JPH04346785A - キメラプラスミノーゲンアクチベーター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、プラスミノーゲンアク
チベーター、その製造法及び用途に関する。より詳しく
は、分子にすぐれたインビボ血栓崩壊能力を付与するポ
リペプチド構造を有するウロキナーゼタイプのプラスミ
ノーゲンアクチベーターのキメラである新規プラスミノ
ーゲンアクチベーター、並びにこれらの新規なプラスミ
ノーゲンアクチベーターの製造法、それらアクチベータ
ーを含む医薬組成物、及びかかるプラスミノーゲンアク
チベーターを血栓塞栓疾患の患者に用いる方法に関する
。

【０００２】

【従来の技術】プラスミノーゲンアクチベーターと呼ば
れる酵素が、ヒト又は動物への静脈注入後、インビボ血
栓崩壊作用を発揮することは知られている。この作用は
、血液中に存在する、血管内のフイブリン含有血餅を溶
解させる一連の反応を開始するプラスミノーゲンの活性
化に基づく。作用のメカニズムは複雑で、使用されるプ
ラスミノーゲンアクチベーターの型によって異なる。 ヒトプラスミノーゲンアクチベーターは２つの型、即ち
組織型のプラスミノーゲンアクチベーター（ｔ−ＰＡ）
とウロキナーゼタイプのプラスミノーゲンアクチベータ
ー（ｕ−ＰＡ）に分けることができる。ウロキナーゼタ
イプのプラスミノーゲンアクチベーターは、二鎖形（ｔ
ｃｕ−ＰＡ）と一鎖形（ｓｃｕ−ＰＡ）に細別できる（
コレン、ジェイ．セル．バイオケム．（Ｊ．Ｃｅｌｌ．
Ｂｉｏｃｈｅｍ．）３３、７７−８６、１９８７）。

【０００３】以下、理解を容易にするため、添付の図面
を引用する。図１はヒトｔ−ＰＡの一次構造を示す。図
２はヒトｓｃｕ−ＰＡの一次構造を示す。図３は本明細
書の実施例で用いたキメラプラスミノーゲンアクチベー
ターの図解的表現である。

【０００４】図１によって、ヒトｔ−ＰＡは、５２７の
アミノ酸を含む一つのポリペプチド鎖からなるセリンプ
ロテアーゼである。これらのアミノ酸は、ペニカ等、ネ
イチャー（Ｎａｔｕｒｅ）３０１、２１４−２２１、１
９８３のシステムにより数えられた。Ａｒｇ２７５−Ｉ
ｌｅ２７６ペプチド結合（矢印で示した）の限定された
血漿の（ｐｌａｓｍｉｃ）加水分解により、分子は一つ
のジスルフイド結合によって結合した二鎖アクチベータ
ーに変換する。ｔ−ＰＡ触媒部位は、図１で星印で示し
た３２２、３７１及び４７８の位置に、それぞれＨｉｓ
、Ａｓｐ及びＳｅｒ残基を含む。ｔ−ＰＡ分子は４つの
特異ドメイン、即ち、１）フィブロネクチンのフイブリ
ン親和性に関与するフインガードメインと同種である４
３残基長の（４３−ｒｅｓｉｄｕｅ−ｌｏｎｇ）アミノ
末端部分、２）ヒト表皮性生長因子と同種である残基４
４−９１、３）プラスミノーゲンの５つのクリンゲル（
ｋｒｉｎｇｌｅ）と共に高度に同種である各８２アミノ
酸（残基９２−１７３及び１８０−２６１）の２つの部
分、４）活性部位残基、Ｈｉｓ、Ａｓｐ及びＳｅｒを有
するセリンプロテアーゼ部を有する。本明細書において
は、これら４つのドメインは、（１）フインガードメイ
ン（Ｆ−ドメイン）、（２）表皮性生長因子ドメイン（
Ｅ−ドメイン）、（３）クリングルドメインＫ１及びク
リングルドメインＫ２、並びに（４）触媒ドメインとし
て示される。

【０００５】図２によって、ヒトｓｃｕ−ＰＡは２４の
システイン残基を有する４１１のアミノ酸を含む単一ポ
リペプチド鎖からなるセリンプロテアーゼである。この
アミノ酸残基は、ホルムス等、バイオテクノロジィ（Ｂ
ｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、３、９２３−９２９，１
９８５のシステムにより数えた。プラスミンの手段によ
るＬｙｓ１５８−Ｉｌｅ１５９ペプチド結合（矢印で示
した）の加水分解により、分子はウロキナーゼ、一つの
ジスルフイド結合により結合した二鎖分子に変換する。 ｓｃｕ−ＰＡ分子は、３つのドメイン、即ち、表皮性生
長因子と同種のシステインリッチなアミノ末端部分（残
基５−４９）、アミノ酸残基５０−１３６を含むクリン
グル部分、及び分子のカルボキシル末端を構成し、位置
２０４、２５５及び３５６にそれぞれ活性部位残基、Ｈ
ｉｓ、Ａｓｐ及びＳｅｒを有するセリンプロテアーゼ部
を有する。本明細書では、三つのドメインは、それぞれ
表皮性生長因子ドメイン（Ｅ−ドメイン）、クリングル
ドメイン、及び触媒ドメイン又はプロテアーゼドメイン
として示す。活性部位は図２において星印で示した。

【０００６】組織型プラスミノーゲンアクチベーター（
ｔ−ＰＡ）はプラスミノーゲンの活性化を起こすことが
できるが、それが存在しないことよりもフイブリンが存
在することがより一層有効である。これは、活性化が主
として溶解される血餅の近くに起こり、一方、プラスミ
ノーゲンの活性化は循環血液中ではほとんど起こらない
ことを意味する。ｔ−ＰＡのフイブリン特異性は、主と
してそのフイブリンへの親和性と、フイブリン表面での
プラスミノーゲンの非常に強い活性化による。ｔ−ＰＡ
内のそのフイブリン親和性に関係する構造は、そのＮＨ
２−末端部分、多分、指様ドメイン及び第二クリングル
（ｋｒｉｎｇｌｅ）にある。ｔ−ＰＡはｔｃｕ−ＰＡ又
はｓｃｕ−ＰＡに対する抗血清と反応しない。

【０００７】単鎖ウロキナーゼタイププラスミノーゲン
アクチベーター（ｓｃｕ−ＰＡ）は、プラスミノーゲン
を効果的に活性化するが、フイブリン含有血餅の存在に
おいてのみである。同様にｔ−ＰＡについても、活性化
のメカニズムは異なるにも拘らず循環血液中の線維素溶
解系の活性化はほとんど起こらない。ｕ−ＰＡのみがＬ
ｙｓ１５８−Ｉｌｅ１５９ペプチド結合が無傷であるそ
のｓｃｕ−ＰＡ形でフイブリン特異性を示す。フイブリ
ン特異性は、ＮＨ２−末端１４３アミノ酸の存在に依存
しない。逆に、ｔｃｕ−ＰＡ（ウロキナーゼ）はフイブ
リンの存在下及び不存在下ともに、血中プラスミノーゲ
ンの活性化を起こす。これは、血餅を溶解できることと
、しかし又、フイブリノーゲン崩壊及び出血傾向に導き
うる循環血液中の線維素溶解系の活性化を起こすことを
意味する（コレン、ジェイ．セル．パイオケム．（Ｊ．
Ｃｅｌｌ．Ｂｃｏｃｈｅｍ．）３３、７７−８６、１９
８７）。

【０００８】これら３つのヒトプラスミノーゲンアクチ
ベーター（ｔ−ＰＡ，ｓｃｕ−ＰＡ及びｔｃｕ−ＰＡ）
のうち、ｔｃｕ−ＰＡは、既に長い間、その間、記述さ
れた副作用がハンディキャップであったが医療業務に用
いられて来た。ｔ−ＰＡは１９８７年から改良血栓崩壊
剤として認められて来た。これらの活性化合物の最適使
用に関する多くの問題はまだ未回答であるが、ヒトでの
ｔ−ＰＡ及びｓｃｕ−ＰＡのフイブリン特異性は、動物
モデルから予想できるほどは報告されていないことが認
められた。　　ｔ−ＰＡ及びｕ−ＰＡとも、速やかな肝
臓クリアランスの結果として非常に短かい血漿半減期を
有し、その結果、それらの治療用使用は比較的大量の物
質の連続的静脈内注入を必要とし、それは時間を消費し
高価である。従って、より高い血栓崩壊能力、より高い
特異的血栓崩壊活性及び／又はより良好なフイブリン選
択性を有する血栓崩壊剤に対する探求が続行されている
（コレン等、アン．レヴ．メド（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｅ
ｄ．）３９、４０５−４２３、１９８８）。

【０００９】改良血栓崩壊剤の開発への一つの接近は、
化学架橋又は組換え型ＤＮＡ法による、ｔ−ＰＡ及びｓ
ｃｕ−ＰＡの共方のフイブリン特異性に関与する構造を
含むキメラ蛋白の生成にあるようである。この接近は、
ハーバー等により（サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２４
３，５１−５６、１９８９）、クロウズにより（フイブ
リノリシス（Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ）２、１３３−
１４２、１９８８）及びリュネン及びコリンにより（ブ
ルト（Ｂｕｌｔ）５７、１４７−１６２、１９８８）考
察されるように幾つかのグループにより既になされた。 キメラプラスミノーゲンアクチベーターは、ｔ−ＰＡ又
はｕ−ＰＡの酵素活性をかくまう（ｈａｒｂｏｕｒｉｎ
ｇ）構造を、他の蛋白から誘導されたアミノ酸配列と組
合せて含む分子である。後者の構造は、分子のフイブリ
ン選択性を増強するために選択され、例えばｔ−ＰＡの
指様ドメイン、或いはｔ−ＰＡ、ｕ−ＰＡ、プロトロン
ビン又はプラスミンのクリングルドメイン或いはフイブ
リン−特異的抗体を含む。

【００１０】ｕ−ＰＡ基礎のキメラはプラスミンのＡ−
鎖とウロキナーゼのＢ鎖の間の（ロビンス及びタナカ、
バイオケミストリィ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）２５
、３６０３−３６１１、１９８６、ヨーロッパ特許出願
ＥＰ−Ａ−０２５００７１、ＥＰ−Ａ−０２９０１１８
、ＥＰ−Ａ−０２９７８８２）又はｔ−ＰＡのＡ−鎖と
ウロキナーゼのＢ−鎖の間の（ヨーロッパ特許出願ＥＰ
−Ａ−０１５５３８７）ジスルフイド架橋により生成さ
れて来た。他のキメラ分子は、ｔ−ＰＡのＮＨ２−末端
配列の部分又は組換え型ＤＮＡ技術によりｕＰＡのＣＯ
ＯＨ−末端プロテアーゼ部位に融合したプラスミンを組
合せる（ネレス等、ジャーナル・オブ・バイオロジカル
・ケミストリィ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）２６２、
１０８５５−１８８６２、１９８７、ド・ヴリース等、
バイオケミストリィ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）２７
、２５６５−２５７２、１９８８、ピーラード等、ディ
ーエヌエイ（ＤＮＡ）８、３２１−３２８、１９８９、
リー等、ジャーナル・オブ・バイオケミカル・ケミスト
リィ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）２６３、２９１７−
２９２４、１９８８、ライプット等、スロンボシス・ア
ンド・ヘモスタシス（Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．
）５８、４３８、１９８７、マオ等、フイブリノリシス
（Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ）２、補遺１、５０、１９
８８、ハイム等スロンボシス・アンド・ヘモスタシス（
Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．）６２、３３７、１９
８９、オーストラリア特許出願ＡＵ−Ａ−３７０７１４
８、ヨーロッパ特許出願ＥＰ−Ａ−０２３１７９４、Ｅ
Ｐ−Ａ−０２７３７７４、ＥＰ−Ａ−０２３１８８３、
ＰＣＴ特許出願ＷＯ８８／０８４５１及びＷＯ８９／１
０４０１）。

【００１１】一方、ｔ−ＰＡ基礎のキメラは、先を切り
取ったｔ−ＰＡ分子にｕ−ＰＡのＮＨ２−末端部分を連
結することによる（ヨーロッパ特許ＥＰ−Ａ−０２１３
７９４、リー等、スロンボシス・アンド・ヘモスタシス
（Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ）５８、３１３、１９
８７）、ｔ−ＰＡ分子内の２つのクリングルの一側又は
間にウロキナーゼ又はプロトロンビンを挿入することに
よる（リー等、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケ
ミストリィ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）２６３、２９
１７−２９２４、１９８８）、又は先を切り取ったｔ−
ＰＡ分子にプラスミノーゲンクリングルを融合すること
による（ランガー−セイファー等、スロンボシス・アン
ド・ヘモスタシス（Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．）
６２、３３７、１９８９）、ｔ−ＰＡのＢ−鎖へのプラ
スミンのＡ−鎖のジスルフイド架橋により構成される。

【００１２】ほとんどのこれらの組換型酵素は、いくら
か、しかし全く全部ではなく、ｔ−ＰＡの部分フイブリ
ン親和性を維持し、又、いくらか、しかし全部ではない
、有意に遅延したクリアランスを有する酵素活性を示し
た。しかしながらシヤフリングする（ｓｈａｆｆｌｉｎ
ｇ）ドメインは天然プラスミノーゲンアクチベーターに
より獲得したものを越えてフイブリン選択性を増強しな
いことが明らかとなった。さらに、長年の熱心な研究に
もかかわらず、インビボで明らかに改良された血栓崩壊
能を有するキメラ分子は発見されなかった。

