DE4443273A1 - Verwendung der Proteasedomäne von humanem Plasminogenaktivator zur Behandlung von thromboembolischen Erkrankungen - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft die Verwendung der Proteasedomäne von humanem Plasminogenakti­ vator zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von thromboembolischen Erkran­ kungen und pharmazeutische Zusammensetzungen, welche dieses Protein als aktive Kompo­ nente enthalten.

Gewebsplasminogenaktivator (t-PA) ist eine aus mehreren Domänen bestehende Serinprotea­ se, welche die Umwandlung von Plasminogen in Plasmin katalysiert und zur fibrinolytischen Therapie verwendet wird.

Es sind eine Vielzahl von t-PA-Varianten und Mutationen bekannt, vgl. beispielsweise die Übersichtsartikel T.J.R. Harris (1987) (1) und J. Krause (1988) (2).

Unter anderem ist bekannt, daß die Fibrinolyse teilweise durch die Interaktion zwischen t-PA und Plasminogenaktivator-Inhibitor 1 (PAI-1, ein Serinprotease-Inhibitor aus der Serpinfami­ lie) reguliert wird. Die Bindung von PAI-1 an t-PA erfolgt im wesentlichen über die Ami­ nosäuren 296-302. Eine Mutation dieses Bereichs vermindert den inhibitorischen Einfluß von PAI-1 auf t-PA (E.L. Madison et al. (1990) (3)). Zum Mechanismus der Interaktion zwischen dem Aminosäurebereich 296-302 von t-PA mit PAI-1 wurden umfangreiche Untersuchungen durchgeführt (vgl. auch E.L. Madison, Nature 339 (1989) 721-723 (4), R.V. Schohet, Thrombosis and Haemostasis 71 (1994) 124-128 (S), C.J. Refino, Thrombosis and Haemost­ asis 70 (1993) 313-319 (6), N.F. Paoni, Protein Engineering 6 (1993) 529-534 (7) und Thrombosis and Haemostasis 70 (1993) 307-312 (8), W.F. Bennett, J. Biol. Chem. 266 (1991) 5191-5201 (9), D. Eastman, Biochemistry 31 (1992) 419-422 (10).

Nicht modifizierter t-PA besteht in seiner im Plasma vorkommenden Form aus 527 Aminosäu­ ren und kann durch Plasmin in zwei Ketten, die dann noch über eine Disulfidbrücke zusam­ mengehalten werden, gespalten werden. Die A-Kette (auch schwere Kette genannt) besteht aus vier strukturellen Domänen. Die Fingerdomäne (Aminosäuren 1-49) zeigt gewisse Ähn­ lichkeiten mit den Fingerstrukturen in Fibronektin. Die Growth-Factor-Domäne (Aminosäuren 50-86) ist in gewissem Umfang homolog zu murinen und humanen epidermalen Wachstums­ faktoren. Die beiden Kringledomänen (Aminosäuren 87-175 und 176-262) sind im großen Umfang homolog zur vierten und fünften Kringledomäne von Plasminogen. Die Finger- und Kringle-2-Domänen von t-PA sind in der Fibrinbindung und in der Stimulation der proteolyti­ schen Aktivität durch Fibrin besonders involviert. Die B-Kette von t-PA (Aminosäuren 276- 527, Proteasendomäne) ist eine Serinprotease und weitgehend homolog zu den B-Ketten von Urokinase und Plasmin (T.J.R. Harris (1987) (1) und J. Krause (1988) (2).

tPA-Varianten, bei deren Anwendung verminderte Blutungsnebenwirkungen auftreten, sind in der WO 93/24635 (11) und von B.A. Keyt et al., P.N.A.S. USA 91 (1994) 3670-3674 be­ schrieben. Diese t-PA-Varianten besitzen eine zusätzliche Glykosylierungsstelle an den Ami­ nosäurepositionen 103-105. Zusätzlich können diese t-PA-Varianten eine Modifikation an den Aminosäuren 296-302 aufweisen, wodurch die Fibrinspezifität erhöht wird.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, t-PA-Derivate zur Verfügung zu stellen, die bei der Anwendung, im Vergleich zu den bekannten Plasminogenaktivatoren, weiter verminderte Blutungsnebenwirkungen zeigen.

