DE4443273A1 - Verwendung der Proteasedomäne von humanem Plasminogenaktivator zur Behandlung von thromboembolischen Erkrankungen - Google Patents
Verwendung der Proteasedomäne von humanem Plasminogenaktivator zur Behandlung von thromboembolischen ErkrankungenInfo
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Description
Die Erfindung betrifft die Verwendung der Proteasedomäne von humanem Plasminogenakti
vator zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von thromboembolischen Erkran
kungen und pharmazeutische Zusammensetzungen, welche dieses Protein als aktive Kompo
nente enthalten.
Gewebsplasminogenaktivator (t-PA) ist eine aus mehreren Domänen bestehende Serinprotea
se, welche die Umwandlung von Plasminogen in Plasmin katalysiert und zur fibrinolytischen
Therapie verwendet wird.
Es sind eine Vielzahl von t-PA-Varianten und Mutationen bekannt, vgl. beispielsweise die
Übersichtsartikel T.J.R. Harris (1987) (1) und J. Krause (1988) (2).
Unter anderem ist bekannt, daß die Fibrinolyse teilweise durch die Interaktion zwischen t-PA
und Plasminogenaktivator-Inhibitor 1 (PAI-1, ein Serinprotease-Inhibitor aus der Serpinfami
lie) reguliert wird. Die Bindung von PAI-1 an t-PA erfolgt im wesentlichen über die Ami
nosäuren 296-302. Eine Mutation dieses Bereichs vermindert den inhibitorischen Einfluß von
PAI-1 auf t-PA (E.L. Madison et al. (1990) (3)). Zum Mechanismus der Interaktion zwischen
dem Aminosäurebereich 296-302 von t-PA mit PAI-1 wurden umfangreiche Untersuchungen
durchgeführt (vgl. auch E.L. Madison, Nature 339 (1989) 721-723 (4), R.V. Schohet,
Thrombosis and Haemostasis 71 (1994) 124-128 (S), C.J. Refino, Thrombosis and Haemost
asis 70 (1993) 313-319 (6), N.F. Paoni, Protein Engineering 6 (1993) 529-534 (7) und
Thrombosis and Haemostasis 70 (1993) 307-312 (8), W.F. Bennett, J. Biol. Chem. 266
(1991) 5191-5201 (9), D. Eastman, Biochemistry 31 (1992) 419-422 (10).
Nicht modifizierter t-PA besteht in seiner im Plasma vorkommenden Form aus 527 Aminosäu
ren und kann durch Plasmin in zwei Ketten, die dann noch über eine Disulfidbrücke zusam
mengehalten werden, gespalten werden. Die A-Kette (auch schwere Kette genannt) besteht
aus vier strukturellen Domänen. Die Fingerdomäne (Aminosäuren 1-49) zeigt gewisse Ähn
lichkeiten mit den Fingerstrukturen in Fibronektin. Die Growth-Factor-Domäne (Aminosäuren
50-86) ist in gewissem Umfang homolog zu murinen und humanen epidermalen Wachstums
faktoren. Die beiden Kringledomänen (Aminosäuren 87-175 und 176-262) sind im großen
Umfang homolog zur vierten und fünften Kringledomäne von Plasminogen. Die Finger- und
Kringle-2-Domänen von t-PA sind in der Fibrinbindung und in der Stimulation der proteolyti
schen Aktivität durch Fibrin besonders involviert. Die B-Kette von t-PA (Aminosäuren 276-
527, Proteasendomäne) ist eine Serinprotease und weitgehend homolog zu den B-Ketten von
Urokinase und Plasmin (T.J.R. Harris (1987) (1) und J. Krause (1988) (2).
tPA-Varianten, bei deren Anwendung verminderte Blutungsnebenwirkungen auftreten, sind in
der WO 93/24635 (11) und von B.A. Keyt et al., P.N.A.S. USA 91 (1994) 3670-3674 be
schrieben. Diese t-PA-Varianten besitzen eine zusätzliche Glykosylierungsstelle an den Ami
nosäurepositionen 103-105. Zusätzlich können diese t-PA-Varianten eine Modifikation an
den Aminosäuren 296-302 aufweisen, wodurch die Fibrinspezifität erhöht wird.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, t-PA-Derivate zur Verfügung zu stellen, die bei
der Anwendung, im Vergleich zu den bekannten Plasminogenaktivatoren, weiter verminderte
Blutungsnebenwirkungen zeigen.
