNA von ÜK89CB6-Kolonien 16 Stunden lang hybridisiert und sodann, wie beschrieben, gewaschen (55) und einem Röntgenstrahlenfilm ausgesetzt. Zwei Kolonien, die positive Hybridisierung gezeigt haben, wurden UK89CB6F1 (pF1) und UK89CB6H10 (pH 10) genannt.

L. Charakterisierung der ρ/Π- und pH 10-UrokinasecDNA

Pstl-Restriktion von pF1 zeigt cDNA-lnsertionsfragmente von etwa 450bp und etwa 125 bp und pH 10 zeigt ein Pstl -cDNA-Insertionsfragment von etwa 500bp. Pstl EcoRI-Doppelrestriktion von pF1 zeigt keine EcoRI-Restriktionssite und weist cDNA-Insertionsfragmente auf, wie sie identisch bei einer Pstl-Restriktion alleine auftreten. pH 10 zeigt eine EcoRI-Restriktionssite, wodurch cDNA-lnsertionsfragmente von etwa 375 bp und etwa 110 bp entstehen. Diese EcoRI-site von pH 10 ist wahrscheinlich dieselbe EcoRI-site, wie sie an Position 627 in Fig.3 gekennzeichnet ist. Die pF¹-cDNA-lnsertion enthält diese EcoRI-Restriktionssite nicht.

pF1, das ein cDNA-lnsertionsfragment aufweist, das langer als das von pH 10 ist, wird für das Sequenzieren ausgesucht. Beide Pstl-Restriktionsfragmente der pFI-cDNA-lnsertion werden durch M13-Subclonieren und Di-Desoxysequenzierung sequenziert. Die zusammengesetzte Nucleotidsequenz der UK cDNA-lnsertion von pF1, pA3 und pD2 codiert die vollständige Aminosäuresequenz der hochmolekularen Urokinase voller Länge, wie es in Fig. 3 gezeigt ist. Die Urokinase codierende Sequenz von pF1 ist von Position 1 bis annähernd Position 57Q gekennzeichnet. Die Urokinase codierende Sequenz von pD2 ist von Position 532 bis Position 2304 in Fig.3 angeordnet

Das Aminoterminale Serin an Aminosäureposition 1, wie es durch Aminosäuresequenz-Analyse bestimmt wurde, ist in den Fig. A und 4 gezeigt. Die vorangehenden 20 Aminosäuren am Aminoende, beginnend mit Met und endend mit GIy dienen wahrscheinlich als Signalsequenz für die Sekretion der verbleibenden 411 Aminosäuren der Urokinase mit hohem Molekulargewicht. Diese vermutete Signalsequenz hat Eigenschaften, beispielsweise Größe und Hydrophobizität (56,57), die man auch bei anderen charakteristischen Signalsequenzen findet.

Die Trypsin-Spaltstellen, mit Hilfe derer aus der hochmolekularen Urokinase die 33K zweikettige niedrigmolekulare Urokinase entsteht, sind die folgenden: Lysan Position 136 ist die aminoterminale Aminosäure der kurzen Kette und Ne an Position 159

M. Expression der niedrigmolekularen Abkömmlinge von Urokinase in E.coli

1. Die lange Trp LE-Fusion (Fig. 5)

Man konstruiert ein Plasmid (pNCV, 58), das die folgenden Eigenschaften hat: 1. Das Plasmid ist ein Abkömmling von pBR322 und liegt in ungefähr 20 Kopien pro Zelle vor. 2. Das Plasmid macht seine Wirtszelle E.coli resistenz gegen Tetracyclin. 3. Das Plasmid enthält einen induzierbaren Tryptophanpromoter, der die Synthese eines Proteins steuert, das aus einer Fusion zwischen dertrp-Leader-Peptid und dem trp E-Strukturgen (LE-Fusionsgen) enthält. 4. Es wird eine einzige Pstl-Restriktionssite im trp Ε-Gen konstruiert, die dazu verwendet werden kann, um Pstl DNA-Fragmente zu clonieren, indem die EcoRI-Site am distalen Ende des LE-Gens im Plasmid pSOM7A1A4in eine Pstl-Site umgewandelt wird und unter Verwendung einer synthetischen Sequenz von zwei EcoRI-Sites flankiert wird, also

AATTCTGCAG

GACQTCTTAA.

Das DNA-Fragment, das den trp-Promoter und das LE-Gen enthält wird sodann in das Plasmid pBR322 eingeführt, wodurch das Plasmid pNCV entsteht (47A).

Das Urokinase Pstl-Fragment vom Nucleotid an Position 5 (der Pstl 5'-Schneidestelle) bis zur Nucleotidposition 1130 (Fig. 1) wird in die Pstl-Site von pNCV in der Weise geclont, daß ein Fusionsprotein mit Induktion des trp-Promoters gemacht wird. Der N-terminale Teil ist trp LE und der C-terminale Teil ist die niedrigmolekulare Urokinase.

Gemäß der Darstellung in Fig. 5 werden 5^g desPlasmidspUK513dT69D2 (pD2) mit 20 Einheiten Pstl verdaut und das 1125bp cDNA-lnsertionsfragment, das die niedrigmolekulare Urokinase codiert, wird durch 6%ige Polyacrylamidgel-Elektrophorese isoliert. Etwa 1 μg dieser Insertion wird aus dem Gel elektroeluiert, phenol/chloroformextrahiert und äthanolpräzipitiert. 1 μg des Vektors Plasmid pNCV (58) wird mit 10 Einheiten Pstl verdaut und nach Phenol/Chloroform-Extraktion präzipitiert. Ungefähr 100ng dieses 1125bp-Fragmentswird mit etwa 100ng Pstl verdautem pNCVin 20μΊ von 20mMTris · HCI (pH7,5) 1OmM MgCI₂,1OmM DTT, 2,5mM ATP und 30 Einheiten T4 DNA-Ligase vereint. Nach einer Übernacht-Bindung bei 14°C wird die eine Hälfte der Mischung in E. coli K12, Stamm 294 transformiert. Durch BamHI-Verdauung der DNA von 12 Transform ante η konnte in drei Fällen eine richtige Orientierung gezeigt werden. Die Expression dieses Plasmids (pUK33trpLE_L) (Fig. 5) in E.coli lieferte ein langes trp-LE-Fusionsprotein, das die 33000-Urokinase enthält. Die33000-Urokinase wird durch Spalten mit einem dem Trypsin ähnlichem aktiven Enzym zwischen der Pos.3 und 4 und der Position 26 und 27 aktiviert (siehe Fig.2).

