DE69031127T2

DE69031127T2 - Aktivierbare fibrinolytische und antithrombotische proteine

Info

Publication number: DE69031127T2
Application number: DE69031127T
Authority: DE
Inventors: Keith Martyn Bucks Sl7 2Nz Dawson; Richard Mark Oxon Ox9 3Xs Edwards; Joan Mabel Oxford Ox3 8Ng Forman
Original assignee: British Bio Technology Ltd
Current assignee: Vernalis R&D Ltd
Priority date: 1989-12-07
Filing date: 1990-12-07
Publication date: 1998-02-05
Anticipated expiration: 2010-12-08
Also published as: JPH05502374A; AU6954091A; PT96103A; ZA909854B; PT96104A; AU644399B2; NO922238D0; WO1991009118A2; IL96601A0; DE69031127D1; CA2069105A1; NZ236330A; GR3024990T3; US5434073A; ATE155812T1; CA2069085A1; FI105202B; JPH05502375A; WO1991009125A1; AU643247B2

Description

BESCHREIBUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft Plasminogen-Analoga, die so aktiviert werden können, daß sie fibrinolytische Aktivität zeigen oder die Blutgerinnung inhibiert. Die Erfindung betrifft deren Herstellung, pharmazeutische Zusammensetzungen, die diese enthalten, und deren Verwendung zur Behandlung von thrombotischen Erkrankungen. Sie betrifft auch Nukleinsäure (DNA und RNA), die für die ganzen oder Teile dieser Analoga kodieren.
Plasminogen ist eine schlüsselkomponente des fibrinolytischen Systems, das das natürliche Gegenstück zu dem Gerinnungssystem im Blut darstellt. In dem Prozeß der Blutkoagulation ist ein Reihe von Enzymaktivitäten daran beteiligt, ein Fibrinnetzwerk aufzubauen, das das Grundgerüst eines Gerinsels oder Thrombus bildet. Der Abbau des Fibrinnetzwerkes (Fibrinolyse) wird durch die Wirkung des Enzyms Plasmin bewerkstelligt. Plasminogen ist der inaktive Vorläufer von Plasmin und die Umwandlung von Plasminogen zu Plasmin wird bewirkt durch Spaltung der Peptid-Bindung zwischen Arginin 561 und Valin 562 des Plasminogens. Unter physiologischen Bedingungen Wird diese Spaltung durch den Gewebetyp-Plasminogenaktivator (tPA) oder durch den Urokinase-Typ-Plasminogenaktivator (uPA) katalysiert.
Wenn das Gleichgewicht zwischen dem Gerinnungs- und dem fibrinolytischen System lokal gestört wird, können an falschen Stellen intravaskuläre Gerinsel gebildet werden, wodurch Koronarthrombosen und Myokardinfarkte, tiefe Venenthrombose, Schlaganfall, peripherer Arterienverschluß und Embolien hervorgerufen werden können. In solchen Fällen hat sich die Verabreichung von fibrinolytischen Mitteln als eine hilfreiche Therapie zur Unterstützung in der Gerinselauflösung erwiesen.
Mit der Verfügbarkeit einer Reihe von Plasminogenaktivatoren, beispielsweise tPA, uPA, Streptokinase und dem nicht-isolierten Plasminogen- Streptokinase-Aktivatorkomplex APSAC hat sich die Fibronolysetherapie relativ weit ausgebreitet. Jedes dieser Mittel hat sich als die Gerinselaufbildung unterstützend erwiesen, jedoch weisen alle Unzulänglichkeiten hinsichtlich ihres Aktivitätsprofils auf, wodurch sie als therapeutische Mittel zur Behandlung von Thrombosen nicht ideal sind (Überblick von Marder und Sherry, New England Journal of Medicine 1989, 318; 1513-1520). Eines der Hauptprobleme bei der Behandlung von akutem Myokardinfarkt oder anderen thrombotischen Erkrankungen mit tPA liegt darin, daß es mit einer Plasma- Halbzeitslebensdauer im Menschen von ungefähr 5 min rasch aus dem Kreislauf entfernt wird (Bounameaux et al. in: "Contemporary Issues in Haemostasis and Thrombosis", Band 1, S. 5-91, 1985, Collen et al., Hrsg. Churchill Livingstone). Das führt zur der Notwendigkeit, tPA mittels Infusion in großen Dosen zu verabreichen. Daher ist die Behandlung kostspielig und wird dadurch verzögert, daß der Patient in ein Krankenhaus eingewiesen werden muß, bevor die Behandlung beginnen kann. Urokinase, sowohl in der einkettigen Form (scuPA) oder in der zweikettigen Form (tcuPA) weist eine ähnlich rasche Plasmaausspülung auf, und erfordert auch die Verabreichung durch kontinuierliche Fusion.
Ein Hauptproblem, das von all diesen Mitteln geteilt wird, ist, daß sie in klinisch geeigneten Dosen nicht thrombosenspezifisch sind, da sie Plasminogen im gesamten Kreislauf aktivieren. Die hauptsächliche Konsequenz hieraus ist, daß Proteine, wie beispielsweise Fibrinogen, das an der Blutgerinnung beteiligt ist, zerstört werden, und gefährliche Blutungen auftreten können. Dieser Effekt tritt auch mit tPA auf, obwohl dieses in physiologischen Konzentrationen an Fibrin gebunden wird, und eine Fibrinselektive Plasminogenaktivierung zeigt.
Ein weiterer wichtiger Nachteil in der Qualität vorhandener Plasminogenaktivatoren ist, daß häufig ein erneuter Verschluß des wieder geöffneten Blutgefäßes nach Beendigung der Verabreichung des thrombolytischen Mittels auftritt. Es wird angenommen, daß der Grund hierfür das Zurückbleiben des thrombogenen Materials am Orte der Thrombusauflösung ist.
Ein alternativer Ansatz zur Beschleunigung der Fibrinolyse ist kürzlich entwickelt worden, der auf der Verwendung von Molekülen beruht, die so aktivierbar sind, daß sie fibrinolytische Aktivität zeigen oder die Gerinselbildung inhibieren. Die Aktivierung (die eine Spaltung beinhalten kann) kann durch ein oder mehrere endogene Enzyme katalysiert werden, die an der Blutgerinnung beteiligt sind. Der Vorteil dieses Ansatzes ist, daß die Thrombuselektivität der Fibrinolyseaktivität oder die Inhibierung der Gerinnungsbildungsaktivität durch Thromobus-spezifische Lokalisierung des aktivierenden Enzyms erzielt wird.
Gemäß einem ersten erfindungsgemäßen Aspekt wird eine Protein- Verbindung bereitgestellt, die durch ein an der Blutgerinnung beteiligtes Enzym aktivierbar ist, das ausgewählt ist aus Kallikrein, Faktor XIIa, XIa, IXa, VIIa, Xa, Thrombin oder aktiviertem Protein C, wodurch es fibrinolytische Aktivität erhält oder die Gerinnungsbildung inhibiert, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindung ein Plasminogen-Analogon ist, das eine Spaltstelle aufweist, die durch eines der oben genannten Enzyme spaltbar ist, wodurch eine Verbindung mit Plasmin-Aktivität gebildet wird.
Das Plasminogen-Analogon besitzt, wenn es aktiviert ist, im wesentlichen die gleiche qualitative fibrinolytische Aktivitat wie natürliches Plasmin. Hinsichtlich der Quantität ist es zwar bevorzugt, daß die Aktivität so gut ist diejenige von natürlichem Plasmin, wenn nicht besser, die erfindungsgemäßen Vorteile können jedoch auch erzielt werden, wenn die Aktivität nicht so gut ist. Weiterhin ist die Leichtigkeit mit der das Plasminogen-Analogon aktiviert werden kann, in quantitativer Hinsicht vorzugsweise, aber nicht notwendigerweise, so gut wie die natürliche Verbindung.
Die Analyse des wild-Typ-Plasminogen-Moleküls hat ergeben, das es ein Glycoprotein darstellt, das aus einer Serinproteasedomäne, fünf Kringel- Domänen und einer N-terminalen Sequenz mit 78 Aminosäuren, die durch Plasminspaltung entfernt werden kann, zusammengesetzt ist. Die Spaltung durch Plasmin erfolgt unter Hydrolyse der Arg(68)-Met(69)-, der Lys(77)-Lys(78)- oder der Lys(78)-Val(79)-Bindungen, wodurch Plasminogenformen mit einem N-terminalen Methionin-, Lysin- oder Valin-Rest gebildet werden, die alle allgemein als Lys-Plasminogen bezeichnet werden. Intaktes Plasminogen wird als glu-Plasminogen bezeichnet, da es einen N- terminalen Glutaminsäure-Rest aufweist. An den Resten Asn(289) und Thr(346) tritt Glycolisierung auf, wobei Ausmaß und Zusammensetzung veränderlich sind, was zur Anwesenheit einer Reihe von verschiedenen Molekulargewichtsformen des Plasminogens im Plasma führt. Die Serinproteasedomäne kann an ihrer Homologie mit anderen Serinproteasen erkannt werden, und durch Aktivierung zu Plasmin ist die katalytisch aktive Domäne am Fibrinabbau beteiligt. Die fünf "Kringel"-Domänen sind zu denjenigen in anderen Plasmaproteinen wie tPA und Prothrombin homolog und sind an der Fibrinbindung und folglich an der Lokalisation von Plasminogen und Plasmin an Thrombin beteiligt. Plasminogen ist ein Zymogen, das normalerweise im Blut als einzelne Polypeptid-Kette zirkuliert, und wird durch Spaltung einer Peptid-Bindung zwischen den Aminosäuren 561 (arg) und 562 (val) in das zweikettige Enzym Plasmin umgewandelt. Diese Spaltung wird spezifisch durch Plasminogen-Aktivatoren katalysiert, wie beispielsweise tPA und uPA. Dies ist in Castellino, F.J. 1984, Seminars in Thrombosis and Haemostasis 10: 18-23 beschrieben. In der vorliegenden Beschreibung ist Plasminogen gemäß den Protein-Sequenzierungsuntersuchungen von Sottrup- Jensen et al. (in: Atlas of Protein Sequence and Structure (Dayhoff M. O., Hrsg.) 5 suppl. 3, S. 95 (1978)) numeriert, wonach das Plasminogen ein Protein von 790 Aminosäuren darstellt, und der Spaltungsort die Arg(560)-Val (561)-Peptid-Bindung ist. Jedoch kodiert eine geeignete Plasminogen-cDNA, die in der erfindungsgemäßen Ausführungsform nützlich war, sowie diejenige, die von Forsgren et al. (FEBS Letters 213, 254-260 (1987)) isoliert wurde, für ein 791-Aminosäuren-Protein mit einem zusätzlichen Ile in der Position 65. In der vorliegenden Beschreibung entspricht die Numerierung der Aminosäuren in dem Plasminogen derjenigen der verwendeten cDNA. In der Struktur des Plasminogens können Polymorphismen auftreten, und es können Plasminogen-Formen auftreten, in denen die Numerierung des Spaltortes abweicht, jedoch sind derartige Varianten als in der Ausführungsform eingeschlossen anzusehen.
Daher bedeutet der Ausdruck "Plasminogen-Analogon", wie er in dieser Beschreibung verwendet wird, ein Molekül, das von Wild-Typ Plasminogen abweicht, und die Fähigkeit besitzt, gespalten oder in anderer Weise beeinflußt zu werden, wodurch ein Molekül gebildet wird, das Plasmin- Aktivität aufweist.
Die Plasma-Halbzeitlebensdauer von glu-Plasminogen wurde zu 2,2 Tagen bestimmt und diejenige von Lys-Plasminogen zu 0,8 Tagen (Claeys H. und Vermylen, J. 1974, Biochim. Biophys. Acta 342: 351-359; Wallen, P. und Wiman, B. in: "Proteases and Biological Control", 291-303; Reich, E. et al. Hrsg. Cold Spring Harbor Laboratory).
Plasminogen-Analoga innerhalb des Umfangs der erfindungsgemäßen Ausführungsform behalten die Fibrin-Bindungsaktivität des Wild-Typ- Plasminogens zur einem angemessenen Ausmaß, besitzen jedoch veränderte Aktivierungscharakteristiken; bevorzugte Plasminogen-Analoga besitzen eine Plasma-Halbzeitlebensdauer, die zumindest derjenigen des Wild-Typ- Plasminogens entsprechen, jedoch ist diese Eigenschaft nicht wesentlich.
Der Blutkoagulationsmechanismus umfaßt eine Reihe von Enzymreaktionen, die in der Erzeugung von unlöslichem Fibrin resultieren, das das gitterartige Protein-Netzwert von Gerinseln bildet. Thrombin ist das Enzym, das für die Umwandlung von löslichem Fibrinogen zu Fibrin verantwortlich ist. Die Umwandlung von Prothrombin, dem inaktiven Vorläufer von Thrombin, zu Thrombin wird durch den aktivierten Faktor X (Faktor Xa) aktiviert. (Thrombin ist auch als Faktor IIa und Prothrombin als Faktor II bekannt.)
Der Faktor Xa wird extrinsisch oder intrinsisch aus dem Faktor X erzeugt. Auf dem extrinsischem Weg wird Faktor VII zu Faktor VIIa aktiviert, der den Faktor Xa aus dem Faktor X erzeugt. Auf dem intrinsischen Weg wird die Aktivierung von Faktor X zu Faktor Xa durch den Faktor IXa katalysiert. Der Faktor IXa wird aus dem Faktor IX durch Einwirkung des Faktors XIa gebildet, welcher wiederum durch Einwirkung von Faktor XIIa auf Faktor XI erzeugt wird. Der Faktor XIIa wird aus dem Faktor XII durch Einwirkung von Kallikrein gebildet. Von den Faktoren VIIIa und Va wird angenommen, daß sie als Co-Faktoren bei der Aktivierung der Faktoren X bzw. II wirken.
Das Fibrin, das zuerst aus Fibrinogen gebildet wird, liegt in lockerer Form vor. Lockeres Fibrin wird durch Einwirkung des Faktors XIIIa, der die Fibrin-Moleküle vernetzt, zu engem Fibrin umgewandelt.
Das aktivierte Protein C ist eine antikoagulierende Serin-Protease, die im Bereich der Gerinselbildung durch Einwirkung von Thrombin in Kombination mit Thrombomodulin auf das Protein C erzeugt wird. Das aktivierte Protein C reguliert die Gerinselbildung durch Spaltung und Inaktivierung der Prokoagulierungs-Co-Faktoren Va und VIIIa.
Der Ausdruck "Enzym, das an der Blutgerinnung beteiligt ist" wie es in der vorliegenden Beschreibung verwendet wird, schließt daher die Kallikrein-Faktoren XIIa, XIa, IXa, VIIa, Xa und Thrombin (Faktor IIa) ein, die direkt an der Bildung von Fibrin und aktiviertem Protein C, das an der Steuerung der Blutgerinnung beteiligt ist, beteiligt sind. Die am meisten bevorzugten Enzyme sind Faktor Xa und Thrombin, da sie am direktesten an der Fibrinbildung beteiligt sind.
Die Erzeugung und Aktivität von zumindest Faktor Xa und Thrombin ist strikt reguliert, damit sichergestellt ist, daß die Thrombusbildung auf den Ort der thrombogenen Stimulierung beschränkt ist. Diese Lokalisierung wird durch die kombinierte Funktionsweise von mindestens zwei Kontrollmechanismen erzielt: Die Blutgerinnungsenzyme fungieren als Komplexe, die eng mit den Phospholipid-Zellmembranen der Plättchen und Endothelialzellen am Orte vaskulärer Verletzungen assoziiert sind (Mann, K. O., 1984, in: "Progress in Hemostasis and Thrombosis", 1-24, Hrsg. Spaet, T. H. Grune und Stratton); und freies Thrombin oder Faktor Xa, das vom Ort des Thrombus in den Kreislauffreigesetzt wird, wird schnell durch die Wirkung von Proteinase-Inhibitoren wie beispielsweise Antithrombin III inaktiviert.
