EP1472346A2 - Verfahren zur herstellung von rekombinanten proteinen in mikroorganismen - Google Patents

Verfahren zur herstellung von rekombinanten proteinen in mikroorganismen

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EP1472346A2
EP1472346A2 EP20030737248 EP03737248A EP1472346A2 EP 1472346 A2 EP1472346 A2 EP 1472346A2 EP 20030737248 EP20030737248 EP 20030737248 EP 03737248 A EP03737248 A EP 03737248A EP 1472346 A2 EP1472346 A2 EP 1472346A2
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EP
European Patent Office
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plasminogen
seq
nucleic acid
plasmid
acid sequence
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP20030737248
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English (en)
French (fr)
Inventor
Rudy Susilo
Hans Christian Korting
Hans Günther GASSEN
Martin Hils
Ralf Pasternack
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N Zyme Biotec GmbH
Original Assignee
N Zyme Biotec GmbH
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Publication date
Application filed by N Zyme Biotec GmbH filed Critical N Zyme Biotec GmbH
Priority to EP20030737248 priority Critical patent/EP1472346A2/de
Publication of EP1472346A2 publication Critical patent/EP1472346A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
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    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence

Definitions

  • the human fibrinolytic system contains the protease plasmin (Pm) as a central element.
  • Pm protease plasmin
  • MMP matrix metalloproteinases
  • two physiological activators of plasminogen also known as plasminogen activators, PA
  • tissue-type plasminogen activator tissue-type PA
  • urokinase-type plasminogen activator urokinase-type PA
  • u-PA urokinase-type PA
  • the system is additionally characterized by a number of protease inhibitors, e.g. B. ⁇ 2-antiplasmin, regulated.
  • protease inhibitors e.g. B. ⁇ 2-antiplasmin
  • t-PA-mediated pathway is responsible for fibrin homeostasis, while the u-PA-mediated pathway in cell migration and tissue remodeling should be emphasized.
  • t-PA-mediated pathway in cell migration and tissue remodeling should be emphasized.
  • mice whose genes for plasminogen and t-PA or u-PA have been switched off.
  • the lifespan of the animals was shortened significantly, which is due among other things to thrombosis and organ failure.
  • Desire Collen Thrombosis and Haemostasis, 82, 1999 (i.
  • plasmin is suitable for the treatment of heart attack or stroke patients in whom a rapid dissolution of the fibrin clot is crucial for survival, and is therefore an alternative treatment to that with plasminogen activators that only hydrolyses the fibrin clot reach indirectly.
  • plasmin is also a potential therapeutic that can be used to treat wounds that do not heal or only heal slowly.
  • Plasminogen is usually activated by t-PA only in the presence of fibrin, i.e. after the blood coagulation cascade has ended. In the absence of a substrate, plasmin is inhibited almost immediately by ⁇ 2 -antiplasmin. The plasmin binds to fibrin However, the interaction slows down significantly, which enables the fibrin clot to break down.
  • plasminogen activation Since the resolution of blood clots in a heart attack or stroke is often unavoidable for the survival of the patient, various strategies of plasminogen activation are used for therapy. For example, the infusion of streptokinase leads to a rapid recanalization of the vascular lumens.
  • streptokinase a bacterial protein
  • the activation of plasminogen with streptokinase is not based on proteolytic activation but on complexation. This complex can then activate other plasminogen molecules to form plasmin.
  • Urokinase is also used therapeutically, but like streptokinase at the molecular level, it cannot distinguish fibrin-bound plasminogen from free plasminogen. Therefore, recombinant human t-PA was developed, which was shown to be superior to streptokinase in the clinical studies. However, these findings could not be confirmed in other studies.
  • plasminogen activators such as rt-PA (plus various derivatives), recombinant single chain urokinase-PA and recombinant staphylokinase emphasize the importance of the production systems generated with molecular genetic methods for the production of recombinant proteins for use in modern therapy.
  • Plasminogen is the norwegian molecule of the fibrinolytic enzyme plasmin.
  • the cD ⁇ A (Malinowski et al., Biochemistry, 23, 1984 (12); Forsgren et al., FEBS Lett. 213, 1987 (2)) and the gene including the non-coding introns (Petersen et al., J. Biol. Chem., 265, 1990 (3)) for human plasminogen have already been published in the scientific literature.
  • Human plasminogen (hPg), the proenzyme of the serine protease plasmin, is a glycoprotein consisting of a polypeptide chain of 791 amino acids with a molecular weight of 92,000 and a theoretical isoelectric point of 7.1. The carbohydrate content is 2% (Collen, 1999, (1)). Plasminogen is formed in the liver, the plasma concentration is around 200 mg / 1 (1.5-2 ⁇ M).
  • the molecule is divided into 7 structural domains; these include the ⁇ -terminal preactivation peptide (Glu-1 - Lys-77), five partially homologous Kringle domains and the catalytically active proteinase domain (Nal-562 - Asn-791; Collen, 1999 (1)).
  • the structural motif of the catalytic triad common to all serine proteases is made up of the Amino acids His-603, Asp-646 and Ser-741 together.
  • the Kringle domain 1 serves as a recognition sequence for binding the plasminogen to fibrin (Petersen et al., 1990 (3)) and various cell surface receptors.
  • Another glycosylation site is the amino acid Ser-248.
  • the amino acid Ser-578 can be phosphorylated.
  • Activation takes place in the organism through proteolytic cleavage between the amino acids Arg-561 and Nal-562. This is followed by a further proteolytic activation between Lys-77 and Lys-78 to Lys-78-hPg. Alternatively, this bond can first be hydrolyzed directly in the Glu-Pg.
  • the active plasmin Lys-78-hPm is always linked via disulfide bridges.
  • the heavy chain of the hPm (1 / 78-561) is for the interaction with the substrates, e.g. B. fibrinogen and fibrin.
  • the light chain (562-791) resulting from the C-terminus represents the catalytically active subunit.
  • the plasminogen domains produced by the two working groups recombinantly in Pichia pastoris do not have the catalytic domain that is decisive for the physiological functionality.
  • glycosylation thus results in a protein which lacks the important physiological functions both in terms of activatability (no enzyme activity detectable) and in terms of endothelial cell recognition (Gonzalez-Gronow et al., Biochimica et Biophysica Acta, 1039, 1990 (6) ).
  • the post-translational modification with the carbohydrates also significantly influences the half-life in the blood of mammals.
  • WO0250290 has disclosed the recombinant production of functional mini and microplasminogen in yeast.
  • the authors expressed the genes for the catalytic domain of human plasminogen with (miniplasminogen) or without a Kringle domain (microplasminogen) in the host organism Pichia pastoris.
  • the mini or microplasminogen produced in such a recombinant manner was then purified, processed to mini or microplasmin and its activity demonstrated in animal experiments.
  • the claimed yield of the recombinant proteins is 100 mg / 1 for miniplasminogen and 3 mg / 1 for microplasminogen.
  • the recombinant production of functional plasminogen in microorganisms has not yet been disclosed, so that a person skilled in the art can carry it out.
  • the object of the present invention is therefore to produce functional human plasminogen in an inexpensive process and to process it to catalytically active plasmin.
  • the invention relates to the cloning of the plasminogen gene, preferably the human micro and mini plasminogen gene and more preferably the glu or lys plasminogen gene or a functional variant thereof in each case, into expression vectors and the recombinant production of functional plasminogen, preferably functional human plasminogen, using molecular genetic methods.
  • the invention further describes the identification of proteases which catalyze the activation of plasminogen to plasmin.
  • the plasminogen or plasmin, which is produced by this invention, is free of contaminants such as. B. animal proteins or viruses that occur naturally when isolated from humans, cattle and other mammals and which can lead to side effects in the patient.
  • the invention is characterized by a recombinant production method, comprising at least the following step: a.) Fusion of the nucleic acid sequence coding at least for the functional part of the plasminogen peptide with a nucleic acid sequence coding for at least one signal peptide, the one for the functional plasminogen peptide coding nucleic acid sequence and the nucleic acid sequence coding for at least the signal peptide are linked to codons for interfaces of proteases which ensure the cleavage of the signal peptide.
  • the production of therapeutic proteins is increasingly being carried out using recombinant production systems. Because of cost factors, the aim is to carry out recombinant production in microbial, in particular bacterial, organisms.
  • the eukaryotic host organism used particularly preferably belongs to the department of fungi, preferably to the Ascomycota. It is further preferred that it belongs to the Saccharomycotina, in particular to the class of the Saccharomycetes, here in particular to the order of the Saccharomycetales.
  • the host organism also belongs to the family Saccharomycetaceae, here in particular to the genus Pichia.
  • Eukaryotic microorganisms which are preferably used according to the invention are, for example, the baker's yeast Saccharomyces cerevisiae, further examples are Candida, the methanothrophic yeasts Pichia pastoris, Pichia methanolica and Hansenula polymorpha or filamentous fungi of the genus Aspergillus, such as, for. B. Asperg ⁇ llus niger, Aspergillus oryzae and Aspergillus nidulans. Pichia pastoris is particularly preferred.
  • the recombinant production process is further characterized in that a nucleic acid molecule coding for at least the functional part of plasminogen is inserted into an expression vector for this microorganism, the nucleic acid molecule preferably coding for human plasminogen with that for at least one signal peptide, preferably a prepropeptide, preferably for the transport into the endoplasmic reticulum, coding nucleic acid molecule is fused, codons for protease interfaces are inserted between the two nucleic acid molecules, which enable the cleavage of the signal sequence or the prepropeptide in the host organism.
  • a nucleic acid molecule coding for human plasminogen is preferably used.
  • nucleic acid molecules can be used which code for plasminogen from other mammals. This leads to the production of plasminogen in the respective mammals.
  • the recombinant human plasminogen is formed by overexpression in accordance with the present method and, if desired, can be secreted into the culture medium from which it can be separated from the host cells by centrifugation, filtration or sedimentation and thus can be used for protein purification without complex cell disruption processes can, which can be carried out using methods known to those skilled in the art.
  • the Activation of plasminogen to plasmin is solved by proteases that are able to process plasminogen to catalytically active plasmin.
  • Recombinant production method means that a peptide or a protein from a nucleic acid sequence, preferably a DNA sequence, is expressed by a suitable host organism, the nucleic acid sequence resulting from the cloning and fusion of individual nucleic acid segments.
  • the “functional plasminogen peptide part” is to be understood as the part of the plasminogen or plasminogen peptide which can perform the biologically relevant functions of the plasminogen. These biologically relevant functions are at least the ability to activate plasmin by plasminogen activators such as twe plasminogen activator, urokinase , vampire-bat plasminogen activator, streptokinase, stapyhlokinase, Pia protein from Yersinia pestis etc., and the proteolytic activity, which is characterized by the hydrolysis of fibrin. Under the term "plasminogen activator (s)" used in the description and the examples both proteolytic and non-proteolytic plasminogen activators are understood.
  • glu-plasminogen the processability to lys-plasminogen is also to be understood by the plasmin-catalyzed cleavage of the preactivation peptide.
  • the biological functions also include the fact that plasminogen can be activated up to a factor of 1000 after binding to fibrin, laminin, fibronectin, vitronectin, heparan sulfate proteoglucan, type 4 collagen and other substrates.
  • plasmin Among the biologically relevant functions of plasmin, which must be ensured after processing the plasminogen, are the degradation of laminin, the degradation of fibronectin, of vitronectin, of heparan sulfate proteoglucan, the activation of ProCoUagenases, the activation of Promatrix metalloproteases, the activation of To understand latent macrophages elastase, prohormones and growth factors such as TGFß-1 (latent transforming growth factor), VEGF (vascular endothelial growth factor) or bFGF (basic f ⁇ broblast growth factor).
  • TGFß-1 latent transforming growth factor
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • bFGF basic f ⁇ broblast growth factor
  • Another biological function is the ability to be inhibited by plasmin inhibitors such as ⁇ 2-antiplasmin and ⁇ 2-macroglobulin.
  • the biologically relevant functions include binding to fibrin, laminin, fibronectin, vitronectin, heparan sulfate proteoglucan and type 4 collagen, binding to receptors such as, for example, ⁇ -enolase, Annexin II or amphoterin.
  • Plasminogen is initially formed as an inactive glu-plasminogen.
  • This glu-plasminogen can be converted from plasmin into Lys-plasminogen by splitting off the so-called preactivation peptide.
  • tissue plasminogen activators in this case only by the above-mentioned proteolytic activators
  • proteolytic cleavage into plasmin which consists of subunits connected via sulfide bridges.
  • the smaller subunit contains the proteolytic domain and the phosphorylation site, the larger subunit carries the three glycosylations and is responsible for binding to fibrin. Furthermore, the glycosylations are important for stability in the plasma.
  • plasminogen can additionally be converted into a proteolytically active enzyme which is able to process plasminogen into plasmin.
  • Functional plasminogen is therefore plasminogen, which can be processed into proteolytically active plasmin by plasminogen activators. Furthermore, functional plasminogen preferably contains the fibrin-binding domain and can preferably contain at least one of the three glycosylations.
  • plasminogen The smallest forms of functional plasminogen are micro and mini plasminogen, a larger form lys plasminogen.
  • Glu-plasminogen which still contains the preactivation peptide, is also functional plasminogen.
  • regions, in particular within the larger chain, can be omitted without significantly impairing the above-mentioned functionality (including proteolysis, fibrin binding).
  • plasminogen derivatives which contain a functional catalytic domain.
  • plasminogen derivatives functionally, as already described, means that the plasminogen variant has proteolytic activity after activation with plasminogen activators such as streptokinase or urokinase.
  • the catalytic domain can contain deletions and amino acid exchanges or can be fused with other amino acids or peptides or proteins.