2. Kurze trp LE-Fusion (Fig. 6)

Es wird das Plasmid plNCV konstruiert. Es ist in jeder Hinsicht ähnlich wie pNCV (siehe supra) mit Ausnahme der Tatsache, daß die Mehrheit des trp-E-Gens deletiert ist. In diesem Plasmid wurde die Bglll-Site in eie Pstl-Site umgewandelt und die Region zwischen dieser neuen Pstl-Site und der ursprünglichen Pstl-Site wird entfernt. Etwa 100 ng des plNCV wird mit Pstl und Hindlll verdaut, sodann Phenol/CHCI₃-extrahiert und Äthanol präzipitiert. Ungefähr 3/xg von pUK33trpLE_L (Fig. 6) wird vollständig mit Hindlll und teilweise mit Pstl verdaut, so daß ein Pstl Hindlll DNA-Fragment von 1150 bp erhalten wird, das durch Elektroeluierung nach Elektrophorese in einem 6%igen Polyacrylamidgel gereinigt wird. Die Pstl-Site innerhalb des UK-Strukturgens wird von der Verdauung ausgenommen. Das gesamte Pstl Hindlll-verdaute plNCV-Material wird mit ungefähr 50ng des 1150bp Hindlll-Teil-Pstl-Fragments von pUK33trpLE_L gemischt und über Nacht bei 14°C ligiert. Diese Mischung wird dann in E.coli K12, Stamm 294 transformiert. BamHI-Verdauung bestätigt die richtige Konstruktion dieses Plasmids (pUK33trpLE_s) (Fig. 6). Die Expression dieses Plasmids in E.coli liefert ein Fusionsprotein, aus dem die 33000 Urokinase aktiviert wird, wie oben beschrieben.

3. Direkte Expression der 33K-Urokinase (Fig.7 und 9)

Ein Urokinase DNA-Fragment, das mit Nucleotid 16 (Fig.1) beginnt, wird in einem pBR322-Abkömmling geclont, wodurch eine Konstruktion erhalten wird, in der der trp-Promoter unmittelbar vor diesem Urokinase-Fragment lokalisiert ist, das die niedrigmolekulare Urokinase codiert. Das Plasmid pLelFAtrp103 (Fig.7) ist ein Abkömmling des Plasmids pLe IFA25 (59), in dem die EcoRI-Site distal zum LelFA-Gen entfernt wurde (59). 10/x von pLe IFAtrp103 (Fig. 7) werden mit 20 Einheiten EcoRI verdaut, Phenol/CHCI₃ extrahiert und äthanol-präzipitert. Die durch EcoRI-Verdauung entstandenen kohäsiven Enden des Plasmid-DNA-Moleküls werden zu glatten Enden aufgefüllt unter Verwendung von 12 Einheiten der DNA-Polymerase I in einer 50/xl-Reaktion, die 6OmM NaCI, 7mM MgCI₂,7mMTris · HCI (pH7,4) und 1 mM von jedem Ribonucleotidtriphosphat enthält. Die Reaktion wird 1 Stunde lang bei 37°C inkubiert, mit Phenol/CHCI₃ extrahiert und mit Äthanol präzipitiert. Die DNA wird sodann in 50μΙ von 1OmM Tris · HCI (pH8), 1 mM EDTA resuspendiert und mit 500 Einheiten bakterieller Alkalinphosphatase bei 65°C 30 Minuten lang behandelt, zweimal extrahiert und äthanolpräzipitiert. Nach Verdauung mit Pstl wird die Mischung in

einem 6%igen Polyacrylamidgel elektrophoretisiert und das etwa 3900bp-Vektor-Fragment elektroeluiert.

Das Plasmid pUK33trpLE_L wird in E.coli K12, Stamm GM48 (DesoxyadenosinmethyTase~) transformiert, damit die aus diesem E.coli-Stamm gereinigte DNA mit der Restriktionsendonuclease Bell (60) verdaut werden kann. 4/ug dieser DNA werden 1 Stunde lang bei 5O⁰C mit 6 Einheiten von Bell behandelt (in 75mM KCI, 6mM Tris · HCI (pH7,4), 1OmM MgCI₂,1 mM DTT), sodann in 5OmM NaCI aufgenommen und mit 10 Einheiten Pstl verdaut. Eine 6%ige Gelelektrophorese wird durchgeführt und das 914bp-Fragment elektroeluiert.

Mit der Phosphotriester-Methode (47) wird ein 14 Nucleotide enthaltender DNA-Primer synthetisiert, der für die Aminosäuresequenz Met-Lys-Lys-Pro codiert und die folgende Sequenz aufweist:

MetLysLysPro

5' CTATGAAAAAGCCC 3'

500 ng dieses Primers werden am 5'-Endemit 10 Einheiten T4DNA-Kinase in einer 20μΙ-Reaktion, enthaltend 0,5 mM ATP phosphoryliert. Es wird das 264bp Pstl Accl-cDNA-lnsertionsfragment von pUK33trpLE_L (gezüchtet in E.coli GM48) isoliert. Etwa 500ng dieses Fragments werden in 10μ,Ι deionisiertem Wasser resuspendiert und mit 20μ.Ι des phosphorylierten Primers gemischt, bei 95°C 3 Minuten lang erhitzt und schnell in einem Trockeneis-Äthanol-Bad gefroren. Die denaturierte DNA-Lösung wurde auf 6OmM NaCI eingestellt und 7mM MgCI₂, 7mM Tris · HCI (pH7,4), 1 mM von jedem Desoxyribonucleotidtriphosphat und 12 Einheiten DNA Polymerase I, großes Fragment, zugegeben. Nach zwei Stunden Inkubation dieser Primer-Repair-Reaktion bei 37°C wird diese Phenol/CHCI₃ extrahiert, äthanolpräzipitiert und vollständig mit BcM bei 50°C verdaut. Diese Reaktionsmischung läuft sodann durch ein 6%iges Polyacrylamidgel und ungefähr 50 ng des 200 bp Bcll-Fragments, das am Aminoende stumpfendig ist, wird elektroeluiert. Anschließend werden etwa 50ng des stumpfendigen Bcll-Primer-Repair-Fragments, etwa 100nq des Bell Pstl-carboxv-terminalen Fraaments. und etwa mrinn He« ^qnn hn.Uoirtnrfranmonfe nhor