Die Aufgabe der Erfindung wird gelöst durch die Verwendung eines thrombolytisch aktiven
Proteins zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von thromboembolischen Er
krankungen, wobei das Protein als einzige die thrombolytische Aktivität bewirkende Struktur
die Proteasendomäne des humanen Gewebsplasminogenaktivators enthält. Vorzugsweise
besteht das Protein aus den wesentlichen Teilen der Proteasendomäne.
Unter den wesentlichen Teilen der Domänen sind die Aminosäurebereiche zu verstehen, wel
che für die biologische Wirksamkeit des Plasminogenaktivators erforderlich sind. Besonders
bevorzugt besitzt das Protein die Sequenz der Aminosäuren 276-527 von t-PA. Ebenso
geeignet sind Proteasenderivate, bei denen die Aminosäuresequenz durch Deletion, Mutation
oder Addition verändert ist, solange Umfang von Fibrinbindung und plasminogenolytische
Aktivität in vitro nicht wesentlich verändert werden.
Derartige Plasminogenaktivatoren zeigen eine geringe Fibrinbindung und eine sehr geringe
plasminogenolytische Aktivität in vitro (Bestimmung nach Verheÿen, J. et al. Thromb. Hae
mostas. 48 (1982), 266-269) und sind deshalb bisher nicht als geeignete thrombolytische
Therapeutica in Betracht gezogen worden. Überraschenderweise zeigt sich jedoch bei der
Anwendung in vivo ein deutlich vermindertes Blutungsrisiko gegenüber den bekannten
Plasminogenaktivatoren und eine hohe Aktivität.
Die Fibrinbindung der Protease kann bestimmt werden in einem Fibrinbindungstest, wobei zur
Durchführung des genannten Fibrinbindungstests zu einer Lösung des genannten Proteins und
1,2 mg/ml Fibrinogen in Pufferlösung (Veronal® 15 mmol/l, NaCl 28 mmol/l, CaCl₂ 0,5
mmol/l, ngl 2 0,2 mmol/l, Tris HCl 5 mmol/l und 0,005% (v/v) Tween® 80, pH 7,75)
Thrombin in einer Endkonzentration von 2,5 NIH Einheiten/ml zugegeben werden, nach drei
Minuten bei 25°C die gebildeten Fibrinclots bei 12 000 g in 8 Minuten abzentrifugiert werden
und die Menge des im Überstand verbliebenen thrombolytisch aktiven Proteins photometrisch
bestimmt wird.
Beispielsweise zeigt das Protein in einem Kaninchenmodell der Halsvenenthrombolyse in einer
Dosis von 1 mg/kg Protein einen um mindestens 50% reduzierten Blutverlust im Vergleich zu
humanem Gewebsplasminogenaktivator, wenn in der Halsvene ein radioaktiv markierter
Thrombus erzeugt wird, anschließend 100 IU/kg Heparin subkutan und eine intravenöse
Einmalbolusinjektion von 1 mg/kg Protein verabreicht wird und die Blutung analog J. Clin.
Invest 71 (1993), 368-376 bestimmt wird.
Es ist damit möglich, durch Verwendung der Protease unter Beibehaltung eines therapeutisch
relevanten thrombolytischen Effektes die Blutungsnebenwirkung zu mehr als 50% klinisch
signifikant zu verringern, ohne bei einer Dosissteigerung diese vorteilhatte Eigenschaft zu ver
lieren.
Die Protease ist ein thrombolytisch aktives Protein, das im Gegensatz zu t-PA (Alteplase®)
für die Verabreichung als i.v. Bolus-Injektion geeignet ist, dafür mit einer geringeren Dosis
auskommen kann und praktisch die gleiche thrombolytische Wirkung wie die klinisch übliche
Infusion von Alteplase erreicht. Überraschenderweise ist die Therapie mit der Protease mit
weniger als 50% des bei Alteplase üblichen Blutverlustes verbunden. Diese Eigenschaft hat
große Bedeutung für die Verbesserung des Sicherheitsprofils neuer thrombolytisch aktiver
Substanzen, da es die sonst bei Thrombolytika, wie z. B. Alteplase, übliche Blutungsnebenwir
kung verringert. Die Daten der aPTT-Messung deuten außerdem daraufhin, daß die Protease
die im Blut für die normale Gerinnung notwendigen Proteine bei einer effektiven Dosis nicht
gespalten hat, da die aPTT Werte zwischen den Gruppen sehr vergleichbar waren. Bei höhe
ren Dosen kann der fibrinogensparende Effekt allerdings verlorengehen, ohne daß dies aber
Auswirkungen auf die Verringerung der Nebenwirkungen hätte. Im Gegenteil, die Verringe
rung des Blutverlustes ist nicht mit der Fibrinspezifität verbunden und auch nicht mit der Dosis
gekoppelt.
