DE69321134T2

DE69321134T2 - Plasminogen-derivate die durch thrombin aktivierbar sind

Info

Publication number: DE69321134T2
Application number: DE69321134T
Authority: DE
Inventors: Keith Martyn Cowley Oxford Ox4 5Ly Dawson; Richard James Cowley Oxford Ox4 5Ly Gilbert; Michael George Cowley Oxford Ox4 5Ly Hunter
Original assignee: British Biotech Pharmaceuticals Ltd
Current assignee: Vernalis R&D Ltd
Priority date: 1992-10-29
Filing date: 1993-10-28
Publication date: 1999-02-25
Anticipated expiration: 2013-10-29
Also published as: FI952071A; WO1994010318A1; NO951648L; GB9222758D0; CA2145749A1; NZ257175A; FI952071A0; AU5343294A; HK1008047A1; EP0666920A1; CA2145749C; JPH08504575A; FI114102B; ATE171213T1; DK0666920T3; DE69321134D1; EP0666920B1; AU674180B2; NO317661B1; NO951648D0

Description

Diese Erfindung betrifft eine Verbesserung der in unserer anhängigen Patentanmeldung WO-A-9109118 offenbarten Erfindung und betrifft Plasminogen-Analoga, die durch Thrombin aktiviert werden und fibrinolytische Aktivität besitzen oder die Blutgerinnselbildung hemmen. Sie betrifft außerdem Nukleinsäuren (DNA und RNA), die die gesamte oder einen Teil solcher Verbindungen codieren. Die Erfindung betrifft außerdem deren Herstellung, pharmazeutischen Zusammensetzungen, enthaltend dieselben und deren Verwendung bei der Behandlung von thrombotischer Erkrankung.
Plasminogen ist eine Schlüsselkomponente des fibrinolytischen Systems, das das natürliche Gegenstück des Gerinnungssystems im Blut ist. Bei dem Verfahren der Blutgerinnung ist eine Kaskade von Enzymaktivitäten an dem Herstellen eines Fibrinnetzes, das den Rahmen eines Blutgerinnsels oder Thrombos bildet, beteiligt. Der Abbau des Fibrinnetzes (Fibrinolyse) wird durch die Wirkung des Enzyms Plasmin erreicht. Plasminogen ist der inaktive Vorläufer von Plasmin, und die Umwandlung von Plasminogen zu Plasmin wird durch die Spaltung der Peptidbindung von Plasminogen zwischen Arginin 561 und Valin 562 erreicht. Unter physiologischen Bedingungen wird diese Spaltung durch den Gewebsplasminogenaktivator (tPA) oder Urokinaseplasmingenaktivator (uPA) katalysiert. Wenn das Gleichgewicht zwischen den Gerinnungs- und fibrinolytischen Systemen örtlich gestört wird, können sich intravaskuläre Gerinnsel an unpassenden Orten bilden, was zu Koronarthrombose, Herzinfarkt, tiefer Venenthrombose, Schlaganfall, peripherem arteriellen Verschluß und Embolie führen kann. In solchen Fällen hat sich gezeigt, daß die Verabreichung von fibrinolytischen Mitteln eine nützliche Behandlung zur Förderung der Gerinnselauflösung ist. Antithrombotische Mittel sind außerdem nützlich zur Behandlung der Gerinnselbildung.
Das Problem bei der Mehrzahl von Mitteln, die zur fibrinolytischen Behandlung verwendet werden, ist, daß sie bei klinisch nützlichen Dosen nicht thrombusspezifisch sind, da sie Plasminogen in der gesamten Zirkulation aktivieren. Eine alternative Methode zur Steigerung der Fibrinolyse ist in unserer anhängigen Patentanmeldung WO-A-9109118 beschrieben und basiert auf der Verwendung von aktivierbaren Molekülen, die fibrinolytische Aktivität besitzen oder die Gerinnselbildung hemmen. Die Akti vierung wird durch ein oder mehrere an der Blutgerinnung beteiligten endogenen Enzyme katalysiert. Ein Vorteil dieser Methode ist, daß thrombusselektive Fibrinolyse oder Hemmung der Aktivität der Gerinnselbildung durch thrombusspezifische Lokalisierung der aktivierenden Enzyme erreicht wird. Insbesondere offenbart WO-A-9109118, inter alia, Plasminogen-Analoga, die durch die Spaltung durch Thrombin zu aktiviertem Plasmin führen.
Thrombin (E. C. 3.4.21.5) ist eine Serinprotease, die die Proteolyse einer Anzahl von Proteinen, einschließlich Fibrinogen (A alpha-Ketten und B beta-Ketten), Faktor XIII, Faktor V, Faktor VII, Faktor VIII, Protein C und Antithrombin III katalysiert. Die erforderliche Struktur zum Erkennen durch Thrombin scheint teilweise durch die örtliche Aminosäuresequenz in der Nähe der Spaltstelle bestimmt zu werden, aber wird außerdem bis zu einem gewissen Grad durch die Sequenz/Sequenzen bestimmt, die von der Spaltstelle entfernt ist/sind. Zum Beispiel sind bei der Fibrinogen A alpha-Kette die Reste P2 (Val), P9 (Phe) und P10 (Asp) entscheidend für die α-Thrombin-katalysierte Spaltung der Arg(16)-Gly(17) Peptidbindung (Ni, F. et al., 1989, Biochemistry 28, 3082-3094). WO-A-9109118 offenbart, daß die optimalen Spaltstellen für α-Thrombin die Struktur (i) P4- P3-Pro-Arg-P1'-P2', worin P3 und P4 jeweils unabhängig voneinander ein Rest einer hydrophoben Aminosäuren (wie Valin) darstellen und P1' und P2' jeweils unabhängig voneinander eine nicht-saure Aminosäure darstellen oder (ii) P2-Arg-P1' haben kann, worin P2 oder P1' ein Glycinrest ist. Folglich haben die durch Thrombin aktivierbaren Plasminogen-Analog-Verbindungen, die in WO-A-9109118 bevorzugt offenbart sind, und alle die darin spezifisch durch Beispiele angegeben sind, Spaltstellen, die sich nach den vorgenannten Strukturen (i) oder (ii) richten. Die in WO-A-91 09118 berichteten Daten legen nahe, daß von den spezifisch durch Beispiele angegebenen durch Thrombin spaltbaren Plasminogen-Analoga das als T19 bezeichnete das bei den verwendeten Assaysystemen wirksamste ist. Es hat eine Spaltstelle, die auf Faktor XIII basiert, worin Pro559 und Gly560 von Wildtyp-Plasminogen durch Val-Glu-Leu-Gln-Gly-Val-Val-Pro ausgetauscht wurde. Die Thrombinspaltstelle von T19, die wirksamste der spezifisch durch Beispiele angegebenen Verbindungen, entspricht daher den Erfordernissen der obigen Struktur (i), die gemäß WO-A-9109118 bevorzugt ist.
In der Abwesenheit von Cofaktoren wurde berichtet, daß Faktor XI nicht (Naito, K. und Fujikawa, K (1991), J. Biol. Chem. 266, 7353-7358) oder nur langsam mit einer kcat/Km = 1,6 · 10&sup5; M&supmin;¹ min&supmin;¹ (Gailani, D. und Broze, G. J. 1991, Science 253, 909-912) durch Thrombin gespalten wird. Die Sequenz der Spaltstelle dieses Thrombinsubstrats unterscheidet sich von den bevorzugten allgemeinen Formeln i) und ii) von WO-A-9109118. Faktor XI hat eine basische Aminosäure, Lys, an der P3 Position. Obwohl die Aktivität der Thrombinspaltung an dieser Stelle von Faktor XI im Vergleich zu der von Faktor XIII sehr niedrig ist (kcat/Km = 1,4 · 10&sup5; M&supmin; ¹ sec&supmin;¹; Naski et al., 1991, Biochemistry 30, 934-941), ist jedoch erfindungsgemäß festgestellt worden, daß Plasminogen-Analoga, die eine Thrombinspaltsequenz mit einem basischen Aminosäurerest an der P3 Position eine unerwartet hohe Aktivität im Vergleich zu T19 haben. Solche neuen Analoga werden durch Thrombin schneller gespalten und entfalten in einem gebundenen homogenen Assay erhöhte Aktivität. Bedeutsamer ist, daß solche Analoga in einem Assay der Lyse von Plasmagerinnsel aktiv sind, was den Bedingungen in vivo näher kommt.