— a — /ίο ν«»

Nacht bei 14⁰C ligiertund in E.coli 294 transformiert. Eine EcoRI-Verdauung zahlreicher Transformanten zeigte, daß die Konstruktion richtig war und eine DNA-Sequenzanalyse wies die gewünschte Sequenz durch das Initiationscodon des neuen Plasmids, pUK33trp103 (Fig.7) nach. In dieser Konstruktion folgen dem N-terminalen Methionin zwei Lysine, welchen ihrerseits die Aminosäuresequenz 5 bis 279 folgt, wie in Fig.2 A dargestellt. Die Expression dieses Plasmids in E.coli lieferte die Synthese der niedrigmolekularen Urokinase. Dieses Protein wurde durch ein trypsinähnliches aktives Enzym aktiviert, wie oben beschrieben, das dazu dient, das N-terminale Lysinpaarzu spalten und ebenfalls zwischen dem Lysin in Pos. 26 und dem Isoleucine in Pos.27 zu spalten (Fig.2A).

Wir hielten es für wünschenswert ein von pUK33trp103 abgeleitetes Plasmid zu konstruieren, das seiner Wirtszelle Tetracyclinresistenz überträgt. In Fig. 8 ist die im folgenden beschriebene Konstruktion des Plasmids pUK33trp103Ap^R"Tc^R gezeigt. 5/ug des Plasmids pHGH207-1 (siehe infra) werden mit Hpal und Pvull verdaut. Das Vektorfragment wird isoliert und gereinigt. 5/xg des Plasmids pUK33trp103 werden mit Hpal und BamHI verdaut, in einem 6%igen Polyacrylamidgel elektrophoretisiert und das 836bp DNA-Fragment gereinigt. Ein zweites 5jug Aliquot des Plasmids pUK33trp103 wird mit BamHI und Pvull zur Isolierung und Reinigung des 119bp DNA-Fragments verdaut. Äquimolare Mengen jedes dieser drei DNA-Fragmente werden über Nacht bei 14⁰C verbunden und zur Transformation von E.coli 294 verwendet. Die Restriktionsendonuclease-Analyse von Plasmid-DNA verschiedener ampicillinresistenter Transformanten sichert die richtige Konstruktion des Plasmids pUK33trp103Ap^R und die Umkehrung der Orientierung der trp-Promoter/UK33-codierenden DNA.

Etwa δμ,ς der pBR322-DNA werden mit EcoRI verdaut und die kohäsiven Enden mit Klenow Poll aufgefüllt. Nach Pstl-Verdauung werden das große Vektorfragment, das die DNA enthält, die für die Tetracyclinresistenz codiert und den Origin der Replikation und einen Teil des Ampicillinresistenzgens enthält, isoliert und gereinigt. Etwa 5 μ-g des Plasmids pUK33trp103Ap^R werden mit BamHI und Pstl verdaut. Sodann wird das DNA-Fragment, das für den restlichen Teil des Ampicillinresistenzgens, den trp-Promoter und den größten Teil der niedrigmolekularen Urokinase codiert, gereinigt. Es werden annähernd äquimolare Mengen dieser beiden DNA-Fragmente und des 119bp BamHI-Pvull-DNA-Fragments aus dem Plasmid pUK33trp103Ap^R über Nacht bei 14°C legiert, um die Herstellung des Plasmids pUK33trp103Ap^RTc^R fertigzustellen. Dieses Plasmid wird für die Konstruktion eines Plasmids verwendet, das die hochmolekulare Urokinase voller Lange exprimiert (siehe Abschnitt N und Fig. 9) N. Expression der hochmolekularen Abkömmlinge von Urokinase 1. Direkte Expression der54K-Urokinase

Fig. 10 stellt die Konstruktion der Urokinase voller Länge dar. Das Plasmid pHGH207-1, das einen einzelnen trp-Promoter enthält, wurde dadurch hergestellt, daß der doppelte lac-Promoter aus dem Plasmid pHGH 207 entfernt wurde. Dieses Plasmid hat einen doppelten lac-Promoter, der von einem einzigen trp-Promoter gefolgt wird. Dies wird folgendermaßen durchgeführt: das trp-Promotor-310bp-DNA-Fragment wird durch Verdauung mit EcoRI aus dem Plasmid pFIFtrp 69 (20) erhalten. Dieses Fragment wird in das Plasmid pHGH107 (44) inseriert, das mit EcoRI geöffnet wird. Auf diese Weise erhält man ein Plasmid (pHGH 207), das einen doppelten lac-Promoter, gefolgt von dem trp-Promoter, flankiert von EcoRI-Sites aufweist. Das auf diese Weise erhaltene Plasmid pHGH 207 wird mit BamHI verdaut; es wird weiterhin teilweise mit EcoRI verdaut und das größte Fragment wird isoliert.

Dieses Fragment weist somit den vollständigen trp-Promoter auf. Aus pBR322 wird das größte EcoRI-BamHI-Fragment isoliert. Beide Fragmente werden ligiert und die Mischung dazu verwendet, um E.coli 294 zu transformieren.