  • the large domain can contain all intermediates from Glu20 to Arg580 (based on the sequence of the pre-plasminogen) which can be activated with plasminogen activators to form active plasmin.
  • Lys plasminogen As a concrete example, three forms of Lys plasminogen are mentioned:
  • Variant 1 N-terminal amino acid: Met88 Variant 2: N-terminal amino acid: Lys97 Variant 3: N-terminal amino acid: Val98
  • the plasminogen derivatives are preferably a number of 1 to 50 amino acids shorter or longer than the corresponding micro, mini, Lys or Glu plasminogen or preferably have an exchange of 1 to 10 amino acids, these derivatives furthermore having the property to be activated by plasminogen activators.
  • sequence homology sequence agreement
  • sequence homology of over 80%, preferably over 85%, more preferably over 90%, further preferably over 95% , particularly preferably of over 98% and furthermore particularly preferably of over 99%.
  • the catalytic domain can contain at least one deletion and / or at least one amino acid exchange and / or be fused with at least one further amino acid or at least one further peptide or at least one further protein.
  • the large domain can contain all intermediates from Glu20 to Arg580 (based on the sequence of the pre-plasminogen), which can be activated with plasminogen activators to active plasmin.
  • a plasminogen derivative has an amino acid sequence homology (match) of preferably over 80%, further preferably over 85%, further preferably over 90%, particularly preferably over 95% and further particularly preferably over 99%.
  • Microorganism encompasses all those life forms which have only small dimensions. Both eukaryotic and prokaryotic microorganisms are to be included. Bacteria, yeasts, fungi and viruses should be mentioned in particular. “Nucleic acid” is intended to encompass both DNA and RNA, both in all conceivable configurations, for example in the form of double-stranded nucleic acid, in the form of single-stranded nucleic acid, combinations thereof, and linear or circular nucleic acids.
  • “Signal sequence” is understood to mean a peptide sequence which is able to ensure the transport of a further peptide sequence into or across a membrane, for example into the endoplasmic reticulum. This can be, for example, a prepropeptide, a prepeptide or a propeptide.
  • Interface denotes those sites in a peptide sequence which make it possible to split off a signal sequence, a prepropeptide or propeptide from the further peptide sequence or generally to split a peptide sequence into two parts in a host organism.
  • a “nucleic acid coding for at least one signal peptide or a prepropeptide” is a nucleic acid sequence which codes for a peptide or a protein structure which enables the further polypeptide to be introduced into membranes, for example into the endoplasmic reticulum.
  • a primer oligonucleotide is referred to as "primer”.
  • primer By this we mean short-chain, single-stranded oligoribo or deoxyribo nucleotides which are complementary to a region on a single-stranded nucleic acid molecule and can hybridize with it to form a double strand.
  • the free 3'- The hydroxyl end in this double strand serves as a substrate for DNA polymerases and as a starting point for the polymerization reaction of the entire single strand to form the double strand.
  • the primers are used in particular for PCR, ie the polymerase chain reaction known to the person skilled in the art.
  • Plasmid denotes the nucleic acid molecules which are present in many prokaryotic and some eukaryotic microorganisms and are not integrated into the chromosome and have a length of approximately 2 kb to more than 200 kb.
  • Ligase is the term for the connection of the ends of two nucleic acid molecules with the aid of a ligase or in the context of a self-ligation, ie by an intramolecular ring closure reaction, in which the two single-stranded ends of a linear DNA molecule join together, provided that their ends are together Can form base pairs.
  • Restriction endonuclease is the name for a class of bacterial enzymes that cleave phosphodiester bonds in both strands of a DNA molecule within specific base sequences.
  • Electrical pulses are a method for introducing nucleic acids into cells. The cell membranes of the exponentially growing recipient cells in suspension are made permeable to high molecular weight molecules by short electrical pulses of high field strength while being exposed to the nucleic acid solution.
  • “Overexpression” is understood to mean an increased production of functional plasminogen by a cell in comparison to a production by the wild type of this cell. In general, one speaks of an overexpression when the expressed foreign gene in the case of intracellular production accounts for about 1-40% of the total cellular protein of the host cell.
  • Expression vector is to be understood as those vectors which, after introduction into a suitable host cell, allow the transcription of the foreign gene cloned into the vector and the subsequent translation of the mRNA (messenger RNA) formed.
  • Expression vectors generally contain those for the expression of genes control signals required in cells of prokaryotes or eukaryotes.
  • B. Pichia pastoris are preferred in the present invention by methanol inducible promoters such.
  • the constitutive GAP promoter is particularly preferred.
  • AOX1 is a gene of alcohol oxidase 1 from P. pastoris
  • GAP is a gene of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase from P. pastoris and
  • YPT1 is a gene of a GTP binding protein from P. pastoris.
  • the signal peptides of the proteins encoded by the genes PHO-1, SUC-2, PHA-E or alpha-MF are often used for secretory production in yeasts.
  • PHO1 is a gene of the acidic phosphatase from P. pastoris
  • SUC-2 is a gene of the secretory invertase from S. cerevisiae
  • PHA-E is a gene of the acid phosphatase from Phaseolus vulgaris Agglutinis.
  • Alpha-MF is a gene of the alpha-mating factor from S. cerevisiaea.
  • the codons for the interfaces of proteases and codons for the interfaces for splitting off the propeptide for the protease Kex 2 or the protease Ste 13 are particularly preferred.
  • the link in step a) above is particularly preferably carried out with codons which are for a Kex 2 interface and additionally code two Ste 13 interfaces. In a preferred embodiment of the present invention, this is for the signal peptide or Prepropeptide-encoding nucleic acid molecule from yeast, in particular the yeast Saccharomyces cerevisiae.
  • a still more preferred embodiment is directed to a nucleic acid molecule coding for the signal peptide or the prepropeptide, which encodes the signal peptide or prepropeptide of the ⁇ -factor of the yeast Saccharomyces cerevisiae.
  • the resulting fusion product described in step a) above is preferably amplified by PCR and then further preferably purified.
  • WO02 / 50290 discloses the recombinant production of mini and microplasminogen with the expression vector pPICZ ⁇ AD D which contains the inducible AOX1 promoter and the prepropeptide of the yeast alpha factor and is suitable for yeast. These smaller variants of plasminogen either have none at all (like microplasminogen) or only a Kringle domain (like mini plasminogen).
  • the expression vector pPICZ ⁇ AD contains the interfaces for the proteases Kex2 and Stel3.
  • a number of promoters are known for inducible expression systems in yeast. These include the AOXl promoter, AOX2, CUP1 (Koller A, Valesco J, Subramani S., Yeast 2000: 16 (7), 651-6), PHO1 (EP0495208), HIS4 (US 4885242), FLD1 (Shen et al., Gene 1998: 216 (1), 93-10) and the XYLl promoter (Den Haan and Van Zyl, Appl. Microbiol. Biotechnol. 2001: 57 (4), 521-7).
  • heterologous protein production can be controlled and a homogeneous biomass can be achieved.
  • the host organisms Before the expression of the foreign protein is induced, the host organisms can achieve a high growth density without any selection disadvantages that would arise from the expression of a foreign protein.
  • the glu and Lys plasminogen recombinantly produced in the present invention contain all five Kringle domains, making their recombinant production difficult for the following reasons makes:
  • the production of glu or Lys plasminogen has not been disclosed in WO02 / 50290.
  • the recombinant protein contains a signal peptide, a Kex2 and at least one Stel3, preferably two Stel3, protease cleavage sites.
  • a glycerol feed between 0.1 and 10 ml / h, preferably between 0.5 and 5 ml / h, more preferably between 0.8 and 1.5 ml / h, was carried out as a further C source and the culture medium buffered to neutral pH of 7.0. Care was taken to ensure sufficient oxygen input.
  • a constitutive promoter was used, not an inducible one. Constitutive promoters that are active and can be used in yeast are the GAP promoter, the YPT1 promoter (Sears et al., Yeast 1998: 14 (8), 783-90), the TKL promoter (Den Haan and Van Zyl, Appl. Microbiol. Biotechnol.
  • Preferred promoters are the GAP promoter and the YPTI promoter.
  • a particularly preferred promoter is the GAP promoter.
  • a constitutive promoter In contrast to an inducible promoter, a constitutive promoter has the disadvantage that the foreign protein to be expressed is produced constructively, that is to say during the entire wax phase. This creates disadvantages for the host cell, which u. a. expresses in a slower growth. Because of the prevailing selection pressure, host cells that have lost the recombinant expression cassette have an advantage and can overgrow the recombinant host cells. This can result in a heterogeneous mixed population that should be avoided. Surprisingly, however, it was found that the constitutive GAP promoter according to a preferred embodiment of the present invention enables a higher yield.
  • a constitutive promoter e.g. B. the GAP promoter is operatively linked to a nucleic acid which codes for at least the functional part of the plasminogen sequence, and which is fused to a nucleic acid sequence which codes for at least one signal peptide, the nucleic acid sequence coding for the functional plasminogen and for at least the nucleic acid sequence encoding the signal peptide is linked to codons for interfaces of proteases which ensure the cleavage of the signal peptide.
  • a constitutive promoter e.g. B. the GAP promoter with the nucleic acid sequence of the micro, mini, Lys or Glu plasminogen operatively linked, which is fused with the nucleic acid sequence of a signal peptide from the yeast.
  • the constitutive GAP promoter according to a preferred embodiment of the present invention enables an approximately 10-fold higher yield (see Example 7c, production of Lys-Plasminogen, 1375 U / 1, which corresponds to 125 mg / 1 results).
  • a glycerol feed between 0.1 and 10 ml / h, preferably between 0.5 and 5 ml / h, more preferably between 0.8 and 1.5 ml / h, is carried out as a further C source and the culture medium buffered to neutral pH of 7.0.
  • the growth rate ⁇ [1 / h] reaches values between 0.002 and 0.10, preferably between 0.004 and 0.020, more preferably between 0.008 and 0.010.
  • lys plasminogen of at least 660 U / 1 (60 mg / 1), preferably 1000 U / 1 ( ⁇ 91 mg / 1), preferably 1500 U / 1 ( ⁇ 136 mg / 1) , more preferably 2000 U / 1 ( ⁇ 182 mg / ml), preferably 2500 U / 1 ( ⁇ 227 mg / 1), particularly preferably and further particularly preferably 2750 U / 1 ( ⁇ 250 mg / 1) after a fermentation time of 250 Received hours.
  • mini and microplasminogen In the recombinant production of mini and microplasminogen, correspondingly higher yields were obtained.
  • the yields of miniplasminogen are between 100 mg to 2 g per liter, preferably from 300 mg / 1 to 1.5 g / 1, more preferably from 400 mg / 1 to 1 g / 1 and more preferably from 500 mg / 1 to 800 mg / 1 and particularly preferably from 600 to 700 mg / 1.
  • the yields of microplasminogen are also at least 10% higher than that of miniplasminogen.
  • the recombinant production of glu-plasminogen yielded slightly poorer yields in comparison to lys-plasminogen.
  • the method according to the invention is suitable for the production of mini, micro, Lys and glu plasminogen.
  • Preferred embodiments are therefore directed to the recombinant Production of mini, micro, Lys and Glu plasminogen, which are each coupled to a signal or prepro sequence, in an expression vector which contains a consumer promoter, e.g. B. contains the GAP promoter.
  • the signal sequence consists of the signal peptide or prepropeptide of the alpha factor of the yeast Saccharomyces cerevisiae.
  • a constitutive promoter e.g. B. the GAP promoter, operatively with a nucleic acid of the sequences Seq. ID. No. 7 or 9 or one of the sequences Seq. ID. No. 13 or 15 or one of the sequences Seq. ID. Nos. 50 to 59 linked and expressed in a suitable expression vector.
  • a constitutive promoter e.g. B. the GAP promoter is operatively linked to a nucleic acid which codes for at least the functional part of the plasminogen sequence.
  • a constitutive promoter e.g. B. the GAP promoter, operatively with a nucleic acid of the sequences Seq. ID. Nos. 13, 15, 7 and 9 or one of the sequences Seq. ID. No. 50 to 59 or the sequence Seq. ID. No. 11 linked and expressed in a suitable expression vector
  • 7,121 isoelectric point at pH 7.0: 1,351 glycosylation sites: O-268, N-308, O-365 (the numbering refers to the 810 AS-long pre-plasminogen)
  • Lys plasminogen (data calculated using the EditSeq TM (DNASTAR) program) Molecular weight: 79655.71 Daltons 714 amino acids
  • the fusion product formed in step a) of the present invention can also be inserted into an expression vector suitable for microorganisms.
  • This expression vector is preferably selected from the group comprising pPICZ ⁇ A, B and C and pPICZ A, B and C and pGAPZ ⁇ A, B and C and pGAPZA, B and C and pPIC6 ⁇ A, B and C and pPIC6A, B and C and pAO815, pPIC3 , 5K and pPIC9K.
  • the introduction into the expression vector is again preferably carried out by ligation.
  • the PCR product and the expression vector are preferably cut with the restriction endonucleases Kspl and Xh ⁇ i before they are ligated with a T4 DNA ligase.
  • the ligated nucleic acid can be transformed into a microorganism, preferably E. coli, by electroporation and the DNA can be isolated from the transformed strains thus obtained and separated by endonucleolytic cleavage, preferably with Xhol or Sful and Kspl.
  • the nucleic acid obtained in this way can be a plasmid, preferably selected from the group pMHS476.1, pSM54.2, pSM49.8, pSM82.1, pSM58.1, pAC37.1, pJW9.1, pPLGl.l, pPLG2.1, pPLG3.2, pPLG4.2, pPLG5.3, pPLG6.1, pPLG7.1, pPLG8.3, pPLG9.1, pPLGlO.l, pPLG11.2, pPLG12.1, pPLG13.1, pPLG14.2, pPLG15.
