DD251791A5

DD251791A5 - Verfahren zur Herstellung von protease-resistenter Urokrinase

Info

Publication number: DD251791A5
Application number: DD28944286A
Authority: DD
Inventors: Michael Blaber; Herbert L Heyneker; Gordon A Vehar
Original assignee: Genentech Inc
Priority date: 1985-04-22
Filing date: 1986-04-21
Publication date: 1987-11-25
Also published as: PT82428A; DD264939A5; ES554249A0; EP0200451B1; DE3689386T2; GR861036B; DK175304B1; US5219569A; HUT40696A; DE3689386D1; ATE98686T1; DK181386D0; ES8800347A1; HU202586B; DK181386A; EP0200451A1; PT82428B

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von einkettigen, protease-resistenten Urokinasederivaten. Insbesondere werden Derivate bereitgestellt, bei denen die Bereiche Lys135Lys136 und Arg156 bis Lys158 gegenueber proteolytischer Spaltung weniger empfindlich sind, was dadurch erreicht wird, dass diese Stellen okkludiert oder kovalent modifiziert werden. Bevorzugte kovalente Modifikationen umfassen Aminosaeuresequenzvarianten an den Stellen, an denen die proteolytische Spaltung von Urokinase erfolgt. Diese Modifikationen werden zweckmaessigerweise durch Synthese von einkettigen Urokinasemutanten in rekombinanten Zellkulturen vorgenommen. Die neuen Urokinasederivate besitzen den Vorteil, dass die Bildung von wesentlichen Mengen an zweikettiger Urokinase entweder in vivo oder in rekombinanten Zellkulturen vermieden wird. Bei diesen Derivaten bleibt jedoch die Funktion zur Aktivierung von Plasminogen bei der Einleitung der Aufloesung von Blutgerinnseln erhalten.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Anwendung der vorliegenden Erfindung erfolgt auf dem Gebiet der Arzneimittel mit thrombolytischer Wirkung.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Urokinase (E.C. 3.4.21.31) ist eine Serinprotease, die Plasminogen unter Bildung von Plasmin aktiviert. Das Protein wird in verschiedenen Geweben, einschl. Endothel und Nieren, synthetisiert und in Spurenmengen in den Urin ausgeschieden. Gereinigte Urokinase liegt in zwei aktiven Formen vor, einer hochmolekularen Form (HUK; etwa 50K) und einer niedermolekularen Form (LUK; etwa 30 K). Die gesamte Aminosäuresequenz von beiden humanen Formen wurde ermittelt (1,2,3). Von LUK wurde gezeigt, daß es sich von HUK durch Spaltung nach Lysin 135 ableitet. Durch diese Spaltung werden die ersten 135 Aminosäuren von HUKfreigesetzt (1). Allgemein wird angenommen, daß HUK oder LUK in proteolytisch aktive Formen durch proteolytische Hydrolyse eines einkettigen Vorläufers, auch als Prourokinase bezeichnet, zwischen Lysin 158 und Isoleucin 159 unter Bildung einer zweikettigen aktivierten Form (die weiterhin entweder HUK oder LUK entspricht) übergeführt werden müssen. Die durch diese hydrolytische Spaltung gebildeten proteolytisch aktiven Urokinasearten enthalten zwei Aminosäureketten, die durch eine einzige Disulfidbindung zusammengehalten werden. Die beiden durch die aktivierende Spaltung gebildeten Ketten werden als A-oder A^Ketten (HUK bzw. LUK) oder als B-Kette, die den Proteasebereich des Moleküls enthält, bezeichnet.

Urokinase stellt ein wirksames thrombolytisches Mittel dar. Da es in der Natur nur in Spurenmengen gebildet wird, sind die Kosten für eine wirksame Dosierung des Enzyms sehr hoch. Urokinase wurde in rekombinanten Zellkulturen gebildet. Für Urokinase kodierende DNA sowie geeignete Vektoren und Wirtsorganismen sind bekannt (3,8).

Wie vorstehend erwähnt, wird angenommen, daß Plasminogenaktivatoren als proteolytisch inaktive Zymogene vorliegen, die durch Proteolyse „aktiviert,, werden müssen, bevor das Enzym auf Plasminogen unter Einleitung der fibrinolytischen Kaskade wirken kann (4,5). Obgleich beobachtet wurde, daß einkettiges Urokinase-Proenzym eine hohe Aktivität bei zymographischen und fibrinolytischen Verfahren aufweist (4, 6)-, hat die Tatsache, daß das Proenzym ferner nur eine geringe amidolytische Aktivität auf niedermolekulare synthetische Polypeptidsubstrate ausübt, zu dem Schluß geführt, daß Spuren an verunreinigender aktiver (zweikettiger) Urokinase in Proenzympräparaten oder Spuren an Plasmin im verwendeten Plasminogen bei Fibrinplattentests für die fibrinolytische Aktivität von Prourokinase verantwortlich sind (4). Dies führt wiederum zwangsläufig zu dem Schluß, daß einkettige Urokinase in die zweikettige Form überführt werden muß, um in vivo Plasminogen zu spalten und die Fibrinolyse einzuleiten.

Die Rolle von Urokinase bei der in vivo-Gerinnselauflösung ist kompliziert. Es wird z.Zt. angenommen, daß Prourokinase in Wechselwirkung mit einem Inhibitor im Plasma steht. Es wird postuliert, daß Fibrin diesen Inhibitor freisetzt, während Prourokinase zur Einwirkung auf Plasminogen freigesetzt wird (7). Es ist unklar, ob die Entfernung des Inhibitors allein ausreicht, um die Plasminogenhydrolyse einzuleiten, oder ob die Freisetzung vom Inhibitor einfach die herkömmliche Urokinaseaktivierung in die zweikettige Form erleichtert. Der vom Inhibitor gebundene Urokinasebereich sowie der Bindungsmechanismus sind unbekannt. Eine den Sachverhalt noch komplizierter gestaltete Hypothese schreibt der HUK-Spezies eine fibrinbindende Fähigkeit zu, insbesondere einem als „Kringel" bezeichneten Bereich, der sich etwa innerhalb der Reste 49 bis 132 befindet (8). Der Zusammenhang zwischen dieser Hypothese und dem Inhibitorpostulat sowie die Bedeutungen dieser Theorien stellen ungelöste Probleme dar.

Ein Haupthinderungsgrund zur Verwendung von zweikettiger Urokinase zur Behandlung von Blutgerinnseln besteht darin, daß die zweikettige Form offensichtlich nicht durch den mutmaßlichen Inhibitor von Prourokinase gebunden wird. Wird zweikettige Urokinase peripher verabreicht, so ist sie in der Lage, Plasminogen an beliebigen Stellen des Kreislaufsystems zu aktivieren, was zu unerwünschten Nebenwirkungen führt. Durch Piasminhydrolyse aus einkettiger Urokinase an der Gerinnselstelle erzeugte zweikettige Urokinase tritt in den Kreislauf ein und erzeugt die gleichen nachteiligen Nebenwirkungen, insbesondere systemische Fibrogenolyse und Verbrauch an α-2-Antiplasmin. Diese Nebenwirkungen behindern eine einwandfreie in vivo-Thrombogenese.

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist es, neue Arzneistoffe mit thrombolytischer Wirkung bereitzustellen.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, einkettige Urokinase bereitzustellen, die (a) zur Bindung entweder mit Fibrin oder dem postulierten Inhibitor fähig ist, d.h. bei der die Endfunktionen in bezug auf Plasminogenaktivierung an den Gerinnselstellen im wesentlichen die gleichen wie bei nativer Prourokinase sind; (b) gegen proteolytische Verdauung, insbesondere gegen eine Umwandlung in die zweikettige Form, beständig ist; und (c) bei Patienten, denen sie verabreicht wird, eine minimale oder gar keine antigene Wirkung aufweist.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von protease-resistenter einkettiger Urokinase, gekennzeichnet dadurch, daß

I. (a) Nucleinsäure bereitstellt, die für eine protease-resistente Aminosäuresequenzvariante von einkettiger Urokinase kodiert.