Tet^r, Amp^r-Kolonien werden isoliert und die meisten von ihnen wiesen das Plasmid mit der Struktur auf, die für pHGH 207-1 gezeigt wurde. Das Plasmid pHGH 207-1 ist somit ein Abkömmling aus dem Plasmid pHGH 107 (44) und hat die folgenden Eigenschaften: 1. Das Gen für menschliches Wachstumshormon wird durch den trp-Promoter flankiert anstelle des lac-Promoters, wie in pHGH107,2. das Plasmid überträgt Ampicillin-und Tetracyclinresistenz, wenn es in E.coli exprimiert wird (siehe auch 47A).

20/Xg von pHGH207-1 werden teilweise mit EcoRI und vollständig mit BgIII verdaut. Die Reinigung des großen Vektorfragments wird durch 5%ige Polyacrylamidelektrophorese, Elektroeluierung, Phenol/CHCI₃-Extraktion und Äthanol-Präzipitation durchgeführt. 14/xg des Plasmids pF1 werden mit BgIlI undTaql verdaut und das 236 bp DNA-Fragment wird aus einem 6%igen Polyacrylamidgel isoliert und gereinigt. Die folgenden komplementären DNA-Fragmente werden mittels der Phosphortriestermethode (47) synthetisiert: MetSerAsnGluLeuHisGlnValPro _ _' __

5'AATTATGAGCAATGAATTACATCAAGTTCCAt

TACTCGTTACTTAATGTAGTTCAAGGTAGCB'

Wie ersichtlich, wird die Aminosäuresequenz Met-Ser-Asn-Glu-Leu-His-Gln-Val-Pro durch das Initiationscodon, durch ATG und die Nucleotidsequenzen für die acht Amino-Ende Aminosäuren der hochmolekularen Urokinase codiert. 50 ng von jedem synthetischen DNA-Fragment werden phosphoryliert, die Fragmente gemischt, eine Minute bei 65⁰C erhitzt und bei Raumtemperatur 5 Minuten abgekühlt.

10ng der phosphorylierten und gemischten synthetischen DNA-Fragmente werden mit etwa 200ng des partiell verdauten EcoRI, Bglll-pHGH207-1-Vektorfragments und ca. 50ng des 236bp-Bglll,Taql-DNA-Fragment, über Nacht bei 14°C ligiert und in E.coli 294 transformiert. Von 24 ampicillinresistenten Kolonien werden einzelne Plasmid-DNA's mit EcoRI und BgIII verdaut und ein Plasmid (plnti) das die gewünschte korrekte Konstruktion zeigte, wurde für eine DNA-Sequenzanalyse ausgesucht. Diese Analyse bestätigte die korrekte DNA-Sequenz durch das ATG-Initiationscodon und den Aminoendeteil der hochmolekularen Urokinase.

4jug von pNCV (siehe Abschnitt M) werden mit BgIII und CIaI verdaut und das große Vektorfragment wird mit 5%iger Polyacrylamidgel-Elektrophorese isoliert und gereinigt, 30^g des Plasmids pF1 wird mit Pstl und BgIII verdaut und durch ein 6%iges Polyacrylamidgel elektrophoretisiert. Das 44bp DNA-Fragment wird elektroeluiert, Phenol/CHCI₃ extrahiert und äthanolpräzipitiert. 4/xg derpA3 DNA — werden mit Pstl undTaql verdaut und das 192bp-Fragmentwird aus einem 6%igen Polycrylamidgel gereinigt. Etwa 100ng des BgIII Clal-Vektor DNA-Fragments, ca. 50ng des 192bp-Fragments und etwa 50ng des 44bp-Fragments werden vereint und über Nacht bei 14°C ligiert, sodann in E.coli 294 transformiert. Eine BgIII CIaI-Doppelverdauung der Plasmid-DNA verschiedener tetracyclinresistenter Transformanten zeigten die korrekte Konstruktion HioQoc noiipn Plasmiris. Has den Namen Dlnt2 erhielt.

von in E.coli GM48 (ATCC Nr.39099,9. April 1982) gezüchteten pUK33trp103Ap^RTc^R werden mit Bell und Sail zum Isolieren und Reinigen des 1366bp-DNA-Fragments verdaut. Aus demselben Plasmid wurde das 108bp EcoRI-Bcll-DNA-Fragment isoliert. Annähernd äquimolare Mengen des EcoRI-Sall-DNA-Fragments aus pUK33trp103Ap^RTc^R und des EcoRI-Sall-DNA-Fragments aus pUK33trp103Ap^RTc^R und des EcoR-Bcl -DNA-Fragments, ebenso aus pUK33trp103 Ap^RTc^R werden über Nacht bei 15°C ligiert, wodurch Plnt3 erhalten wird.

5/i.g von plnt3 DNA werden mit BgIII und Sail in einem 6%igen Polyacrylamidgel elektrophoretisiert und das 1701 bp-Fragment, das den Carboxy-Endeteil der Urokinase voller Länge und den Amino-Endeteil des Gens für Tetracyclinresistenz enthält, wird gereinigt. Etwa 5μg der ρ Zwischenprodukt 1 DNA wird mit BgIII und Sail verdaut und einer Elektrophorese in 6%igen Polyacrylamidgel unterworfen und das große Vektorfragment, das den Carboxy-End-Teil des Gens für Tetracyclinsresistenz, den Origin der Replikation, das Gen für Ampicillinresistenz, den trp-Promoter, das Initiationscodon ATG und den Amino-End-Teil der Urokinase voller Länge enthält, wird gereinigt. Etwa 100 ng des Vektorfragments und etwa 100 ng des 1701 bp-Fragments werden vereinigt, über Nacht bei 14⁰C ligiert und in E.coli 294 transformiert. Ein Plasmid aus einer tetracyclin-und ampicillinresistenten Kolonie, das das korrekte Pvull-Restriktionsendonuclease-Muster aufwies, wurde identifiziert und bestätigte die Herstellung der Urokinase voller Länge stromabwärts vom trp-Promoter. Dies ist das Plasmid pUK54trp207-1. Die Urokinase voller Länge wird durch Expression dieses Plasmids in E.coli 294 hergestellt.