Ein weiteres Beispiel einer Thrombinspaltstelle, bei der P3 ein basischer Aminosäurerest ist, wurde in der einkettigen Urokinase festgestellt, bei der P3 Arginin ist. Die Spaltung an dieser Stelle stellt eine inaktive Urokinase mit zwei Ketten her (Ichinose et al., 1986, J. Biol. Chem. 261, 3486-9). In Abwesenheit von Cofaktoren ist die Spaltung der einkettigen Urokinase durch Thrombin auch verhältnismäßig langsam, wobei kcat/Km = 3,8 · 10&sup4; M&supmin;¹ sec&supmin;¹ ist (de Munk et al., 1990, Fibrinolysis 4, 161); es wurde jedoch gezeigt, daß Plasminogen-Analoga, die die Urokinasespaltstelle tragen, eine erhöhte Aktivität im Vergleich zu T19 haben. Diese Erfindung stellt folglich eine Verbesserung der in WO-A- 9109118 offenbarten Erfindung dar, dadurch daß sie ein Plasminogen-Analog bereitstellt, das durch Thrombin aktivierbar ist und Plasminaktivität hat (wie im allgemein in WO-A-9109118 offenbart), und das dadurch gekennzeichnet ist, daß es eine Sequenz einer Thrombinspaltstelle P4-P3-Pro- Arg-P1'-P2' umfaßt, worin P3 eine basische Aminosäure, P4 ein Rest einer hydrophoben Aminosäure ist und jeweils P1' und P2' unabhängig voneinander ein nicht-saurer Aminosäurerest sind, wobei die Stelle zwischen Arg und P1' durch Thrombin spaltbar ist.
Plasminogen wurde gemäß der Untersuchungen der Proteinsequenz von Sottrup-Jensen et al. (in Atlas of Protein Sequence and Structure (Dayhoff, M. O., Hrsg.) 5 Erg. 3, S. 995 (1978), die darauf hinweisen, daß Plasminogen ein Protein mit 790 Aminosäuren ist und die Spaltstelle die Arg560-Val561-Peptidbindung ist, numeriert. Eine geeignete Plasminogen cDNA ist erfindungsgemäß nützlich; sie wurde von Forsgren et al (FEBS Letters 213, 254-260 (1987)) isoliert und codiert ein Protein mit 791 Resten, das eine zusätzliches Ile an der Position 65 aufweist. In dieser Beschreibung entspricht die Numerierung der Aminosäuren von Plasminogen der der verwendeten cDNA. Polymorphie kann in der Plasminogen-Struktur vorkommen und es kann Plasminogenformen geben, bei denen sich die Numerierung der Spaltstelle unterscheidet, aber es ist beabsichtigt, daß solche Varianten von der Ausführungsform umfaßt sind.
Daher bedeutet der Ausdruck "Plasminogen-Analog", wie er in dieser Beschreibung verwendet wird, ein von Wildtyp-Plasminogen unterschiedliches Molekül, das die Fähigkeit hat, gespalten zu werden oder auf das zur Bildung eines Moleküls mit Plasminaktivität anders eingewirkt wird.
Plasminogen-Analoga innerhalb des Umfangs dieser Erfindung behalten die Aktivität der Fibrinbindung von Wildtyp-Plasminogen zu einem angemessenen Grad bei, aber können veränderte Hemmungseigenschaften aufweisen; bevorzugte Plasminogen-Analoga haben eine Plasma-Halbwertszeit, die mit der von Wildtyp-Plasminogen vergleichbar ist, aber diese Eigenschaft ist nicht wesentlich.
In der Sequenz der Throminspaltstelle der erfindungsgemäßen Plasminogen-Analoga kann der basische Aminosäurerest P3 ein Lysin- oder Argininrest sein, der hydrophobe Aminosäurerest P4 kann ein Valin-, Isoleucin- oder Leucinrest sein und jede der nicht-sauren Aminosäurereste P1' und P2' können unabhängig voneinander ein Valin- oder Isoleucinrest sein.
In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform ist der basische Aminosäurerest P3 ein Lysinrest, und der hydrophobe Aminosäurerest P4 ist Isoleucin. In einer anderen Ausführungsform sind zusätzlich zu P3, das Lysin ist, und P4, das Isoleucin ist, die nicht-sauren Reste P1' und P2' jeweils Isoleucin und Valin.
In einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform ist der basische Aminosäurerest P3 ein Argininrest, und der hydrophobe Aminosäurerest ist Leucin. In wiederum einer anderen Ausführungsform ist P3 Arginin und P4 Leucin, und zusätzlich sind die nicht sauren Reste P1' und P2' beide Valin.
Bestimmte im Umfang dieser Erfindung liegende Plasminogen-Analoga enthalten die Spaltstelle Ile-Lys-Pro-Arg-P1'-P2', Thr-Thr-Lys-Ile-Lys- Pro-Arg-P1'-P2' oder die Spaltstelle Leu-Arg-Pro-Arg-P1'-P2', worin P1' und P2' jeweils unabhängig voneinander ein nicht-saurer Aminosäurerest sind. P1' und P2' können wie erwähnt Isoleucin- oder Valinreste sein. Andere innerhalb des Umfangs dieser Erfindung liegende bestimmte Plasminogen-Analoga enthalten die Spaltstelle Val-Glu-Leu-Gln-Gly-Leu-Arg- Pro-Arg-Val-Val, Gly-Gln-Lys-Thr-Leu-Arg-Pro-Arg-Val-Val, Ala-Gly-Gln- Lys-Thr-Leu-Arg-Pro-Arg-Val-Val, Ala-Leu-Arg-Pro-Arg-Val-Val oder Ala- Thr-Thr-Lys-Ile-Lys-Pro-Arg-Ile-Val.
Spezifische und bevorzugte erfindungsgemäße Verbindungen sind Plasminogen-Analoga, bei denen relativ zum Wildtyp-Plasminogen:
a) Pro559-Gly560 durch Thr-Thr-Lys-Ile-Lys-Pro ausgetauscht sind und Val562 durch Ile ausgetauscht ist. Bei diesem Analog ist die Aminosäure 563 Valin wie im Wildtyp. Diese Mutante wurde mit BB10151 bezeichnet.
b) Cys558-Pro559-Gly560 durch Ala-Gly-Gln-Lys-Thr-Leu-Arg-Pro ausgetauscht sind und Cys566 durch Ala ausgetauscht ist. Bei diesem Analog sind die Aminosäuren 562 und 563 Valin wie im Wildtyp. Diese Mutante wurde mit BB10156 bezeichnet.
c) Cys558-Pro559-Gly560 durch Ala-Leu-Arg-Pro ausgetauscht sind und Cys566 durch Ala ausgetauscht ist. Bei diesem Analog sind die Aminosäuren 562 und 563 Valin wie im Wildtyp. Diese Mutante wurde mit BB10170 bezeichnet.
d) Pro559-Gly560 durch Val-Glu-Leu-Gln-Gly-Leu-Arg-Pro ausgetauscht sind. Bei diesem Analog sind die Aminosäuren 562 und 563 Valin wie im Wildtyp. Diese Mutante wurde mit BB10171 bezeichnet.
e) Cys558-Pro559-Gly560 durch Ala-Thr-Thr-Lys-Ile-Lys-Pro ausgetauscht sind und Val562 durch Ile und Cys566 durch Ala ausgetauscht ist. Diese Mutante wurde mit BB10158 bezeichnet.
f) Pro559-Gly560 durch Gly-Gln-Lys-Thr-Leu-Arg-Pro ausgetauscht sind.
Erfindungsgemäße Plasminogen-Analoga wurden in Bezug auf die Beschaffenheit der Sequenz der thrombinspaltbaren Stelle definiert, da es die überraschende Schnelligkeit der Spaltung an dieser Stelle ist, die der verbesserten thrombolytischen Aktivität der Verbindungen unterliegt. Es ist jedoch wahrscheinlich, daß erfindungsgemäße Plasminogen-Analoga (d. h. die die jetzt identifizierten neuen Sequenzen der Spaltstellen enthalten) andere Modifikationen (im Vergleich mit Wildtyp-Plasminogen) ent halten können, die ein oder mehrere Additionen, Deletionen oder Substitutionen an Stellen, die mehr oder weniger entfernt von der Spaltstelle liegen, sein können, ohne das Verlust der Vorteil der schnellen Spaltung verloren geht. Diese Additions-, Deletions- oder Substitutionsmutationen liegen folglich außerhalb der Domäne der Verbindung, die der Serinprotease-Domäne von Wildtyp-Plasminogen entspricht. Ein Beispiel einer solchen Modifikation würde die Addition, Entfernung, Substitution oder Änderung einer oder mehrerer Kringle-Domänen sein, um die Aktivität der Fibrinbindung zu ändern oder die α-2-Antiplasmin-Bindung zu verringern. Ein spezifisches Beispiel wäre die Mutation der Lysin-Bindungsstelle, die auf dem Kringle 1 lokalisiert ist, um die Bindung von α-2-Antiplasmin an diese Stelle zu stören. Solche Varianten können in Bezug auf die Hemmung durch α-2-Antiplasmin resistent sein. Bevorzugte Ausführungsformen umfassen BB10189, BB10190, BB10192, die jeweils die Plasminogen-Analoga von BB10153, BB010170 und BB10171 mit zusätzlichen Mutationen von Asp137 > Ser und Asp137 > Ser sind.