(b) eine Wirtszelle mit der Nucleinsäure von Stufe (a) transformiert,

(c) die transformierte Wirtszelle bis zur Anreicherung der Urokinasevariante züchtet und

(d) die Urokinasevariante aus der Kultur gewinnt, oder

II. einkettige Urokinase an der Kettenumwandlungsstelle und vorzugsweise an der LUK-Stelle durch Umsetzung mit einer derivatisierenden Verbindung so modifiziert, daß das Enzym gegen proteolytische Spaltung weniger empfindlich wird. Erfindungsgemäß wird Protease-resistente einkettige Urokinase gebildet, indem man Urokinase mit einem Mittel zur Komplexierung von Urokinase kombiniert oder einkettige Urokinase an den Proteolysestellen kovalent modified, so daß die Urokinase an diesen Stellen nicht mehr langer gegenüber einer Proteasehydrolyse empfindlich ist. Die Zielstellen umfassen Argi56 bis Lysise und insbesondere die Reste LySi₃₅ bis Lysi36- Kovalente Modifikationen werden durch Umsetzung von nativer Urokinase mit derivatisierenden Reagentien oder durch rekombinante Synthese von Mutanten mit stellenspezifischen Substitutionen, Insertionen oder Deletionen von Aminosäureresten an der oder den Zielstellen erreicht. Komplexbildende Mittel, wie Anitkörper, gehen mit Urokinase eine Bindung an den Zielstellen oder an benachbarten Stellen ein, so daß der Zutritt von Proteasen zu diesen Stellen erschwert oder verhindert wird. Alle diese Urokinasepräparate sind dazu bestimmt, die Neigung von Proteasen zur Spaltung an den Zielstellen zu verringern oder auszuschließen. Die Umwandlung von einkettiger Urokinase in zweikettige Urokinase durch Plasmin, bakterielle Proteasen, Trypsin oder andere Proteasen wird durch derartige stellenspezifische Mutationen behindert, wodurch unerwünschte in vivo-Nebenreaktionen vermindert werden, ohne daß die Fähigkeit der mutierten Urokinaseart zur vollen Ausübung ihrer übrigen Wirkungen, die bei nativer einkettiger Urokinase gegeben sind, behindert wird. Insbesondere ist es nicht erforderlich, daß die einkettige Urokinase in vivo in zweikettige Urokinase übergeführt wird, um Plasminogen zu aktivieren. Die erfindungsgemäß bereitgestellten Mutanten sind beim Menschen im wesentlichen nicht-immunogen, bleiben letztendlich fibrinspezifisch und sind zur Aktivierung von Plasminogen ohne Freisetzung von zweikettiger Urokinase in das Gefäßsystem fähig.

Fig. 1 zeigt die Aminosäure- und Nucleotidsequenz von humaner Urokinase. Die Aminosäuresequenz ergibt sich aus der oberen Zeile, während die Nucleotidsequenz darunter angegeben ist. Ferner sind auch nicht-translatierte 5'- und 3'-Bereiche gezeigt. Einkettige Urokinase ist definiert als Protein mit der Aminosäuresequenz von humaner Urokinase gemäß Fig. 1A und 1 B in der hochmolekularen Form (etwa 54000 Dalton, NH₂-Ser, GIn₂ Glu₃-Ende) oder in der niedermolekularen Form (etwa 33000 Dalton, NH₂-Lys_l36Proi37Ser₁3₈-Ende) oder mit von dieser Aminosäuresequenz abgeleiteten Variationen und Derivaten unter Einschluß von natürlichen Allelen, wobei das Molekül aus einer einzelnen Aminosäurekette besteht, die an der Proteolysestelle unter Einschluß der Reste Arg₁₅₆ bis LyS₁₅₈ (nachstehend als „Kettenumwandlungsstelle" bezeichnet) ungespalten verbleibt. Proteaseresistente einkettige Urokinase ist ein Urokinasederivat mit einer einzelnen Aminosäurekette, die gegenüber proteolytischer Hydrolyse weniger empfindlich als die underivatisierte, native Form von Urokinase ist. Insbesondere ist protease-resistente Urokinase gegenüber der Umwandlung in zweikettige Urokinase durch Proteolyse an der Kettenumwandlungsstelle beständig. Typischerweise wird dies bestimmt, indem man das mutmaßlich protease-resistente Urokinasederivat mit Humanplasmin inkubiert und die Aktivität des behandelten Produkts gegenüber einem chromogenen Substrat, wie S-2444, mit nativer einkettiger Urokinase bei gleicher Behandlung und gleichen Testbedingungen vergleicht. Beträgt die Geschwindigkeit der Piasminumwandlung des zu untersuchenden Urokinasederivats in die zweikettige Form (bestimmt durch Anstieg der hydrolytischen S-2444-Aktivität) weniger als etwa 50% und im allgemeinen weniger als 10% der Geschwindigkeit der Umwandlung der vergleichbaren nativen Urokinase in die zweikettige Form, so wird das zu untersuchende Produkt als proteolyseresistent bezeichnet. Dieses Testverfahren wird in den Ausführungsbeispielen näher beschrieben. Gegenüber Proteolyse resistente einkettige Urokinase umfaßt auch einkettige Urokinasederivate, die im wesentlichen nicht zur proteolytischen Spaltung an der Stelle LySi₃₅LySi₃₆ (nachstehend als „LUK"-Stelle bezeichnet) fähig sind. Diese Derivate sind als Produkte definiert, bei denen die Umwandlung von HUK zu LUK bei gegenüber Proteolyse beständiger Urokinase mit geringerer Geschwindigkeit als bei nativer einkettiger Urokinase verläuft. Beträgt die Geschwindigkeit der Trypsinumwandlung des in Frage stehenden Urikinasederivats zur LUK-Form (bestimmt durch Gelelektrophorese, Gelfiltration, Immunoassay oder dergl.) weniger als etwa 50% und im allgemeinen weniger als etwa 10% der Umwandlungsgeschwindigkeit der vergleichbaren Urikinasespezies zu LUK, so wird das in Frage stehende Produkt als gegenüber Proteolyse resistent bezeichnet. Die Proteolyseresistenz wird ggf. auch als Resistenz gegenüber anderen Proteasen, deren Anwesenheit in der Umgebung von einkettiger Urokinase zu erwarten ist, definiert. Als Wirte für die rekombinante Synthese von einkettiger Urokinase verwendete Mikroorganismen enthalten Proteasen, wie Endo- und Exopeptidasen, sowie einige Esterasen oder Amidasen mit proteolytischer Aktivität. Einige dieser zufällig vorhandenen Proteasen spalten einkettige Urokinase. Der Umgang mit diesen Proteasen bei der Reinigung ist besonders schwierig, wenn die rekombinante Urokinase löslich ist und erhöhten Konzentrationen an diesen Proteasen ausgesetzt wird. Früher wurden zur Lösung dieser Schwierigkeit Proteolyseinhibitoren, z. B. 1 m Guanidin · HCI in den Reinigungslösungsmitteln verwendet (3). Ferner wurde ein als einkettige Urokinase identifiziertes Enzym aus natürlichen Quellen durch rasche Trennverfahren (6), die zur Verhinderung der Umwandlung in die zweikettige Form bestimmt waren, isoliert.