2. Direkte Expression von Pre-UK54Kin E.coli (Fig. 10) Das folgende Schema wurde verwendet, um ein Plasmid für die direkte Expression von preUK54 herzustellen. Mit Hilfe der Phosphortriestermethode (47) werden zwei komplementäre DNA-Fragmente synthetisiert, die für das die Aminosäuresequenz iniziierende Codon ATG codiert, gefolgt von den ersten drei N-terminalen Aminosäuren der Urokinase-Vorläufersequenz Arg-Ala-Leu, wie im folgenden dargestellt:

EcoRI MetArgAlaLeu BgII 5'AATTATGCGTGCCCTGC TACGCACGGG5'

Dieser Teil der Vorläufersequenz wird von EcoRI- und Bgll-Restriktionsendonuciease-Schnittstellen flankiert. 50 ng jedes synthetischen DNA-Fragments werden phosphoryliert. Die phosphorylierten Fragmente werden gemischt, eine Minute auf 65⁰C erhitzt und bei Raumtemperatur abgekühlt, 5^g einer pF1-DNA wird mit BgII und BgIII verdaut und das310bp-UK-DNA-Fragmentwird isoliert und gereinigt. Etwa 50 ng des310bp-UK-DNA-Fragments, etwa 150ng des teilverdauten EcoRI, BgIII-Vektor-DNA-Fragments aus pHGH207-1 (siehe Abschnitt N) und 10ng der phosphorylierten und gemischten synthetischen DNA-Fragmente werden über Nacht bei 14°C ligiert und in E.coli 294 transformiert. Einzelne, aus verschiedenen ampiciilinresistenten Transformanten erhaltene Plasmid-DNA's werden analysiert, um die korrekte Konstruktion und Nucleatidsequenz der Vorsequenz der hochmolekularen Urokinase zu bestätigen.

Eines der korrekten Plasmide wurde plnt4 genannt. 5μg von plnt4-DNA wurde mit BgIII und EcoRV zum Isolieren und Reinigen eines Vektor-DNA-Fragments verdaut, das die N-terminalen Nucleotide des pre-UK54, den trp-Promoter, die Gene für Ampicillinresistenz, den Origin der Replikation und einen Teil der für Tetracyclinresistenz codierenden DNA enthält. 5^.g der pUK54trp207-1-DNA wurde mit BgIII und EcoRV, verdaut. Das BgIII EcoRV-DNA-Fragment, das für den Rest des UK54 und die Tetracyclinresistenz codierende DNA codiert, wurde isoliert, gereinigt und mit dem BgIII EcoRV-Vektor-DNA-Fragment ligiert, um die Konstruktion des Plasmids p-preUK54trp 207-1 zu vollenden.

0. Direkte Expression von (Pre-)-Urokinase in Zellkulturen

Fig. 11 stellt das Einführen des für Preurokinase codierenden Gens in einen eukaryotischen Expressions-Vektor p342E (62) dar, der in der Lage ist, die Replikation und Expression von Pre-Urokinase in permissiven Affenzellen durchzuführen, 10^g von p342E-DNA werden mit XBaI verdaut und etwa 100 Basenpaare werden unter Verwendung von Ba 131-Nuclease in jeder Richtung entfernt (Fragment I). 100ng des Hindlll-Linkers 5' CTCAAGCTTGAG, synthetisiert durch die Phosphotriestermethode (47), werden phosphoryliert, 1 Minute auf 65°C erhitzt und bei Raumtemperatur abgekühlt. Die phosphorilierten Linker und Fragment 1 werden über Nacht bei 14°C ligiert und E.coli 294 transformiert. Mit der Restriktionsendonuclease-Analyse einer Transformanten, genannt pEH3-Bal14wurde das Einführen einer Hindlll-Restriktionsendonucleasestelle und der Verlust der XBal-site nachgewiesen. 5μg der pEH3-Bal14-DNA wird mit Hindlll und Hpal verdaut. Die kohäsiven Enden werden mittels Klenow Poll zu stumpfen Enden aufgefüllt. Die DNA wird mit BAP behandelt und das Vektorfragment, das den frühen SV40-Promoter enthält, die Gene für Ampicillin-Resistenz und den Replikationsorigin, werden isoliert und gereinigt (Fragment 2). 5^g ppreUK54trp207-1 werden mit CIaI und XBaI verdaut. Die kohäsiven Enden werden mit Klenow Poll aufgefüllt und das DNA-Fragment, das für preUK54 codiert, wird isoliert und gereinigt (Fragment 3). Etwa 100 ng des Fragments 2 und etwa 100ng des Fragments 3 werden über Nacht bei 14°C ligiert und E.coli transformiert. Eine Restriktionsendonuclease-Analyse der Plasmid-DNA, genannt pEH3-Bal14 preUK54 aus einem Transformanten bestätigte die korrekte Herstellung. pEH3-Bal14preUK54-DNA wurde sodann für dieTransfektion permessiver Affenzellen (62) verwendet, um preUK54zu exprimieren und hochmolekulare Urokinase voller Länge zu sekretieren

P. Isolierung und Charakterisierung

Aus E.coli wurde ein Urokinase enthaltender Rest isoliert. Das Molekül wurde in 5M Guanidin-HCI gelöst, das 5OmM Tris, pH8,0, enthält. Die Lösung wurde weitergeführt in 1 M Guanidin-HCI, 5OmM Tris HCI, pH9, bei einer Proteinkonzentration von 1 ng/ml. Die Lösung wurde sodann zu 2mM reduziertem Gluthion (GSH) und 0,2mM oxidiertem Glutathion (GSSG) zugegeben und über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Die so erhaltene Lösung enthält wiedergefaltetes Protein und wurde sodann in wässrigem Medium dialysiert. Die entstandene Lösung enthielt Urokinase, die eine Aktivität von 100PU/mg zeigte. Nach einer gemäß konventioneller Techniken erfolgten Reinigung wurde das Protein charakterisiert, indem die für das niedermolekulare, bioaktive Material erwarteten N-terminalen Sequenzen für beide Ketten gezeigt wurden. C-terminale Analyse zeigt weiterhin die korrekte Sequenz für beide Ketten. Das Protein wandert bei einem Molekulargewicht von etwa 30000 Daltons. Es hat eine spezifische Aktivität von etwa 170000PU/mg 9225,000IU/mg), unter der Annahme, daß 1 mg/ml ein OD₂₈₀ von 1,3 hat

Q. Assays für den Nachweis der Expression von Urokinase

1. Chromogene Substrate a. Theorie

Der Assay basiert auf dem proteolytischen Spalten eines Tripeptids von einer chromophoren Gruppe. Die Spaltungsrate kann

in direkte Relation zu der Spezifität und der Konzentration der zu testenden Protease gesetzt werden. Urokinase spaltet das chromogene Substrat S2444 (gekauft bei Kabi Group Inc., Greenwich, CT).

