DE3886755T3 - Verfahren zur behandlung von gefässkrankheiten. - Google Patents

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Description

  • Hintergrund der Erfindung
  • 1. Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein die Herstellung von Medikamenten zur Behandlung von Gefäßerkrankungen bei Patienten, die ein t-PA-Mittel mit erhöhter "Halbwertszeit" oder "verringerter Clearancerate" brauchen, sowie ein Verfahren zur Schaffung eines solchen Mittels.
  • 2. Beschreibung des Standes der Technik
  • Human-Gewebs-Plasminogenaktivator, t-PA, ist ein äußerst wichtiges neues biologisches Pharmazeutikum, das sich aufgrund seiner hohen Spezifität und starken Fähigkeit zur Auflösung von Blutgerinnsel in vivo als vielversprechend bei der Behandlung von Gefäßerkrankungen erwiesen hat. Demgemäß hat die medizinische Fachwelt t-PA als eines der beeindruckendsten neuen Mittel der jüngeren Geschichte zur Behandlung von Gefäßerkrankungen und insbesondere Herzerkrankungen gepriesen. Aus diesen und anderen Gründen wird t-PA die klinische Behandlung gefährlicher Gefäßerkrankungen wahrscheinlich revolutionieren.
  • Human-t-PA-Protein, sowie die zugrundeliegenden Gensequenzen, die dafür kodieren, war in den letzten Jahren Gegenstand zahlreicher wissenschaftlicher Offenbarungen. Beispielsweise ist die Struktur von t-PA-Protein sowie seine Isolierung aus natürlichen Quellen von Rijken et al., (1981), "J.Biol.Chem.", 256:7035, beschrieben worden. Darüberhinaus sind ein Patent und verschiedene Patentanmeldungen veröffentlicht worden, die sich im Detail mit der Isolierung von natürlichem t-PA aus sowohl natürlichen als auch rekombinanten Quellen beschäftigen (siehe z.B. GB-PS-2,119,804; EP-A-041766; und EP-A-093619). Ausgehend von solchen Offenbarungen ist nun klar, daß natürlicher t-PA, gleichgültig, ob natürlich isoliert oder eine rekombinante Spezies davon, typischerweise 5 Bereiche umfaßt, die bezüglich in verschiedenen anderen Proteinen identifizierter homologer oder ähnlicher Strukturen definiert worden sind. Diese Bereiche sind als der Finger(F)-, der Wachstumsfaktor(G)-, der Kringle 1(K1)-, der Kringle 2(K2)- und der Protease(P)-Bereich λ bezeichnet worden und befinden sich aneinandergrenzend in der N-Terminus- zum C-Terminus-Richtung der Proteinrückgratstruktur.
  • Trotz der deutlichen Vorteile, die natürlicher Human-t-PA als Gerinnsel auflösendes pharmazeutisches Mittel aufweist, ist seine Verwendung unter verschiedenen Umständen mit bestimmten Nachteilen verbunden. Beispielsweise weist natürlicher t-PA eine extrem kurze Plasmahalbwertszeit, typischerweise etwa 6 Minuten, auf, wenn es Patienten in therapeutisch wirksamen Mengen verabreicht wird. Darüberhinaus weist natürlicher t-PA, was die Clearancerate, einen weiteren wichtigen pharmakokinetischen Indikator, betrifft, typischerweise eine extrem hohe Clearancerate von etwa 7 bis 8,b ml/min/kg auf. Kurze Halbwertszeiten und hohe Clearanceraten sind unter bestimmten Umständen wünschenswert, beispielweise wenn akute aggressive Therapie gegen eine lebensgefährliche Erkrankung wie Myokardinfarkt oder Lungenembolie angewandt wird. Bei dieser mit hohem Risiko verbundenen Situation kann es sein, daß Patienten behandelt werden, die ein deutliches oder unerkanntes Potential für unkontrollierte Blutung aufweisen. Wenn eine solche Blutung auftreten würde, könnte die Arzneimittelverabreichung gestoppt werden, und die verursachenden t-PA-Spiegel würden durch hohe Clearanceraten rasch gesenkt.
  • Jedoch ist unter anderen Umständen, beispielsweise bei der Behandlung von Myocardinfarkt nach Reperfusion das gewünschte therapeutische Dosierungsschema weniger aggressiv und von längerer Dauer (4 bis 12 Stunden). Eine t-PA-Form mit langer Halbwertszeit kann bei Patienten, die sich nicht in lebensbedrohlichen Situationen befinden, als eine wünschenswertere, wirksamere und zweckmäßigere Behandlung angesehen werden. Darüberhinaus wäre ein t-PA mit längerer Halbwertszeit als Mittel zur Bolusverabreichung, beispielsweise durch Ambulanztechniker, wünschenswert, wenn allgemein nicht die Möglichkeit zur Infusion besteht, und(?) es wäre wünschenswerter, t-PA-artige Mittel mit längerer Halbwertszeit und/oder geringeren Clearanceraten einzusetzen.
  • Demgemäß ist es gegenwärtig notwendig, verbesserte Verfahren und damit verbundene Ausführungsformen zur Herstellung von t-PA-Varianten zu finden, die verbesserte pharmakokinetische Parameter aufweisen und dennoch in vivo hohe Gerinnsellysewirkung beibehalten. Auf diese Art würde die medizinische Wissenschaft wichtige neue Alternativen für die Behandlung kardiovaskulärer Erkrankungen und bei der Behandlung zahlreicher anderer medizinischer Zustände schaffen, die durch den thromboembolischen Verschluß von Blutgefäßen entstehen.
  • Die EP-A-0196920 gibt an, daß Ala160-t-PA, der im wesentlichen aus der B-Kette von nativem t-PA gemeinsam mit Kringle 2 (K2) besteht, worin das aktive Zentrum blockiert ist, verbesserte pharmakokinetische Eigenschaften aufweist. Die EP-A-0207589 offenbart eine im Wachstumsfaktorbereich modifizierte Variante, insbesondere eine, bei der der Bereich von Aminosäurerest 51 bis inklusive 87 gelöscht ist. Die EP-A-238304, die einen Verweis nach Art 54(3)EPÜ darstellt, offenbart eine t-PA-Variante, bei der die funktionelle Kohlehydratstruktur am Aminosäurerest 117 entfernt ist, beispielsweise durch die Behandlung mit Endoglycosidase oder durch Aminosäuresubstitution an den Positionen 117 und/oder 118 und/oder 119.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • In Anbetracht dieser und anderer Nachteile nach dem Stand der Technik ist ein allgemeines Ziel der vorliegenden Erfindung, verbesserte Verfahren zur Behandlung von Gefäßerkrankungen zu schaffen, insbesondere zur Vorbeugung gegen Rethrombose von Herzkranzarterien bei betroffenen Patienten.
  • Es ist ein spezielles Ziel der vorliegenden Erfindung, Medikamente zur Behandlung von Patienten zu schaffen, die Gerinnselauflösungsmittel brauchen, die bezogen auf zur Zeit verfügbare Gerinnselauflösungsmittel eine längere Halbwertszeit und/oder verringerte Clearancerate aufweisen.
  • Es ist ein spezielleres Ziel der vorliegenden Erfindung, Medikamente zur Behandlung von Zuständen zu schaffen, welche die Verwendung von Gerinnselauflösungsmitteln mit bezogen auf natürlichen t-PA längerer Halbwertszeit und/oder verringerten Clearanceraten zulassen, beispielsweise Zuständen wie Tiefvenenthrombose oder Peripherarterienthrombose (Periphergefäßerkrankung).
  • Es können Human-t-PA-Proteinvarianten erzeugt werden, die bezogen auf natürlichen t-PA längere Halowertszeiten und/oder verringerte Clearanceraten-Wirkung aufweisen und dennoch hohe Gerinnsellyse in vivo beibehalten. Wie hierin verwendet bezieht sich der Begriff "Human-t-PA-Proteinvariante" auf Proteinstrukturen, die grundlegende Strukturmerkmale von natürlichem t-PA enthalten, beispielsweise solche Strukturen, die im allgemeinen in natürlichem t-PA zu findenden Aminosäuresequenzen oder biologisch funktionellen Äquivalenten solcher Sequenzen von Aminosäuren entsprechen, die aber auf eine oder mehrere Arten geändert worden sind, um eine Proteinvariante mit, bezogen auf natürlichen t-PA, statistisch erhöhter Halbwertszeit und/oder Clearancerate zu erzeugen. Wie hierin verwendet soll der Begriff "natürlicher t-PA" t-PA umfassen, wie beispielsweise in den EPO-Anmeldungsveröffentlichungen 041766 und 093619 beschrieben, gleichgültig ob aus natürlichen oder rekombinanten Quellen erhalten.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft so allgemein verbesserte Verfahren zur Behandlung von Gefäßerkrankungen bei einem Patienten, der ein t-PA-Mittel mit erhöhter Halbwertszeit oder verringerter Clearancerate benötigt. Derartige Verfahren umfassen allgemein die Herstellung einer t-PA-Proteinvariante, die eine größere Plasmahalbwertszeit aufweist, zumindest etwa zweimal länger, als die von natürlichem t-PA, oder die eine verringerte Clearancerate aufweist, etwa die Hälfte oder weniger, als die Clearancerate von natürlichen t-PA-Proteinen. Die t-PA-Proteinvariante wird mit verschiedenen pharmazeutisch verträglichen Trägern oder Exzipienten in Mengen formuliert, die adäquat sind, um einem Patienten in einer zweckmäßigen Dosis therapeutischen Nutzen zu bringen, gefolgt von der Verabreichung geeigneter Mengen an einen Patienten, der diese benötigt, entsprechend der speziellen Umstände.
  • Fachleute werden wissen, daß mit den Begriffen "Halbwertszeit" oder "Plasmahalbwertszeit" die Zeit gemeint ist, in der sich eine Arzneimittelkonzentration im Plasma auf die Hälfte verringert, typischerweise nach der Verabreichung einer ausgewählten Dosis gemessen. Demgemäß mißt die Halbwertszeit die Zeit der Eliminierung der Hälfte der Arzneimittelkonzentration im Plasma. Im Gegensatz dazu ist mit dem Begriff "Clearancerate" die Rate der Arzneimitteleliminierung dividiert durch die Konzentration des Arzneimittels im speziellen Fluid, im allgemeinen Plasma, gemeint. Mit "Plasma" ist in der vorliegenden Beschreibung entweder Plasma oder Serum gemeint. Der Begriff der Clearance ist in der klinischen Pharmakokinetik äußerst nützlich, da die Clearance eines bestimmten Arzneimittels über die meisten klinisch vorkommenden Arzneimittelkonzentrationen üblicherweise konstant ist und typischerweise für Ratenkinetik erster Ordnung(?) geeignet sein kann. Die Clearancerate kann gelegentlich als die verabreichte Dosis dividiert durch AUC definiert werden, worin AUC als die Fläche unter der Plasmakonzentration-Zeit-Kurve definiert ist. Demgemäß ist mit einer "verlängerten", "erhöhten" oder "längeren" Halbwertszeit eine statistisch längere Halbwertszeit gemeint. Darüberhinaus ist mit "verringerter" oder "reduzierter" Clearancerate eine gemeint, die statistisch reduziert ist.
  • Da die Pharmakokinetik von natürlichem t-PA biphasig oder multiphasig zu sein scheint, ist eine solche Pharmakokinetik typischerweise für bi- (oder multi-)Exponentialgleichungen geeignet. Demgemäß sollte anerkannt werden, daß es sich bei den hierin wiedergegebenen Halbwertszeitzahlen um "nominale" Halbwertszeiten handelt, und somit ist die dominante Halbwertszeit von natürlichem t-PA mit etwa 2,2 Minuten für t1/2a und etwa 30 Minuten für t1/2b wiedergegeben. Wenn jedoch Co = 100 beträgt der t1/2a-Bestandteil im allgemeinen etwa 95% und der t1/2b-Bestandteil etwa 5%. Demgemäß ist die Alphaphase dominant und gibt die nominale Halbwertszeit wieder.
  • Der Schlüssel zur Herstellung von t-PA-Proteinvarianten, welche die hohe Gerinnsellysewirkung von natürlichem t-PA in vivo wirksam beibehalten, ist das Entfernen der gesamten oder eines Abschnitts des Fingerbereichs oder des gesamten oder eines Teils des Wachstumsfuktarbereichs, oder des gesamten oder eines Teils des Kringle 1-Bereichs, der typischerweise mit natürlichem t-PA assoziiert ist. Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff "Fingerbereich" allgemein auf den Aminoterminusbereich von natürlichem t-PA-Protein, das aufgrund der vermutlichen Anordnung von Disulfidbindungen zwischen den Zysteinresten 6 und 36 sowie 34 und 43 eine "fingerähnliche" Struktur aufweist. Der Fingerbereich kann alternativ dazu durch die zugrundeliegende Genstruktur als der individuelle Fingerkodierungsexonbereich, beispielsweise wie durch Typ 1-Homologien mit Fibronektin gekennzeichnet, und als ein unabhängiger Exonbereich definiert werden. Demgemäß umfaßt der Fingerbereich in bestimmten bevorzugten Ausführungsformen Aminosäuren, die den Aminosäuren etwa 1 (SER) bis etwa 44 (HIS) von natürlichem t-PA entsprechen.
  • Der Wachstumsfaktorbereich (G) ist (basierend auf seiner Homologie mit EGF) verschiedentlich als sich von etwa Aminosäure 45 nach oberhalb von Aminosäure 91 erstreckend definiert worden. Kringle 1 (K1) ist als sich von etwa Aminosäure 92 bis etwa 173 erstreckend definiert worden, und Kringle 2 (K2) ist als sich von etwa Aminosäure 180 bis etwa Aminosäure 261 erstreckend definiert worden. Der sogenannte Serinproteasebereich (P) ist allgemein als sich von etwa Aminosäure 264 zum C-terminalen Ende des Moleküls erstreckend definiert worden. Diese Bereiche sind im allgemeinen aneinander anliegend angeordnet, oder sie sind durch kurze "Linker"-Bereiche getrennt und machen die gesamte Aminosäuresequenz von 1 bis 527 Aminosäuren in ihrer vermutlich reifen Form aus.
  • Jeder Bereich ist verschiedentlich als bestimmte spezifische Aktivität beitragend beschrieben worden: das heißt, der Fingerbereich ist verschiedentlich als eine Sequenz enthaltend beschrieben worden, die essentiell oder zumindest von wesentlicher Bedeutung für hohe Bindungsaffinität an Fibrin ist. (Es wird angenommen, daß diese Aktivität für die hohe Spezifität wichtig ist, die Humangewebeplasminogenaktivator bezogen auf Gerinnsellyse an der Stelle eines fibrinreichen Thrombus aufweist.) Der wachstumsfaktor-artige Bereich ist, zumindest bezogen auf Urokinase, ebenso mit Zelloberflächenbindungsaktivität assoziiert gewesen. Der Kringle 2-Bereich ist ebenso stark mit Fibrinbindung und mit der Fähigkeit von Fibrin assoziiert gewesen, die Aktivität von t-PA zu stimulieren. Beim Serinproteasebereich scheint man sich darüber einig zu sein, daß er der "Arbeitspferd"-Bereich des Moleküls ist, was Plasminogenaktivierungsaktivität betrifft.
  • Die Plasmahalbwertszeit des t-PA kann auf eine Art erhöht werden, die mit der/dem entfernten Menge oder Abschnitt an Finger-, Wachstumsfaktor- oder Kringle 1-Bereich in Beziehung steht. So ist die Steigerung der Halbwertszeit, die die Variante aufweist, umso größer, je größer das Ausmaß der in der t-PA-Variante reflektierten funktionellen Bereichsänderung ist. Jedoch ist festgestellt worden, daß auch das Entfernen so gut wie des gesamten Finger-, Wachstumsfaktor- oder Kringle 1-Bereichs zu wenig Verringerung der Gerinnsellyseaktivität in vivo führt. Demgemäß können pharmazeutische Präparate einfach mit t-PA-Proteinvarianten hergestellt werden, die Gerinnsellyseaktivität in vivo beibehalten, wobei Varianten eingesetzt werden, die einen oder mehrere aus dem funktionellen Finger-, Wachstumsfaktor-, Kringle 1-, Kringle 2- und/oder Proteasebereich enthalten, bei denen aber zumindest ein Abschnitt des Finger-, Wachstumsfaktor- oder Kringle 1-Bereichs entfernt oder verändert worden ist.