Daher ist die Aktivität der vorletzten (Faktor Xa) und der letzten (Thrombin) Enzyme der Gerinnungskaskade besonders gut am Ort der Thrombusbildung lokalisiert und aus diesem Grunde bevorzugt.
Es wurde herausgefunden, daß Thrombin mit Thrombi assoziiert bleibt und nicht kovalent an Fibrin bindet. Durch Verdauung von Thrombi mit Plasmin wird aktives Thrombin freigesetzt, von dem angenommen wird, daß es zur Wiedererzeugung von Thrombi und dem Wiederverschluß der Gefäße beiträgt, der üblicherweise nachfolgend die thrombolytische Behandlung mit Plasmin-Aktivatoren auftritt (Bloom A. L., 1962, Br. J. Haematol. 82, 129; Francis et al., 1983 J. Lab. Clin. Med. 102, 220; Mirshahi et al. 1989, Blood 74, 1025).
Aus diesen Gründen ist es in bestimmten erfindungsgemäßen Ausführungsformen bevorzugt, Plasminogen oder eine andere potentiell aktivierbare Eiweißverbindung so zu modifizieren, daß es sie durch Thrombin oder Faktor Xa aktivierbar wird, wodurch eine bevorzugte Klasse Thrombusselektiver, fibrinolytischer oder blutgerinnungshemmender Proteine erzeugt wird. Die am meisten bevorzugten Plasminogen-Analoga behalten die vorteilhaften Eigenschaften des Ursprungsplasminogen-Moleküls bei, eine lange Plasma-Halbzeitlebensdauer zu besitzen, und zeigen durch Kombination von zwei Mechanismen Thrombusslekektivität, nämlich durch Fibrinbindung über die "Kringel"-Domänen und die neue Eigenschaft der Umwandlung zu Plasmin am Orte der neuen Thrombusbildung durch Einwirkung eines der Enzyme, die an der Bildung des Thrombus beteiligt und vorzugsweise dort lokalisiert sind.
Faktor Xa (E. C. 3.4.21.6) ist eine Serinprotease, die humanes Prothrombin durch spezifische Spaltung der Arg(273)-Thr(274) und Arg(322)-Ile(323) Peptid-Bindungen zu Thrombin konvertiert (Mann et al. 1981, Methods in Enzymology 80, 286-302) In humanem Prothrombin geht dem Arg(273)-Thr(274)-Ort das Tripeptid Ile-Glu-Gly voraus, und dem Arg(322)-Ile(323)-Ort das Tripeptid Ile-Asp-Gly. Die zur Erkennung erforderliche Struktur wird anscheinend durch die lokale Aminosäure-Sequenz determiniert, die dem Spaltort vorausgeht (Magnusson et al., 1975, in: "Proteases and Biological Control", 123-149, Hrsg. Reich et al., Cold Spring Harbor Larboratory, New York). Die Spezifität für die Ile-Glu-Gly- Arg-Sequenz ist nicht absolut, da herausgefunden wurde, daß Faktor Xa andere Proteine spaltet, beispielsweise Faktor VIII in den Positionen 336, 372, 1689 und 1721, in denen die vorhergehende Aminosäure-Sequenz signifikant von diesem Format abweicht (Eaton et al. 1986, Biochemistry 25, 505-512). Da das hauptsächliche natürliche Substrat für Faktor Xa Prothrombin ist, sind bevorzugte Erkennungssequenzen diejenigen, worin Arginin und Glycin die P1- bzw. P2-Positionen besetzen, ein saurer Rest (Aspartan- oder Glutaminsäure) die P3-Position besetzt, und Isoleucin oder anderer kleiner hydrophober Rest (wie beispielsweise Alanin, Valin, Leucin oder Methionin) die P4-Position besetzt. Da Faktor Xa jedoch Sequenzen spalten kann, die von diesem Format abweichen, können erfindungsgemäß andere Sequenzen verwendet werden, die durch Faktor Xa spaltbar sind, sowie andere Sequenzen, die durch andere Enzyme in der Gerinnungskaskade spaltbar sind.
In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung Plasminogen-Analoga, die durch das Blutgerinnungsenzym Faktor Xa aktivierbar sind, und umfassen die Spaltortsequenz P4-P3-Gly-Arg, worin P4 einen hydrophoben Rest repräsentiert, und P3 repräsentiert einen sauren Rest. In einer weiter bevorzugten Ausführungsform ist der hydrophobe Rest in der P4-Position Isoleucin.
Die Umwandlung von Plasminogen zu Plamin durch tPA und uPA beinhaltet die Spaltung der Peptid-Bindung zwischen Arginin 561 und Valin 562, wodurch ein Disulfid-gebundenes zweikettiges Protein mit einem Amino-terminalen Valin auf der leichten (Proteasedomäne) und einem Carboxy-terminalen Arginin auf der schweren Kette gebildet wird. Plasminogen wird nicht in signifikantem Ausmaß durch Thrombin oder Faktor Xa gespalten und aktiviert, und zur Herstellung von Plasminogen-Analoga, die durch diese bevorzugten Enzyme spaltbar sind, muß der Spaltort Pro(559), Gly(560), Arg(561), Val(562), der durch tPA und uPA erkannt wird, verändert werden. Zur Herstellung von Plasminogen-Analoga, die durch beispielsweise Faktor Xa gespalten werden, kann eine Aminosäure-Sequenz, die durch den Faktor Xa spaltbar ist, in das Plasminogen-Molekül eingeführt werden. Die Sequenz Ile-Glu-Gly-Arg, die einen der Orte in Prothrombin darstellt, der durch Faktor Xa gespalten wird, kann eine solche Sequenz sein. Andere Möglichkeiten wären Sequenzen oder Abwandlungen von Sequenzen, die durch Faktor Xa zu anderen Proteinen oder Peptiden gespalten werden. Ein Plasminogen- Analogon, worin Pro(558) entfernt und durch Ile-Glu ersetzt ist, kann die Arg(561)-Val (562) (Wild-Typ-Plasminogen-Numerierung) Peptid-Bindung aufweisen, die durch Faktor Xa gespalten wird, wodurch ein Disulfid-gebundenes zweikettiges Plasminogen-Analogon mit einem Amino-terminalen Valin auf der leichten (Protease-Domäne)-Kette und einem Carboxy-terminalen Arginin auf der schweren Kette gebildet wird. Die DNA, die für die Ile-Glu-Gly-Arg- Sequenz als Carboxy-terminaler Teil eines spaltbaren Linkers als Protein- Herstellungshilfe kodiert, ist in GB-A-2160206 offenbart, jedoch ist die Verwendung einer Ile-Glu-Gly-Arg-Sequenz zum Ermöglichen eines veränderten Aktivierungsprozesses für ein Zymogen in dieser Beschreibung nicht offenbart.
Die Spaltung und Aktivierung von Plasminogen-Analoga durch ein Enzym der Gerinnungskaskade wie beispielsweise Thrombin oder Faktor Xa kann auf eine Vielzahl von Arten erfolgen, beispielsweise durch SDS-PAGE-Analyse, und im Falle von Plasminogen-Analoga durch Bestimmung der Bildung von Plasmin unter Verwendung der 52251-Chromogenuntersuchung oder einer Fibrin- Gellyseuntersuchung.
Thrombin (E. C. 3.4.21.5) ist eine Serinprotease, die die Proteolyse einer Reihe von Proteinen katalysiert, einschließlich Fibrinogen (A-α- und B-β-Ketten), Faktor XIII, Faktor V, Faktor VII, Faktor VIII, Protein C und Antithrombin III. Die erforderliche Struktur zur Erkennung durch Thrombin erscheint teilweise bestimmt zu sein durch die lokale Aminosäure-Sequenz in der Umgebung des Spaltortes, sie ist jedoch auch zu einem variablen Anteil bestimmt durch Sequenz(en), die vom Spaltort entfernt liegen. Beispielsweise sind in der Fibrinogen-A-α-Kette die Reste P2 (Val), P9 (Phe) und P10 (Asp) wesentlich für die α-Thrombin-katalysierte Spaltung der Arg(16)- Gly(17)-Peptid-Bindung (Ni, F. et al. 1989, Biochemistry 28, 3082-3092). Vergleichende Studien mehrerer Proteine und Peptide, die durch Thrombin gespalten werden, haben zu dem Vorschlag geführt, daß optimale Spaltorte für α-Thrombin (i) die Struktur P4-P3-Pro-Arg-P1'-P2' aufweisen, worin P3 und P4 jeweils unabhängig voneinander eine hydrophobe Aminosäure (wie beispielsweise Valin) und P1' und P2' jeweils unabhängig voneinander eine nicht-saure Aminosäure wie beispielsweise eine hydrophobe Aminosäure wie Valin darstellen, oder (ii) P2-Arg-P1', worin P2 oder P1' Glycin ist (Chang, J., 1985, Bur. J. Biochem, 151, 217-224) aufweisen kann. Es gibt jedoch Ausnahmen von diesen allgemeinen Strukturen, die durch Thrombin gespalten werden und die erfindungsgemäß verwendet werden können.
In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung Plasminogen-Analoga, die durch das Blutgerinnungsenzym Thrombin aktivierbar sind, und die die Spaltortsequenz P4-P3-Pro-Arg-P1'-P2' aufweisen, worin P4 und P3 jeweils unabhängig voneinander einen hydrophoben Rest und P1' und P2' jeweils unabhängig voneinander einen nicht-sauren Rest repräsentieren.
Andere bevorzugte Thrombin-aktivierbare Plasminogen-Analoga umfassen die Spaltortsequenz P2-Arg-P1', worin einer der Reste P2 und P1' Glycin repräsentiert, und der andere ist ein beliebiger Aminosäure-Rest.
Zur Herstellung eines Plasminogen-Analogon, das durch Thrombin gespalten und aktiviert werden könnte, kann ein Ort, der von Thrombin erkannt und gespalten wird, in einer geeigneten Position in das Plasminogen-Molekül eingeführt werden. Es kann eine Aminosäure-Sequenz wie diejenige in der Fibrinogen-A-α-Kette, die durch Thrombin gespalten wird, verwendet werden. Andere mögliche Sequenzen schließen diejenigen ein, die an der Spaltung von Fibrinogen-B-β, Faktor XIII, Faktor V, Faktor VII, Faktor VIII, Protein C, Antithrombin III durch Thrombin beteiligt sind, sowie andere Proteine, deren Spaltung durch Thrombin katalysiert wird. Ein Beispiel für ein Thrombin-spaltbares Analogon von Plasminogen kann ein solches sein, worin die Sequenz Pro(559), Gyl(560) zu Gly(559), Pro(560) verändert ist, wodurch die Sequenz Gly(559)-Pro(560)-Arg(561)-Val(562) erzeugt wird, die mit derjenigen identisch ist, die in den Positionen 17 bis 20 in Fibrinogen-A-α gefunden wurde. Dies ist nicht der Haupt- Thrombinspaltort in Fibrinogen-A-α, jedoch kann Thrombin die Arg(19)- Val(20)-Peptid-Bindung spalten. Solche subtile Veränderungen sind bedeutsam, sofern die wichtigen Merkmale der vollen Aktivität und Stabilität in dem veränderten Derivat aufrecht erhalten werden sollen, wie es bevorzugt ist.
Bevorzugte erfindungsgemäße Thrombin-aktivierbare Plasminogen-Analoga umfassen die Spaltortsequenz Gly-Pro-Arg.
In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung Plasminogen-Analoga mit einzelnen oder mehrfachen Aminosäure-Substitutionen, -Addidionen oder Auslassungen zwischen den Resten Pro(555) und Cys(566) einschließlich. Derartige Plasminogen-Analoga werden durch Thrombin, Faktor Xa oder andere Enzyme, die an der Blutgerinnung beteiligt sind, gespalten, wodurch Plasminogen-Analoga mit fibrinolytischer Aktivität erzeugt werden.
Plasminogen-Analoga gemäß der erfindungsgemäß bevorzugten Ausführungsform können weitere Modifikationen (im Vergleich zu Wild-Typ-Gly- Plasminogen) enthalten, die eine oder mehrere aus Additionen, Auslassungen oder Substitutionen sein können. Ein Beispiel für eine derartige Modifikation wäre die Addition, Entfernen, Substitution oder Veränderung einer oder mehrerer "Kringel"-Domänen zur Erhöhung der Fibrinbindungsaktivität.
Ein Beispiel für eine Modifikation, die eine Auslassung einschließt, wären Lys-Plasminogenvarianten von Plasminogen-Analoga, worin die Aminoterminalen 68, 77 oder 78 Aminosäuren entfernt sind. Derartige Varianten können erhöhte Fibrin-Bindungsaktivität im Vergleich zu Wild-Typ Glu- Plasminogen aufweisen, wie dies für Lys-Plasminogen beobachtet wurde (Bok, R. A. und Mangel, W. F., 1985, Biochemistry 24, 3279-3286).
Der Plasmin-Inhibitor α-2-Antiplasmin ist im Blut vorhanden, und wird in die Fibrin-Matrix von Blutgerinseln inkorporiert. Die Rolle dieses Inhibitors besteht darin, die Plasmin-Aktivität in dem Gerinsel und im Blutkreislauf zu beschränken. Für die erfindungsgemäßen hoch Gerinselselektiven Plasminogen-Analoga kann es von Vorteil sein, eine Mutation in die Serinproteasedomäne einzuführen, die mit der Plasmin-Inhibitorbindung interferiert. Diese Veränderung könnte sich in einer Position analog zu derjenigen, von der gezeigt wurde, daß sie die Inhibitorbindung an Gewebe- Plasminogen-Aktivator verhindert, befinden (Madison, E. L., et al., 1989, Nature 339, 721-724).
Andere erfindungsgemäße mehrfach modifizierten Plasminogen-Analoga können eine oder mehrere Modifikationen zur Verhinderung, Reduzierung oder Veränderung der Glykosylierungs-Muster einschließen. Plasminogen-Analoga, die der derartige Modifikationen einschließen, können eine längere Halbzeitlebensdauer, ein reduzierte Freigabe aus dem Plasma und/oder eine höhere spezifische Aktivität aufweisen.
Andere Proteine können ebenso verändert werden, so daß sie durch Enzyme, die an der Blutgerinnung beteiligt sind, gespalten oder anders aktiviert werden, wodurch sie fibrinolytische Aktivität erhalten oder die Gerinnungsbildung inhibieren. Einzelketten-Urokinase-Plasminogen-Aktivator (scuPA) ist ein Beispiel für ein fibrinolytisches Protein, und Protein C ist ein Beispiel für ein Enzym, das an der Inhibierung der Blutgerinnung beteiligt ist, das so aktiviert werden kann.
scuPA wird durch Plasminspaltung an der Lys(158)-Ile(159)-Peptid- Bindung zu zweikettigern uPA (tcuPA) aktiviert. Thrombin inaktiviert scuPA durch Spaltung der Arg(156)-Phe(157)-Peptid-Bindung. Es kann ein Analogon von scuPA konstruiert werden, worin die Aminosäure-Sequenz in der Umgebung des Spaltortes so verändert wurde, daß die Spaltung durch Thrombin oder ein anderes an der Blutgerinnung beteiligtes Enzym aktives tcupa erzeugt.
Protein C wird durch Einwirkung von Thrombin, das an Thrombomodulin gebunden ist, zu seiner aktivierten Form gespalten. Ein Protein-C-Analogon innerhalb des erfindungsgemäßen Bereichs wird so modifiziert, daß es durch Thrombin als solchem unter Bildung von aktiviertem Protein C spaltbar ist.
Es können Fusionsproteine zur Erzielung selektiver Freisetzung von fibrinolytischen oder antikoagulierenden Proteinen am Orte der Blutgerinnung konstruiert werden. Damit dies erreicht wird, werden Proteine, die an der Fibrinolyse oder der Inhibierung der Koagulation beteiligt sind, durch eine Linkerregion, die durch ein an der Blutgerinnung beteiligtes Enzym spaltbar ist, gebunden. Beispiele für Proteine, die in ein solches spaltbares Protein inkorporiert werden können, schließen tPA, uPA, Streptokinase, Plasminogen, Protein C, Hirudin und Antithrombin III ein. Die Fusion solcher Proteine zu einem Protein mit einer bevorzugten Eigenschaft, die nicht direkt mit der Auflösung von Blutgerinseln in Verbindung steht (beispielsweise Albumin, das eine längere Plasmahalbzeitlebensdauer besitzt) kann ebenso von Vorteil sein.