Ein anderes Beispiel wäre eine Mutation, die die Bildung der Disulfidbindung zwischen Cys558 und Cys566 verhindert, zum Beispiel durch Deletieren oder Austauschen eines oder beider Cysteinreste, um die Einschränkung hinsichtlich der Spaltstelle durch die zwischen den Cysteinresten gebildeten Disulfidbindung zu überwinden. In einer anderen erfindungsgemäßen Ausführungsform wird ein Cystein oder beide Cysteine durch Alanin- oder Serinreste ausgetauscht. Von den oben beschriebenen bevorzugten Ausführungsformen haben die Varianten BB10156, BB010158 und BB10170 solche offenschleifigen Modifikationen.
Ein Beispiel einer eine Deletion umfassenden Modifikation würden Lys-Plasminogen-Varianten eines Plasminogen-Analogs sein, bei dem die aminoterminalen Aminosäuren 68, 77 oder 78 deletiert wurden. Solche Varianten können erhöhte Aktivität der Fibrinbindung haben, wie für Lys- Plasminogen im Vergleich zu Glu-Plasminogen des Wildtyps beobachtet wurde (Bok, R. A. und Mangel, W. F., 1985, Biochemistry 24, 3279-3286). Ein weiteres eine Deletion umfassendes Beispiel würden die Varianten eines Plasminogen-Analogs sein, bei dem die Kringle 1 oder Kringle-Domänen 1 bis 4 zur Beeinträchtigung der α-2-Antiplasmin-Bindung deletiert wurden. Solche Varianten können in Bezug auf die Hemmung durch α-2-Antiplasmin resistent sein. Die Deletion der Kringle 1 bis 4 würde außerdem die Fibrin-Bindung und die pharmakokinetischen Eigenschaften des Moleküls ändern.
Für das erfindungsgemäße Gerinnsel-hochselektive Plasminogen-Analog kann es bevorzugt sein, eine Mutation in der Serinprotease-Domäne einzuführen, die die Plasmininhibitor-Bindung stört (SEQ. ID Nr. 2 stellt die Serinprotease-Domäne von Plasmin des Wildtyps dar und Bezugnahmen auf diese Domäne wurden hier numeriert, wobei die Numerierung der SEQ. ID Nr. 2 verwendet wurde). Die Mutation könnte in einer Position sein, die analog zu der ist, von der gezeigt wurde, daß sie die Hemmstoff-Bindung an Gewebsplasminogenaktivator verhindert (Madison, E. L. et al., 1989, Nature 339, 721-724). Besondere Plasminogen-Analoga mit zusätzlichen Mutationen innerhalb der Serinprotease-Domäne von Plasmin sind Glu606 zu Lys oder Glu623 zu Lys. In einer anderen erfindungsgemäßen Ausführungsform befinden sich Additions-, Deletions- oder Substitutions-Mutationen in Resten in einem Bereich, der den Resten 22 oder 24 der Protease-Domäne von Plasmin entspricht. Besondere Plasminogen-Analoga mit zusätzlichen Mutationen an den Positionen 22 oder 24 der Serinprotease-Domäne sind solche, die ein oder zwei der folgenden Mutationen haben: Phe583 zu Arg oder Met585 zu Arg. Alternativ können sie an einer anderen Position liegen, die die Inhibitorbindung an Plasminogen verhindert. Solche Additionen, Deletionen oder Substitutionen können sich in einem oder mehreren Resten in enger räumlicher Nähe, außer der Sequenznähe, an einer Stelle der Wechselwirkung zwischen der Verbindung und Antiplasmin befinden. Geeignete Plasminogen-Analoga würden diese Sequenz-Additionen, -Deletionen oder -Substitutionen in einem Rest oder in Resten in einem Bereich haben, der den Resten 17-20, 44-54, 62, 154, 158 oder 198-213 der Protease-Domänen von Plasmin entspricht (unter Verwendung der Numerierung der SEQ. ID Nr. 2); solche Modifikationen sind in der anhängigen Patentanmeldung WO-A-9403614 beschrieben, die Endopeptidasen der Chymotrypsin-Überfamilie offenbart, die in Bezug auf Serinprotease-Hemmstoffe Resistenz entfalten. Eine solche Resistenz wird durch eine Modifikation in der Endopeptidase oder ihrem Vorläufer bereitgestellt, der folgendes induziert
a) eine Konformationsänderung in der örtlichen Faltung der Protease,
b) eine Änderung in den relativen Orientierungen der Protease und des Inhibitors bei der Bildung eines Komplexes,
c) eine Änderung in dem sterischen Volumen der Protease im Bereich des Inhibitors,
d) eine Änderung des elektrostatischen potentiellen Feldes im Bereich der Inhibitor-Bindungsstelle oder,
e) eine Kombination der obigen.
Geeignete erfindungsgemäße Plasminogen-Analoga besitzen ein oder mehrere der folgenden Mutationen: Glu62 zu Lys oder Ala, Ser17 zu Leu, Arg19 zu Glu oder Ala, oder Glu45 zu Lys, Arg oder Ala der Serinprotease- Domäne von Plasminogen des Wildtyps (SEQ. ID Nr. 2).
Eine bevorzugte Ausführungsform ist BB10158 mit der A4 Mutation (Glu606 zu Lys), die in WO-A-9403614 (BB10199) beschrieben ist. Diese Mutation ist darauf abgestellt, ionische Wechselwirkungen auf der Oberfläche von Plasminogen zu unterbrechen und die Bindung an Antiplasmin zu stören. Die Mutagenese wurde unter Verwendung eines 24-Basen Oligonucleotids 5'CTT GGG GAC TTC TTC AAG CAG TGG3', das darauf abgestellt ist, Glu606 zu Lys umzuwandeln, durchgeführt. Andere bevorzugte Ausführungsformen haben entweder einzeln oder in Kombination Mutationen an Glu606, Glu623, Phe583, Met585 oder Lys607. Die Glu606 und Glu623 Mutationen sind in WO-A-9403614 beschrieben. Ein Beispiel dieser Ausführungsform ist BB10153, das das Plasminogen-Analog BB10151 mit zusätzlichen Mutationen von Glu606 zu Lys und Glu623 zu Lys ist.
Andere erfindungsgemäße mehrfach modifizierte Plasminogen-Analoga können ein oder mehrere Modifikationen umfassen, um Glycosylierungsmuster zu verhindern, zu verringern oder zu ändern. Plasminogen-Analoga, die solche Modifikationen umfassen, können eine längere Halbwertszeit, eine verringerte Plasma-Clearance und/oder höhere spezifische Aktivität haben. Bevorzugte Merkmale der Plasminogen-Analoga innerhalb des Umfangs dieser Erfindung sind außerdem, wo geeignet, auf andere erfindungsgemäße Verbindungen, mutatis mutandis, anzuwenden.
Die Plasminogen-Analoga des ersten erfindungsgemäßen Aspekts können durch alle herkömmlichen Wege synthetisiert werden. Gemäß eines zweiten erfindungsgemäßen Aspekts wird ein Verfahren zur Herstellung eines solchen Plasminogen-Analogs bereitgestellt, worin das Verfahren die Kupplung aufeinanderfolgender Aminosäurereste und/oder die Ligasierung von Oligopeptiden umfaßt. Obwohl Proteine im Prinzip ganz oder teilweise durch chemische Mittel synthetisiert werden können, ist es bevorzugt, sie durch ribosomale Translation einer entsprechenden Nukleinsäuresequenz, bevorzugt in vivo, herzustellen. Das Protein kann entsprechend glykolylisiert sein.
Es ist bevorzugt erfindungsgemäße Proteine unter Verwendung der rekombinanten DNA-Technologie herzustellen. DNA, die ein natürlich vorkommendes Plasminogen codiert, kann von einer cDNA oder einem Genomklon erhalten oder synthetisiert werden. Aminosäuresubstitutionen, -additionen oder -deletionen werden bevorzugt durch seitengerichtete Mutagenese eingeführt. Plasminogen-Analoga codierende DNA-Sequenzen können durch Verfahren erhalten werden, die dem Fachmann der Gentechnologie vertraut sind.