Die Aufgabe der Erfindung wird gelöst durch die Verwendung eines thrombolytisch aktiven Proteins zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von thromboembolischen Er­ krankungen, wobei das Protein als einzige die thrombolytische Aktivität bewirkende Struktur die Proteasendomäne des humanen Gewebsplasminogenaktivators enthält. Vorzugsweise besteht das Protein aus den wesentlichen Teilen der Proteasendomäne.

Unter den wesentlichen Teilen der Domänen sind die Aminosäurebereiche zu verstehen, wel­ che für die biologische Wirksamkeit des Plasminogenaktivators erforderlich sind. Besonders bevorzugt besitzt das Protein die Sequenz der Aminosäuren 276-527 von t-PA. Ebenso geeignet sind Proteasenderivate, bei denen die Aminosäuresequenz durch Deletion, Mutation oder Addition verändert ist, solange Umfang von Fibrinbindung und plasminogenolytische Aktivität in vitro nicht wesentlich verändert werden.

Derartige Plasminogenaktivatoren zeigen eine geringe Fibrinbindung und eine sehr geringe plasminogenolytische Aktivität in vitro (Bestimmung nach Verheÿen, J. et al. Thromb. Hae­ mostas. 48 (1982), 266-269) und sind deshalb bisher nicht als geeignete thrombolytische Therapeutica in Betracht gezogen worden. Überraschenderweise zeigt sich jedoch bei der Anwendung in vivo ein deutlich vermindertes Blutungsrisiko gegenüber den bekannten Plasminogenaktivatoren und eine hohe Aktivität.

Die Fibrinbindung der Protease kann bestimmt werden in einem Fibrinbindungstest, wobei zur Durchführung des genannten Fibrinbindungstests zu einer Lösung des genannten Proteins und 1,2 mg/ml Fibrinogen in Pufferlösung (Veronal® 15 mmol/l, NaCl 28 mmol/l, CaCl₂ 0,5 mmol/l, ngl 2 0,2 mmol/l, Tris HCl 5 mmol/l und 0,005% (v/v) Tween® 80, pH 7,75) Thrombin in einer Endkonzentration von 2,5 NIH Einheiten/ml zugegeben werden, nach drei Minuten bei 25°C die gebildeten Fibrinclots bei 12 000 g in 8 Minuten abzentrifugiert werden und die Menge des im Überstand verbliebenen thrombolytisch aktiven Proteins photometrisch bestimmt wird.

Beispielsweise zeigt das Protein in einem Kaninchenmodell der Halsvenenthrombolyse in einer Dosis von 1 mg/kg Protein einen um mindestens 50% reduzierten Blutverlust im Vergleich zu humanem Gewebsplasminogenaktivator, wenn in der Halsvene ein radioaktiv markierter Thrombus erzeugt wird, anschließend 100 IU/kg Heparin subkutan und eine intravenöse Einmalbolusinjektion von 1 mg/kg Protein verabreicht wird und die Blutung analog J. Clin. Invest 71 (1993), 368-376 bestimmt wird.

Es ist damit möglich, durch Verwendung der Protease unter Beibehaltung eines therapeutisch relevanten thrombolytischen Effektes die Blutungsnebenwirkung zu mehr als 50% klinisch signifikant zu verringern, ohne bei einer Dosissteigerung diese vorteilhatte Eigenschaft zu ver­ lieren.

Die Protease ist ein thrombolytisch aktives Protein, das im Gegensatz zu t-PA (Alteplase®) für die Verabreichung als i.v. Bolus-Injektion geeignet ist, dafür mit einer geringeren Dosis auskommen kann und praktisch die gleiche thrombolytische Wirkung wie die klinisch übliche Infusion von Alteplase erreicht. Überraschenderweise ist die Therapie mit der Protease mit weniger als 50% des bei Alteplase üblichen Blutverlustes verbunden. Diese Eigenschaft hat große Bedeutung für die Verbesserung des Sicherheitsprofils neuer thrombolytisch aktiver Substanzen, da es die sonst bei Thrombolytika, wie z. B. Alteplase, übliche Blutungsnebenwir­ kung verringert. Die Daten der aPTT-Messung deuten außerdem daraufhin, daß die Protease die im Blut für die normale Gerinnung notwendigen Proteine bei einer effektiven Dosis nicht gespalten hat, da die aPTT Werte zwischen den Gruppen sehr vergleichbar waren. Bei höhe­ ren Dosen kann der fibrinogensparende Effekt allerdings verlorengehen, ohne daß dies aber Auswirkungen auf die Verringerung der Nebenwirkungen hätte. Im Gegenteil, die Verringe­ rung des Blutverlustes ist nicht mit der Fibrinspezifität verbunden und auch nicht mit der Dosis gekoppelt.