Bevorzugte Eigenschaften von Plasminogen-Analoga innerhalb des erfindungsgemäßen Bereiches gelten auch mutatis mutandis für andere erfindungsgemäße Verbindungen, soweit angemessen.
Verbindungen gemäß dem ersten erfindungsgemäßen Aspekt können auf einen beliebigen passenden Weg hergestellt werden. Gemäß einem zweiten erfindungsgemäßen Aspekt wird ein Verfahren zur Herstellung einer wie oben beschriebenen Protein-Verbindung bereitgestellt, umfassend die Zusammenkopplung aufeinanderfolgender Aminosäure-Reste und/oder die Ligation von Oligopeptiden. Obwohl Proteine prizipiell vollständig oder teilweise durch chemische Mittel synthetisiert werden können, wird der Weg der Wahl die ribosomale Transiation einer entsprechenden Nukleinsäure-Sequenz sein, vorzugsweise in vivo. Das Protein kann in geeigneter Weise glykosyliert sein.
Es ist bevorzugt, erfindungsgemäße Proteine unter Anwendung rekombinanter DNA-Technologien herzustellen, insbesondere wenn sie Analoga (durch Aminosäure-Substitution, -Deletion oder -Addition) von natürlichen Proteinen darstellen. Die DNA, die für Plasminogen oder ein anderes natürliches Protein kodiert, kann aus einer cDNA oder einem genomischen Klon stammen, oder kann synthetisiert werden. Aminosäure-Substitutionen, -Additionen oder -Deletionen werden vorzugsweise durch ortsspezifische Mutagenese eingeführt. Geeignete DNA-Sequenzen, die für Glu-Plasminogen, Lys-Plasminogen und Plasminogen-Analoga und andere Verbindungen innerhalb des erfindungsgemäßen Bereiches kodieren, können erhalten werden durch die Vorgehensweisen, die den Durchschnittsfachmann der Gentechnologie bekannt sind. Für verschiedene Proteine einschließlich von beispielsweise Gewebe- Plasminogen-Aktivator, ist es eine routinemäßige Vorgehensweise zur Gewinnung von rekombinantem Protein, die kodierende Sequenz in einen Expressionsvektor einzuführen, und den Vektor in eine geeignete Wirtszelle zu transfizieren. Ein geeigneter Wirt kann ein Bakterium wie beispielsweise E. coli sein, ein eukaryontischer Mikroorganismus wie Hefe oder eine höhere eukaryontische Zelle. Plasminogen ist jedoch ungewöhnlich schwierig zu exprimieren, und es wurden mehrere erfolgiose Versuche unternommen, rekombinantes Plasminogen in Säugerzellen herzustellen (Busby S., et al. 1988, Fibrinolysis 2, suppl 1, 64; Whitefleet-Smith et al., 1989, Arch. Bioc. Biop. 271, 390-399). Es kann möglich sein, Plasminogen in E. coli zu exprimieren, jedoch wird das Protein in einer unlöslichen Form erzeugt, und müßte renaturiert werden. Eine zufriedenstellende Renaturierung wäre mit der derzeitigen Technologie schwierig. Plasminogen wurde in Insektenzellen unter Verwendung eines Baculovirus-Vektor-infizierten Zellsystems in Mengen von 0,7 bis 1,0 µg/10&sup6; Zellen (gemessen 66 h nach Infektion) exprimiert (Whitefleet-Smith et al, ibid), jedoch erzeugt dieses Verfahren keine stabile Zell-Linie, die Plasminogen erzeugt, und irgendwelche posttransiationalen Modifizierungen, wie beispielsweise Glykolisierung, sind möglicherweise nicht authentisch.
Gemäß einem dritten erfindungsgemäßen Aspekt wird synthetische oder rekombinante Nukleinsäure bereitgestellt, die für eine wie oben beschriebene Eiweißverbindung kodiert. Die Nukleinsäure kann RNA oder DNA sein. Die bevorzugten Charakteristiken dieses erfindungsgemäßen Aspektes sind die gleichen wie für den ersten Aspekt.
Gemäß einem vierten erfindungsgemäßen Aspekt wird ein Verfahren zur Herstellung einer Nukleinsäure gemäß dem dritten Aspekt bereitgestellt, umfassend die Aneinanderkopplung von aufeinanderfolgenden Nukleotiden und/oder die Ligation von Oligo- und/oder Polynukleotiden.
Rekombinante Nukleinsäure gemäß dem dritten erfindungsgemäßen Aspekt kann in Form eines Vektors vorliegen, der beispielsweise ein Plasmid, Cosmid oder ein Phage sein kann. Der Vektor kann zur Transfizierung oder Transformierung prokaryontischer (beispielsweise bakterieller) Zellen und/oder eukaryontischer (beispielsweise Hefe- oder Säuger-) Zellen adaptiert sein. Ein Vektor umfaßt einen Klonierungsort und üblicherweise mindestens ein Markergen. Ein Bxpressionsvektor besitzt einen Promotor, der operativ an die Sequenz gebunden ist, die in die Klonierungsstelle insert werden soll, und vorzugsweise eine Sequenz, die die Sekretion des erzeugten Proteins ermöglicht. Expressionsvektoren und Klonierungsvektoren (die nicht zur Expremierung in der Lage sein müssen) sind in dem erfindungsgemäßen Umfang eingeschlossen.
Bestimmte Vektoren sind erfindungsgemäß besonders nützlich. Gemäß einem fünften erfindungsgemäßen Aspekt wird ein Vektor bereitgestellt, der eine erste Nukleinsäure-Sequenz umfaßt, die für ein Protein kodiert oder einen Klonierungsort darstellt, und die operativ an eine zweite Nukleinsäure-Sequenz gebunden ist, die eine starke Promotor- und Verstärkersequenz enthält, die von humanem Cytomegalovirus abgeleitet ist, sowie eine dritte Nukleinsäure-sequenz, die für eine Polyadenylierungs-Sequenz kodiert, die von SV40 abgeleitet ist, und eine vierte Nukleinsäure-Sequenz, die für einen auswählbaren Marker kodiert, der von einem SV40-Promotor exprimiert wird, und ein zusätzliches SV40-Polyadenylierungssignal an dem 3'-Ende der auswählbaren Markersequenz aufweist.
Es sei angemerkt, daß der Ausdruck "Vektor" wie er in der vorliegenden Beschreibung verwendet wird, in einem funktionellen Sinne zu verstehen ist, und nicht notwendigerweise als auf ein einzelnes Nukleinsäure-Molekül beschränkt anzusehen ist. So können beispielsweise die ersten, zweiten und dritten Sequenzen des oben definierten Vektors in einem ersten Nukleinsäure-Molekül enthalten sein, und die vierte Sequenz kann in einem zweiten Nukleinsäure-Molekül enthalten sein.
Der auswählbare Marker kann ein beliebiger geeigneter Marker sein. Geeignet ist der gpt-Marker.
Ein solcher Vektor ermöglicht die Expremierung von Proteinen wie Plasminogen und Plasminogen-Analoga (einschließlich Glu-Plasminogen und Lys-Plasminogen), die anders schwierig zu exprimieren sein können.
Dieser erfindungsgemäße Aspekt stellt den Aufbau eines Vektors bereit, der zur Exprimierung fremder Gene und cDNAs und zur Herstellung von heterologen Proteinen in Säugerzellen nützlich ist. Die spezielle beispielhafte Ausführungsform ist die Bildung stabiler Zell-Linien, die in der Lage sind, Plasminogen und Plasminogen-Analoga in hohen Mengen zu exprimieren.
Durch Verwendung eines Vektors, beispielsweise eines wie oben beschriebenen, werden heterologe Proteine, wie beispielsweise Plasminogen und Plasminogen-Analoga, vorzugsweise in einer biologisch aktiven Form exprimiert und in das Zellkulturmedium abgegeben, ohne daß die Notwendigkeit für irgendwelche zusätzlichen biologischen oder chemischen Vorgehensweisen besteht. Geeignete Zellen oder Zell-Linien für die Transformierung sind vorzugsweise Säugerzellen, die in kontinuierlicher Kultur wachsen, und die durch Standardtechniken transfiziert oder in anderer Weise transformiert werden können. Beispiele für geeignete Zellen schließen chinesische Hamster-Ovarienzellen (CHO), Maus-Myeloma-Zell-Linien wie P3X63-Ag8.653, COS-Zellen, HeLa-Zellen, BHK-Zellen, Melanom-Zell-Linien wie beispielsweise Bowes-Zell-Linie, Maus-L-Zellen, Human-Hepatom-Zell-Linien wie beispielsweise Hep G2, Maus-Fibrinoblasten und Maus-NIH'3T3-Zellen ein.
Es scheint, daß die Verwendung von CHO-Zellen als Wirtszellen für die Exprimierung von Plasminogen und Plasminogen-Analoga besonders vorteilhaft ist. Gemäß einem sechsten erfindungsgemäßen Aspekt wird daher eine chinesische Hamster-Ovarien (CHO)-Zelle bereitgestellt, die zur Exprimierung von Plasminogen oder Plasminogen-Analoga transformiert ist.
CHO oder andere Zellen, wie beispielsweise Hefe (beispielsweise Saccharomyces cerevisiae) oder Bakterien (beispielsweise Escherichia coli), können zur Expremierung anderer erfindungsgemäßer Eiweißverbindungen bevorzugt sein. Gemäß einem siebten erfindungsgemäßen Aspekt wird eine Zelle oder eine Zell-Linie bereitgestellt, die durch Nukleinsäure und/oder einen Vektor wie oben beschrieben transformiert ist. Die Transformierung kann erzielt werden durch ein beliebiges geeignetes Verfahren; ein Verfahren der Wahl ist die Elektroporierung.
Erfindungsgemäße Eiweißverbindungen können in pharmazeutischen Zusammensetzungen zur Vorbeugung oder Behandlung von Thrombose oder anderen Zuständen verwendet werden, in denen es wünschenswert ist, lokal fibrinolytische und/oder antikoagolative Aktivität zu erzeugen. Derartige Zustände schließen myokardiale und cerebrale Infarkte, bakterielle und venöse Thrombose, Tromboembolie, postoperative Adhäsionen, Thrombophlebitis und diabetische Vaskulopathien ein.
Gemäß einem achten erfindungsgemäßen Aspekt wird eine pharmazeutisch Zusammensetzung bereitgestellt, die eine oder mehrere Verbindungen gemäß dem ersten erfindungsgemäßen Aspekt und einen pharmazeutisch oder tiermedizinisch annehmbaren Träger umfassen. Eine derartige Zusammensetzung kann angepaßt sein für die intravenöse Verabreichung und kann daher steril sein. Beispiele für erfindungsgemäße Zusammensetzungen schließen Zubereitungen eines oder mehrerer steriler Plasminogen-Analoga in isotonischer physiologischer Kochsalz- und/oder Pufferlösung ein. Die Zusammensetzung kann zur Verringerung des Injektionsschmerzes ein Lokalanästhetikum einschließen. Die erfindungsgemäßen Verbindungen können in Einheitsdosisform abgegeben werden, beispielsweise als trockenes Pulver oder als wasserfreies Konzentrat in einem hermetisch verschlossenen Behälter wie beispielsweise einer Ampulle oder einem Beutel, worauf die Menge des Proteins angegeben ist Wenn eine Verbindung durch Infusion verabreicht werden soll, so kann diese mittels einer Infusionsflasche, die steriles Wasser für Injektionen oder Kochsalz- oder eine geeignet Pufferlösung enthält, abgegeben werden. Wenn sie durch Injektionen verabreicht werden soll, so kann sie mit einer Ampulle Injektionswasser, Kochsalz- oder einer geeigneten Pufferlösung abgegeben werden. Die infusier- oder injezierbare Zusammensetzung kann durch Vermischung der Bestandteile vor der Verabreichung hergestellt werden. Wenn sie durch topische Behandlung verabreicht werden soll, so kann sie in einer geeigneten Basis zugeführt werden.
Die Menge an zu verabreichenden Material hängt ab von dem eforderlichen Ausmaß an Fibrinolyse und Gerinnungsinhibierung, der erforderlichen Wirkungsgeschwindigkeit, der Ernsthaftigkeit der thromboembolischen Position und der Größe des Gerinsels. Die genaue zu verabreichende Dosis wird aufgrund der spezifischen Natur des mit den erfindungsgemäßen Verbindungen zu behandelnden Zustandes durch den Arzt bestimmt. Als Richtlinie wird jedoch ein Patient, der wegen eines ausgewachsenen Thrombus behandelt wird, im allgemeinen eine Tagesdosis eines Plasminogen-Analogons von 0,01 bis 10 mg/kg Körpergewicht entweder durch Injektion in beispielsweise bis zu 5 Einzeldosen oder durch Infusion erhalten.
Die Erfindung kann angewandt werden in einem Verfahren zur Behandlung oder Prophylaxe von Thrombose, umfassend die Verabreichung einer wirksamen, nicht-toxischen Menge einer Verbindung gemäß dem ersten Aspekt. Gemäß einem weiteren erfindungsgemäßen Aspekt wird daher die Verwendung einer wie oben beschriebenen Verbindung zur Herstellung eines throbolytischen und/oder antikoagulativen Mittels bereitgestellt.
Die Erfindung betrifft insbesondere die DNAS, die Vektoren, die transformierten Wirtsstränge, die plasminogenanalogen Proteine und das Verfahren für deren Herstellung, wie in den Beispielen beschrieben.
Die folgenden Figuren und Beispiele der Erfindung dienen der Illustrierung und nicht der Beschränkung. Beispiele 1 bis 3 beschreiben den für die Exprimierung von Plasminogen und Plasminogen-Varianten aus höheren eukaryontischen Zellen verwendeten Vektor. Die nachfolgenden Beispiele beschreiben die Exprimierung von Plasminogen und Plasminogen-Varianten und ihre Eigenschaften. In den Figuren, auf die in Beispielen Bezug genommen wird, zeigt:
Figur 1 den Aufbau von pGWH,
Figur 2 die Nukleotid-Sequenz des Glu-Plasminogens cDNA und die vorhergesagte Aminosäure-Sequenz,
Figur 3 eine Karte des Expressionsvektors pGWHgP1,
Figur 4 die Spaltortsequenzen von Faktor Xa-aktivierten Plasminogen- Analoga,
Figur 5 die spaltortsequenzen von Thrombin-aktivierten Plasminogen- Analoga,
Figur 6 die Aktivierung von X2 durch Faktor Xa und T2 durch Thrombin auf einem Fibrin-Agargel.
Figur 7 die Aktivierung der Plasminogen-Mutanten X3, T13 und T19 durch Faktor Xa (für X3) oder Thrombin (für T13 und T19); X3 ist Gegenstand der Beispiele 5 und 21, T13 ist Gegenstand der Beispiele 13 und 24, und T19 ist Gegenstand der Beispiele 16 und 26,
Figur 8 die Aktivierung der Plasminogen-Mutante T19 (Beispiele 16 und 26) durch Thrombin, bestimmt durch Plasmin-Untersuchung,
Figur 9 ein SDS-PAGE-Gel, das die Spaltung von X2 durch Faktor Xa und T2 durch Thrombin zeigt, und
Figur 10 die Geschwindigkeit der Spaltung der Plasminogen-Mutante T19 (Beispiele 16 und 26) mit Thrombin.