Die protease-resistente einkettige Urokinase wird nach an sich üblichen Verfahren hergestellt. Die Kettenumwandlungsstelle und vorzugsweise auch die LUK-Stelle werden entweder kovalent modifiziert, so daß sie gegenüber einer proteolytischen Spaltung weniger empfindlich sind, oder mit einem Mittel kombiniert, das den Zutritt von Protease zu diesen Stellen hemmt. Mit.el, die den Proteasezutritrhemmen, umfassen monoklonale Antikörper oder Fragmente davon, z. B. fab-Fragmente, die gegen die in Frage stehenden Stellen oder gegen in Nachbarschaft befindliche epitope Stellen gerichtet sind, so daß der gebundene Antikörper sterisch den Zutritt der Proteasen zu der entsprechenden Stelle behindert. Bei dieser Ausführungsform kann es sich um eine native Urokinase oder um ein mutiertes Molekül handeln, das nicht-kovalent mit einem anderen Molekül, das die Proteaseresistenz verleiht, assoziiert ist. Geeignete Antikörper oder andere bindende Proteine lassen sich leicht durch Immunisierung von Tieren, z. B. Mäusen, gegen einkettige Urokinase in Freund-Komplettadjuvans, Gewinnung der Milzzellen aus den immunisierten Tieren, Verschmelzen der Zellen zu Hybridomen und Screening der Überstände von Fusionskulturen auf antiproteolytische Aktivität identifizieren. Ein geeigneter Screeningtest wird durchgeführt, indem man zunächst den zu untersuchenden Antikörper mit einkettiger Urokinase und sodann mit Plasmin, Trypsin oder einer anderen zu prüfenden Protease inkubiert. Anschließend wird ein Proteaseinhibitor zum Abbruch der Reaktion zugesetzt, und die Fragmente werden durch Gelelektrophorese getrennt. Ein Vergleich mit und ohne Reduktion an einem Elektrophoresegel zeigt, ob der Antikörper einen Schutz der einkettigen Urokinase bewirkt hat oder nicht, d.h. die Anwesenheit einer mit einkettiger Urokinase im reduzierenden Gel wandernden Bande zeigt das Ausmaß des für die einkettige Urokinase erzielten Schutzes.

Eine weitere Ausführungsform betrifft die kovalente Modifikation von einkettiger Urokinase an der Kettenumwandlungsstelle und insbesondere der LUK-Stelle, um sie gegenüber proteolytischer Spaltung weniger empfindlich zu machen. Für die kovalente Modifikation stehen im allgemeinen zwei Möglichkeiten zur Verfugung. Gemäß einer Ausführungsform wird einkettige Urokinase mit einer derivatbildenden Verbindung umgesetzt, bis mindestens ein Rest in einem wesentlichen Anteil der Kettenumwandlungs- oder LUK-Stellen durch eine kovalente Bindung der Urokinase an einen organischen Rest substituiert oder sterisch gehindert ist. Die Bedingungen für die Umsetzung werden durch einen einfachen Matrixversuch bestimmt, bei dem die Beständigkeit der Plasminogen aktivierenden Wirkung der Urokinase mit dem Anstieg der proteolytischen Resistenz verglichen wird. Geeignete Mittel sind monofunktionelle Verbindungen, die unter solchen Bedingungen eingesetzt werden, daß sie eine maximale Selektivität für die Seitenketten von Arginin- und vorzugsweise von Lysinresten besitzen. Beispiele hierfür sind 1,2-Cyclohexandion, Essigsäureanhydrid und Phenylglyoxal. Eine unerwünschte Derivatbildung am aktiven Zentrum von Urokinase und an der Kringel-Struktur wird minimiert, indem man die Umsetzung in einem stöchiometrischen Überschuß von Plasminogen (oder einem anderen Substrat oder Substratanalogen) und Fibrin oder Benzamidin durchführt. Da das Mittel monofunktionell ist, kommt es nicht zur Vernetzung der Proteine.

Die bevorzugte Ausführungsform zur Herstellung von protease-resistenter einkettiger Urokinase besteht in der Einführung einer Aminosäuresequenzvariation in die Kettenumwandlungs- oder LUK-Stellen durch rekombinante Methoden. Eine DNA-Sequenz, die für einkettige Urokinase kodiert, ist bekannt. Ebenso sind Verfahren zu deren Expression in rekombinanten Wirtszellen bekannt (3, 8). Methoden, die zur Einführung von Mutationen in diese DNA, die als gegenüber Proteolyse beständige Aminosäuresequenzvarianten exprimiert werden, verwendet werden können, sind an sich bekannt. Zum Beispiel werden DNA-Segmente/die für die Kettenumwandlungs- und LUK-Stellen (sowie ggf. fürflankierende Bereiche) kodieren, aus der für die Urokinase kodierenden DNA herausgeschnitten, indem man sequentiell mit Restriktionsendonucleasen, die an den flankierenden DNA-Bereichen, die für die Proteolysestellen kodieren, einwirken (bestimmt durch DNA-Sequenzanalyse), verdaut, die entsprechend gespaltene DNA (bestimmt durch Gelfiltration), gewinnt, das für die gewünschte Aminosäuresequenz und die flankierenden Bereiche kodierende Oligonucleotid synthetisiert, mit den Restriktionsenzymen, die auch zum Herausschneiden des unerwünschten Fragments verwendet werden, abbaut, dadurch kohäsive Enden schafft und die synthetische DNA in das restliche Strukturgen der einkettigen Urokinase durch Ligation einbaut. Die für die LUK-Stelle kodierende DNA wird beispielsweise herausgeschnitten, indem man pUK54trp207-1 (3) mit Mstl und Ball partiell abbaut, das Vektorfragment gewinnt und den Vektor durch Ligation des Fragments mit einem synthetischen Oligonucleotid mit der gewünschten Sequenz rekonstituiert. Bei dieser Ausführungsform wird für DNA kodierende [Lysi35—> A]-Humanurokinase bereitgestellt, indem man an den Mstl- und Ball-Enden ein Oligonucleotid der Sequenz

pGCAGATGGAAAGCCCTCCTCTCCTCCAGAAGAATTAAAATTTCAGTGTGG CGTCTACCTTTCGGGAGGAGAGGAGGTCTTCTTAATTTTAAAGTCACACCp

530 582

einsetzt, wobei die unter der Sequenz angegebenen Nummern mit Fig. 1 übereinstimmen.

In ähnlicher Weise wird die für die Kettenumwandlungsstelle kodierende DNA beispielsweise herausgeschnitten, indem man die Urokinase-DNA mit Ball und EcoRI auf gleiche Weise abbaut und mit dem geöffneten Gen ein Oligonucleotid mit der Basensequenz, die für die gewünschten Aminosäurereste kodiert, verknüpft. Ein Beispiel für ein entsprechendes Oligonucleotid bei der Herstellung von [Argi₆₆ -> His; LyS₁₅₈ —> A]-Humanurokinase ist

-HisPhelle-

pCCAAAAG ACTCTG AG G CCCCACTTTATTATTGG G G G AG GGTTTTCTGAGACTCCGGGGTGAAATAATAACCCCCTCTTAAp.

583 627

Weitere Sequenzvarianten können auf analoge Weise durch Synthese und Insertion von entsprechenden Oligonucleotiden hergestellt werden.

Zweckmäßigerweise ist es jedoch, die Urokinase-DNA zu mutieren, indem man das M13-Phagen-Mutagenseseverfahren (9) anwendet. Dieses Verfahren ist an sich bekannt.

Die erfindungsgemäßen Aminosäuresequenzmutanten sind durch Deletion oder Substitution der in den Proteasestellen vorkommenden basischen Reste (Arginin und/oder Lysin) oder durch die Insertion von Resten, die es den basischen Resten im wesentlichen unmöglich machen, an der proteolytischen Spaltung teilzunehmen, charakterisiert. Kombinationen von Insertionen, Deletionen oder Substitutionen werden angewandt. Bevorzugte Mutationen sind in der nachstehenden Tabelle zusammengestellt. Diese Tabelle soll keine abschließende Aufzählung von geeigneten Mutationen darstellen.