  • Bei bestimmten bevorzugten Ausführungsformen ist bei den so hergestellten und klinisch eingesetzten t-PA-Varianten im wesentlichen der gesamte Fingerbereich entfernt, insbesondere gekennzeichnet durch die Entfernung von Aminosäuren, die den Aminosäuren 1 bis 44 von natürlichem t-PA entsprechen (hierin als "des (1-44) t-PA" bezeichnet).
  • Bei anderen bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind die Aminosäuren 44 bis 84, im wesentlichen der gesamte Wachstumsfaktorbereich, gelöscht, oder es sind die Aminosäuren 92 bis 179, im wesentlichen der gesamte Kringle 1-Bereich, gelöscht.
  • Wie in der Folge beschrieben hergestellte t-PA-Varianten weisen Plasma-Halbwertszeiten auf, die im allgemeinen zumindest zweimal höher sind als die von natürlichem t-PA, und weisen in bestimmten Ausführungsformen Halbwertszeiten auf, die zwischen etwa dem Fünf- und etwa dem Zwanzigfachen der Plasmahalbwertszeit von natürlichem t-PA liegen. Da die Plasmahalbwertszeit von natürlichem t-PA beim Menschen etwa 6 Minuten beträgt, weisen bevorzugte t-PA-Variantenpräparate gemäß vorliegender Erfindung typischerweise eine Halbwertszeit von zumindest 12 bis 20 Minuten, und im Fall von des (1-44) t-PA, von bis zu einer Stunde oder mehr auf.
  • Es wird anerkannt werden, daß die "nominale" Halbwertszeit von natürlichem t-PA bei Kaninchen, Affen und dem Menschen etwa 2, 3, 5 bzw. 6 Minuten beträgt. Dieses Verhältnis ist typischerweise relativ konstant. Somit würde eine beispielsweise beim Kaninchen beobachtete Halbwertszeit einer etwas größeren Halbwertszeit beim Menschen entsprechen.
  • Bei anderen Ausführungsformen ist die verbesserte Pharmakokinetik von t-PA-Variantenstrukturen durch die verringerte Clearancerate des Mittels definiert. Bei solchen Ausführungsformen werden t-PA-Variantenproteine geschaffen, die Clearanceraten aufweisen, die 1/2 oder 1/5 oder weniger der Clearancerate von natürlichem t-PA betragen, vorzugsweise eine Clearancerate von zwischen etwa 1/15 und etwa 1/25 der Clearancerate von natürlichem t-PA. Bei den meisten anerkannten Testsystemen sowie beim Menschen weist natürlicher t-PA im allgemeinen eine Clearancerate in der Größenordnung von 7 bis 8,5 ml/min/kg auf. Jedoch weisen in der Praxis der vorliegenden Erfindung eingesetzte t-PA-Varianten typischerweise eine Clearancerate von weniger als etwa 2 ml/min/kg auf, wobei die bevorzugte des (1-44) t-PA-Variante eine Clearancerate von weniger als etwa 0,5 ml/min/kg aufweist.
  • Um die Möglichkeit von nachteiligen Wirkungen und unbekannten Toxizitäten von t-PA-Proteinvariantenpräparaten zu vermeiden, wird vorgezogen, wenn auch nicht erforderlich, daß die so hergestellte Proteinvariante frei von synthetischen Derivaten ist, wie beispielweise Derivaten, worin Alkyl, Alkylamin oder methylierte Benzylamine oder andere blockierende Gruppen in der Proteinstruktur enthalten sind.
  • Jedoch ist früher festgestellt worden, daß andere Modifikationen verbesserten t-PA schaffen, und solche modifizierte t-PAs können auch bei erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden. Beispielsweise sind neuartige t-PA-Mutanten mit bestimmten Aminosäuresubstitutionen im Bereich der Aminosäuren 270 bis etwa 279, und im spezielleren den Positionen 275, 276 und 277 von Human-t-PA in der am 9. Juli 1987 eingereichten US-07/071,506 und ihren Stammanmeldungen Nr. 06/846,697, eingereicht am 1. April 1986, und Nr. 06/725,468, eingereicht am 22. April 1985, (entspricht der EP-Anmeldung Veröffentlichungsnr. 199,574, veröffentlicht am 29. Oktober 1986 beschrieben worden; alle diese Anmeldungen sind durch Verweis hierin eingeschlossen). Diese Mutanten, die vorzugsweise als t-PA-Mutanten mit einer Aminosäure mit Ausnahme von Arginin an Position 275 oder Lysin an Position 277 charakterisiert sind, werden hierin als proteaseresistente einkettige t-PA-Varianten bezeichnet, da sie, anders als natürlicher t-PA, der sowohl in einkettiger als auch in zweikettiger Form vorliegen kann, gegen Proteasespaltung an den Positionen 275 und/oder 277 resistent sind und daher nicht in vivo metabolisch in eine zweikettige Form umgewandelt werden. Derartige resistente "einkettige" Varianten werden auf ähnliche Art nach erfindungsgemäßen Verfahren verbessert bzw. verarbeitet und fallen in den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung. Beispiele für solche enzymatisch Resistente (an den Aminosäurepositionen 275 und/oder 277) gemäß vorliegender Erfindung umfassen jene wie Varianten in Verbindung mit einem (zumindest in einem Abschnitt) fehlenden Finger-, Wachstumsfaktor- oder Kringle 1-Bereich, beispielsweise des 1-44 Glu 275 t-PA und des 1-44 Glu275Iso277 t-PA.
  • Obwohl angenommen wird, daß t-PA-Proteinvarianten beispielsweise durch enzymatische Spaltung von natürlichem t-PA, gefolgt durch enzymatische Hinzufügung ausgewählter Aminosäuren, oder sogar durch vollständig synthetische Mittel erhalten werden können, werden t-PA-Varianten davon durch den praktischen Einsatz rekombinanter DNA-Technologie und Zellkulturtechniken erhalten. Rekombinante Ausgangsvektoren und die rekombinanten Techniken zum Bilden, Kultivieren und Exprimieren geeigneter t-PA-Varianten durch die Verwendung solcher Vektoren sind nach dem Stand der Technik allgemein bekannt oder sind im Detail hierin dargelegt worden.
  • Im allgemeinen umfassen bevorzugte rekombinante Verfahren zur Herstellung geeigneter t-PA-Proteinvarianten die Herstellung eines rekombinanten Vektors, der für die Variante kodiert, beispielsweise für Aminosäuren kodiert, die den Aminosäuren 45 bis 527 entsprechen, im Fall von des (1-44) t-PA die Aminosäuren 1-44 von natürlichem t-PA ausschließt und auf ähnliche Art im Fall von des-Wachstumsfaktor und des-Kringle 1-t-PA die entsprechenden Aminosäuren ausschließt. Es wird anerkannt werden, daß durch den Einsatz rekombinanter DNA-Technologie zur Herstellung von t-PA-Proteinvarianten Varianten hergestellt werden, worin die Größe und Sequenz des beibehaltenen Finger-, Wachstumsfaktor- oder Kringle 1-Bereichs mit hoher Spezifität reguliert werden kann. Darüberhinaus können große Mengen an Proteinvariante hergestellt und mit herkömmlichen Mitteln weiter gereinigt werden, um pharmazeutisch verträgliche Präparate zu schaffen. Das durch das genetische Engineering von Mikroorganismen oder Zellkultursystemen hergestellte Produkt schafft eine Möglichkeit zur Herstellung von menschlichem Gewebeplasminogenaktivator auf wesentlich effizientere Art als dies bisher möglich war, was eine bis dato kaum vorstellbare kommerzielle Ausbeutung ermöglicht. Außerdem kann der erfindungsgemäße menschliche Gewebeplasminogenaktivator je nach der Wirtszelle assoziierte Glykosylierung im Vergleich zu nativem Material in einem größeren oder geringeren Ausmaß enthalten. In jedem Fall ist der t-PA frei von verunreinigenden Substanzen, wie verunreinigenden Proteinen und anderen fremden Mitteln, beispielsweise Einheiten auf viraler Basis, die normalerweise in nichtrekombinanter zellularer Umgebung oder in von gepooltem Serum abgeleiteten Präparaten damit assoziiert sind.
  • Die Verbindungen gemäß vorliegender Erfindung können nach bekannten Verfahren formuliert werden, um pharmazeutisch nützliche Zusammensetzungen herzustellen, wodurch das modifizierte Human-t-PA-Produkt gemäß vorliegender Erfindung in Mischung mit einem pharmazeutisch verträglichen Trägervehikel kombiniert wird. Geeignete Trägervehikel und ihre Formulierung, einschließlich anderer Humanproteine, z.B. Humanserumalbumin, werden beispielsweise in "Remington's Pharmaceutical Sciences", 16. Auflage, 1980, Mack Publishing Co., herausgegeben von Oslo et al., beschrieben, das durch Verweis hierin eingeschlossen ist. Derartige Zusammensetzungen enthalten typischerweise eine wirksame Menge der t-PA-Variante, beispielsweise von etwa 0,5 bis etwa 5 mg/ml, zusammen mit einer geeigneten Menge an Trägervehikel, um pharmazeutisch verträgliche Zusammensetzungen herzustellen, die zur wirksamen Verabreichung an den Wirt geeignet ist. Die t-PA-Zusammensetzung kann parenteral oder nach anderen Verfahren verabreicht werden, die ihre Abgabe an den Blutkreislauf in einer wirksamen Form und Menge gewährleisten.
  • Zusammensetzungen, die besonders gut für die klinische Verabreichung von t-PA-Variantenprodukten geeignet sind, die in der Praxis der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden, umfassen beispielsweise sterile wässerige Lösungen oder sterile hydratisierbare Pulver, wie lyophilisiertes Protein. Es ist im allgemeinen wünschenswert, in der Formulierung weiters eine geeignete Menge eines pharmazeutisch verträglichen Salzes aufzunehmen, im allgemeinen in einer Menge, die ausreicht, um die Formulierung isotonisch zu machen. Ein pH-Regulator, wie Argininbase und Phosphorsäure, ist ebenfalls typischerweise in ausreichenden Mengen enthalten, um einen entsprechenden pH-Wert, im allgemeinen von 5,5 bis 7,5, beizubehalten. Darüberhinaus kann es, um die Lagerbeständigkeit oder Stabilität wässeriger Formulierungen zu verbessern, auch wünschenswert sein, weiters Mittel wie Glycerin einzubeziehen. Auf diese Art werden t-PA-Variantenformulierungen für die parenterale Verabreichung und im speziellen intravenöse Verabreichung geeignet gemacht.
  • Die Dosierungen und gewünschten Arzneimittelkonzentrationen von pharmazeutischen Zusammensetzungen gemäß vorliegender Erfindung können je nach der beabsichtigten speziellen Verwendung variieren. Beispielsweise werden bei der Behandlung von Tiefvenenthrombose oder peripherer Gefäßerkrankung typischerweise "Bolus"-Dosen in der Größenordnung von etwa 0,05 bis etwa 0,3 mg/kg bevorzugt, wobei daraufhin Verabreichungen in der Größenordnung von etwa 0,1 bis etwa 0,2 mg/kg erfolgen, um einen in etwa konstanten Spiegel im Blut beizubehalten, vorzugsweise in der Größenordnung von etwa 3 μg/ml. Jedoch ist es für die Verwendung im Zusammenhang mit medizinischen Notversorgungseinrichtungen, wo im allgemeinen nicht die Möglichkeit zur Infusion zur Verfügung steht, und aufgrund der allgemein kritischen Art der zugrundeliegenden Erkrankung (z.B. Embolie, Infarkt), im allgemeinen wünschenswert, etwas größere Anfangsdosen vorzusehen, wie einen intravenösen Bolus in der Größenordnung von 0,3 mg/kg.
  • Beispielsweise kann der menschliche Gewebetyp-Plasminogenaktivator gemäß vorliegender Erfindung Patienten, die an Herzkreislauferkrankungen oder -affektionen leiden, parenteral verabreicht werden. Die Dosierung oder Dosierungsrate kann parallel zu jener sein, die zur Zeit bei klinischen Untersuchungen mit anderen thrombolytischen Herzkreislaufmitteln eingesetzt wird, beispielsweise etwa 1–2 mg/kg Körpergewicht als eine intravenöse oder intraarterielle Dosis über 1,5–12 Stunden bei Patienten, die an Myocardinfarkt, Lungenembolie usw. leiden.
  • Als ein Beispiel für eine geeignete Dosierungsform kann eine Phiole, die 50 mg menschlichen Gewebe-Typ-Plasminogenaktivator, Arginin, Phosphorsäure und Polysorbat 80 enthält, mit 50 ml sterilem Wasser für Injektionen rekonstituiert und mit einem geeigneten Volumen an 0,9%iger Natriumchloridinjektion gemischt werden.
  • Die verlängerte Halbwertszeit von menschlichem Gewebetyp-Plasminogenaktivator gemäß vorliegender Erfindung kann für rasche intravenöse Injektion geeignet sein. Das würde die Notwendigkeit für komplexe Verabreichungsverfahren ausschalten und kann die Möglichkeit für die Verwendung von t-PA in Umgebungen mit beschränkter medizinischer Ausrüstung, wie in mit paramedizinischem Personal besetzten Rettungsfahrzeugen erhöhen. Eine verlängerte Halbwertszeit von menschlichem Gewebetyp-Plasminogenaktivator kann auch geringere, sicherere Anfangsdosen zulassen und könnte die thrombolytisch wirksamen Plasmaspiegel bis zu 45 Minuten lang oder länger aufrechterhalten. Eine längere Halbwertszeit von menschlichem Gewebetyp-Plasminogenaktivator kann auch für längere Therapie mit geringer Dosis nützlich sein, die notwendig sein kann, um Wiederverschluß nach erfolgreicher akuter Thrombolyse zu vermeiden oder für verlängerte Thrombolyse, die in Fällen von peripherem Gefäßverschluß notwendig sein kann.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • Die 1A–1C zeigen die Nukleinsäuresequenz und entsprechende Aminosäuresequenz von Human-t-PA in voller Länge (Aminosäuren 1-527), einschließlich des mutmaßlichen Präsequenzbereichs (Aminosäuren -35 bis -1), sowie 5'- und 3'-Flankierungssequenzen.
  • 2 zeigt schematisch die Schritte, die zur Erzeugung eines des (1-44)-t-PA-Varianten-Kodierungsmutantplasmids gesetzt werden.
  • 3 zeigt denl Vergleich der Wanderung auf Polyacrylamidgel von natürlichem t-PA zur des (1-44)-t-PA-Variante sowohl in Gegenwart als auch in Abwesenheit von Reduktionsmitteln.
  • 4 vergleicht die Fibrinstimulierung von des (1-44)-t-PA und natürlichem t-PA in vitro unter Verwendung des plasminspezifischen Substrats S-2251.
  • 5 vergleicht die Fibrinbindungswirkung von natürlichem t-PA (intaktes Fibrin
    Figure 00120001
    und Fibrin mit abgebautem Plasmin
    Figure 00120002
    ) mit des (1-44) t-PA (intaktes Fibrin, 0, und mit abgebautem Plasmin
    Figure 00120003
    ).
  • 6 vergleicht die thrombolytische Aktivität in vivo von des (1-44) t-PA (N44) mit natürlichem t-PA (RIK) bei Kaninchen (jeweils n = 6, 5 + Standardabweichung).
  • 7 vergleicht die Lyserate von natürlichem t-PA (0) mit der des (1-44)-t-PA-Variante (
    Figure 00130001
    ) bei einer Dosis von 0,3 bzw. 0,064 mg/kg, als ein 10%-Bolus verabreicht, gefolgt von Infusion des Rests über 90 Minuten.
  • 8 vergleicht den Zeitverlauf der Plasmakonzentration als Ergebnis von Verabreichung von 0,3 natürlicher oder 0,064 mg/kg N44-Variante, als ein 10% mg/kg-Bolus verabreicht, wobei der Rest über einen Zeitverlauf von 90 min infundiert wird.
  • 9 vergleicht die Pharmakokinetik von N44 mit natürlichem t-PA (rt-PA) unter Verwendung von nicht-radioaktivem rt-PA als der Träger.