Die Verringerung der Blutungsnebenwirkung macht die Protease zu einem außerordentlich wertvollen Thrombolytikum für die Behandlung aller thromboembolischen Erkrankungen. Im Gegensatz zu den bisher nur bei äußerst lebensbedrohlichen Erkrankungen wie Herzinfarkt und massiver Lungenembolie zugelassenen Thrombolytika, eröffnet die Benutzung der Protea­ se die Möglichkeit, die Thrombolyse durch die Protease auch bei weniger akut lebensbedrohli­ chen Erkrankungen, wie z. B. tiefe Beinvenenthrombose, einzusetzen. Darüberhinaus kann die Verwendung von Thrombolytika auf Basis der Protease als wirksame t-PA-Domäne nun viel breiter als bisher erfolgen, da ein Haupthinderungsgrund für den weitverbreiteten Einsatz die Gefahr der Blutungskomplikationen war. Unabhängig davon, kann die Protease vorteilhaft auch bei akuten Erkrankungen, wie Herzinfarkt oder Lungenembolie, angewendet werden.

Die Herstellung der erfindungsgemäß verwendeten t-PA-Varianten kann nach den dem Fach­ mann geläufigen Methoden in eukaryontischen oder prokaryontischen Zellen erfolgen. Vor­ zugsweise werden die erfindungsgemäßen Verbindungen gentechnologisch hergestellt. Ein derartiges Verfahren ist beispielsweise in der WO 90/09437 (25), EP-A 0297 066 (26), EP-A 0 302456 (27), EP-A 0245 100 (28) und EP-A 0400 545 (29), welche Gegenstand der Offenbarung für derartige Herstellverfahren sind, beschrieben. Mutationen können durch "oligonucleotide-directed site-specific mutagenesis" in die cDNA von t-PA oder einem Derivat davon eingeführt werden. Die "site-specific mutagenesis" ist beispielsweise von Zoller und Smith (1984) (12), modifiziert nach T.A. Kunkel (1985) (13) und Morinaga et al. (1984) (19) beschrieben. Ebenso geeignet ist das Verfahren der PCR-Mutagenese, welches beispielsweise in Ausubel et al. (1991) (30) beschrieben ist.

Die auf diese Weise erhaltene Nukleinsäure dient zur Expression des erfindungsgemäß ver­ wendeten t-PA-Derivats, wenn sie auf einem für die verwendete Wirtszelle geeigneten Expressionsvektor vorhanden ist.

Die Nukleinsäuresequenz des erfindungsgemäßen Proteins kann zusätzlich noch modifiziert sein. Derartige Modifikationen sind beispielsweise:

Veränderung der Nukleinsäuresequenz, um verschiedene Erkennungsse­ quenzen von Restriktionsenzymen zur Erleichterung der Schritte der Ligation, Klonierung und Mutagenese einzuführen
Veränderung der Nukleinsäuresequenz zum Einbau von bevorzugten Codons für die Wirtszelle
Ergänzung der Nukleinsäuresequenz, um zusätzliche Regulations- und Transkriptionselemente, um die Expression in der Wirtszelle zu optimie­ ren.

Alle weiteren Verfahrensschritte zur Herstellung von geeigneten Expressionsvektoren und zur Expression sind Stand der Technik und dem Fachmann geläufig. Beschrieben sind derartige Methoden beispielsweise bei Sambrook et al. (1989) (14).

Die Herstellung der erfindungsgemäß verwendeten glykosylierten t-PA-Derivate erfolgt in eukaryontischen Wirtszellen. Die Herstellung der erfindungsgemäß verwendeten, nicht glyko­ sylierten t-PA-Derivate erfolgt entweder in eukaryontischen Wirtszellen, wobei das dabei zunächst gewonnene glykosylierte Produkt durch dem Fachmann geläufige Methoden degly­ kosyliert werden muß, oder vorzugsweise durch Expression in nicht glykosylierenden Wirts­ zellen, besonders bevorzugt in prokaryontischen Wirtszellen.