Durch Überwachen des Entstehens des Chromophors kann die Menge einer in einer Probe anwesenden,funktionellen Urokinase bestimmt werden. Urokinase wird als inaktive Vorläuferform synthetisiert der Aminosäure 26 (Lysin) und 27 (Isoleucin) (die Numerierung bezieht sich auf den Proteaseclon in Fig. 2A). Bei einigen Urokinasepräparatioen stellte sich heraus, daß sie autoaktiviert waren und/oder durch E.coli-Proteasen aktiviert wurden. Um die Aktivierung der Urokinase sicherzustellen, durch die das Auffinden mittels der Chromogen-Technik ermöglicht wird, ist es erforderlich, die Probe mit geringen Mengen von Trypsin zu behandeln. Trypsin ist eine Protease, die die Lysin-Isoleucin-Bindung spaltet, eine Spaltung, die für die Aktivierung der Urokinase erforderlich ist.

Trypsin spaltet jedoch auch das chromogene Substrat und muß daher aus dem Assay entfernt werden. Ein Protein, das Trypsin inaktiviert und gleichzeitig jedoch keine Wirkung auf Urokinase zeigt, ist der Trypsininhibitor aus Sojabohnen (STI). Der Assay besteht daher aus dem Trypsinaktivator der Urokinase, STI-Inhibierung des Trypsins und schließlich Zugabe des chromogenen Substrats, um die anwesende funktionell Urokinase zu messen.

b. Verfahren

Der Assay wird folgendermaßen durchgeführt:

0,2 ml von 0,1 M Tris, pH 8,0, 50 μΙ der zu bestimmenden Probe und 5μ.Ι Trypsin (0,1 mg/ml in 0,1 MTris, pH 8,0 plus 0,25 M CaCI₂) werden in einTeströhrchen gegeben und die Probe wird bei 37°C 10 Minuten lang inkubiert. Das Trypsin wird durch Zugabe von 2μ.Ι eines 10mg/ml STI (in 0,1 MTris, p8,0) inaktiviert. Die Urokinaseaktivität wird durch Zugeben von 50μΙ einer 1 mM-Lösung von S2444(in Wasser) und Inkubieren der Reaktion bei 37°Cfür 10 Minuten bestimmt. Durch Zugabe von 50μΙ Essigsäure wird die Reaktion gestoppt, die Lösung zum Entfernen des Präcipitats zentrifugiert und die Absorption bei 405nm bestimmt. Die tatsächliche Menge der Urokinase kann durch vergleichendes Ablesen mit einer Probe abgeschätzt werden, die hergestellt wird, indem ein Assay aus Verdünnungen einer Standardlösung mit bekannter Menge von Urokinase (erhältlich bei Calbiochem, San Diego, CA) hergestellt wird.

2. Direkter Assay der Plasminbildung a.. Theorie

Ein sehr viel empfindlicherer Assay für Urokinase kann durch Beobachtung der urokinase-katalysierten Umwandlung von Plaminogen in Plasmin erhalten werden. Für das Enzym Plasmin gibt es nach gleichem Prinzip, wie es unter Punkt 1. beschrieben wurde. Assays mit chromogenen Substraten. Die Grundlage für den Assay ist die Bestimmung der Piasminmenge nach der Inkubation einer Urokinase enthaltenden Lösung mit einer Lösung, die Plasminogen enthält. Je größer die Urokinasemenge, desto größer die Menge des gebildeten Plasmins

b. Verfahren

Ein Aliquot der Probe wird mit 0,10 ml einer 0,7 mgs/ml-Plasminogen-Lösung (in 0,5 M Tris HCI, pH7,4, enthaltend 0.012 M NaCI) gemischt und das Volumen auf 0,15ml eingestellt. Die Mischung wird bei 37°C verschiedene Male (wiegezeigt) inkubiert, es werden 0,35ml von S2251 (1,OmM Lösung im obengenannten Puffer) zugegeben und die Reaktion wird für 5 Minuten bei 37⁰C fortgesetzt. Sodann wird Essigsäure (25μ,Ι) zugegeben, um die Reaktion zu beenden und sodann die Absorption bei 405 nm gemessen. Der Umfang der Aktivität läßt sich durch Vergleich mit Verdünnungen einer Standard-Urokinase-Lösung bestimmen..

3. Indirekter Assay der Plasminbildung

a. Theorie

Es wurde ein empfindlicher Assay für die Urokinaseaktivität entwickelt (61). Der Assay basiert auf der Bestimmung der Plasminbildung durch Messen des Ausmaßes der Plasmin-Verdauung des Fibrins auf einer Agrarplatte, die Fibrin und Plasminogen enthält. Plasmin erzeugt eine klare Lysiszone auf der Fibrinplatten. Das Ausmaß dieser Lysiszone kann zu der Urokinasemenge in der Probe korreliert werden.

b. Verfahren

Entsprechend dem Verfahren nach Granelli-Piperno und Reich (61), werden die Platten 1 bis 3 Stunden bei 37°C inkubiert und die Lysiszonen gemessen. Eine Mengenbestimmung erhält man durch Durchführung eines Assays mit Verdünnungen einer Standard-Urikonase-Lösung.