  • Two oligonucleotide primers selected from the group comprising N034 (Sequence ID number 1), N036 (Sequence ID number 2), N036a (Sequence ID number 19), N036b (sequence) are preferably used as primers for the above-mentioned amplification -ID- number 20), N036c (sequence ID number 21), N036d (sequence ID number 22), N036e (sequence ID number 23), N036f (sequence ID number 24), N036g (sequence -ID number 25), N036h (Sequence ID number 26), N036i (Sequence ID number 27), N036j (Sequence ID number 28), N057 (Sequence ID number 3), N037 (Sequence ID -
  • Codons which code for the protease Kex2 and the protease Stel3 and the plasminogen fusion protein which has the amino acid sequence shown in Sequence ID number 10 or 16.
  • the above-mentioned plasmid which is preferably selected from the above-mentioned group, is transformed into a microbial host.
  • the transformation can be carried out, for example, by electroporation.
  • the microorganism used is preferably a eukaryotic microorganism which belongs to the department of fungi.
  • Preferred microorganisms belong to the Ascomycota, preferably Saccharomycotina and thereof preferably the class of the Saccharomycetes, more preferably the order of the Saccharomycetales, more preferably the family of the Saccharomycetaceae and particularly preferably the genera Pichia, Saccharomyces, Hansenula and Aspergillus.
  • the nucleic acid sequence coding for at least the functional part of the plasminogen is overexpressed from a microbial host organism transformed with the fusion product formed in step a) described above, and at least the functional part of plasminogen is secreted, preferably in the culture medium is secreted.
  • the functional part of the nucleic acid sequence of plasminogen is one of the sequences ID number 60, 61, 62, 63, 64, 65 or 66.
  • the functional part of the nucleic acid sequence of plasminogen corresponds to the complete plasminogen sequence.
  • a human functional plasminogen is preferably produced using the recombinant production method according to the present invention.
  • This plasminogen which is obtainable by the recombinant production process according to the present invention, or the plasmin resulting therefrom by the action of proteases, can be used to produce a medicament for the treatment of wounds, in particular for the treatment of slow or poorly healing wounds, for the treatment of thrombotic events , or for the prevention of thrombotic events.
  • the plasminogen produced according to the invention and the plasmin obtained therefrom have anti-coagulative properties. These advantageous properties also make it possible to use the plasminogen and / or plasmin as anti-thrombotic and anti-coagulant active ingredients for the prophylaxis and / or treatment of Heart attack, thrombosis, restenosis, hypoxia, ischemia, coagulation necrosis, inflammation of the blood vessels and for treatment after a heart attack, after bypass surgery, after angioplasty and after balloon dilatation.
  • the plasminogen can also be used for thrombolytic therapy in acute myocardial infarction, for recanalizing arteriovenous shunts and for reopening (reperfusion) of closed coronary arteries in acute myocardial infarction.
  • plasminogen produced according to the invention include the prophylaxis and treatment of acute pulmonary embolism, of fresh or older clots in the case of venous thrombosis, acute and subacute arterial thrombosis, venous thrombosis, acute arterial occlusion of the extremities, chronic occlusive arteriopathy, thrombosis of arteriovenous thrombosis and the extremities, early thrombosis in the area of the obliterated vessels, acute central vascular occlusion on the eye, conjunctivitis with plasminogen type I deficiency, burns and frostbite, burns and disseminated intravascular coagulation in shock.
  • Plasminogen and / or plasmin are preferably used for these indications together with an anticoagulant.
  • Heparin, heparin derivatives or acetylsalicylic acid are suitable as anticoagulants.
  • the present invention is therefore also directed to pharmaceutical compositions comprising a plasminogen which has been prepared according to the recombinant production process of the present invention, or the resulting plasmin, optionally in combination with a pharmaceutically acceptable carrier, additive and / or solvent.
  • the pharmaceutical compositions can preferably contain an anticoagulant active ingredient, in particular heparin, heparin derivatives or acetylsalicylic acid.
  • the plasminogen produced according to the invention and / or the plasmin obtained therefrom are preferably used in the external wound treatment in pharmaceutical compositions which are suitable for topical use.
  • Plasminogen and / or plasmin are used in a concentration of 0.01-500 U per gram of pharmaceutical composition, preferably 0.1-500 U, more preferably 0.1-250 U, further preferably 0.5-250 U per gram pharmaceutical composition and particularly preferably used in a concentration of 1 - 150 U plasminogen and / or plasmin per gram of pharmaceutical composition.
  • Preparations in the form of, for example, ointments, pastes, gels, etc. plasters or other dressing materials, the concentration ranges given above per 2 cm plaster surface or surface of the dressing material apply.
  • the pharmaceutical compositions according to the invention are produced in a known manner with the customary solid or liquid carriers or diluents and the commonly used pharmaceutical adjuvants according to the desired type of application in a suitable dosage.
  • the preferred pharmaceutical formulations or preparations are in a dosage form which is suitable for topical external application.
  • Such dosage forms are, for example, ointments, pastes, gels, films, dispersions, emulsions, suspensions or special formulations, such as, for example, nanodisperse systems in the form of liposomes, nanoemulsions or lipid nanoparticles, and also surfactant-free formulations, polymer-stabilized or solids-stabilized emulsions.
  • compositions for the prophylaxis and / or treatment of heart attack thrombosis, restenosis, hypoxia, ischemia, coagulation necrosis, inflammation of the blood vessels, acute myocardial infarction and for treatment after a heart attack, after a bypass operation, after an angioplasty and after
  • parenteral administration are suitable for balloon dilation.
  • compositions are suitable for various systemic applications, including use for acute pulmonary embolism, thrombolytic therapy for acute myocardial infarction, fish or older clots for venous thrombosis, acute and subacute arterial thrombosis, recanalization of arteriovenous shunts, venous thrombosis, reopening (reperfusion arteries) of closed coronary artery acute heart attack, acute arterial occlusion of the extremities, chronic occlusive arteriopathies, thrombosis of arteriovenous shunts, deep vein thrombosis of the pelvis and extremities, early thrombosis in the area of desobliterated vessels, acute central vascular occlusion on the eye, conjunctivitis with plasminogen and type I deficiency, burns or disseminated intravascular coagulation in shock.
  • acute pulmonary embolism thrombolytic therapy for acute myocardial infarction, fish or older clot
  • plasminogen deficiency such as. B. acquired or congenital plasminogen deficiency (homozygous type I plasminogen deficiency)
  • the z. B. can lead to conjunctivitis lignosa or thrombophilia.
  • intravenous administration of the recombinant plasminogen including the forms of glu, lys, mini and microplasminogen, as well as of these derived variants to treat the disease.
  • the recombinantly produced plasminogen may be used together with the plasmin obtained therefrom or also only plasmin in pharmaceutical compositions which are used for the prophylaxis and / or treatment of acute pulmonary embolism, thrombolytic therapy for acute myocardial infarction, fresh or older clots for venous thrombosis, acute and subacute arterial Thrombosis, recanalization of arteriovenous shunts, venous thrombosis, reopening (reperfusion) of closed coronary arteries in acute myocardial infarction, acute arterial occlusion of the extremities, chronic occlusive arteriopathies, thrombosis of arteriovenous shunts, deep vein thrombosis of the pelvic area and central vein occlusion, amniotic and occlusive areas Eye, conjunctivitis with plasminogen type I deficiency, burns, burns and frostbite, dissemin
  • the plasminogen produced recombinantly according to the invention is preferably used in pharmaceutical compositions which are suitable for the topical treatment of burns, frostbite, burns, injuries and / or wounds, in particular poorly healing wounds.
  • the recombinant plasminogen is preferably used together with at least one activator (plasminogen activators such as urokinase or streptokinase).
  • activator plasminogen activators such as urokinase or streptokinase
  • Another preferred possibility consists in converting the plasminogen produced according to the invention in whole or in part by means of an activator into plasmin and using it as plasmin or plasmin with plasminogen in the indications and formulations described herein.
  • Intravenous, intravascular, intraperitoneal, subcutaneous and intramuscular administration are considered as parenteral applications.
  • the protein in particular in the form of solutions for injection or infusion, is used in a concentration of 0.1-100 million units, preferably 10 to 100 million units per 10 ml solution, further preferably 1 to 10 million units per 10 ml solution and particularly preferably 3 to 5 million units per 10 ml of solution.
  • the protein in formulations suitable for oral administration, is in a concentration of 0.1 to 100,000 units per gram of formulation, preferably 100 to 80,000 units per gram of formulation and particularly preferably 1,000 to 50,000 units per gram of formulation.
  • compositions for example, protease-containing plasters, bandages or other dressing materials. These formulations are particularly suitable for topical use in wound treatment or for the treatment of burns, frostbite, burns and / or injuries.
  • the plasminogen produced recombinantly according to the invention is preferably used in the pharmaceutical compositions, in particular the wound healing agents, plasters and bandaging materials, together with at least one activator (plasminogen activators such as urokinase or streptokinase) or previously converted into plasmin using the activators described above and possibly together with as plasmin Plasminogen and possibly used with at least one activator in and / or on the pharmaceutical compositions and formulations.
  • activator plasminogen activators such as urokinase or streptokinase
  • plasminogen preferably plasminogen with an activator, or plasmin or plasmin together with plasminogen and an activator in and / or on plasters and dressing materials which are used for wound treatment, in particular for treating poorly healing wounds, and for treating burns, Frostbite, burns or other injuries are suitable.
  • the dressing materials, wound dressings or plasters contain the plasminogen produced according to the invention and / or plasmin obtained therefrom in a concentration of 0.01
  • 500 units of plasminogen and / or plasmin per cm 2 of the pharmaceutical formulation preferably 0.1 to 500 units of plasminogen and / or plasmin per cm 2 of dressing material or plaster.
  • the pasminogen and / or plasmin is further preferred in a concentration of 0.1-250 units, further preferably 0.5-250 units and particularly preferably 1
  • urokinase Between 100 ⁇ g and 1 ng urokinase are used for the activation of 1 mg plasminogen, preferably between 10 ⁇ g and 10ng urokinase. Between 1 mg and 1 ⁇ g streptokinase are used for the activation of 1 mg plasminogen, preferably between 300 ⁇ g and 3 ⁇ g streptokinase are used. Between 100 ⁇ g and 10 ng protease from S. griseus are used for the activation of 1 mg plasminogen, preferably between 10 ⁇ g and 100 ng protease from S. griseus are used.
  • protease VIII are used for the activation of 1 mg plasminogen, preferably between 10 ⁇ g and 100 ng protease VIII.
  • the nucleic acid sequence coding for the functional part of the plasminogen is preferably a DNA sequence.
  • the present invention also relates to the following plasmids:
  • Plasmid pSM54.2 (accession number: DSM 14682)
  • Plasmid ⁇ SM82.1 (deposit number: DSM 14679)
  • Plasmid ⁇ SM58.1 (deposit number: DSM 14680)
  • Plasmid ⁇ AC37.1 (deposit number: DSM 15369)
  • Plasmid pJW9.1 (accession number: DSM 15368).
  • the present invention relates to a DNA sequence suitable for expression, which comprises at least the nucleic acid sequence coding for the functional part of plasminogen, obtainable by the recombinant production method according to the present invention. It also affects the microbial host organism, which Fusion product obtained in step a) described above and a nucleic acid sequence derived therefrom.
  • the present invention further relates to a vector, a DNA molecule or an RNA molecule which comprises the fusion product obtained in step a) described above or a nucleic acid sequence derived therefrom.
  • the present invention also relates to a screening method for the identification of plasminogen activators, in particular plasminogen-activating proteases, the functional plasminogen, produced according to the recombinant production method described above, being used.
  • the resulting piasmin activity is preferably measured after preincubation of the proteases with the functional plasminogen, as produced according to the present invention.
  • the resulting piasmin activity can be measured with a synthetic peptide substrate.
  • the resulting piasmin activity is particularly preferably measured with N-tosyl-Gly-Pro-Lys-pNA.
  • Fig. 1 Physical map of the plasmid pMHS476.1 (5682 bp).
  • the gene of the prepropeptide of the alpha factor is linked to the human Lys plasminogen gene by the codons for a Kex2 interface and is under the control of the AOX1 promoter.
  • Fig. 2 Physical map of the plasmid pSM54.2 (5694 bp).
  • the gene of the prepropeptide of the alpha factor is linked to the human Lys plasminogen gene by the codons for a Kex2 interface and two Stel3 interfaces and is under the control of the AOX1 promoter.
  • Fig. 3 Physical map of the plasmid pSM49.8 (5715 bp).
  • the human preplasminogen gene is under the control of the AOXl promoter.
  • Fig. 4 Physical map of plasmid pSM82.1 (5913 bp).
  • the gene of the prepropeptide of the alpha factor is linked to the human Lys plasminogen gene by the codons for a Kex2 interface and is under the control of the AOX1 promoter.
  • Fig. 5 Physical map of plasmid pSM58.1 (5925 bp).
  • the gene of the prepropeptide of the alpha factor is linked to the human glu-plasminogen gene by the codons for a Kex2 site and two Stel3 sites and is under the control of the AOX1 promoter.
  • Fig. 6 Physical map of plasmid pAC37.1 (11400 bp).
  • the gene of the prepropeptide of the alpha factor is linked to the human Lys plasminogen gene by the codons for a Kex2 interface and two Stel3 interfaces and is under the control of the AOX1 promoter.
  • Fig. 7 Physical map of plasmid pJW9.1 (5925 bp).
  • the gene of the prepropeptide of the alpha factor is linked to the human Lys plasminogen gene by the codons for a Kex2 site and two Stel3 sites and is under the control of the GAP promoter.
  • Fig. 8 Physical map of the plasmid pPLGl.l.