Beispiel 1

Das Plasmid pSSI ist ein Signalsequenzvektor, der ein Sekretionssignal für ein beliebiges Gen bereitstellt, das keine solche Sequenz aufweist. pGWI ist von diesem Vektor abgeleitet, und pGWH ist ein Expressionsvektor, der einen Promotor enthält.

Aufbau von pSS1

1. Das Plasmid pUC18 (Figur 1.1.) wurde als Rückgrat des Vektors verwendet, das es sowohl einen E. coli-Replikationsursprung enthält, der die Produktion der Plasmid-DNA in E. coli ermöglicht, sowie ein Ampicillin- Resistenzgen, das die Auswahl für das Plasmid in E. coli ermöglicht (Figur 1.1) (pUC18 ist offenbart in Gene 19, 259-268 (1982) und Gene 26, 101-106 (1983) und ist hinterlegt in der amerikanischen Typen-Kultur-Sammlung unter Hinterlegungs-Nr. ATCC 37253). pUC18 enthält ferner einen Polylinker, in den die synthetische DNA insertiert wurde, jedoch besitzt dieser Polylinker einen EcoRI-Ort der vor der Einfügung der synthetischen Sequenz entfernt werden mußte. Dies wurde erzielt durch Spaltung der DNA mit EcoRI und Behandlung mit Mungobohnen-Nuklease, einer einsträngingen Nuklease, und anschließender Religierung der Plasmid-DNA (Figur 1.2).
2. Die modifizierte pUC18-DNA wurde mit HindIII und BamHI gespalten und in diese Orte wurde ein synthetisches DNA-Fragment:
(5'AGCTTCCACCATGAAGTGCTCCTGGGTGATCTTCTTCCTGATGGCCGTGGT GACCGGCGTGAACTCGCGAGATCTAGAGTCGACCTGCAGGATATCGAATTCATT 3' (unterer Strang),
5'GATCAATGAATTCGATATCCTGCAGGTCGACTCTAGATCTCGCGAGTTCACG CCGGTCACCACGGCCATCAGGAAGAAGATCACCCAGGAGCACTTCATGGTGGA 3' (unterer Strang)), das eine Immunoglobulin-Signalsequenz (Nature, 331, 173-175 Rogelj et al., 1988) und einen Polylinker, der eine Reihe von Restriktionsenzymenorten enthält, sowie ein 237-Basenpaar-BcII-BamHI- Fragment, das aus SV40-DNA isoliert wurde und ein Polyadenylierungssignal enthält, in einer Dreiwegreaktion ligiert (Figur 1.3). Polyadenylierungssignale von anderen Genen, wie beispielsweise Rinderwachstumshormon, konnte ebenso zum Aufbau dieses Vektors verwendet werden. Reste des pUC18-Rückgrats, nämlich KnpI- und SmaI-Orte, blieben in dieser Konstruktion zurück und folglich wurden wurden diese Orte durch Verdauung der Plasmid-DNA mit KpnI und BamHI, Entfernung des Fragmentes und Insertion eines unteren Strangverbinders (5'GATCCGTAC3'), der die KpnI und SmaI-Orte zerstört und den BamHI-Ort wieder herstellt, entfernt (Figur 1.3).
3. Damit dieser Vektor für diese transiente Exprimierung in COS- Zellen nutzbar gemacht werden konnte, wurde ein synthetischer 90- Basenpaare-SV40-Replikationsursprung
(5'TATGAAGACGTCGCCTCCTCACTACTTCTGGAATAGCTCAGAGGCCGAGGC GGCCTCGGCCTCTGCATAAATAAAAAAATTAGTCAGGG 3' (oberer Strang)),
5'CGCCCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCGGCCTC TGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCGACGTCTTCA 3' (unterer Strang) in die NdeI-NarI-Orte von pUC18 liegiert, wodurch ein 53-Basenpaar-Fragment ersetzt wurde (Figur 1.4).
4. Eine synthetische DNA-Sequenz (5 'AAGCGGCCGCGGCCATGCC- GGCCACTAGTCTCGAGTT 3' (oberer Strang),
5 'AACTCGAGACTAGTG- GCCGGCATGGCCGCGGCCGCTT 3' (unterer Strang)), die für Restriktionsenzymorte kodiert, die unregelmäßig in das Säugergenom einschneiden, und das bei der Linearisierung der Plasmid-DNA vor der Transfizierung hilft, wurde in das Plasmid am SspI-Ort unter Bildung des promotorlosen Vektors pSSI ligiert (Figur 1.5).
5. Die Nukleotid-Sequenz des gesamten Plasmids wurde bestätigt.
Aufbau von pGW1
Viele cDNAS oder zu exprimierende Gene weisen bereits eine Signalsequenz auf, und so wurde pSSI dahingehend modifiziert, daß das Sekretionssignal entfernt wurde.
6. Die DNA wurde mit HindIII und NruI gespalten, das Fragment entfernt, und ein Linker
(5'AGCTTCCCGGGATAGG- TACCTCG 3' (oberer Strang),
5'CGAGGTACCTATCCCGGGA 3' (unterer Strang)), der die HindIII-, SmaI-, KpnI- und NruI-Orte enthielt, wurde eingefügt (Figur 1.6). Zusätzlich zum Entfernen der Signalsequenz werden dadurch zwei Restriktionsenzymorte in den Polylinker eingefügt, wodurch dieser vielseitiger wird. Dieser promotorlose Vektor wird als pGWI bezeichnet, und der korrekte Aufbau wurde durch Nukleotid-Sequenzanalyse des gesamten Plasmids bestätigt.
Aufbau von pGWH
7. Das Plasmid pSSI wies keine Promotor- oder Verstärkersequenz auf. Diese kann bequem durch die Ligierung geeigneter DNA-Fragmente in den Polylinker zugefügt werden, beispielsweise am HindIII-Ort. Eine für diese Anwendung geeignete Promotor/Verstärkersequenz ist die unmittelbare frühe Transkriptionsregulationsregion des Human-Cytomegalovirus (HCMV) (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 659-663, Thomsen et al. 1984), obwohl andere Regulationsregionen verwendet werden können wie Rous-Sarcoma-Viruslangterminale Wiederholung (RSV LTR), die SV40- frühe oder späte Promotor/Verstärkerregion, Maus-Brusttumor-Virus (MMTV) LTR, Maus- Metallothionein-Promotor. Dieser wurde in pGWI am HindIII-Ort insertiert und dann wurde die Orientierung durch Restriktionsendonukleaseverdauung überprüft. Der 5'-HindIII-Ort wurde dann mittels Durchführung einer teilweisen Verdauung mit HindIII in einer solchen Weise, daß nur der 5'-Ort gespalten wurde, entfernt. Dieser Ort wurde dann durch Behandlung mit Mungobohnen-Nuklease und anschließende Religierung entfernt, wodurch pGWH (Figur 1.7) gebildet wurde. Der korrekte Aufbau des Vektors wurde durch Nukleotid-Sequenzanalyse des gesamten Plasmids bestätigt.
8. Ein DNA-Fragment, das das ausfüllbare Markergen gpt und die SV40- frühe Promotor/Verstärkersequenz und Polydenylierungssequenz einschloß, wurde in den Bampil-Ort des Vektors geklont, wodurch pGWHg gebildet, und die Auswahl von Zellen, die die Plasmid-DNA stabil integriert haben, ermöglicht wurde. Ebenso konnten Gene verwendet werden, die für Proteine kodieren, die eine Resistenz gegen G418 oder Hygromycin, oder eine Reihe von metabolischen Selektionen bewirken.
Dieses bestimmte Expressionssystem ist aufgrund seiner Wirksamkeit bevorzugt, jedoch ist dessen Verwendung nicht so zu verstehen, daß sie den Umfang der vorliegenden Erfindung limitiert. In der Literatur sind viele alternative Verfahren zur Exprimierung von Genen in Säugerzellen beschrieben, und derartige Expressionssysteme sind dem Fachmann im Bereich der Gentechnologie gut bekannt und sind zumindest teilweise dokumentiert von Gorman in "DNA Cloning, Bd. II: A Practical Approach" (D. M. Glover, Hrsg. IRL Press, Oxford (1985), S. 143-190).