Als prokaryontische Wirtsorganismen sind beispielsweise E. coli, Streptomyces spec. oder Bacillus subtilis geeignet. Zur Herstellung der erfindungsgemäßen Protein werden die Pro­ karyontenzellen in üblicher Weise fermentiert und nach Aufschluß der Bakterien das Protein in üblicher Weise isoliert. Falls das Protein in inaktiver Form (Inclusion Bodies) anfällt, wird es nach den dem Fachmann geläufigen Verfahren solubilisiert und naturiert. Ebenso ist es nach den dem Fachmann geläufigen Methoden möglich, das Protein als aktives Protein aus den Mikroorganismen zu sekretieren. Ein hierfür geeigneter Expressionsvektor enthält vorzugs­ weise eine Signalsequenz, die für die Sekretion von Proteinen in den verwendeten Wirtszellen geeignet ist, und die Nukleinsäuresequenz, welche für das Protein codiert. Das mit diesem Vektor exprimierte Protein wird dabei entweder in das Medium (bei gram-positiven Bakte­ rien) oder in den periplasmatischen Raum (bei gram-negativen Bakterien) sekretiert. Zwischen der Signalsequenz und der für das erfindungsgemäße t-PA-Derivat codierenden Sequenz ist zweckmäßig eine Sequenz enthalten, die für eine Spaltstelle codiert, die entweder bei der Prozessierung oder durch Behandlung mit einer Protease die Abspaltung des Proteins erlaubt.

Die Auswahl des Basisvektors, in den die für das erfindungsgemäße t-PA-Derivat codierende DNA-Sequenz eingebracht wird, ist abhängig von den später zur Expression verwendeten Wirtszellen. Geeignete Plasmide sowie die Minimalanforderungen, die an ein derartiges Plasmid gestellt werden (z. B. Replikationsursprung, Restriktionsschnittstellen), sind dem Fachmann geläufig. Im Rahmen der Erfindung können auch anstelle eines Plasmids ein Cosmid, die replikative doppelsträngige Form von Phagen (λ, M13) oder andere dem Fach­ mann bekannte Vektoren verwendet werden.

Bei der Herstellung der erfindungsgemäßen t-PA-Derivate in Prokaryonten ohne Sekretion ist es bevorzugt, die sich bildenden Inclusion Bodies von den löslichen Zellpartikeln abzutrennen, die t-PA enthaltenden Inclusion Bodies durch Behandlung mit Denaturierungsmitteln unter reduzierenden Bedingungen zu solubilisieren, anschließend mit GSSG zu derivatisieren und das t-PA-Derivat durch Zugabe von GSH und von Denaturierungsmitteln in nicht denaturie­ render Konzentration oder von L-Arginin zu renaturieren. Derartige Verfahren zur Aktivie­ rung von t-PA und Derivaten aus Inclusion Bodies sind beispielsweise in der EP-A 0 219 874 (15) und EP-A 0241 022 (16) beschrieben. Es können jedoch auch andere Verfahren zur Gewinnung des aktiven Proteins aus den Inclusion Bodies verwendet werden.

Vorzugsweise erfolgt die Aufreinigung der erfindungsgemäßen t-PA-Derivate in Anwesenheit von L-Arginin, insbesondere bei einer Arginin-Konzentration von 10-1000 mmol/l.

Die Abtrennung von Fremdproteinen erfolgt vorzugsweise durch Affinitätschromatographie und besonders bevorzugt über eine Adsorbersäule, an der ETI (Erythrina trypsin Inhibitor) immobilisiert ist. Als Trägermaterial wird beispielsweise Sepharose® verwendet. Die Reini­ gung über eine ETI-Adsorbersäule hat den Vorteil, daß das ETI-Adsorbersäulenmaterial direkt aus dem konzentrierten Renaturierungsansatz sogar in Gegenwart von so hohen Argi­ ninkonzentrationen wie 0,8 mol/l Arginin beladen werden kann. Vorzugsweise erfolgt die Reinigung der erfindungsgemäßen Plasminogenaktivatoren über eine ETI-Adsorbersäule in Gegenwart von 0,6-0,8 mol/l Arginin. Die dabei verwendete Lösung hat vorzugsweise einen pH von über 7, besonders bevorzugt zwischen 7,5 und 8,6.