  • the gene of the prepropeptide of the alpha factor is linked to the human mini-plasminogen gene by the codons for a Kex2 interface and two Stel3 interfaces and is under the control of the AOX1 promoter.
  • Fig. 9 Physical map of the plasmid pPLGl 1.2.
  • the prepropeptide of the alpha factor is linked to the human mini-plasminogen gene by the codons for a Kex2 site and two Stel3 sites and is under the control of the GAP promoter.
  • Fig. 10 Detection of fibrinolysis activity in the clarification yard assay.
  • microorganisms which are capable of carrying out the glycosylation and, if desired, the secretion of proteins are suitable as host organisms.
  • host organisms examples include: S. cerevisiae, P. pastoris, P. methanolica and H. polymorpha or the filamentous fungus Aspergillus sp.
  • the functional plasminogen or plasmin produced according to the present production method in a pharmaceutical formulation is possible.
  • the functional plasminogen can be mixed with a pharmaceutically acceptable carrier or auxiliary as well as other suitable hoofs or additives in a manner known to those skilled in the art.
  • the Kex2 interface ensures that the propeptide is split off by the Kex2 protease located in the Golgi apparatus.
  • This protease also called protease YscF or kexin, is a proprotein-processing serine protease that cuts C-terminally from basic amino acid pairs (for example: Lys-Arg).
  • the Stel3 interface ensures that the propeptide is split off by the protease Stel3 located in the Golgi apparatus.
  • Stel3 also called protease YscVI or Dipeptidylaminopeptidase A
  • protease YscVI Dipeptidylaminopeptidase A
  • interfaces for the proteases Kex2 and Ste 13 In addition to the interfaces for the proteases Kex2 and Ste 13, further interfaces can be inserted which are recognized as a substrate by proteases located in the endoplasmic reticulum or in the Golgi device.
  • the propeptide e.g. B. the mating factor of yeast S. cerevisiae is not absolutely necessary.
  • pPICZA, B and C are 3.3 kb Pichia pastoris expression vectors.
  • the vectors carry a Zeocin resistance gene for the direct selection of Ptc ⁇ t transformants.
  • the vectors also carry a C-terminal tag sequence, which enables rapid purification and the detection of fusion proteins.
  • PPICZalpha A, B and C are 3.6 kb Pichia pastoris expression vectors which also carry the Zeocin resistance gene and the above-mentioned C-terminal tag sequence. They also contain the alpha-factor secretion signal from Saccharomyces cerevisiae for an efficient transport of proteins into the medium.
  • the plasminogen can also be activated.
  • the plasminogen can be incubated, for example, with a protease that was identified using the screening method according to the invention.
  • the plasminogen is preferably incubated with protease from S. griseus, with protease VIII or protease XVIII, with ficin, metalloendopeptidase, clostripain, with endoproteinase Glu-C, protease XIII, proteinase A, trypsin, endoproteinase Asp-N or elastase. It is also conceivable to activate plasminogen by incubating plasminogen with one of the proteases t-PA, u-PA, or vb-PA (vampire bat PA).
  • the plasminogen is activated by incubating it with staphylokinase or with streptokinase. Streptokinase or staphylokinase form a 1: 1 complex with plasminogen. As a result of this complex formation, the plasminogen bound in the complex undergoes a conformational change, so that it becomes proteolytically active and is able to activate plasminogen to plasmin.
  • the functional plasminogen or activated functional plasmin produced according to the present recombinant manufacturing process is capable of hydrolyzing fibrin. It is also able to activate pro-matrix metalloproteases and growth factors.
  • Example la Amplification of the Lys plasminogen gene with incorporation of the codons for a Kex2 interface at the 5 'end
  • the plasmid pPLGKG (Forsgren et al, FEBS Lett. 1987 Mar 23; 213 (2): 254-60 (2)), which contains the gene for pre-glu-plasminogen, was derived from the strain E. coli HB101 (pPLGKG) isolated using the QIAGEN Plasmid Midi-Kit (QIAGEN, Hilden). 150 ng of pPLGKG-DNA were linearized with 10 U of the restriction endonuclease EcoRI (Röche, Mannheim) and then purified with the QIAquick PCR-Purification Kit (QIAGEN, Hilden). The oligonucleotide-primer pair N034 (Seq. ID No. 1) and N036 (Seq.
  • the oligonucleotide primer N036 bears the codons for the Kex2 interface.
  • 0.5 UJ DNA polymerase Hybaid, Heidelberg
  • 400 nM each of the oligonucleotide primers 200 ⁇ M dNTP, 3 ng linearized pPLGKG-DNA and the associated reaction buffer were used in a final volume of 50 ⁇ l.
  • the primer binding temperature was 58 ° C.
  • the resulting PCR product was examined for the expected size by agarose gel electrophoresis and purified using the QIAquick PCR Purification Kit.
  • the DNA of the ligating ring approach was then purified using the QIAquick PCR purification kit and used to transform E. coli JM109 by electroporation.
  • E. coli JM109 cells were incubated for 1 h at 37 ° C. in 1 ml SOC medium, then plated on LB agar solid medium with 20 ⁇ g / ⁇ l zeocin (Invitrogen, Groningen, Netherlands) and overnight at 37 ° C incubated.
  • the DNA was isolated from one of the E. co / z strains thus obtained using the QIAGEN Plasmid Mini-Kit (QIAGEN, Hilden) and separated 300 ng after endonucleolytic cleavage with the enzymes Xhol and Kspl by agarose gel electrophoresis.
  • the isolated plasmid contained a fragment of the expected size and was named pMHS476.1 (Fig. 1).
  • the correct sequence of the fusion gene from the prepropeptide gene of the alpha factor of the yeast Saccharomyces cerevisiae and the Lys plasminogen gene and the codons for the interface sequence of the protease Kex2 was confirmed by sequence analysis (Seq. ID No. 7).
  • plasmid DNA of the plasminogen expression vector pMHS476.1 was isolated from the strain E. coli JM109 (pMHS476.1). 10 ⁇ g of pMHS476.1 DNA were linearized with 100 U Pmel (New England Biolabs, Frankfurt) and according to the protocol for electroporation of Pichia pastoris KM71H his 4 :: HIS 4 arg 4 aoxl :: reproduced in the EasySelect TM Pichia Expression Kit Instruction Manual. ARG 4 genotype from Pichia pastoris Y-11430 (Northern Regional Research Laboratories, Peoria, USA) was used.
  • BMGY medium EasySelect TM Pichia Expression Kit Instruction Manual
  • 100 ml of BMGY medium EasySelect TM Pichia Expression Kit Instruction Manual
  • the precultures were then centrifuged at 4645 g and 4 ° C. for 10 min.
  • the cells harvested in this way were resuspended in BMMY medium (0.5% methanol) in order to obtain a biofum concentration of 80 g / l.
  • 60 ml of these main cultures were incubated in 300 ml baffle flasks at 28 ° C and 250 rpm for 118 h. After 24 and 72 hours, 2% methanol was added.
  • the baffle flask and the high speed of 250 rpm were used to ensure sufficient oxygen entry, which is necessary when using the AOX promoter.
  • Example le Measurement of the plasminogen activity in the supernatant of the main cultures after activation with streptokinase
  • the main culture samples were centrifuged at 16,000 g for 10 min. 300 ⁇ l of the supernatant were incubated for 20 min at 37 ° C. with 1 ⁇ l streptokinase (S8026) (Sigma, Deisenhofen). To 750 ⁇ l 100 mM sodium phosphate buffer pH 8, 0.36 mM CaCl 2 , 0.9% NaCl was added 100 ⁇ l N-tosyl-Gly-Pro-Lys-pNA solution (9.5 mg dissolved in 75 mg glycine / 10 ml, 2% Tween® 20) pipetted and incubated at 37 ° C for 10 min.
  • S8026 streptokinase
  • Example 2a Amplification of the Lys plasminogen gene with incorporation of the codons of a Kex2 interface and two Stel3 interfaces at the 5 'end
  • the amplification of the Lys plasminogen gene for cloning into the vector pPICZ ⁇ A with incorporation of the codons for a Kex2 interface and two Stel3 interfaces was carried out with the two oligonucleotide primers N034 and N057 (Seq. ID No. 3) using the in Example la conditions described performed.
  • the oligonucleotide primer N057 carries in addition to the bases complementary to the plasminogen gene, the codons for the Kex2 interface and the Ste 13 interfaces.
  • Example 2b Cloning of the Lys plasminogen gene amplified as described in Example 2a into the vector pPICZ ⁇ A
  • the cloning of the Lys plasminogen gene into the vector pPICZ ⁇ A for the production of a fusion gene from the gene of the prepropeptide of the alpha factor of the yeast S. cerevisiae and the human plasminogen gene with incorporation of the codons for the interfaces of the proteases Kex2 and Stel3 was analogous to the cloning described in Example 1b.
  • the plasmid obtained was designated pSM54.2 (Fig.2).
  • the correct sequence (Seq. ID No. 9) was confirmed by sequence analysis.
  • Pichia pastoris KM71H was transformed with the plasmid pSM54.2.
  • the colonies obtained were referred to as Pichia pastoris KM71H / pSM54.2-l / a, where “a” in turn stands for the consecutive numbering of the colonies starting with 1.
  • Example 2d Cultivation of Pichia pastoris KM71H / pSM54.2-l / l to -1/3 and induction of the plasminogen gene
  • Example 2e Measurement of the plasminogen activity in the samples of the main cultures after activation with streptokinase
  • the plasminogen activity after activation with streptokinase was determined as described in example le for KM71H / pMHS476.1-l / l to -1/3. The following activity values were obtained for the samples taken after 72 h induction: KM71H / pSM54.2-l / l: 2 U / 1; KM71H / pSM54.2-l / 2: 8 U / 1; KM71H / pSM54.2-l / 3: 6 U / 1.
  • Example 3a Amplification of the plasminogen gene with its own signal sequence and cloning into the vector pPICZA; Transformation of Pichia pastoris
  • the amplification of the plasminogen gene including the sequence coding for the own signal peptide (pre-plasminogen) for cloning into the vector pPICZA was carried out with the two oligonucleotide primers N034 and N037 (Seq. ID No. 4) using the ones described in Example la Conditions carried out.
  • the cloning of the pre-plasminogen gene into the vector pPICZA was carried out analogously to the cloning described in Example 1b, with both the vector and the PCR product being cut with the restriction endonucleases Sful and Kspl.
  • the plasmid obtained was designated pSM49.8 (Fig.3).
  • the correct sequence (Seq. ID No. 11) was confirmed by sequence analysis.
  • Pichia pastoris KM71H was transformed with the plasmid pSM49.8.
  • the colonies obtained were referred to as Pichia pastoris KM71H / pSM49.8-l / a, where “a” in turn stands for the consecutive numbering of the colonies starting with 1.
  • Example 4a Amplification of the human GIu plasminogen gene with incorporation of the codons of a Kex2 interface and cloning into the expression vector pPICZ ⁇ (alpha) A; Transformation of Pichia pastoris
  • the amplification of the glu-plasminogen gene for cloning into the vector pPICZ ⁇ A with incorporation of the codons for a Kex2 interface was carried out with the two oligonucleotide primers N034 and N035 (Seq. ID No. 5) using the conditions described in Example la , In addition to the bases complementary to the glu-plasminogen gene, the oligonucleotide primer N035 bears the codons for the Kex2 interface.
  • the cloning of the glu-plasminogen gene in the vector pPICZ ⁇ A for the production of a fusion gene from the gene of the prepropeptide of the alpha factor of the yeast S. cerevisiae and the human glu-plasminogen gene with incorporation of the codons for the interfaces of the protease Kex2 was analogous to the cloning described in Example 1b.
  • the plasmid obtained was designated pSM82.1 (Fig.4).
  • the correct sequence (Seq. ID No. 13) was confirmed by sequence analysis.
  • Pichia pastoris KM71H was transformed with the plasmid pSM82.1.
  • the colonies obtained were referred to as Pichia pastoris KM71H / pSM82.1 / a, where “a” again stands for the consecutive numbering of the colonies starting with 1.
  • Example 5a Amplification of the human glu-plasminogen gene with incorporation of the codons of a Kex2 site and two Stel3 sites at the 5 'end and cloning into the expression vector pPICZ ⁇ A; Transformation of Pichia pastoris
  • the amplification of the glu-plasminogen gene for cloning into the vector pPICZ ⁇ A with incorporation of the codons for a Kex2 interface and two Stel3 interfaces was carried out with the two oligonucleotide primers N034 and N056 (Seq. ID No. 6) using the in Example la conditions described performed.
  • the oligonucleotide primer N056 bears the codons for the Kex2 and Stel3 interfaces.
  • the cloning of the glu-plasminogen gene in the vector pPICZ ⁇ A to produce a fusion gene from the gene of the prepropeptide of the alpha factor of the yeast S. cerevisiae and the human glu-plasminogen gene with incorporation of the codons for the interfaces of the proteases Kex2 and Stel3 was carried out analogously to the cloning described in Example 1b.
  • the plasmid obtained was designated pSM58.1 (Fig.5).
  • the correct sequence (Seq. ID No. 15) was confirmed by sequence analysis.
  • Pichia pastoris KM71H was transformed with the plasmid pSM58.1.
  • the colonies obtained were designated Pichia pastoris KM71H / pSM58.1 / a, where “a” in turn stands for the consecutive numbering of the colonies starting with 1.
  • Example 6a Insertion of the Lys plasminogen gene from pSM54.2 into the vector pPIC9K
  • plasmid constructed in this way was designated pAC37.1 (FIG. 6).
  • Pichia pastoris KM71 was transformed with the plasmid pAC37.1 linearized with the restriction endonuclease SaR.
  • the transformed cells were plated out on the histidine-free medium MD-agar (Multi-Copy Pichia Expression Kit Instruction Manual) and incubated.