Urokinase-Rest(e)

Mutationsereignis

l.Lys₁₃₅ 2.

3.

is, SeroderTyr

Δ,-oderLys

*^?oderAr9l56^Phe157^Lys158"

Ser, lphe, ς-Jser,

4.

5. 6.

Tyr GIu or lGly J

Ser,

156

Tyr GIu, or 1.GIy J

or

158

fipder Lys₁₅₈->His, Ser, TyrodeKSly

^ProIle159

Wenn LyS₁₃₅ unverändert ist oder zu Arginin mutiert ist, soll LySi₃₆ zu Prolin mutiert werden oder wegfallen. Ferner soll, wenn Lys!58 unverändert oder zu Arginin mutiert ist, Prolin zwischen LyS₁Sa und Me₁₅₉ insertiert oder lle₁₅g durch Prolin ersetzt werden. Bei den besonders bevorzugten Ausführungsformen handelt es sich um die Deletionsmutanten, insbesondere in bezug auf Lysi35, Arg₁₆₆ und LyS₁₅₃, knapp gefolgt von Histidinylsubstitutionen, da bei diesen Mutationen die Wahrscheinlichkeit der Bildung von Autoantikörpern bei den Patienten am geringsten ist. Eine bevorzugte Ausführungsform besteht in der Deletion von LySi₃₅ oder LyS₁₃₆ kombiniert mit einer Deletion von Phei₅₇Lys₁₅s· Diese Mutante hat den Vorteil, daß, selbst wenn eine begrenzte Proteolyse im Anschluß an Argi₅₆ stattfindet, bei der proteolytischen Umwandlung in die zweikettige Form das gebildete Molekül in beiden Urokinaseketten die gleichen C- und N-Enden aufweist, wie sie in zweikettiger Urokinase vorliegen (die normale Proteolyse von Prourokinase setzt in vivo das Phe-Lys-Dipeptid frei). Ferner verbleibt bei dieser bevorzugten Mutante das Molekül in der HUK-Form.

Die für die protease-resistente Variante kodierende Nucleinsäure wird in einen Expressionsvektor insertiert, der Vektor wird zur Transformation einer Wirtszelle verwendet, die Transformante wird gezüchtet, bis sich die Urokinasevariante in der Kultur' anreichert, und die Variante wird sodann aus der Kultur gewonnen. Die Methoden zur rekombinaten Urokinaseherstellung, die in der Literatur (3) beschrieben sind und auf die hier ausdrücklich Bezug genommen wird, sind alle zur Herstellung der Varianten geeignet. Ein beispielhaftes Verfahren wird in den folgenden Beispielen beschrieben. Jedoch ist darauf hinzuweisen, daß andere Vektoren und Wirtszellen mit zufriedenstellendem Erfolg zur Herstellung der hier beschriebenen Varianten verwendet werden können.

Direkt in rekombinanten Bakterien (d. h. ohne Verwendung eines Sekretionsleaders) erzeugte Urokinasevarianten werden als intrazelluläre, wasserunlösliche Aggregate abgeschieden, die als refraktile Körper bezeichnet werden. Sie werden durch Trennung der refraktilen Körper von Zellbruchstücken, z. B. von Zellwandfragmenten und dergl., gewonnen. Dies wird zweckmäßigerweise durch Zentrifugationsverfahren,z.B. durch Saccharosegradiententrennung, durchgeführt. Anschließend werden die refraktilen Körper in einem Proteindenaturierungsmittel, wie 6m Guanidinhydrochlorid, in Lösung gebracht, wobei das Protein wieder gefaltet wird, das Mittel wird beispielsweise durch Dialyse entfernt, und die Urokinasevariante wird durch klassische Techniken, beispielsweise durch lonenaustauscherharz- oder Gelsäulen, weiter gereinigt. Da die Urokinasevariante jedoch protease-resistent ist, ist es nicht erforderlich, Benzamidinsepharose zur Trennung der einkettigen von der zweikettigen Urokinase zu verwenden. Ferner ist es auch nicht notwendig, einen Proteaseinhibitor (1 m Guanidin-hydrochlorid) oder rasche Trennverfahren während der Reinigungsstufen anzuwenden.

Protease-resistente Urokinase wird sodann unabhängig davon, ob sie in rekombinaten Bakterien, Hefen oder höheren eukariontischen Zellkulturen oder durch kovalente oder adsorptive Modifikation von nativer Urokinase hergestellt worden ist, zu einer Zusammensetzung für die therapeutische Verabreichung an Patienten mit Blutgerinnseln formuliert. Die Urokinasekonzentration, dt r Verabreichungsweg undislie pharmazeutischen Trägerstoffe, die bisher für native Urokinase verwendet worden sind, sind in gleicher Weise für die erfindungsgemäße protease-resistente Urokinase geeignet. Typischerweise werden etwa 10000 bis75000lU/ml an resistenter Urokinase in 5% Dextrose oder anderen isotonen intravenösen Vehikeln, ggf. zusammen mit Trägerstoffen, Verdünnungsmitteln und Stabilisatoren, formuliert. Die proteaseresistente Urokinase wird intravenös in einer Geschwindigkeit infundiert, die zur Erzielung der Perfusion der okkludierten Arterie oder Vene gemäß üblicher Darstellung nach herkömmlichen Techniken ausreicht. Im allgemeinen liegt die Infusionsgeschwindigkeit über etwa 4000 IU/kg/h. Im allgemeinen können jedoch die Infusionsgeschwindigkeit und die Urokinasekonzentration in beträchtlichem Umfang in Abhängigkeit vom gewählten Urokinasederivat, dem Allgemeinzustand des Patienten, d. h. dem Umfang des Gerinnsels und dem hämostatischen Zustand des Patienten, und dem Verabreichungsweg, z. B. durch Koronarkatheter oder periphere Verabreichung, variieren. Die Bestimmung der geeigneten Urokinasekonzentrationen und Verabreichungsgeschwindigkeiten liegt im Fachwissen des normalen Fachmanns. Es ist festzuhalten, daß.das durch die erfindungsgemäße Urokinasespezies erzielte Ausbleiben von Nebenwirkungen die Anwendung von größeren Dosen und höheren Verabreichungsgeschwindigkeiten ermöglicht, als das bisher mit zweikettiger Urokinase der Fall war.

Ausführungsbeispiele Beispiel 1

Aufbau der Lysi36-^-Δ-Mutante

Plasmid pÜK54trp207*TX wurde als Äusgangsplasmid verwendet. Dieses Plasmid enthält DNA, die für das vollständige HUK-Gen unter der Kontrolle des E. coli trp-Promotors kodiert. Dieses Plasmid ist identisch mit pUK54trp207-1 (3), mit der Ausnahme, daß es nur eine EcoRI-Stelle in der Nähe des 3'-Endes des trp-Promotors enthält und die 641 bp (Basenpaare) zwischen den Aval- und Pvull-Stellen der pBR322-Vektorkomponente deletiert worden ist (sog. „XAP"-Deletion) (14).

Das Plasmid pUK54trp207-1*TX wird nach einem bekannten Verfahren (3) hergestellt, mit der Ausnahme, daß bei diesem Verfahren als Äusgangsplasmid pHGH207-1*XAP anstelle von pHGH207-1 verwendet wird. pHGH207-1 *XAP wurde durch partielle EcoRI-Verdauung von pHGH207-1 zur Öffnung des Plasmids gebildet, die kohäsiven Enden wurden unter Verwendung des Klenow-Fragments von DNA-Polymerase I gefüllt, das Plasmid wurde unter Verwendung von T4-Ligase rezirkularisiert und anschließend zur Transformation von E. coli verwendet. Ein Plasmid, pHGH207-1 *, wurde gewählt, in dem nur die EcoRI-Stelle am 3'-Ende des trp-Promotors erhalten blieb, wie durch Restriktionsenzymanalyse festgestellt wurde.