R. Auffinden der Urikonaseaktivität -...

1. Bakterienzüchtung und Herstellung einer Urokinaseprobe

Ein Stamm von E.coli (W3110) wird unter Verwendung eines Plasmids (pUK33trpLE_s), dasein Urikonase-Fusionsprotein enthält, transformiert. Dieser Expressionsvektor (kurze trpLE-Fusion) wurde oben beschrieben. Die Zellen werden über Nacht in Minimalmedium gezüchtet, bis zu einer optischen Dichte bei 550 nm von 1,2. Sodannwerden zusätzliche 200 ml des Mediums zugegeben. Weiterhin wird Indol-Acrylsäure bis zu einer Konzentration von 10μg/ml zugegeben, eine Verbindung, die die Expression der Tryptophan-Operon-Kontrollgene zu verstärken scheint. Die Zellen werden 2 Stunden inkubiert und geerntet. Die Zellen die aus 400ml des Mediums erhalten werden, werden in Wasser suspendiert und sodann wird Guanidin bis zu einer Konzentration von 7 M (Endvolumen 40ml) zugegeben. Die Lösung wird bei Raumtemperatur 90 Minuten lang inkubiert. Unlösliches Material wird durch Zentrifugation entfernt. Der Überstand wird gegen 0,01 M Tris HCI, pH7,5, enthaltend 0,1 M NaCI 4 Stunden lang dialysiert. Unlösliches Material wird durch Zentrifugieren entfernt und die Probe wiederum 2,5 Stunden gegen 0,01 M Tris HCI, pH 7,5 dialysiert.

Die Probe wird auf eine 3,9 x 9cm DE-52-Säule aufgegeben, die mit 0,01 M Tris HCI, pH 7,5 gepuffert wird, die Säule wird mit dem gleichen Puffer gewaschen und mit 0,01 MTris HCI, pH7,5, enthaltend 0,15M NaCI, eluiert. Der Peak der Aktivität wird gepoolt und für alle weiteren Untersuchungen verwendet.

2. Auffinden der Aktivität

Fig. 12 zeigt das Ergebnis einer direkten Aktivierung von Plasminogen durch fraktionierte E.coli-Extrakte, wenn sie unter Bedingungen, ähnlich wie in Abschnitt Q.2. oben beschrieben, durchgeführt wurde. Es entsteht eine Aktivität, die von der Abwesenheit von Plasminogen abhängig ist. Die zu beobachtende Aktivität ist somit eine plasminogen-abhängige Aktivität. Die gemessene Aktivität ist weiterhin abhängig von der Zeit, wodurch eine zeitabhängige, katalytische Entstehung des Plasmins angezeigt wird. Diese Eigenschaften stimmen mit denen der Urokinase überein, nämlich einer katalytischen Aktivierung von Plasminogen. Extraktionen aus E.coli, die unter ähnlichen Bedingungen durchgeführt wurden, jedoch nicht das Urokinase-Plasmid enthalten, aktivieren unter diesen Bedingungen Plasminogen nicht.

Die Extrakte werden in den Assays, wie oben beschrieben, auch getestet, um Urokinaseaktivität festzustellen und zu quantifizieren. Fig. 13 zeigt die Wirkung verschiedener Mengen bakterieller Fraktionen in dem in Abschnitt Q.2. beschriebenen Assays nach einer 10-Minuten-Aktivierung. Die erhaltenen Werte werden mit solchen Werten verglichen, die unter Verwendung einer Standard-Urokinase-Lösung (Plough Einheit-Bestimmung) erhalten werden.

Das Ausmaß der Plasminogen-Aktivierung ist direkt proportional zur Menge der zugegebenen geclonten Urokinase. Es ist bekannt, daß Antikörper, die gegen gereinigte, natürliche Urokinase entstanden sind, die Aktivität der natürlichen Urokinase verringern. Die Wirkung dieser Antikörper, wenn sie zu dem Assay zum Zeitpunkt 0 zugegeben werden, sind ebenfalls in Fig. gezeigt. „Es kann eine deutliche Hemmung des E.coli-abgeleiteten Materials beobachtet werden. Das stellt sicher, daß die in dem E.coli-abgeleiteten Material beobachtete Aktivität dieselben antigenen Stellen aufweist wie die natürliche Urokinase und somit tatsächlich Urokinase mikrobiell synthetisiert wird.

Bezüglich des Auffindens der Aktivität und der Inhibierung durch Antikörper werden ähnliche Ergebnisse beobachtet, wenn der in Abschnitt Q.3. beschriebene Fibrin-Plattierungs-Assay angewendet wird. Diese Ergebnisse sind in Tabelle I gezeigt.

Tabelle I

FIBRIN-PLATTIERUNGS-ASSAYVON UROKINASE-PROTEIN

Probe	Aktivität	Aktivität in	Prozentualer
	(Plough Units/ml)1	Anwesenheitvon	Anteil der
		Urokinase-Körpern	Inhibierung
		(Plough Units/ml)1
Urokinase-Standard	112	2.5	98
	11	0,45	96
	1,1	0	100
die hier hergstellte	480	1,12	99
Urokinase	224	0	100

1) Standardkurve, die durch Zugabe einer bekannten Menge eines Urokinase-Standards zu den Ansätzen erhalten wird. Werte für die E.coli-Fraktionierung und Antikörper-Inhibierung werden durch Extrapolieren aus diesen Standardkurven erhalten.

Die Standard-Urokinase-Aktivität wird zu 96% oder mehr durch das Zugeben der Urokinase-Antikörper, die gegen dieses Protein entstanden sind, inhibiert. Der Assay der E.coli-abgeleiteten Extrakte hatte signifikante Urokinase-Aktivität. Diese Aktivität wurde nahezu vollständig inhibiert, wenn Antikörper gegen natürliche Urokinase dem Assay zugegeben werden. Der dritte Assay (Assay mit chromogenem Substrat) stellte ebenfalls eine urokinase-ähnliche Aktivität in E.coli-Extrakten fest. Da dies der am wenigsten empfindliche Assay ist, konnten Antikörper-Inhibierungs-Untersuchungen nicht durchgeführt werden, da große Mengen von Antikörpern benötigt werden, um eine Inhibierung zu erkennen.