  • 10 zeigt die Pharmakokinetik von N44, wobei N44 als der Träger verwendet wird. 11 ist eine schematische Verabreichung dessen, wie Plasmid p1154 hergestellt werden kann, und zeigt auch ein teilweises Restriktionsmapping davon.
  • 11 ist eine schematische Darstellung, die zeigt, wie Plasmid p1154 hergestellt wird und zeigt auch ein teilweises Restriktions-Mapping davon.
  • 12 zeigt die Sequenz vom des 1-44 Glu 275 t-PA-Mutanten, für den Plasmid p1154 kodiert.
  • 13 zeigt die pharmakokinetischen Profile der verschiedenen Bereichslöschungsmutanten bei Kaninchen: Wachstumsfaktorlöschung, des 44-84 ("d-GF"); Kringle 1-Löschung, des 92-179("d-K1"); Kringle 2-Löschung, des 174-261("d-K2"); und nativen t-PA ("rt-PA") als eine Kontrolle.
  • 14 zeigt die Fibrinbindungseigenschaften der verschiedenen Bereichslöschungsmutanten (siehe 13), die Fingerlöschungen des 1-44 enthalten, ausgedrückt als prozentuelle Bindung gegenüber Fibrin(ogen)konzentration.
  • Detaillierte Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
  • I. Einleitung
  • Beim Menschen und anderen Tieren spielt der Gewebetyp-Plasminogenaktivator (t-PA) eine wesentliche Rolle bei der Auflösung von Fibringerinnsel (siehe z.B. Verstraete und Collen (1986), "Blood", 67:1425). t-PA ist eine Serinprotease, die Fibrinolyse in Gang setzt, indem sie Plasminogen in Plasmin umwandelt. t-PA besteht aus mehreren Bereichen, die Sequenzhomologie mit anderen Proteinen aufweisen, und es ist postuliert worden, daß jeder Bereich zu diesem multifunktionellen Protein eine spezifische Funktion beiträgt (siehe z.B. Pennica et al., (1983), "Nature" 301:214; Banyai et al (1983), FEBS Lett., 163:37). Nur die Funktion des Proteasebereichs (Reste 276-627) ist unzweideutig definiert worden. Diese Erkenntnis basierte zuerste auf der beobachteten Sequenzhomologie mit anderen bekannten Serinproteasen. In jüngerer Vergangenheit hat die begrenzte Reduktion der zweikettigen Form von t-PA die direkte Isolierung und funktionelle Charakterisierung des Proteasebereichs ermöglicht (Rijken und Groeneveld (1986), "J.Biul.Chem.", 261:3098; Dodd et al., (1986), "Thrombos.Haemostas." 55:94).
  • Jedoch ist/sind die präzise(n) Funktion(en) des Fingerbereichs (z.B. siehe 1A–C; Reste 1-44, die homolog mit den Typ 1- Fingerbereichen von Fibronektin sind), der Wachstumsfaktorbereich (Reste 45-89, die mit epidermalem Wachstumsfaktor und den Wachstumsfaktorbereichen in Urokinase, Faktor IX, Faktor X und Protein C homolog sind) und die beiden Kringle-Bereiche (Reste 92-173 und 180-261, die mit den Kringle-Bereichen in Plasminogen, Prothrombin, Urokinase und Faktor XII homolog sind) zur Zeit unbekannt. Banyai et al., oben, verwendete Sequenzhomologie mit den Fingerbereichen, die für die Fibrinaffinität von Fibronektin verantwortlich sind, und eingeschränkte proteolytische Untersuchungen an t-PA, um darauf hinzuweisen, daß der aminoterminale Finger-Bereich verantwortlich für die Fibrinaffinität von t-PA ist. Alternativ dazu haben Ichinoise et al. (1986), "J.Clin.Invest." 78:103, Sequenzhomologie mit den Kringle-Bereichen, die für die Fibrinaffinität von Plasminogen verantwortlich sind, und begrenzte Proteolyse verwendet, um darauf hinzuweisen, daß der zweite Kringle-Bereich von t-PA für die Interaktion mit Fibrin verantwortlich ist.
  • Stellenspezifische Mutagenese ist eine Technik, die die selektive Löschung von gewünschten Abschnitten eines bestimmten Proteins durch selektive Löschung entsprechender zugrundeliegender Gensequenzen zuläßt. In Kombination mit der funktionellen Charakterisierung des resultierenden Mutanten können solche Techniken die Erhellung der Funktion oder Funktionen eines jeden Bereichs ermöglichen. Beispielsweise haben Bang et al. (1985), "Clin.Res." 33:878A vorbereitende Arbeit unter Verwendung dieses Ansatzes vorgestellt, die darauf hinweist, daß der Finger- und der Wachstumsfaktorbereich ausreichend für Fibrinbindung und maximale Stimulierung der Aktivität durch Fibrin sind. Im Gegensatz dazu haben van Zonneveld et al. (1986), "Proc.Natl.Acad.Sci. USA", 83:4670 unter Verwendung eines Übergangsexpressionssystems und ungereinigter Überstände gezeigt, daß der zweite Kringle-Bereich und in einem geringeren Ausmaß der Finger- und der Wachstumsfaktorbereich für die Fibrinbindung verantwortlich sind. Jedoch haben Kagitani et al. (1985), "FEBS Lett." 189:145 eine natürlich auftretende t-PA-cDNA isoliert, die für die Reste 50-527 von Detroit 562-Zellen kodiert und das Protein nach Expression in E.coli charakterisiert. Im Gegensatz zu anderen Forschern haben sie festgestellt, daß dieser Mutant, dem der Finger-Bereich und ein Abschnitt des Wachstumsfaktorbereichs fehlte, sehr wohl an Fibrin band.
  • Verheijen et al., EMBO 5, 3525 (1986) haben eine Serie von Varianten von t-PA hergestellt, denen eine oder mehrere Bereiche fehlten. Sie haben festgestellt, daß in der Abwesenheit von Plasminogen bei geringen Fibrinkonzentrationen das Entfernen des Finger-Bereichs die Fibrinbindung deutlich verringerte; jedoch scheint die Gegenwart des zweiten Kringle-Bereichs bei hohen Fibrinkonzentrationen auszureichen, um beträchtliche Bindung zu gewährleisten. In Gegenwart von Plasminogen ist der Kringle 2-Bereich auch bei niedrigen Fibrinkonzentrationen wichtig. Sie haben auch gefolgert, daß nur der Kringle 2-Bereich an der Stimulierung der Aktivität durch Fibrin beteiligt ist.
  • Demgemäß hat es viel Verwirrung und Unsicherheit gegeben, was die funktionelle Bedeutung der verschiedenen Strukturbereiche, und insbesondere die Rolle des N-terminalen Finger-Bereichs von natürlichem t-PA betrifft. Jedoch kann nun auf der Basis der vorliegenden Erfindung eindeutig geoffenbart werden, daß es neben bestimmten anderen möglichen pharmakologischen Attributen des Finger-, Wachstumsfaktor- oder Kringle 1-Bereichs klar ist, daß das Vorhandensein dieser Bereiche in t-PA-Proteinen direkt mit der kurzen Halbwertszeit von natürlichem t-PA korreliert. Insbesondere kann nun geoffenbart werden, daß das Entfernen des Finger-, Wachstumsfaktor- oder Kringle 1-Bereichs, wie beispielsweise durch das Entfernen der ersten 44 Aminosäuren von natürlichem t-PA im Fall des Entfernens des Finger-Bereichs beispielhaft dargestellt, zu t-PA-Proteinvarianten führt, die im Lichte dessen, was zuvor hinsichtlich natürlichem t-PA und seinen assoziierten intramolekularen Strukturen bekannt war, überraschende und unerwartete pharmakokinetische Eigenschaften aufweisen.
  • II. Herstellung von t-PA-Varianten
  • Wie oben angeführt werden rekombinante Techniken zur Herstellung von t-PA-Varianten bevorzugt, die bei den erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden. Insbesondere wird rekombinante DNA-Technologie für die Herstellung dieser Human-t-PA-Löschungsmutanten eingesetzt, verschiedentlich modifiziert durch resultierende Einzel- oder Mehrfachaminosäuresubstitutionen, -löschungen, -hinzufügungen und -ersetzungen, beispielsweise durch stellengerichtete Löschungsmutagenese. Eingeschlossen wäre die Herstellung von t-PA-Löschungsvarianten, bei denen der gesamte oder ein Teil des Finger-Bereichs gelöscht ist, die jedoch den (die) Kringle-Bereich(e) und Serinproteasebereich beibehalten, die im allgemeinen für zuvor beschriebenen menschlichen Gewebeplasminogenaktivator charakteristisch sind (siehe z.B. UK-Patent 2,119,804, durch Verweis hierin eingeschlossen), ansonsten aber durch das Entfernen oder die Änderung des Finger-Bereichs modifiziert sind.
  • Fachleute werden anerkennen, daß im Kontext der spezifischen Löschungen, die in der Praxis der vorliegenden Verfahren eingesetzt werden, "menschlicher Gewebeplasminogenaktivator", "Human-t-PA" Oder "natürlicher t-PA" durch mikrobielle oder Zellkulturen-Systeme erzeugten menschlichen extrinsischen (Gewebetyp-) Plasminogenaktivator in bioaktiven Formen bezeichnet, die einen Proteaseabschnitt umfassen und jenen Gewebeplasminogenaktivtatoren entsprechen, die ansonsten zu menschlichem Gewebe nativ sind. Das gemäß vorliegender Erfindung erzeugte menschliche Gewebeplasminogenaktivatorprotein ist durch bestimmtes DNA-Gen und deduktives Aminosäuresequenzieren definiert worden (siehe 1A–C). Es wird verstanden werden, daß natürliche allelische Variationen existieren und von Individuum zu Individuum auftreten. Diese Variationen können durch Aminosäuredifferenzen in der Gesamtsequenz oder durch Löschungen, Substitutionen, Einfügungen, Inversionen oder Hinzufügungen von Aminosäuren in der genannten Sequenz gezeigt werden. Außerdem hängen die Stelle und das Ausmaß der Glykosylierung von der Art der zellulären Wirtsumgebung ab.
  • Alle derartigen allelischen Variationen und Modifikationen, die zu Derivaten von menschlichem Gewebeplasminogenaktivator führen, die als biologische funktionelle Äquivalente von t-PA charakterisiert sind, fallen in den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung, ebenso wie andere verwandte menschliche extrinsische (Gewebetyp-) Plasminogenaktivatoren, die physikalisch und biologisch ähnlich sind, solange die wesentliche charakteristische Aktivität von menschlichem Gewebeplasminogenaktivator, was die Art betrifft, unbeeinflußt bleibt. Darüberhinaus ist bekannt, daß bestimmte Änderungen der Aminosäuresequenz vorgenommen werden können, ohne daß die zugrundeliegende biologische Funktion des Proteins geändert wird. Beispielsweise ist bekannt, daß Aminosäuren basierend auf einer Korrelation des Hydropathieindex der beiden ausgetauschten Aminosäuren mit verschiedenen anderen Aminosäuren ausgetauscht werden können.
  • Wie bei t-PA wird typischerweise t-PA-Variante gemäß vorliegender Erfindung hergestellt, (1) die Methionin als ihre erste Aminosäure aufweist (vorhanden dank der ATG-Startsignalkodon-Einfügung vor dem strukturellen Gen) oder (2) worin das Methionin intra- oder extrazellulär gespalten ist, das seine normalerweise erste Aminosäure aufweist, oder (3) gemeinsam mit entweder seinem Signalpolypeptid oder einem konjugierten Protein mit Ausnahme des herkömmlichen Signalpolypeptids, wobei das Signalpolypeptid oder Konjugat in einer intra- oder extrazellulären Umgebung spezifisch spaltbar ist, oder (4) durch direkte Expression in reifer Form ohne die Notwendigkeit des Abspaltens irgendeines äußeren, überflüssigen Polypeptids. Letzteres ist besonders wichtig, wenn ein bestimmter Wirt ein Signalpeptid nicht oder nicht wirksam entfernen kann, worin das Expressionsvehikel dazu konstruiert ist, den Gewebeplasminogenaktivator gemeinsam mit seinem Signalpeptid zu exprimieren. In jedem Fall wird die so hergestellte Human-t-PA-Variante in ihren verschiedenen Formen gewonnen und in einem Ausmaß gereinigt, das es für die Behandlung verschiedener Gefäßzustände oder -erkrankungen geeignet macht.
  • Weiters hat t-PA Formen, die sowohl das einkettige (nicht-proteaseresistente 1-kettige) Protein als auch das 2-kettige Protein umfassen. Das letztere wird proteolytisch von der nichtresistenten 1-kettigen Verbindung abgeleitet. Es gibt die Theorie, daß das 2-kettige an der Stelle der Umwandlung von Plasminogen in Plasmin auftritt. Die vorliegende Erfindung sorgt für die Verabreichung von 1-kettiger Proteinvariante, ob proteaseresistent oder nicht, oder für die Verabreichung von 2-kettigem Protein, bei dem auch gezeigt wurde, daß es wirksam ist. Das 2-kettige Protein kann durch proteolytische Umwandlung in vitro hergestellt werden, nachdem das nichtresistente 1-kettige Material hergestellt ist. Ein sogenannter "Kringle"-Bereich befindet sich stromaufwärts vom Serinproteaseabschnitt, und es wird angenommen, daß er wichtige Funktion bei der Bindung des Gewebeplasminogenaktivators gemäß vorliegender Erfindung an eine Fibrinmatrix spielt, und daher die beobachtete spezifische Aktivität des vorliegenden Gewebeplasminogenaktivators gegenüber greifbarer, bestehender Thrombi. Der Gewebeplasminogenaktivator gemäß vorliegender Erfindung wird hergestellt, sodaß er den enzymatisch aktiven Abschnitt enthält, der nativem Material entspricht, und der Begriff menschlicher Gewebeplasminogenaktivator definiert Produkte, die einen solchen Abschnitt allein oder gemeinsam mit zusätzlichen Aminosäuresequenzen bis zum Molekül mit voller Länge enthalten.
  • Mit "im wesentlichen reine Form" ist, wenn es verwendet wird, um den Zustand der erfindungsgemäß hergestellten Human-t-PA-Variante zu beschreiben, frei von Protein oder anderen Materialien gemeint, die normalerweise mit Human-t-PA assoziiert sind, wenn es durch nicht-rekombinante Zellen, das heißt in seiner "nativen" Umgebung erzeugt wird.
  • "DHFR-Protein" bezieht sich auf ein Protein, das fähig zur mit Dihydrofolatreduktase (DHFR) verbundenen Aktivität ist und das daher durch Zellen erzeugt werden muß, die zum überleben auf Medium fähig sind, dem Hypoxanthin, Glycin und Thymidin fehlt (-HGT-Medium). Im allgemeinen sind Zellen, denen DHFR-Medium fehlt, unfähig, auf diesem Medium zu wachsen, Zellen die DHFR-Protein enthalten, sind erfolgreich dabei. Aus diesem Grund stellt die Einbeziehung von DHFR-Kodierungssequenzen in rekombinante Vektoren gemäß vorliegender Erfindung eine Möglichkeit zur Auswahl erfolgreich transformierter Wirte dar.
  • "Gegenüber MTX empfindliche Zellen" bezieht sich auf Zellen, die unfähig sind, auf Medien zu wachsen, die das DHFR-Inhibitormethotrexat (MTX) enthalten. Somit sind "gegenüber MTX empfindliche Zellen" Zellen, die, wenn sie nicht genetisch verändert oder allenfalls ergänzt sind, unter für den Zelltyp geeigneten Umgebungs- und Mediumbedingungen nicht wachsen, wenn die MTX-Konzentration 0,2 μg/ml oder mehr beträgt. Einige Zellen, wie Bakterien, weisen aufgrund dessen, daß sie kein MTX innerhalb ihrer Zellgrenzen zulassen, keine MTX-Empfindlichkeit auf, obwohl sie DHFR enthalten, das ansonsten für dieses Arzneimittel empfindlich wäre. Somit sind im allgemeinen Zellen, die DHFR enthalten, nur dann empfindlich gegenüber Methotrexat, wenn sie für MTX durchlässig oder fähig zu deren Aufnahme sind.
  • "Wildtyp-DHFR" bezieht sich auf Dihydrofolatreduktase, wie sie üblicherweise im speziellen fraglichen Organismus zu finden ist. Wildtyp-DHFR ist im allgemeinen in vitro für geringe Konzentrationen an Methotrexat empfindlich.