【００１３】我々の研究所で、ｔ−ＰＡ分子のドメイン
と接合又は融合することによりフイブリン親和性をｓｃ
ｕ−ＰＡの酵素的に活性な部位に与える試みは、ｓｃｕ
−ＰＡのそれに比べてキメラの血栓崩壊能を減少するか
、又はよくてもわずかに維持するという証拠が得られた
。即ち、ｔ−ＰＡ及びｕ−ＰＡのキメラ分子は、（アミ
ノ酸１３６ないし４１１、１３９ないし４１１又は１９
５ないし４１１をそれぞれプログラムしている）ｓｃｕ
−ＰＡのｃＤＮＡ断片に融合する（アミノ酸１ないし６
７、１ないし２１２又は１ないし３１３をそれぞれプロ
グラムしている）ｔ−ＰＡのｃＤＮＡ細片の一時的表現
により生成した。これらの組換型生成物は、続いてプラ
スミンにより切断し、ｕ−ＰＡへのｔ−ＰＡ構造の融合
が酵素の触媒活性をそこなわないことを示すプラスミノ
ーゲンをｕ−ＰＡと非常によく似た速度で活性化した（
ピーラード等、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケ
ミストリィ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）２６２、１１
７７１−１１７７８、１９８７）。しかしながら、これ
らのキメラ分子（ｔ−ＰＡの１ないし６７及び、ｓｃｕ
−ＰＡの１３６ないし４１１アミノ酸）の１つについて
さらに研究の結果、ｓｃｕ−ＰＡに比べてｔ−ＰＡへの
フイブリン親和性も改良されたインビボフイブリン選択
性をも獲得したことが明らかとなった（ゲイセン等、ジ
ャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリィ（Ｊ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）２６２、１１７７９−１１７８
４、１９８７）。これらキメラのあるものについて最近
さらに付け加えられた研究により、ｓｃｕ−ＰＡへのｔ
−ＰＡのフインガー及び／又はクリングルドメインの融
合が分子にフイブリン親和性を付与しないことを示した
（ピーラード等、ディ−エヌエイ（ＤＮＡ）８、３２１
−３２８、１９８９）。

【００１４】さらに我々の研究所では、幾つかのキメラ
プラスミノーゲンアクチベーターが、哺乳動物細胞系で
のｃＤＮＡの安定な表現により生成した。ｔ−ＰＡのＮ
Ｈ２−末端部分（それぞれアミノ酸１ないし２６３及び
１ないし２７４）及びｓｃｕ−ＰＡの触媒ドメイン（そ
れぞれアミノ酸１４４ないし４１１及び１３８ないし４
１１）よりなる２つのキメラプラスミノーゲンアクチベ
ーター（ｔ−ＰＡ／ｕ−ＰＡ−ｓ及びｔ−ＰＡ／ｕ−Ｐ
Ａ−ｅ）は、（それらの単鎖又はそれらの二鎖形のいず
れかで）ｕ−ＰＡインビボ特異活性、触媒効率及び線維
素溶解能を維持したが、部分的にフイブリン親和性とｔ
−ＰＡのフイブリン刺激のみを獲得した（ネルス等、ジ
ャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリィ（Ｊ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）２６２、１０８５５−１０８６
２、１９８７、リュネン等、ジャーナル・オブ・バイオ
ロジカル・ケミストリィ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）
２６３、１９０８３−１９０９１、１９８８）。

【００１５】ｔ−ＰＡ／ｕ−ＰＡ−ｅキメラのドメイン
削除／置換変異体とみなすことができる他の３つのキメ
ラプラスミノーゲンアクチベーターは我々により生成さ
れた。これらの変異体のうち、フインガー様（Ｆ）及び
表皮性発育因子様（Ｅ）ドメインは、削除され、及び／
又はクリングル１（Ｋ１）はクリングル２（Ｋ２）の二
次複写で置換される。ｔ−ＰＡ／ｕ−ＰＡ−ｅ内のＥ及
びＥドメインの削除は明らかにそのフイブリン親和性を
減ずることが明らかとなり、一方、同一分子内のＫ２の
二次複写によるＫ１の置換はフイブリンに対する親和性
を有意に増強した。しかしながら、修飾は、インビトロ
での試験では、血餅溶解系で、特異的活性、触媒効率又
は線維素溶解能を何ら有意に変えなかった。

【００１６】ｔ−ＰＡ／ｕ−ＰＡ−ｓ、ｔ−ＰＡ／ｕ−
ＰＡ−ｅ及び３つの最後に説明した変異体の構造は、図
３で棒図表により図式的に示した。削除及び再配列の起
こる位置はアンダーラインをしたアミノ酸により示す。

【００１７】５つの最後に説明したキメラのインビボ試
験での配列について、非常に驚いたことに、我々は、こ
れらキメラの一つ、即ち、Ｆ及びＥドメインが削除され
たｔ−ＰＡ／ｕ−ＰＡ−ｅの変異体（ｔ−ＰＡ−△ＦＥ
／ｕ−ＰＡ−ｅとして示す）が、ｔ−ＰＡ又はｓｃｕ−
ＰＡに比べ明らかに増加したインビボ線維素溶解能を有
することを発見した。この効果は、ハムスター肺塞栓症
モデルで発見され、ウサギ頸静脈血栓症モデル及びヒヒ
大腿静脈血栓症モデルで確認された。さらに、我々は、
インビボでの増強された血栓崩壊能力が、インビボでの
特異的血栓崩壊活性の相対的維持を組合せて、身体から
の減少クリアランスにより主として測定されることを見
いだした。明らかに減少したクリアランスの現象は、ｔ
−ＰＡ／ｕ−ＰＡ−ｅの２つの他の変異体（ｔ−ＰＡ−
△Ｋ１▽Ｋ２／ｕ−ＰＡ−ｅ及びｔ−ＰＡ−△ＦＥＫ１
▽Ｋ２／ｕ−ＰＡ−ｅとして示す）によっても示された
が、これらは特異的血栓崩壊活性も明らかに減少した。 即ち、血栓崩壊能において、ｓｃｕ−ＰＡのそれと同様
であるか、よくてかろうじて少し高いという結果になっ
た。本発明はこれらの発見に基づくものである。

【００１８】本発明の第一の目的は、ｔ−ＰＡ又はｓｃ
ｕ−ＰＡに比べて増強された血栓崩壊能力を有する新規
なキメラプラスミノーゲンアクチベーターを提供するこ
とである。関連する目的はかかるキメラプラスミノーゲ
ンアクチベーターの製造法を提供することである。

【００１９】その次の目的は、かかるキメラプラスミノ
ーゲンアクチベーターを基礎とし、血栓塞栓疾患の処置
に有用である医薬組成物及び／又は治療方法を提供する
ことである。

【００２０】本発明に包含される新規なキメラプラスミ
ノーゲンアクチベーターは、分子のクリアランスを実質
的に減少し、一方インビボでその特異的血栓崩壊活性を
相対的に維持する能力を有するポリペプチド構造と結合
した単鎖ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベータ
ーのカルボキシ末端部位を含む試験した及び他の全ての
キメラとして上記ｔ−ＰＡ−△ＦＥ／ｕ−ＰＡ−ｅキメ
ラを含む。より一般的には、本発明は、分子に改良され
たインビボ血栓崩壊能力を付与する能力を有するポリペ
プチド構造と連結した、ウロキナーゼ型プラスミノーゲ
ンアクチベーターの酵素活性を有するポリペプチド構造
を含む全てのキメラプラスミノーゲンアクチベーターを
含む。

【００２１】新規なキメラプラスミノーゲンアクチベー
ターは、化学的方法により又は組換え型ＤＮＡ方法によ
り生成することができる。化学的生成法は、架橋、削除
、付加操作を含む。組換え型ＤＮＡ方法は、所望のキメ
ラをプログラムするＤＮＡクローンの構成、プラスミド
の構成、適当な宿主細胞中でのプラスミドの発現、並び
にかかる細胞により生成したプラスミノーゲンアクチベ
ーターの分離及び精製を含む。ｃＤＮＡ断片及び分子の
構成に適した技術は、この分野の当業者にとって入手可
能である。どのような細胞タイプもプラスミドの発現用
宿主細胞として使用しうるが、チャイニーズハムスター
卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）がこの目的にとって好ましい。 生成したプラスミノーゲンアクチベーターの分離及び精
製は、既知の方法、例えば亜鉛キレートセファロースの
クロマトグラフィ、不溶化マウスモノクローナル抗体の
免疫吸着等により行ないうる。

【００２２】本発明のキメラプラスミノーゲンアクチベ
ーターは、適当な賦形剤と組合せて血栓塞栓疾患の処置
に有効な医薬組成物を提供しうる。賦形剤は、この目的
に通した全ての慣用で製薬上許容しうる媒体でありうる
。さらに他のプラスミノーゲンアクチベーターも、本発
明のキメラプラスミノーゲンアクチベーターに付随して
使用し、これにより可能な相乗効果を奏しうる。得られ
る組成物は、好ましくは、静脈内注入用液体の形であり
、というのはこの形が有効な結果を与える最良の機会を
有するからである。そして投与は、連続的注入、又はボ
ーラス（Ｂｏｌｕｓ）注入のいずれでも行ないうる。本
発明を以下の実施例で示すが、これは限定的意味に読む
べきではない。

【００２３】実施例１ ｔ−ＰＡ／ｕ−ＰＡ−ｓ及びｔ−ＰＡ／ｕ−ＰＡ−ｅの
生成２つのキメラプラスミノーゲンアクチベーター、ｔ
−ＰＡ／ｕ−ＰＡ−ｓ及びｔ−ＰＡ／ｕ−ＰＡ−ｅを、
ネレス等、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミス
トリィ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）２６２、１０８５
５−１０８６２、１９８７、及びリュネン等、ジャーナ
ル・オブ・バイオロジカル・ケミストリィ（Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．）２６３、１９０８３−１９０９１、１
９８８により記載された方法で生成し、精製した。生成
工程の種々の段階を便宜上、本明細書中に繰り返す。全
ＲＮＡを、既知のイソチオシアン酸グアニジウム抽出／
塩化リチウム沈澱法（カサラ等、ディ−エヌエイ（ＤＮ
Ａ）２、３２９−３３５、１９８３）によりボウス（Ｂ
ｏｗｅｓ）ヒトメラノーマ細胞から分離した。ポリＡ＋
ｍＲＮＡをオリゴーｄＴクロマトグラフィ（アヴィヴ及
びレダー、プロシーデングス・オブ・ナショナル・アカ
デミィ・オブ・サイエンス・ユーエスエイ（Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）６９、１４０８
−１４１２、１９７２）により調製した。オリゴーｄＴ
−感作（ｐｒｉｍｅｄ）ｃＤＮＡをグブラー及びホフマ
ン（ジーン（Ｇｅｎｅ）２５、２６３−２６９、１９８
３）に従って調製し、λｇｔｌｌにクローン化した（フ
ィン等、「ディエヌエイ・クローニング：ア・プラクチ
カル・アプローチ（ＤＮＡ　ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ　ｐｒ
ａｃｔｉｃａｌ　ａｐｐｒｏａｃｈ）」第１巻、４９−
７８頁、ディ．エム．グロヴァー等、アイアールシー・
プレス・オクスフォード、１９８４）。ｔ−ＰＡｃＤＮ
Ａの２つの部分重複デオキシリボヌクレオチドを表現す
る相補ストランドを化学的に合成した。これら２つのス
トランド、５’−ＧＧＧＣＡＣＣＴＧＣＣＡＧＣＡＧＧ
ＣＣＣＴＧＴＡＣＴＴＣＴＣ−３’および５’−ＧＧＧ
ＡＣＴＣＧＧＣＡＣＡＣＧＡＡＡＴＣＴＧＡＧＡＡＧＴ
ＡＣ−３’をアニールし、エセリシア・コリ（Ｅ．ｃｏ
ｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩ（最終濃度０．１単位／ｍ
ｌ、ベーリンガー・マンハイム）のクルノウ（Ｋｌｅｎ
ｏｗ）断片、並びに各２００μＭのｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
及びｄＡＴＰ（ファルマシア、ウプサラ、スゥエーデン
）並びに２５０μＣｉ（α−３２Ｐ）ｄＣＴＰ、５，０
００Ｃｉ／ｍモル（ニュー・イングランド・ヌクレアー
，ボストン，マサチュセッツ）を用い満たして、−１０
８ｃｐｍ／μｇの特異活性を有する５１ヌクレオチドの
プローブを生成した。このプローブはｃＤＮＡ配列のヌ
クレオチド３６６ないし４１６に及ぶ（ペニカ等、ネイ
チャー（Ｎａｔｕｒｅ）３０１、２１４−２２１、１９
８３）。ボウスメラノーマｃＤＮＡライブライ−でのプ
ラクハイブリッド形成はこのプローブにより実施した。 陽性プラク（λｔ−ＰＡ４及びλｔ−ＰＡ８）からのｃ
ＤＮＡをｐＵＣ１８（セニシューペロン等；ジーン（Ｇ
ｅｎｅ）３３、１０３−１１９、１９８５）と継ぎ、隣
接ｃＤＮＡ配列をコードするｔ−ＰＡ（ｐＵＬ−ｔ−Ｐ
Ａ）を生成した。次いでｔ−ＰＡｃＤＮＡ配列をＭ１３
ｍｐ１８またはＭ１３ｍｐ１９（ヤニシューペロン等、
ジーン（Ｇｅｎｅ）３３、１０３−１１９、１９８５）
中にサブクローン化し、ジデオキシヌクレオチド鎖終止
法（ｃｈａｉｎ　ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏ
ｄ）（サンガー等、プロシーディングス・オブ・ナショ
ナル・アカデミィ・オブ・サイエンス・ユーエスエイ（
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）７４
，５４６３−５４６７，１９７７）により配列を決めた
。完全ｔ−ＰＡｃＤＮＡをコードする配列、並びに５’
−未翻訳配列の付加的１２５ヌクレオチド及び３’−未
翻訳配列の３９１ヌクレオチドをｐＵＬｔ−ＰＡからＢ
ａｍＨＩ制限エンドヌクレアーゼ断片として分離し、発
現ベクターｐＳＶ３２８ＤＨＦＲ（ネルス等、ジャーナ
ル・オブ・バイオロジカル・ケミストリィ（Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．）２６２、５６８２−５６８９、１９８
７）のユニークなＢａｍＨＩ制限部位にクローン化して
ｐＳＶｔ−ＰＡ−ＤＨＦＲを生成した。