Die quantitativen Bestimmungen mit den drei obengenannten Assays wurden unter Verwendung einer Standard-Urokinase durchgeführt, die von Calbiochem erhalten werden können. Die erhaltenen Werte (Plough-Einheiten pro ml) waren alle von derselben Größenordnung: 500 für die Fibrin-Plattierung; 100 für die Plasminogenaktivierung und 350 für das chromogene Substrat (S2444). Die auftretenden Abweichungen sind zweifellos auf die relative Unreinheit des Materials zur Zeit der Untersuchungen zurückzuführen.

Pharmazeutische Zusammensetzungen

Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können nach bekannten Verfahren formuliert werden, so daß pharmazeutisch brauchbare Zusammensetzungen hergestellt werden, wobei das hier beschriebene Urokinase-Produkt in einer Mischung mit einem pharmazeutisch-annehmbaren Träger zusammengefügt wird. Geeignete Träger und deren Formulierung sind beispielsweise in Remington's Pharmaceutical Sciences von E.W. Martin beschrieben, das hiermit Teil der Offenbarung sein soll. Diese Zusammensetzungen enthalten eine wirksame Menge des hier beschriebenen Proteins zusammen mit einer geeigneten Menge eines Trägers, um eine pharmazeutisch annehmbare Zusammensetzung herzustellen, die für eine wirksame Anwendung beim Patienten geeignet ist.

A. Parenterale Anwendung

Die hier beschriebene menschliche Urokinase kann bei Subjekten, die anthrombo-embolytischen Krankheiten oder Anomalien leiden, parenteral angewendet werden.

Dosierung und Dosierungsrate können in der gleichen Weise durchgeführt werden, wie sie kürzlich für die Verwendung von klinischen Anwendungen anderer cardiovascularer und thrombolytischer Mittel festgesetzt wurden, beispielsweise etwa ^ 4400IU/kg Körpergewichtals intravenöse Anfangsdosierung, gefolgt von einer intravenösen Dauerinfusion von etwa 4400IU/ kg/hr während einer Dauer von 12 Stunden bei Patienten, die an Lungenembolie leiden. Als ein Beispiel einer geeigneten Dosierungsform für im wesentlichen homogene menschliche Urokinase in parenteralapplizierbarer Form kann für eine Injektion eine Lösung hergestellt werden, die 250000 Urokinase-Aktivität, 25mg Mannitol und 45mg Natriumchlorid sowie 5ml steriles Wasser enthält. Für eine intravenöse Anwendung wird diese Lösung mit einem geeigneten Volumen einer 0,9% NaCI-Injektion oder 5% Dextrose-Injektion gemischt.

Das hier beschriebene menschliche Urokinase-Protein wird durch ein bestimmtes DNA-Gen und daraus folgende Aminosäuren-Sequenzen bestimmt. Man weiß, daß natürliche, allele Variationen existieren und bei verschiedenen Individuen auftreten. Unsere Variationen können durch einen oder mehrere Unterschiede in der vollständigen Aminosäuresequenz zum Ausdruck kommen oder durch Deletionen, Substitutionen, Insertionen, Inversionen oder durch Hinzufügen von einer oder mehreren Aminosäuren in die Gesamtsequenz. Zusätzlich kann durch die Anwendung von rekombinanter DNA-Technologie die Möglichkeit der Herstellung weiterer, verschiedener Abkömmlinge der menschlichen Urokinase eröffnet werden, die auf verschiedenste Weise modifiziert sein können und zwar durch einzelne oder vielfältige Substitution einer Aminosäure, Deletionen, durch Hinzufügen oder Austauschen, beispielsweise mittels einer site-spezifischen Mutagenese der zugrundeliegenden DNA. Alle derartigen Modifikationen und allelen Variationen, die in Derivaten der menschlichen Urokinase resultieren, sind durch den Umfang dieser Erfindung einbezogen, solange die wesentliche, charakteristische Aktivität der menschlichen Urokinase in ihrer Art unberührt bleibt.

Obwohl in der vorliegenden Erfindung spezielle Ausführungsformen beschrieben wurden, wird darauf hingewiesen, daß die Erfindung nicht auf diese eingeschränkt werden kann, der Schutzumfang vielmehr durch den Bereich der Ansprüche bestimmt wird.

Biblographie

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4. US-PS Nr. 4258 030

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62. Crowleyetal.,Mol.andCellularBiol.3,44(1983)

Claims (5)

1. -1- /1,5UJ

   Erfindungsanspruch:

   1. Verfahren zum Herstellen eines Mikroorganismus oder einer Zellkultur, gekennzeichnet dadurch, daß der Mikroorganismus oder die Zellkultur genetisch in der Weise geändert sind, daß sie die Herstellung eines Proteins steuern, das den enzymatischen Teil der menschlichen Urokinase enthält.
2. 2. Verfahren zum Herstellen eines Mikroorganismus oder einer Zellkultur nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß der Mikroorganismus oder die Zellkultur mit einem Vektor transformiert ist, der in dem transformierten Mikroorganismus oder der transformierten Zellkultur fähig ist, eine DNA-Sequenz zu exprimieren, die für ein Protein codiert, das den enzymatischen Teil der menschlichen Urokinase enthält.
3. 3. Verfahren zum Herstellen eines Mikroorganismus nach Punkt 1 und/oder Punkt 2, gekennzeichnet dadurch, daß er durch Transformation eines E. coli-Stammes hergestellt wird.
4. 4. Verfahren zum Herstellen eines Mikroorganismus nach Punkt 3, gekennzeichnet dadurch, daß er durch Transformation mit einem Plasmid hergestellt wird, das ausgewählt wird aus einer Gruppe, die die Plasmide pUK33trpLE_L, pUK33trpLE_s, pUK33trp103, pUK54trp207-1 und p-preUK54trp207-1 enthält.
5. 5. Verfahren zum Herstellen eines Mikroorganismus oder einer Zellkultur nach einem der vorhergehenden Punkte, gekennzeichnet dadurch, daß die DNA-Sequenz wirksam mit einer DNA-Sequenz verbunden ist, die fähig ist, die Expression der erstgenannten DNA-Sequenz zu bewirken.