Das Verfahren zur Herstellung von Proteinen unter Verwendung rekombinanter DNA-Technologie umfaßt gewöhnlich die Schritte: Einführen einer geeigneten codierenden Sequenz in einen Expressionsvektor und Übertragen des Vektors in eine Wirtszelle. Daher wird gemäß eines dritten erfindungsgemäßen Aspekts eine synthetische oder rekombinante Nucleinsäure bereitgestellt, die eine proteinartige Verbindung, wie oben beschrieben, codiert. Die Nucleinsäure kann RNA oder DNA sein und kann in Form eines Vektors vorliegen, wie ein Plasmid, Cosmid oder Phage. Der Vektor kann angepaßt sein, um prokaryontische (z. B. bakterielle) Zellen und/oder eukaryontische (z. B. Hefe oder Säuger) Zellen zu transfektieren oder transformieren. Ein Vektor umfaßt eine Klonierungsstelle und gewöhnlich mindestens ein Markergen. Ein Expressionsvektor hat einen Promotor, der operativ an die Sequenz gebunden ist, die in die Klonierungsstelle einzuführen ist, und bevorzugt eine Sequenz, die die Sekretion des Proteinerzeugnisses ermöglicht.
Die erfindungsgemäßen Plasminogen-Analoga können unter Verwendung eines Vektors des in WO-A-9109118 beschriebenen Typs exprimiert werden, der eine erste Nucleinsäuresequenz umfaßt, die ein Protein codiert oder eine Klonierungsstelle umfaßt, die operativ an eine zweite Nucleinsäuresequenz gebunden ist, die einen starken Promotor oder eine von menschlichem Cytomegalovirus abstammende Enhancersequenz umfaßt, eine dritte Nucleinsäuresequenz, die eine von SV40 abstammende Polyadenylierungs-Sequenz codiert und eine vierte Nucleinsäuresequenz, die einen selektierbaren Marker codiert, der durch einen SV40 Promotor exprimiert wird und ein zusätzliches SV40 Polyadenylierungs-Signal am 3'-Ende der selektierbaren Markersequenz hat.
Es ist zu verstehen, daß der Ausdruck "Vektor" in dieser Beschreibung im funktionellen Sinn verwendet wird und nicht notwendigerweise auf ein einziges Nucleinsäuremolekül beschränkt ist. Zum Beispiel können die oben definierten Sequenzen 1, 2 und 3 des Vektors von einem ersten Nucleinsäuremolekül umfaßt sein, und die vierte Sequenz kann in einem zweiten Nucleinsäuremolekül enthalten sein.
Dieser Vektor ermöglicht, daß die Plasminogen-Analoga exprimiert und in das Zellkulturmedium in einer biologisch aktiven Form ohne die Notwendigkeit zusätzlicher biologischer oder chemischer Verfahren abgesondert werden.
Gemäß einem dritten Aspekt dieser Erfindung wird ein Verfahren zum Herstellen einer Nucleinsäure bereitgestellt, die die oben beschriebenen Plasminogen-Analoga codiert, worin das Verfahren die Kupplung aufeinanderfolgender Nucleotide und/oder die Ligasierung von Oligo- und/oder Polynucleotiden umfaßt.
In einem weiteren Aspekt dieser Erfindung wird eine Zelle oder Zellinie bereitgestellt, die durch die Nucleinsäure und/oder einen Vektor, wie oben beschrieben, transformiert ist. Geeignete zu transformierende Zellen oder Zellinien umfassen sowohl prokaryontische (zum Beispiel Escherichia coli) als auch eukaryontische Zellen, wie Hefezellen (einschließlich Saccharomyces cerevisiae und Pichia pastoris) und Säugerzellen. Säugerzellen, die in kontinuierlicher Kultur wachsen und durch Standardtechniken transfiziert oder sonst transformiert werden können, sind bevorzugt. Beispiele geeigneter Zellen umfassen Eierstockzellen des chinesischen Hamsters (CHO), Maus-Myelom-Zellinien, wie NSO und P3X63- Ag8.653, COS-Zellen, HeLa-Zellen, BHK-Zellen, Melanom-Zellinien, wie Bowes-Zellinie, Maus-L-Zellen, menschliche Hepatom-Zellinien, wie Hep G2, Maus-Fibroblasten und Maus-NIH 3T3-Zellen. CHO-Zellen sind Expressionswirte von Plasminogen und Plasminogen-Analoga besonders bevorzugt.
Die Transformation kann durch jedes herkömmliche Verfahren erreicht werden, wobei Elektroporation besonders geeignet ist.
Erfindungsgemäße Plasminogen-Analoga können zur Prophylaxe und/oder Behandlung von Zuständen verwendet werden, die durch eine Gleichgewichtsstörung zwischen der Gerinnung und Fibrinolyse verursacht werden, worin das Verfahren die Verabreichung einer wirksamen Menge des Plasminogen- Analogs an einen Patienten umfaßt. Daher wird gemäß einem weiteren Aspekt dieser Erfindung ein hier offenbartes Plasminogen-Analog zur Ver wendung in der Medizin bereitgestellt, insbesondere bei der Prophylaxe und/oder Behandlung von Zuständen, die durch eine Gleichgewichtsstörung zwischen Gerinnung und Fibrinolyse verursacht werden, wobei es gewünscht ist, örtliche fibrinolytische und/oder antikoagulierende Aktivität zu liefern. Solche Zustände umfassen Herz- und Hirninfarkt, arterielle und venöse Thrombose, Thromembolie, postoperative Adhäsionen, Thrombophlebitis und diabetische Gefäßerkrankungen und mit Krebs verbundene Gerinnungsungleichgewichte.
Die Erfindung stellt außerdem die Verwendung eines hier offenbarten Plasminogen-Analogs bei der Herstellung eines thrombolytischen, antithrombotischen oder thrombolytischen antithrombotischen Mittels bereit. Außerdem wird eine pharmazeutische oder veterinäre Zusammensetzung bereitgestellt, umfassend ein oder mehrere hier offenbarte Plasminogen- Analoga und einen pharmazeutisch oder veterinär annehmbaren Träger. Eine solche Zusammensetzung kann zur oralen Verabreichung oder zur Verabreichung durch intravenöse oder intramuskuläre Injektion oder durch Infusion angepaßt werden. Geeignete injizierbare Zusammensetzungen umfassen Präparationen aus sterilem/sterilen Plasminogen-Analog/Plasminogen-Analoga in isotonischer physiologischer Kochsalzlösung und/oder Puffer und können außerdem ein lokales Anaesthetikum umfassen, um den Schmerz durch die Injektion zu lindern. Ähnliche Zusammensetzungen können für die Infusion verwendet werden. Wenn die Verbindung zur topischen Behandlung verabreicht wird, kann sie als eine Creme, Salbe oder Lotion in einer geeigneten Base formuliert sein.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können in Form einer Einheitsdosierung, zum Beispiel als Trockenpulver oder wasserfreies Konzentration in einem hermetisch abgeschlossenen Behälter, wie einer Ampulle oder einem Sachet, bereitgestellt werden.
Die zu verabreichende Materialmenge ist abhängig von der erforderlichen Menge zur Fibrinolyse oder der Hemmung der Gerinnung, der erforderlichen Wirkungsgeschwindigkeit, der Ernsthaftigkeit der thromboembolytischen Position und der Gerinnselgröße. Die genaue zu verabreichende Dosis wird durch den Arzt bestimmt wegen des Wesens des Zustandes, der durch die erfindungsgemäßen Verbindungen behandelt werden soll. Als Richtlinie erhält ein zu behandelnder Patient bei einem Hauptthrombus im allgemeinen eine tägliche Dosis eines Plasminogen-Analogs von 0,01 bis 10 mg/kg Körpergewicht entweder durch Injektion zum Beispiel durch bis zu 5 Dosen oder durch Infusion.
Die folgenden Figuren und Beispiele der Erfindung sollen die Erfindung veranschaulichen, sind aber in keiner Weise als beschränkend anzusehen. In den Abbildungen, auf die in den Beispielen Bezug genommen wird, zeigt
Fig. 1 die Spaltrate von BB10151 (T51) durch Thrombin,
Fig. 2 die Ergebnisse eines chromogenen Assays, das die Aktivierung von BB101151 (T51) und T19 durch Thrombin vergleicht,
Fig. 3 die Aktivität der Gerinnsellyse von BB101151 (T51).