Die Elution der erfindungsgemäß verwendeten t-PA-Derivate von der ETI-Säule erfolgt durch pH-Erniedrigung sowohl in Gegenwart als auch in Abwesenheit von Arginin unter Bedingun­ gen, in denen die erfindungsgemäß verwendeten tPA-Derivate gut löslich sind. Vorzugsweise liegt dabei der pH-Wert im sauren Bereich, besonders bevorzugt zwischen pH 4,0 und 5,5. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend ein thrombolytisch aktives Protein, wobei das Protein als die einzige die thrombolytische Aktivität bewirkende Struktur die Proteasendomäne des humanen Gewebsplasminogenaktivators ent­ hält.

Die erfindungsgemäß verwendeten t-PA-Varianten können zur Herstellung von Therapeutika in einer dem Fachmann geläufigen Weise formuliert werden, wobei die erfindungsgemäßen Verbindungen üblicherweise mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger kombiniert wer­ den. Solche Zusammensetzungen enthalten typischerweise eine effektive Menge von 0,3- 7 mg/kg, vorzugsweise 0,7-5 mg/kg und besonders bevorzugt 1-3 mg/kg Körpergewicht als Dosis. Die therapeutischen Zusammensetzungen liegen üblicherweise als sterile, waßrige Lö­ sungen oder sterile, lösliche Trockenformulierungen wie Lyophilisate vor. Die Zusammenset­ zungen enthalten üblicherweise eine geeignete Menge eines pharmazeutischen akzeptablen Salzes, mit der eine isotonische Lösung hergestellt wird. Weiter können Puffer wie Arginin­ puffer, Phosphatpuffer zur Stabilisierung eines geeigneten pH-Wertes (vorzugsweise 5,5-7,5) verwendet werden. Die Höhe der Dosierung der erfindungsgemäßen Verbindungen ist durch jeden Fachmann ohne weiteres zu ermitteln. Sie hängt beispielsweise ab von der Art der Anwendung (Infusion oder Bolus) und der Dauer der Therapie. Aufgrund ihrer verlängerten Halbwertszeit sind die erfindungsgemäßen Verbindungen besonders geeignet für eine Bolusanwendung (Einmalbolus, Mehrfachbolus). Eine geeignete Form für eine Bolusanwen­ dung ist beispielsweise eine Ampulle, welche 25-1000 mg erfindungsgemäße Verbindung, Arginin und Puffer enthält. Die Anwendung erfolgt vorzugsweise intravenös, aber auch subku­ tan, intramuskulär oder intraarteriell. Ebenso kann die Protease infundiert oder lokal appliziert werden.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können als Mehrfachbolus (vorzugsweise als Doppel­ bolus) angewendet werden. Geeignete Zeitintervalle sind zwischen 20 und 180 Minuten, besonders bevorzugt ist ein Intervall zwischen 30 und 90 Minuten und ganz besonders ist ein Intervall zwischen 30 und 60 Minuten bevorzugt. Es hat sich jedoch gezeigt, daß die Protease überraschenderweise auch bei einer Einmalbolusanwendung ausreichend wirksam ist. Vorzugsweise liegt dabei die Dosis bei ca. 1 mg/kg.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen eignen sich insbesondere zur Behandlung von allen thromboembolischen Erkrankungen, wie z. B. akuter Herzinfarkt, Hirninfarkt, Lungenembolie, tiefe Beinvenenthrombose, akuter arterieller Verschluß usw. Besonders bevorzugt werden die erfindungsgemäßen Verbindungen zur Behandlung von subchronischen thromboembolischen Erkrankungen, bei denen eine längere Thrombolyse durchgeführt werden muß, angewendet.

Es ist bevorzugt, die erfindungsgemäßen Verbindungen in Kombination mit einem Hemmstoff der Gerinnung (Antikoagulans), wie z. B. Heparin oder Hirudin und/oder einem Hemmstoff der Plättchenaggregation anzuwenden, wodurch die Gefäßöffnungswirkung bei geringen Nebenwirkungen gesteigert wird. Ebenso bevorzugt ist der Zusatz von durchblutungsfördern­ den Stoffen oder die Mikrozirkulation verbessernde Stoffe.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter.

Beispiel 1 Expression in E.coli a) Konstruktion des Expressionsplasmids

Das Ausgangsplasmid pA27fd, beschrieben in EP 0 382 174, enthält die folgenden Kom­ ponenten: tac-Promotor, lac-Operator-Region mit einem ATG-Startcodon, die kodieren­ de Region für das t-PA-Derivat, bestehend aus der Kringel2-Domäne und der Protease- Domäne, und den fd-Transkriptionsterminator; der Ausgangsvektor stellt das Plasmid pKK223-3 dar.