Beispiel 2 - Exprimierung von Glu-Plasminogen

Verfahren, die zur Isolierung von cDNA verwendet werden können, sind gut dokumentiert, und eine Vorgehensweise, die zur Isolierung des Plasminogens cDNA verwendet wurde, ist in dem folgenden Protokoll zusammengefaßt. Die Human-Plasminogen-cDNA wurde geklont und sequenziert (Forsgren et al. FEBS Letters, 213, 254-260 (1987)).
1. Die RNA wurde aus frischer Humanleber unter Verwendung des Guanidinthiocyanat-Verfahrens (Chirgwin et al. Biochemistry 10: 5294 (1979)) hergestellt und mittels einer Oligo-dT-Kolonne (Aviv and Leder PNAS 69: 1408 (1972)) gereinigt.
2. Die cDNA-Bibliothek wurde wie im Amersham-Protokoll beschrieben ("cDNA Synthesis and Cloning System", Amersham Internation plc, 1985) hergestellt. Die doppelsträngige cDNA wurde in einen k-Vektor ligiert.
3. Plaques wurden auf Plasminogen cDNA durch Hybridisierung zu Nitrocellulose-Replikaten gescreent, wobei ³²P-markierte Oligonukleotid- Sonden (17mers) verwendet wurden, die die 3'- und 5'-Enden von Plasminogen repräsentierten, in einer Pufferlösung, die 6 x SSC (SSC ist 150 mM NaCl, 15 mM Natriumcitrat), 5 x Denhardts 0,2 % SDS und 0,1 mg/ml Lachssperma-DNA enthielt, bei Raumtemperatur über Nacht. Filter wurden unter Verwendung von 6 x SSC, 0,1 % SDS bei 47ºC gewaschen. Positive Plaques wurden gereinigt, der Plasmid-Rückgewinnung unterzogen und die vereinigten rekombinanten Plasmid-Klone und ihre Subklone wurden mittels einer Modifikation des Dideoxy-Verfahrens unter Verwendung von dATP-5'-α-[35S] thiophosphophat (siehe Verfahrensabschnitt) sequenziert. Diese cDNA kodiert für ein Glu- Plasminogenprotein von 791 Aminosäuren, was der Länge des von Forsgren et al. (ebd.) berichteten Plasminogens entspricht, und eine zusätzliche Aminosäure (Ile65) enthält, wenn es mit der Aminosäure-Sequenz verglichen wird, die durch Protein-Sequenzierung bestimmt wird (Sottrup-Jensen et al., ebd.). Die Nukleotid-Sequenz in der cDNA und der 791-Aminosäure-Sequenz von Glu-Plasminogen ist in Figur 2 gezeigt.
Andere Verfahren zur Isolierung können verwendet werden, beispielsweise kann aus Plasminogen erzeugenden Zellen isolierte mRNA hergestellt werden unter Anwendung des Guanidinthiocyanat-Verfahrens (Chirgwin et al., Biochemistry 10: 5294 (1979)) und eines komplementären ersten DNA-Stranges, der unter Verwendung von reverser Transkriptase synthetisiert wurde. Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) kann dann zur Vervielfältigung der Plasminogen-Sequenz verwendet werden (Saiki R., et al., Science 239, 487-491 (1988)). Die PCR-Reaktion kann auch zur Vervielfältigung der DNA- Sequenz verwendet werden, die aus einer genomischen oder cDNA-Bibliothek hergestellt wurde, die für Plasminogen kodierende Sequenzen enthält. Alternativ kann das Gen durch chemisch synthetisierte Oligonukleotide zusammengesetzt werden.
Das 2,5 kb-BAII-SphI Glu-Plasminogen-Fragment wurde in den Polylinker von pUC18 an den SmaI-SphI-Orten subgeklont (Figur 2). Die Plasminogen-cDNA wurde dann aus dem pUC18 auf einem KpnI-SphI-Fragment gespalten und in den Vektor pGWH ligiert, wodurch pGWHP, das wie in Beispiel 1 hergestellt wurde, an den KpnI- und EcoRI-Orten unter Verwendung eines EcoRI-SphI- Linkers (5'AATTCCATG 3') hergestellt wurde. Folglich kann die Transkription durch die Plasminogen-cDNA am HCMV-Promotor/Verstärker beginnen (Figur 3). Der auswählbare Marker gpt, der aus SV40-Promotor exprimiert war, und ein Polyadenylierungssignal an seinem 3'-Ende aufwies, wurde in den BamHI-Ort von pGWHP geklont, wodurch pGWHgP1 (Figur 3) hergestellt wurde, und die Orientierung wurde durch Restristriktionsenzymnuklease-Verdauung überprüft. Plasmid-DNA wurde in CHO-Zellen durch Elektroporierung bei 800 V und 25 µF, wie unten in dem Verfahrensabschnitt beschrieben, eingeführt. Ein selektives Medium (250 µl/ml Xanthin, 5 µg/ml Mycophenolsäure, 1 x Hypoxanthin- Thymidin (HT)) wurde 24 h nach der Transfektion zu den Zellen hinzugegeben, und die Medien wurden alle zwei bis drei Tage ausgetauscht. Platten, die gpt-resistente Kolonien hervorbrachten, wurden auf Plasminogen-Produktion mittels eines ELISA-Testes gescreent. Die Zellen, die die höchsten Mengen an Antigen produzierten, wurden wieder geklont und die besten Produzenten in Kolben aufgesammelt, wobei die Produktion sorgfältig aufgezeichnet wurde. Von all diesen Zell-Linien wurden eingeforene Proben niedergelegt. Die Zell-Linien C1.44 und C1.75, die beide Glu-Plasminogen in einer Konzentration von > 3 mg/l erzeugen, wurden in Rollflaschen (roller bottles) aufgesammelt, wodurch ein konditioniertes Medium bereitgestellt wurde, aus dem Plasminogenprotein unter Verwendung von Lysin-SEPHAROSE 4B gereinigt wurde (das Wort SEPHAROSE ist ein Warenzeichen). Das gereinigte Plasminogen wurde dann auf seine Fähigkeit, durch tPA oder Streptokinase gespalten zu werden, unter Anwendung des Fibrin-Agar-Gerinnungstests untersucht. Die Spaltung des Zymogens wurde auch unter Verwendung von SDS-PAGE (Nature, 227, 680, Laemmli, 1970) untersucht.
Die Techniken der Genmanipulation, Exprimierung und Protein-Reinigung, wie sie zur Herstellung dieses Wild-Typ-Plasminogens sowie für die nachfolgenden modifizierten Plasminogen-Beispiele verwendet wurden, sind dem Fachmann im Bereich der Gentechnologie wohlbekannt. Eine Beschreibung der meisten dieser Techniken kann in einem der folgenden Laborhandbücher gefunden werden: "Molecular Cloning" von T. Maniatis, E. F. Fritsch und J. Sambrook, veröffentlicht von Cold Spring Harbor Laboratory, Box 100, New York, oder "Basic Methods in Molecular Biology" von L. G. Davis, M. D. Dibner und J. F. Battey, veröffentlicht von Elsevier Science publishing Co Inc., New York.
Zusätzliche und modifizierte Methoden sind unten in dem Verfahrensabschnitt detaillierter dargestellt.

Beispiel 3 - Aufbau und Exprimierung von X1

Plasminogen-Analoga, die um die Arg(561), Val(562)-Spaltorte herum verändert wurden, wurden zur Modifizierung des Ortes und zur Ermöglichung der Erkennung und Spaltung durch alternative Enzyme aufgebaut. X1 ist ein Plasminogen-Analogon, worin der Aminosäure-Rest Pro(559) durch Ile und Glu ersetzt ist (Figur 4). Dieser Ort basiert auf einem Faktor Xa-Spaltort in Prothrombin. Die Modifizierungsstrategie in diesem Beispiel war die Subklonierung des 1,87 Kb KpnI-HincII-Fragments von der Plasminogen-cDNA in einem pUC18-Vektor in den einzeisträngigen Bacteriophagen M13mp18, wodurch die Mutagenese vereinfacht wird. Einzeistrangtemplates wurden hergestellt, und die Mutationen durch Oligonukleotid-gesteuerte Mismatch-Mutagenese bewirkt. In diesem Falle wurde ein 21 Basenpaare langes Oligonukleotid (5'CCCTTCCCTCGATACATTTCT3') für die Mutagenese verwendet. Durch Sequenzierung wurden die Klone identifiziert, die die Mutation aufwiesen, und diese wurden dann voll sequenziert, damit sichergestellt war, daß nicht unbeabsichtigt andere Mutationen eingeführt wurden. Dann wurde replikative Form (RF)-DNA hergestellt und die Mutation in den Expressionsvektor, der das Glu-Plasminogen enthielt (wie in Beispiel 2 beschrieben) durch Ersetzen des Wild-Typ-KpnI-EcoRV-Fragments durch das mutierte Fragment transferiert. Das pGWHg-Plasmid, das das Mutanten-Plasminogen trug, wurde dann mit der Restriktionsendonuklease NotI linearisiert und mittels Elektroporierung in CHO-Zellen eingeführt. Das Exprimierungsprotokoll war dann das gleiche wie in Beispiel 2 beschrieben. Die Zell-Linie, die zur Erzeugung dieses Mutantenproteins verwendet wurde, ist C7.9. Die Aktivierung und Spaltung dieser Mutante mit gereinigtem Faktor Xa wurde wie für Beispiele 20 und 29 beschrieben untersucht.

Beispiel 4 - Aufbau und Exprimierung von X2

Die Vorgehensweise von Beispiel 3 wurde im allgemeinen eingehalten, mit der Ausnahme, daß der verwendete Primer das 22mer (5'CCTTCCCTCGATGCCACATTTC 3') war. Das resultierende mutante Plasminogen-Derivat wies die folgenden Aminosäure-Veränderungen auf: Pro(559) zu Gly, Gly(560) zu Ile und Einfügung von Glu und Gly vor Arg(561) (Figur 4). Dieser Spaltort basiert auf einem Faktor Xa-Spaltort in Prothrombin. Die Zell-Linie C8.24 wurde zur Produzierung dieses Mutantenproteins hochgezüchtet. Im übrigen wurde im allgemeinen die Vorgehensweise von Beispiel 3 befolgt. Die Aktivierung und Spaltung dieser Mutante wurde wie in den Beispielen 20 und 27 beschrieben untersucht.

Beispiel 5 - Aufbau und Exprimierung von X3

In X3 wurde Pro(559) durch Gly, Ala, Ile und Glu unter Verwendung des 48mers (5 'CCCCCCCACAACCCTTCCCTC-TATT-GCACCACATTTCTTCGGCTCCAC 3') substituiert (Figur 4). Die Zell-Linie C37.4 wurde zur Herstellung diese Proteins verwendet, das einen Spaltort aufweist, der auf einem Faktor Xa-Spaltort in Prothrombin basiert. Im übrigen wurde die Vorgehensweise von Beispiel 3 weitestgehend befolgt. Die Aktivierung dieser Mutante ist unten in Beispiel 21 beschrieben.

Beispiel 6 - Aufbau und Exprimierung von X5

In X5 wurde unter Verwendung eines 4Bmers (5'CCCCCCCACAACCCTTCCGTCTATGTAAC-CACATTTCTTCGGC-TCCAC 3') (Figur 4) das Pro(559) durch Gly, Tyr, Ile und Asp ersetzt. Die Zell-Linie C39.7 wurde zur Herstellung dieses Proteins verwendet, das einen Spaltort aufweist, der auf einem Faktor Xa-Spaltort in Prothrombin basiert. Im übrigen wurde die Vorgehensweise von Beispiel 3 im allgemeinen befolgt. Die Aktivierung dieser Mutante ist unten in Beispiel 21 beschrieben.

Beispiel 7 - Aufbau und Exprimierung von X6

Zusätzlich zu der Mutation in X5 ist in X6 Val(561) durch Ile ersetzt (Figur 4). Dies wurde bewirkt unter Verwendung des 52mers (5'CACACCCCCCCACAATCCTTCCGTCTATGTAACCACATTTCTTCG-GCTCCAC 3'). Die Zell- Linie C36.1 wurde zur Erzeugung dieses Proteins verwendet. Im übrigen wurde im allgemeinen die Vorgehensweise aus Beispiel 3 befolgt. Die Aktivierung dieser Mutante ist unten in Beispiel 21 beschrieben.

Beispiel 8 - Aufbau und Exprimierung von T1

T1 ist ein Plasminogen-Derivat, worin Pro(559) und Gly(560) ausgetauscht wurden, wodurch Gly in der Position 559 und Pro auf 560 lokalisiert ist (Figur 5). Dieser Spaltort ist eine Nachahmung des Thrombin-Spaltortes bei Arg(19)-Val(20) in der Fibrinogen-A-α-Kette. Es wurde im allgemeinen die Vorgehensweise aus Beispiel 3 befolgt, mit der Ausnahme, daß der verwendete Primer das 21mer (5'CAAC-CCTTGGACCACATTTCT 3') war. Die Zell-Linie, die die T1-Mutante hergestellte, ist C6.23. Die Aktivierung und Spaltung dieses Proteins ist unten in Beispiel 22 und 28 beschrieben.

Beispiel 9 - Aufbau und Exprimierung von T2

T2 ist ein Plasminogen-Derivat, das im Vergleich zum Wild-Typ- Plasminogen in der gleichen Weise wie T1 modifiziert ist, und worin eine zusätzliche Gly-Aminosäure zwischen Gly(559) und Pro(560) eingefügt wurde (Figur 5). Es wurde im allgemeinen die Vorgehensweise von Beispiel 3 befolgt, mit der Ausnahme, daß der zur Herstellung dieser Mutante verwendete Primer ein 22mer (5'ACCCTTGGACCACCACATTTCT 3') ist. Zur Herstellung dieses Mutanten-Proteins wurde die Zell-Linie CS.16 verwendet. Die Aktivierung und Spaltung dieser Mutante ist unten in den Beispielen 22 und 28 gezeigt.

Beispiel 10 - Aufbau von T6

In dem T6-Protein befinden sich zwei Orte mit Aminosäureveränderungen. Die Aminosäuren Pro(559), Gly(560), Arg(561), Val(562) wurden durch sechs Aminosäure Gly(559), Val(560), Val(561), Pro(562), Arg(563), Gly(564) ersetzt. Zusätzlich zu diesen Veränderungen wurden Val(553), Lys (556) und Lys(557) ersetzt durch Leu, Glu und Leu, wozu ein 61mer (5'GGGCCACACACCCCCCCACTCCCCTAGGCACAACTCCACATAGCTCCGGCT-CCAGTTGAGG 3') (Figur 5) verwendet wurde. Diese Modifizierung basiert auf einem Thrombin- Spaltort in Faktor XIII. Die Zelle-Linie C45.1 wurde zur Herstellung dieses Proteins verwendet. Im übrigen wurde im allgemeinen die Vorgehensweise von Beispiel 3 befolgt. Die Aktivierung und Spaltung dieses Proteins ist unten in den Beispielen 23 und 29 beschrieben.

Beispiel 11 - Aufbau und Exprimierung von T7

In einer anderen Modifikation, die auf einem Thrombin-Spaltort Faktor XIII basiert, beinhaltete T7 den ersten Satz von Veränderungen, wie sie für T6 beschrieben wurden, nämlich die Ersetzung von Pro(559), Gly(560), Arg(561), Val(562) durch sechs Aminosäuren zu Gly(559), Val(560), Val(561), Pro(562), Arg(563), Gly(564). Zusätzlich wurden Val(553), Lys(556) und Lys(557) durch Leu, Gin und Leu unter Verwendung eines 60mers (5'GGCCACACACCCCCCCAC-TCCCCTAGGCACAACTCCACAT-AGTTGCGGCTCCAGTTGAGG 3') (Figur 5) ausgetauscht. Die Zell-Linie C26.5 wurde zur Herstellung dieses Proteins verwendet. Im übrigen wurde im allgemeinen die Vorgehensweise von Beispiel 3 befolgt. Die Aktivierung und Spaltung dieses Proteins ist unten in den Beispielen 23 und 29 beschrieben.