Beispiel 1: Expression und Reinigung von BB10151

Die Isolierung der Plasminogen-cDNA und die Herstellung der Vektoren pGWH und pGWHgP wurde in WO-A-9109118 beschrieben. Bei pGWHgP kann die Transkription der Plasminogen-cDNA durch den HCMV Promoter/Enhancer initiiert werden, und der selektierbare Marker gpt wird verwendet. Die Techniken der genetischen Manipulation, Expression und Proteinreinigung, die bei der Herstellung des modifizierten Plasminogen-Beispiels, welches gleich folgt, verwendet werden, sind dem Fachmann der Biotechnologie bekannt. Eine Beschreibung der meisten Techniken kann in den folgenden Laborhandbüchern gefunden werden: "Molecular Cloning" von T. Maniatis, E. F. Fritsch und J. Sambrook, herausgegeben von Cold Spring Harbor Laboratory, Box 100, New York, oder "Basic Methods in Molecular Biology" von L. G. Davis, M. D. Dibner und J. F. Battey, herausgegeben von Elsevier Science Publishing Co. Inc., New York.
Zusätzliche und modifizierte Methodiken sind in den Verfahrensabschnitten unten detailliert aufgeführt.
BB10151 ist eine Plasminogen-Analog, bei dem die Aminosäurereste Pro559-Gly560 von Wildtyp-Plasminogen durch Thr-Thr-Lys-Ile-Lys-Pro ausgetauscht sind und Val562 durch Ile ausgetauscht ist, um ein Spaltschleife, die durch Thrombin spaltbar ist, herzustellen (SEQ. ID Nr. 1). Diese Stelle basiert auf einer potentiellen Thrombinspaltstelle von Faktor XI. Die in diesem Beispiel verwendeten Verfahren sind im wesentlichen in den Beispielen 2 und 3 von WO-A-9109118 beschrieben, wobei die Mutagenese-Reaktion mit dem 1,87kb I bis II Fragment von Plasminogen durchgeführt wird, das in den Bakteriophagen M13mp18 kloniert wird. Eine einzelstrangige Matrix wurde hergestellt und die Mutation durch oligonucleotid-gerichtete Mutagenese hervorgerufen. In diesem Fall wurde zum Führen der Mutagenese ein 48 Basen langes Oligonucleotid (5'CAC CCC CCT ACG ATT CTA GGT TTA ATT TTA GTT GTA CAT TTC TTC GGC3') (SEQ. ID Nr. 4) verwendet.
Die Plasmid-DNA wurde in CHO-Zellen durch Elektroporation unter Verwendung von 800 V und 25 uF eingeführt. Ein selektives Medium, enthaltend 250 ul/ml Xanthin, 5 ug/ml Mycophenolinsäure und 1 · Hypoxanthin- Thymidin (HT), wurde 24 Stunden nach der Transfektion zu den Zellen gegeben, und das Medium wurde alle zwei bis drei Tage gewechselt. Die Platten, die gpt-resistente Kolonien hervorbrachten, wurden auf Plasminogen-Herstellung unter Verwendung eines ELISA-Assays gescreent. Die Zellen, die die höchsten Antigengehalte herstellten, wurden wieder kloniert, und die besten Hersteller wurden in Kolben vermehrt, wobei die Herstellung vorsichtig beobachtet wurde. Gefrorene Stocks von all diesen Zellinien wurden niedergelegt. Herstellende Zellen wurden in Rollflaschen vermehrt, um konditioniertes Medium bereitzustellen, aus dem das Plasminogenprotein unter Verwendung von Lysin SEPHAROSE 4B gereinigt wurde (das Wort SEPHAROSE ist eine Marke). Die Zellinie, die verwendet wurde, um dieses mutante Protein herzustellen, war 123. C6.

Beispiel 2: Herstellung von BB10153

BB10153 ist ein Derivat von BB10151, enthaltend zwei zusätzliche Mutationen (Glu606 zu Lys und Glu623 zu Lys), um die Bindung von α-2-Antiplasmin zu beeinträchtigen. Das 663 bp RV bis I Fragment von BB10151 (das in pUC kloniert wurde - siehe Beispiel 1) wurde entfernt und durch das äquivalente 663 bp Fragment der Antiplasmin-resistenten Mutante A3A4 ersetzt. Die Herstellung davon ist in Beispiel 5 von WO-A-9403614 beschrieben. Das 24 Basen Nucleotid 5'CTT GGG GAC TTC TTC AAG CAG TGG3' (SEQ. ID Nr. 3) wurde verwendet, um Glu606 zu Lys umzuwandeln, und das 27 Basen Oligonucleotid 5'GTT CGA GAT TCA CTT TTT GGT GTG CAC3' (SEQ. ID Nr. 5) wurde verwendet, um Glu606 zu Lys umzuwandeln. Das gesamte Plasminogen wurde anschließend in den Expressionsvektor pGWlH kloniert, bevor der Selektionsmarker gpt eingeführt wurde, wie in WO-A-9109118, Beispiel 2, beschrieben.

Beispiel 3: Herstellung von BB10156, BB10158 und BB10170

Die DNA, die die Plasminogen-Mutante BB10150 codiert, wurde als Matrix zur Herstellung von BB10156, BB10158 und BB10170 verwendet. BB10150 ist ein Plasminogen-Analog, bei dem die Aminosäurereste Pro559-Gly560 von Wildtyp-Plasminogen durch Val-Val-Pro ausgetauscht sind und das zusätz lich die Mutationen Cys558 zu Ala und Cys566 zu Ala hat, um die Bildung der Disulfidbindung zu verhindern. Die Sequenz der offenen Spaltschleife von BB10150 ist in SEQ. ID Nr. 6 gezeigt. BB10150 wurde durch Mutagenese unter Verwendung von zwei Oligonucleotidprimern (5'CTA GGT ACA ACC GCT TTC TTC GGC T3' (SEQ. ID Nr. 7) und 5'GGT GGG CCA CCG CCC CCC CCA C3' (SEQ. ID Nr. 8)) hergestellt und das 1,87 kg I bis II Fragment der Mutante T13 (siehe Patentanmeldung WO-A-9109118, Beispiel 13 und SEQ. ID Nr. 9) in M13 kloniert.
Die Plasminogen-Analoga BB10156, BB10158 und BB10170 wurden alle durch seitengerichtete Mutagenese unter Verwendung der zuvor beschriebenen Mutante BB10150 in M13 als Matrix hergestellt, so daß sie alle die gleichen Cys zu Ala Mutationen der Reste 558 und 556 haben. BB10156 ist ein Plasminogen-Analog, bei dem die Aminosäurereste Pro559-Gly560 durch Gly-Gln-Lys-Thr-Leu-Arg-Pro (SEQ. ID Nr. 10) ausgetauscht sind. BB10158 ist ein Plasminogen-Analog, bei dem die Aminosäurereste Pro559-Gly560 durch Thr-Thr-Lys-Ile-Lys-Pro ausgetauscht sind und Val562 durch Ile ausgetauscht ist (SEQ. ID Nr. 11). BB10170 ist ein Plasminogen-Analog, bei dem die Aminosäurereste Pro559-Gly560 durch Leu-Arg-Pro ausgetauscht sind (SEQ. ID Nr. 12). Die Oligonucleotide, die verwendet wurden, um jede Mutagenese zu primieren, sind unten gezeigt:

MUTANTE OLIGONUCLEOTIDSEQUENZ

BB10156 (SEQ. ID Nr. 13)
5'CAA CCC TAG GTC TAA GTG TTT TCT GAC CCG CTT TCT TCG3'
BB10158 (SEQ. ID Nr. 14)
5'CAA CCC TAG GTT TGA TCT TCG TTG TCG CTT TCT TCG3'
BB10170(SEQ. ID Nr. 15)
5'CAC AAC CCT AGG TCT AAG CGC TTT CTT CGG3'
In jedem Fall wurde nach dem DNA-Sequenzieren die Mutation direkt in den pGW1Hg-Plasminogen-Expressionsvektor unter Verwendung der Restriktionsenzyme III und I kloniert. Diese Stellen wurden jeweils zuvor an dem äußersten 5'-Ende von Plasminogen und an 1850 durch Mutagenese eingeführt; die codierende Aminosäuresequenz von Plasminogen wurde durch dieses Verfahren nicht beeinträchtigt.