【００２４】Ｉ、２、ｕ−ＰＡｃＤＮＡクローンの構築
全ＲＮＡをイソチオシアン酸グアニジウム抽出／塩化リ
チウム沈澱法によりＣＡＬＵ−３細胞（ＡＴＣＣ、ＨＴ
Ｂ−５５）から分離した。ポリＡ＋ｍＲＮＡをオリゴー
ｄＴセルロースクロマトグラフィーにより調製した。オ
リゴーｄＴ−感作ｃＤＮＡを調製しλｇｔｌｌにクロー
ン化した。 ｓｃｕ−ＰＡｃＤＮＡの２つの部分重複デオキシリボヌ
クレオチドを表現する相補ストランドを化学的に合成し
た。 これら２つのストランド、５’−ＧＧＧＣＡＧＧＴＧＴ
ＧＣＧＣＡＧＣＣＡＴＣＣＣＧＧＡＣＴ−３’および５
’−ＧＧＧＣＡＧＧＣＡＧＡＴＧＧＴＣＴＧＴＡＴＡＧ
ＴＣＣＧＧＧ−３’を前節に記載したようにアニールし
、満して−１０８ｃｐｍ／μｇの特異活性を有する４９
ヌクレオチドのプローブを生成した。本プローブはｕ−
ＰＡｃＤＮＡ配列（ダブリュ．イー．ホルムス等、バイ
オテクノロジィ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）３、９
２３−９２９、１９８５）のヌクレオチド９３１ないし
９７９に及ぶ。プラクハイブリッド形成を前節に記載し
たように実施した。後者の言及したデオキシリボヌクレ
オチドを用いて、二次特異的に感作したｃＤＮＡライブ
ラリィを調製し、一次ストランドｃＤＮＡ合成を開始し
た。３つの重複ｃＤＮＡをｐＵＣ１８に継ぎ、近接する
ｃＤＮＡ配列をコード化する短縮していないｓｃｕ−Ｐ
Ａ（ｐＵＬｓｃｕ−ＰＡ）を生成し、これを前節で記載
したように配列を決めた。ｓｃｕ−ＰＡを完全にコード
している配列、５’−未翻訳配列の８９ヌクレオチド及
び３’−未翻訳配列の７８ヌクレオチドを含む、ｐＵＬ
ｓｃｕ−ＰＡからのＨｉｎｄＩＩＩ制限エンドヌクレア
ーゼ断片をｐＳＶ３２８ＤＨＦＲのユニークなＨｉｎｄ
ＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼ部位（ネルス等、ジャー
ナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリィ（Ｊ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｃｈｅｍ．）２６２、５６８２−５６８９、１９
８７）に挿入してｐＳＶｓｃｕ−ＰＡ−ＤＨＦＲを生成
し、これを以下に記載するようにＣＨＯ細胞中ｓｃｕ−
ＰＡの発現に用いた。

【００２５】Ｉ、３、ｔ−ＰＡ／ｕ−ＰＡキメラｃＤＮ
Ａクローンの構築 ｔ−ＰＡ／ｕ−ＰＡ−ｓ　ｃＤＮＡの構成のために、ｐ
ＵＬｓｃｕ−ＰＡからのＢｌｇｌｌ−ｓａｕ３Ａ１断片
（ヌクレオチド３９９ないし７３２、アミノ酸Ａｒｇ８
８ないしＶａｌ１９９をコードする）を、Ｍ１３ｍｐ１
８を分解したＢａｍＨＩに連結してＭ１３ｍｔＩを生成
した。次いでＮＨ２−末端Ｍｅｔ−３５ないしＬｅｕ４
１１のアミノ酸をコードするｐＵＬｔ−ＰＡのＳｓｔＩ
断片（ヌクレオチド−２０ないし１４２１）を、ｓｃｕ
−ＰＡ配列の上流、Ｍ１３ｉｎｔ１のＳｓｔＩ部位に連
結しＭ１３ｔ−ＰＡ−ｓｃｕ−ＰＡを生成した。このＤ
ＮＡ分子中、ｃ−ＰＡとｓｃｕ−ＰＡの配列は共に同一
配向である。 ｔ−ＰＡコドンＴｈｒ２６３及びｓｃｕ−ＰＡコドンＬ
ｅｕ１４４でＤＮＡを継ぐことは、Ｍ１３ｔ−ＰＡ−ｓ
ｃｕ−ＰＡの単一ストランド鋳型ＤＮＡ及びｔ−ＰＡの
アミノ酸Ｓｅｒ２６０ないしＴｈｒ２６３、及びｓｃｕ
−ＰＡのアミノ酸Ｌｅｕ１４４ないしＧｌｎ１４７に対
するコドンと相補である合成デオキシリボヌクレオチド
削除プライマー５’−ＣＴＧＡＡＡＴＴＴＴＡＡＧＧＴ
ＧＧＡＧＣＡＧＧＡ−３’（ニュー・イングランド・バ
イオロブス）を用いるインビボ変異誘発部位により行な
った。２００ｎｇのリン酸化デオキシリボヌクレオチド
を１μｇの鋳型と、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ緩衝液ｐ
Ｈ７、８、１０ｍＭＭｇＣｌ２及び２０ｍＭＤＴＴ中、
６５℃で５分間加熱し、室温及び０℃に段階的に冷却す
ることによりアニールした。ＡＴＰを０．４ｍＭの濃度
まで加え、ｄＮＴＰｓを０．０５ｍＭの濃度に、最終容
量５０μｌで加えた。４００ＵＴ４ＤＮＡリガーゼ及び
エセリシア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼ
の５単位クルノウ断片を加えた。１４℃で１時間インキ
ュベート後得られたＤＮＡをエセリシア・コリ（Ｅ．ｃ
ｏｌｉ）ＳＭ１０１細胞に移入するのに用いた。２５０
ｎｇの削除プライマーを、１０ｍＭＭｇＣｌ２及び５ｍ
Ｍジチオトレイトールを含み、２０μｌ反応混合物中１
００μＣｉの（γ−３２Ｐ）ＡＴＰ及び１０単位のＴ４
−ポリヌクレオチドキナーゼの７０ｍＭトリス−ＨＣｌ
緩衝液、ｐＨ８．０中、３７℃で３０分間インキュベー
トすることにより、１０８ｃｐｍ／μｇの特異的活性に
放射能標式した。次いでこの標式プローブをプラクハイ
ブリッド形成に用いてＭ１３ｔ−ＰＡ／ｕ−ＰＡ−ｓの
結合ＤＮＡを確認した。ハイブリッド形成は、０．９Ｍ
ＮａＣｌ、０．５％ノニデット（Ｎｏｎｉｄｅｔ）Ｐ４
０界面活性剤、１×デンハーツ（Ｄｅｎｈａｒｄｔｓ）
、６ｍＭＥＤＴＡ，１ｍＭピロリン酸Ｎａ、０．１ｍＭ
ＡＴＰ及び０．２ｍｇ／ｍｌエセリシア・コリ（Ｅ．ｃ
ｏｌｉ）ｔＲＮＡを含む０．０９Ｍトリス−ＨＣｌ緩衝
液中２２℃で一晩行なった。ニトロセルロースフイルタ
ーを７５ｍＭＮａｃｌ中、４９℃で１時間、何回か洗浄
し、Ｘ線フイルムに一晩接触させた。陽性ハイブリッド
形成信号を明らかにするプラクは、必要としないＤＮＡ
の除去を証明するためにジデオキシヌクレオチドシーケ
シングで選択した。ｔ−ＰＡ／ｕ−ＰＡ−ｅｃＤＮＡの
構成のため、Ｍ１３ｔ−ＰＡ／ｓｃｕ−ＰＡからＤＮＡ
をストランドする信号を用いて、Ｇｌｙのコドン（ＧＧ
Ａ）によりｔ−ＰＡｃＤＮＡ中Ｃｙｓ２６４のコドン（
ＴＧＣ）を置換した。従って、ｔ−ＰＡｃＤＮＡ配列の
ヌクレオチド９６９ないし９９２に相補のデオキシオリ
ゴヌクレオチド５’−ＴＧＴＣＴＣＡＧＧＣＣＴＣＣＧ
ＧＴＧＧＡＧＣＡＧ−３’を、前節で本質的に記載した
ように置換変異誘発に向けられた部位及びプラクハイブ
リッド形成に用いた。得られる変異誘発Ｍ１３ファージ
ＤＮＡを配列決定して、上記のようにｔ−ＰＡのＧｌｎ
２７１ないしＰｈｅ２７４のコドン（ヌクレオチド１０
００−１０１１）及びｓｃｕ−ＰＡのＳｅｒ−１３８な
いしＰｒｏ１４１のコドン（ヌクレオチド５４８−５５
９）に相補のデオキシオリゴヌクレオチド５’−ＴＧＧ
ＡＧＧＡＧＡＧＧＡＡＡＡＣＴＧＡＧＧＣＴＧ−３’と
削除変異誘発に向けられた部位に用いた。正しく継いだ
ｃＤＮＡを含むプラク（Ｍ１３ｔ−ＰＡ／ｕ−ＰＡ−ｅ
）はＤＮＡシーケシングにより証明した。 　　ｔ−ＰＡ／ｕ−ＰＡ−ｓ及びｔ−ＰＡ／ｕ−ＰＡ−
ｅｃＤＮＡは次のように再構築した。ＢｑＴ１１−部分
ＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼ断片を、ｔ−ＰＡ配
列のｓｅｒ１ないしＴｈｒ２６３及びｓｃｕ−ＰＡ配列
のＬｅｕ１４４ないしＧｌｕ１６３をコードするＭ１３
ｔ−ＰＡ／ｕ−ＰＡ−ｓから、又はｔ−ＰＡ配列のＳｅ
ｒ１ないしＰｈｅ２７４及びｓｃｕ−ＰＡ配列のＳｏｒ
１３８ないしＧｌｕ１６３をコードするＭ１３ｔ−ＰＡ
／ｕ−ＰＡ−ｅから分離した。これらの断片を、Ｐｈｅ
１６３ないしＬｅｕ４１１をコードし、３’−未翻訳ｓ
ｃｕ−ＰＡｃＤＮＡ配列の他の７８ヌクレオチド及びｐ
ＵＣ１８ポリリンカーの残部を含む部分ＥｃｏＲＩ−Ｓ
ｓｔＩ制限エンドヌクレアーゼ断片と結合し、ｔ−ＰＡ
／ｕ−ＰＡ−ｓのＢｇｌＩＩ−ＳｓｔＩ発現ベクターに
連結し、そしてｔ−ＰＡ／ｕ−ＰＡ−ｅは以下のように
構築した。ｔ−ＰＡの単一配列をコードするｐＵＬｔ−
ＰＡからのＨｉｎｄＩＩＩ−ＢｇｌＩＩ制限エンドヌク
レアーゼ断片及び成熟ｔ−ＰＡ／ｕ−ＰＡ−ｓをコード
するＢｇｌＩＩ−ＳｓｔＩ制限エンドヌクレアーゼ断片
を結合し、そしてＨｉｎｄＩＩＩ−ＳｓｔＩ線状化（ｌ
ｉｎｅａｒｉｚｅｄ）ｐＵＣ１８（エル・ネルス等、ジ
ャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリィ（Ｊ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）２６２、５６８２−５６８９、
１９８７）に連結してｐＳＶｔ−ＰＡ／ｕ−ＰＡ−ｓＤ
ＨＦＲを生成した。完全ｔ−ＰＡ／ｕ−ＰＡ−ｅｃＤＮ
Ａの制限エンドヌクレアーゼについては、信号配列をコ
ードするｐＵＬｔ−ＰＡからのＨｉｎｄＩＩＩ−Ｂｇｌ
ＩＩ制限エンドヌクレアーゼ断片及び成熟ｔ−ＰＡ／ｕ
−ＰＡ−ｅをコードするＢｇｌＩＩ−ＳｓｔＩ制限エン
ドヌクレアーゼ断片を結合し、そしてＨｉｎｄＩＩＩ−
ＳｓｔＩ線状化ｐＵＣ１８に連結した。この構造物から
、全ｔ−ＰＡ／ｕ−ＰＡ−ｅｃＤＮＡはＨｉｎｄＩＩＩ
制限断片としてｐＳＶ３２８ＤＨＦＲに転換しｐＳＶｔ
−ＰＡ／ｕ−ＰＡ−ｅ−ＤＨＦＲを生成した。５４８ア
ミノ酸の蛋白をコードするＤＮＡ配列は、ジデオキシヌ
クレオチドシーケシングにより確認した。これを図１に
示す。

【００２６】Ｉ、４、ｔ−ＰＡ／ｕ−ＰＡキメラｃＤＮ
Ａクローンの真核発現 ５μｇのｐＳＶｔ−ＰＡ−ＤＨＦＲ、ｐＳＶｓｃｕ−Ｐ
Ａ−ＤＨＦＲ、ｐＳＶｔ−ＰＡ／ｕ−ＰＡ−ｓ−ＤＨＦ
Ｒ、又はｐＳＶｔ−ＰＡ／ｕ−ＰＡ−ｅ−ＤＨＦＲプラ
スミドを、ＤＨＦＲ−欠損チャイニーズハムスタ卵巣細
胞に移入するのに用いた。これらの細胞は、ベルギー、
ゲント（Ｇｈｅｎｔ）の大学のダブリュ．フィアース博
士から入手した。細胞をリン酸カルシウム共同沈降法（
グラハム及びヴアン・デア・エブ、ヴァイロロジィ（Ｖ
ｉｒｏｌｏｇｙ）５２、４５６−４６７、１９７３）を
用いて移入した。ＤＨＦＲ＋細胞を、グリシン、ヒポキ
サンチン及びチミジンを無くし、１０％透柝胎児仔ウシ
血清を補足したＦ１２−培地（ギブコ／ＢＲＬ，ゲント
、ベルギー）中、選択により分離し、特異的エリサアッ
セー（ホルヴェト等、スロンボシス・アンドヘモスタシ
ス（Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．）５４、６８４−
６８７，１９８５、スツンプ等、ジャーナル・オブ・バ
イオロシカル・ケミストリィ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ
．）２６１、１７１２０−１７１２６、１９８６）を用
いてｔ−ＰＡ−関連抗原の、又は低分子量ｕ−ＰＡ−関
連抗原の分泌をモニターした。大量の生成がなされ、血
清フリーの培地中、続く２日間のインキューション後、
調整培地を３回収集した。