Zur Erzielung der XAP-Deletion wurde pHGH207-1 * mit Aval und Pvull verdaut, das große Vektorfragment wurde gewonnen, die kohäsiven Enden wurden unter Verwendung des Klenow-Fragments von DNA-Polymerase I gefüllt, das Plasmid wurde stumpfendig unter Verwendung von T4-Ligase verknüpft, und E. coli wurde unter Verwendung des Ligationsgemisches transformiert. pHGH207-1 *XAP wurde gewonnen und gemäß dem bekannten Verfahren zur Bildung von pUK54trp207*TX verwendet.

pUK54trp207-1 *TK wurde mit Pstl und Bell verdaut, und das Fragment, das in etwa die Basen 439 bis 732 umfaßt, wurde gewonnen. Doppelsträngiges M 13mp10 (die äquivalente Phage M 13mp18 wird voriBethesda Research Laboratories vertrieben) wurde mit Pstl und BamHI verdaut und an das Pstl-Bcll-Urokinase-DNA-Fragment unter Bildung von M13mp10UK1 verschweißt. E. coli JM101-Zellen (ATCC Nr. 33876) wurden mit der doppelsträngigen replikativen Form (RF) von M13mp10UK1 transformiert. Daseinzelsträngige und RF-M13mp10UK1 wurde aus infizierten E. coli JM101-Zellen auf bekannte Weise isoliert. Es ist anzumerken, daß Bell und BamHI kohäsive Enden bilden, so daß die M13mp10-Phage zur Rezirkularisierung mit dem • Urokinaseinsert in der Lage war. Die einzelsträngige Form wurde für die stellenspezifische Mutagenese von Urokinase an der Lysi36-Stelle verwendet.

Ein sythetischesOligonucleotid wurde nach dem Festphasen-Phosphotriesterverfahren (16) zur Verwendung als Mutageneseprimer hergestellt. Der folgende Primer wurde für die Deletion von Lysi₃₆ eingesetzt:

5'PGCAGATGGAAAACCCTCCTCTCCt.

"> 530 556

Dies ist der Bereich von Urokinase, der für den Lys^flankierenden Strang kodiert, mit der Abänderung, daß das AAG-Codon für Lysi36 deletiert war.

Das nachstehend beschriebene Verfahren wurde zur Erzeugung eines Urokinaseklons mit einem Gehalt an der mutierten Sequenz des synthetischen Primers eingesetzt. Dieses Verfahren ist an sich bekannt (9).

50 ng des synthetischen Oligonucleotids wurden 30 Minuten bei 37⁰C in 10μΙ eines Gemisches mit einem Gehalt an 50 millimolar Tris-HCI vom pH-Wert 7,5,10 millimolar MgCI₂,10 millimolar Dithiothreit, 1 millimolar ATP und 8U T4-Polynucleotidkinase phosphoryliert. Als Tracer wurden 400 ng synthetisches Oligonucleotid auf die vorstehend beschriebene Weise phosphoryliert, mit der Abänderung, daß das ATP durch 6OmCi [y³²P]-ATP(3000Ci/mMol) ersetzt wurden, was etwa 50 bis 60 x 10^ecpm/400ng des 24meren ergab. Zur Heteroduplexbildung wurden 100ng einzelsträngiges M13mp10Uk1 10 Minuten auf 95⁰C erwärmt und innerhalb von 30 Minuten ίη40μΙ eines Gemisches mit einem Gehalt von 10 millimolar Tris-HCI vom pH-Wert 7,5,10 millimolar MgCI₂,1 millimolar Dithiothreit und 10ng phosphoryliertem Primer und 500ng großem Fragment von mit EcoRI verdautem M13mp10UK1 langsam auf Raumtemperatur abgekühlt. Die Primerextension wurde durch Zugabe von 10/xl Puffer mit einem Gehalt an 50 millimolar Tris-HCI vom pH-Wert 7,5,10 millimolar MgCI₂ und 1 millimolar Dithiothreit, 2 millimolar ATP, jeweils 0,25 millimolar dGTP, dTTP, dCTP und dATP, 5 U großem Fragment von E. coli-DNA-Polymerase I und 400 U T4-DNA-Ligase gestartet. Nach 1 h bei 12°C wurde das Reaktionsgemisch zur Transformation von E. coli-JM 101 -Zellen verwendet. Die Transformation wurde durch Vermischen von 10μΙ des Ligationsgemisches mit 200μ,Ι an kompetenten JM101-Zellen und anschließende 30minütige Inkubation auf Eisundöminütige Inkubation bei 37⁰C erreicht. Sodann wurden 3,5ml 2YT-Topagar bei 55⁰C mit 300μΙ gesättigten JM101-Zellen, 10μ\ IPTG (200 millimolar) und 50μ,Ι Xgai vermischt und nach Zugabe der transformierten Zellen wurde auf 9cm-Petrischalen mit einem Gehalt an LB ohne Arzneistoffe ausgestrichen. Zweifarblose Plaques (B 2 und G 12) wurden aufgenommen und auf eine Mikrotiterplatte mit einem Gehaltan 100/xl 2YT-Medium übertragen. Die inokulierten Mikrotiterflüssigkeiten wurden auf LB-Agarplatten von 15cm Durchmesser, die mit einem Rasen von 600/LtIJM 101 -Zellen in 8 ml 2YT-Topagar überschichtet waren, aufgedrückt und über Nacht bei 37°C inkubiert. Die gebildeten Plaques wurden durch 1 minütigen physikalischen Kontakt auf eine Nitrocellulosescheibe übertragen. Die Nitrocelluloseschejbe wurde mit 0,5m NaOH, 1,5m NaCI 3 Minuten behandelt und 2mal mit 3m NaCI-O^mTrisHCI vom pH-Wert 7,5 15 Minuten gewaschen und sodann 15 Minuten mit 2X SSC gewaschen. Das Prähybridierungsgemisch enthält 10 millimolar Tris vom pH-Wert 7,5,5 millimolar EDTA, 0,9m NaCI, 1 X Denhardt, 0,5% NP40,100 mikromolar ATP, 1 millimolar Natriumpyrophosphat, 1 millimolar Natriumphosphat und 50^g/ml E. coli tRNA. 1 X Denhardt enthält pro Liter 200 mg Ficoll, 200 mg Polyvinylpyrrolidon und 200 mg Rinderserumalbumin (BSA, Fraktion V). Die Scheibe wurde 90 Minuten unter vermindertem Druck auf 80⁰C erwärmt und sodann 3 Stunden mit 6ml Prähybridisierungsflüssigkeit in einer Petrischale inkubiert, wonach 5 χ 10⁶cpm markierter Primer zugesetzt und über Nacht hybridisiert wurde. Ein selektiver Waschvorgang der Scheibe wurde mit 0,4XSSC bei 49⁰C durchgeführt. Nach Trocknen an der Luft ließ man die Scheibe auf einen Röntgenfilm einwirken. Die positiv hybridisierenden Klone wurden weiter durch Didesoxysequenzierung analysiert. Beim B2-Klon wurde die richtige Sequenz mit der Lys₁₃₆-Deletion bestätigt.