Die Verringerung der Blutungsnebenwirkung macht die Protease zu einem außerordentlich
wertvollen Thrombolytikum für die Behandlung aller thromboembolischen Erkrankungen. Im
Gegensatz zu den bisher nur bei äußerst lebensbedrohlichen Erkrankungen wie Herzinfarkt
und massiver Lungenembolie zugelassenen Thrombolytika, eröffnet die Benutzung der Protea
se die Möglichkeit, die Thrombolyse durch die Protease auch bei weniger akut lebensbedrohli
chen Erkrankungen, wie z. B. tiefe Beinvenenthrombose, einzusetzen. Darüberhinaus kann die
Verwendung von Thrombolytika auf Basis der Protease als wirksame t-PA-Domäne nun viel
breiter als bisher erfolgen, da ein Haupthinderungsgrund für den weitverbreiteten Einsatz die
Gefahr der Blutungskomplikationen war. Unabhängig davon, kann die Protease vorteilhaft
auch bei akuten Erkrankungen, wie Herzinfarkt oder Lungenembolie, angewendet werden.
Die Herstellung der erfindungsgemäß verwendeten t-PA-Varianten kann nach den dem Fach
mann geläufigen Methoden in eukaryontischen oder prokaryontischen Zellen erfolgen. Vor
zugsweise werden die erfindungsgemäßen Verbindungen gentechnologisch hergestellt. Ein
derartiges Verfahren ist beispielsweise in der WO 90/09437 (25), EP-A 0297 066 (26),
EP-A 0 302456 (27), EP-A 0245 100 (28) und EP-A 0400 545 (29), welche Gegenstand der
Offenbarung für derartige Herstellverfahren sind, beschrieben. Mutationen können durch
"oligonucleotide-directed site-specific mutagenesis" in die cDNA von t-PA oder einem Derivat
davon eingeführt werden. Die "site-specific mutagenesis" ist beispielsweise von Zoller und
Smith (1984) (12), modifiziert nach T.A. Kunkel (1985) (13) und Morinaga et al. (1984) (19)
beschrieben. Ebenso geeignet ist das Verfahren der PCR-Mutagenese, welches beispielsweise
in Ausubel et al. (1991) (30) beschrieben ist.
Die auf diese Weise erhaltene Nukleinsäure dient zur Expression des erfindungsgemäß ver
wendeten t-PA-Derivats, wenn sie auf einem für die verwendete Wirtszelle geeigneten
Expressionsvektor vorhanden ist.
Die Nukleinsäuresequenz des erfindungsgemäßen Proteins kann zusätzlich noch modifiziert
sein. Derartige Modifikationen sind beispielsweise:
Veränderung der Nukleinsäuresequenz, um verschiedene Erkennungsse
quenzen von Restriktionsenzymen zur Erleichterung der Schritte der
Ligation, Klonierung und Mutagenese einzuführen
Veränderung der Nukleinsäuresequenz zum Einbau von bevorzugten Codons für die Wirtszelle
Ergänzung der Nukleinsäuresequenz, um zusätzliche Regulations- und Transkriptionselemente, um die Expression in der Wirtszelle zu optimie ren.
Veränderung der Nukleinsäuresequenz zum Einbau von bevorzugten Codons für die Wirtszelle
Ergänzung der Nukleinsäuresequenz, um zusätzliche Regulations- und Transkriptionselemente, um die Expression in der Wirtszelle zu optimie ren.
Alle weiteren Verfahrensschritte zur Herstellung von geeigneten Expressionsvektoren und zur
Expression sind Stand der Technik und dem Fachmann geläufig. Beschrieben sind derartige
Methoden beispielsweise bei Sambrook et al. (1989) (14).
Die Herstellung der erfindungsgemäß verwendeten glykosylierten t-PA-Derivate erfolgt in
eukaryontischen Wirtszellen. Die Herstellung der erfindungsgemäß verwendeten, nicht glyko
sylierten t-PA-Derivate erfolgt entweder in eukaryontischen Wirtszellen, wobei das dabei
zunächst gewonnene glykosylierte Produkt durch dem Fachmann geläufige Methoden degly
kosyliert werden muß, oder vorzugsweise durch Expression in nicht glykosylierenden Wirts
zellen, besonders bevorzugt in prokaryontischen Wirtszellen.