【００２７】Ｉ、５、調整細胞培養培地からｔ−ＰＡ／
ｕ−ＰＡキメラ蛋白の精製 キメラ蛋白、ｔ−ＰＡ／ｕ−ＰＡ−ｓ及びｔ−ＰＡ／ｕ
−ＰＡ−ｅを、亜鉛キレートセファロースでのクロマト
グラフィ、続く不溶化ネズミモノクローナル抗体での免
疫吸着により精製した。調製培地（４３０±２２０μｇ
／リットルの、ｔ−ＰＡ／ｕ−ＰＡ−ｓに対するｕ−Ｐ
Ａ−関連抗原を含有する約２０リットルのバッチ、又は
、約１ｍｇ／リットルの、ｔ−ＰＡ／ｕ−ＰＡ−ｅに対
するｕ−ＰＡ−関連抗原を含有する２５ないし３５リッ
トルのバッチ）を、０．０１％ツィーン８０及び１０Ｋ
ＩＵ／ｍｌアプロチニンを含む０．３ＭＮａＣｌ、０．
０２Ｍトリス−ＨＣｌ緩衝液で予め平衡化した亜鉛キレ
ートセファロースの５×２５ｃｍカラムに、４℃、１時
間当り２５０ｍｌの流速で適用した。カラムを平衡緩衝
液で洗浄し、５０ｍＭイミダゾール含有の緩衝液で溶出
した、７．５ｍｌのフラクションを、２．５ｍｌ０．４
Ｍアルギニン、０．０８Ｍクエン酸緩衝液、ｐＨ５．０
及び４０ＫＩＵ／ｍｌのアプロチニンを含有する管に収
集した。エリサにより測定されたｕ−ＰＡ−関連抗原は
、主蛋白ピークと事実上一致するピークに溶出した。亜
鉛キレートセファロースによる精製段階により、定量的
に近い回収率（＞８５％）で、又、７５ないし１００分
の１の容量減少で得られた。亜鉛キレートセファロース
カラムのフラクションを含むプールしたｕ−ＰＡを、ｔ
−ＰＡ／ｕ−ＰＡ−ｓのｔ−ＰＡ（ＭＡ−１Ｃ８）に対
する、又はｔ−ＰＡ／ｕ−ＰＡ−ｅのｕ−ＰＡ（ＭＡ−
４ＤＩＥ８）に対する可溶化モノクローナル抗体を含有
する１．６×２０ｃｍ免疫吸着カラムに４℃で１時間当
り約１５ｍｌの流速でクロマトグラフィにかけた。カラ
ムを、０．０１％ツウィーン２０及び１０ＫＩＵ／ｍｌ
アプロチニンを含む０．３ＭＮａＣｌ、０．０２Ｍトリ
ス−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．５で洗浄し、次いで同一緩
衝液中２ＭＫＳＣＮで溶出した。７．５ｍｌのフラクシ
ョンを２．５ｍｌ０．４Ｍアルギニン、０．０８Ｍクエ
ン酸緩衝液、ｐＨ５．０及び４０ＫＩＵ／ｍｌのアプロ
チニンを含む管に収集した。ｕ−ＰＡ−関連抗原を含む
フラクションをプールし、０．０１％ツィーン８０及び
１０ＫＩＵ／ｍｌアプロチニンを組む０．３ＭＮａＣｌ
、０．１Ｍアルギニン、０．０２Ｍクエン酸緩衝液、ｐ
Ｈ５．０で透柝した。免疫吸着クロマトグラフィ後、ｕ
−ＰＡ−関連抗原の全収量は、約８０％で、３３０又は
８００μｇ精製物質が、それぞれｔ−ＰＡ／ｕ−ＰＡ−
ｓ又はｔ−ＰＡ／ｕ−ＰＡ−ｅに関し、調製培地１リッ
トル当り得られた。精製の間に用いた細胞培養培地及び
緩衝液に１０ＫＩＵ／ｍｌアプロチニンを加えることに
より、キメラ蛋白を単一鎖形でほぼ完全に得た。使用前
に、キメラ蛋白の試料をベンズアミジン−セファロース
でクロマトグラフィにかけ、Ｓ−２４４４に対するアミ
ド−ｎ化（ａｍｉｄｏｌｙｔｉｃ）活性に欠けているフ
ラクションをプールした。アプロチニンをセントリコン
３０微量濃縮器（アミコン）で広範囲に洗浄することに
より除き、プラスミンによる加価測定により確認した。

【００２８】実施例ＩＩ ｔ−ＰＡ／ｕ−ＰＡ−ｅの変異体の生成キメラプラスミ
ノーゲンアクチベーターｔ−ＰＡ／ｕ−ＰＡ−ｅの３つ
の変異体を、組換え型ＤＮＡ技術により形質転換した真
核細胞を培養することにより生成した。生成工程は以下
の段階を含む。

【００２９】ＩＩ、１、ｔ−ＰＡ−△Ｋ１▽Ｋ２／ｕ−
ＰＡをコードするｃＤＮＡの構築（ネルス等、スロンボ
リシス・アンド・ヘマスタシス（Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅ
ｍｏｓｔ．）…投稿中、参照）ｔ−ＰＡ／ｕ−ＰＡ変異
体キメラの再構築の間ｔ−ＰＡｃＤＮＡの操作を容易に
するため、大部分の５’−未翻訳部位を以下のように除
去した。ｐＵＬｔ−ＰＡからの、５’−未翻訳配列及び
ＮＨ２−末端コドンを含む８５０ｂｐＥｃｏＲＩ制限断
片をｐＵＣ１８にクローン化し、ヘニコフ（ジーン（Ｇ
ｅｎｅ）２８、３５１−３５９、１９８４）により記載
されたように、引き続いてエキソヌクレアーゼＩＩＩ及
びＳＩヌクレアーゼ作用によりその５’−終末で先を切
り取った。得られるｐｔ−ＰＡ−ｓｈ−５’と呼ばれる
プラスミド、これはｔ−ＰＡの開始コドンの９ｂｐ上流
ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を有し、又、ｔ−ＰＡｃＤＮＡ
配列のヌクレオチド７６−８０１を含む、を以下に記載
するようにｐｔ−ＰＡ−△Ｋ１▽Ｋ２／ｕ−ＰＡの構築
に用いた。キメラｔ−ＰＡ／ｕ−ＰＡ−ｅのＤＮＡ中の
クリングル２部分（リュネン等、ジャーナル・オブ・バ
イオロジカル・ケミストリィ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ
．）２６３、１９０８３−１９０９１、１９８８）を以
下の方法で複写した。ｔ−ＰＡｃＤＮＡのヌクレオチド
１８９ないしｓｃｕ−ＰＡｃＤＮＡのヌクレオチド５８
２に及び、ｔ−ＰＡＡ−鎖の完全コード付け部位を含む
、ｐｔ−ＰＡ／ｕ−ＰＡ−ｅのＢｌｇＩＩ−ＢａｌＩ制
限断片をブランドにし、ｐｔ−ＰＡ／ｕ−ＰＡ−ｅのユ
ニークＢａｌＩ部位に挿入してｐＩｎｔｌを得た。ｐＩ
ｎｔｌは完全ｔ−ＰＡ鎖をコードする配列の従列反復を
含み、その一つをｕ−ＰＡＢ−鎖をコードする部位に挿
入する。このプラスミドから、制限エンドヌクレアーゼ
断片を、以下の方法で欠失変異誘発に向けられたオリゴ
ヌクレオチドに用いた。ｐＩｎｔｌから、ｔ−ＰＡｃＤ
ＮＡのヌクレオチド８０２ないし１０１１、ｕ−ＰＡｃ
ＤＮＡのヌクレオチド５４８ないし５８２及び再びｔ−
ＰＡｃＤＮＡのヌクレオチド１８８ないし１８０１をカ
バーする８５９ｂｐＥｃｏＲＩ制限断片をＭ１３ｍｐ１
９のＥｃｏＲＩ部位にクローン化し、ｍ８５９Ｉｎｔｌ
、を生成した。デオキシオリゴヌクレオチド５’−ＧＴ
ＴＴＣＣＣＴＣＡＧＡＧＣＡＧＧＡＧＧＧＣＡＣ−３’
を用いて欠失変異誘発を記載の如く実施してＣｙｓ２６
１のコドンをｔ−ＰＡのＳｅｒ１７４のコドンに融合し
、Ｋ２をコードするｃＤＮＡの３’−末端が内部クリン
グル配列の５’−末端に結合したｍ８５９Ｉｎｔ２を得
た。Ｆ、Ｅ及びＫ１ドメイン並びにＫ２ドメインの部分
を含むｐＩｎｔｌからの６１４ｂｐＢｌｇｌＩ−Ｅｃｏ
ＲＩ制限断片をＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ線状化Ｍ１３ｍ
ｐ１９にクローン化し、ｍ６１４Ｉｎｔｌを生成した。 デオキシオリゴヌクレオチド５’−ＣＣＣＡＡＡＧＴＡ
ＧＣＡＣＧＴＧＧＣＣＣＴＧＧＴ−３’でＴｈｒ９１コ
ドンをＣｙｓ１８０コドンに融合する欠失変異誘発は、
ｔ−ＰＡの完全クリングル１及び内部クリングル配列の
欠失したｍ６１４Ｉｎｔ２を生成した。完全ｔ−ＰＡ−
△Ｋ１▽Ｋ２／ｕ−ＰＡｃＤＮＡの再構築に、ｔ−ＰＡ
のヌクレオチド２０９ないし８０１を含むｐｔ−ＰＡ−
ｓｈ−５’からＰｓｔＩ−ＥｃｏＲＩ制限断片をｍ６１
４Ｉｎｔ２の対応ＰｓｔＩ−ＥｃｏＲＩ断により置換し
ｐＩｎｔ２を生成した。次いでＡｓｎ２０５ないしＣｙ
ｓ２６１をコードするｔ−ＰＡ配列、続いてＳｅｒ１７
４ないしＴｒｐ２０４のコドンを有するｍ８５９Ｉｎｔ
２のＥｃｏＲＩ制限断片をｐＩｎｔ２のＥｃｏＲＩ部位
にコード化してｐＩｎｔ３を得た。最後に、ｔ−ＰＡ配
列を有し、開始コドン、Ｆ及びＥドメイン、Ｋ２の第一
複写及びＫ２の第二複写を含むｐＩｎｔ３からのＥｃｏ
ＲＩ制限断片を、Ｋ２の残存部分と完全ｕ−ＰＡＢ−鎖
配列に及ぶｐｔ−ＰＡ／ｕ−ＰＡの部分ＥｃｏＲＩ−Ｓ
ｓｔＩ制限断片と結合し、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＳｓｔＩ線
状化ｐＵＣ１８に挿入してｐｔ−ＰＡ−△Ｋ１▽Ｋ２／
ｕ−ＰＡを生成した。

【００３０】ＩＩ、２、ｔ−ＰＡ−△ＦＥ／ｕ−ＰＡを
プログラム化しているｃＤＮＡの構築 ｔ−ＰＡのＦ及びＥドメインの欠失を、完全信号配列並
びにＦ、Ｅ及びＫ１ドメイン並びにＫ２ドメインの部分
のコード化配列を含むｐｔ−ＰＡ−ｓｈ−５’からの制
限エンドヌクレアーゼ断片上、以下の方法で実施した。 プラスミドｐｔ−ＰＡ−ｓｈ−５’から、ｔ−ＰＡＡ−
鎖配列を含むＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ断片をＭ１３
ｍｐ１９に移入してｍ７３２Ｉｎｔ１を生成した。この
プラスミドをデオキシオリゴヌクレオチド５’−ＧＧＣ
ＣＣＴＧＧＴＡＴＣＴＴＧＧＴＡＡＧＡＴＣＴ−３’に
よる欠失変異誘発に用いて、Ｆ及びＥドメインを欠失し
た。変異誘発後、短縮ＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ制限
断片をｔ−ＰＡＡ−鎖及びｕ−ＰＡＢ−鎖の残存部分を
含むｐｔ−ＰＡ／ｕ−ＰＡの部分ＥｃｏＲＩ−ＳｓｔＩ
断片と結合してＨｉｎｄＩＩＩ−ＳｓｔＩ線状化ｐＵＣ
１８に連結してｐｔ−ＰＡ−△ＦＥ／ｕ−ＰＡを生成し
た。

【００３１】ＩＩ、３、ｃＤＮＡｔ−ＰＡ−△ＦＥＫ１
▽Ｋ２／ｕ−ＰＡの構築 ｔ−ＰＡ−△Ｋ１▽Ｋ２／ｕ−ＰＡからＦ及びＥドメイ
ンを欠失するため、ｐｔ−ＰＡ−△Ｋ１▽Ｋ２／ｕ−Ｐ
Ａ構築の中間プラスミドを用いた。ＩＩ、１節に記載し
たｐＩｎｔ２から、ｔ−ＰＡｃＤＮＡの開始コドン並び
にＦ及びＥコドンと第一Ｋ２複写の部分をコードする下
流配列を含む４６８ｂｐＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ制
限断片をＭ１３ｍｐ１９のＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ
制限部位にクローン化し、ｍ４６８Ｉｎｔｌを得た（開
始せず）。このＤＮＡをＩＩ、２節に記載のデオキシオ
リゴヌクレオチドと欠失変異誘発に用いて、Ｆ及びＥド
メインを欠失した。これによりｍ４６８Ｉｎｔ２△ＦＥ
が生成した。ｔ−ＰＡ−△Ｋ１▽Ｋ２／ｕ−ＰＡの欠失
変異体の完全ｃＤＮＡの再構築は、ｔ−ＰＡにコドンＡ
ｓｎ２０５ないしＣｙｓ２６１、次いでＳｅｒ１７４な
いしＴｒｐ２０４をプログラム化する、ｍ８５９Ｉｎｔ
２のＥｃｏＲＩ制限断片のｍ４６８Ｉｎｔ２△ＦＥのＥ
ｃｏＲＩ制限部位への挿入を含み、ｍ４６８Ｉｎｔ３△
ＦＥを得た。大部分のｔＰＡＡ−鎖配列を含むｍ４６８
Ｉｎｔ３△ＦＥからのＨｉｎｄＩＩＩ−部分ＥｃｏＲＩ
制限断片を、次いで初めに説明したｔＰＡ／ｕ−ＰＡの
ＥｃｏＲＩ−ＳｓｔＩ制限断片と結合し、ＨｉｎｄＩＩ
Ｉ−ＳｓｔＩ線状化ｐＵＣ１８と連結してｐｔ−ＰＡ−
△Ｋ１▽Ｋ２／ｕ−ＰＡを生成した。