-7- 251 731

Das Expressionsplasmid wurde durch Ligation von Xbal-Bcl- und Xbal-Pstl-Fragmenten aus pUK54trp207-1 *TX mit dem Sau3A-Pstl-Insertionsfragmentaus Plaque 82 und Transformation des Ligationsgemisches in E. coli rekonstituiert. EineTransformante wurde ausgewählt, die ein Plasmid enthielt, das die Genmutante (pUK54B2) trug. Die Fragmente wurden durch herkömmliche Behandlung (Verdauung) mit Restriktionsenzym und Gewinnung des gewünschten Fragments erhalten. Dabei wurden die BcII- und BamHI-Stellen beide zerstört. Das M13-Urokinaseinsert wurde am gleichen Punkt wie die Bell- und BamHI-Ligation durch Sau3A, das die zentralen vier Basen von Bell-, BamHI- oder Bcll-BamHI-Ligationsstellen erkennt, herausgeschnitten. pUK54B2 wurde zur Transformation von E. coli verwendet. Der gegenwärtig bevorzugte Stamm von E. coli ist W3110fhuA~. Dieser Stamm ist für die Herstellung der erfindungsgemäßen Urokinasemutanten nicht wesentlich, erweist sich jedoch als besonders zweckmäßig, da er gegenüber kontaminierenden Phagen sehr resistent und für großtechnische Herstellungsverfahren praktischer ist.

E.coli W3110fhuA~ ist ein T1-Phagen-resistentes Bakterium, das durch eine Deletion oder Inversion der mit dem fhuA-Gen assoziierten DNA-Sequenzen assoziiert ist.

Kurz zusammengefaßt, wird E. coli W3110 (ATCC 27325) mit λ-Bakteriophagen mit einem Gehalt am transponierbaren Element Tn10, das Tetracyclin-Resistenz verleiht, transduziert. Stämme von mitTn10transduziertemW3110 werden in bezug auf Resistenz gegen Phageninfektion ausgewählt. Phagen-resistente Stämme werden vereinigt und mit Bakteriophagen Pl infiziert. Das erhaltene Lysatwird zurTransduktion von E. coli AT982 (17) verwendet. Der Stamm AT982 enthält eine DAP-Mutation, die sich in der Nähe des fhuA-Gens befindet. Demzufolge zeigt die Transduktion des Stammes AT982 durch das Pl-Lysat und die Wahl von Transduktanten, die gegen Tetracyclin resistent sind und die die DAP-Funktion regenerieren, daß das Transposon Tn 10 sich innerhalb des fhuA-Gens befindet. Stämme, die gegen Tetracyclin resistent sind und eine regenerierte DAP-Funktion aufweisen, stellen die DNA-Quelle für die Bakteriophagen Pl-Transduktion von E. coli W3110dar. TransduzierteW3110-Stämme, die dieTetracyclinresistenz und Phagenresistenz exprimieren, werden ausgewählt. Diese Stämme werden sodann auf der Basis der Resistenz gegen Phageninfektion und Reversion zur Tetracyclinempfindlichkeit (18) ausgewählt. Eine Reversion zur Tetracyclinempfindlichkeit, die mit der Beibehaltung der Resistenz gegen T1-Phageninfektion gekoppelt ist, zeigt, daß die mit dem fhuA-Gen assozierte DNA-Sequenz entweder deletiert oder irreversibel invertiert worden ist. Die so hergestellten Stämme werden als E. coli W3110fhuA" bezeichnet.

Die das transponierbare Element Tn 10 enthaltenden Phagen, die zur Insertion von Tn 10 und W3110 verwendet wurden, wurden folgendermaßen aufgebaut. Beim Ausgangsmaterial handelte es sich um \-c1857b 2210am29. Diese Phage ist dem Fachmann geläufig (19) und wurde aus drei bekannten Mutanten von λ-Phagen nach üblichen Verfahren hergestellt. Ein Lysat dieser λ-Phage wurde am amber-Suppressor E. coli C600 (ATCC 23724), das nach üblichen Verfahren so manipuliert worden war, daß es ebenfalls das Tn10-Transposon enthielt (19), hergestellt. Dieses Lysat wurde zur Infektion von E.coli C600 (X-C1857), das einem amber-Suppressor und eine λ-Prophage mit dem c1857-Genotyp enthält, verwendet. Lysate von gegen Tetracyclin resistenten Kolonien wurden durch Wärmeinduktion unter Züchten der Tetracyclin-resistenten Kolonien zunächst in Gärbrühe von 32⁰C und anschließend 90 Minuten bei 42'⁰C hergestellt. Das Lysat wurde sodann auf E. coli C600 ausgestrichen und der Replikaplattierung bei 32°C an E. coli C600 und E. coli W3102 sup+ (\-imm434), das die heteroimmune Prophage A-imm434 enthält (20), unterworfen. Am heteroimmunen Stamm auftretende Plaques wurde auf Tetracyclinplatten ausgestrichen. Auf diesen Platten auftretende Plaques sind zurTransduktion derTetracyclinresistenzin der Lage und werden beim vorerwähnten Verfahren zur Erzeugung von E. coli W3110fhuA~ verwendet.

Rekom bin ante native und [Iysi36 —* Δ] humane Urokinase wurden aus 1-Liter-Kulturen von W3110- oder W3110f hu A"-Zellen, die mit dem entsprechenden Plasmid transformiert sind, erhalten. Die Expression wurde ferner durch Zugabe von Indolacrylsäure induziert. _ ;

Beispiel 2 Aufbau von [LyS₁₃₆-* Δ; PhIeI₅₇LyS₁₅₈-* A]-Humanurokinase

Es wurde im wesentlichen das gleiche Verfahren zur Erzeugung von Expressionsplasmiden, die andere oder zusätzliche Mutanten tragen, durchgeführt. In einigen Fällen ist es zweckmäßig, die M13-Phage, die bereits eine oder mehrere Mutanten trägt, zur Herstellung von an zusätzlichen Stellen mutierter DNA zu verwenden. Das folgende Verfahren wurde zur Herstellung von [PtIe₁₅₇LyS₁₅₈-* Δ; LySi₃₆ —* A]-Humanurokinase angewandt. M13mp10UK1 wurde als Schablone für einen Primer mit der folgenden Sequenz verwendet:

5'pCTGAGGCCCCGCATTATTGGGGGA

593 621

Unter Anwendung des vorstehend beschriebenen Verfahrens wurde die Plaque 2F3 identifiziert. Phagen von der Plaque 2F3 wurden ermittelt, die ein Urokinase-DNA-Fragment mit der Phei₅₇Lys_15g —*AMutation enthielten. Das Expressionsplasmid für diese Mutation, das auch die Lysi₃₆-Deletionsmutation (Beispiel 1) enthielt, wurde durch Ligation des Vektorfragments aus einem Ball-Bcll-Abbau von pUK54B2 mit dem Ball-Sau3A-lnsertionsfragment des Phagen 2F3, Transformation und Züchten von E.coli W3110 oder W3110fhuA" rekonstituiert. Transformierte Z-eilen wurden über Nacht auf Minimalmedien bis zu einer optischen Dichte bei 550 nm von 1,2 gezüchtet. Zusätzliche Medien wurden zugesetzt. Indolacrylsäure, eine Verbindung, die die Expression der durch dasTryptophanoperon kontrollierten Gene weiter induziert, wurde in einer Konzentration von 10/u.g/ml zugesetzt. Die Zellen wurden 2 Stunden inkubiert und sodann geerntet.

Während pUK54trp207-1 *TX, das bei der Herstellung der hier beschriebenen protease-resistenten Urokinase-Sequenzvarianten tatsächlich verwendete Plasmid war, ist es für den Fachmann klar, daß auch andere Expressionsvektoren geeignet sind. Es ist lediglich für Urokinase kodierende klonierte DNA erforderlich. Diese DNA wird durch Synthese oder durch Bereitstellung von mRNA aus geeigneten Zellen, z. B. Detroit 562-Zellen (ATCC CCL 138), und Herstellen von cDNA daraus, erhalten (3). Diese DNA wird durch eine zumindest wesentliche DNA- und Aminosäuresequenz-Homologie mit der in Fig. 1 gezeigten Sequenz von nativer Urokinase identifiziert. Geeignete Restriktionsenzymstellen werden aus der DNA-Sequenz identifiziert und angewandt, zusammen mit erforderlichen Adaptoren oder Linkern, um eine zur Insertion in den ausgewählten Expressionsvektor geeignete DNA zu erhalten. Die Anwendung von anderen Plasmidkonstruktionen und Wirt-Vektor-Systemen liegt im Bereich des Wissens des Fachmanns.