Als prokaryontische Wirtsorganismen sind beispielsweise E. coli, Streptomyces spec. oder
Bacillus subtilis geeignet. Zur Herstellung der erfindungsgemäßen Protein werden die Pro
karyontenzellen in üblicher Weise fermentiert und nach Aufschluß der Bakterien das Protein in
üblicher Weise isoliert. Falls das Protein in inaktiver Form (Inclusion Bodies) anfällt, wird es
nach den dem Fachmann geläufigen Verfahren solubilisiert und naturiert. Ebenso ist es nach
den dem Fachmann geläufigen Methoden möglich, das Protein als aktives Protein aus den
Mikroorganismen zu sekretieren. Ein hierfür geeigneter Expressionsvektor enthält vorzugs
weise eine Signalsequenz, die für die Sekretion von Proteinen in den verwendeten Wirtszellen
geeignet ist, und die Nukleinsäuresequenz, welche für das Protein codiert. Das mit diesem
Vektor exprimierte Protein wird dabei entweder in das Medium (bei gram-positiven Bakte
rien) oder in den periplasmatischen Raum (bei gram-negativen Bakterien) sekretiert. Zwischen
der Signalsequenz und der für das erfindungsgemäße t-PA-Derivat codierenden Sequenz ist
zweckmäßig eine Sequenz enthalten, die für eine Spaltstelle codiert, die entweder bei der
Prozessierung oder durch Behandlung mit einer Protease die Abspaltung des Proteins erlaubt.
Die Auswahl des Basisvektors, in den die für das erfindungsgemäße t-PA-Derivat codierende
DNA-Sequenz eingebracht wird, ist abhängig von den später zur Expression verwendeten
Wirtszellen. Geeignete Plasmide sowie die Minimalanforderungen, die an ein derartiges
Plasmid gestellt werden (z. B. Replikationsursprung, Restriktionsschnittstellen), sind dem
Fachmann geläufig. Im Rahmen der Erfindung können auch anstelle eines Plasmids ein
Cosmid, die replikative doppelsträngige Form von Phagen (λ, M13) oder andere dem Fach
mann bekannte Vektoren verwendet werden.
Bei der Herstellung der erfindungsgemäßen t-PA-Derivate in Prokaryonten ohne Sekretion ist
es bevorzugt, die sich bildenden Inclusion Bodies von den löslichen Zellpartikeln abzutrennen,
die t-PA enthaltenden Inclusion Bodies durch Behandlung mit Denaturierungsmitteln unter
reduzierenden Bedingungen zu solubilisieren, anschließend mit GSSG zu derivatisieren und
das t-PA-Derivat durch Zugabe von GSH und von Denaturierungsmitteln in nicht denaturie
render Konzentration oder von L-Arginin zu renaturieren. Derartige Verfahren zur Aktivie
rung von t-PA und Derivaten aus Inclusion Bodies sind beispielsweise in der EP-A 0 219 874
(15) und EP-A 0241 022 (16) beschrieben. Es können jedoch auch andere Verfahren zur
Gewinnung des aktiven Proteins aus den Inclusion Bodies verwendet werden.
Vorzugsweise erfolgt die Aufreinigung der erfindungsgemäßen t-PA-Derivate in Anwesenheit
von L-Arginin, insbesondere bei einer Arginin-Konzentration von 10-1000 mmol/l.
Die Abtrennung von Fremdproteinen erfolgt vorzugsweise durch Affinitätschromatographie
und besonders bevorzugt über eine Adsorbersäule, an der ETI (Erythrina trypsin Inhibitor)
immobilisiert ist. Als Trägermaterial wird beispielsweise Sepharose® verwendet. Die Reini
gung über eine ETI-Adsorbersäule hat den Vorteil, daß das ETI-Adsorbersäulenmaterial
direkt aus dem konzentrierten Renaturierungsansatz sogar in Gegenwart von so hohen Argi
ninkonzentrationen wie 0,8 mol/l Arginin beladen werden kann. Vorzugsweise erfolgt die
Reinigung der erfindungsgemäßen Plasminogenaktivatoren über eine ETI-Adsorbersäule in
Gegenwart von 0,6-0,8 mol/l Arginin. Die dabei verwendete Lösung hat vorzugsweise einen
pH von über 7, besonders bevorzugt zwischen 7,5 und 8,6.