  • the colonies obtained were referred to as Pichia pastoris KM71 / pAC37.1-3 / a, where “a” in turn stands for the consecutive numbering of the colonies starting with 1.
  • Example 6c Cultivation of Pichia pastoris KM71 / pAC37.1-3 / l and induction of the plasminogen gene
  • Example 1d The preparation of the precultures and of the main cultures and the induction with methanol were carried out analogously to the conditions described in Example 1d. Induction took place over 216 h. It started with a methanol concentration of 0.5%, after 24 h and then at 48 h intervals, 2% methanol was added.
  • Example 6d Measurement of the plasminogen activity in the samples of the main cultures after activation with streptokinase
  • the plasminogen activity after activation with streptokinase was determined as described in example le for KM71H / ⁇ MHS476.1-l / l to -1/3. Obtain 120 U / 1 activity for the sample taken after 120 h induction. After 216 h induction, 190 U / 1 activity could be measured.
  • Example 6e Induction of Pichia pastoris KM71 / pAC37.1-3 / l in minimal medium (BSM) and measurement of the plasminogen activity in the samples of the main cultures after activation with streptokinase
  • BSM Basal Salts Medium
  • Biotin solution (0.2 g / L): 8.0 mL / L.
  • composition of the trace solution H2SO4: 5.0 mL / L; CuSO4-5H2O: 6.0 g / L; KI: 0.08 g / L;
  • MnSO4-H2O 3.0 g / L; Na2MoO4: 0.2 g / L; H3BO3: 0.02 g / L; CoC12: 0.5 g / L; ZnC12: 20.0 g / L; FeSO4-7H2O: 65.0 g / L.
  • Activation with streptokinase was determined as described in example le for KM71H / pMHS476.1-l / l to -1/3. After 120 hours of induction, 193 U / 1 plasminogen activity was determined, after 168 h 289 U / L could be measured.
  • Example 6f Detection of the plasminogen activity in the samples of the main cultures after activation with streptokinase in the fibrinolysis clarification test
  • 35 ml of a fibrinogen solution (225 mg / 37.5 ml 50 mM sodium phosphate buffer pH 7.4) were bubble-free with 350 ⁇ l thrombin solution (10 U / ml in 50 mM sodium phosphate buffer pH 7.4) mixed, stirred into the agarose solution and poured into a petri dish. After the fibrin agar solidified, 1 mm holes were made in the agar.
  • Example 6g Purification of the plasminogen recombinantly produced in Pichia pastoris KM71 / pAC37.1-3 / l by affinity chromatography
  • Proteins bound non-specifically bound were washed with 50 mM sodium phosphate buffer, pH 7.5, 0.5 M NaCl.
  • the bound plasminogen was eluted with 50 mM sodium phosphate buffer pH 7.5, 0.01 M ⁇ -aminocaproic acid.
  • Individual samples were analyzed by 7.5% SDS-PAGE with subsequent silver staining (FIG. 11).
  • the recombinant plasminogen contained in the fractions is in the gel at the level of the human plasminogen applied as a reference (see FIG. 11).
  • FIG. 11 shows a 7.5% SDS-PAGE of the cleaning fractions from example 6g.
  • the abbreviations used in FIG. 11 have the following meanings:
  • M size standard (from top to bottom: 116 kDa, 66 kDa, 45 kDa, 35 kDa.)
  • Plg plasminogen (American Diagnostica, Pfung GmbH).
  • Example 6h Fermentation of Pichia pastoris KM71 / pAC37.1-3 / l to evaluate the pH and the influence of the substrate
  • YEP-G medium (10 g / 1 yeast extract, 20 g / 1 casein peptone, 20 g / 1 glycerol) in a 1 1 wide-necked flask without baffles were mixed with 2 ml glycerol cryoculture Pichia pastoris KM71 / ⁇ AC37.1-3 / l inoculated and incubated for 9 h at 30 ° C and 300 rpm.
  • glycerol feed medium 500 g / l anhydrous glycerol, 10 ml / l trace solution, 10 ml / l biotin solution [see Example 6e]
  • glycerol feed medium 500 g / l anhydrous glycerol, 10 ml / l trace solution, 10 ml / l biotin solution [see Example 6e]
  • Example 7a Inserting the Lys plasminogen gene from pAC37.1 into the vector pGAPZ ⁇ A
  • the two fragments were combined and ligated with 1 U T4 DNA ligase overnight at 4 ° C.
  • the transformation of E. coli DH5 ⁇ , the isolation and characterization of the resulting plasmid was carried out analogously to the description in Example 1b.
  • the plasmid constructed in this way was designated pJW9.1 (Fig.7).
  • Example 7b Transformation of Pichia pastoris with the plasmid pJW9.1
  • Pichia pastoris KM71H was transformed with the plasmid pJW9.1 linearized with the restriction endonuclease Blnl.
  • the transformed cells were plated on YPDS agar with 100 ⁇ g / ml Zeocin (EasySelect TM Pichia Expression Kit Instruction Manual) and incubated.
  • the colonies obtained were designated Pichia pastoris KM71H / JW9.1-a, where "a” in turn stands for the consecutive numbering of the colonies starting with 1.
  • Example 7c Fermentation of Pichia pastoris KM71H / pJW9.1-3 to evaluate the pH value and the glycerol feed rate
  • Example 7d Fermentation of Pichia pastoris KM71H / pJTW9.1-3
  • YEP-G medium (10 g / 1 yeast extract, 20 g / 1 casein peptone, 20 g / 1 glycerol) in a 1 1 wide neck flask without baffles were inoculated with Pichia pastoris KM71H / pJW9.1-3 and added for 9 h Incubated at 30 ° C and 300 rpm. 10 ml of this culture was used to make 40 ml MG medium (5 g / 1 yeast nitrogen base w / o amino acids, 20 g / 1 glycerol, 2.5 ml / 1 biotin solution (0.2g / l)) in a 1 1 wide-mouth shake flask without inoculation. This culture was incubated at 30 ° C and 300 rpm for 16 h.
  • 3 1 BSM medium (see Example 6e) were inoculated with 30 ml of this culture in a 7.5 1 laboratory fermenter (type Labfors, ors AG, CH). The fermentation was carried out at 25 ° C. and a constant gassing rate of 3.2 l / min. After 24 h, glycerol solution (500 g / l glycerol, 10 ml / 1 trace solution, 10 ml / 1 biotin solution [see Example 6e]) was metered in. The dosage rate was gradually increased from 10 ml / h during the fermentation to 45 ml / h. After 250 h, 1375 U / 1 plasminogen activity after streptokinase activation could be measured.
  • glycerol solution 500 g / l glycerol, 10 ml / 1 trace solution, 10 ml / 1 biotin solution [see Example 6e]
  • proteases supplied in powder form were dissolved in buffer, the proteases supplied in solution were used directly or, if necessary, diluted with buffer. 25 ul of the protease solutions were mixed with 25 ul plasminogen according to the present invention (20 mg / ml) and incubated at 37 ° C for 10 min. The plasmin activity with respect to the substrate N-tosyl-Gly-Pro-Lys-pNA was then determined.
  • proteases protease from S. griseus, protease VIII, protease XXIII, protease XLX, protease XVIII, ficin, metalloendopeptidase, clostripain, Glu-C, protease XIII, chymopapain, chymotrypsin, protease X, bromelain, kallikrein and proteinase A were from Sigma, Related to Deisenhofen; Trypsin, papain, Asp-N, Dispase I, Lys-C, thrombin and elastase were from Röche, Mannheim, proteinase K was supplied by QIAGEN, Hilden.
  • the protease stock solutions produced had the protein concentrations given in the table.
  • the dilution factor F indicates the ratio in which the stock solutions were diluted for the measurements.
  • the recombinant functional plasminogen used in the following examples was obtained using the inventive production process.
  • the term "plasminogen” refers to both recombinant micro, mini, Lys or glu plasminogen and the term "plasmin” to plasmin, which by proteolytic cleavage of recombinant micro, mini, Lys or glu plasminogen was won.
  • the activation of micro, mini, Lys or Glu plasminogen can be obtained using the same plasminogen activators, in particular plasminogen activating proteases, as described above, but is not limited to this, the ratio of units activator to units plasminogen (micro , Mini, Lys or Glu plasminogen) is approximately 1: 1000.
  • the plasminogen can be proteolytic, i.e. H. activated by the proteases tissue plasminogen activator, urokinase or the proteases VIII or protease from S. griseus described in the patent, and also by complexation with streptokinase or staphylokinase.
  • Hydroxyethyl cellulose 10,000 3.5 g optional preservation (sorbic acid / potassium sorbate 0.1-0.4% » PHB ester 0.1%). purified water ad 100.0
  • hydroxyethyl cellulose or instead hypromellose or methyl cellulose can alternatively be used in an amount of 0.5-15.0 g.
  • Hydroxyethyl cellulose 10,000 32.5 g optional preservation (sorbic acid / potassium sorbate 0.1-0.4%, PHB ester 0.1%)
  • Hydrophilic ointment (macrogol ointment)
  • Macrogol 4000 10.0 g optional preservation (sorbic acid / potassium sorbate 0.1-0.2%, PHB ester 0.1%) purified water ad 50.0 g
  • Vaseline white to 100 g
  • Plasminogen 100 U Plasminogen activator (s) 0.1 U Hypromellose 400 20 g Vaseline, white to 100 g
  • Carbomer e.g. Carbopol 974p 15 g
  • Sorbitol 10 g optional preservation (sorbic acid / potassium sorbate 0.1-0.2%, PHB ester 0.1%)
  • Capsule one capsule with 0.25g powder / granules contains:
  • one capsule with 0.25g powder / granules contains:
  • 100g pellets contain:
  • plasminogen activator s
  • the same amount based on the activity of plasmin can also be used in the formulations listed. If plasmin is used directly, the plasminogen activator (s) need not be contained in the pharmaceutical formulation.
  • Hydroxyethylcellulose 400 2.5 - 5.0 g of purified water to 100.0 g
  • the swelling time is 1 to 3 hours.
  • Polyhexanide can optionally be used as an antimicrobial agent in a concentration of up to 0.2
  • Hydroxyethylcellulose 400 e.g. Tylose ® H 300 or Natrosol 250 ® HX PHARM
  • Macrogol 400 30.0 - 32.5 g
  • Macrogol 4000 12.5 - 7.5 g of purified water to 50.0 g
  • 12.5 g Macrogol 4000 and 30.0 g Macrogol 400 (7.5 g Macrogol 4000 and 32.5 g Macrogol 400 for soft ointments) are heated in an ointment dish in a water bath until the macrogol has melted. After cooling, the corresponding amount of plasmin, which was produced with the aid of the inventive method, is added dissolved in 7.5 g of purified water and then homogenized.
  • Propylene glycol 30 ml of purified water to 100 ml.
  • micro-, mini-, lys- or glu-plasminogen can also be used in the amounts specified for the plasmin based on the activity in units, if at least one plasminogen activator is added at the same time, in an amount of 1: 10,000 to 1 : 100, preferably in an amount of 1: 1000 based on the plasminogen activity.
  • Example 10a Amplification and cloning of various forms of the mini and microplasminogen gene and cloning into the vector pPICZ ⁇ A; Transformation of Pichia pastoris
  • Mini and microplasminogen are shortened plasminogen derivatives which lack N-terminal domains, but which can nevertheless be activated to active plasmin.
  • the amplification of the mini and microplasminogen genes for cloning into the vector pPICZ ⁇ A was carried out with the oligonucleotide primer N034 for the 3 'end and one of the primers N036a-j (Seq. ID No. 19 to 28) for the respective 5' end using the conditions described in Example la.
  • the oligonucleotide primers N036a, c, e, g, i carry the codons for the Kex2 interface
  • the primers N036b, d, f, hj also carry the codons for the Kex2- Interface the codons for two Stel3 interfaces.
  • the primer N034 also carries a Ksp ⁇ interface
  • the primers N036 a-j carry a J ⁇ ol interface.
  • the cloning of the mini and microplasminogen genes into the vector pPICZ ⁇ A was carried out analogously to the cloning described in Example 1b, both the vector and the respective PCR product with the and Kspl were cut.
  • the primers used, the names of the plasminogen derivative, the encoded protease cleavage sites, the name of the plasmids obtained and the N-terminal amino acid of the secreted plasminogen derivative can be found in the following table.
  • the numbering refers to the 810 amino acid long pre-plasminogen (Seq. ID No. 12)
  • the plasmid pPLGl. 1 is shown as an example in FIG.
  • strains based on the plasmids pPLG2.1, pPLG3.2, pPLG4.2, pPLG5.3, pPLG ⁇ .l, pPLG7.1, pPLG8.3, pPLG9.1 and pPLGlO.l was carried out in accordance with the
  • N036b AAAAACTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTGCACCTCCGCCTGTTG
  • N036j AAAAACTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTTCATTTGATTGTGGGAAGCC.
  • Example 10b Amplification and cloning of various forms of the mini and microplasminogen gene and cloning into the vector pGAPZ ⁇ A; Transformation of Pichia pastoris
  • the amplification of the mini and microplasminogen genes for cloning into the vector pGAPZ ⁇ A was carried out with the oligonucleotide primer N034 for the 3 'end and one of the primers N036a-j (Seq. ID No. 19 to 28) for the respective 5th 'End performed using the conditions outlined in Example la.
  • the oligonucleotide primers N036a, c, e, g, i carry the codons for the Kex2 interface
  • the primers N036b, d, f, h, j also carry the codons for the Kex2 interface the codons for two Ste 13 interfaces.
  • the primer N034 also carries an i & pI interface
  • the primers N036 a-j carry a J ⁇ ol interface.