  • "Expressionsvektor" umfaßt Vektoren, die fähig sind, darin enthaltene DNA-Sequenzen zu exprimieren, worin solche Sequenzen operabel mit anderen Sequenzen verbunden sind, die fähig sind, ihre Expression zu bewirken. Es wird impliziert, obwohl nicht immer explizit gesagt, daß diese Expressionsvektoren in den Wirtsorganismen entweder als Episome oder als ein integraler Teil der chromosomalen DNA replizierbar sein müssen.
  • Klarerweise würde ein Mangel an Replizierbarkeit sie effektiv nichtbetriebsfähig machen. In Summe hat "Expressionsvektor" eine funktionelle Definition, und jede DNA-Sequenz, die fähig ist, die Expression eines spezifizierten darin vorhandenen DNA-Codes zu bewirken, ist in diesem Begriff enthalten, wie er auf die spezifizierte Sequenz angewandt wird. Im allgemeinen liegen Expressionsvektoren, die bei rekombinanten DNA-Techniken von Nutzen sind, oft in der Form von "Plasmiden" vor, was sich auf zirkulare doppelstrangige DNA-Schleifen bezieht, die in ihrer Vektorform nicht an das Chromosom gebunden sind. In der vorliegenden Beschreibung werden "Plasmid" und "Vektor" austauschbar verwendet, da es sich beim Plasmid um die am häufigsten verwendete Vektorform handelt. Jedoch soll die Erfindung solche anderen Formen von Expressionsvektoren umfassen, die äquivalenten Funktionen dienen und in Folge hiervon nach dem Stand der Technik bekannt werden.
  • "Rekombinante Wirtszellen" bezieht sich auf Zellen, die mit Vektoren transformiert worden sind, die unter Einsatz rekombinanter DNA-Techniken konstruiert worden sind. Wie hierin definiert, wird t-PA-Variante in den Mengen produziert, die dank dieser Transformation erreicht werden, und nicht in solchen geringeren Mengen, oder allgemeiner in solchen nicht mehr nachweisbaren Mengen, wie sie durch den untransformierten Wirt erzeugt werden könnten. Durch solche Zellen erzeugter t-PA kann als "rekombinanter t-PA" bezeichnet werden.
  • Wie hierin verwendet, bezieht sich ein "biologisches funktionelles Äquivalent" von t-PA oder t-PA-Variante auf natürlichen t-PA oder t-PA-Varinate, worin die natürliche Sequenz (oder die entsprechende Sequenzvariante), beispielsweise wie in den 1A–1C dargestellt, durch eine ersetzt ist, die eine ähnliche biologische Funktion hat. Beispielsweise haben Kyte et al. (1982), "J.Mol.Biol." 157:105 herausgefunden, daß bestimmte Aminosäuren andere Aminosäuren mit einem ähnlichen Hydropathieindex oder Score bzw. Bewertung ersetzen können und dennoch eine ähnliche biologische Wirkung beibehalten. Wie in der nachstehenden Tabelle angeführt, wird Aminosäuren ein Hydropathieindex auf der Basis ihrer Hydrophobizität und Ladungseigenschaften zugewiesen. Es wird angenommen, daß der relative hydropathische Charakter der Aminosäure die sekundäre Struktur des resultierenden Proteins bestimmt, was wiederum die Interaktion des Proteins mit seinem Rezeptor definiert. Im Fall von t-PA wird angenommen, daß biologische funktionelle Äquivalente von t-PA durch Substitution von Aminosäuren mit ähnlichen Hydropathiewerten erhalten werden können. Wie hierin verwendet, ein biologisch funktionelles Äquivalent von t-PA oder t-PA-Variante bezogen auf die biologische Wirksamkeit. So kann beispielsweise Isoleucin, das einen Hydropathieindex von +4,5 aufweist, Valin (+4,2) oder Leucin (+3,8) ersetzen und dennoch ein Protein mit ähnlicher biologischer Wirkung erhalten werden. Alternativ dazu kann am anderen Ende der Skala Lysin (–3,9) Arginin (+4,5) ersetzen und so weiter. Im allgemeinen wird angenommen, daß Aminosäuren erfolgreich substituiert werden können, wo eine solche Aminosäure einen Hydropathiewert innerhalb etwa +/–1 Hydropathieindexeinheit der ersetzten Aminosäure aufweist.
    Aminosäure Hydropathieindex
    Isoleucin 4.5
    Valin 4.2
    Leucin 3.8
    Phenylalanin 2.8
    Zystein/Zystin 2.5
    Methionin 1.9
    Alanin 1.8
    Glycin –0.4
    Threonin –0.7
    Tryptophan –0.9
    Serin –0.8
    Tyrosin –1.3
    Prolin –1.6
    Histidin –3.2
    Glutaminsäure –3.5
    Glutamin –3.5
    Asparaginsäure –3.5
    Asparagin –3.5
    Lysin –3.9
    Arginin –4.5
  • a. Stellenspezifische Löschungsmutagenese
  • Wie oben besprochen, werden TPA-Varianten gemäß vorliegender Erfindung vorzugsweise durch spezifische Löschungsmutationen erzeugt. In der Praxis der vorliegenden Erfindung nützliche Löschungsmutanten werden am einfachsten durch die Verwendung spezifischer Oligonukleotidsequenzen gebildet, die für die DNA-Sequenz der gewünschten Löschungsverbindung kodieren, sowie eine ausreichende Anzahl benachbarter Nukleotide, um eine Primersequenz mit ausreichender Größe und Sequenzkomplexität zu schaffen, um ein stabiles Duplex an beiden Seiten der überquerten Löschungsverbindung zu bilden. Typischerweise wird ein Primer mit einer Länge von zumindest 27 Nukleotiden bevorzugt, mit etwa 10 Nukleotiden an der 5'-Seite der Verbindung und 17 an der 3'-Seite.
  • Demgemäß wird zur Herstellung der bevorzugten des (1-44) t-PA-Variante vorzugsweise ein Primer mit der Sequenz
    Figure 00220001
    eingesetzt. Jedoch ist offensichtlich, daß durch die Verwendung ähnlicher DNA-Primer jedes Ausmaß an Finger-Löschung erreicht werden kann. So würde man beispielsweise für Löschungsmutanten, die für zunehmende carboxy- und/oder aminoterminale Abschnitte des Finger-Bereichs kodieren, der obige Primer durch einen mit der Sequenz:
    Figure 00220002
    ersetzen und so weiter. So werden durch das "Abstufen" der Finger-Bereichslöschung von einer vollständigen Löschung (z.B. des 1-44) zu abnehmenden Löschungen (z.B. des 1-43, des 2-43, des 2-42 usw.) t-PA-Varianten mit bezogen auf natürlichen t-PA variierenden verbesserten pharmakokinetischen Parametern geschaffen. Die spezielle(n) Methodik, Reagenzien usw., die eingesetzt werden können, um verschiedene solche Löschungsvarianten herzustellen, wird unten in Verbindung mit Beispielen geoffenbart, die die Entwicklung von CVSVPA-N44 (D22) zeigen, ein Plasmid, das für des (1-44) t-PA kodiert, oder umfaßt nach dem Stand der Technik bekannte Techniken.
  • Demgemäß können geeignete Löschungsvarianten des t-PA-Gens auf diese allgemeine Art aus bekannten für t-PA kodierenden Vektoren hergestellt werden, welche Löschungsmutanten dann weiter eingesetzt werden können, um geeignete Wirte zu transformieren.
  • b. Wirtszellkulturen und Vektoren
  • Die hierin geoffenbarten Vektoren und Verfahren sind geeignet zur Verwendung in Wirtszellen über einen weiten Bereich prokaryoter und eukaryoter Organismen.
  • Im allgemeinen werden selbstverständlich Prokaryoten zum Klonieren von DNA-Sequenzen beim Konstruieren der erfindungsgemäß nützlichen Vektoren bevorzugt. Beispielsweise ist E.coli K12 Stamm 294 (ATCC Nr. 31446) besonders nützlich. Andere Mikrobenstämme, die verwendet werden können, umfassen E.coli-Stämme, wie E.coli B und E.coli X1776 (ATCC Nr. 31537). Diese Beispiele sollen selbstverständlich veranschaulichen und nicht einschränken.
  • Prokaryoten können ebenfalls zur Expression verwendet werden. Die obengenannten Stämme sowie E.coli W3110 (F-, λ-, prototroph, ATCC Nr. 273325), Bazillen wie Bacillus subtilus und andere Enterobacteriaceae, wie Salmonella typhimurium oder Serratia marcesans, und verschiedene Pseudomonasspezien können verwendet werden.
  • Im allgemeinen werden Plasmidvektoren, die Replikon- und Steuersequenzen enthalten, die von mit der Wirtszelle kompatiblen Zellen abgeleitet sind, in Verbindung mit diesen Wirten verwendet. Der Vektor trägt üblicherweise eine Replikationsstelle, sowie Markierungssequenzen, die fähig sind, für phänotypische Selektion in transformierten Zellen zu sorgen. Beispielsweise wird E.coli typischerweise unter Verwendung von pBR 322, eines von E.coli-Spezies abgeleiteten Plasmids, transformiert (siehe z.B. Bolivar et al., "Gene" 2:95 (1977)). pBR322 enthält Gene für Ampicillin- und Tetrazyklinresistenz und schafft so eine einfache Einrichtung zum Identifizieren transformierter Zellen. Das pBR 322-Plasmid oder anderes mikrobielles Plasmid oder Phage muß auch Promotoren enthalten, die vom Mikrobenorganismus zur Expression seiner eigenen Proteine verwendet werden können, oder so modifiziert sein, daß es sie enthält.
  • Zu den am häufigsten bei rekombinanter DNA-Konstruktion verwendeten Promotoren gehören B-Laktase(Penicillinase)- und Laktosepromotorsysteme (Chang et al., "Nature" 375:615 (1978); Itakura et al., "Science" 198:1056 (1917); Goeddel et al., "Nature" 281:544 (1979)) und ein Tryptophan(trp)-Promotorsystem, (Goeddel et al., "Nucleic Acids Res." 8:4057 (1980); EPO-Anmeldung Veröffentlichungsnr. 0036776). Während es sich dabei um die am häufigsten verwendeten handelt, sind auch andere mirkobielle Promotoren entdeckt und eingesetzt worden, und Details hinsichtlich ihrer Nukleotidsequenzen sind veröffentlicht worden, was es einem Fachmann ermöglicht, sie funktionell mit Plasmidvektoren zu ligieren (siehe z.B. Siebenlist et al., "Cell" 20: 269 (1980))
  • Zusätzlich zu Prokaryoten können auch eukaryote Mikroben wie Hefekulturen verwendet werden. Saccharomyces cerevisiae oder gewöhnliche Backhefe ist die am häufigsten verwendete von den eukaryoten Mikroorganismen, obwohl eine Anzahl anderer Stämme im allgemeinen erhältlich ist. Zur Expression in Saccharomyces wird im allgemeinen beispielsweise das Plasmid YRp7 (Stinchomb et al., "Nature" 282:39 (1979); Kingsman et al., "Gene" 7:141 (1979); Tschemper et al., "Gene" 10. 157 (1980)) verwendet. Dieses Plasmid enthält bereits das trpl-Gen, das eine Selektionsmarkierung für einen Mutantstamm von Hefe darstellt, dem die Fähigkeit zum Wachstum in Tryptophan fehlt, beispielsweise ATCC Nr. 44076 oder PEP4-1 (Jones, "Genetics", 85:12 (1977)). Die Gegenwart der trpl-Läsion als ein Charakteristikum für das Hefewirtszellgenom schafft dann eine wirksame Umgebung zum Nachweisen von Transformation durch das Wachstum in Abwesenheit von Tryptophan.
  • Zu geeigneten Promotorsequenzen in Hefevektoren gehören die Promotoren für 3-Phosphoglyceratkinase (Hitzeman et al., "J.Biol.Chem." 255:2073 (1980)) oder andere glykolytische Enzyme (Hess et al., "J.Adv.Enzyme Reg." 7:149 (1968); Holland et al., "Biochemistry", 17:4900 (1978)), wie Enolase, Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase, Hexokinase, Pyruvatdecarboxylase, Phosphofruktokinase, Glukose-6-phosphatisomerase, 3-Phosphoglyceratmutase, Pyruvatkinase, Triosephosphatisomerase, Phosphoglukoseisomerase und Glukokinase. Bei der Konstruktion geeigneter Expressionsplasmide werden die mit diesen Genen assoziierten Terminationssequenzen ebenfalls in den Expressionsvektor 3' von der Sequenz ligiert, die exprimiert werden soll, um für Polyadenylierung der mRNA und Termination zu sorgen. Andere Promotoren, die den zusätzlichen Vorteil der durch Wachstumsbedingungen gesteuerten Transkription haben, sind der Promotor-Bereich für Alkoholdehydrogenase 2, Isozytochrom C, Säurephosphatase, abbauende Enzyme, die mit Stickstoffstoffwechsel in Verbindung stehen, und die obengenannten Glyceraldehyd-3-Phosphatdehydrogenase, und Enzyme, die für Maltose- und Galaktoseeinsatz verantwortlich sind. Es ist jeder Plasmidvektor geeignet, der hefekompatiblen Promotor, Replikationsursprung und Terminationssequenzen enthält.
  • Zusätzlich zu Mikroorganismen können auch Kulturen von Zellen als Wirte verwendet werden, die von multizellulären Organismen abgeleitet sind. Im Prinzip ist jede solche Zellkultur einsetzbar, gleichgültig ob sie aus Wirbeltier- oder wirbelloser Kultur abgeleitet ist. Jedoch war das Interesse an Wirbeltierzellen am größten, und die Vermehrung von Wirbeltierzellen in Kultur (Gewebekultur) ist in den letzten Jahren ein Routineverfahren geworden |"Tissue Culture", Academic Press, Hrsg. Kruse and Patterson (1973)|. Beispiele für solche nützliche Wirtszellinien sind VERO- und HeLa-Zellen, Chinesische Hamster-Eierstock(CHO)-Zellinien und W138, BHK, COS-7 und MDCK-Zellinien. Expressionsvektoren für solche Zellen enthalten üblicherweise (wenn notwendig) einen Replikationsursprung, einen vor dem zu exprimierenden Gen angeordneten Promotor, gemeinsam mit allen notwendigen Ribosombindungsstellen, RNA-Spleißstellen, Polyadenylierungsstelle und Transkriptionsterminatorsequenzen.
  • Zur Verwendung in Säugetierzellen liefert virales Material oft die Steuerfunktionen über die Expressionsvektoren. Beispielsweise sind die üblicherweise verwendeten Promotoren von Polyoma, Adenovirus 2 und am häufigsten Affen Virus 40 (SV40) abgeleitet. Die frühen und späten Promotoren von SV40-Virus sind besonders nützlich, da beide leicht aus dem Virus als ein Fragment erhalten werden, das auch den viralen SV40-Replikationsursprung enthält (Fiers et al., "Nature", 273:113(1978)). Es können auch kleinere oder größere SV40-Fragmente verwendet werden, vorausgesetzt, daß die Sequenz mit etwa 250 bp enthalten ist, die sich von der Hind III-Stelle zur Bgl I-Stelle hin erstreckt, die im viralen Replikationsursprung angeordnet ist. Weiters ist es auch möglich und oft wünschenswert, Promotor- oder Steuersequenzen einzusetzen, die normalerweise mit der gewünschten Gesequenz assoziiert sind, vorausgesetzt, daß solche Kontrollsequenzen mit den Wirtszellsystemen kompatibel sind.
  • Ein Replikationsursprung kann entweder durch Konstruktion des Vektors geschaffen werden, sodaß er einen exogenen Ursprung enthält, wie er von SV40 oder einer anderen viralen (z.B. Polyoma-, Adeno-, VSV-, BPV-) Quelle abgeleitet werden kann, oder kann vom chromosomalen Wirtszellenreplikationsmechanismus geschaffen werden. Wenn der Vektor in das Wirtszellenchromosom integriert ist, ist letzteres oft ausreichend.