Die Elution der erfindungsgemäß verwendeten t-PA-Derivate von der ETI-Säule erfolgt durch
pH-Erniedrigung sowohl in Gegenwart als auch in Abwesenheit von Arginin unter Bedingun
gen, in denen die erfindungsgemäß verwendeten tPA-Derivate gut löslich sind. Vorzugsweise
liegt dabei der pH-Wert im sauren Bereich, besonders bevorzugt zwischen pH 4,0 und 5,5. Ein
weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend ein
thrombolytisch aktives Protein, wobei das Protein als die einzige die thrombolytische Aktivität
bewirkende Struktur die Proteasendomäne des humanen Gewebsplasminogenaktivators ent
hält.
Die erfindungsgemäß verwendeten t-PA-Varianten können zur Herstellung von Therapeutika
in einer dem Fachmann geläufigen Weise formuliert werden, wobei die erfindungsgemäßen
Verbindungen üblicherweise mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger kombiniert wer
den. Solche Zusammensetzungen enthalten typischerweise eine effektive Menge von 0,3-
7 mg/kg, vorzugsweise 0,7-5 mg/kg und besonders bevorzugt 1-3 mg/kg Körpergewicht als
Dosis. Die therapeutischen Zusammensetzungen liegen üblicherweise als sterile, waßrige Lö
sungen oder sterile, lösliche Trockenformulierungen wie Lyophilisate vor. Die Zusammenset
zungen enthalten üblicherweise eine geeignete Menge eines pharmazeutischen akzeptablen
Salzes, mit der eine isotonische Lösung hergestellt wird. Weiter können Puffer wie Arginin
puffer, Phosphatpuffer zur Stabilisierung eines geeigneten pH-Wertes (vorzugsweise 5,5-7,5)
verwendet werden. Die Höhe der Dosierung der erfindungsgemäßen Verbindungen ist durch
jeden Fachmann ohne weiteres zu ermitteln. Sie hängt beispielsweise ab von der Art der
Anwendung (Infusion oder Bolus) und der Dauer der Therapie. Aufgrund ihrer verlängerten
Halbwertszeit sind die erfindungsgemäßen Verbindungen besonders geeignet für eine
Bolusanwendung (Einmalbolus, Mehrfachbolus). Eine geeignete Form für eine Bolusanwen
dung ist beispielsweise eine Ampulle, welche 25-1000 mg erfindungsgemäße Verbindung,
Arginin und Puffer enthält. Die Anwendung erfolgt vorzugsweise intravenös, aber auch subku
tan, intramuskulär oder intraarteriell. Ebenso kann die Protease infundiert oder lokal appliziert
werden.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können als Mehrfachbolus (vorzugsweise als Doppel
bolus) angewendet werden. Geeignete Zeitintervalle sind zwischen 20 und 180 Minuten,
besonders bevorzugt ist ein Intervall zwischen 30 und 90 Minuten und ganz besonders ist ein
Intervall zwischen 30 und 60 Minuten bevorzugt. Es hat sich jedoch gezeigt, daß die Protease
überraschenderweise auch bei einer Einmalbolusanwendung ausreichend wirksam ist.
Vorzugsweise liegt dabei die Dosis bei ca. 1 mg/kg.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen eignen sich insbesondere zur Behandlung von allen
thromboembolischen Erkrankungen, wie z. B. akuter Herzinfarkt, Hirninfarkt, Lungenembolie,
tiefe Beinvenenthrombose, akuter arterieller Verschluß usw. Besonders bevorzugt werden die
erfindungsgemäßen Verbindungen zur Behandlung von subchronischen thromboembolischen
Erkrankungen, bei denen eine längere Thrombolyse durchgeführt werden muß, angewendet.
Es ist bevorzugt, die erfindungsgemäßen Verbindungen in Kombination mit einem Hemmstoff
der Gerinnung (Antikoagulans), wie z. B. Heparin oder Hirudin und/oder einem Hemmstoff
der Plättchenaggregation anzuwenden, wodurch die Gefäßöffnungswirkung bei geringen
Nebenwirkungen gesteigert wird. Ebenso bevorzugt ist der Zusatz von durchblutungsfördern
den Stoffen oder die Mikrozirkulation verbessernde Stoffe.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter.
Das Ausgangsplasmid pA27fd, beschrieben in EP 0 382 174, enthält die folgenden Kom
ponenten: tac-Promotor, lac-Operator-Region mit einem ATG-Startcodon, die kodieren
de Region für das t-PA-Derivat, bestehend aus der Kringel2-Domäne und der Protease-
Domäne, und den fd-Transkriptionsterminator; der Ausgangsvektor stellt das Plasmid
pKK223-3 dar.