Beispiel 4: Herstellung von BB10169 und BB10171

BB10169 ist ein Plasminogen-Analog, bei dem die Aminosäurereste Pro559-Gly560 von Wildtyp-Plasminogen durch Val-Glu-Leu-Gln-Gly-Ile-Lys- Pro ausgetauscht sind und Val562 durch Ile ausgetauscht ist (SEQ. ID Nr. 16). BB10169 wurde durch Oligonucleotid-gerichtete Mutagenese von BB10151 in M13 unter Verwendung des 42 Basen Nucleotids (5'GAT TCT AGG TTT AAT GCC CTG CAG TTC CAC ACA TTT CTT CGG 3' (SEQ. ID Nr. 17) hergestellt, gefolgt von Klonierung in pGW1Hg-Plasminogen unter Verwendung von III und I.
BB10169 ist ein Plasminogen-Analog, bei dem die Aminosäurereste Pro559-Gly560 durch Val-Glu-Leu-Gln-Gly-Leu-Arg-Pro ausgetauscht sind (SEQ. ID Nr. 18). Der einzelstrangige M13 von BB10169 wurde als Matrix zur Herstellung von BB10171 verwendet. Die Mutagenese wurde unter Verwendung des 39 Basen Oligonucleotids
5'CAC CCC CCT ACC ACT CTG GGT CTC AGG CCC TGC AGT TCC3' (SEQ. ID Nr. 19) primerisiert und nach dem DNA-Sequenzieren wurde es in den Expressionsvektor unter Verwendung von von III und I kloniert.

Beispiel 5: Herstellung und Expression von BB10189, BBlO190 und BB10191

Die Plasminogen-Analoga BB10189, BB10190 und BB10191 haben die Kringle 1 Doppelmutation Asp137 zu Ser, Asp139 zu Ser, um die Lysin-Bindungsstelle unwirksam zu machen. Die Mutation wurde in den BB10153, BB10170 und BB10171 Hintergründen (siehe Beispiele 2, 3 und 4) unter Verwendung des 28 Basen Oligonucleotids 5'CCC TGC GGA GAG TTG GAT GGA TTC CTG C3' (SEQ. ID No. 20) durchgeführt. Die Mutation wurde anschließend in pGW1Hg-Plasminogen kloniert unter Verwendung der Restriktionsenzyme III und I.

Beispiel 6: Herstellung von BB10181

BB10181 hat die Spaltstellensequenz von BB10170 und eine zusätzliche Mutation von Phe583 zu Arg, um die Bindung von α-2-Antiplasmin zu stören. BB10181 wurde über ein intermediäres, auf BB10150 basierendem Konstrukt, unter Verwendung von M13, enthaltend die gesamte Länge von BB10150 als Matrix und das Oligonucleotid
5'GAA GTG CAT TCC TCT CCT CGT ACG AAG 3' (SEQ. ID No. 21) als Primer hergestellt. Das mutierte BB10150-Gen wurde anschließend in pGW1Hg- Plasminogen kloniert unter Verwendung der Restriktionsenzyme III und I. Der BB10181 Expressionsvektor wurde daraufhin von diesem Zwischenprodukt durch Austausch des III bis 1 Fragments dieses Plasmids mit dem entsprechenden Teil von BB10170 hergestellt (siehe Beispiel 3).

Beispiel 7: Herstellung von BB10186

BB10186 hat die Spaltstellensequenz von BB10171 und eine zusätzliche Mutation von Met585 zu Arg, um die Bindung von α-2-Antiplasmin zu stören.
BB10186 wurde auf die gleiche Weise hergestellt, wie in dem obigen Beispiel 6 für BB10181 beschrieben. Das intermediäre BB10150 Konstrukt wurde hergestellt unter Verwendung des 25 Basen langen Oligonucleotids 5'CCA CAG AAG TCT CTT CCA AAC CTC G3' (SEQ. ID No. 22) gefolgt von der Klonierung in pGWlHg. BB10186 wurde anschließend durch einen Fragmentaustausch unter Verwendung des III bis I Fragments von BB10170 (siehe Beispiel 4) hergestellt.

Beispiel 8: Herstellung von BB10199

BB10199 hat die Spaltstellensequenz von BB10158 und eine zusätzliche Mutation von Glu606 zu Lys, um die Bindung von α-2-Antiplasmin zu stören. BB10199 wurde im wesentlichen wie in den Beispielen 2 und 3 von WO-A- 9403614 beschrieben hergestellt. Das I bis RV Fragment von BB10158 (siehe obiges Beispiel 3) wurde verwendet, um das entsprechende Fragment eines BB10151 Glu606 zu Lys-Konstrukts, das in pUC kloniert wurde, auszutauschen und wurde anschließend in den Endexpressionsvektor kloniert, wie in WO-A-9403614 beschrieben.

Beispiel 9: Spaltung von BB10151

Die Plasminogen-Mutanten (12,5 ug) wurden mit 2, 8 ug Thrombin inkubiert, wie in Verfahren 1 beschrieben. Der Zeitverlauf der Spaltung der Plasminogen-Mutanten wurde durch quantitatives Gelscannen bestimmt; Spaltungszeiten für T19 und BB10151 von 50% waren jeweils 9 und 3 Minuten. Die Daten der Gelscans für die Spaltung von BB10151 sind in Fig. 1 gezeigt.

Beispiel 10: Aktivierung von BBl0l5l

Gereinigtes BB10151 Protein wurde auf Aktivierung unter Verwendung des gebundenen chromogenen Assays untersucht (siehe Verfahren 2.1). Die Ergebnisse dieses Assays sind in Fig. 2 gezeigt, wobei die Erhöhung der Absorption bei 405 nm mit der Zeit zeigt, daß die Plasminaktivität durch Inkubierung von BB10151 mit Thrombin erzeugt wird. T19 ist zum Vergleich gezeigt, und es wurde festgestellt, daß es ungefähr zweimal weniger wirksam als BB10151 in diesem Assay ist.

Beispiel 11: Lyse von Plasmagerinnsel

Die Fähigkeit von BB10151 und T19, ein Plasmagerinnsel zu lysieren, wurde, wie in Verfahren 2.2-beschrieben, bestimmt, und die Ergebnisse eines solchen Assays sind in Fig. 3 gezeigt. BB10151 (20 ug/ml) konnte die vollständige Lyse des Gerinnsels bewirken, während T19 bei Konzentrationen von bis zu 150 ug/ml das Gerinnsel nicht lysieren konnte.
Folglich wurde festgestellt, daß BB10151 mindestens 7 mal aktiver als T19 bei der Induzierung der Lyse eines Plasmagerinnsels ist.
Repräsentative Beispiele anderer erfindungsgemäßer Plasminogen-Analoga wurden in Bezug auf die Lyseaktivität eines Plasmagerinnsels bei einer Konzentration von 40 ug/ml verglichen, und die Ergebnisse in Tabelle 1 zeigen, daß sie ähnliche Aktivitäten wie BB10151 besitzen. Tabelle 1

Verfahren

1. Spaltungsanalyse

Die Plasminogen-Analoga wurden auf die Empfänglichkeit der Spaltung durch Thrombin unter Verwendung von SDS PAGE unter reduzierten Bedingungen untersucht. Gewöhnliche Inkubierungsvolumen von 0,125 ml in 100 mM Tris/HCl pH 7,4 enthalten das Plasminogen-Analog bei Konzentrationen, die in den Beispielen gezeigt sind, und Thrombin bei Konzentrationen, die in den Beispielen gezeigt sind. Die Inkubierungen wurden bei 37ºC durchgeführt. Kontrollinkubierungen wurden unter den gleichen Bedingungen in Abwesenheit von Thrombin durchgeführt. Die Aktivierungsreaktionen wurden durch Ausfällen des Proteins durch Zugabe von Trichloressigsäure auf ein Endvolumen von 20%- und durch Stehenlassen mehr als 4 Stunden bei 4ºC gestoppt. Anschließend wurden die Niederschläge pelletisiert, mit Aceton gewaschen und wieder in SDS PAGE Probenpuffer (0,1 mM Tris/pH 6,8, 10% Glycerol, 1% SDS, 0,5% Mercaptoethanol und 0,05%Bromphenolblau) suspendiert. Die Proben wurden entweder auf 8 bis 25%igen Gradientengelen oder 12%igen Gelen untersucht. Die resultierenen Gele wurden unter Ver wendung eines SHIMADZU-Gelscanners untersucht, der das Gel scannt und die Proteinkonzentration der Banden durch Bestimmen des Bereichs unter den Peaks berechnet. (Der Ausdruck SHIMADZU ist ein Handelsname). Die Spaltrate von Plasminogen wurde so durch Messen des Verschwindens der Plasminogenbande bei ungefähr 92 kDa, und das Auftreten der Bande der Schwerkette von Plasmin bei ungefähr 66 kDa bestimmt.