  • the cloning of the mini and microplasminogen genes in the vector pGAPZ ⁇ A was carried out analogously to the cloning described in Example 1b, both the vector and the respective PCR product with the restriction endonucleases Xhol and Kspl were cut.
  • the primers used, the names of the plasminogen derivatives, the encoded protease cleavage sites, the name of the plasmids obtained and the N-terminal amino acid of the secreted plasminogen derivative can be found in the following table.
  • the plasmid pPLGl 1.2 is shown by way of example in FIG. 9.
  • the KM71H strain was produced in accordance with the preparation /pPLGl.ll/a.
  • Sequence 8 human Lys plasminogen with Kex2 cleavage and the signal peptide of the alpha factor of the yeast Saccharomyces cerevisiae
  • Sequence 10 human Lys-plasminogen with Stel3 and Kex2 interfaces and the signal peptide of the alpha-factor of the yeast Saccharomyces cerevisiae RFPSIFTAVLFAASSALAAPVN TTEDETAQIPAEAVIGYSD EGDFDV AV PFSNSTNNGL FI TTIASIAAKEEGVSLEKREAEAKVY SECKTGN GK1 -TRGTMSKTKNGITCQKWSSTSPHRPRFSPATHPSEG EENYCRNPDN DPQGPWCYTTDPEKRYDYCDILECEEEC HCSGENYDGKISKTMSG ECQ ATiTOSQSPHAHGYIPSKFPNKl r KKNYCRNPDRELRP CFTTDPN R ELC DIPRCTTPPPSSGPTYQCLKGTGENYRGNVAVTVSGHTCQH SAQTPHTH KKTPENFPC N DE YCRNPDG RAP CHTTNSQVR EYC IPSCDSSPV STEQLAPTAPPELTPWQDC
  • Sequence 14 human Glu plasminogen with Kex2 cleavage and the signal peptide of the alpha factor of the yeast Saccharomyces cerevisiae
  • a TG AGATTT C CTT C A A TTT T T A CTGCTGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCT CC A GTC AA C ACT AC AA C AA AG GATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGT TACT C AGATT DAY AAGGGGATTT CGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAAT AACGGGTTATTGTTTATAA ATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTA TC T CTCGAGA A AA G A G A G A GGCTGAAGCTGAGCCTCTGGATGACTATGTGAATACCCAGGGG
  • TGA Sequence 16 human Glu-plasminogen with Stel3 and Kex2 interfaces and the signal peptide of the alpha-factor of the yeast Saccharomyces cerevisiae RFPSIFT ⁇ VLFAASSA AAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDV AVLPFSNSTNNG LFINTTIASIAAKEEGVSLEKREAEAEPLDDYVNTQG ASLFSV KKQ GAGSIEECAAKCEED ⁇ EFTCRAFQYHSKEQQCVIMAENR KSS11IR RDVVLFEKKVY SEC TGNGKNYRGTMSKT NGITCQKWSST SPHRPRFSPATHPSEGLE ⁇ NYCRNPDNDPQGP CYTTDPEKRYDYCDILE CEEECMHCSGENYDGKISKTMSGLECQAWDSQSPHAHGYIPSKFPNKNLK KNYCRNPDRELRP CFTTDPN R ELCDIPRCTTPPPSSGPTYQCLKGTG ENYRGNVAVTVSGHTCQH
  • Sequence 17 sequence of the glu-plasminogen secreted into the medium (pSM49.8, pSM58.1 and pSM82.1)
  • Sequence 18 sequence of the Lys plasminogen secreted in the medium (pMHS476.1, pSM54.2, pAC37.1 and pJW9.1)
  • Sequence 29 mini-plasminogen (pPLGl.l and pPLG2.1)
  • Sequence 30 micro-plasminogen ( ⁇ PLG3.2 and pPLG4.2)
  • Sequence 31 micro-plasminogen (pPLG5.3 and pPLG ⁇ .l)
  • Sequence 32 micro-plasminogen (pPLG7.1 and pPLG8.3)
  • Sequence 33 micro-plasminogen (pPLG9.1 and pPLGlO.l)
  • Sequence 34 DNA sequence of the alpha factor from the yeast Saccharomyces cerevisiae in pPICZ ⁇ A up to the Kex2 interface.
  • Sequence 35 amino acid sequence of the alpha factor from the yeast Saccharomyces cerevisiae in pPICZ ⁇ A up to the Kex2 interface.
  • Sequence 36 DNA sequence of the Kex2 interface
  • Sequence 38 amino acid sequence of the Kex2 interface
  • Sequence 40 amino acid sequences of the human mini-plasminogen as in pPLGl.l with Kex2 cleavage and the prepro peptide of the alpha factor of the yeast Saccharomyces cerevisiae
  • Sequence 42 amino acid sequence of the human micro-plasminogen as in pPLG3.2 with Kex2 cleavage and the prepro peptide of the alpha factor of the yeast Saccharomyces cerevisiae
  • Sequence 43 amino acid sequence of the human micro-plasminogen as in pPLG4.2 with Kex2 cleavage and two Stel3 cleavages and the prepro peptide of the alpha factor of the yeast Saccharomyces cerevisiae
  • Sequence 44 amino acid sequence of the human micro-plasminogen as in pPLG5.3 with Kex2 cleavage and the prepro peptide of the alpha factor of the yeast Saccharomyces cerevisiae
  • Sequence 45 amino acid sequence of the human micro-plasminogen as in pPLG6.1 with Kex2 cleavage and two Stel3 cleavages and the prepro peptide of the alpha factor of the yeast Saccharomyces cerevisiae
  • Sequence 46 Ammo acid sequence of the human micro-plasminogen as in pPLG7.1 with Kex2 cleavage and the prepro peptide of the alpha factor of the yeast Saccharomyces cerevisiae
  • Sequence 47 amino acid sequence of the human micro-plasminogen as in pPLG8.3 with Kex2 cleavage and two Stel3 cleavages and the prepro peptide of the alpha factor of the yeast Saccharomyces cerevisiae
  • Sequence 48 amino acid sequence of the human micro-plasminogen as in pPLG9.1 with Kex2 cleavage and the prepro peptide of the alpha factor of the yeast Saccharomyces cerevisiae
  • Sequence 49 amino acid sequence of the human micro-plasminogen as in pPLGlO.l with Kex2 cleavage and two Stel3 cleavages and the prepro peptide of the alpha factor of the yeast Saccharomyces cerevisiae
  • Sequence 50 nucleic acid sequence of the human mini-plasminogen gene as in pPLGl.l with the codons for the Kex2 site and the gene of the prepro peptide of the alpha factor of the yeast Saccharomyces cerevisiae
  • Sequence 51 nucleic acid sequence of the human mini-plasminogen gene as in pPLG2.1 with the codons for the Kex2 interface and the Stel3 interfaces and the gene of the prepro peptide of the alpha factor of the yeast Saccharomyces cerevisiae
  • Sequence 52 Nuclear acid sequence of the human micro-plasminogen gene as in pPLG3.2 with the codons for the Kex2 site and the gene of the prepro peptide of the alpha factor of the yeast Saccharomyces cerevisiae
  • Sequence 53 nucleic acid sequence of the human micro-plasminogen gene as in pPLG4.2 with the codons for the Kex2 and Stel3 sites and the gene of the prepro peptide of the alpha factor of the yeast Saccharomyces cerevisiae
  • Sequence 54 nucleic acid sequence of the human micro-plasminogen gene as in pPLG5.3 with the codons for the Kex2 interface and the gene of the prepro peptide of the alpha factor of the yeast Saccharomyces cerevisiae
  • a Sequence 55 nucleic acid sequence of the human micro-plasminogen gene as in pPLG6.1 with the codons for the Kex2 site and the Stel3 sites and the gene of the prepro peptide of the alpha factor of the yeast Saccharomyces cerevisiae
  • Sequence 56 nucleic acid sequence of the human micro-plasminogen gene as in pPLG7.1 with the codons for the Kex2 site and the gene of the prepro peptide of the alpha factor of the yeast Saccharomyces cerevisiae
  • Sequence 57 Nuclear acid sequence of the human microplasminogen gene as in pPLG8.3 with the codons for the Kex2 interface and the Stel3 cleavage sites and the gene of the prepro peptide of the alpha Factor of the yeast Saccharomyces cerevisiae
  • Sequence 58 Nucleic acid sequence of the human micro-plasminogen gene as in pPLG9.1 with the codons for the Kex2 site and the gene of the prepro peptide of the alpha factor of the yeast Saccharomyces cerevisiae
  • Sequence 59 Nuclear acid sequence of the human micro-plasminogen gene as in pPLGlO.l with the codons for the Kex2 interface and the Stel3 interfaces and the gene of the prepro peptide of the alpha factor of the yeast Saccharomyces cerevisiae
  • Sequence 60 nucleic acid sequence of the human mini-plasminogen gene as in pPLGl.l and pPLG2.1
  • Sequence 61 nucleic acid sequence of the human micro-plasminogen gene as in pPLG3.2 and pPLG4.2
  • Sequence 62 nucleic acid sequence of the human micro-plasminogen gene as in pPLG5.3 and pPLG6.1
  • Sequence 63 nucleic acid sequence of the human micro-plasminogen gene as in pPLG7.1 and pPLG8.3
  • Sequence 64 Nuclear acid sequence of the human micro-plasminogen gene as in pPLG9.1 and pPLGlO.l
  • Sequence 65 nucleic acid sequence of the human glu-plasminogen gene

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Abstract

Beschrieben wird ein Verfahren zur Herstellung von rekombinantem, funktionellem Plasminogen in Mikroorganismen, und ein Verfahren zur Identifizierung von Plasminogenaktivatoren. Die für den funktionellen Teil des Plasminogen kodierende Nukleinsäuresequenz wird mit einem Nukleinsäuremolekül fusioniert, das für mindestens ein Signalpeptid kodiert, wobei das für das Plasminogen kodierende Nukleinsäuremolekül und das für das Signalpeptid kodierende Nukleinsäuremolekül mit Kodons für Schnittstellen von Proteasen verknüpft sind, welche die Abspaltung des Signalpeptids gewährleisten. Das rekombinante Plasminogen oder das entsprechende Plasmin ist geeignet, langsam oder nicht heilende Wunden durch Applikation des Enzyms in einer geeigneten Formulierung zu behandeln.

Description

Verfahren zur Herstellung von rekombinanten Proteinen in Mikroorganismen
Beschreibung
Das humane fibrinolytische System beinhaltet die Protease Plasmin (Pm) als zentrales Element. Plasmin ist zum einen in der Lage, Fibrin abzubauen, und zum anderen, Matrix- metalloproteinasen (MMP) und Wachstumsfaktoren zu aktivieren, die wiederum für den Abbau der extrazellulären Matrix und die Wundheilung mitverantwortlich sind.
Plasmin entsteht dabei aus seinem Norläufermolekül, dem Plasminogen. Bislang sind zwei physiologische Aktivatoren des Plasminogens (auch als Plasminogenaktivatoren, PA bezeichnet) bekannt. Dies sind der Gewebe-Typ Plasminogenaktivator (tissue-type PA; t-PA) und der Urokinase-Typ Plasminogenaktivator (urokinase-type PA; u-PA). Das System ist zusätzlich durch eine Reihe von Proteaseinhibitoren, z. B. α2-Antiplasmin, reguliert. Direkt mit den beiden unterschiedlichen Aktivatoren sind die zwei wichtigsten biologischen Eigenschaften des Plasminogens bzw. des Plasmins verknüpft.
Der sogenannte t-PA- vermittelte Weg ist für die Fibrinhomöostase verantwortlich, während der u-PA- ermittelte Weg bei der Zellmigration und der Geweberemodellierung hervorzuheben ist. Insbesondere konnte gezeigt werden, dass bei u-PA defϊzienten Mäusen chronische, nichtheilende Wunden entstehen. Gleiches gilt für Mäuse, deren Gene für Plasminogen und t- PA bzw. u-PA ausgeschaltet wurden. Darüber hinaus verkürzte sich die Lebenszeit der Tiere deutlich, was unter anderem auf Thrombosen und Organversagen zurückzuführen ist. Eine Übersicht über das Plasminogen/Plasminsystem wurde von Desire Collen (Thrombosis and Haemostasis, 82, 1999 (i publiziert.
Der therapeutische Einsatz von Plasmin bietet sich für die Behandlung von Herzinfarkt- oder Schlaganfall-Patienten an, bei denen eine schnelle Auflösung des Fibrinclots entscheidend für das Überleben ist, und stellt somit eine alternative Behandlung zu der mit Plasminogenaktivatoren dar, die die Hydrolyse des Fibrinclots nur indirekt erreichen.
Wie die oben erwähnten Mausmodelle zeigen, ist Plasmin zudem ein potentielles Therapeutikum, das bei der Behandlung von nicht oder nur langsam heilenden Wunden eingesetzt werden kann.
Die Aktivierung von Plasminogen durch t-PA erfolgt in der Regel nur in Gegenwart von Fibrin, also nach Abschluss der Blutgerinnungskaskade. In Abwesenheit eines Substrats wird Plasmin nahezu sofort durch α2-Antiplasmin inhibiert. Durch Bindung des Plasmin an Fibrin wird diese Wechselwirkung allerdings deutlich verlangsamt und dadurch der Abbau des Fibrinclots ermöglicht.
Da die Auflösung von Blutgerinnseln bei einem Herzinfarkt oder bei einem Schlaganfall für das Überleben der Patienten oft unumgänglich ist, werden verschiedene Strategien der Plasminogenaktivierung zur Therapie eingesetzt. Beispielsweise führt die Infusion von Streptokinase zu einer raschen Rekanalisierung der Gefäßlumina. Die Aktivierung von Plasminogen mit Streptokinase, einem bakteriellen Protein, beruht dabei nicht auf einer proteolytischen Aktivierung sondern auf einer Komplexierung. Dieser Komplex kann dann andere Plasminogenmoleküle zu Plasmin aktivieren.