【００３２】ＩＩ、４、ｔ−ＰＡ／ｕ−ＰＡ−ｅ変異体
キメラの発現用プラスミドｐＣＭβＮｅｏの構築発現プ
ラスミドｐＣＭβＮｅｏを、高複写数プラスミドとして
エセリシア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）に増すことができる
高発現レベルベクターを得るために、ｐＵＣ１８を用い
て構築した。このベクターはヒトサイトメガロウイルス
即時−初期プロモータを経て転写を推進し、一方、選択
マーカー、ネオマイシン−ホスホトランスフェラーゼは
、ＳＶ４０初期プロモーターにより調節する。ベクター
は、ｃＤＮＡ’ｓの挿入に適した単一ＨｉｎｄＩＩＩ−
制限部位を有する。ｐＮｅｏからのネオマイシントラン
スフェラーゼ遺伝子（ファルマシア、ウプサラ、スエー
デン）を含むＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｎＨＩ断片を、Ｂｇ
ｌＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ線状化ｐＳＶ３２８Ａ＋（ヴァ
ン・ヘウヴエル等、ジェイ．ゲン．ヴァイロル．（Ｊ．
Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．）６７、２２１５−２２２２、１
９８６）に連結し、ＨｉｎｄＩＩＩ部位が破壊されたｐ
ＳＶ３２８Ｎｅｏを得た。プラスミドｐＳＶ３２８ＤＨ
ＦＲから、ＳＶ４０の初期プロモーター／エンハンサー
、多重クローン化部位及びウサギβ−グロビン転写終結
信号を含むＰｖｕＩＩ−ＮｄｅＩ制限断片をＮｄｅＩ−
ＳｓｐＩ線状化ｐＵＣ１８にクローン化してｐＳＶ１８
を得た。このプラスミドをＰｖｕＩＩで開放し、これに
よりｐＵＣ１８の多重クローン加部位及び大部分のβ−
ガラクトシダーゼ配列を除去した。ＳＶ４０初期プロモ
ーター、ネオマイシン遺伝子及び平滑化押出し断端を有
するウサギβ−グロビン複写終結信号を含むｐＳＶ３２
８ＮｅｏのＰｖｕＩＩ−ＮｄｅＩ制限断片を挿入してｐ
ＳＶβＮｅＯを生成した。このプラスミド中、ＳＶ４０
初期プロモーター／エンハンサーを含む小Ｓｃａｔ−Ｈ
ｉｎｄＩＩＩ制限断片をｐＵＣ１８の小ＳｃａＩ−Ｈｉ
ｎｄＩＩＩ制限断片により置換し、ｐＵＣβＮｅｏを得
た。最後に、ヒトサイトメガロウイルス即時初期プロモ
ーター／エンハンサー（ボシャート等、セル（Ｃｅｌｌ
）４１、５２１−５３０、１９８５）の大部分を形成す
るプラスミドｐＲＲ２３の２つの制限断片を分離した。 ＨｉｎｄＩＩＩ部位を平滑化したＨｉｎｄＩＩＩ−Ｎｄ
ｅＩ並びにＳａｕ３Ａｌ断端を平滑化し、ＨｉｎｄＩＩ
Ｉを連結したＮｄｅＩ−Ｓａｕ３Ａｌ制限断片をＨｉｎ
ｄＩＩＩ−ＳｓｐＩ線状化ｐＵＣβＮｅｏに連結してｐ
ＣＭβＮｅｏを得た。

【００３３】ＩＩ、５、ｔ−ＰＡ／ｕ−ＰＡ−ｅ変異体
キメラの発現 ｔ−ＰＡ−△Ｋ１▽Ｋ２／ｕ−ＰＡ−ｅ，ｔ−ＰＡ−△
ＦＥ／ｕ−ＰＡ−ｅ及びｔ−ＰＡ−△ＦＥＫ１▽Ｋ２／
ｕ−ＰＡｅをプログラム化しているｃＤＮＡの発現プラ
スミドは、おのおのが各変異体キメラの完全コード化配
列を含む、ｐｔ−ＰＡ−△Ｋ１▽Ｋ２／ｕ−ＰＡ，ｐｔ
−ＰＡ−△ＦＥ／ｕ−ＰＡ及びｐｔ−ＰＡ−△ＦＥＫ１
▽Ｋ２／ｕ−ＰＡのＨｉｎｄＩＩＩ制限断片をｐＣＭβ
ＮｅｏのユニークＨｉｎｄＩＩＩ制限部位に挿入するこ
とにより構築して、ｐＣＭｔ−ＰＡ−△Ｋ１▽Ｋ２ｕ−
ＰＡ、ｐＣＭｔ−ＰＡ−△ＦＥ／ｕ−ＰＡ及びｐＣＭｔ
−ＰＡ−△ＦＥＫ１▽Ｋ２／ｕ−ＰＡをそれぞれ得た。 変異体ｃＤＮＡを含む発現プラスミドを１、４節に記載
したようにチャイニーズハムスター卵巣細胞を安定に移
入するのに用いた。移入細胞を４００μｇ／ｍｌゲネチ
シン（ジブコ／ＢＲＬ）耐性を選択し、耐性コロニーを
ｔ−ＰＡ−関連抗原、分泌用にスクリーニングし、適当
な細胞系をキメラ蛋白の大量生産用に選択した。大量生
産を、１００ＩＵ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌ
ストレプトマイシン及び１０ＫＩＵ／ｍｌアプロチニン
を含むオプチメム（Ｏｐｔｉｍｅｍ）培地（ジブコ／Ｂ
ＲＬ）中、本質的に前述のようにして実施した。

【００３４】ＩＩ、６、調整細胞培養培地からｔ−ＰＡ
／ｕ−ＰＡ−ｅ変異体キメラ蛋白の精製本発明で特徴付
けられる、組換え体ｔ−ＰＡ／ｕ−ＰＡ−ｅ分子を、本
質的に先に記載したように亜鉛キレート−セファロース
上、１５−４０リットルの調整培地のバッチのクロマト
グラフィーにより、次いでｕ−ＰＡ（ＭＡ−４ＤＩＥ８
）（ｔ−ＰＡ／ｕ−ＰＡ−ｅ及びｔ−ＰＡ−△Ｋ１▽Ｋ
２／ｕ−ＰＡ−ｅの）に対する、又はｔＰＡ（ＭＡ＝Ｉ
Ｃ８）（ｔ−ＰＡ−△ＦＥＫ１▽Ｋ２／ｕ−ＰＡ−ｅの
）に対する不溶化ネズミモノクローナル抗体への免疫吸
着により精製した。ｔ−ＰＡ−△ＦＥ／ｕ−ＰＡ−ｅを
本質的に既に記載されるように（スタンプ等、ジャーナ
ル・オブ・バイオロジカル・ケミストリィ（Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ，Ｃｈｅｍ．）２６１、１２７４−１２７８、１９８
６）ＳＰ−セファデックスＣ５０によるクロマトグラフ
ィにより、次いで不溶化ＭＡ−ＩＣ８によるクロマトグ
ラフィにより精製した。抗体カラムからの溶出は、１．
６ＭＫＳＣＮで行ない、ｔ−ＰＡ−関連抗原を含むフラ
クションをプールし、０．０１％ツィーン８０及び１０
ＫＩＵ／ｍｌアプロチニン含有、０．３ＭＮａｌ、０．
１Ｍアルギニン、０．０２ＭトリスＨＣｌ緩衝液、ｐＨ
７．４に対し透柝した。ｔ−ＰＡ−関連抗原の主要生成
物（２調製品）は、０．７０ｍｇ／ｌのｔ−ＰＡ／ｕ−
ＰＡ−ｅ，０．４６ｍｇ／ｌのｔ−ＰＡ−△Ｋ１▽Ｋ２
／ｕ−ＰＡ−ｅ；０．２８ｍｌのｔ−ＰＡ−△ＦＥ／ｕ
−ＰＡ−ｅ及び０．３２−ｍｇ／ｌのｔ−ＰＡ−△ＦＥ
Ｋ１▽Ｋ２／ｕ−ＰＡ−ｅであった。調製品中の２鎖誘
導体はＧｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＣＨ２Ｃｌの添加（最
終濃度１０−４Ｍ）により阻害された。使用前にセント
リコン３０マイクロ濃縮器（アミコン）で繰り返し洗浄
してアプロチニン及びＧｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＣＨ２
Ｃｌを除去した。

【００３５】実施例ＩＩＩ 生化学的特徴 実施例１で生成した２つのキメラプラスミノーゲアクチ
ベーター、及び実施例ＩＩで生成したその２つの変異体
を、生化学的特徴の種々の試験に付した。４つの他のプ
ラスミノーゲンアクチベーター、即ち、自家製ｕ−ＰＡ
、市販ｕ−ＰＡ、自家製ｔ−ＰＡ及び市販ｔ−ＰＡを比
較の目的に用いた。自家製ｕ−ＰＡは、チャイニーズハ
ムスター卵巣細胞中の発現により生成した組換え体、単
鎖ｕ−ＰＡであり、亜鉛キレート−セファロースによる
クロマトグラフィ及びＳＰ−セファデックスＣ５０によ
るクロマトグラフィにより（スタンプ等ジャーナル・オ
ブ・バイオロジカル・ケミストリィ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．）２６１、１２７４−１２７８、１９８６参照
、これを引用して明細書記載の一部とする）精製した。 その二鎖形を単鎖形のプラスミン活性化により生成した
。市販ｕ−ＰＡ（サルプラーゼ）はエセリシア・コリ（
Ｅ．ｃｏｌｉ）中の発現により生成され、ドイツアーケ
ンのグリューネンタールＧｍｂＨから販売される組換え
体ＵＰＡであった。この生成物は単鎖形で、二鎖形はプ
ラスミン活性化により生成した。自家製ｔ−ＰＡは、実
施例Ｉ及びＩＩで記載したと同じ方法でチャイニーズハ
ムスター卵巣細胞中ｔ−ＰＡｃＤＮＡの発現により生成
し、亜鉛キレート−セファロースによるクロマトグラフ
ィ及び不溶化モノクローナル抗体ＭＡ−１Ｃ８への免疫
吸着の組合せにより調整培養培地から精製した。市販ｔ
−ＰＡ（アクチヴァーゼ）は米国、南サンフランシスコ
、ジェネンテイック・インコーポレーションから販売さ
れる組換え体ｔ−ＰＡであった。生化学的特徴の第一段
階として、以下のアッセーを用いた。

【００３６】ＩＩＩ、１、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、即ち、ド
デシル硫酸ポリアクリルアミドゲル中の電気泳動、分子
量を測定するのに用いた。このアッセーで、１２％平板
ゲルを用いた。レムリ等、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）
２２７、６８０−６８５、１９７０参照、これを引用し
て明細書記載の一部とする。

【００３７】ＩＩＩ、２、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの免疫ブロ
ッテイングは、ｕ−ＰＡ及びｔ−ＰＡに対する抗血清で
行なう。これは、トウビン等、プロシーデイングス・オ
ブ・ナショナル・アカデミィ・オブ・サイエンス、ユー
エスエイ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ）７６、４３５０−４３５４、１９７９、これを引
用して明細書記載の一部とする、に従ってニトロセルロ
ースシート上で行なった。

【００３８】ＩＩＩ、３、アミノ酸分析、これは、６Ｍ
ＨＣｌ中、１１０℃インヴアクオ（ｉｎｖａｃｕｏ）で
ベックマン１１９ＣＬアミノ酸アナライサーで実施した
。ＩＩＩ、４、特異活性、これは、アストラップ等、ア
ーカイブス・オブ・バイオケミストリィ・アンド・バイ
オフィジックス（Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ．）４０、３４６−３５１、１９５２、これを引
用して明細書記載の一部とする、に従って実施した。結
果は以下の通りであった。精製単鎖ｔ−ＰＡ／ｕ−ＰＡ
−ｓ（ｔ−ＰＡ／ｓｃｕ−ＰＡ−ｓ）は、ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ上非還元条件下、二重じまバンドとして、又、還元
条件下、Ｍｒ約７０，０００の単一主バンドとして、移
動した。非還元ゲル上二重じまの両バンドは、ｔ−ＰＡ
こｔ−ＰＡに対する抗血清により免疫活性である、精製
単鎖ｔ−ＰＡ／ｕ−ＰＡ−ｅ（ｔ−ＰＡ／ｓｃｕ−ＰＡ
−ｅ）は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上、還元条件下Ｍｒ約７０
，０００の単一主バンドとして移動した。両キメラ蛋白
のアミノ酸組成物は、ｔ−ＰＡ／ｕ−ＰＡ分子の既知配
列から誘導されたものと一致した。ヒブリンプレート上
特異活性は、ザ・ナショナル・インスチチュート・フオ
ア・バイオロジカル・スタンダード・アンド・コントロ
ール、ロンドン、英国から得た、ジ・インターナショナ
ル・リファレンス・プレパレイション・フオア・ウロキ
ナーゼとの比較による測定により、７５０００ＩＵ／ｍ
ｇのｔ−ＰＡ／ｓｃｕ−ＰＡ−ｓ及び６５，０００ＩＵ
／ｍｇのｔ−ＰＡ／ｓｃｕ−ＰＡ−ｅ、及び７１，００
０ＩＵ／ｍｇのｔ−ＰＡ／ｔｃｕ及び６８，０００ＩＵ
／ｍｇのｔ−ＰＡ／ｔｃｕ−ＰＡ−ｅとして見出された
。続く研究で、高特異活性をｔ−ＰＡ／ｓｃｕ−ＰＡ−
ｅ及びｔ−ＰＡ／ｔｃｕ−ＰＡ−ｅについて得た。これ
らの値及び自家製ｔ−ＰＡ、サルプラーゼ、自家製ｔｃ
ｕ−ＰＡ及びアクチバーゼの対応特異活性を表Ｉに示す
。