Zur Deletion der für die Kringel2-Domäne kodierenden Sequenz (Deletion der Aminosäu
repositionen 176-261; Zählung der Aminosäuren gemäß Pennica et al. 1983, Nature
301 : 214) wurde im wesentlichen die Methode von Morinaga et al. (1984, Biotechnology
21 : 634) durchgeführt. Für die Mutagenese wurde das folgende Oligonukleotid synthetisch
hergestellt:
5′ CAGAATTCTTATGTCTTACCAATCCACCTGCGGCCTGAGACAG 3′
Die Heteroduplexbildung wurde, wie in EP 0 382 174 beschrieben, vorgenommen. Der
Heteroduplexansatz wurde zusammen mit dem Plasmid pUBS520 (Brinkmann et al.
1989, Gene 85 : 109) in E.coli C600+ transformiert. Die Transformanten wurden durch
Zugabe von Ampicillin und Kanamycin (jeweils 50 µg/ml) zum Nährmedium selektioniert.
Das erhaltene Plasmid wurde mit pA27Protease bezeichnet; es unterscheidet sich vom
Ausgangsplasmid durch das Fehlen einer EcoRI-Schnittstelle.
Zur Überprüfung der Expressionsleistung wurde der E.coli Stamm C600+ mit den Plas
miden pA27Protease und pUBS520 in LB-Medium (Sambrook et al., 1989, Molecular
Cloning, Cold Spring Harbor) in Gegenwart vom Ampicillin und Kanamycin (jeweils 50
µg/ml) bis zu einer OD bei 550 nm von 0.4 angezüchtet. Die Expression wurde durch Zu
gabe von 5 mmol/1 IPTG initiiert. Die Kultur wurde für weitere 4 Stunden inkubiert. Im
Anschluß daran wurden die E.coli Zellen durch Zentrifugation gesammelt und in Puffer
resuspendiert (50 mmol/l Tris-HCl pH g, 50 mmol/l EDTA); durch Beschallung wurde die
Lyse der Zellen herbeigeführt. Durch erneute Zentrifugation wurden die unlöslichen Pro
teinfraktionen gesammelt und in oben genannten Puffer durch Beschallung resuspendiert.
Die Suspension wurde mit 1/4 Volumen Auftragspuffer (250 mmol/l Tris-HCl pH 6.8, 10
mmol/l EDTA, 5% SDS, 5% Mercaptoethanol, 50% Glycerin und 0.005% Bromphe
nolblau) versetzt und mit Hilfe eines 12.5% SDS-Polyacrylamidgels analysiert. Als Kon
trolle wurde die gleiche Präparation mit einer Kultur von E.coli mit den beiden o. g.
Plasmiden, die nicht mit IPTG induziert worden war, durchgeführt und im Gel aufge
trennt. In der Präparation der IPTG-induzierten Kultur kann man, nach Anfärben des Gels
mit Coomassie Blue R250 (gelöst in 30% Methanol und 10% Essigsäure), eine deutliche
Bande mit einem Molekulargewicht von etwa 30 kD erkennen; diese Bande ist in der
Kontrollpräparation nicht vorhanden.
Zur Prüfung der thrombolytischen Potenz und Effizienz wurde das von D. Collen etablierte
Kaninchenmodell der Halsvenenthrombolyse angewandt (J. Clin. Invest. 1983; 71: 368-376).
Dabei wurde bei den Tieren in der Halsvene ein radioaktiv markierter Thrombus erzeugt. Die
Tiere wurden mit 100 IU/kg Heparin subcutan antikoaguliert. Alteplase (rekominanter Gewe
be-Plasminogenaktivator, kommerziell erhältlich als Actilyse® von der Firma Thomae,
Biberach, Deutschland), die Protease von rPA, Streptokinase (kommerziell erhältlich als
Streptase® von der Behring, Marburg, Deutschland) oder Lösungsmittel (0,2 M Argininphos
phat Puffer) wurden den Kaninchen intravenös verabreicht:
Die Placebo-Gruppe erhielt eine intravenöse Einmalbolus-Injektion von 1 ml/kg Lösungsmit tel. Die Alteplase-Gruppe erhielt eine Gesamtdosis von 1,45 mg/kg intravenös verabreicht, davon 0,2 mg/kg als Anfangsbolusinjektion, 0,75 mg/kg als 30-minütige Infusion, direkt gefolgt von 0,5 mg/kg als 60-minütige Dauerinfusion (Gesamtinfusion: 90 min). Die Strepto kinase-Gruppe erhielt eine 60-min intravenöse Innfusion von 64 000 IU/kg. Die Protease- Gruppe erhielt eine intravenöse Einmalbolus-Injektion von 1 mg/kg oder 2 mg/kg.