Weiterhin wird Urokinase therapeutisch eingesetzt, die allerdings ähnlich wie Streptokinase auf molekularer Ebene fibringebundenes Plasminogen von freiem Plasminogen nicht unterscheiden kann. Deshalb wurde rekombinantes humanes t-PA entwickelt, das sich in den klinischen Studien als überlegen gegenüber Streptokinase erwies. Allerdings konnten diese Befunde in anderen Studien nicht bestätigt werden.
Gerade die rekombinant hergestellten Plasminogenaktivatoren wie rt-PA (zuzüglich verschiedener Derivate), rekombinanter Single chain urokinase-PA und rekombinante Staphylokinase heben die Bedeutung der mit molekulargenetischen Methoden erzeugten Produktionssysteme zur Herstellung rekombinanter Proteine für die Anwendung in der modernen Therapie hervor.
Plasminogen ist das Norläufermolekül des fibrinolytischen Enzyms Plasmin. Die cDΝA (Malinowski et al., Biochemistry, 23,1984 (12); Forsgren et al., FEBS Lett. 213, 1987 (2)) sowie das Gen einschließlich der nicht codierenden Introns (Petersen et al., J. Biol. Chem., 265, 1990 (3)) für humanes Plasminogen wurden bereits in der wissenschaftlichen Literatur publiziert.
Humanes Plasminogen (hPg), das Proenzym der Serinprotease Plasmin, ist ein aus einer Polypeptidkette von 791 Aminosäuren bestehendes Glykoprotein mit einem Molekulargewicht von 92.000 und einem theoretischen isoelektrischen Punkt von 7,1. Der Kohlenhydratanteil liegt bei 2 % (Collen, 1999, (1)). Plasminogen wird in der Leber gebildet, die Plasmakonzentration liegt bei etwa 200 mg/1 (1,5-2 μM).
Das Molekül ist unterteilt in 7 Strukturdomänen; dazu gehören das Ν-terminale Präaktivierungspeptid (Glu-1 - Lys-77), fünf partiell homologe Kringle-Domänen und die katalytisch aktive Proteinase-Domäne (Nal-562 - Asn-791; Collen, 1999 (1)). Das allen Serinproteasen gemeinsame Strukturmotiv der katalytischen Triade setzt sich aus den Aminosäuren His-603, Asp-646 und Ser-741 zusammen. Die Kringle-Domäne 1 dient als Erkennungssequenz zur Bindung des Plasminogens an Fibrin (Petersen et al., 1990 (3)) und verschiedene Zelloberflächenrezeptoren.
Unter den posttranslationalen Modifikationen sind besonders die zwei für die Funktion von Plasminogen (Aktivierbarkeit durch diverse Proteinasen bzw. Streptokinase, Rezeptor- Bindungseigenschaften) essentiellen Glykosylierungsstellen Asn-289 und Thr-346 hervorzuheben, die beide in der Kringle-Domäne 3 lokalisiert sind. Anhand dieser Modifizierungen werden zwei Hauptformen des Plasminogens unterschieden:
- Plasminogen I besitzt das oben beschriebene Glykosylierungsmuster
- Plasminogen II fehlt die Modifizierung an Asn-289
Eine weitere Glykosylierungstelle ist die Aminosäure Ser-248. Die Aminosäure Ser-578 kann phosphoryliert vorliegen.
Die Aktivierung erfolgt im Organismus durch proteolytische Spaltung zwischen den Aminosäuren Arg-561 und Nal-562. Anschließend erfolgt eine weitere proteolytische Aktivierung zwischen Lys-77 und Lys-78 zum Lys-78-hPg. Alternativ kann auch zunächst diese Bindung direkt im Glu-Pg hydrolysiert werden. Das aktive Plasmin Lys-78-hPm ist in jedem Fall über Disulfϊdbrücken verknüpft. Die schwere Kette des hPm (1/78-561) ist dabei für die Wechselwirkung mit den Substraten, z. B. Fibrinogen und Fibrin, verantwortlich. Die aus dem C-Terminus entstandene leichte Kette (562-791) stellt die katalytisch aktive Untereinheit dar.
Bereits aus der Literatur bekannt ist ein Verfahren, mit dem die Fibrinbindedomäne des Plasminogens in Pichia pastoris rekombinant mit einer Ausbeute von 17 mg/1 hergestellt wurde (Duman et al., Biotechnol Appl Biochem. 28; 39-45, 1998 (4)). Die Glykosylierung dieser Domäne (Kringle 1-4) konnte von den Autoren nachgewiesen werden. Eine weitere Literaturstelle beschreibt die Produktion der zwei Domänen Kringle 4 und 5 des humanen Plasminogens (Guan et al, Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao, 17, 2001 (5)). Zielsetzung war die Domäne zu identifizieren, die das Wachstum von Endothelzellen inhibieren kann.
Die von den beiden Arbeitsgruppen rekombinant in Pichia pastoris hergestellten Plasminogendomänen verfügen jedoch nicht über die für die physiologische Funktionalität entscheidende katalytische Domäne.
Gonzalez-Gronow et al. (Biochimica et Biophysica Acta, 1039, 1990 (6)) verglichen die Expression von rekombinantem humanem Plasminogen in Escherichia coli und COS-Zellen, einer Affen-Νierenzelllinie, miteinander. Die mikrobielle Produktion in E. coli scheiterte, was die Autoren auf die mangelnde Glykosylierung zurückführen. Die Produktion der Peptidkette gelang zwar, jedoch in einer nicht aktivierbaren Form, d. h. die Behandlung mit Aktivatoren (Urokinase und t-PA) führte nicht zu aktivem Plasmin.
Die fehlende Glykosylierung resultiert also in einem Protein, dem die wichtigen physiologischen Funktionen sowohl im Hinblick auf Aktivierbarkeit (keine Enzymaktivität nachweisbar) als auch in Bezug auf Endothelzellerkennung fehlen (Gonzalez-Gronow et al., Biochimica et Biophysica Acta, 1039, 1990 (6)). Die posttranslationale Modifizierung mit den Kohlenhydraten beeinfmsst darüber hinaus maßgeblich die Halbwertszeit im Blut von Säugetieren.
In COS-Zellen konnten die Autoren hingegen fünktionelles Plasminogen herstellen. Andere Autoren beschreiben die funktionelle Expression in Insektenzellen (Whitefleet-Smith et al., Arch. Biochem. Biophys., 271, 1989 (7)). Nachteilig sind jedoch die aufwendigen und kostenintensiven Kultivierungsbedingungen bei der Verwendung von Säugetier- und Insektenzellen sowie die erzielbaren, geringen Proteinmengen. Weiterhin sind Säugerzellen aufgrund der intrazellulären Expression und den Proteasen im Cytoplasma ungeeignet, um größere Mengen eines Proenzyms herzustellen (Nilsen und Castellino, Protein Expression and Purification, 16, 1999 (8) und Busby et al, J. Biol. Chem., 266,1991 (9)). Typischerweise liegen die Expressionsausbeuten beim System Baculovirus / Lepidopteran (Insektenzellen) lediglich bei 3-10 mg/ml.
In WO0250290 wurde die rekombinante Herstellung von funktionellem Mini- und Microplasminogen in Hefe offenbart. Die Autoren exprimierten hierzu die Gene für die katalytische Domäne von humanem Plasminogen mit (Miniplasminogen) oder ohne einer Kringle-Domäne (Microplasminogen) in dem Wirtsorganismus Pichia pastoris. Das derart rekombinant hergestellte Mini- bzw. Microplasminogen wurde anschliessend gereinigt, zu Mini- bzw. Microplasmin prozessiert und dessen Aktivität im Tierversuch demonstriert. Die beanspruchte Ausbeute der rekombinanten Proteine liegt bei 100 mg/1 für Miniplasminogen und bei 3 mg/1 für Microplasminogen. Je grösser jedoch ein Protein ist, desto schwieriger ist dessen rekombinante Herstellung, was durch die deutliche Abnahme der Ausbeute um zwei Zehnerpotenzen von Micro- zu Miniplasminogen in der Offenbarung von WO0250290 bestätigt wird. Ein Ausführungsbeispiel zur Expression von längeren Plasminogen- Varianten wie z. B. Lys- oder Glu-Plasminogen wurde nicht dargestellt.
Die rekombinante Herstellung von funktionellem Plasminogen in Mikroorganismen wurde bisher noch nicht offenbart, so dass ein Fachmann sie ausführen kann. Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, fünktionelles humanes Plasminogen in einem kostengünstigen Verfahren herzustellen und zu katalytisch aktivem Plasmin zu prozessieren.
Diese Aufgabe wird gelöst durch ein rekombinantes Herstellungsverfahren zur Herstellung von Plasminogen mit einem Mikroorganismus gemäß Anspruch 1. Weitere Lösungen werden in den unabhängigen Ansprüchen genannt. Die abhängigen Ansprüche reflektieren bevorzugte Ausführungsformen.
Überraschenderweise wurde gefunden, dass in Mikroorganismen die rekombinante mikrobielle Produktion von funktionellem Glu- und Lys-Plasminogen möglich ist. Weiterhin wurde gefunden, dass die rekombinante Herstellung von Micro-, Mini-, Lys- und Glu-Plaminogen in unerwartet hohen Mengen möglich ist.
Gegenstand der Erfindung ist die Klonierung des Plasminogen-Gens, bevorzugt des humanen Micro- und Miniplasminogen-Gens und weiter bevorzugt des Glu- oder Lys-Plasminogen-Gens oder jeweils einer funktionellen Variante hiervon, in Expressionsvektoren und die rekombinante Herstellung von funktionellem Plasminogen, vorzugsweise funktionellem humanem Plasminogen, unter Verwendung von molekulargenetischen Methoden. Die Erfindung beschreibt des weiteren die Identifizierung von Proteasen, welche die Aktivierung von Plasminogen zu Plasmin katalysieren. Das Plasminogen bzw. Plasmin, das durch diese Erfindung hergestellt wird, ist frei von Kontaminationen wie z. B. tierischen Proteinen oder Viren, die bei der Isolierung aus Menschen, Rindern und anderen Säugern natürlicherweise auftreten und die zu Nebenwirkungen bei den Patienten führen können.
Die Erfindung ist durch ein rekombinantes Herstellungsverfahren gekennzeichnet, umfassend mindestens den folgenden Schritt: a.) Fusion der mindestens für den funktionellen Teil des Plasminogen-Peptids kodierenden Nukleinsäuresequenz mit einer Nukleinsäuresequenz, die für mindestens ein Signalpeptid kodiert, wobei die für das funktioneile Plasminogen-Peptid kodierende Nukleinsäuresequenz und die für mindestens das Signalpeptid kodierende Nukleinsäuresequenz mit Kodons für Schnittstellen von Proteasen verknüpft sind, welche die Abspaltung des Signalpeptids gewährleisten. Die Herstellung von therapeutischen Proteinen wird zunehmend mit rekombinanten Produktionssystemen durchgeführt. Aufgrund von Kostenfaktoren wird angestrebt, die rekombinante Produktion in mikrobiellen, insbesondere in bakteriellen, Organismen durchzuführen. Diese Systeme bringen den Vorteil mit sich, dass neben einer vergleichsweise kostengünstigen Produktion Proteinausbeuten im g/1-Bereich erreichbar sind und die rekombinanten Proteine nicht mit Viren oder Proteinen wie z. B. Prionen verunreinigt sind, die für die Patienten schädlich sein können. Da bakterielle Produktionssysteme oftmals nicht in der Lage sind, korrekt gefaltetes Protein herzustellen, wird, neben der in vttro-Rückfaltung der fehlgefalteten Proteine, häufig die Herstellung in eukaryontischen Systemen wie Hefen, Insektenzellen oder Säugerzellen durchgeführt. Die eukaryontischen Produktionsstämme und -zelllinien bieten den Vorteil, dass mit ihnen glykosylierte Proteine hergestellt werden können. Insbesondere für Insektenzellen oder Säugerzellen gilt, dass die rekombinante Proteinproduktion sehr kostenintensiv ist und die Ausbeuten häufig sehr gering sind. Des weiteren haben sie den Nachteil, dass sie ebenfalls mit für den Menschen schädlichen Viren und Proteinen verunreinigt sein können. Dies ist bei der Verwendung von eukaryontischen Mikroorganismen nicht der Fall. Die apparative Ausstattung für die Kultivierung von eukaryontischen Mikroorganismen ist mit der bakterieller Organismen vergleichbar, Kontaminationen mit Säugerviren und Proteinen sind nicht vorhanden und Proteinausbeuten im g/1-Bereich sind ebenfalls möglich. Besonders bevorzugt gehört der verwendete eukaryontische Wirtsorganismus zur Abteilung der Pilze, vorzugsweise zu den Ascomycota. Weiterhin wird bevorzugt, dass er zu den Saccharomycotina, insbesondere zur Klasse der Saccharomycetes, hier besonders zur Ordnung der Saccharomycetales, zählt. Gemäß besonders bevorzugten Ausführungsformen gehört der Wirtsorganismus weiterhin zur Familie Saccharomycetaceae, hier insbesondere zur Gattung Pichia. Erfindungsgemäß bevorzugt verwendete eukaryontische Mikroorganismen sind beispielsweise die Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae, weitere Beispiele sind Candida, die methanothrophen Hefen Pichia pastoris, Pichia methanolica und Hansenula polymorpha oder filamentöse Pilze der Gattung Aspergillus, wie z. B. Aspergϊllus niger, Aspergillus oryzae und Aspergillus nidulans. Besonders bevorzugt wird Pichia pastoris.