【表１】 ｔ−ＰＡ／ｕ−ＰＡ−ｅに対する３つの変異体を、主と
してＤＴＥによる還元後ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより示され
る単鎖形で得た。イムノグロッテイングはキメラにｔ−
ＰＡ−関連及びｕ−ＰＡ−関連抗原の存在確認した。全
単鎖変異体のＳ−２４４４（色素産生基質、Ｐｙｒｏｇ
ｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮａ）により測定した特異活
性は、１，０００ＩＵ／ｍｇ以下であった。３つの変異
体のアミノ酸組成は、これらのｃＤＮＡ配列から推定さ
れるアミノ酸配列と一致した。フイブリンプレート上の
特異活性は６８，０００ＩＵ／ｍｇと２００，０００Ｉ
Ｕ／ｍｇの間に及び表Ｉに示した。　　さらに以下の試
験を行った。

【００３９】ＩＩＩ、５、プラスミンによるキメラの処
理 ０．３ＭＮａＣｌ、０．２Ｍアルギニン及び０．０１％
ツィーン８０を含む０．０２Ｍトリス−ＨＣｌ緩衝液、
ｐＨ７．４中、実施例Ｉのキメラ蛋白（最終濃度１．０
−２．０μＭ）を、３７℃でプラスミン（最終濃度は、
モル基礎として０．２５−８％）で処理した。時間間隔
で（０−３０分）、０．３ｍＭの最終濃度でＳ−２４４
４を含む同一緩衝液の８００μｌに５μｌを除去及び添
加した。ウロキナーゼ活性を４０５ｎｍでの吸収の測定
から決定し、ウロキナーゼの国際標準製品と比較して国
際単位で表わした。 ｔ−ＰＡ／ｓｃｕ−ＰＡ−ｓ及びｔ−ＰＡ／ｓｃｕ−Ｐ
Ａ−ｅの特異活性はそれぞれ３２０ＩＵ／ｍｇ及び１０
００ＩＵ／ｍｇであった。プラスミンは、アミドール化
による活性ウロキナーゼへの単鎖蛋白の時間依存（ｔｉ
ｍｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ）変換を起こした。最大変換
は、約４３，０００ＩＵ／ｍｇのｔ−ＰＡ／ｓｃｕ−Ｐ
Ａ−ｓ及び５０，０００ＩＵ／ｍｇのｔ−ＰＡ／ｓｃｕ
−ＰＡ−ｅ（続く研究で１００，０００±６．９００）
の特異活性に対応するアミド−ル化活性であった。 処理後のキメラの分子形は、還元後１２％ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ上でモニターした。これは、プラスミン（モルを基
礎として３％）と３０分間３７℃でインキュベーション
後、二鎖分子への単鎖キメラの完全変換を示した。自家
製ｔｃｕ−ＰＡ及びプラスミン処理サルプラートの対応
値は表Ｉに示される。０．０５ＭＮａＣｌ、０．０１ツ
ィーン８０及び０．１Ｍアルギニン含有０．０５Ｍトリ
ス−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．４中、実施例ＩＩの変異体
キメラ（最終濃度５−１０μＭ）をプラスミで（モルを
基礎として１−３％）３０分間、３７℃で処理した。ウ
ロキナーゼ活性の出現を、試料の少くとも２００倍希釈
後４０５ｎｍでの吸収を測定することによりＳ−２４４
４（最終濃度０．３ｍＭ）でモニターした。又、プラス
ミンは、アミドール化による活性ｔ−ＰＡ／ｔｃｕ−Ｐ
Ａ−ｅ誘導体への全ｔ−ＰＡ／ｓｃｕ−ＰＡ−ｅ変異体
の時間依存変換を生じた。最大変換後の特異的アミドー
ル化活性は表Ｉに示す。ＤＴＥによるプラスミン処理変
異体の還元後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、２つのポリペプチ
ドバンド、ｕ−ＰＡのＣＯＯＨ末端ポリペプチド鎖適合
性Ｍｒと移動する一つのバンド及びｔ−ＰＡのＮＨ２−
末端鎖の予期された大きさの断片と適合性Ｍｒと移動す
る他のバンドの存在を明らかにした。この同定は還元Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥのイミノブロッチングにより確認した。 ２鎖の誘導体の系統（ｓｔｏｃｋ）を得るため、最大活
性に達したとき、過剰のアプロチニン（２，０００ＫＩ
Ｕ／ｍｌ）を加えることによりプラスミンを中和し、試
料をベンズアミジン−セファロースに適用した。溶出を
０．１５ＭＮａＣｌ、０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ緩衝液
、ｐＨ２．２で行ない、１ｍｌフラクションを直接、８
０μｌの１Ｍトリス−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ９．０を含む
管に集めた。Ｓ−２４４４に対するアミドール化活性を
有するフラクションをプールし、次の分析に用いた。

【００４０】ＩＩＩ、６、プラスミノーゲンの活性化実
施例Ｉの二鎖形のキメラ（最終濃度２．５−５ｍＭ）に
よるプラスミノーゲンの活性化を、０．０３８ＭＮａＣ
ｌ及び０．０１％ツィーン８０含有ｐＨ７．４の０．０
５Ｍトリス−ＨＣｌ緩衝液中、３７℃でプラスミノーゲ
ンをインキュベートすることにより測定した。異なる時
間間隔（０−６分）で出現したプラスミンを：試料を１
００ないし２００倍希釈後、色素産生プラスミン基質Ｓ
−２２５１（最終濃度０．３Ｍ）で測定した。初期活性
速度は、出現プラスミンの濃度対インキュベーション時
間のプロットから得た。これらのプロットから、速度係
数（ｌｅｉｎｅｔｉｃ　　ｃｏｎｓｔｏｕｔ）Ｋｍ及び
Ｋ２を得た。触媒効率（Ｋ２／Ｋｍ）は表Ｉに示す。実
施例ＩＩの変異体に関して、二鎖ｔ−ＰＡ／ｕ−ＰＡ−
ｅ変異体（最終濃度１．０−１．５ｎＭ）による天然プ
ラスミノーゲン（最終濃度１５−７５μＭ）の活性化を
、０．０３８ＭＮａＣｌ及び０．０１％ウィーン８０含
有ｐＨ７．４の０．０５Ｍトリス−ＨＣｌ緩衝液中、３
７℃でプラスミノーゲンをインキュベートすることによ
り測定した。異なる時間間隔（０−５分）で出現したプ
ラスミンを試料の５０倍希釈後Ｓ−２２５１（最終濃度
１ｍＭ）で測定した。初期活性速度を出現プラスミンの
濃度対インキュベーション時間のプロットから得た。速
度係数をデータのラインウィーヴァ−バルク（Ｌｉｎｅ
ｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋ）プロットの直線状回帰分析に
より決定した。触媒効率（Ｋ２／Ｋｍ）は表Ｉに示す。 実施例１の二鎖キメラによるプラスミノーゲンの活性速
度に対するフイブリンの効果は、０．０３８ＭＮａＣｌ
及び０．０１％ツィーン８０含有、キメラ添加（最終濃
度１．２５又は１．５ｍＭ）前ＣＮＢｒ−消化フイブリ
ノーゲン（最終濃度０．０５−１．０μＭ）を加えたｐ
Ｈ７．４０．０５Ｍトリス−ＨＣｌ緩衝液中、３７℃で
、プラスミノーゲン（最終濃度０．１−２μＭ）のイン
キュベーションにより評価した。出現したプラスミンを
、試料を２０倍に希釈後上記のように測定した。ＣＮＢ
Ｒ消化フイブリノーゲンの添加により両キメラによるプ
ラスミノーゲンの活性速度は濃度に従って増加すること
を示した。２ないし３倍の刺激因子は自家製ｔｃｕ−Ｐ
Ａ又はプラスミン処理セファロースで観察されたものと
非常に似ているが、ｔ−ＰＡにより観察される１４０な
いし２００倍のものよりも非常に低い（表Ｉ）。 　　実施例ＩＩの二鎖形の変異体によるプラスミノーゲ
ンの活性速度に対するフイブリンの効果は、０．０３８
ＭＮａＣｌ及び０．０１ウィーンを含有し、変異体の添
加（最終濃度１ｎＭ）の添加前、ＣＮＢｒ−消化フイブ
リノーゲン（最終濃度０．１−２．０μＭ）を有する、
０．０５Ｍトリス−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．４中、３７
℃でプラスミノーゲン（最終濃度１μＭ）をインキュベ
ーションすることにより評価した。出現したプラスミン
を試料の２０倍希釈後上述したように測定し、初期活性
速度を決定した。 ＣＮＢｒ消化フイブリノーゲンの添加によって、３つの
全ての二鎖形の変異体によるプラスミノーゲンの活性速
度は濃度に従って増加することを示した。表Ｉは、初期
フイブリン濃度の存在下の初期活性速度をフイブリン不
存在下のそれで割った比として計算された増加因子を示
す。この増加因子は、ｔｃｕ−ＰＡのそれと同一オーダ
ーでのものである。

【００４１】ＩＩＩ、７、精製フイブリンへの結合０．
０１％ツィーン８０及び１ｍｇ／ｍｌＢＳＡ含有ｐＨ７
．４、０．０３８ＭＮａＣｌ、０．０５Ｍトリス−ＨＣ
ｌ緩衝液中、ヒトフイブリノーゲン（最終濃度０−３．
２ｍｇ／ｍｌ）をｓｃｕ−ＰＡ、ｔｃｕ−ＰＡ、ｔ−Ｐ
Ａ／ｓｃｕ−ＰＡ−ｓ、ｔ−ＰＡ／ｔｃｕ−ＰＡ−ｓ、
ｔ−ＰＡ／ｓｃｕ−ＰＡ−ｅ、ｔ−ＰＡ／ｔｃｕ−ＰＡ
−ｅ、単鎖又は二鎖ｔ−ＰＡ或いはアクチヴァーゼと混
合した（最終濃度５０−２００ｎｇ／ｍｌ）。混合物を
、トロンビンを２０ＮＩＨ単位／ｍｌの最終濃度まで添
加することにより凝固した。次いで３７℃で１分インキ
ュベーションし、トロンビンを、Ｄ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−
Ａｒｇ−ＣＨ２Ｃｌ（１０μＭ最終濃度）の添加により
不活性化してウロキナーゼの不活性を防止し、そして試
料を１０，０００ｇで１分間遠心分離した。上清中のｕ
−ＰＡ−関連又はｔ−ＰＡ−関連抗原の濃度を、特異的
エリサにより測定した。スタンプ等、ジャーナル・オブ
・バイオロジカル・ケミストリィ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．）２６１、１７１２０−１７１２６；１９８６及
びホルヴォート等、スロンボシス・アンド・ヘモスタシ
ス（Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔａｓ．）５４、６８
４−６８７、１９８５参照、これらを引用して明細書記
載の一部とする。実施例ＩＩの変異体について、０．０
１％ツィーン８０及び１ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン
含有ｐＨ７．４、０．０３８ＭＮａＣｌ０．０５Ｍトリ
ス−ＨＣｌ緩衝液中、プラスミノーゲン除去ヒトフイブ
リノーゲン（最終濃度０ないし３．２ｍｇ／ｍｌ）を単
鎖又は二鎖ｔ−ＰＡ／ｕ−ＰＡ−ｅ変異体（最終濃度１
００ｎｇ／ｍｌ）と混合した。混合物をトロンビンを２
０ＮＩＨ単位／ｍｌの最終濃度まで添加することにより
凝固した。３７℃で１分間インキュベーション後、トロ
ンビンをＤ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＣＨ２Ｃｌ（最
終濃度１０μＭ）の添加により不活性化し、試料を１０
，０００ｇで１分間遠心分離した。上清中のｔ−ＰＡ−
関連抗原の濃度を上記の特異的エリサにより測定した。 結果を表Ｉに示す。これは、単鎖及び二鎖キメラ蛋白は
ｕ−ＰＡ及びｔ−ＰＡのフイブリン親和性中間体を有す
ることを示す。表Ｉで、フイブリンプレート上及びＳ−
２４４４上の特異活性の全ての値は、３又はそれ以上の
測定の平均値±ＳＤである。フイブリン親和性の値は３
ないし７実験の平均値±ＳＤである。星印は単鎖形を用
いたことを意味する。ＩＩＩ、８、血漿ミリュー中のフ
イブリン血餅溶解及びフイブリノーゲン溶解実施例Ｉ及
びＩＩのキメラ蛋白の、並びに比較の基質（最終濃度は
０．０１−５．０μｇ／ｍｌに及ぶ）の比較線維素溶解
能力及びフイブリン特異性は、ヒトクエン化（ｃｉｔｒ
ａｔｅｄ）血漿中に懸濁した１２５Ｉ−フイブリン−標
識化ヒト血漿血餅よりなる系内で測定した。試験方法は
、ザマロン等、スロンボシス・アンド・ヘモスタシス（
Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．）５２、１９−２３、
１９８４により記載されており、これを引用して明細書
記載の一部とする。フイブリノーゲンレベルは慣用の凝
固速度アッセーで測定した。試験した全ての単鎖及び二
鎖形のプラスミノーゲンアクチベーターは、ヒト血漿中
に浸漬した標識化血漿血餅の時間及び濃度依存溶解を誘
導した。結果は、２時間で５０％血餅溶解（Ｃ５０）を
得るのに必要な濃度として、又、２時間後の残留フイブ
リノーゲンレベルとして示した。これらの結果は表ＩＩ
に示す。