Beispiel 12 - Aufbau und Exprimierung von T8

T8 basiert auf dem Thrombin-Spaltort in Faktor XIII, und in diesem Protein ist Pro(559), Gly(560), Arg(561), Val(562) ersetzt durch Val, Glu, Leu, Gln, Gly, Val, Val, Pro, Arg, Gly unter Verwendung eines 61mers (5'CACACACCCCCCC-ACTCCCCTAGGCACTACTCCTTGTAGTTCTACACATTTCTTCGGCTCC 3') (Figur 5). Die Zell-Linie C34.5 wurde zur Herstellung dieses Proteins verwendet. Im übrigen wurde im allgemeinen die Vorgehensweise aus Beispiel 3 befolgt. Die Aktivierung und Spaltung dieses Proteins ist unten in den Beispielen 23 und 29 beschrieben.

Beispiel 13 - Aufbau und Exprimierung von T13

In dem Plasminogen-Derivat T13 wurden die zwei Aminosäuren Pro(559) und Gly(560) ersetzt durch die drei Aminosäuren Val, Val und Pro unter Verwendung eines 41mers (5'CACCCCCCCA-CAACCCTAGGTACAACACATTTCTTCGGCTC 3') (Figur 5). Zur Herstellung dieses Proteins wurde die Zell-Linie C51.1 verwendet. Im übrigen wurde im allgemeinen die Vorgehensweise aus Beispiel 3 befolgt. Die Aktivierung und Spaltung des Proteins ist unten in den Beispielen 24 und 29 beschrieben.

Beispiel 14 - Aufbau und Exprimierung von T14

Das Plasminogen-Analogon T14 weist einen Thrombin-Spaltort auf, der auf einem Ort in Calcitonin basiert, der durch Thrombin gespalten wird. In der Mutante sind die Aminosäuren Gly und Tyr zwischen Cys(558) und Pro(559) eingefügt, und zusätzlich ist Gly(560) entfernt (Figur 5). Diese Mutationen wurden durchgeführt unter Verwendung eines 41mers (5'CACCCCCCCACAACCCTAGGGTATCCA-CATTTCTTCGGCT 3'). Die zur Herstellung dieses Proteins verwendete Zell-Linie war C61.1. Im übrigen wurde im allgemeinen die Vorgehensweise aus Beispiel 3 befolgt.

Beispiel 15 - Aufbau und Exprimierung von T17

Das Protein T17 besitzt einen Spaltort, der auf einem Ort in Cholecystokinin basiert, der durch Thrombin gespalten wird. In diesem Protein ist zwischen Pro 559 und Gly 560 Ser unter Verwendung eines 38mers (5'CACCCCCCCACAACCCTTCCACTAGGACA-TTTCTTCGG 3') (Figur 5) insertiert. Zur Herstellung dieses Proteins wurde die Zell-Linie C49.7 verwendet. Im übrigen wurde im allgemeinen die Vorgehensweise von Beispiel 3 befolgt. Die Aktivierung und Spaltung dieses Proteins ist unten in Beispielen 25 und 29 beschrieben.

Beispiel 16 - Aufbau und Exprimierung von T19

Der Spaltort dieses Proteins basiert auf einem Thrombin-Spaltort im Faktor XIII. Diese Mutante weicht von T8 dahingehend ab, daß die P1'- Aminosäure Val anstelle von Gly ist. Die Spaltung erzeugt zweikettiges T19 Plasmin mit einer ursprünglichen leichten Kettensequenz. In diesem Protein sind Pro(559), Gly(560) und Arg(561) ersetzt durch Val, Glu, Leu, Gin, Gly, Val, Val, Pro, Arg unter Verwendung eines 61mers (5'CACACCCCCCCACAACCCTTGGGACTACTCCCTGCAATTCTACAC-ATTCTTCGGCTCCAC 3') (Figur 5). Die Zell-Linie C53.5 wurde zur Herstellung des Proteins verwendet. Im übrigen wurde im allgemeinen die Vorgehensweise von Beispiel 3 befolgt. Die Aktivierung und Spaltungsanalyse dieses Proteins ist unten in den Beispielen 26 und 29 angegeben.

Beispiel 17 - Aufbau und Exprimierung von T20

Der Spaltort dieses Proteins entspricht demjenigen von T19, jedoch ist in der terminalen Aminosäure-Sequenz der durch Spaltung erzeugten leichten Plasminkette Val(562) und Val(563) entfernt. In diesem Protein wurden Pro(559), Gly(560), Arg(561), Val(562) und Val(563) unter Verwendung eines 58mers (5'GGCCACACACCCC- CCCCTTGGGACTACTCCCTGCAATTCTACACATTTCTTCGGCTCC 3') (Figur 5) durch Val, Glu, Leu, Gln, Gly, Val, Val, Pro, Arg ersetzt. Die Zell-Linie C54.2 wurde zur Herstellung des Proteins verwendet. Im übrigen wurde im allgemeinen die Vorgehensweise von Beispiel 3 befolgt.

Beispiel 18 - Aufbau und Exprimierung von T21

Diese Mutante weicht von T6 dahingehend ab, daß die P1'-Aminosäure Val anstelle von Gly ist. Die Spaltung erzeugt zweikettiges T21-Plasmin mit einer ursprünglichen leichten Kettensequenz. Die cDNA, die für dieses Protein kodiert, wurde unter Verwendung des T6 cDNA-templates, das in Beispiel 10 beschrieben ist, und des 23mers (5'CACCCCCCCACTACCCTAGGCAC 3') (Figur 5) hergestellt. Zur Herstellung dieses Proteins wurde die Zell-Linie C55.9 verwendet. Im übrigen wurde im allgemeinen die Vorgehensweise aus Beispiel 3 befolgt.

Beispiel 19 - Aufbau und Exprimierung von T22

Diese Mutante weicht von T7 dahingehend ab, daß die P1'-Aminosäure Val anstelle von Gly ist. Die Spaltung erzeugt zweikettiges T22-Plasmin mit einer ursprünglichen leichten Kettensequenz (Figur 5). Die cDNA, die für dieses Protein kodiert, wurde wie in Beispiel 11 beschrieben mit einem T7- cDNA-Hintergrund unter Verwendung des für T21 beschriebenen 23mers hergestellt. Zur Herstellung dieses Proteins wurde die Zell-Linie C56.11 verwendet. Im übrigen wurde im allgemeinen die Vorgehensweise aus Beispiel 3 befolgt.

Beispiel 20 - Aktivierung von X1 und X2

Die Aktivierung der X1- und X2-Proteine zu Plasmin durch den Faktor Xa wurde mittels eines Fibrin-Lysistests bestimmt. Die Erzeugung von Plasmin wird nachgewiesen durch das Auftreten einer Klärungszone, die sich wie in Verfahren 12.1 (siehe unten im Verfahrensabschnitt) in einem Fibrin- Agarosegel entwickelt. 25 µl-Mengen gereinigter Plasminogen-Mutante (635 µg/ml) wurden mit 2,5 µl gereinigtem Faktor Xa (0,35µg) bei 37ºC inkubiert. Die Erzeugung von Plasmin wurde durch Zugabe von 10 µl-Proben aus der Inkubation in Vertiefungen in einen Fibrin-Agargel getestet. Proben der mit Faktor Xa inkubierten Plasminogen-Mutante ergaben eine Klärungszone auf dem Gel, die in den Kontrollproben, die nicht mit dem Faktor Xa inkubiert wurden, nicht vorhanden war. Die Aktivierung von X2 zu Plasmin durch den Faktor Xa ist in Figur 6 gezeigt.

Beispiel 21 - Aktivierung von X3, X5 und X6

Gereinigtes X3-Protein wurde bezüglich der Aktivierung unter Verwendung des gebundenen Chromogen-Tests (siehe Verfahren 12.3) untersucht. Die Ergebnisse des Tests sind in Figur 7 gezeigt, worin die Zunahme der Absorbanz bei 405 nm im Laufe der Zeit anzeigt, daß durch Inkubation von X3 mit Faktor Xa Plasmin-Aktivität gebildet wird. In gleicher Weise wurde gezeigt, daß X5 und X6 durch Inkubation mit Faktor Xa aktiviert werden.

Beispiel 22 - Aktivierung von T1 und T2

Die gereinigten mutanten Proteine T1 und T2 wurden wie in Beispiel 20 beschrieben bezüglich der Aktivierung getestet, mit dem Unterschied, daß die mutanten Proteine mit Thrombin (2551 Plasminogen-Mutante (120 µg/ml) wurde mit 2,5 µl Thrombin (0,69 Einheiten) inkubiert) präinkubiert wurden, und die Vertiefungen in dem Fibrin-Gel wurden mit Hirudin zur Inhibierung eines aktivierenden Effektes des Thrombins, das zur Herstellung des Gels verwendet wurde, vorbehandelt. Beide Mutanten wurden durch Thrombin aktiviert, da die mit Thrombin inkubierten Proben eine Klärungszone auf dem Gel hervorriefen. Durch Kontrollproben, die nicht mit Thrombin inkubiert wurden, wurden keine Klärungszonen erzeugt. Die Ergebnisse für T2 sind in Figur 6 gezeigt.

Beispiel 23 - Aktivierung von T6, T7 und T8

Die Mutanten-Proteine wurden bezüglich der Aktivierung mittels eines gebundenen Chromogen-Tests (siehe Verfahren 12.3.) untersucht. Dieser Test zeigt, daß T6, T7 und T8 nicht durch Thrombin aktiviert werden (obwohl sie gespalten werden, siehe Beispiel 29).

Beispiel 24 - Aktivierung von T13

Gereinigtes T13-Protein wurde unter Anwendung des gebundenen Chromogen-Tests wie in Beispiel 23 beschrieben untersucht. Die Ergebnisse dieses Tests sind in Figur 7 gezeigt, worin die Zunahme der Absorbanz bei 405 nm mit der Zeit zeigt, daß T13 durch Thrombin aktiviert wird. Die Aktivierung wurde auch unter Anwendung des direkten Chromogen-Tests wie in Beispiel 26 bschrieben, nachgewiesen.

Beispiel 25 - Aktivierung von T17

Gereinigtes T17-Protein wurde unter Anwendung des gebundenen Chromogen-Tests wie in Beispiel 25 beschrieben getestet. Dieser Test zeigte, daß Thrombin T17 aktiviert.

Beispiel 26 - Aktivierung von T19

Gereinigtes T19-Protein wurde unter Anwendung des gebundenen Chromogen-Tests wie in Beispiel 23 beschrieben untersucht, und die Ergebnisse dieses Tests sind in Figur 7 gezeigt, worin die Zunahme der Absorbanz bei 405 nm mit der Zeit zeigt, daß T19 durch Thrombin aktiviert wird.
Das mutante Protein T19 wurde auch unter Anwendung des direkten Chromogen-Tests analysiert, der die Quantifizierung des durch die Aktivierung erzeugten Plasmins erlaubt (siehe Verfahren 12.2). Die Ergebnisse dieses Tests sind in Figur 8 gezeigt, worin die Erzeugung von Plasmin im Laufe der Zeit zeigt, daß T19 durch Thrombin aktiviert wird.

Beispiel 27 - Spaltung von X-Mutanten

Proben von 25 µg X-Plasminogen-Mutanten wurden mit 1,5 µg Faktor Xa in 0,25 ml Puffer inkubiert, und die Spaltungsanalyse wurde wie in Verfahren 11 beschrieben durchgeführt. Figur 9 zeigt, daß die X2-Plasminogenbande bei ungefähr 92 kDa gespalten wurde, wodurch eine schwere Ketten- Plasminbande bei ungefähr 66 kDa gebildet wurde. Dies zeigt an, daß die mutante Aminosäuresequenz, die wir eingeführt haben, durch Faktor Xa gespalten wird, und daß die Aktivierung, die für X2 in Beispiel 20 gezeigt wurde, ein Ergebnis der Spaltung des Plasminogen-Analogons unter Erzeugung von Plasmin ist.

Beispiel 28 - Spaltung von T1 und T2

Die Spaltungsanalysen an dem gereinigten Protein T1 und T2 wurden wie in Beispiel 27 beschrieben durchgeführt, mit dem Unterschied, daß Thrombin (1,5 µg) anstelle von Faktor Xa verwendet wurde. Die Spaltung von T2 zu Plasmin durch Thrombin ist in Figur 9 gezeigt, wodurch bestätigt wird, daß die in Beispiel 24 gezeigte Aktivierung ein Ergebnis der Thrombin-Spaltung ist.

Beispiel 29 - Spaltung von T6, T7, T8, T13, T17 und T19

Proben von 12,5 µg Plasminogen-Mutante wurden mit 2,8 µg Thrombin wie in Verfahren 11 beschrieben inkubiert. Der zeitliche Verlauf der Spaltung der Plasminogen-Mutanten wurde durch quantitatives Gel-Scanning bestimmt, und die Zeiten für 50%ige Spaltung von T6, T7, T8, T13 und T19 betrugen 13, 40, 15, 70 bzw. weniger als 10 min, während die Spaltzeit für T17 ungefähr 30 h betrug. Gel-Scan-Daten für die Spaltung von T19 (Verschwinden der Plasminogen-Bande) sind in Figur 10 gezeigt.

Beispiel 30 - Aufbau von Lys-3

Eine cDNA, die für ein Lys-Plasminogen kodiert, worin die native Plasminogen-Signalsequenz in Nachbarschaft zu dem Glu(76)-Rest liegt, wurde hergestellt durch Entfernung der 75 Amino-terminalen Aminosäuren von Glu- Plasminogen durch Loop out-Mutagenese unter Verwendung eines 35mers (5'CTGAGAGATACACTTTCTT-TTCTCCTTGACCTGAT 3'). Im übrigen wurde im allgemeinen die Vorgehensweise von Beispiel 3 befolgt.

Beispiel 31 - Aufbau von Lys-4

In diesem Lys-Plasminogen wurden 77 Aminosäuren zwischen Gly(19) der Signalsequenz und Lys(78) von Glu-Plasminogen durch Loop out-Mutagenese unter Verwendung eines 28mers (5'CTGAGAGATACACTTTTCCTTGACCTGAT 3') entfernt. Im übrigen wurde die Vorgehensweise aus Beispiel 3 befolgt.

Beispiel 32 - Aufbau von Lys-5

In diesem Lys-Plasminogen wurden 76 Aminosäuren zwischen Gly(19) der Signalsequenz und Lys(77) von Glu-Plasminogen durch Loop out-Mutagenese unter Verwendung eines 32mers (5'CTGAGAGATACACTTTCTTTCCTTGACCTGAT 3') entfernt. Im übrigen wurde im allgemeinen die Vorgehensweise von Beispiel 3 befolgt.