Die Placebo-Gruppe erhielt eine intravenöse Einmalbolus-Injektion von 1 ml/kg Lösungsmit tel. Die Alteplase-Gruppe erhielt eine Gesamtdosis von 1,45 mg/kg intravenös verabreicht, davon 0,2 mg/kg als Anfangsbolusinjektion, 0,75 mg/kg als 30-minütige Infusion, direkt gefolgt von 0,5 mg/kg als 60-minütige Dauerinfusion (Gesamtinfusion: 90 min). Die Strepto kinase-Gruppe erhielt eine 60-min intravenöse Innfusion von 64 000 IU/kg. Die Protease- Gruppe erhielt eine intravenöse Einmalbolus-Injektion von 1 mg/kg oder 2 mg/kg.
Zwei Stunden nach Beginn der Therapie wurde der Restthrombus entfernt, und das Ausmaß
der Thrombusauflösung (Thrombolyse) mittels der Abnahme der Radioaktivität im Thrombus
bestimmt. Blutproben zur Gewinnung von Plasma wurden vor Therapie und 2 h nach Thera
piebeginn abgenommen und die aktivierte Thromboplastinzeit mit einem Testkit (Bestell-Nr.:
126 551, Boehringer Mannheim (GmbH, Mannheim, Deutschland) gemessen. Außerdem
wurde der Blutverlust aufgrund der thrombolytischen Therapie quantifiziert. Hierzu wurde den
Tieren auf dem Oberschenkel mit Hilfe einer Schablone und eines Skalpels ein definierter
Hautschnitt von 4 cm Länge und 0,3 cm Tiefe vor Gabe der Thrombolytika zugefügt. Die
dabei entstehende Blutung kam spontan durch die natürliche Gerinnung zum Stillstand. Nach
Beginn der Therapie wurde auf die Wunde ein Schwamm gelegt, der das Blut aus der durch
die Thrombolyse neu ausgebrochenen Blutung aufsog. Durch Wiegen des Schwammes (nach
Abzug des Eigengewichtes) kann man die Menge des ausgetretenen Blutes messen und so das
Ausmaß der Blutungsnebenwirkung beschreiben.
Sowohl Alteplase als auch die Protease von rPA sind thrombolytisch hoch aktive Substanzen
und lösten im Vergleich zur Lösungsmittel-Kontrolle die Thromben signifikant auf; unterschie
den sich dabei aber nicht signifikant voneinander. Dabei genügte als effektive Dosis der Pro
tease nur 1 mg/kg statt 1,45 mg/kg bei Alteplase und damit 31% weniger. Die bei Alteplase
angewandte Dosis und Verabreichungsweise (dreistufige Infusion) entspricht der in der Klinik
bei der Behandlung des Herzinfarktes üblichen Dosis und Verabreichungsweise (siehe
GUSTO-Studie: N Engl J Med 1993; 329 : 673-82). Vorteilhaft ist nicht nur die geringere
Dosis zur Erzielung eines therapeutisch relevanten Effektes, nämlich der Auflösung von
Thromben, sondern auch die Möglichkeit, mit einer Einmalbolusinjektion diesen Effekt zu
erreichen, der bei Alteplase nicht möglich ist.
Außerordentlich wichtig ist aber die überraschende Beobachtung eines höchstens halb so
großen (46,8%) Blutverlustes unter Therapie mit 1 mg/kg Protease, bzw. eines sogar um 71
% geringeren Blutverlustes bei der höheren Protease-Dosis von 2 mg/kg im Vergleich mit der
Standardtherapie mit Alteplase. Gegenüber Streptokinase ist dieser Unterschied noch viel
deutlicher. Besonders auffällig ist, daß der Blutverlust bei Alteplase und Streptokinase auftritt,
ohne daß die aPTT deutlich verlängert ist, was daraufhin weist, daß in vivo keine nennens
werte Fibrinogenspaltung stattgefunden hat. Dagegen findet sich bei der höheren Protease-
Dosis durchaus eine aPTT-Verlängerung, allerdings ohne daß dies irgendeinen negativen
Einfluß auf die Blutungsneigung hätte.
t-PA und rekombinante Protease wurden mit Puffer auf die in der Tabelle und in den Abbil
dungen angegebenen Konzentrationen eingestellt und ihre Aktivität im Clot-Lyse-Assay
bestimmt.