2. Analyse der Aktivierung

2.1 Gebundenes chromogenes Assay

Das Plasminogen-Analog und Thrombin wurden zusammen in Gegenwart des chromogenen Substrats S2251 inkubiert und Plasmin, das durch Aktivierung hergestellt wurde, spaltet direkt S2251, was zu einer Erhöhung der Absorption bei 405 nm führt. Das Assay wird in einem Gesamtvolumen von 880 ul in einem Puffer, enthaltend 50 mM Tris/HCl, 0,1 mM EDTA, 0,005% TRITON X100 und 0,1% HSA (der Ausdruck TRITON ist ein Handelsname) durchgeführt. S2251 wurde auf eine Endkonzentration von 0,35 mg/ml zugegeben, und die verwendete Konzentration des Plasminogen-Analogs ist 3 ug/ml. Die verwendete Thrombinkonzentration ist 4,55 NIHU/ml. 100 ul Aliquote der Reaktion wurden durch Inkubation bei 37ºC entfernt und zu 25 ul 4% Essigsäure in Mikrotiterplatten gegeben, um die Reaktion zu stoppen. Bei Beendigung des Zeitablaufs wurden die Platten in einen Mikroplattenleser bei einer Wellenlänge von 405 nm gelesen.

2.2 In vitro Assay der Lyse von Plasmagerinnsel

Eine Mischung aus 50 ul Kaninchenplasma (das mit 3,8% Trinatriumcitrat anticoaguliert wurde), 50 ul APTT-Reagens (Instrumentation Labs) und einem geeigneten Volumen des Plasminogen-Analogs in 0,1 M Tris/HCl pH 7,4 wurde mit demselben Puffer auf 200 ul in einem Well einer 96 Well- Mikrotiterplatte gebracht. Ein getrenntes Well enthält 4,4 ul 500 mM CaCl&sub2;, das mit 50,6 ul desselben Puffers gemischt wurde. Die Platte wurde bei 37ºC 30 Minuten inkubiert, und die Gerinnung wurde durch Übertragen von 50 ul
CaCl&sub2; zu den das Plasminogen enthaltenden Wells begonnen. Der Verlauf der Gerinnselbildung und die Auflösung wurde durch Messen der Absorption bei 405 nm (620 nm Referenz) in Zeitabschnitten während der kontinuierlichen Inkubation bei 37ºC 1 Stunde verfolgt.

Sequence ID Nrn.

1 Cys Thr Thr Lys Ile Lys Pro Arg Ile Val Gly Gly Cys
2 Val Val Gly Gly Cys Val Ala His Pro His Ser Trp Pro Trp Gln Val Ser Leu Arg Thr Arg Phe Gly Met His Phe Cys Gly Gly Thr Leu Ile Ser Pro Glu Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Leu Glu Lys Ser Pro Arg Pro Ser Ser Tyr Lys Val Ile Leu Gly Ala His Gln Glu Val Asn Leu Glu Pro His Gly Gln Glu Ile Glu Val Ser Arg Leu Phe Leu Glu Pro Thr Arg Lys Asp Ile Ala Leu Leu Lys Leu Ser Ser Pro Ala Val Ile Thr Asp Lys Val Ile Pro Ala Cys Leu Pro Ser Pro Asn Tyr Val Val Ala Asp Arg Thr Glu Cys Phe Ile Thr Gly Trp Gly Glu Thr Gln Gly Thr Phe Gly Ala Gly Leu Leu Lys Glu Ala Gln Leu Pro Val Ile Glu Asn Lys Val Cys Asn Arg Tyr Glu Phe Leu Asn Gly Arg Val Gln Ser Thr Glu Leu Cys Ala Gly His Leu Ala Gly Gly Thr Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Phe Glu Lys Asp Lys Tyr Ile Leu Gln Gly Val Thr Ser Trp Gly Leu Gly Cys Ala Arg Pro Asn Lys Pro Gly Val Tyr Val Arg Val Ser Arg Phe Val Thr Trp Ile Glu Gly Val Met Arg Asn Asn
3 5' CTT GGG GAC TTC TTC AAG CAG TGG 3'
4 5' CAC CCC CCT ACG ATT CTA GGT TTA ATT TTA GTT GTA CAT TTC TTC GGC 3'
5 5' GTT CGA GAT TCA CTT TTT GGT GTG CAC 3'
6 Ala Val Val Pro Arg Val Val Gly Gly Ala
7 5' CTA GGT ACA ACC GCT TTC TTC GGC T 3'
8 5' GGT GGG CCA CCG CCC CCC CCA C 3'
9 Cys Val Val Pro Arg Val Val Gly Gly Cys
10 Ala Gly Gln Lys Thr Leu Arg Pro Arg Val Val Gly Gly Ala
11 Ala Thr Thr Lys Ile Lys Pro Arg Ile Val Gly Gly Ala
12 Ala Leu Arg Pro Arg Val Val Gly Gly Ala
13 5' CAA CCC TAG GTC TAA GTG TTT TCT GAC CCG CTT TCT TCG 3'
14 5' CAA CCC TAG GTT TGA TCT TCG TTG TCG CTT TCT TCG 3'
15 5' CAC AAC CCT AGG TCT AAG CGC TTT CTT CGG 3'
16 Cys Val Glu Leu Gln Gly Ile Lys Pro Arg Ile Val Gly Gly Cys
17 5' GAT TCT AGG TTT AAT GCC CTG CAG TTC CAC ACA TTT CTT CGG 3'
18 Cys Val Glu Leu Gln Gly Leu Arg Pro Arg Val Val Gly Gly Cys
19 5' CAC CCC CCT ACC ACT CTG GGT CTC AGG CCC TGC AGT TCC 3'
20 5' CCC TGC GGA GAG TTG GAT GGA TTC CTG C 3'
21 5' GAA GTG CAT TCC TCT CCT CGT ACG AAG 3'
22 5' CCA CAG AAG TGT CTT CCA AAC CTC G 3'

Claims

1. Durch Thrombin aktivierbares Plasminogen-Analog, das Plasmin- Aktivität besitzt, enthaltend die Spaltstellensequenz

P4-P3-Pro-Arg-P1'-P2',

worin P3 ein basischer Aminosäurerest ist, P4 ein hydrophober Aminosäurerest ist und P1' und P2' jeweils unabhängig voneinander ein nicht-saurer Aminosäurerest sind, wobei die Stelle zwischen Arg und P1' durch Thrombin spaltbar ist.

2. Verbindung nach Anspruch 1, worin der basische Aminosäurerest P3 ein Lysin- oder Arginrest ist.

3. Verbindung nach Äraspruch 1 oder 2, worin der hydrophobe Aminosäurerest P4 Isoleucin oder Leucin ist.

4. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin die nichtsauren Aminosäurereste P1' und P2' jeweils unabhängig voneinander Valin oder Isoleucin sind.

5. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin der basische Aminosäurerest P3 ein Leucinrest ist und der hydrophobe Aminosäurerest P4 Isoleucin ist.

6. Verbindung nach Anspruch 5, worin die nicht-sauren Aminosäurereste P1' und P2' jeweils Isoleucin und Valin sind.

7. Verbindung nach Anspruch 1, die die Spaltstelle Ile-Lys-Pro- Arg-P1'-P2' enthält, worin P1' und P2' jeweils unabhängig voneinander eine nicht-saure Aminosäure sind.

8. Verbindung nach Anspruch 7, die die Spaltstellensequenz Thr- Thr-Lys-Ile-Lys-Pro-Arg-Ile-Val enthält.

9. Verbindung nach Anspruch 8, worin Pro559-Gly560 von Wildtyp- Plasminogen durch Thr-Thr-Lys-Ile-Lys-Pro ausgetauscht sind und Val562 durch Ile ausgetauscht ist.