Verfahren

1. Mungobohnen-Nukleaseverdauung

10 Einheiten Mungobohnen-Nuklease wurden zu ungefähr 1 µg DNA hinzugegeben, die mit einem Restriktionsenzym in einem Puffer verdaut wurden, der 30 mm NaOAc pH 5,0, 100 mm NaCl, 2 mm ZnCl und 10 % Glycerol enthielt. Die Mungobohnen-Nuklease wurde bei 37ºC für 30 min inkubiert, und für 15 min bei 67ºC inaktiviert, bevor sie Phenol-extrahiert und mit Ethanol ausgefällt wurde.

2. Oligonukleotid-Synthese

Die Oligonukleotide wurden durch automatisierte Phosphoramidit-Chemie unter Verwendung von Cyanoethylphosphoramiditen synthetisiert. Diese Technologie wird nicht weitverbreitet verwendet, und wurde beschrieben in (Beaucage, S. L. und Caruthers, M. H., Tetrahedron Letters 24, 245 (1981) und Caruthers, M. H., Science 230, 281-285 (1985)).

3. Reinigung der Oligonukleotide

Die Oligonukleotide wurden entschützt und von dem CPG-Träger durch Inkubation in konzentriertern NH&sub3; entfernt. Typischerweise wurden 50 mg CPG, das 1 µmol Oligonukleotid trug, durch Inkubation für 5 h bei 70ºC in 600 µl konzentriertem NH&sub3; entschützt. Der Überstand wurde in ein frisches Röhrchen transferiert und das Oligomer mit 3 Volumen Ethanol ausgefällt. Nach der Zentrifugierung wurde das Pellet getrocknet und in 1 ml Wasser resuspendiert. Die Konzentration an rohem Oligomer wurde dann durch Messung der Absorbanz bei 260 nm bestimmt.
Für die Gel-Reinigung wurden 10 Absorbanzeinheiten des rohen Oligonukleotids getrocknet und in 15 µl Markerfarbstoff (90 % deionisiertes Formamid, 10 mm Tris, 10 mm Borat, 1 mm EDTA, 0,1 % Bromphenolblau) resuspendiert. Die Proben wurden für 1 min auf 90º erhitzt und dann auf 1,2 mm dickes denaturierendes Polyacrylamid-Gel mit 1,6 mm breiten Schlitzen geladen. Das Gel wurde hergestellt aus einem Ausgangsmaterial aus 15 % Acrylamid, 0,6 % Bisacrylamid und 7 M Harnstoff in 1 x TBE und wurde mit 0,1 % Ammoniumpersulfat und 0,025 % TEMED polymerisiert. Das Gel wurde für eine Stunde vorlaufen gelassen. Die Proben wurden bei 1500 V für 4 bis 5 h laufen gelassen. Die Banden wurden durch UV-Schattenbildung sichtbar gemacht, und diejenigen, die dem Produkt mit voller Länge entsprachen, wurden ausgeschnitten und in Mikroteströhrchen transferiert. Die Oligomere wurden durch Eintauchen in AGEB (0,5 M Ammoniumacetat, 0,01 M Magnesiumacetat und 0,1 % SDS) über Nacht aus der Gel-Scheibe eluiert. Der AGEB- Puffer wurde dann in frische Röhrchen transferiert, und das Oligomer wurde mit drei Volumina Ethanol bei 70ºC für 15 min ausgefällt. Der Niederschlag wurde durch Zentrifugieren in einer Eppendorf-Mikrofuge für 10 min konzentriert, das Pellet mit 80 % Ethanol gewaschen, das gereinigte Oligomer getrocknet, in 1 ml Wasser wieder aufgelöst und zum Schluß durch einen 0,45 um-Mikrofilter filtriert (der Begriff EPPENDORF ist ein eingetragenes Warenzeichen). Die Konzentration an gereinigtem Produkt wurde durch Messung der Absorbanz bei 260 nm gemessen.

4. Kinasierung der Oligomere

100 µmol Oligomer wurde getrocknet und in 20 µl Kinasepuffer (70 mM Tris pH 7,6, 10 mM MgCl&sub2;, 1 mM ATP, 0,2 mM Spermidin, 0,5 mM Dithiothreitol) resuspendiert. 10 u an T4-Polynukleotidkinase wurden zugegeben und die Mischung bei 37ºC für 30 min inkubiert. Die Kinase wurde dann durch 10-minütiges Erhitzen auf 70ºC inaktiviert.

5. Dideoxy-Sequenzierung

Das angewandte Protokoll war im wesentliche wie in Biggin, M. D., Gibson, T. J., Hong, G. F.; P.N.A.S., 80, 3963-3965 (1983) beschrieben. Wo dies angemessen war, wurde das Verfahren so modifiziert, daß eine Sequenzierung der Plasmid-DNA ermöglicht wurde, wie in Guo, L.-H., Wu R.; Nucleic Acids Research 11, 5521-5540 (1983) beschrieben.

6. Transformierung

Die Transformierung wurde unter Anwendung von Standardvorgehensweisen bewirkt. Der als Rezipient bei der Klonierung unter Verwendung von Plasmidvektoren verwendete Strang war HW87, das den folgenden Genotyp aufwies:
araD139(ara-leu)de17697(laclPOZY)del74 galU galK hsdR rpsL srl recA56 RZ1032 ist ein Derivat von E. coli, dem zwei Enzyme des DNA- Metabolismus fehlen: (a) dUTPase (dut), woraus eine hohe Konzentration an intrazellulärem dUTP resultiert, und (b) Uracil-N-glycosylase (ung), das verantwortlich ist für Entfernung von fehlinkorporiertem Uracil aus der DNA (Kunkel et al., Methods in Enzymol., 154, 367-382 (1987)). Sein Hauptvorteil ist, daß diese Mutation zu einer höheren Mutantenfrequenz in der ortsgelenkten Mutagenese führt. RZ1032 besitzt den folgenden Genotyp:
HfrKLI6PO/45(lysA961-62), dutl, ungl, thil, re[A], Zbd-279: Tn10, supE44
JM103 ist ein Standard-Rezipientenstamm für Manipulationen, an denen auf M13 basierende Vektoren beteiligt sind.

7. Ortsgelenkte Mutagenese

Kinasierte Mutageneseprimer (2,5 pmol) wurde an die einsträngingen Template-DNA angeklebt (annealed), die unter Verwendung von RZ1032 als Wirt hergestellt wurde, (1 µg) in finaler Reaktionsmischung von 10 µl, die 70 mm Tris und 10 mm MgCl&sub2; enthielt. Die Reaktionsmischung in einem Polypropylen- Mikroteströhrchen (EPPENDORF) wurde für 3 min in ein Becherglas plaziert, das 250 ml Wasser von 70ºC enthielt, gefolgt von 37ºC für 30 min. Die getemperte Mischung wurde dann auf Eis gegeben, und die folgenden Reagenzien wurden zugegeben: 1 µl 10 X TM (700 mM Tris, 100 mM MgCl&sub2; pH7,6), 1 µl einer Mischung von allen vier Deoxyribonukleotid-triphosphaten von jeweils 5 mM, 2 µl T4 DNA-Ligase (100 u), 0,5 µl Klenow-Fragment von DNA-Polymerase und 4,5 µl Wasser. Die Polymerasereaktionsmischung wurde dann für 4 bis 16 h bei 15ºC inkubiert. Nach Beendigung der Reaktion wurden 180 µl TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA pH 8,0) zugegeben, und die Mutagenes-Mischung bei -20ºC gelagert.
Zur Isolierung mutanter Klone wurde die Mischung wie folgt in den Rezipienten JM103 transformiert. 5 ml einer Übernachtkultur von JM103 in 2 X YT (1,6 % Bactotrypton, 1 % Hefeextrakt, 1 % NaCl) wurde 1:100 in 50 ml vorgewärmten 2 X YT verdünnt. Die Kultur wurde bei 37ºC unter Belüftung aufgezogen, bis der A&sub6;&sub0;&sub0; 0,4 erreichte. Die Zellen wurden pelletiert und in 0,5 Volumina 50 mM CaCl&sub2; resuspendiert und für 15 min auf Eis gehalten. Die Zellen wurden dann bei 4ºC repelletiert und in 2,5 ml kaltem 50 mM CaCl&sub2; resuspendiert. Für die Transfizierung wurden 0,25, 1, 2, 5, 20 und 50 µl Aliquots der Mutagenesemischung zu 200 µl kompetenter Zellen gegeben, die für 30 min auf Eis gehalten wurden. Die Zellen wurden dann für 2 min bei 42ºC wärmegeschockt. Dann wurden zu jedem Röhrchen 3,5 ml YT-Weichagar hinzugegeben, das 0,2 ml einer spätexponentiellen Kultur von JM103 enthielt, die Bestandteile wurden kurz gemischt und dann auf die Oberfläche einer vorgewärmten Platte gegossen, die 2 X YT enthielt, das mit 1,5 % Agar verfestigt wurde. Man ließ die Weichagar-Schicht absetzen und die Platten wurden dann bei 37ºC über Nacht inkubiert.
Aus dem isolierten Klon wurde dann wie folgt einzelsträngige DNA hergestellt: Einzelne Plaques wurden in 4 ml 2 X YT aufgenommen, das mit 10 µl einer frisch Übernachtkultur von JM103 in 2 X YT angeimpft wurde. Die Kultur wurde heftig für 6 h geschüttelt. Dann wurden 0,5 ml der Kultur entnommen und zu 0,5 ml 50 % Glycerol gegeben, wodurch ein Referenzmaterial erhalten wurde, das bei -20ºC gelagert wurde. Die zurückbleibende Kultur wurde zur Entfernung der Zellen zentrifugiert, und 1 ml Überstand, der die Phagenteilchen trug, wurde in ein frisches EPPENDORF-Röhrchen transferiert. 250 µl 20 % PEG6000, 250 mM NaCl wurden dann zugegeben, gemischt und die Röhrchen wurden auf Eis für 15 min inkubiert. Die Phagen wurden dann bei 10 000 Upm für 10 min pelletiert, der Überstand verworfen und die Röhrchen rezentrifugiert, wodurch die letzten Spuren PEG-Lösung eingesammelt und dann entfernt und verworfen werden konnten. Das Phagen-Pellet wurden sorfgältig in 200 µl TEN (10 mM Tris, 1 mM EDTA, 0,3 M NaOAc) resuspendiert. Die DNA wurde durch Extraktion mit einem gleichen Volumen an Trisgesättigtem Phenol isoliert. Die Phasen wurden durch kurze Zentrifugierung separiert und die wäßrige Phase in ein sauberes Röhrchen transferiert. Die DNA wurde einer Mischung aus 100 µl Phenol, 100 µl Chloroform reextrahiert, und die Phasen wurden erneut durch Zentrifugieren getrennt. Phenolspuren wurden durch zwei aufeinanderfolgende Extraktionen mit Chloroform entfernt, und die DNA wurde letztendlich durch Ausfällung mit 2,5 Volumina Ethanol bei -20ºC über Nacht isoliert. Die DNA wurde bei 10 000 Upm für 10 min pelletiert, in 70 % Ethanol gewaschen, getrocknet und schließlich in 50 µl TE resuspendiert.

8. Elektroporierung

Chinesische Hamster-Ovarien-Zellen (CHO) oder die Maus-Myeloma-Zell- Linie p3x63-Ag8.653 wurden gezüchtet und in der Mitte der logarithmischen Wachstumsphase geerntet. Die Zellen wurden gewaschen und in PBS resuspendiert, und es wurde eine Zählung der lebensfähigen Zellen durchgeführt. Die Zellen wurden dann pelletiert und mit 1 x 10&sup7; Zellen/ml resuspendiert. 40 µg linearisierte DNA wurde zu 1 ml der Zellen hinzugegeben und 15 min auf Eis stehen gelassen. An die Zellen wurde ein Puls von 800 V/25 µF unter Verwendung einer kommerziell erhältlichen Elektroporierungsvorrichtung (BIORAD GENE PULSER, eingetragenes Warenzeichen) angelegt. Die Zellen für weitere 15 min auf Eis inkubiert und dann entweder auf 10 x 96-Quellenplatten mit 200 µl konditioniertem Medium pro Quelle (DMEM, 5 % FCS, Pen/Strep, Glutamin) oder in 10 x 15 cm Platten mit 15 ml-Medium je Platte plattiert und über Nacht inkubiert. Nach 24 h wurde das Medium entfernt und durch selektive Medien ersetzt, die Xanthin (250 µg/ml), Mycophenolsäure (5 µg/ml) und 1 x Hypoxanthin-thymidin (HT) enthielten. Die Zellen wurden jeden dritten Tag gefüttert.
Nach ungefähr 14 Tagen wurden in einigen der Quellen und auf den Platten gpt-resistente Kolonien sichtbar. Die Platten wurden durch Entfernung eines Aliquots an Medium von jeder Quelle oder Platte und Untersuchung mittels eines ELISA-Tests auf Plasminogen gescreent.
Plasminogen-erzeugende Klone wurden hochgezüchtet und in das Expresionsniveau wurde angezeigt, wodurch die Auswahl des besten Produzenten möglich wurde.

9. ELISA für Human-Plasminogen

ELISA-Platten (Pro-Bind, Falcon) Werden mit 50 µl/Quelle Ziegen- Antihuman-Plasminogen in Serum (Sigma) in Verdünnung von 1:1000 in Beschichtungspuffer (4,0 g Na&sub2;CO&sub3; (10 H&sub2;O), 2,93 g NaHCO&sub3; pro Liter H&sub2;O, pH 9,6) beschichtet und über Nacht bei 4ºC inkubiert. Die Beschichtungslösung wird dann entfernt, und die Platten werden durch Inkubation mit 50 µl/Quelle PBS/0,1 % Casein für 15 min bei Raumtemperatur blockiert. Die Platten werden dann dreimal mit PBS/0,05 % Tween 20 gewaschen. Proben von Plasminogen oder in PBS/Tween verdünnten Standards werden der Platte zugegeben und bei Raumtemperatur für 2 h inkubiert. Die Platten werden dann dreifach mit PBS/Tween gewaschen und dann werden 50 µl/Quelle einer 1:1000- Verdünnung in PBS/Tween eines monoklonalen Antihuman-Plasminogen-Antikörpers (American Diagnostica, New York, USA) hinzugegeben und für eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten werden erneut dreimal mit PBS/Tween gewaschen, un dann werden 50 µl/Quelle Meerrettichperoxydasekonjugiertes Ziegen-Anti-Maus-IgG (Sigma) zugegeben und für 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten werden fünfmal mit PBS/Tween gewaschen und dann mit 100 µl/Quelle Peroxidase-Substrat (0,1 M Natriumcarbonat/Zitronensäure-Puffer pH 6,0, der 100 mg/1 3,3'5,5'-Tetramethylbenzidin und 13 mm H&sub2;O&sub2; enthält) inkubiert. Die Reaktion wird nach ungefähr 5 min durch Zugabe von 25 µl/Quelle 2,5 M Schwefelsäure unterbrochen und dann wird die Absorbanz bei 450 nm auf einem Plattenleser gemessen.