Die Probe wird durch Zugabe von Puffer (0,06 M Na₂HPO₄, pH 7,4, 5 mg/ml BSA
(Rinderserumalbumin), 0,01% Tween®) auf die jeweils benötigte Proteinkonzentration ein
gestellt. 0,1 ml der Probe werden mit 1 ml Human Fibrinogen-Lösung (IMCO) (2 mg/ml
0,006 M Na₂HPO₄, pH 7,4, 0,5 mg/ml BSA, 0,01% Tween 80®) gemischt und 5 min bei
37°C inkubiert. Anschließend werden je 100 µl einer Plasminogen-Lösung (10 CU/ml 0,06 M
Na₂HPO₄/H₃PO₄, pH 7,4, 0,5 mg/ml BSA, 0,01% Tween 80®) und einer Thrombin-Lösung
(30 U/ml 0,06 M Na₂HPO₄, pH 7,4, 0,5 mg/lm BSA, 0,01% Tween 80) hinzugegeben und
der Testansatz erneut bei 37°C inkubiert. Nach 2 min wird eine Teflon®-Kugel auf den Fibrin-
Clot aufgelegt und die Zeit gestoppt, bis zu der die Kugel den Boden des Test-Röhrchens
erreicht hat.
- (1) T.J.R. Harris, Protein Engineering 1 (1987) 449-459
- (2) J. Krause, Fibrinolysis 2 (1988) 133-142
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Claims (7)
1. Verwendung eines thrombolytisch aktiven Proteins zur Herstellung eines Arzneimittels
zur Behandlung von thromboembolischen Erkrankungen, wobei das Protein als einzige
die thrombolytische Aktivität bewirkende Struktur die Proteasendomäne des humanen
Gewebsplasminogenaktivators enthält.
2. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die therapeutisch aktive
Dosis des genannten Proteins zwischen 0,1 und 5 mg/kg beträgt.
3. Verwendung nach den Ansprüchen 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein als
Einmal- oder Mehrfachbolus als iv, i.m., s.c.- oder i.a.-Injektion verabreicht wird.
4. Verwendung nach den Ansprüchen 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein
infundiert oder lokal appliziert wird.
5. Verwendung nach den Ansprüchen 1-5, dadurch gekennzeichnet, daß die thromboem
bolische Erkrankung eine tiefe Beinvenenthrombose oder ein akuter Beinarterienver
schluß ist.
6. Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend ein thrombolytisch aktives Protein, wobei
das Protein als einzige die thrombolytische Aktivität bewirkende Struktur die Protea
sendomäne des humanen Gewebsplasminogenaktivators enthält.
7. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 6, enthaltend ein Anticoagulanz,
einen blättchenhemmenden Stoff oder durchblutungsfördernde und die Mikrozirkulation
verbessernde Stoffe.
Priority Applications (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE19944443273 DE4443273A1 (de) | 1994-12-06 | 1994-12-06 | Verwendung der Proteasedomäne von humanem Plasminogenaktivator zur Behandlung von thromboembolischen Erkrankungen |
PCT/EP1995/004717 WO1996017928A1 (en) | 1994-12-06 | 1995-11-30 | Use of the protease domain of human plasminogen activator for the treatment of thromboembolic diseases |
EP95941060A EP0796323A1 (de) | 1994-12-06 | 1995-11-30 | Verwendung der proteasedomäne humanes gewebsplasminakilivators für die behandlung von thromboembolischen erkrankungen |
AU42594/96A AU4259496A (en) | 1994-12-06 | 1995-11-30 | Use of the protease domain of human plasminogen activator for the treatment of thromboembolic diseases |
Applications Claiming Priority (1)
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DE4443273A1 true DE4443273A1 (de) | 1996-06-13 |
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Family Applications (1)
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DE19944443273 Withdrawn DE4443273A1 (de) | 1994-12-06 | 1994-12-06 | Verwendung der Proteasedomäne von humanem Plasminogenaktivator zur Behandlung von thromboembolischen Erkrankungen |
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DE (1) | DE4443273A1 (de) |
-
1994
- 1994-12-06 DE DE19944443273 patent/DE4443273A1/de not_active Withdrawn
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8127 | New person/name/address of the applicant |
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