  • Bei der Auswahl einer bevorzugten Wirtszelle zur Transfektion durch die erfindungsgemäßen Vektoren, die DNA-Sequenzen umfassen, die sowohl für t-PA-Variante als auch DHFR-Protein kodieren, ist angemessen, den Wirt je nach dem Typ des verwendeten DHFR-Proteins auszuwählen. Wenn Wildtyp-DHFR-Protein eingesetzt wird, ist es vorzuziehen, eine Wirtszelle auszuwählen, der DHFR fehlt, wodurch die Verwendung der DHFR-Kodierungssequenz als Markierung für die erfolgreiche Transfektion in selektivem Medium ermöglicht wird, dem Hypoxanthin, Glycin und Thymidin fehlt. Eine geeignete Wirtszelle ist in diesem Fall die Chinesischer Hamster-Eierstock(CHO)-Zellinie, der DHFR-Aktivität fehlt, hergestellt und vermehrt, wie von Urlaub und Chasin, "Proc.Natl.Acad.Sci." (USA) 77:4216 (1980) beschrieben.
  • Wenn andererseits DHFR-Protein mit geringer Bindungsaffinität für MTX als die Steuersequenz verwendet wird, ist es nicht notwendig, Zellen mit DHFR-Defizienz zu verwenden. Da die mutante DHFR gegen Methotrexat resistent ist, kann MTX enthaltendes Medium als ein Mittel zur Selektion verwendet werden, vorausgesetzt, daß die Wirtszellen selbst methotrexatempfindlich sind. Die meisten eukaryoten Zellen, die zum Absorbieren von MTX fähig sind, scheinen methotrexatempfindlich zu sein. Eine solche nützliche Zellinie ist eine CHO-Linie, CHO-K1 ATCC Nr. CCL 61.
  • Zufriedenstellende Mengen an Human-t-PA werden durch Zellkulturen hergestellt, jedoch dienen Verfeinerungen unter Verwendung einer sekundären Kodierungssequenz zur noch weiteren Erhöhung der Produktionsmengen. Die sekundäre Kodierungssequenz umfaßt Dihydrofolatreduktase (DHFR), die von einem extern gesteuerten Parameter, wie Methotrexat, beeinflußt wird, wodurch die Steuerung der Expression durch die Steuerung der Methotrexat(MTX)-Konzentration ermöglicht wird.
  • c. Verwendete Verfahren
  • Wenn Zellen ohne unüberwindliche Zellmembranbarrieren als Wirtszellen verwendet werden, wird die Transfektion nach dem Kalziumphosphat-Ausfällungsverfahren durchgeführt, wie von Graham und Van der Eb, Virology, 52:546 (1978) beschrieben. Jedoch können auch andere Verfahren zum Einbringen von DNA in Zellen verwendet werden, wie durch Nuklearinjektion oder Protoplastfusion.
  • Wenn prokaryote Zellen oder Zellen, die wesentliche Zellwandkonstruktionen enthalten, verwendet werden, ist das bevorzugte Verfahren zur Transfektion Kalziumbehandlung unter Verwendung von Kalziumchlorid, wie von Cohen, F.N. et al., "Proc.Natl.Acad.Sci." (USA) 69:2110 (1972) beschrieben.
  • Bei der Konstruktion geeigneter Vektoren, welche die gewünschten Kodierungs- und Steuersequenzen enthalten, werden Standardligationstechniken eingesetzt. Isolierte Plasmide oder DNA-Fragmente werden gespalten, zugeschnitten und in der gewünschten Form religiert, um die erforderlichen Plasmide zu bilden.
  • Spaltung wird durch Behandlung mit Restriktionsenzym (oder -enzymen) in einem geeigneten Puffer durchgeführt. Im allgemeinen wird etwa 1 μg Plasmid oder DNA-Fragmente mit etwa 1 Einheit Enzym in etwa 20 μl Pufferlösung verwendet. (Geeignete Puffer und Substratmengen für spezielle Restriktionsenzyme sind vom Hersteller angegeben.) Inkubationszeiten von etwa 1 Stunde bei 37° sind einsetzbar. Nach den Inkubationen wird Protein durch Extraktion mit Phenol und Chloroform entfernt, und die Nukleinsäure wird aus der wässerigen Fraktion durch Ausfällung mit Äthanol gewonnen.
  • Wenn stumpfe Enden erforderlich sind, wird das Präparat 15 Minuten lang bei 15°C mit 10 Einheiten Polymerase I (Klenow) behandelt, mit Phenol-Chloroform extrahiert und mit Äthanol ausgefällt.
  • Größentrennung der gespaltenen Fragmente wird unter Verwendung von 6%-igem Polyacrylamidgel, wie von Goeddel, D., et al., "Nucleic Acids Res.", 8:4057 (1980) beschrieben, durchgeführt.
  • Zur Ligation werden in etwa äquimolare Mengen der gewünschten Bestandteile, mit auf geeignete Weise zugeschnittenen Enden, um für korrektes Zusammenpassen zu sorgen, mit etwa 10 Einheiten T4 DNA-Ligase pro 0,5 μg DNA behandelt. (Wenn gespaltene Vektoren als Bestandteile verwendet werden, kann es nützlich sein, erneute Ligation des gespaltenen Vektors durch Vorbehandlung mit bakterieller alkalischer Phosphatase zu verhindern.)
  • Wie oben besprochen, werden erfindungsgemäße t-PA-Varianten vorzugsweise durch spezifische Löschungsmutation erzeugt. Löschungsmutanten, die in der Praxis der vorliegenden Erfindung nützlich sind, werden am leichtesten durch die Verwendung von spezifischen Oligonukleotidsequenzen gebildet, die für die DNA-Sequenz der gewünschten Löschungsverbindungen kodieren, sowie eine ausreichende Anzahl angrenzender Nukleotide, um eine Sequenz mit ausreichender Größe und Sequenzkomplexität zu schaffen, um ein stabiles Duplex an beiden Seiten der überquerton Löschungsverbindung zu bilden.
  • Zur Analyse zur Bestätigung der korrekten Sequenzen in konstruierten Plasmiden werden die Ligationsmischungen verwendet, um E.coli K 12 Stamm 294 (ATCC 31446) zu transformieren, und erfolgreiche Transformanten durch Ampicillin- oder Tetracyclinresistenz ausgewählt, wo angemessen. Plasmide von den Transformanten werden hergestellt, durch Restriktion analysiert und/oder nach dem Verfahren von Messing et al., "Nucleic Acids Res.", 9:309 (1981) oder nach dem Verfahren von Maxam et al., "Methods of Enzymology" 65:499 (1980) sequenziert.
  • Verstärkung der DHFR-Proteinkodierungssequenzen wird durch Züchten von Wirtszellkulturen in der Gegenwart von etwa 20–500.000 nM-Konzentrationen an Methotrexat, einem kompetitiven Inhibitor von DHFR-Aktivität, bewirkt. Der tatsächliche Konzentrationsbereich hängt natürlich in hohem Maß von der Art des DHFR-Gens, dem Protein und den Eigenschaften des Wirts ab. Klarerweise können allgemein definierte Ober- und Untergrenzen nicht verifiziert werden. Geeignete Konzentrationen anderer Folsäureanaloga oder anderer Verbindungen, die DHFR hemmen, könnten ebenfalls verwendet werden. MTX selbst ist jedoch zweckmäßig, leicht verfügbar und wirksam.
  • In den folgenden Beispielen werden bevorzugte Ausführungsformen in Form von Versuchen geoffenbart, die von den Anmeldern durchgeführt wurden, um die Praxis und überraschende Nützlichkeit der vorliegenden Erfindung darzulegen bzw. nachzuweisen. Fachleute werden feststellen, daß es sich bei den Verfahren. um jene handelt, die für die praktische Durchführung der Erfindung gut geeignet sind, und daß diese Versuche solcherart keineswegs das einzige Mittel zur Erreichung der Vorteile der Erfindung darstellen.
  • BEISPIEL I
  • HERSTELLUNG VON DES (1-44) HUMAN-t-PA-VARIANTE
  • Wie oben kurz erörtert, er Folgt das zweckmäßigste Verfahren zum Einbringen von spezifischen Löschungen in den Finger-Bereich von natürlichem t-PA durch stellenspezifische Löschungsmutagenese der zugrundeliegenden cDNA-Gensequenzen. Bei diesem Verfahren wird eine einstrangige synthetische "Primer"-Sequenz eingesetzt, die für die gewünschte neue Sequenz kodiert. Der neue Primer wird an eine einzelstrangige Schablone hybridisiert, die komplementäre Sequenzen trägt, typischerweise eine Schablone, die für das Gen kodiert, von dem Sequenzen zu löschen sind. Nachdem der Primer durch die Verwendung einer DNA-Polymerase verlängert worden ist, läßt man das Hybridmolekül in einem geeigneten Wirt replizieren.
  • Um einen des (1-44) t-PA-Mutanten herzustellen, wurde stellengerichtete Löschungsmutagenese unter Verwendung eines Ausgangsplasmids praktiziert, das für das Struktur-t-PA-cDNA-Gen und einen Teil des 3'-untranslatierten Bereichs kodiert. Die Herstellung dieses Plasmids, pPADHFR-6 (auch als pETPFR bezeichnet), sowie Bedingungen für seine Expression in geeigneten Wirten und die Reinigung des resultierenden Proteins wird im Detail in der EPO-Anmeldung Veröffentlichungsnr. 093,619 beschrieben, die hierin durch Verweis eingeschlossen ist. Ein schematisches Diagramm der Schritte, die bei der Durchführung der Löschung gesetzt werden, wird in 2 gezeigt. Die verwendete zugrundeliegende Methodik wird in Adelman et al. (1983), DNA 2:183, geoffenbart, das hierin durch Verweis eingeschlossen ist.
  • Plasmid pPADHFR-6 wurde mit StuI und EcoRI digeriert, um ein Fragment mit 826 Basenpaaren freizusetzen, das Sequenzen enthielt, die für die t-PA-Präsequenz bis Aminosäure 203 kodieren. Dieses Fragment wurde mit dem Vektorfragment von SmaI/EcoRI-digeriertem M13mp10RF ligiert, einem M13-Phagenvektor in replikativer Form (siehe z.B. Messing et al., "Third Cleveland Symposium on Macromolecules Recombinant DNA", Hrsg. A.Walton, Elsevier, Amsterdam (1981)). Das Zwischenplasmid, pPA-N44intA, war somit eine replikative Form von M13-Phage, die den Abschnitt des t-PA-Gens umfaßte, von dem die Kodone für die Aminosäuren 1-44 durch stellengerichtete Löschungsmutagenese zu entfernen waren.
  • Um die Mutagenese durchzuführen, wurde ein Oligonukleotidprimer nach einem Verfahren wie dem Phosphotriesterverfahren von Crea et al., (1978), "Proc.Natl.Acad.Sci." USA, 75:5765, hergestellt. Der zur Herstellung eines des (1-44)-Mutanten verwendete Primer war der folgende:
  • Figure 00310001
  • Wie anerkannt werden wird, kodieren die 10 5'-Nukleotide dieses Primers für die Präsequenzaminosäuren -3 bis -1 (gly-ala-arg), während die 17 3'-Nukleotide für die Aminosäuren 45 bis 49 (SER-VAL-PRO-VAL-LYS) kodieren. Es ist festzustellen, daß das "TCT"-Kodon für Serin-45 eingesetzt wurde, um die BglII-Stelle beizubehalten.
  • Etwa 200 mg des synthetischen Oligonukleotids wurden 30 Minuten lang bei 37°C in 30 μl 50 mM-Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl2, 10 mM Dithiothreitol, 1 mM ATP, das etwa 8 E T4-Polynukleotidkinase enthält, phosphoryliert. Zur Heteroduplexbildung wurden etwa 50 ng einstrangiges pPA-N44intA auf 95°C erwärmt (10 min), und langsam auf Raumtemperatur (30 min), dann auf 4°C abgekühlt, und zwar in etwa 40 μl 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl2, 1 mM Dithiothreitol, das 100 ng des phosphorylierten Primers entielt. Primerverlängerung wurde durch das Hinzufügen von 10 μl Ligasepuffer in Gang gesetzt, der 2 mM ATP, je 0,25 mM dGTP, dCTP, dATP, dTTP, 5 E E.coli Polymerase I großes (Klenow-) Fragment und 400 E T4 DNA-Ligase enthielt. Nach einer Stunde bei 15°C wurde die Reaktionsmischung verwendet, um JM101-Zellen zu transformieren.
  • Die Transformation wurde durchgeführt, indem die gesamte Ligationsmischung mit 200 μl kompetenten JM101-Zellen gemischt wurde, gefolgt von Inkubation auf Eis für 30' und 5' bei 37°C. Dann wurden 3,5 ml 2YT-Topagar bei 55' mit 200 μl der phagengesättigten Zellen, 10 μl IPTG (200 mM) und 50 μl X gal gemischt, und nach dem Hinzufügen wurden die Zellen auf Petri-Schalen aufgebracht, die 2YT ohne Arzneimittel enthielten.
  • Farblose Plaques wurden entnommen und auf eine Mikrotiterschale übertragen, die 100 μl 2YT-Medium enthielt. Die geimpften Mikrotiterfluids wurden auf LB-Agarplatten mit 15 cm Durchmesser aufgeprägt, die mit einem Rase aus 500 μl JM1O1-Zellen in 8 ml 2YT-Topagar bedeckt waren, und über Nacht bei 37°C inkubiert. Die gebildeten Plaques wurden durch 1 minütigen physischen Kontakt auf eine Nitrozellulosescheibe übertragen. Die Nitrozellulosescheibe wurde mit 0,5 M NaOH, 1,5 M NaCl 3 Minuten lang behandelt und zweimal mit 3 M NaCl-0,5 M Tris HCl, pH 7,5 15 Minuten lang und dann mit 2X SSC 15 Minuten lang gewaschen. Die Prähybridisierungsmischung enthält 10 mM Tris pH 7,5, 5 mM EDTA, 0,9 M NaCl, 1XDenhardt 0,5% NP40, 100 μM ATP, 1 mM Natriumpyrophosphat, 1 mM Natriumphosphat und 50 μg/ml E.coli tRNA. 1X Denhardt-Lösung enthält pro Liter 200 mg Ficoll, 277 mg Polyvinylpyrrolidon, 200 mg Rinderserumalbumin (BSA; Fraktion V). Die Scheibe wurde bei 80°C im Vakuum 90 Minuten lang gebacken. Die Scheibe wurde dann 3 Stunden lang mit 6 ml Prähybridisierungsfluid in einer Petri-Schale inkubiert, gefolgt vom Hinzufügen von 5×106 cpm markiertem Primer und über Nacht hybridisiert. Selektives Waschen der Scheibe wurde mit 0,4X SSC bei 49°C durchgeführt, und nach dem Lufttrocknen wurde die Scheibe Röntgenfilm ausgesetzt. Positiv hybridisierende Klone wurden durch Didesoxysequenzieren weiter analysiert. Siehe Adelman, ebd. Aus den positiven Kolonien wurde ein rekombinantes Plasmid mit der Bezeichnung pPA-N44intA delta ausgewählt, das die richtige Löschung aufwies.
  • Um die Mutantgensequenz vom M13-Phagen wieder in den richtigen Expressionskontext in den DHFR-hältigen Expressionsvektor zu setzen, wurde Plasmid pPADHFR6 gesondert mit BglI/KpnI, um das große Fragment zu isolieren, das für das DHFR-Gen kodiert, und BstXI/KpnI digeriert, um ein Fragment mit 2240 Basen zu isolieren, das für das 3'-Ende (Aminosäuren 45-527) von natürlichem t-PA kodiert. Ein 400 Basen-Fragment, das die N44-Mutation trägt, wurde durch Digestion mit BglII/BstX1 aus pPA-N44intA-delta isoliert und mit den beiden von pPADHFR6 abgeleiteten Fragmenten zusammen ligiert. Das als CVSVPA-N44 D22 bezeichnete Produkt dieser Ligation war somit eine Kopie des parentalen Plasmids pPADHFR6, mit der Ausnahme, daß die für die Aminosäuren 1-44 kandierenden Kodone entfernt waren.