【表２】 それは、値がｕ−ＰＡの値と、又はｔ−ＰＡの値と適合
することを示す。

【００４２】実施例ＩＶ 動物モデル内での薬物動態学的性質 プラスミノーゲンアクチベーターの薬動学は、３匹のウ
サギのグループに０．１ｍｇ／ｋｇの試験物質を静脈内
ボーラス注射後、異なる時間間隔で血漿中のｔ−ＰＡ−
関連又はｖ−ＰＡ−関連抗原濃度を測定することにより
決定した。ホルヴォート著、スロンボシス・アンド・ヘ
モストシス（Ｒｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．）５４、
６８４−６８７、１９８５及びスタンプ著、ジャーナル
・オブ・バイオロジカル・ケミストリィ（Ｊ．Ｂｉｏｌ
．Ｃｈｅｍ．）２６１、１７１２０−１７１２６、１９
８６参照。これらを引用して明細書記載の一部とする。 結果は半対数用紙上にプロットし、２つの指数用語の和
、グラフ曲線剥離（ｐｅｅｌｉｎｇ）によるＣ（ｔ）＝
Ａｅ−αｔ＋Ｂｅ−βｔにあてはめた（ギバルディ及び
パーリアー、ファーマコカイネティクス（Ｐｈａｒｍａ
ｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ）マーセル・デッカー・インコ．
ニューヨーク、１９８３、これを引用して明細書記載の
一部とする）。それに加えて、抗原対時間曲線の直線末
端部分が、縦切片Ｂを生ずると推定した。この線はスロ
ープ−βを有する。 推定値を初期値から引き、集めたデータをスロープ−α
及び縦切片Ａを有する線とあてはめた。血漿から抗原の
消失することは一つの中央分画（ｃｏｎｐａｒｔｍｅｎ
ｔ）及び中央分画から起こる排出（ｅｌｉｍｉｎａｔｉ
ｏｎ）を伴う一つの周辺分画からなる二分画乳頭状モデ
ルにより表わした。薬動学的パラメーターは、ギバルデ
ィ及びパーリアーにより導かれた標準式を用いこれらの
係数及び指数から計算した。以下の薬物配列（ｄｉｓｐ
ｏｓｉｔｉｏｎ）パラメーターを導いた。中央分画の容
量Ｖｃ＝用量／（Ａ＋Ｂ）：分布の全容量ＶＤ＝用量／
Ｂ：曲線下の推定領域ＡＵＣ＝Ａ／α＋Ｂ／β：血漿ク
リアランスＣｌｐ＝用量／ＡＵＣ：初期半減時間ｔ１／
２（α）：及び終末半減期ｔ１／２（β）。最も適切な
パラメーターｔ１／２（α）の結果の要約を表ＩＩＩに
示す。

【表３】 ボーラス注射後の血液からのキメラ蛋白及び比較物質の
分配の薬動学的パラメーターも、ハムスターで測定した
。測定及び計算は、各３匹のハムスターのグループに０
．２５ｍｇ／ｋｇのボーラス注射後、ウサギについてと
同様の方法で行なった。結果の要約は、表ＩＩＩに示す
。 さらに、一連の試験をヒヒのプラスミノーゲンアクチベ
ーター（サルプラーゼ及びｔ−ＰＡ−△ＦＥ／ｓｃｕ−
ＰＡ−ｅ）で行なった。ｕ−ＰＡ−関連抗原を、サルプ
ロースの注入前並びに注入後１、２、５、７、１０、１
５、２０及び３０分に採った血液試料について測定した
。一方ｔ−ＰＡ−関連抗原はｔ−ＰＡ−△ＦＥ／ｓｃｕ
−ＰＡ−ｅの注入前並びに注入終了後１５、３０、６０
、９０及び１２０分に採った血液試料について測定した
。血漿からの抗原の消失を示す実験データを、２つの指
数（ｅｘｐ）用語の和：Ｃ（ｔ）＝Ｒｅｘｐ（−αｔ）
＋Ｓｅｘｐ（−βｔ）とあてはめた。この凾数の係数（
Ｒ及びＳ）及び指数（α及びβ）は、上記したようにグ
ラフ曲線剥離による半対数プロットから得た。薬動学的
パラメーターは、ギバルディ及びパーリアーから導かれ
た標準式を用い、これらの係数及び指数から計算した。 初期半減時間及び血漿クリアランスについて得られた値
は表ＩＩＩに示され、データは平均値±ＳＥＤを表わす
。星印で示されるデータは、サルプラーゼに対しｐ＜０
．０１を有する。ウサギで試験したｓｃｕ−ＰＡは、サ
ンド、バーゼル、スイスから得た天然ｓｃｕ−ＰＡであ
った。ハムスターモデルでは、自家製ｓｃｕ−ＰＡを用
いた。

【００４３】実施例Ｖ 動物モデル内での血栓崩壊性質 キメラ蛋白及び比較物質の血栓崩壊能力をウサギ、ハム
スター及びヒヒで評価した。ウサギ肘静脈血栓症モデル
は、コレン等ジェイ．キン．インヴェスト．（Ｊ．Ｃｈ
ｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．）７２、３６８−３７６、１９８
３により前に記載されている。これを引用して明細書記
載の一部とする。 本研究では、１２５Ｉ−標識化肘静脈血栓を３０分間熟
成し（ａｇｅ）、次いで、プラスミノーゲンアクチベー
ターを、１０％ボーラス注射、続いて反対の辺緑耳静脈
を経て４時間かけて残り９０％用量の連続的注入により
投与した。注入終了後、３０分、肘静脈切片の残留放射
活性を計算することにより、血栓崩壊を定量した。１ｍ
ｌの血液試料を０．０１Ｍクエン酸塩溶液に加え、ｕ−
ＰＡ抗原又はｔ−ＰＡ抗原の、並びに残留フィブリノー
ゲン及びα２−抗プラスミンレベルの測定に用いた。

【００４４】第一試験系列では、対照動物に溶剤注入後
３０分に測定した溶解は１１％±１％であった。同様の
スロープを有する線状用量依存溶解を試験した３化合物
、即ち天然ｓｃｕ−ＰＡ、ｔ−ＰＡ／ｓｃｕ−ＰＡ−ｓ
及びｔ−ＰＡ／ｓｃｕ−ＰＡ−ｅについて得た。同様の
範囲の溶解が３つの全ての試験化合物について得られ、
０．２ないし３．２ｍｇ／ｋｇの濃度範囲で注入したと
き、１２％ないし３４％溶解を生じた。１１±１％のバ
ックグランド溶解の収集後、用量応答データを、由来か
ら出た線状回帰線とあてはめ、≧０．９５の相関係数を
生じた。溶解はｍｇ／ｋｇ投与量当りの％溶解（血栓崩
壊能力）及びμｇ／ｍｌ定常状態ｕ−ＰＡ−関連又はｔ
−ＰＡ−関連抗原当りの％溶解（特異的血栓崩壊活性）
として表わした。用量回帰線に対する溶解のスロープは
、３つの全化合物について非常に類似し、一方μｇ／ｍ
ｌ血漿抗原レベル当りの溶解は、天然ｓｃｕ−ＰＡより
も２つのキメラは２倍高かった。

【００４５】実験の第二系列では、対照動物への溶剤の
注入後３０分で測定した溶解は８±１％であった。血餅
溶解の線状用量依存程度は試験した全３化合物、即ち、
サルプラーゼ、ｔ−ＰＡ−△ＦＥ／ｓｃｕ−ＰＡ−ｅ及
びアクチヴァーゼについて得た。しかしながら、ｔ−Ｐ
Ａ−△ＦＥ／ｓｃｕ−ＰＡ−ｅについて得たスロープは
、サルプラーゼ又はアクチヴァーゼのものより有意に急
公配であった。データは表ＩＶに示す。

【表４】 全ての試験したプラスミノーゲンアクチベーターは、注
入終了３０分後の事実上未変化のフィブリノーゲンレベ
ルより延期されるように、全身性線維素溶解活性化なし
に血栓崩壊を生じた。

【００４６】幾つかのプラスミノーゲンアクチベーター
（キメラ、変異体及び比較蛋白）の血栓崩壊能力を、さ
らにハムスター肺塞栓症モデルで評価した。アトロピン
の０．２５ｍｇ／ｍｌの５０μｌを筋肉内注射１０後投
与した６−８週令の体重８０−１００ｇの非近交系ハム
スター（Ｐｆｄ　ｇｏｌｄ，リューベン大学、ベルギー
）を、ペントバルビタールを食塩水中２０ｍｇ／ｍｌに
希釈したペントバルビタール溶液０．３ｍｌを腹腔内注
射して麻酔した。２ＦＧカテーテルを次いで血液サンプ
リングのために大腿部静脈に設置した。肺塞栓症を起こ
す手続は以下の通りであった。３００μｌ新鮮凍結ヒト
血漿、約５００，０００ｃｐｍの１２５Ｉ含有５μｌヒ
ト１２５Ｉ−標識化フィブリノーゲン並びにウシトロン
ビン（１０単位／ｍｌ）及びＣａＣｌ２（０．５Ｍ）の
混合物５０μｌの混合物を８ＦＧカテーテルに吸引した
。カテーテルを３０分間３７℃でインキュベートし、次
いで血漿血餅を陽圧で静かに除去し、食塩水中、３０分
間洗浄し、１ｃｍ切片にカットし（全容量約２５μｌ）
て、放射性同位体を測定した。放射性標識化血餅を次い
で注射のために６ＦＧカテーテルに吸引した。 左肘静脈を露出し、標識化血漿血餅を含むカテーテルを
腕頭静脈内に導入し１ｃｍ進め、そこで注射した。血餅
は通常肺に血栓したが、時に心臓にトラップした。次い
で６ＦＧカテーテルを２ＦＧカテーテルと置き換え、こ
れを通して０．１ｍｌの２０ｍｇ／ｍｌヨウ化ナトリウ
ム溶液を注射し、続いて１，０００単位／ｋｇのヘパリ
ンをボーラス注射した。血栓崩壊剤又は食塩水を０．０
１％ツイーン８０含有食塩水で全量３５０μｌに希釈後
６０分にわたり、定速注入ポンプを用いて２ＦＧ肘静脈
カテーテルを経て注入した。注入終了３０分後、動物を
ペントバルビタールの過剰量で犠牲にし、胸部を開き、
大静脈と大動脈を小さな血液クリップで留めた。心臓と
両肺を除去し、それぞれ分離し、その放射性同位体含量
を測定した。血餅溶解の程度を、血餅中に初めに存在し
た放射活性と、肺及び心臓中の残留放射活性との差とし
て測定した。血液試料（０．２ｍｌ）を注入開始直前、
並びに６０分及び９０分後にクエン酸三ナトリウ０．０
１１Ｍ最終濃度まで加えた。これらの試料を、放射活性
、フィブリノーゲン、α２−抗プラスミン及びｔ−ＰＡ
−関連又はｕ−ＰＡ−関連抗原の測定に用いた。注入に
より、全身性フィブリノーゲン又はα２−抗プラスミン
を消費することなく、本質的に直線状の用量応答曲線を
生成した。用量応答データ（血栓崩壊能力の測定につい
てのｍｇ／ｋｇでの用量に対する％溶解又は特異的血栓
崩壊活性の測定についてのμｇ／ｍｌでの定常状態血漿
レベルに対する％溶解）をバックグランド溶解で収集し
、収集データを統計的プログラムを用いて、由来から出
た線状回帰線とあてはめた。直線スロープは、注入化合
物のｍｇ／ｋｇ当りの％溶解として、又はｔ−ＰＡ−関
連又はｕ−ＰＡ−関連抗原のμｇ／ｍｌ定常状態血漿レ
ベル当りの％溶解として表わした。データは表ＩＶに示
し、ほとんどの試験プラスミノーゲンアクチベーターが
血栓崩壊能力で有意に高い位を示す。ｔ−ＰＡ−ｄｈＦ
Ｅ／ｓｃｕ−ＰＡ−ｅを除き同様の結果を生じることが
判る。

【００４７】幾つかプラスミノーゲンアクチベーター（
サルプロース及びｔ−ＰＡ−△ＦＥ／ｓｃｕ−ＰＡ−ｅ
）の血栓崩壊能力を、さらにヒヒ大腿静脈血栓症モデル
で評価した。この目的のため、７−１８ｋｇの各性のヒ
ヒ（パピオ・ハマドラウス（　Ｐａｐｉｏ　ｈａｍａｄ
ｒａｅｕｓ））を、５ｍｇジアゼパム筋肉内に前投薬後
、１０ｍｇ／ｋｇケタミン塩酸塩（イマルギン５００、
サノフィ、ブラッセル、ベルギー）及び０．０６ｍｇ／
ｋｇアトロピンを筋肉内に投与して麻酔した。気管内イ
ンキュベーション後、レスピレーターで肺に通気した。 麻酔は、３０ｍｇペントパルビタールを静脈内に投与す
ることにより維持した。大腿静脈血餅形成の外科手順は
次の通りであった。大腿静脈を鼠径部の５ｃｍ切り口を
経て露出し、静脈を鼠径部の大腿静脈の入口からはっき
りみえる（ｓａｐｈｅｎｏ．）大腿接合部の２ｃｍ下ま
できれいにした。細い側枝と深い大腿静脈は、ポルテッ
クスカニューレを挿入した主筋皮枝を除いて連結した。 次いで羊毛糸を静脈の内腔に４ｃｍの距離にわたって挿
入した。出血が止ると、静脈切片を分離するため、静脈
の近くと遠くの両方を締め、切片は、側枝カテーテルを
経て全ての血液を空にした。容積測定注入器から食塩水
を管が十分に広がるまで注入することにより測定した片
切の容積は、０．８ないし１．０ｍｌであった。次いで
血栓を以下のようにして生成させた。１ないし２×１０
６ｃｐｍを含む約１０−２０μｌの１２５Ｉ−標識化ヒ
トフィブリノーゲンを鮮血と混合し、分離静脈切片の測
定容量に対応する容量まで１．０ｍｌ注入器内に吸引し
た。次いで切片を側枝カテーテルを経て食塩水を引き出
すことにより空にし、１０ｍＭＣａＣｌ２含有０．２ｍ
ｌトロンビン（１００ＮＩＨＵ／ｍｌ）溶液を、次いで
直ちに血液及び放射活性フィブリノーゲンの混合物を注
入した。次いで綿棒を管の上に置き、静脈切片からもれ
る血液を吸収させた。大低の場合、血餅が速やかに形成
し、その後３０分間熟成させた。次いで両管締め具を除
去し、傷ついた足を一時的に閉じた。放射性同位体計数
のため綿棒を除去し、血餅に伝わった放射活性の量を、
管中の放射活性の元の量から綿棒損失、注入器に残る放
射活性及び全血液放射活性を引くことにより計算した。 プラスミノーゲンアクチベーターは、１０％をボーラス
注射として静脈内に、次いで残り９０％用量を２時間に
わたり枝静脈を経て連続的に注入して投与した。動物は
、ヘパリンで抗凝固した（静脈ボーラスとして３００単
位／ｋｇ及び実験終了まで６０単位／ｋｇ／時の連続注
入）。血栓崩壊は、注入終了後３０分、大腿静脈切片の
残留放射活性の測定により定量した。この目的のため、
大腿静脈の血栓切片を、両端を注意して縫合したのち除
去し、静脈切片中の残留放射活性物質を測定した。溶解
の程度は、血餅中に結合しているとして元から計算され
た放射活性と静脈切片中の残留放射活性の差で表わし、
％で表わした。２ｍｌ血液試料を、注入開始前、開始後
１時間間隔で、そして実験終了時にチエン酸塩（最終濃
度０．０１Ｍ）に加えた。血漿試料を、放射活性の測定
に、又、フィブリノーゲン、α２−抗プラスミン及び抗
原測定に用いた。注入により、全身フィブリノーゲン又
はα２−抗プラスミン消費なしに、実質的に直線状の用
量応答曲線を生じた。直線状回帰線をハムスターを用い
た試験と同様の方法で描いた。 得られる線スロープを注入化合物のｍｇ／ｋｇ当りの％
として（血栓崩壊能力）又はｕ−ＰＡ−関連抗原のμｇ
／ｍｌ定常状態血漿レベル当りの％として（特異的血栓
崩壊活性）表わした。データは表ＩＶに示す。表ＩＶで
は、全データは平均値±ＳＥＭを示す。ウサギモデルで
用いたｓｃｕ−ＰＡは天然ｓｃｕ−ＰＡで、一方、ハム
スターモデルでは、自家製ｓｃｕ−ＰＡを用いた。幾つ
かの統計的データを示す。表ＩＶから、試験したほとん
ど全てのプラスミノーゲンアクチベーターの血栓崩壊能
力は、３つの動物モデルで有意に高い血栓崩壊能力を有
するｔ−ＰＡ−△ＦＥ／ｓｃｕ−ＰＡ−ｅを除き、相対
的であることを導くことができる。表ＩＩＩとの比較に
より、この効果は、かなり高い特異的血栓崩壊活性と組
合さった遅延クリアランスによるものであることが判る
。遅延クリアランスは、又、試験した他の２つのプラス
ミノーゲンアクチベーターにも見られたが、これらは、
減少した特異的血栓崩壊活性の結果として目だった血栓
崩壊能力を有しなかった。