Zur Deletion der für die Kringel2-Domäne kodierenden Sequenz (Deletion der Aminosäu­ repositionen 176-261; Zählung der Aminosäuren gemäß Pennica et al. 1983, Nature 301 : 214) wurde im wesentlichen die Methode von Morinaga et al. (1984, Biotechnology 21 : 634) durchgeführt. Für die Mutagenese wurde das folgende Oligonukleotid synthetisch hergestellt:

5′ CAGAATTCTTATGTCTTACCAATCCACCTGCGGCCTGAGACAG 3′

Die Heteroduplexbildung wurde, wie in EP 0 382 174 beschrieben, vorgenommen. Der Heteroduplexansatz wurde zusammen mit dem Plasmid pUBS520 (Brinkmann et al. 1989, Gene 85 : 109) in E.coli C600+ transformiert. Die Transformanten wurden durch Zugabe von Ampicillin und Kanamycin (jeweils 50 µg/ml) zum Nährmedium selektioniert. Das erhaltene Plasmid wurde mit pA27Protease bezeichnet; es unterscheidet sich vom Ausgangsplasmid durch das Fehlen einer EcoRI-Schnittstelle.

b) Expression in E.coli

Zur Überprüfung der Expressionsleistung wurde der E.coli Stamm C600+ mit den Plas­ miden pA27Protease und pUBS520 in LB-Medium (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor) in Gegenwart vom Ampicillin und Kanamycin (jeweils 50 µg/ml) bis zu einer OD bei 550 nm von 0.4 angezüchtet. Die Expression wurde durch Zu­ gabe von 5 mmol/1 IPTG initiiert. Die Kultur wurde für weitere 4 Stunden inkubiert. Im Anschluß daran wurden die E.coli Zellen durch Zentrifugation gesammelt und in Puffer resuspendiert (50 mmol/l Tris-HCl pH g, 50 mmol/l EDTA); durch Beschallung wurde die Lyse der Zellen herbeigeführt. Durch erneute Zentrifugation wurden die unlöslichen Pro­ teinfraktionen gesammelt und in oben genannten Puffer durch Beschallung resuspendiert. Die Suspension wurde mit 1/4 Volumen Auftragspuffer (250 mmol/l Tris-HCl pH 6.8, 10 mmol/l EDTA, 5% SDS, 5% Mercaptoethanol, 50% Glycerin und 0.005% Bromphe­ nolblau) versetzt und mit Hilfe eines 12.5% SDS-Polyacrylamidgels analysiert. Als Kon­ trolle wurde die gleiche Präparation mit einer Kultur von E.coli mit den beiden o. g. Plasmiden, die nicht mit IPTG induziert worden war, durchgeführt und im Gel aufge­ trennt. In der Präparation der IPTG-induzierten Kultur kann man, nach Anfärben des Gels mit Coomassie Blue R250 (gelöst in 30% Methanol und 10% Essigsäure), eine deutliche Bande mit einem Molekulargewicht von etwa 30 kD erkennen; diese Bande ist in der Kontrollpräparation nicht vorhanden.

Beispiel 2 In vivo Charakterisierung der Protease von rPA

Zur Prüfung der thrombolytischen Potenz und Effizienz wurde das von D. Collen etablierte Kaninchenmodell der Halsvenenthrombolyse angewandt (J. Clin. Invest. 1983; 71: 368-376). Dabei wurde bei den Tieren in der Halsvene ein radioaktiv markierter Thrombus erzeugt. Die Tiere wurden mit 100 IU/kg Heparin subcutan antikoaguliert. Alteplase (rekominanter Gewe­ be-Plasminogenaktivator, kommerziell erhältlich als Actilyse® von der Firma Thomae, Biberach, Deutschland), die Protease von rPA, Streptokinase (kommerziell erhältlich als Streptase® von der Behring, Marburg, Deutschland) oder Lösungsmittel (0,2 M Argininphos­ phat Puffer) wurden den Kaninchen intravenös verabreicht:
Die Placebo-Gruppe erhielt eine intravenöse Einmalbolus-Injektion von 1 ml/kg Lösungsmit­ tel. Die Alteplase-Gruppe erhielt eine Gesamtdosis von 1,45 mg/kg intravenös verabreicht, davon 0,2 mg/kg als Anfangsbolusinjektion, 0,75 mg/kg als 30-minütige Infusion, direkt gefolgt von 0,5 mg/kg als 60-minütige Dauerinfusion (Gesamtinfusion: 90 min). Die Strepto­ kinase-Gruppe erhielt eine 60-min intravenöse Innfusion von 64 000 IU/kg. Die Protease- Gruppe erhielt eine intravenöse Einmalbolus-Injektion von 1 mg/kg oder 2 mg/kg.