  • BEISPIEL II
  • TRANSFEKTION VON CHO-ZELLEN MIT CVSVPA-N44 (D22)
  • Das rekombinante Plasmid CVSVPA-N44 (D22) wurde in DHFR-CHO-Zellen exprimiert, die wie oben erörtert hergestellt wurden. Die CHO-Zellen wurden bis zu etwa 75% Konfluenz gezüchtet und mit etwa 2 μg Plasmid-DNA (etwa 1/2 normales Miniscreen) transfiziert, die zuvor RNase in Tris-EDTA-Puffer unterworfen worden war. Die DNA wurde zur 50 mM CaPO4/HEPES gebracht, und dieses Material wurde verwendet, um die Zellen allgemein nach dem Verfahren von Graham et al. (1978), "Virology", 52:546 zu transfizieren. Kurz gesagt wurde das Medium von den Einschicht-Zellen in einer 100 mm Kulturschale entfernt und durch etwa 5 ml Ham's F12-Medium mit 10% FCS ersetzt. Die kalziumausgefällte DNA wurde auf die Zellen gegeben und bei 37°C zwei Stunden lang belassen.
  • Nach etwa 2 Stunden wurden die Zellen durch Entfernen des alten Mediums und Hinzufügen von 1 ml Schocklösung (20% Glycerin in PBS) etwa 45 Sekunden lang Glycerinschock unterworfen. Die Zellen wurden dann mit F12-Medium gewaschen, um Glycerin zu entfernen, und etwa 48 Stunden lang wieder mit frischem Medium versorgt. An diesem Punkt wurden die Zellen etwa 1/10 geteilt und wieder auf selektives Medium gesetzt (Ham's F12, G-, H-, T-, mit 10% ausgiebig dialysiertem FCS). Nach dem Plattieren auf selektivem Medium wurden die Zellen eingefroren, bis sie zur Herstellung von Des (1-44) t-PA verwendet wurden.
  • BEISPIEL III
  • HERSTELLUNG VON DES (1-44) HUMAN-t-PA
  • Des 1-44-t-PA wurde wie oben besprochen in Chinesischen Hamster-Eierstock(CHO)-Zellen exprimiert. Die Überstände wurden gesammelt, filtriert und bei –20°C in der Gegenwart von Aprotinin gelagert. Der t-PA wurde aus Zellüberständen unter Verwendung veröffentlichter Arbeitsweisen (siehe z.B. GB-PS-2,119,804; EPO-Anmeldung Veröffentlichungsnr. 041,766, 0,93,619 oder 0,199,574, alle durch Verweis hierin eingeschlossen) oder einer Säule mit monoklonalem Antikörper gereinigt. Insbesondere wurden transformierte CHO-Zellen in Rollflaschen in F12-Medium, das 10% FBS, 600 mM MTX, 200 mM Glutamin, 20 mM Hepes, 100 E/ml Pen-strep enthielt, bis zur Konfluenz gezüchtet, woraufhin das Medium durch serumfreies Medium ersetzt wurde und die Inkubation 5–6 Tage lang fortgesetzt wurde. Die Zellen wurden abgetrennt und der Überstand über eine Zn-chelatierende Säule geschickt (siehe z.B. EP-Veröffentlichung 0,199,574) und mit 2 Säulenvolumina 1M NaCl, 50 nM Tris, pH 8,0, gewaschen. Die t-PA-Variante wurde dann mit dem gleichen Puffer eluiert, der 50 mM Imidazol enthielt, und Aktivität aufweisende Röhrchen wurden gepoolt.
  • Dieses Material wurde dann in 25 mM Tris, 0,5 M NaCl, pH 8,0, dialysiert, und über eine Lysin-Sepharose-Säule geschickt. Nach dem Waschen mit 2 Säulenvolumina an 0,8 M NaCl, 40 mM NaPO4, wurde es mit 50 mM NaPO4, 0,2 M Arginin, pH 7,2–7,4, eluiert. Obwohl die Argininkonzentration, die erforderlich war, um des 1-44 t-PA aus Lysin-Agarose zu eluieren, der Konzentration zum Eluieren von t-PA mit normaler Sequenz ähnlich war, war es notwendig, die Säule sehr langsam mit des 1-44 t-PA zu beschicken, um seine Bindung zu gewährleisten.
  • Die Proteinkonzentrationen wurden durch ein ELISA-Verfahren bestimmt und Für die Aminosäureanalyse von sowohl des 1-44 t-PA als auch t-PA mit normaler Sequenz genormt. Proteinreinheit und -homogenität wurden durch N-terminales Sequenzieren auf einem Prototyp Gas/Flüssigphasen-Sequenziergerät analysiert, und durch Polyacrylamidgelelektrophorese in der Gegenwart von Natriumdodecylsulfat (PAGE-SDS) mit dem Puffersystem von Laemmli (1970), "Nature", 227:680. Typscherweise wurden 7 bis 17% Gradientgels verwendet, und Proteine wurden mit der Silberfärbungstechnik von Morrissey (1981), "Anal.Biochem." 117:307, sichtbar gemacht. t-PA mit natürlicher Sequenz wurde auf ähnliche Art exprimiert und gereinigt.
  • Sowohl t-PA als auch des 1-44 t-PA wurden unter Verwendung identischer Techniken bis zur Homogenität gereinigt, und jedes Protein wies bei SDS-PAGE das erwartete Molekulargewicht auf. Obwohl als eine Polypeptidkette synthetisiert, kann nichtresistenter einkettiger t-PA an der Arg275-Ile276-Peptidbindung leicht hydrolysiert werden, um eine zweikettige Form zu ergeben. 3 zeigt, daß in der Abwesenheit von Reduktionsmitteln die scheinbaren Mr's von t-PA und des 1-44 t-PA etwa 60.000 bzw. 55.000 sind. Wenn die zweikettigen Formen der Proteine durch das Hinzufügen von Dithiothreitol reduziert wurden, wies t-PA Bänder mit etwa 35.000 Dalton und ein diffuses Band von etwa 30.000 bis 34.000 Dalton auf, was dem Proteaseabschnitt des Moleküls (Reste 275-527) bzw. den aminoterminalen Finger-, Wachstumsfaktor- und Kringle-Bereichen (Reste 1-275) entspricht. Des 1-44 t-Pa wies Bänder mit Mr's von etwa 35.000 und ein diffuses Band von etwa 25.000 bis 30.000 auf, was einem Proteaseabschnitt entspricht, der mit dem in t-PA identisch ist, und einem aminoterminalen Bereich mit einem geringeren Molekulargewicht als der entsprechende Bereich in t-PA. Die Identifizierung dieser Bänder wurde durch ein Western-blot-Verfahren unter Verwendung von Antikörpern gegen die aminoterminale Hälfte von t-PA bestätigt.
  • Aminoterminales Sequenzieren von Proben von beiden Proteinen zeigte, daß jedes Protein eine Nebensequenz I-K-G aufwies, die den Resten 276-278 entspricht, was darauf hindeutet, daß die Proben in der zweikettigen Form vorlagen. Die andere Hauptsequenz in der t-PA-Probe war S-Y-Q, was den Resten 1-3 entspricht. In des 1-44 t-PA war die Hauptsequenz S-V-P, was den Resten 45-47 entspricht und bestätigt, daß der Finger-Bereich (Reste 1-44) gelöscht wurde und daß das Mutantprotein mit Rest 45 als dem neuen Aminoterminus richtig exprimiert und verarbeitet wurde.
  • Obwohl die Ergebnisse von SDS-PAGE und Sequenzanalyse bestätigten, daß des 1-44 t-PA ein homogenes Protein mit dem/der erwarteten Molekulargewicht und Sequenz war, kann die Löschung eines Bereichs des Proteins deutliche Wirkungen auf die Struktur und Faltung des Rests des Moleküls haben. Obwohl keine direkten Tests verfügbar sind, um die sekundäre und tertiäre Struktur am Molekül zu untersuchen, wurde ermittelt, daß begrenzte Proteolyse falsch gefaltete Moleküle effizient identifiziert. Beim Vergleich der Abbaumuster von trypsinbehandeltem t-PA und des 1-44 t-PA wurden keins Unterschiede beobachtet (4). Obwohl der aminoterminale Bereich in den des 1-44 t-PA-Proben (siehe 4) ein geringeres Molekulargewicht als der entsprechende Bereich in t-PA hat, war weder die Protease noch der aminoterminale Bereich von des 1-44 t-PA mehr für Proteolyse durch Trypsin anfällig. Proteolyse mit höheren Trypsin-t-PA-Verhältnissen und mehreren Verhältnissen von Chymotrypsin und Pepsin zu t-PA zeigte ebenfalls keine Differenzen in der Proteolyserate.
  • BEISPIEL IV
  • HERSTELLUNG UND EINSATZ VON EXPRESSIONSVEKTOR ZUR REKOMBINANTEN PRODUKTION VON ERFINDUNGSGEMÄSSEN DES 1-44 GLU 275 t-PA VARIANTEN
  • 1. Plasmidkonstruktionen
  • a. Plasmid p1154
  • 1) Plasmid pPADHFR-6
  • Plasmid pPADHFR-6 (ansonsten als pETPFR bezeichnet) wurde hergestellt, wie beispielsweise in der EP-A-93619, oben, beschrieben, die hiermit durch Verweis eingeschlossen ist, siehe 1 für perspetivische Details. Überreichlich ist dieses Plasmid an sich und in transfizierter Form in CHO-Zellen am 15. Dezember 1987 unter den ATCC-Nummern 40403 bzw. CRL 9606 bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA, hinterlegt worden.
  • 2) Plasmid pCVSVPA-N44 D22
  • Plasmid pCVSVPA-N44 D22 wurde wie oben beschrieben hergestellt. Um zu rekapitulieren wurden Plasmid pPADHFR-6 (oben) mit StuI und EcoRI digeriert, um ein Fragment mit 826 bp freizusetzen, das Sequenzen enthielt, die für die t-PA-Präsequenz bis Aminosäure 203 kodieren. Dieses Fragment wurde mit dem Vektorfragment von SmaI/EcoRI-digeriertem M13mp10RF, dem M13-Phagenvektor in replikativer Form, ligiert. (siehe z.B. Messing et al., "Third Cleveland Symposium on Macromolecules Recombinant DNA", Hrsg. A. Walton, Elsvier, Amsterdam (1981)). Das Zwischenstufenplasmid, pPA-N44intA, war somit eine replikative Form von M13 Phage, die den Abschnitt des t-PA-Gens enthielt, von dem die Kodone für die Aminosäuren 1-44 durch stellengerichtete Löschungsmutagenese zu entfernen waren.
  • Um die Mutagenese durchzuführen, wurde ein Oligonukleotidprimer nach einem Verfahren wie dem Phosphotriesterverfahren von Crea et al., "Proc.Natl.Acad.Sci. (USA) 75, 6765 (1978) hergestellt. Der zur Herstellung eines des (1-44)-Mutanten eingesetzte Primer war der folgende:
  • Figure 00370001
  • Wie anerkannt werden wird, kodieren die zehn 5'-Nukleotide dieses Primers für die Präsequenzaminosäuren -3 bis -1 (gly-ala-arg), während die 17 3'-Nukleotide für die Aminosäuren 45 bis 49 (SER-VAL-PRO-VAL-LYS) kodieren. Es ist anzumerken, daß das "TCT"-Kodon für Serin-45 eingesetzt wurde, um die BglII-Stelle beizubehalten.
  • Etwa 200 mg des synthetischen Oligonukleotids wurden 30 Minuten lang bei 37°C in 30 μl 50 mM-Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl2, 10 mM Dithiothreitol, 1 mM ATP phosphoryliert, das etwa 8 E T4-Polynukleotidkinase enthielt. Zur Heteroduplexbildung wurden etwa 50 ng einstrangiger pPA-N44intA auf 95°C erwärmt (10 min), und langsam auf Raumtemperatur (30 min) und dann auf 4°C abgekühlt, und zwar in etwa 40 μl 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl2, 1 mM Dithiothreitol, das 100 ng des phosphorylierten Primers enthielt. Primerverlängerung wurde durch das Hinzufügen von 10 μl Ligasepuffer in Gang gesetzt, der 2 mM ATP, jeweils 0,25 mM dGTP, dCTP, dATP, dTTP, 5 E E.coli Polymerase I großes (Klenow-) Fragment und 400 E T4-DNA-Ligase enthielt. Nach 1 Stunde bei 15°C wurde die Reaktionsmischung verwendet, um JM101-Zellen zu transformieren.
  • Die Transformation wurde durchgeführt, indem die gesamte Ligationsmischung mit 200 μl kompetenten JM101-Zellen gemischt wurde, gefolgt von Inkubation auf Eis für 30' und 5' bei 37°C. Dann wurden 3,5 ml 2YT-Topagar bei 55°C mit 200 μl der phagengesättigten Zellen, 10 μl IPTG (200 mM) Und 50 μl X gal gemischt, und nach dem Hinzufügen wurden die Zellen auf Petri-Schalen plattiert, die 2YT ohne Arzneimittel enthielten.
  • Farblose Plaques wurden entnommen und auf eine Mikrotiterschale übertragen, die 100 μl 2Y7-Medium enthielten. Die geimpften Mikrotiterfluids wurden auf LB-Agarplatten mit 15 cm Durchmesser geprägt, die mit einem Rasen aus 600 μl JM101-Zellen in 8 ml 2YT-Topagar bedeckt waren, und über Nacht bei 37°C inkubiert. Die gebildeten Plaques wurden dann durch einminütigem physischen Kontakt auf eine Nitrozellulosescheibe übertragen. Die Nitrozellulosescheibe wurde mit 0,5 M NaOH, 1,5 M NaCl 3 Minuten lang behandelt und zweimal mit 3 M NaCl-0,5 M Tris-HCl, pH 7,5, 15 Minuten lang und dann mit 2X SSC 15 Minuten lang gewaschen. Prähybridisierungsmischung enthält 10 mM Tris, pH 7,5, 5 mM EDTA, 0,9 M NaCl, 1X Denhardt 0,5% NP40, 100 μM ATP, 1 mM Natriumpyrophosphat, 1 mM Natriumphosphat und 50 ug/ml E.coli tRNA. 1X Denhardt-Lösung enthält pro Liter 200 mg Ficoll, 200 mg Polyvinylpyrrolidon, 200 mg Rinderserumalbumin (BSA; Fraktion V). Die Scheibe wurde bei 80°C im Vakuum 90 Minuten lang gebacken. Die Scheibe wurde dann 3 Stunden lang mit 6 ml PrähybridisierungsFluid in einer Petri-Schale inkubiert, gefolgt vom Hinzufügen von 5×106 cmp markiertem Primer, und über Nacht hybridisiert. Selektives Waschen der Scheibe wurde mit 0,4X SSC bei 49°C durchgeführt, und nach dem Lufttrocknen wurde die Scheibe Röntgenfilm ausgesetzt. Positiv hybridisierende Klone wurden weiter durch Didesoxysequenzieren analysiert. Siehe Adelman, oben. Aus den positiven Kolonien wurde ein als pPA-N44intA-delta bezeichnetes rekombinantes Plasmid ausgewählt, das die richtige Löschung enthielt.
  • Um die Mutantgensequenz vom M13-Phagen wieder in den richtigen Expressionskontext in den DHFR-hältigen Expressionsvektor zu stellen, wurde Plasmid pPADHFR-6 gesondert mit BglI/KpnI, um das für das DHFR-Gen kodierende große Fragment zu isolieren, und mit BStXI/KpnI digeriert, um ein Fragment mit 2240 Basen zu isolieren, das für das 3'-Ende (Aminosäuren 45-527) von natürlichem t-PA codiert. Ein Fragment mit 400 Basen, das die N44 (des 1-44)-Mutation trägt, wurde durch Digerieren mit BglII/BstXI aus pPA-N44intA-delta isoliert und gemeinsam mit den beiden von pPADHFR-6 abgeleiteten Fragmenten ligiert. Das Produkt dieser Ligation mit der Bezeichnung CVSVPA-N44 D22 war somit eine Kopie des Elternplasmids pPADHFR-6, mit der Ausnahme, daß die für die Aminosäuren 1-44 kodierenden Kodone entfernt waren.
  • 3) Plasmid pPADHFR-6 2C9
  • Plasmid pPADHFR-6 2C9 wurde hergestellt, wie beispielsweise in U.S.S.N. 07/071,506, eingereicht am 9. Juli 1987, und seinen Stammanmeldungen - siehe oben - beschrieben. Zusammenfassend wurde Human-t-PA-DNA von den Plasmiden pPADHFR-6 (auch als pETPFR bezeichnet) und pA25E10 erhalten. Die Herstellung dieser beiden t-PA-Plasmide wird in der EP-Anmeldung Veröffentlichungsnr. 093619, oben, beschrieben.