10. Reinigung von Plasminogen-varianten

Plasminogen-Varianten werden in einem Schritt durch Chromatographie auf Lysin SEPHAROSE 4B (Pharmacia) gereinigt. Eine Kolonne wird mit mindestens 10 Kolonnenvolumina 0,05 M Natriumphosphatpuffer von pH 7,5 äquilibriert. Die Kolonne wird mit konditioniertem Medium in einem Verhältnis von 1 ml Harz pro 0,6 mg Plasminogen-Variante, bestimmt durch ELISA unter Verwendung von Glu-Plasminogen als Standard, beladen. Typischerweise werden 400 ml konditioniertes Medium, das Plasminogen enthält, bei einer 10 ml- Kolonne (H:D=4) mit einer linearen Flußgeschwindigkeit von 56 ml/cm/h bei 4ºC angewandt. Nach Beendigung der Beladung wird die Kolonne mit mindestens 5 Kolonnenvolumina 0,05 M Phosphatpuffer von pH 7,5 gewaschen, der 0,5 M NaCl enthält, bis kein nicht-spezifisch gebundenes Protein mehr ausgewaschen wird. Die Desorption des gebundenen Plasminogens wird bewirkt durch die Zugabe von 0,2 M &epsi;-Aminocapronsäure in deionisiertem Wasser von pH 7,0. Die Elution erfordert 2 Kolonnenvolumina und wird mit einer linearen Flußgeschwindigkeit von 17 ml/cm/h durchgeführt. Nach der Analyse durch SDS-PAGE zur Überprüfung der Reinheit wird die s-Aminocapronsäure entfernt und durch Chromatographie auf vorgepackten PD10-Einwegkolonnen, die SEPHADEX G-25M (Pharmacia) enthalten, durch einen geeigneten Puffer ersetzt, beispielsweise Tris, PBS, HEPES oder Acetat (das Wort SEPHADEX ist ein eingetragenes Warenzeichen). Typischerweise werden gemäß den Anweisungen des Herstellers 2,5 ml jeder Plasminogen-Mutante bei einer Konzentration von 0,3 mg/ml verarbeitet. Die plasminogenhaltigen Fraktionen, bestimmt durch A&sub2;&sub8;&sub0;, werden dann vereinigt.

11. Spaltung

Die Plasminogen-Analoga werden hinsichtlich ihrer Fähigkeit zur Spaltung durch proteolytische Aktivatoren unter Verwendung von SDS PAGE unter reduzierenden Bedingungen getestet. Typische Inkubationsvolumina von 0,125 ml in 100 mM Tris HCl von pH 7,4 und 1 mM Ca²+ enthalten Plasminogen- Analogonkonzentrationen wie in den Beispielen gezeigt, und die Aktivatoren Faktor Xa oder Thrombin in Konzentrationen wie in den Beispielen angegeben. Die Inkubationen werden bei 37ºC durchgeführt. Kontrollinkubationen werden unter den gleichen Bedingungen in Abwesenheit von Aktivatoren durchgeführt. Die Aktivierungsreaktionen wurden durch Ausfällung des Proteins mittels Zugabe von Trifluoressigsäure auf eine Endkonzentration von 20 % und Stehenlassen bei 4ºC für > 4 h unterbrochen. Die Ausfällungen wurden dann pelletiert, mit Aceton gewaschen und in SDS PAGE-Probenpuffer (0,1 M Tris pH 6,8, 10 % Glycerol, 1 % SDS, 0,5 % Mercaptoethanol und 0,05 % Bromphenolblau) resuspendiert. Die Proben wurden entweder auf 8-25 % Gradientgels oder 12 % Gels analysiert. Die resultierenden Gele wurden unter Verwendung eines SHIMADZU Gel-Scanners analysiert, der das Gel scannt und die Proteinkonzentration in den Banden durch Bestimmung der Fläche unter den Peaks berechnet (das Wort SHIMADZU ist ein eingetragenes Warenzeichen). Die Geschwindigkeit der Spaltung von Plasminogen wurde dann durch Messung des Verschwindens der Plasminogenbande bei ungefähr 92 kDa und des Auftretens der Plasmin-Schwerkettenbande bei ungefähr 66 kDa bestimmt.

12. Aktivierung

12.1. Fibrin-Gerinsel-Lysistest

In dem Fibrin-Lysistest wird die Plasmin-Aktivität durch Auftreten einer Klärungszone bestimmt, die sich in einem Fibrin-Agarosegel (aufgrund der Fibrin-Auflösung) entwickelt. Das Gel wird in einem 1 % Niedergeliertemperatur-Agarosegel hergestellt, gepuffert in 0,1 M Tris HCL von pH 7,4, 0,15 M NaCl, 2 mM CaCl&sub2;, durch Zugabe von plasminogenfreiem Fibrinogen, das in 0,9 % (G/V) NaCl in einer Endkonzentration von 1 mg/ml aufgelöst ist. 6 Einheiten Thrombin werden zur Umwandlung des Fibrinogens zu Fibrin zugegeben, und die Lösung wird dann auf ein Blatt GEL-BOND gegossen und zur Auswertung stehen gelassen (der Ausdruck GEL-BOND ist ein eingetragenes Warenzeichen). Vor der Verwendung werden Quellen in das Gel gedrückt, und die Agaroseflecken werden entfernt. Proben von 5 bis 10 µl werden in die Quellen eingefüllt und das Gel wird in einer Feuchtigkeitskammer bei 37ºC über Nacht (17 bis 20 h) inkubiert, oder für einen ausreichenden Zeitraum bis zum Auftreten einer Lysis-Zone. Das Gel wird dann in 7,5 % Essigsäure für 1 h eingetaucht, für 1 bis 10 min in Schnellgrün (2 % Lösung) eingefärbt und dann werden Flecken mit 40 % Methanol, 10 % Essigsäure für mindestens 2 h entfernt. Das Gel wird dann trockengelegt und bei 37ºC über Nacht zur Trocknung aufbewahrt. Der Durchmesser der Lysis-Zonen kann gemessen und mit denjenigen verglichen werden, die durch die Standards hervorgerufen werden, z.B. Wild-Typ-Plasminogen, das mit tPA oder uPA aktiviert wurde.

12.2. Direkter Chromogen-Test und zeitlicher Verlauf der Aktivierung

Plasminogen-Analogon (12,5 µg) wurde mit Thrombin (2,8 µg) bei 37ºC in 125 µl eines Puffers, der 100 mN Tris HCl von pH 7,4 und 1 mm CaCl&sub2; enthielt, inkubiert. In Intervallen wurden Aliquots entfernt und auf den Plasmin-Gehalt in einem wie unten beschriebenen Chromogentest untersucht. Wenn Thrombin als Aktivator verwendet wurde, wurde der Thrombin-Inhibitor Hirudin in leichtem molaren Überschuß zur Beendigung der Aktivierungsreaktion hinzugegeben, und die Proben wurden bei -70ºC aufbewahrt. Wenn Faktor Xa als Aktivator verwendet wurde, wurden die Proben zur Beendigung der Aktivierungsreaktion sofort schockgefroren. Plasmin wurde mittels Spaltung des chromogenen Tripeptid-Substrats S2251 (Kabi) gemessen. Aliquots der Probe (25 µl) wurden mit 75 µl Puffer (50 mM Tris HCl, 0,1 M EDTA, 0,0005 % Triton X100, pH 8,0), der 0,6 mM S2251 enthielt, in 96- Quellen-Platten (Costar) gemischt. Die Platten wurden für 2 h bei 37ºC inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 25 µl 0,5 M Essigsäure beendet und die Absorbanz bei 405 nm unter Verwendung eines automatischen Plattenlesers (Dynatech) ausgelesen. Die Quantifizierung wurde durch Vergleich mit einer Standard-Plasminzubereitung durchgeführt.

12.3 Gebundener Chromogen-Test

Eine Modifikation des Chromogen-Testes wurde entwickelt, damit der zeitliche Verlauf der Aktivierung von mutanten Plasminogenen direkter gemessen werden konnte. In diesem Test werden mutantes Plasminogen und Aktivator zusammen in Gegenwart von S2251 inkubiert, und das durch die Aktivierung produzierte Plasmin spaltet direkt das Chromogen-Substrat, was zu einer Zunahme der Absorbanz bei 405 nm führt. Der Test wurde in einem Gesamtvolumen von 880 µl in einem Puffer durchgeführt, der 50 mM Tris HCl, 0,1 mM EDTA, 0,005 % Triton X100 und 0,1 % HSA enthielt. Das chromogene Substrat S2251 wurde in einer Endkonzentration von 0,35 mg/ml zugegeben, und die verwendete mutante Protein-Konzentration betrug 3 µg/ml. Im Falle der Thrombin-Aktivierung wurde Thrombin in einer Endkonzentration von 1 oder 0,2 µg/ml zugegeben. Der Faktor Xa wurde in einer Endkonzentration von 1,5 oder 0,3 µg/ml zugegeben. Aliquots von 100 µl der Reaktion wurden in Intervallen entfernt und zur Beendigung der Reaktion zu 25 µl 4 % Essigsäure in Mikrotiterplatten gegeben. Nach Beendigung des zeitlichen Verlaufes wurden die Platten auf einem Mikroplatten-Ausleser bei einer Wellenlänge von 405 nm ausgelesen. In diesem Test wurde kein Versuch unternommen, die Plasminogen-Erzeugung zu quantifizieren.

Claims

1. Eiweißartige Verbindung, die durch ein an der Blutgerinnung beteiligtes Enzym, ausgewählt aus Kallikrein, Faktor XIIa, XIa, IXa, VIIa, Xa, Thrombin oder aktiviertem Protein C, aktivierbar ist, fibrinolytische Aktivität zu zeigen oder Gerinselbildung zur inhibieren, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindung ein Plasminogenanalogon ist, das eine Spaltstelle aufweist, die durch eines der oben genannten Enzyme spaltbar ist, wodurch eine Verbindung mit Plasmin-Aktivität gebildet wird.

2. Verbindung gemäß Anspruch 1, worin das an der Blutgerinnung beteiligte Enzym Faktor Xa ist, und worin die Verbindung die Spaltortesequenz P4-P3-Gly-Arg umfaßt, worin P4 ein hydrophobe Gruppe repräsentiert und P3 repräsentiert eine saure Gruppe.

3. Verbindung gemäß Anspruch 2, worin die hydrophobe Gruppe Isoleucin ist.

4. Verbindung gemäß Anspruch 1, worin das an der Blutgerinnung beteiligte Enzym Thrombin ist.

5. Verbindung gemäß Anspruch 4, das die Spaltortesequenz P4-P3- Pro-Arg-P1'-P2' umfaßt, worin P4 und P3 jeweils unabhängig voneinander eine hydrophobe Gruppe repräsentieren, und P1' und P2' repräsentieren unabhängig voneinander jeweils eine nicht-saure Gruppe.

6. Verbindung gemäß Anspruch 4, die die Spaltortsequenz P2-Arg-P1' umfaßt, worin eine der Gruppen P2 und P1' Glycin repräsentiert und die andere ist eine beliebige Aminosäure-Gruppe.

7. Verbindung gemäß Anspruch 4, die die Spaltortsequenz Gly-Pro- Arg umfaßt.

8. Verbindung gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 7, die eine oder mehrere Aminosäuresubstitutionen, -additionen oder -deletionen zwischen den Gruppen Pro(555) und Cys(566) einschließlich aufweisen.

9. Verbindung gemäß Anspruch 1 oder 8, die eine oder mehrere Modifikationen (im Vergleich zu Wild-Typ Glu-Plasminogen) aufweist, welche eine oder mehrere Additionen, Deletionen oder Substituierungen sein können.

10. Verfahren zur Herstellung einer eiweißartigen Verbindung gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 9, das Verfahren umfaßt die aufeinanderfolgende Kupplung von Aminosäure-Resten und/oder die Ligation von Oligo- und/oder Polypeptiden.

11. Synthetische oder rekombinante Nukleinsäure, die für eine eiweißartige Verbindung gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 9 kodiert.

12. Nukleinsäure gemäß Anspruch 11, die einen Vektor darstellt.

13. Verfahren zur Herstellung einer Nukleinsäure gemäß Anspruch 11, das Verfahren umfaßt die aufeinanderfolgende Kupplung von Nukleotiden und/oder Ligation von Oligo- und/oder Poly-Nukleotiden.

14. Vektor, umfassend eine erste Nukleinsäure-Sequenz, die für eine eiweißartige Verbindung gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 9 kodiert, die operativ mit einer zweiten Nukleinsäure-Sequenz verbunden ist, die eine starke Promotor- und Verstärkersequenz enthält, die von Humancytomegalovirus abgeleitet :st, eine dritte Nukleinsäure-Sequenz, die für eine aus SV40 abgeleitete Polyadenylierungs-Sequenz kodiert, und eine vierte Nukleinsäure-Sequenz, die für den von einen SV40 Promotor exprimierten gpt auswählbaren Marker kodiert und ein zusätzliches SV40 Polyandenylierungssignal am 3'-Ende der auswählbaren Markersequenz aufweist.

15. Zelle oder Zell-Linie, die mit einem Vektor gemäß Anspruch 12 oder 14 transformiert oder transfiziert ist.

16. Zell-Linie gemäß Anspruch 15, die Säugetierzellen umfaßt, die in kontinuierlicher Kultur wachsen.

17. Zelle oder Zell-Linie gemäß Anspruch 15 oder 16, die eine Chinesische Hamster-Ovarienzelle ist.

18. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine oder mehrere Verbindungen gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 9 und einen pharmazeutisch oder tiermedizinisch annehmbaren Träger.

19. Eiweißartige Verbindung gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 9, zur Verwendung in der Human- oder Veterinärmedizin.

20. Verwendung einer Verbindung gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 9 bei der Herstellung eines thrombolytischen oder antithrombotischen Mittels.