【００４８】実施例Ｖ ハムスター肺塞栓症モデルでのｔ−ＰＡ−△ＦＥ／ｓｃ
ｕ−ＰＡ，アクチヴァーゼ及びサルプラーゼのボーラス
注射による血栓崩壊 試験は、肺塞栓症のハムスターに０．２５−１．０ｍｇ
／ｋｇサルプラーゼ、０．００８−０．０６４ｍｇ／ｋ
ｇｔ−ＰＡ−△ＦＥ／ｓｃｕ−ＰＡ−ｅ及び０．０６２
−１．０ｍｇ／ｋｇアクチヴァーゼをボーラス注射して
行なった。ｔ−ＰＡ−△ＦＥ／ｓｃｕ−ＰＡ−ｅの血栓
崩壊能力は、サルプラーゼ及びアクチヴァーゼのそれよ
りも明らかにすぐれていることを示した。事実、ｍｇ／
ｋｇ化合物に対する％溶解の直線状回帰線スロープは、
ｔ−ＰＡ−△ＦＥ／ｓｃｕ−ＰＡ−ｅは１２４０±２９
０で、これに比べサルプラーゼは３６±７でアクチヴァ
ーゼは７７±１５であった。

【図面の簡単な説明】

【図１】　　ヒトｔ−ＰＡの一次構造を示すアミノ酸配
列である。

【図２】　　ヒトＡｃｕ−ＰＡの一次構造を示すアミノ
酸配列である。

【図３】　　実施例で用いたキメラブラスミノーゲンア
クチベーターの図解的表現である。

Claims (25)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　その分子中に、（ａ）ウロキナーゼタ
   イププラスミノーゲンアクチベーターから誘導され、且
   つウロキナーゼタイププラスミノーゲンアクチベーター
   の全ての酵素活性を実質的に有するポリペプチド構造、
   及び（ｂ）ウロキナーゼタイププラスミノーゲンアクチ
   ベーターと比べてすぐれたインビボ血栓崩壊能力をキメ
   ラプラスミノーゲンアクチベーターに付与する能力を有
   するポリペプチド構造、を含む、キメラプラスミノーゲ
   ンアクチベーター。
2. 【請求項２】　　ウロキナーゼタイププラスミノーゲン
   アクチベーターの酵素活性を有する該ポリペプチド構造
   が、単鎖ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター
   のＣ末端セリンプロテアーゼ部位を含む、請求項１のキ
   メラプラスミノーゲンアクチベーター。
3. 【請求項３】　　ウロキナーゼタイププラスミノーゲン
   アクチベーターの酵素活性を有する該ポリペプチド構造
   が、単鎖ウロキナーゼタイププラスミノーゲンアクチベ
   ーターの１３８から４１１までのアミノ酸残基を含む、
   請求項１のキメラプラスミノーゲンアクチベーター。
4. 【請求項４】　　すぐれたインビボ血栓崩壊能力をキメ
   ラプラスミノーゲンアクチベーターに付与する能力を有
   する該ポリペプチド構造が、生物からのキメラプラスミ
   ノーゲンアクチベーターのクリアランスを減少させ、一
   方、インビボでのその特異的血栓崩壊能力を比較的維持
   する能力を有するポリペプチド構造を含む、請求項１の
   キメラプラスミノーゲンアクチベーター。
5. 【請求項５】　　すぐれたインビボ血栓崩壊能力をキメ
   ラプラスミノーゲンアクチベーターに付与する能力を有
   する該ポリペプチド構造が、組織型プラスミノーゲンア
   クチベーターから誘導された、請求項１のキメラプラス
   ミノーゲンアクチベーター。
6. 【請求項６】　　すぐれたインビボ血栓崩壊能力をキメ
   ラプラスミノーゲンアクチベーターに付与する能力を有
   する該ポリマー構造が、組織型プラスミノーゲンアクチ
   ベーターの１から３までの、及び８７から２７４までの
   アミノ酸残基を含む、請求項１のキメラプラスミノーゲ
   ンアクチベーター。
7. 【請求項７】　　その分子中に、（ａ）単鎖ウロキナー
   ゼタイププラスミノーゲンアクチベーターの１３８から
   ４１１までのアミノ酸残基を含むポリペプチド構造、及
   び（ｂ）組織型プラスミノーゲンアクチベーターの１か
   ら３までの、及び８７から２７４までのアミノ酸残基を
   含むポリペプチド構造、を含む、請求項１のキメラプラ
   スミノーゲンアクチベーター。
8. 【請求項８】　　請求項１のキメラプラスミノーゲンア
   クチベーターをコード化するＤＮＡ切片。
9. 【請求項９】　　請求項８のＤＮＡ切断を含む表現ベク
   ター。
10. 【請求項１０】　　請求項９の表現ベクターにより移入
    されるか形質転換され、そして請求項１のキメラプラス
    ミノーゲンアクチベーターを表現する能力を有する原核
    又は真核細胞。
11. 【請求項１１】　　その分子中に、（ａ）ウロキナーゼ
    タイププラスミノーゲンアクチベーターから誘導され、
    ウロキナーゼタイププラスミノーゲンアクチベーターの
    全ての酵素活性を実質的に有するポリペプチド構造、及
    び（ｂ）ウロキナーゼタイププラスミノーゲンアクチベ
    ーターと比べてすぐれたインビボ血栓崩壊能力をキメラ
    プラスミノーゲンアクチベーターに付与する能力を有す
    るポリペプチド構造、を含むキメラプラスミノーゲンア
    クチベーターの製造法であって、該方法は、−該キメラ
    プラスミノーゲンアクチベーターをコード化するＤＮＡ
    切片を組み立てること、−該表現ベクターにより原核又
    は真核細胞を形質転換すること、−該形質転換細胞を培
    養すること、及び−該キメラプラスミノーゲンアクチベ
    ーターを含む培養培地を収集すること、のステップを含
    む。
12. 【請求項１２】　　血栓崩壊疾患の処置に用いる医薬組
    成物であって、該組成物は有効量のキメラプラスミノー
    ゲンアクチベーターを製薬上許容しうる賦形剤と共に含
    み、該キメラプラスミノーゲンアクチベーターは、その
    分子中に、（ａ）ウロキナーゼタイププラスミノーゲン
    アクチベーターから誘導され、且つウロキナーゼタイプ
    プラスミノーゲンアクチベーターの全ての酵素活性を実
    質的に有するポリペプチド構造、及び（ｂ）ウロキナー
    ゼタイププラスミノーゲンアクチベーターに比べてすぐ
    れたインビボ血栓崩壊能力をキメラプラスミノーゲンア
    クチベーターに付与を能力を有するポリペプチド構造、
    を含む。
13. 【請求項１３】　　ウロキナーゼタイププラスミノーゲ
    ンアクチベーターの酵素活性を有する該ポリペプチド構
    造が、単鎖ウロキナーゼタイププラスミノーゲンアクチ
    ベーターのＣ末端部位を本質的に含む、請求項１２の医
    薬組成物。
14. 【請求項１４】　　ウロキナーゼタイププラスミノーゲ
    ンアクチベーターの酵素活性を有する該ポリペプチド構
    造が、単鎖ウロキナーゼタイププラスミノーゲンアクチ
    ベーターの１３８から４１１までのアミノ酸残基を含む
    、請求項１２の医薬組成物。
15. 【請求項１５】　　すぐれたインビボ血栓崩壊能力をキ
    メラプラスミノーゲンアクチベーターに付与する能力を
    有する該ポリペプチド構造が、生物からのキメラプラス
    ミノーゲンアクチベーターのクリアランスを減少させ、
    一方、インビボでのその特異的血栓崩壊能力を比較的維
    持する能力を有するポリペプチド構造を含む、請求項１
    ２の医薬組成物。
16. 【請求項１６】　　すぐれたインビボ血栓崩壊能力をキ
    メラプラスミノーゲンアクチベーターに付与する能力を
    有する該ポリペプチド構造が、組織型プラスミノーゲン
    アクチベーターから誘導された、請求項１２の医薬組成
    物。
17. 【請求項１７】　　すぐれたインビボ血栓崩壊能力をキ
    メラプラスミノーゲンアクチベーターに付与する能力を
    有する該ポリペプチド構造が、組織型プラスミノーゲン
    アクチベーター分子の１から３までの、及び８７から２
    ７４までのアミノ酸残基を含む、請求項１２の医薬組成
    物。
18. 【請求項１８】　　有効量のキメラアクチベーターと製
    薬上許容しうる賦形剤を含む医薬組成物であって、該キ
    メラプラスミノーゲンアクチベーターは、その分子中に
    、（ａ）単鎖ウロキナーゼタイププラスミノーゲンアク
    チベーターの１３８−４１１アミノ酸残基を含むポリペ
    プチド構造、及び（ｂ）組織型プラスミノーゲンアクチ
    ベーターの１から３までの、及び８７から２７４までの
    アミノ酸残基を含むポリペプチド構造、を含む。
19. 【請求項１９】　　キメラプラスミノーゲンアクチベー
    ターを、それが必要な患者に投与することを含む血栓塞
    栓疾患の処置方法であって、該キメラプラスミノーゲン
    アクチベーターは、その分子中に、（ａ）ウロキナーゼ
    タイププラスミノーゲンアクチベーターから誘導され、
    且つウロキナーゼタイププラスミノーゲンアクチベータ
    ーからの全ての酵素活性を実質的に有するポリペプチド
    構造、及び（ｂ）ウロキナーゼタイププラスミノーゲン
    アクチベーターと比べてすぐれたインビボ血栓崩壊能力
    をキメラプラスミノーゲンアクチベーターに付与する能
    力を有するポリペプチド構造、を含む。
20. 【請求項２０】　　ウロキナーゼタイププラスミノーゲ
    ンアクチベーターの酵素活性を有する該ポリペプチド構
    造が、単鎖ウロキナーゼタイププラスミノーゲンアクチ
    ベーターのＣ末端セリンプロテアーゼ部位を含む、請求
    項１９の血栓塞栓疾患の処置方法。
21. 【請求項２１】　　ウロキナーゼタイププラスミノーゲ
    ンアクチベーターの酵素活性を有する該ポリペプチド構
    造が、単鎖ウロキナーゼタイププラスミノーゲンアクチ
    ベーターの１３８から４１１までのアミノ酸残基を含む
    、請求項１９の血栓塞栓疾患の処置方法。
22. 【請求項２２】　　すぐれたインビボ血栓崩壊能力をキ
    メラプラスミノーゲンアクチベーターに付与する能力を
    有する該ポリペプチド構造が、生物からのキメラプラス
    ミノーゲンアクチベーターのクリアランスを減少させ、
    一方、インビボでの特異的血栓崩壊活性を比較的維持す
    る能力を有するポリペプチド構造を含む、請求項１９の
    血栓塞栓疾患の処置方法。
23. 【請求項２３】　　すぐれたインビボ血栓崩壊能力をキ
    メラプラスミノーゲンアクチベーターに付与する能力を
    有する該ポリペプチド構造が組織型プラスミノーゲンア
    クチベーターから誘導された、請求項１９の血栓塞栓疾
    患の処置方法。
24. 【請求項２４】　　すぐれたインビボ血栓崩壊能力をキ
    メラプラスミノーゲンアクチベーターに付与する能力を
    有する該ポリペプチド構造が、組織型プラスミノーゲン
    アクチベーター分子の１から３までの、及び８７から２
    ７４までのアミノ酸残基を含む、請求項１９の血栓塞栓
    疾患の処置方法。
25. 【請求項２５】　　該キメラプラスミノーゲンアクチベ
    ーターがその分子中に、（ａ）単鎖ウロキナーゼタイプ
    プラスミノーゲンアクチベーターの１３８から４１１ま
    でのアミノ酸残基を含むポリペプチド構造、及び（ｂ）
    組織型プラスミノーゲンアクチベーターの１から３まで
    の、及び８７から２７４までのアミノ酸残基を含むポリ
    ペプチド構造を含む、請求項１９の血栓塞栓疾患の処置
    方法。