  • Plasmid pA25E10 enthält Sequenzen, die für die letzten 508 Aminosäuren des t-PA-Gens und 772 Basenpaare des 3'-untranslatierten Bereichs kodieren. Dieses Plasmid wurde mit SacI und BglII digeriert, um ein Fragment mit 744 Basenpaare herzustellen, das durch Standardmethoden wie zuvor beschrieben isoliert wurde. Dieses Fragment enthält die Kodone für t-PA-Aminosäuren 411 bis 527 und umfaßt einen Teil des 3'-untranslatierten Bereichs.
  • Plasmid pPADHFR-6 enthält das gesamte strukturelle Gen für t-PA und einen Teil des 3'-untranslatierten Bereichs. Dieses Plasmid wurde mit SacI und BglII digeriert, um ein Fragment mit 1.230 bp zu. erzeugen, das isoliert wurde. Dieses Fragment enthält Kodone für die ersten 410 Aminosäuren der reifen Form von t-PA.
  • Diese Fragmente wurden unter Verwendung von Standardverfahren miteinander ligiert und mit BglII digeriert. Ein Fragment mit 1.974 bp, das Kodone für die gesamte reife t-PA-Sequenz plus einen Teil des 3'-untranslatierten Bereichs enthielt, wurde isoliert. Doppelstrangiges M13mp8 (Messing, oben) wurde mit BamHI digeriert und an den BglII-digerierten t-PA angelagert, um M13mp8PABglII zu bilden. E.coli JM 101-Zellen (ATCC Nr. 33876) wurden. mit der doppelstrangigen replikativen Form von M13mp8PABglII transformiert. Die einstrangigen und doppelstrangigen (RF) Formen von M13mp8PABglII können aus E.coli JM 101-Zellen isoliert werden, die mit diesem Phagen infiziert sind. Die einstrangige Form wurde für die stellenspezifische Mutagenese von t-PA verwendet.
  • Das strukturelle Human-t-PA-Gen wurde durch stellenspezifische Mutagenese modifiziert, um t-PA mit Aminosäuresubstituion an der entsprechenden unterschiedlichen Position zu exprimieren. Ein synthetisches Oligonukleotid wurde hergestellt, wie nach dem Festphasenphosphotriesterverfahren von Crea et al. (oben). Unter den synthetischen Primern, die für solche stellenspezifische Mutagenese hergestellt und verwendet wurden, befanden sich:
  • Figure 00400001
  • Das in der Folge beschriebene Verfahren wurde verwendet, um unterschiedliche t-PA-Klone zu erzeugen, welche die mutierte Sequenz der synthetischen Primer enthalten. Das verwendete allgemeine Verfahren ist das von Adelman (oben), das hierin durch Verweis eingeschlossen ist. Beispielsweise wurde 3M13RF2C9 durch die Verwendung des obigen Primers erzeugt. Gereinigte M13 RF-DNA vom mutierten t-PA-Gen wurde aus E.coli JM101-Zellen hergestellt. In der Folge wurden DNA-Fragmente, die die mutierte t-PA-DNA-Sequenz enthielten, verwendet, um Expressionsvektoren für den mutierten t-PA zu konstruieren.
  • 50 ng eines synthetischen Oligonukleotids wurden 30 Minuten lang bei 37°C in 10 μl 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl2, 10 mM Dithiothreitol, 1 mM ATP, das 8 E T4-Polynukleotidkinase enthielt, phosphoryliert. Zur Verwendung als eine Sonde wurden 400 ng des synthetischen Oligonukleotids wie oben phosphoryliert, mit der Ausnahme, daß ATP durch 60 mCi |32-P|-ATP (3000 μCi/mmol ) ersetzt wurde, was zu etwa 50 bis 60 × 106 cpm/400 ng 24-mer führte. Zur Heteroduplexbildung wurden 10 ng einstrangiges M13mp8PABglII auf 95°C erwärmt (10 min), und langsam auf Raumtemperatur abgekühlt (30 min), und zwar in 40 μl 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl2, 1 mM Dithiothreitol, der 10 ng des phosphorylierten Primers und 50 ng EcoRI-digeriertes M13mp8PABglIIRF großes Fragment enthielt. Primerverlängerung wurde durch die Hinzufügung von 10 μl Ligasepuffer in Gang gesetzt, der 2 mM ATP, je 0,25 mM dGTP, dTTP, dCTP und dATP, 5 E E.coli DNA-Polymerase I großes Fragment und 400 E T4 DNA-Ligase enthielt. Nach einer Stunde bei 12°C wurde die Reaktionsmischung verwendet, um E.coli JM101-Zellen zu transformieren.
  • Die Transformation wurde erreicht, indem 10 μl der Ligationsmischung mit 200 μl kompetenter JM101-Zellen gemischt wurden, gefolgt von 30 minütiger Inkubation auf Eis und 5 minütiger bei 37°C. Dann wurden 3, ml 2YT-Topagar bei 55°C mit 200 μl gesättigten JM101-Zellen, 10 μl IPTG (200 mM) und 50 μl X gal gemischt, und nach dem Hinzufügen der transformierten Zellen 9 cm auf Petri-Schalen plattiert, die LB ohne Arzneimittel enthielten.
  • Farblose Plaques wurden entnommen und auf eine Mikrotiterschale übertragen, die 100 μl 2YT-Medium enthielt. Die geimpften Mikrotiterfluids wurden auf LB-Agarplatten mit 15 cm Durchmesser aufgedrückt, die mit einem Rasen aus 600 μl JM101-Zellen in 8 ml 2YT-Topagar überzogen waren, und über Nacht bei 37°C inkubiert. Die gebildeten Plaques wurden durch 1 minütigen physischen Kontakt auf eine Nitrozellulosescheibe übertragen. Die Nitrozellulosescheibe wurde mit 0,5 M NaOH, 1,5 M NaCl 3 Minuten lang behandelt und zweimal mit 3 M NaCl-0,5 M Tris-HCl, pH 7,5 15 Minuten lang und dann mit 2X SSC 15 Minuten lang gewaschen. Die Prähybridisierungsmischung enthält 10 mM Tris, pH 7,5, 5 mM EDTA, 0,9 M NaCl, 1X Denhardt 0,5% NP40, 100 μM ATP, 1 mM Natriumpyrophosphat, 1 mM Natriumphosphat und 50 μg/ml E.coli-tRNA. 1X Denhardt-Lösung enthält pro Liter 200 mg Ficoll, 200 mg Polyvinylpyrrolidon, 200 mg Rinderserumalbumin (BSA; Fraktion V). Die Scheibe wurde bei 80°C 90 Minuten lang im Vakuum gebacken. Die Scheibe wurde dann 3 Stunden lang mit 6 ml Prähybridisierungsfluid in einer Petri-Schale inkubiert, gefolgt vom Hinzufügen von 5×106 cpm markiertem Primer, und über Nacht hybridisiert. Selektives Waschen der Scheibe wurde mit 0,4X SSC bei 49°C durchgeführt, und nach dem Lufttrocknen wurde die Scheibe Röntgenfilm ausgesetzt. Positiv hybridisierende Klone wurden durch Didesoxysequenzieren weiter analysiert. Siehe Adelman (oben).
  • Als Fragment 1 bezeichnetes Vektorfragment wurde erhalten, indem das durch Digestion von pPADHFR-6 mit BglII und BstEII erzeugte große Fragment isoliert wurde. Ein als Fragment 2 bezeichnetes Fragment wurde erhalten, indem das 400 bp-t-PA-Fragment isoliert wurde, das durch Digestion von pPADHFR-6 mit BglII und Bst XI gewonnen wurde. Ein t-PA-Fragment mit 1.141 bp, das die gewünschten Mutationen enthielt (Fragment 3) wurde durch das Digerieren von RF-DNA aus den Mutant-t-PA-Klonen (oben) mit BstXI und BstEII erhalten. Die Fragmente 1 und 2 wurden jeweils mit Fragment 3 ligiert. Die DNA-Mischungen wurden verwendet, um E.coli zu transformieren. Von jedem der Transformanten wurden die jeweiligen eukaryoten Expressionsvektoren erhalten, beispielsweise: pPADHFR-6 2C9.
  • 4) Endkonstruktion von p1154
  • Plasmid pETPFR wurde mit den Restriktionsenzymen BglII und ApaI digeriert und die Fragmente durch Agarosegelelektrophorese fraktioniert. Das den t-PA-Präprokodierungsbereich enthaltende 6,0 kb-Fragment, der SV40 frühe Promotor, β-Laktamase und DHFR-Gene wurden aus dem Gel herausgeschnitten und elektroeluiert.
  • Plasmid pCVSVPA-N44 D22 wurde mit BglII und ScaI digeriert, die Fragmente durch Arylanidgelelektrophorese fraktioniert und das Band, das das Fragment mit 0,63 kb enthält (die die Kodierungssequenzen für die |partiellen| Wachstumsfaktor-, Kringle 1- und Kringle 2-Bereiche von t-PA darstellen), wurden ausgeschnitten und elektroeluiert.
  • Plasmid pPADHFR-6 2C9 wurde mit ScaI und ApaI digeriert, und das die Kodierungssequenzen für Kringle 2- (partiell) und die Protease- (mit der Glu 275-Mutation) Bereiche enthaltende Fragment mit 0,63 kb wurde durch Acrylamidgelelektrophorese und Elektroeluierung gereinigt.
  • Die drei so isolierten, gereinigten Fragmente wurden in Gegenwart von T4 DNA-Ligase und rATP inkubiert, um das Plasmid p1154 herzustellen, das Sequenzen enthält, die für ein t-PA-Molekül kodieren, dem die Reste 1-44 fehlen (Finger-Bereich-Löschung) und das eine Arg 275 → Glu-Mutation enthält (einkettiger Mutant). Siehe 11.
  • BEISPIEL V
  • HERSTELLUNG VON ANDEREN BEREICHSLÖSCHUNGSVARIANTEN VON t-PA
  • Die Konstruktion von Plasmid pCVSVPA-N44 D22 wird oben im Zusammenhang mit der Beschreibung der Herstellung von Plasmid p1154 im Detail beschrieben.
  • Ebenso werden Versuche über stellengerichtete Mutagenese oben im Zusammenhang mit der Herstellung von Plasmid pPADHFR-6 2C9 im Detail erörtert.
  • Die des 44-84-Wachstumsfaktorbereichlöschung, des 92-179 Kringle 1-Bereichlöschung und des 174-261 Kringle 2-Bereichlöschung wurden ebenfalls durch stellengerichtete Mutagenese unter Verwendung der folgenden Oligonukleotide durchgeführt:
    Figure 00430001
    (Die Deltazeichen geben die Stelle der gelöschten Sequenz an.)
    und diese verwendet, um Expressionsplasmide auf eine Weise analog zur obigen Konstruktion von des 1-44 herzustellen, mit der Ausnahme, daß Mutagenese am 1,4 kb BglII/ApaI-Fragment (in einem einstrangigen Vektor) durchgeführt wurde, das die Hauptmenge der t-PA-Kodierungssequenz enthielt - siehe 11. Ebenfalls auf eine zur Konstruktion von des 1-44 ähnliche Weise konnten die des 44-84- und des 92-179-Mutationen im Prinzip ebenfalls auf BglII/ScaI-Fragmenten isoliert und an die Glu275-Mutationen und die tPA-C-terminalen PA-Kodierungssequenzen auf dem ScaI/ApaI-Fragment mit 0,63 kb angefügt werden, wodurch Plasmide erzeugt wurden, die p1154 wie oben beschrieben ähnlich waren. Diese Plasmide werden verwendet, um geeignete Zellen und die entsprechende wie oben beschrieben erzugte t-PA-Variante zu transfizieren.
  • BEISPIEL VI
  • DEMONSTRATION DER AMIDOLYTISCHEN PROTEASEWIRKUNG VON DES (1-44) t-PA IN VITRO
  • Die Wirkung von des (1-44) t-PA in einem amidolytischen Proteaseassay wurde mit der von natürlichem t-PA verglichen, wobei das chromogene Paranitroanilidsubstrat S-2288 (Helena Labs) verwendet wurde. Das Paranitroanilidsubstrat S-2288 ermöglicht eine direkte Messung der amidolytischen Proteasewirkung. Die kinetischen Konstanten für t-PA und des 1-44 t-PA wurden mit dem S-2288-Substrat bestimmt, wobei ein H-P-Diodenreihen-Spektrophotometer (HP8451-A) verwendet wurde. Hydrolyse des Substrats wurde kontinuierlich bei zwei Substratkonzentrationen (1,0 mM und 0,1 mM) gemessen, während die Proteinkonzentrationen in einem Puffer, der aus 0,05 M Tris-HCl, 0,12 M NaCl, 0,01% Tween 80, pH 7,4, bestand, bei 23 nM konstant gehalten wurden. Unter Verwendung der Differentialform der Michaelis-Menten-Gleichung und einer nichtlinearen Regression wurden der Km und Vmax aus den Kurven des Verlaufs der Reaktion berechnet.
  • Sowohl des 1-44 t-PA als auch t-PA mit normaler Sequenz wiesen unter Verwendung des kleinen synthetischen S-2288-Substrats, H-D-Isoleucyl-L-prolyl-L-Arginin-p-Nitroanilid, ähnliche spezifische Wirksamkeit auf. Wie in Tabelle 1 gezeigt, lagen der kcat und Km der beiden Enzyme innerhalb des Versuchsfehlers zueinander, was darauf hinwies, daß der Proteaseabschnitt des Moleküls normale Funktion besitzt und daß der Fingerbereich keine Wirkung auf die Hydrolyse von Substraten mit kleinem Molekulargewicht hat.
  • TABELLE 1 KINETISCHE KONSTANTEN FÜR WILDTYP-t-PA UND DES 1-44 t-PA MIT S-2288
    Figure 00440001
  • BEISPIEL VII
  • DEMONSTRATION DER PLAMINOGENAKTIVIERUNG IN VITRO DURCH DES (1-44) t-PA
  • Die Fähigkeit von t-PA, Plasminogen zu aktivieren, kann in einem Assay in vitro gemessen werden, indem t-PA und Plasminogen vorinkubiert werden und dann das plasminspezifische Substrat N-D-Valyl-H-leucyl-H-lysin-p-nitroanilid (S-2251) hinzugefügt wird. Die maximale Rate dieser Umsetzung wird in Gegenwart von Fibrin(ogen) oder Fragmenten von Fibrin(ogen) beobachtet, die als Stimulatoren der Reaktion wirken.
  • Das plasminspezifische Substrat S-2251 wurde in einem Zweistufenassay verwendet, um die Fähigkeit der Probe zum Aktivieren von Plasminogen zu messen. Fibringerinnsel wurden hergestellt, indem die Probe mit 0,02 ml einer 20 mg/ml Fibrinogenlösung mit 1 E Thrombin in einem Gesamtvolumen von 0,12 ml 0,05 M Tris-HCl, 0,12 M NaCl, 0,01% Tween 80, pH 7,4, 30 Minuten lang bei 37°C inkubiert wurde. Alternativ dazu konnte das Thrombin weggelassen und Fibrinogen als der Stimulator verwendet werden. Glu-Plasminogen-Lösung, 0,03 ml einer Lösung mit 2,1 mg/ml, wurden dann hinzugefügt. Nach 10 Minuten bei 37°C wurden 0,35 ml 2,86 mM S-2251 in 0,037 M Tris, 0,86 NaCl, 0,007% Tween 80, pH 7,4, hinzugefügt. Diese Mischung wurde 5 Minuten lang inkubiert, dann wurde die Umsetzung durch das Hinzufügen von 0,1 ml 50%-igem Eisessig abgebrochen. Die dekad. Extinktion bei 405 nm wurde gemessen. Die Aktivität wurde als die Veränderung der dekad. Extinktion pro Nanogramm pro Minute in Gegenwart von Substrat ausgedrückt.
  • Das Assay wurde wie beschrieben durchgeführt, gemeinsam mit einem zusätzlichen Satz an Proben, die keine Fibringerinnsel enthielten. Die Stimulierung ist das Verhältnis zwischen der spezifischen Wirkung der Fibrin enthaltenden Probe und der spezifischen Wirkung der kein Fibrin enthaltenden Probe.