Zwei Stunden nach Beginn der Therapie wurde der Restthrombus entfernt, und das Ausmaß der Thrombusauflösung (Thrombolyse) mittels der Abnahme der Radioaktivität im Thrombus bestimmt. Blutproben zur Gewinnung von Plasma wurden vor Therapie und 2 h nach Thera­ piebeginn abgenommen und die aktivierte Thromboplastinzeit mit einem Testkit (Bestell-Nr.: 126 551, Boehringer Mannheim (GmbH, Mannheim, Deutschland) gemessen. Außerdem wurde der Blutverlust aufgrund der thrombolytischen Therapie quantifiziert. Hierzu wurde den Tieren auf dem Oberschenkel mit Hilfe einer Schablone und eines Skalpels ein definierter Hautschnitt von 4 cm Länge und 0,3 cm Tiefe vor Gabe der Thrombolytika zugefügt. Die dabei entstehende Blutung kam spontan durch die natürliche Gerinnung zum Stillstand. Nach Beginn der Therapie wurde auf die Wunde ein Schwamm gelegt, der das Blut aus der durch die Thrombolyse neu ausgebrochenen Blutung aufsog. Durch Wiegen des Schwammes (nach Abzug des Eigengewichtes) kann man die Menge des ausgetretenen Blutes messen und so das Ausmaß der Blutungsnebenwirkung beschreiben.

Ergebnisse

Eine Zusammenfassung der Ergebnisse ist der nachfolgenden Tabelle zu entnehmen

Sowohl Alteplase als auch die Protease von rPA sind thrombolytisch hoch aktive Substanzen und lösten im Vergleich zur Lösungsmittel-Kontrolle die Thromben signifikant auf; unterschie­ den sich dabei aber nicht signifikant voneinander. Dabei genügte als effektive Dosis der Pro­ tease nur 1 mg/kg statt 1,45 mg/kg bei Alteplase und damit 31% weniger. Die bei Alteplase angewandte Dosis und Verabreichungsweise (dreistufige Infusion) entspricht der in der Klinik bei der Behandlung des Herzinfarktes üblichen Dosis und Verabreichungsweise (siehe GUSTO-Studie: N Engl J Med 1993; 329 : 673-82). Vorteilhaft ist nicht nur die geringere Dosis zur Erzielung eines therapeutisch relevanten Effektes, nämlich der Auflösung von Thromben, sondern auch die Möglichkeit, mit einer Einmalbolusinjektion diesen Effekt zu erreichen, der bei Alteplase nicht möglich ist.

Außerordentlich wichtig ist aber die überraschende Beobachtung eines höchstens halb so großen (46,8%) Blutverlustes unter Therapie mit 1 mg/kg Protease, bzw. eines sogar um 71 % geringeren Blutverlustes bei der höheren Protease-Dosis von 2 mg/kg im Vergleich mit der Standardtherapie mit Alteplase. Gegenüber Streptokinase ist dieser Unterschied noch viel deutlicher. Besonders auffällig ist, daß der Blutverlust bei Alteplase und Streptokinase auftritt, ohne daß die aPTT deutlich verlängert ist, was daraufhin weist, daß in vivo keine nennens­ werte Fibrinogenspaltung stattgefunden hat. Dagegen findet sich bei der höheren Protease- Dosis durchaus eine aPTT-Verlängerung, allerdings ohne daß dies irgendeinen negativen Einfluß auf die Blutungsneigung hätte.

Beispiel 3 Vergleich der Clot-Lyse-Aktivität von t-PA und rekombinanter Protease

t-PA und rekombinante Protease wurden mit Puffer auf die in der Tabelle und in den Abbil­ dungen angegebenen Konzentrationen eingestellt und ihre Aktivität im Clot-Lyse-Assay bestimmt.