Beispiel 3

Reinigung von [Lysi3₅ —» Δ; Phe₁₅₇Lysis8 —» A]-Humanurokinase

200g Zellbrei, der aus der Hälfte eines 10-Liter-Fermenteransatzes gemäß Beispiel 2 geerntet worden war, wurde bei 4⁰C in 10 Liter 0,05 m Tris vom pH-Wert 7,2 mit einem Gehaltan 0,02m EDTA, 0,5 g/Liter Lysozym (Sigma) und jeweils 0,01 g/Liter Ribonuclease (Sigma) und Desoxyribonuclease (Sigma) homogenisiert. Die Lösung wurde 3mal durch eine Menton-Gaulin-Mühle bei 316bar (4500psi) gegeben und 30 Minuten bei 4700 χ g bei 5°C zentrifugiert. Das erhaltene Pellet, das gemäß SDS-PAGE-und Western-Blotting-Technik Urokinase enthält, wurde durch Homogenisieren in 500ml 0,05m Tris und 0,02 m EDTA vom pH-Wert 7,2 resuspendiert. Dieses Suspension wurde über 1,3 Liter 50% Glycerin geschichtet und nochmals 30 Minuten bei 4700xg zentrifugiert.

Die wiederum im Pellet gefundene Urokinase wurde unter 6- bis8stündigem Rühren bei 4°C in 300ml 6,0m Guanidinhydrochlorid gelöst. Unlösliches Material wurde durch 30mi nötige Zentrifugation bei 4700 xg entfernt. Der Überstand wurde zur erneuten Faltung auf 6,0 Liter verdünnt. Die endgültige Salzkonzentration im Puffer zur Ermöglichung der erneuten Faltung vom pH-Wert 9,0 war: 0,05m Tris, 1,0 m Guanidin-hydrochiorid, 0,2 m Arginin, 0,005m EDTA, 0,005%Tween 80,1,25 millimolar reduziertes Glutathion und 0,25 millimolar oxidiertes Glutathion. Das Volumen von 6,0 Liter wurde berechnet, um einen OD₂₈O-Wert von < 1 zu erreichen. Die Lösung wurde 24 Stunden bei 4°C stehengelassen, um maximale Aktivitätsausbeuten, gemessen durch Fibrinplattentest, zu erreichen. Die Reagentien zum erneuten Falten wurde durch Dialyse bei 4°C gegen (2maliger Wechsel) 60 Liter mit jeweils 0,05 m Natriumphosphat vom pH-Wert 6,8 mit einem Gehalt an 0,005% Tween 80 entfernt. Die Dialyse wurde über Nacht beendet. Sämtliche folgenden Reinigungsstufen wurden bei 4°C durchgeführt.

Die dialysierte Lösung wurde mit 400 ml DE-52-Cellulose (Whatman) im Dialysepuffer äquilibriert. Die Aufschlämmung wurde unter Verwendung eines Büchner-Trichters filtriert. Der Überstand, der nicht-adsorbierte Urokinase enthielt, wurde sofort auf eine mit 100ml (5 χ 5cm) Hydroxylapatit (BioRad) gepackte Säule, die vorher mit dem Dialysepuffer äquilibriert worden war, aufgesetzt. Die Säule wurde mit 0,125 m Natriumphosphat vom pH 6,8 mit einem Gehaltan 0,005% Tween 80 gewaschen. Die Urokinase wurde mit 0,4m Natriumphosphat vom pH-Wert 6,8 mit einem Gehaltan 0,005% Tween 80 el uiert. Der Elutionspool aus der Hydroxylapatitsäule wurde auf etwa 30 ml unter Verwendung eines YM10 Amicon-Filters eingeengt und auf eine mit Sephacryl S-200 gepackte Säule der Abmessungen 2,5 χ 130cm, die mit 0,05 m Natriumphosphat vom pH-Wert 6,8 mit einem Gehaltan 1,0 m Guanidinhydrochlorid und 0,005% Tween 80 äquilibriert worden war, aufgesetzt. Der Urokinase enthaltende Peak wurde gewonnen und gegen das lOOfache Volumen an 0,05m Natriumphosphat vom pH-Wert 7,3 mit einem Gehalt an 0,15m Natriumchlorid und 0,005% Tween 80dialysiert.

Beispiel 4

Aktivität von [Lysi₃₆ -* Δ; PHe₁₅₇LyS₁₅₈ —> A]-Humanurokinase

Urokinase und deren Mutanten wurden an Fibrinplatten getestet (11). Die Fibrinplatten bestanden aus 1,25% Agarose, 4,1 mg/ml Humanfibrinogen, 0,3 Einheiten/ml Thrombin und 0,5/zg/ml Sojabohnen-Trypsininhibitor. Urokinase und deren Mutanten wurden ferner, wie erwähnt, durch das direkte chromogene Substrat S-2444 (Helena Laboratories, Beaumont, Texas) getestet (12). Sämtliche Tests wurden mit dem Urökinase-Standard (Calbiochem) zur Ermittlung von absoluten Aktivitäten verglichen. Die relativen Aktivitäten von [Lys^ -» Δ; Phei5₇Lys₁₅₈ -» A]-humaner rekombinanter Urokinase, rekombinanter nativer HUK (3) und nativer HUK wurden durch den Fibrinplattentest miteinander verglichen. Als Ergebnis wurden folgende Werte erzielt: 96250,126200 bzw. 121 200 Ploug-Einheiten (PU)/mg. Dies zeigt, daß die drei Aminosäuredeletionen die Plasminogenaktivierungsfähigkeitder Urokinasemutante nicht wesentlich modifiziert. 300PU der Mutante enthielten nur 0,76 PU S-2444-chromogene Aktivität. Dies war nur etwa 0,25% der S-2444-Aktivität von nativer Urokinase. Daraus wurde geschlossen, daß die Mutante entweder eine gewisse S-2444-Restaktivität aufwies oder daß eine begrenzte Umwandlung in die zweikettige Form stattgefunden hatte.

Ein Vergleich der Aktivität von Plasmin auf [LySi₃₆ -» Δ; Phei₅₇Lysi₅s -> A]-Humanurokinase und rekombinante, einkettige, native Urokinase wurde durchgeführt. Wurden 0,625 Piasmineinheiten auf 300PU (Fibrinplatte) der Mutante aufgesetzt und 1 Stunde bei 37⁰C inkubiert, so wurde Enzym mit einer S-2444-Aktivität von 10,36PU gebildet, während eine wesentlich geringere Piasminmenge (0,005 Einheiten) bei kürzerer Inkubation (15min) bei 37⁰C mit 50PU rekombinanter, einkettiger, nativer Urokinase Enzym mit einer wesentlich höheren S-2444-Aktivität (~45 PU) ergab. Die spezifischen S-2444-Aktivitäten von zweikettiger und plasmininkubierter, rekombinanter nativer und rekombinanter, mutierter Urokinase werden zu Vergleichszwecken einander gegenübergestellt.

Enzym S-2444-Aktivität (PU χ 10³/mg)

rekombinante einkettige HUK 89,0

zweikettige rekombinante HUK 102,2

zweikettige native HUK 92,7

mutierte, rekombinante einkettige HUK 3,3

Somit ist die Mutante gegen eine Piasminaktivierung wesentlichiweniger empfindlich als das native Molekül.