10. Verbindung nach Anspruch 7, die die Spaltstellensequenz Ala- Thr-Thr-Lys-Ile-Lys-Pro-Arg-Ile-Val enthält.

11. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin der basische Aminosäurerest P3 ein Argininrest ist und der hydrophobe Aminosäurerest P4 Leucin ist.

12. Verbindung nach Anspruch 11, worin die nicht-sauren Aminosäurereste P1' und P2' beide Valin sind.

13. Verbindung nach Anspruch 1, die die Spaltstellensequenz Leu- Arg-Pro-Arg-P1'-P2' enthält, worin P1' und P2' jeweils unabhängig voneinander eine nicht-saure Aminosäure sind.

14. Verbindung nach Anspruch 13, die die Spaltstellensequenz Val- Glu-Leu-Gln-Gly-Leu-Arg-Pro-Val-Val enthält.

15. Verbindung nach Anspruch 14, worin Pro559-Gly560 von Wildtyp- Plasminogen durch Val-Glu-Leu-Gln-Gly-Leu-Arg-Pro ausgetauscht sind.

16. Verbindung nach Anspruch 13, die die Spaltstellensequenz Gly- Gln-Lys-Thr-Leu-Arg-Pro-Arg-Val-Val enthält.

17. Verbindung nach Anspruch 16, worin Pro559-Gly560 von Wildtyp- Plasminogen durch Gly-Gln-Lys-Thr-Leu-Arg-Pro ausgetauscht sind.

18. Verbindung nach Anspruch 13, die die Spaltstellensequenz Ala- Gly-Gln-Lys-Thr-Leu-Arg-Pro-Arg-Val-Val enthält.

19. Verbindung nach Anspruch 13, die die Spaltstellensequenz Ala- Leu-Arg-Pro-Arg-Val-Val enthält.

20. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 19, die zusätzlich zu der Spaltstellensequenz Additionen, Deletionen oder Substitutionen relativ zum Wildtyp-Plasminogen umfaßt.

21. Verbindung nach Anspruch 20, bei der eine oder beide Aminosäuren, die Cys558 und Cys566 von Wildtyp-Plasminogen entsprechen, ausgetauscht oder deletiert sind.

22. Verbindung nach Anspruch 21, bei der einer oder beide Reste durch einen Alanin- oder Serinrest/reste ausgetauscht ist/sind.

23. Verbindung nach einem der Ansprüche 20 bis 22, bei der sich Sequenz-Additionen, -Deletionen oder -Substitutionen in der Domäne der Verbindung, die der Serinprotease-Domäne von Wildtyp-Plasminogen (SEQ. ID Nr. 2) entspricht, befinden.

24. Verbindung nach einem der Ansprüche 20 bis 22, bei der sich Sequenz-Additionen, -Deletionen oder -Substitutionen außerhalb der Domäne der Verbindung, die der Serinprotease-Domäne von Wildtyp-Plasminogen (SEQ. ID Nr. 2) entspricht, befinden.

25. Verbindung nach Anspruch 23, bei der sich Sequenz-Additionen, - Deletionen oder -Substitutionen in einem oder mehreren Resten befinden, die in enger räumlicher Nähe, außer der Sequenznähe, zu der Wechselwirkungsstelle zwischen der Verbindung und Antiplasmin sind.

26. Verbindung nach Anspruch 25, die eine oder mehrere der folgenden Mutationen hat: Glu62 zu Lys oder Ala, Ser17 zu Leu, Arg19 zu Glu oder Ala oder Glu45 zu Lys, Arg oder Ala der Serinprotease-Domäne von Wildtyp- Plasminogen (SEQ. ID Nr. 2).

27. Verbindung nach Anspruch 23, bei der sich Sequenz-Additionen, - Deletionen oder -Substitutionen in einem Rest oder in Resten befinden, die in einem Bereich liegen, der den Resten 22 oder 24 der Protease-Domäne von Plasmin entspricht (unter Verwendung der Numerierung von SEQ. ID Nr. 2).

28. Verbindung nach Anspruch 27, die eine oder mehrere der folgenden Mutationen hat: Phe583 zu Arg oder Met585 zu Arg.

29. Verbindung nach Anspruch 25, bei der der Aminosäurerest, der Glu606 von Wildtyp-Plasminogen entspricht, durch einen Lysinrest ausgetauscht ist.

30. Verbindung nach Anspruch 25, bei der der Aminosäurerest, der Glu623 von Wildtyp-Plasminogen entspricht, durch einen Lysinrest substituiert ist.

31. Verbindung nach Anspruch 24, die Lys-Plasminogen entspricht, bei der die N-terminale Domäne deletiert worden ist.

32. Verbindung nach Anspruch 24, bei der die Aminosäurereste, die den aminoterminalen Aminosäureresten 68, 77 oder 78 von Wildtyp-Plasminogen entsprechen, deletiert worden sind.

33. Verbindung nach Anspruch 24, bei der eine oder mehrere Kringle- Domänen, die den Kringle-Domänen von Wildtyp-Plasminogen entsprechen, deletiert sind.

34. Verbindung nach Anspruch 24, enthaltend ein oder mehrere der folgenden Mutationen: Asp137 zu Ser oder Asp139 zu Ser.

35. Verbindung nach Anspruch 1, worin Pro559-Gly560 von Wildtyp- Plasminogen durch Thr-Thr-Lys-Ile-Lys-Pro ausgetauscht sind, Val562 durch Ile, Glu606 durch Lys und Glu623 durch Lys ausgetauscht ist.

36. Verbindung nach Anspruch 1, worin Cys558-Pro559-Gly560 von Wildtyp-Plasminogen durch Ala-Gly-Gln-Lys-Thr-Leu-Arg-Pro ausgetauscht sind und Cys566 durch Ala ausgetauscht ist.

37. Verbindung nach Anspruch 1, worin Cys558-Pro559-Gly560 von Wildtyp-Plasminogen durch Ala-Leu-Arg-Pro ausgetauscht sind und Cys566 durch Ala ausgetauscht ist.

38. Verbindung nach Anspruch 1, worin Cys558-Pro559-Gly560 von Wildtyp-Plasminogen durch Ala-Thr-Thr-Lys-Ile-Lys-Pro ausgetauscht sind, Val562 durch Ile und Cys566 durch Ala ausgetauscht ist.

39. Nucleinsäure, die eine Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 38 codiert.

40. Nucleinsäure nach Anspruch 39, die ein Vektor ist.

41. Vektor nach Anspruch 40, der ein Plasmid, Cosmid oder Phage ist.

42. Nucleinsäure nach Anspruch 40 oder 41, umfassend eine erste Nucleinsäuresequenz, die ein Protein codiert oder eine Klonierungsstelle umfaßt, die operativ an eine zweite Nucleinsäuresequenz gebunden ist, die einen starken Promoter und eine von menschlichem Cytomegalovirus abstammende Enhancersequenz enthält, eine dritte Nucleinsäuresequenz, die eine von SV40 abstammende Polyadenylierungssequenz codiert und eine vierte Nucleinsäuresequenz, die einen selektierbaren Marker codiert, der durch einen SV40 Promotor exprimiert wird und ein zusätzliches SV40 Polyadenylierungs-Signal am 3' Ende der selektierbaren Markersequenz hat.

43. Zelle oder Zellinie, die mit einer Nucleinsäuresequenz nach einem der Ansprüche 39 bis 42 transformiert ist.

44. Zelle nach Anspruch 43, die eine Säuger-Eierstockzelle des chinesischen Hamsters (CHO) ist.

45. Zelle oder Zellinie nach Anspruch 43, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus: einer Maus-Myelom NS0-Zellinie, einer COS-Zelle oder einer BHK-Zelle.

46. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 38 zur Verwendung bei der Prophylaxe und/oder Behandlung von Zuständen, die durch eine Gleichgewichtsstörung zwischen der Gerinnung und Fibrinolyse verursacht werden.

47. Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 38 bei der Herstellung eines Mittels zur Prophylaxe und/oder Behandlung von Zuständen, die durch eine Gleichgewichtsstörung zwischen Gerinnung und Fibrinolyse verursacht werden.

48. Pharmazeutische oder veterinäre Zusammensetzung, umfassend ein oder mehrere modifizierte Plasminogen-Analog/Analoga nach einem der Ansprüche 1 bis 38, zusammen mit einem pharmazeutisch oder veterinär annehmbaren Träger.