Durchführung des Clot-Lyse Assays

Die Probe wird durch Zugabe von Puffer (0,06 M Na₂HPO₄, pH 7,4, 5 mg/ml BSA (Rinderserumalbumin), 0,01% Tween®) auf die jeweils benötigte Proteinkonzentration ein­ gestellt. 0,1 ml der Probe werden mit 1 ml Human Fibrinogen-Lösung (IMCO) (2 mg/ml 0,006 M Na₂HPO₄, pH 7,4, 0,5 mg/ml BSA, 0,01% Tween 80®) gemischt und 5 min bei 37°C inkubiert. Anschließend werden je 100 µl einer Plasminogen-Lösung (10 CU/ml 0,06 M Na₂HPO₄/H₃PO₄, pH 7,4, 0,5 mg/ml BSA, 0,01% Tween 80®) und einer Thrombin-Lösung (30 U/ml 0,06 M Na₂HPO₄, pH 7,4, 0,5 mg/lm BSA, 0,01% Tween 80) hinzugegeben und der Testansatz erneut bei 37°C inkubiert. Nach 2 min wird eine Teflon®-Kugel auf den Fibrin- Clot aufgelegt und die Zeit gestoppt, bis zu der die Kugel den Boden des Test-Röhrchens erreicht hat.

Referenzliste

• (1) T.J.R. Harris, Protein Engineering 1 (1987) 449-459
• (2) J. Krause, Fibrinolysis 2 (1988) 133-142
• (3) E.L. Madison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (1990) 3530-3533
• (4) E.L. Madison, Nature 339 (1989) 721-723
• (5) R.V. Schohet, Thrombosis and Haemostasis 71 (1994) 124-128
• (6) C.J. Refino, Thrombosis and Haemostasis 70 (1993) 313-319
• (7) N.F. Paoni, Protein Engineering 6 (1993) 529-534
• (8) Thrombosis and Haemostasis 70 (1993) 307-312
• (9) W.F. Bennett, J. Biol. Chem. 266 (1991) 5191-5201
• (10) D. Eastman, Biochemistry 31 (1992) 419-422)
• (11) WO 93/24635
• (12) Zoller und Smith, DNA 3 (1984) 479-488
• (13) T.A. Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985) 488-492
• (14) Sambrook et al., "Expression of cloned genes in E. coli" in Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA
• (15) EP-A 0 219 874
• (16) EP-A 0 241 022
• (17) EP-A 0 382 174
• (18) Pennica et al., Nature 301 (1983) 214-221
• (19) Morinaga et al., Biotechnology 21 (1984) 634
• (20) Brinkmann et al., Gene 85 (1989) 109-114
• (21) D. Collen, J. Clin. Invest. 71 (1983) 368-376
• (22) EP-A 0 373 965
• (23) H. Lili et al., ZGJMAL 42 (1987) 478-486
• (24) Martin et al., Thromb Res 62 (1991) 137-146
• (25) WO 90/09437
• (26) EP-A 0 297 066
• (27) EP-A 0 302 456
• (28) EP-A 0 245 100
• (29) EP-A 0 400 545
• (30) Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, eds. Greene Publ. Assoc. and Wiley Interscience, Vol. 2, Chapter 15 (1991)

Claims (7)

1. Verwendung eines thrombolytisch aktiven Proteins zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von thromboembolischen Erkrankungen, wobei das Protein als einzige die thrombolytische Aktivität bewirkende Struktur die Proteasendomäne des humanen Gewebsplasminogenaktivators enthält.

2. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die therapeutisch aktive Dosis des genannten Proteins zwischen 0,1 und 5 mg/kg beträgt.

3. Verwendung nach den Ansprüchen 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein als Einmal- oder Mehrfachbolus als iv, i.m., s.c.- oder i.a.-Injektion verabreicht wird.

4. Verwendung nach den Ansprüchen 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein infundiert oder lokal appliziert wird.

5. Verwendung nach den Ansprüchen 1-5, dadurch gekennzeichnet, daß die thromboem­ bolische Erkrankung eine tiefe Beinvenenthrombose oder ein akuter Beinarterienver­ schluß ist.

6. Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend ein thrombolytisch aktives Protein, wobei das Protein als einzige die thrombolytische Aktivität bewirkende Struktur die Protea­ sendomäne des humanen Gewebsplasminogenaktivators enthält.

7. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 6, enthaltend ein Anticoagulanz, einen blättchenhemmenden Stoff oder durchblutungsfördernde und die Mikrozirkulation verbessernde Stoffe.