Bibliographie

1. Gunzler, W.A., et al. The primary structure of high molecular mass urokinase from human urine: The complete amino acid sequence of the A chain. „Hoppe-Seyler'sz. Physiol. Chem. Bd." 363: 1155-1165 (1982).

2. Steffens, G. J., et al. The complete amino acid sequence of low molecular mass urokinase from human urine. „Hoppe-Seyler'sZ. Physiol. Chem. Bd." 363: 1043-1058(1982).

3. EP-A-92182.

4. Wun, T-C, et al. A Proenzyme Form of Human Urokinase. „Journal of Biological Chemistry" 257: 7262-7268 (1982).

5. Nielsen, L. S., et al. Purification of Zymogen to Plasminogen Activator from Human Glioblastoma cells by Affinity Chromatography with Monoclonal Antibody. „Biochemistry" 21: 6410-6415 (1982).

6. U.S. Patent 4381 346.

7. Zamarron et al., Competitive Inhibition by Human Plasma of the Activation of Plasminogen by Pro-Urokinase in „Thrombosis and Haemostasis" 54 (1): abs. 604, ρ ρ 102, (July 14,1985).

8. Heyneker, H. et al., Functional Expression of the human urokinase gene in Escherichia coliin „Genetics of Industrial Microorganisms, 1982, Proceedings of the IVth International Symposium" K. lkeda et al. Eds., pp 214-221 (1983).

9. Adelman, J. et al., In Vitro Deletional Mutagenesisfor Bacteial Production of the 20,000-Dalton Form of Human Pituitary Growth Hormone. „DNA" 2 (3): 183-193 (1983).

10. Winter, G. et al.. Redesigning Enzyme Structure by Site-directed Mutagenesis: Tyrosyl tRNA Synthetase and ATP Binding. „Nature" 290: 756-758 (1982).

11. Ploug, J. et al., Urokinase: An activator of plasminogen from human urine. I. Isolation and Porperties. „Biochim. Biophys. Acta" 24: 278-282 (1957).

12. Hayashi, S. et al., Assay of urokinase activity in plasma with a chromogenic substrate. „Thrombosis Research" 22: 573-578 (1981).

13. Grayetal. „Bio/Technology" 2:161-165(February 1984).

14. Sutcliff, Cold Spring Harbor Symposium on Quantitative Biology, 43: 77 (1979).

15. Goeddel, D., et al., „Nature" 287: 411(1980).

16. Crea et al., „Proc. Nat. Acad. Sei. USA" 75: 5765 (1978).

17. Bukhari,etal., „J. Bacteriology" 105: 844(1971).

18. Naloyetal., „J. Bacteriology" 145:1110 (1981).

19. Kleckneretal., „J. MoI. Biol." 116: 125(1977).

20. Kleckneretal., „Genetics" 90: 427 (1978).

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von protease-resistenter einkettiger Urokinase, gekennzeichnet dadurch, daß man

I. (a) Nucleinsäure bereitstellt, die für eine Protease-resistente Aminosäuresequenzvariante von

einkettiger Urokinase kodiert,

(b) eine Wirtszelle mit der Nucleinsäure von Stufe (a) transformiert,

(d) die Urokinasevariante aus der Kultur gewinnt, oder

II. einkettige Urokinase an der Kettenumwandlungsstelle und vorzugsweise an der LUK-Stelle durch Umsetzung mit einer derivatisierenden Verbindung so modifiziert, daß das Enzym gegen proteolytische Spaltung weniger empfindlich wird.

2. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß man als Wirtszelle eine prokariontische Zelle verwendet.

3. Verfahren nach Punkt 2, gekennzeichnet dadurch, daß man die Urokinase aus der Kultur gewinnt, indem man

(a) refraktile Körper mit einem Gehalt an einkettiger Urokinase erntet,

(b) die Urokinase in den refraktilen Körpern in Lösung bringt,

(c) unerwünschte Proteine an einem Kationenaustauscherharz adsorbiert,

(d) die in Lösung gebrachte Urokinase an Hydroxylapatit adsorbiert und

(e) die Urokinase vom Hydroxylapatit eluiert.

4. Verfahren nach Punkt 2, gekennzeichnet dadurch, daß man die Urokinase nach einem Verfahren gewinnt, das weder die Anwendung eines exogen zugesetzten Proteolyseinhibitors noch von Benzamidin-sepharose umfaßt.

5. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß man Urokinase mit einer Resistenz gegen bakterielle Proteasen herstellt.

6. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß man Urokinase mit Resistenz gegen Plasmin herstellt.

7. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß man einkettige Urokinase herstellt, die gegen proteolytische Umwandlung in zweikettige Urokinase resistent ist.

8. Verfahren nach Punkt 7, gekennzeichnet dadurch, daß man Urokinase mit einer Aminosäuresequenzvariante herstellt.

9. Verfahren nach Punkt 8, gekennzeichnet dadurch, daß man Urokinase mit einer Deletionsmutation herstellt.

10. Verfahren nach Punkt 8, gekennzeichnet dadurch, daß es sich bei der Urokinase um Humanenzym handelt und die Variation eine mutierte Aminosäuresequenz etwa im Bereich der Reste Arg₁₅₆ bis LyS₁₅₈ umfaßt.

11. Verfahren nach Punkt 10, gekennzeichnet dadurch, daß es sich bei der Urokinase um [Peh₁₅₇Lysi58 -» A]-Urokinase handelt.

12. Verfahren nach Punkt 10, gekennzeichnet dadurch, daß die Variation ferner eine mutierte Aminosäuresequenz etwa im Bereich der Reste LyS₁₃₅ bis Lysi₃₆ umfaßt.

13. Verfahren nach Punkt 7, gekennzeichnet dadurch, daß man eine protease-resistente einkettige Urokinase herstellt, die bei Inkubation mit Humanplasmin mit einer solchen Geschwindigkeit in zweikettige Urokinase übergeführt wird, die weniger als etwa 10% der Umwandlungsgeschwindigkeit von nativer einkettiger Urokinase entspricht.

14. Verfahren nach Punkt I₁ gekennzeichnet dadurch, daß man eine Protease-resistente Urokinase herstellt, die gegen proteolytische Umwandlung in zweikettige Urokinase weniger empfindlich als native einkettige Urokinase ist.

15. Verfahren nach Punkt 7, gekennzeichnet dadurch, daß die Variante ausfolgender Gruppe ausgewählt wird: [Phe₁₅₇Lys₁₅₈->A]-Humanurokinase, [PhCi₅₇LyS₁₅₈-LySi₃₅-^ A]-Humanurokinase, [Arg₁₅₈]-Humanurokinase, [His₁₅₈]-Humanurokinase, [Gly₁₅₈]-Humanurokinase, [Ser₁₅₈]-Humanurokinase, [Tyr₁₅₈]-Humanurokinase, [Argi₅₆ —> His; LyS₁₅₈ —> Ser]-Humanurokinase, [Arg₁₅₆Lys₁₅₈ -» A]-Humanurokinase, [Argi₅₆Phei₅₇Lysi₅₈ —> A]-Humanurokinase, [LySi₅₈IIe₁₅₉ -» Lys₁₅₈Pro Ile₁₅₉]-Humanurokinase, [Phe₁₅₇Lys₁₅₈ -» Δ; Arg₁₅₆ -» His]-Humanurokinase und [Arg₁₅₆Phei₅₇ —> Δ; Lysi₅₈ -» Gly]-Humanurokinase.

16. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß man eine Zusammensetzung herstellt, die die Urokinase in therapeutisch wirksamer Konzentration in einem pharmakoiogisch verträglichen Träger enthält.

17. Verfahren nach Punkt 16, gekennzeichnet dadurch, daß die Urokinasekonzentration etwa 10000 bis75000IU/ml beträgt.

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