  • In verschiedenen Assays (siehe Tabelle 2 und 4) war die mit des 1-44 t-PA in Gegenwart von Fibrin erhaltene maximale spezifische Wirkung geringfügig größer als 50% der mit t-PA mit normaler Sequenz erhaltenen Rate. Die Wirkung von sowohl t-PA als auch des (1-44) t-PA nahm in Gegenwart von Fibrin um etwa das 50-fache zu. In Tabelle 2 vergleicht der Wert für "stim" die in Gegenwart von Fibrinogen festzustellende Stimulierung gegenüber der ohne Fibrinogen.
  • TABELLE 2
    Figure 00460001
  • Um die Fähigkeit von des 1-44 t-PA zur Aktivierung von Plasminogen in Gegenwart von Fibrin(ogen) weiter zu vergleichen, wurde sie mit t-PA in einem Assay verglichen, das die Fähigkeit von t-PA und sättigendem Plasminogen zur Lyse eines Fibringerinnsels mißt. Bei diesem Assay wies des 1-44 t-PA nur 35% der Wirksamkeit auf, die bei normalem t-PA beobachtet wird (Tabelle 3). Diese Ergebnisse weisen darauf hin, daß es möglicherweise einen Defekt bei der Fähigkeit von des 1-44 t-PA gibt, richtig mit Fibrin zu interagieren.
  • Tabelle 3 WIRKSAMKEIT VON r-PA und DES 1-44 t-PA
    Figure 00470001
  • Die Bindung von des 1-44 t-PA an Fibrin wurde überwacht, indem eine Modifikation des Verfahrens von Rijken et al. (1982, "J.Biol.Chem." 27:2920) verwendet wurde. Proben wurden mit verschiedenen Konzentrationen an menschlichem plasminogenfreiem Fibrinogen in Gegenwart von 1 mg/ml Humanserumalbumin (von J E M Research, Inc., Kensington, MD) gemischt, um nichtspezifische Adsorption zu verhindern. Das Gesamtreaktionsvolumen betrug 1 ml, und der Puffer bestand aus 0,05 M Tris-HCl, 0,12 M NaCl, 0,01% Tween 80, pH 7,4. Eine Einheit Thrombin (von Sigma Chemical Co. St. Louis, MO) wurde hinzugefügt, und die Mischungen wurden eine Stunde lang bei 37°C zum Gerinnen gebracht. Die Gerinnsel wurden durch 5-minütiges Zentrifugieren mit 10.000 UpM physikalisch entfernt, und ein Aliquot des Überstands wurde dann entweder durch ein Wirksamkeits-Assay oder ein ELISA-Verfahren auf verbleibenden t-PA-Gehalt untersucht.
  • Die Ergebnisse werden in 5 gezeigt. Wie anerkannt werden wird, wies der des (1-44) eine stark verringerte Fähigkeit zur Bindung von Fibrin auf. Obwohl die Bindung an Fibrin so schwach war, daß keine Dissoziationskonstante erhalten werden konnte, wurde geschätzt, daß die Dissoziation zumindest 10fach höher als jene für natürlichen t-PA ("RIK") war. Demnach ist Fibrinbindung nicht erforderlich, um die Wirksamkeit der t-PA-Wirkung beizubehalten.
  • BEISPIEL VIII
  • GERINNSELLYSEWIRKUNG VON DES (1-44) t-PA GEGENÜBER NATÜRLICHEM t-PA IN VIVO
  • An Kaninchen wurde ein in vivo-Versuch vorgenommen, um die Dosisreaktion von natürlichem t-PA (als RIK bezeichnet) gegenüber der des (1-44) t-PA-Variante zu zeigen. Die thrombolytischen Wirkungen wurden bei Kaninchen unter Verwendung eines Shunts außerhalb des Körpers ermittelt, der einen mit I-125 Fibrinogen markierten Thrombus enthielt. Lyse wurde durch das Verschwinden von Radioaktivität, gemessen durch einen externen Natriumjodidkristall, gemessen. Der Wildtyp-t-PA wurde als ein 10%iger Bolus verabreicht, wobei der Pest der Dosis über die folgenden 90 Minuten infundiert wurde. Der des (1-44) t-PA wurde als Einzeldosis mit 0.064 mg/kg unter Verwendung eines Bolus mit 0,03 mg/kg gefolgt von einer Infusion mit 0,034 mg/kg für 30 Minuten getestet. Die vollständige Lyse wurde am Ende der 90minütigen Infusion ermittelt.
  • Wie in 6 zu erkennen ist, wies die des (1-44) t-PA-Variante in einem Assay in vivo eine überraschend hohe Gerinnsellysewirkung auf, die innerhalb des Normfehlers von natürlichem t-PA liegt. Dieses Ergebnis war im Lichte der Ergebnisse von Assays in vitro besonders überraschend, worin die Lysewirkung eine geringere Lysewirkung für die N44-Variante widerspiegelte. Jedoch berücksichtigten solche in vitro-Versuche die erhöhte Halbwertszeit der Variante nicht.
  • In einer zweiten Art von Assay wurden die beiden Spezien hinsichtlich prozentueller Lyse gegenüber Zeit verglichen. Die Ergebnisse werden in 7 gezeigt, worin vergleichbare Lyseraten für die Wildtyp-rt-PA-Dosis von 0,3 mg/kg und die des (1-44) rt-PA-Dosis von 0,064 mg/kg graphisch dargestellt sind. Wie anerkannt werden wird, ist die Wirkung im Zeitverlauf der des (1-44)-Variante (N44) stark parallel zur Wirkung von natürlichem t-PA (RIK).
  • In 8 wird der Zeitverlauf der Plasmakonzentration der beiden Formen von rt-PA aus der vorangehenden Untersuchung gezeigt. Die Konzentrationen wurden durch ein polyklonales ELISA-Verfahren ermittelt, das bei beiden Formen von rt-PA gleiche Wirkung feststellt. Blutproben wurden auf EDTA gesammelt, und ein irreversibler Inhibitor von rt-PA, D-Phe-Pro-Arg-Chlormethylketon, wurde hinzugefügt. Dieser Inhibitor blockiert die in vitro-Bildung von t-PA-Komplexen mit Plasmaproteaseinhibitoren. Diese Komplexe weisen eine deutlich verringerte Immunreaktivität auf. Wie anerkannt werden wird, erzeugte die N44-Variante eine viel höhere Plasmakonzentration als natürlicher t-PA mit einer viel geringeren Anfangs- und Gesamtdosis.
  • BEISPIEL IX
  • PHARMAKOKINETISCHE UNTERSUCHUNGEN
  • Vergleichende pharmakokinetische Untersuchungen wurden an Kaninchen durchgeführt. I-125 markierter Versuchs-t-PA, entweder Wildtyp oder N44-Variante, 5 μCi/kg mit einer spezifischen Wirkung von 5 bis 10 μCi/ug, und Trägerwildtyp-t-PA, 1,0 mg/kg, wurden koinjiziert, Serien-Blutproben wurden gesammelt, Plasma hergestellt und die TCA (Trichloressigsäure)-ausfällbaren Zählungen wurden an jedem Zeitpunkt bestimmt. TCA-Ausfällung wurde verwendet, um jegliche kleine Stoffwechselprodukte zu entfernen, die zu späteren Zeitpunkten aufgrund von Abbau von t-PA durch die Leber auftreten. Die Plasmakonzentration-Zeit-Kurve für rt-PA war für eine Bioexponentialgleichung C=Aexp(-alphaXt)+Bexp(-betaXt) geeignet. Die Kurve für den des (1-44) rt-PA war für eine Monoexponentialgleichung C=Aexp(-alphaXt) geeignet. Die Clearance (Cl) wurde durch die Formel Cl= DOSE/AUC berechnet, worin AUC die Fläche unter der Plasmakonzentration-Zeit-Kurve ist.
  • Wie aus den erhaltenen Ergebnissen zu sehen ist, die unten in Tabelle 4 aufgezeigt und in 9 eingetragen sind, wies die natürliche t-PA-Probe, rt-PA, in einem Kaninchenversuchssystem eine Clearancerate von etwa 8,4 ml/min/kg mit einer Standardabweichung von etwa 0,92 und eine Halbwertszeit (tl/2a) von etwa 3,1 Minuten mit einer Standardabweichung von etwa 0,55 auf.
  • TABELLE 4 Pharmakokinetische Parameter einer intravenösen Bolusdosis von I-125 rT-PA, bei Kaninchen, Dosis = 5μCi/kg I-125 rt-PA koinjiziert mit 1 mg/kg kaltem rt-PA
    Figure 00500001
  • Jedoch wurde bei der des (1-44)-Variante, N44, wie unten in Tabelle 5 und 9 gezeigt, eine Clearancerate von etwa 0,48 ml/min/kg (Standardabweichung = 0,02) und eine Halbwertszeit von etwa 53,7 Minuten (Standardabweichung = 6,58) beobachtet.
  • TABELLE 5 Pharmakokinetische Parameter einer intravenösen Bolusdosis von I-125 N-44, bei Kaninchen, Dosis = 5 μCi/kg I-125 N-44 koinjiziert mit 1 mg/kg kaltem rT-PA
    Figure 00510001
  • Pharmakokinetische Analysen wurden wie oben wiederholt, mit der Ausnahme, daß anstelle der Verwendung von natürlichem t-PA als Träger für die markierte N44-Variante die Variante N44 (nicht radioaktiv) selbst in einer Konzentration von 1 mg/kg verwendet wurde. Die Ergebnisse werden unten in Tabelle 6 und 10 gezeigt. Wie anerkannt werden wird wurde bei Verwendung von N44-Träger eine Halbwertszeit von etwa 73,1 Minuten (Standardabweichung = 1,22) beobachtet, mit einer Clearancerate von etwa 0,42 ml/min/kg (Standardabweichung = 0,03).
  • TABELLE 6 Pharmakokinetische Parameter einer intravenösen Bolusdosis von I-125 N-44, bei Kaninchen, Dosis = 5μCi/kg I-125 N44 koinjiziert mit 1 mg/kg kaltem N44
    Figure 00520001
  • Basierend auf den bei den Kaninchen-Versuchstieren beobachteten Clearanceraten und Halbwertszeiten kann leicht vorhergesagt werden, daß eine ähnliche oder längere Halbwertszeit, sowie eine ähnliche oder geringere Clearancerate beim Menschen erhalten werden.

Claims (22)

  1. Verwendung einer Aminosäurelöschungsvariante von in einer rekombinanten Wirtszelle produziertem Human-t-PA-Protein, das frei von Derivaten ist, worin Blocker-Gruppen auf der Proteinstruktur vorhanden sind, bei der Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Gefäßkrankheiten bei einem Patienten, für den eine t-PA-Plasma-Halbwertszeit, die länger ist als jene, die natürlicher t-PA aufweist, und/oder Clearanceraten, die geringer sind als die Clearancerate von natürlichem t-PA, vorteilhaft ist, worin aus der genannten Löschungsvariante der gesamte oder ein Teil des Fingerbereichs entfernt wurde und diese in der genannten Human-t-PA-Proteinvariante resultiert, deren Plasma-Halbwertszeit wenigstens 12 Minuten beträgt oder wenigstens zweimal länger ist als jene von in der gleichen Wirtszelle hergestelltem natürlichem t-PA und/oder deren Clearanceraten weniger als 2 ml/min/kg oder die Hälfte oder weniger der Clearancerate von in der gleichen Wirtszelle hergestelltem natürlichem t-PA-Protein betragen.
  2. Verwendung einer t-PA-Variante nach Anspruch 1, worin das t-PA-Protein glykosyliert ist.
  3. Verwendung einer t-PA-Variante nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin die t-PA-Variante als proteaseresistente einkettige Variante näher definiert ist.
  4. Verwendung einer t-PA-Variante nach Anspruch 3, worin die genannte einkettige Variante eine andere Aminosäure als Arginin an Position 275, gemessen in Bezug auf natürlichen t-PA aufweist.
  5. Verwendung einer t-PA-Variante nach Anspruch 4, worin die t-PA-Variante Glu an Aminosäure 275 aufweist.
  6. Verwendung einer t-PA-Variante nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin die genannte t-PA-Variante als zweikettige Variante näher definiert ist.
  7. Verwendung einer t-PA-Variante nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin die genannte t-PA-Variante einen Wachstumsfaktor-, Kringle 1-, Kringle 2- und Proteasebereich einschließt.
  8. Verwendung einer t-PA-Variante nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin der genannten t-PA-Variante im Wesentlichen der gesamte Fingerbereich fehlt.
  9. Verwendung einer t-PA-Variante nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin die genannte t-PA-Variante natürlichen t-PA enthält, dem die Aminosäuren 1 bis 44 fehlen.
  10. Verwendung einer Aminosäurelöschungsvariante von in einer rekombinanten Wirtszelle produziertem Human-t-PA-Protein, das frei von Derivaten ist, worin Blocker-Gruppen auf der Proteinstruktur vorhanden sind, bei der Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Gefäßkrankheiten bei einem Patienten, für den eine t-PA-Plasma-Halbwertszeit, die länger ist als jene, die natürlicher t-PA aufweist, und/oder Clearanceraten, die geringer sind als die Clearancerate von natürlichem t-PA, vorteilhaft ist, worin aus der genannten Löschungsvariante wenigstens ein Teil des Kringle-1-Bereichs entfernt wurde und diese in der genannten Human-t-PA-Proteinvariante resultiert, deren Plasma-Halbwertszeit wenigstens 12 Minuten beträgt oder wenigstens zweimal länger ist als jene von in der gleichen Wirtszelle hergestelltem natürlichem t-PA und/oder deren Clearanceraten weniger als 2 ml/min/kg oder die Hälfte oder weniger der Clearancerate von in der gleichen Wirtszelle hergestelltem natürlichem t-PA-Protein betragen, mit Ausnahme einer t-PA-Variante, die aus der gesamten Wildtyp-Aminosäuresequenz von t-PA besteht, abgesehen von einer die Aminosäure 92-173 umfassenden Löschung und dem N-Terminus stromauf von Ser1, der durch R bezeichnet ist, worin R abwesend ist oder aus der natürlichen Signalsequenz von t-PA, Gly-Ala-Arg, Met-Gly-Ala-Arg oder Met- ausgewählt ist und gegebenenfalls Glu an 276 und/oder Ile an 277 aufweist.
  11. Verwendung einer t-PA-Variante nach Anspruch 10, worin die genannte t-PA-Variante natürlichen t-PA enthält, dem die Aminosäuren 92-179 fehlen.
  12. Verwendung einer t-PA-Variante nach Anspruch 10, worin die Löschung wenigstens einen Abschnitt des Wachstumsfaktorbereichs einschließt.
  13. Verwendung einer t-PA-Variante nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin die genannte Variante eine Plasma-Halbwertszeit zwischen etwa dem Zweifachen bis zum etwa Fünfundzwanzigfachen der Plasma-Halbwertszeit von natürlichem t-PA aufweist.
  14. Verwendung einer t-PA-Variante nach Anspruch 13, worin die genannte Variante eine Plasma-Halbwertszeit zwischen etwa dem Fünffachen bis zum etwa Zwanzigfachen der Plasma-Halbwertszeit von natürlichem t-PA aufweist.
  15. Verwendung einer t-PA-Variante nach einem der Ansprüche 1 bis 12, worin die genannte t-PA-Variante eine Plasma-Halbwertszeit von wenigstens 15 Minuten aufweist.
  16. Verwendung einer t-PA-Variante nach einem der Ansprüche 1 bis 12, worin die t-PA-Variante eine Plasma-Halbwertszeit von zwischen etwa 20 und etwa 75 Minuten aufweist.
  17. Verwendung einer t-PA-Variante nach einem der Ansprüche 1 bis 12, worin die t-PA-Variante eine Clearancerate zwischen etwa 1/2 und 1/25 der Clearancerate von natürlichem t-PA aufweist.
  18. Verwendung einer t-PA-Variante nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin die t-PA-Variante durch Expression eines rekombinanten Vektors, der für die Variante kodiert, in einem geeigneten Wirt hergestellt wurde.
  19. Verwendung einer t-PA-Variante nach Anspruch 18, worin der rekombinante Vektor ein bakterieller Vektor und der Wirt ein bakterieller Wirt ist.
  20. Verwendung einer t-PA-Variante nach Anspruch 18, worin der rekombinante Vektor ein eukaryotischer Vektor und der Wirt ein eukaryotischer Wirt ist.
  21. Verwendung einer t-PA-Variante nach Anspruch 19, worin der Wirt aus CHO-Zellen besteht.
  22. Des 1-44 Glu275 t-PA.
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