Das rekombinante Herstellungsverfahren ist weiterhin dadurch gekennzeichnet, dass ein für mindestens den funktionellen Teil von Plasminogen kodierendes Nukleinsauremolekul in einen Expressionsvektor für diesen Mikroorganismus eingefügt wird, wobei das vorzugsweise für humanes Plasminogen kodierende Nukleinsauremolekul mit dem für mindestens für ein Signalpeptid, vorzugsweise ein Präpropeptid, vorzugsweise für den Transport in das endoplasmatische Reticulum, kodierende Nukleinsauremolekul fusioniert ist, wobei zwischen den beiden Nukleinsäuremolekülen Kodons für Protease-Schnittstellen eingefügt sind, die das Abspalten der Signalsequenz oder des Präpropeptids im Wirtsorganismus ermöglichen. Vorzugsweise wird ein für humanes Plasminogen kodierendes Nukleinsauremolekul verwendet. Außer einem für humanes Plasminogen kodierenden Nukleinsauremolekul können Nukleinsäuremoleküle verwendet werden, die für Plasminogen aus anderen Säugetieren kodieren. Dies führt zur Produktion von Plasminogen der jeweiligen Säuger. Des weiteren wird das rekombinante humane Plasminogen gemäß dem vorliegenden Verfahren durch Überexpression gebildet und kann, wenn gewünscht, in das Kulturmedium sezerniert werden, aus dem es durch Zentrifugation, Filtration oder Sedimentation von den Wirtszellen abgetrennt werden kann und somit ohne aufwendige Zellaufschlussverfahren der Proteinreinigung zugeführt werden kann, die mittels dem Fachmann bekannten Methoden durchführbar ist. Die Aktivierung von Plasminogen zu Plasmin wird durch Proteasen gelöst, die in der Lage sind, Plasminogen zu katalytisch aktivem Plasmin zu prozessieren.
Im folgenden werden im Kontext der vorliegenden Erfindung verwendete Ausdrücke definiert:
„Rekombinantes Herstellungsverfahren" bedeutet, dass ein Peptid oder ein Protein von einer Nukleinsäuresequenz, vorzugsweise einer DNA-Sequenz, durch einen geeigneten Wirtsorganismus exprimiert wird, wobei die Nukleinsäuresequenz aus einer Klonierung und Fusion einzelner Nukleinsäureabschnitte entstanden ist.
Unter „Klonierung" sollen hier alle zufolge dem Stand der Technik bekannten Klonierungsmethoden umfasst sein, die jedoch nicht alle im einzelnen beschrieben werden, weil sie zum selbstverständlichen Handwerkszeug des Fachmanns gehören.
„Expression in einem geeigneten Expressionssystem" soll hier alle zufolge dem Stand der Technik bekannten Expressionmethoden umfassen, insbesondere diejenigen, welche in den Ansprüchen angesprochen werden.
Unter dem „funktionellen Plasminogen-Peptidteil" ist der Teil des Plasminogens oder Plasminogen-Peptids zu verstehen, der die biologisch relevanten Funktionen des Plasminogens wahrnehmen kann. Diese biologisch relevanten Funktionen sind mindestens die Aktivierbarkeit zu Plasmin durch Plasminogenaktivatoren wie beispielsweise t we-Plasminogenaktivator, Urokinase, vampire-bat Plasminogenaktivator, Streptokinase, Stapyhlokinase, Pia-Protein aus Yersinia pestis etc., und die proteolytische Aktivität, die durch die Hydrolyse von Fibrin gekennzeichnet ist. Unter dem in der Beschreibung und den Beispielen verwendeten Begriff „Plasminogenaktivator(en)" sollen sowohl proteolytische als auch nicht-proteolytische Plasminogenaktivatoren verstanden werden.
Bei Glu-Plasminogen ist zusätzlich die Prozessierbarkeit zu Lys-Plasminogen durch die Plasmin-katalysierte Abspaltung des Präaktivierungspeptids zu verstehen.
Ebenfalls gehört zu den biologischen Funktionen die bis zum Faktor 1000 gesteigerte Aktivierbarkeit von Plasminogen nach Bindung an Fibrin, Laminin, Fibronectin, Vitronectin Heparansulfatproteoglucan, Collagen Typ 4 und andere Substrate.
Unter den biologisch relevanten Funktionen von Plasmin, welche nach Prozessierung des Plasminogens gewährleistet sein müssen, ist die Degradation von Laminin, die Degradation von Fibronectin, von Vitronectin, von Heparansulfatproteoglucan, die Aktivierung von ProCoUagenasen, die Aktivierung von Promatrixmetalloproteasen, die Aktivierung von Latenter Makrophagen Elastase, Prohormonen und Wachstumsfaktoren wie den TGFß-1 (latent transforming growth factor), VEGF (vascular endothelial growth factor) oder bFGF (basic fϊbroblast growth factor) zu verstehen.
Eine weitere Biologische Funktion ist die Inhibierbarkeit durch Plasmin-Inhibitoren wie α2- Antiplasmin und α2-Makroglobulin.
Außerdem gehört zu den biologisch relevanten Funktionen die Bindung an Fibrin, Laminin, Fibronectin, Vitronectin, Heparansulfatproteoglucan und Collagen Typ 4, die Bindung an Rezeptoren wie beispielsweise die α-Enolase, Annexin II oder Amphoterin.
Plasminogen wird zunächst als inaktives Glu-Plasminogen gebildet. Dieses Glu-Plasminogen kann von Plasmin durch Abspaltung des sog. Präaktivierungspeptids in Lys-Plasminogen umgewandelt werden. Beides wird von tissue-Plasminogenaktivatoren (also in diesem Fall nur durch die oben erwähnten proteolytischen Aktivatoren) durch proteolytische Spaltung in Plasmin umgewandelt, das aus über Sulfid-Brücken verbundenen Untereinheiten besteht. Die kleinere Untereinheit beinhaltet die proteolytische Domäne und die Phosphorylierungsstelle, die größere Untereinheit trägt die drei Glykosylierungen und ist für die Bindung an Fibrin verantwortlich. Des weiteren sind die Glykosylierungen wichtig für die Stabilität im Plasma. Plasminogen kann zusätzlich durch die Ausbildung eines 1:1 Komplexes mit Streptokinase oder Staphylokinase zu einem proteolytisch aktiven Enzym umgewandelt werden, das in der Lage ist, Plasminogen zu Plasmin zu prozessieren.
Funktionelles Plasminogen ist demnach Plasminogen, das durch Plasminogenaktivatoren zu proteolytisch aktivem Plasmin prozessiert werden kann. Des weiteren beinhaltet funktionelles Plasminogen vorzugsweise die Fibrin-bindende Domäne und kann vorzugsweise mindestens eine der drei Glykosylierungen enthalten.
Kleinste Formen von funktionellem Plasminogen sind Micro- und Miniplasminogen, eine grössere Form Lys-Plasminogen. Glu-Plasminogen, das noch das Präaktivierungspeptid beinhaltet, ist ebenfalls funktionelles Plasminogen. Es ist jedoch denkbar, dass Bereiche insbesondere innerhalb der größeren Kette weggelassen werden können, ohne die oben genannte Funktionalität (u. a. Proteolyse, Fibrinbindung) entscheidend zu beeinträchtigen.
Es ist für den Fachmann naheliegend, unterschiedliche Formen des Plasminogens (im folgenden als Plasminogenderivate bezeichnet) herzustellen, die eine funktionelle katalytische Domäne beinhalten. Unter funktionell ist wie bereits beschrieben zu verstehen, dass die Plasminogen- Variante nach Aktivierung mit Plasminogenaktivatoren wie Streptokinase oder Urokinase proteolytische Aktivität aufweist. • die katalytische Domäne kann Deletionen und Aminosäureaustausche beinhalten oder mit weiteren Aminosäuren oder Peptiden oder Proteinen fusioniert sein.
• die große Domäne kann alle Zwischenstufen von Glu20 bis Arg580 (bezogen auf die Sequenz des Prä-Plasminogens) beinhalten, die mit Plasminogenaktivatoren zu aktivem Plasmin aktivierbar sind.
Als konkretes Beispiel seien drei Formen von Lys-Plasminogen genannt:
Variante 1: N-Terminale Aminosäure: Met88 Variante 2: N-Terminale Aminosäure: Lys97 Variante 3: N-Terminale Aminosäure: Val98
Die Plasminogenderivate sind bevorzugt um eine Anzahl von 1 bis 50 Aminosäuren kürzer oder länger als das entsprechende Micro-, Mini-, Lys- oder Glu-Plasminogen oder weisen bevorzugt einen Austausch von 1 bis 10 Aminosäuren auf, wobei diese Derivate weiterhin die Eigenschaft besitzten, durch Plasminogenaktivatoren aktiviert zu werden. Zwischen dem jeweiligen Micro-, Mini-, Lys- oder Glu-Plasminogen und dem zugehörigen Plasminogenderivat besteht eine Sequenzhomologie (Sequenzübereinstimmung) von über 80%, bevorzugt von über 85%, weiter bevorzugt von über 90%, ferner weiter bevorzugt von über 95%, insbesondere bevorzugt von über 98% und ferner insbesondere bevorzugt von über 99%.
Bevorzugt weisen die Plasminogenderivate folgende Charakteristiken auf:
• die katalytische Domäne kann mindestens eine Deletion und/oder mindestens einen Aminosäureaustausch beinhalten und/oder mit mindestens einer weiteren Aminosäure oder mindestens einem weiteren Peptid oder mindestens einem weiteren Protein fusioniert sein.
• die große Domäne kann alle Zwischenstufen von Glu20 bis Arg580 (bezogen auf die Sequenz des Prä-Plasminogens) beinhalten, die mit Plasminogenaktivatoren zu aktivem Plasmin aktivierbar ist.
• Ein Plasminogenderivat weist eine Aminosäuresequenzhomologie (-Übereinstimmung) von bevorzugt von über 80%, ferner weiter bevorzugt von über 85%, des weiteren bevorzugt von über 90%, insbesondere bevorzugt von über 95% und ferner insbesondere bevorzugt von über 99% auf.
Mit „Mikroorganismus" werden alle solchen Lebensformen umfasst, die nur geringe Abmessungen aufweisen. Dabei sollen sowohl eukaryontische als auch prokaryontische Mikroorganismen umfasst sein. Insbesondere zu nennen wären Bakterien, Hefen, Pilze und Viren. „Nukleinsäure" soll sowohl DNA als auch RNA, beide in allen denkbaren Konfigurationen, umfassen, z.B. in Form von doppelsträngiger Nukleinsäure, in Form von einzelsträngiger Nukleinsäure, Kombinationen davon, sowie lineare oder zirkuläre Nukleinsäuren.
Unter „Signalsequenz" wird eine Peptidsequenz verstanden, die in der Lage ist, den Transport einer weiteren Peptidsequenz in oder über eine Membran zu gewährleisten, z.B. in das endoplasmatische Retikulum. Dabei kann es sich beispielsweise um ein Präpropeptid, ein Präpeptid oder ein Propeptid handeln.
Mit „Schnittstelle" werden solche Stellen in einer Peptidsequenz bezeichnet, welche die Abspaltung einer Signalsequenz, eines Präpropeptids oder Propeptids von der weiteren Peptidsequenz oder allgemein die Spaltung einer Peptidsequenz in zwei Teile in einem Wirtsorganismus ermöglichen.
Eine „für mindestens ein Signalpeptid oder ein Präpropeptid kodierende Nukleinsäure" ist eine Nukleinsäuresequenz, die für ein Peptid oder eine Proteinstruktur kodiert, die dem weiteren Polypeptid ein Einschleusen in Membranen, z. B. ins endoplasmatische Retikulum, ermöglicht.
Mit „Primer" wird ein Starter-Oligonukleotid bezeichnet. Hiermit meint man kurzkettige, einzelsträngige Oligoribo- oder Desoxyribo-Nukleotide, die zu einem Bereich auf einem einzelsträngigen Nukleinsäure-Molekül komplementär sind und mit diesem zu einem Doppelstrang hybridisieren können. Das freie 3'-Hydroxy-Ende in diesem Doppelstrang dient als Substrat für DNA-Polymerasen und als Startstelle für die Polymerisierungsreaktion des gesamten Einzelstranges zum Doppelstrang. Die Primer werden insbesondere für die PCR, d. h. die dem Fachmann bekannte Polymerase-Kettenreaktion, eingesetzt.
Mit „Plasmid" werden die in vielen prokaryontischen und einigen eukaryontischen Mikroorganismen vorkommenden, nicht ins Chromosom integrierten Nukleinsäure-Moleküle mit einer Länge von ca. 2 kb bis mehr als 200 kb bezeichnet.
„Ligation" ist die Bezeichnung für die Verknüpfung der Enden zweier Nukleinsäure-Moleküle mit Hilfe einer Ligase oder im Rahmen einer Selbst-Ligation, d. h. durch eine intramolekulare Ringschlussreaktion, bei der sich die beiden einzelsträngigen Enden eines linearen DNA Moleküls zusammenlagern, sofern ihre Enden miteinander Basenpaare bilden können.
„Restriktionsendonuklease" ist die Bezeichnung für eine Klasse von bakteriellen Enzymen, die in beiden Strängen eines DNA Moleküls innerhalb spezifischer Basensequenzen Phosphodiester-Bindungen spalten. „Elektroporation" ist ein Verfahren zur Einführung von Nukleinsäuren in Zellen. Dabei werden die Zellmembranen der in Suspension befindlichen, exponentiell wachsenden Empfängerzellen durch kurze elektrische Pulse hoher Feldstärke für hochmolekulare Moleküle durchlässig gemacht, während man sie der Nukleinsäure-Lösung aussetzt.
Unter „Überexpression" wird eine vermehrte Herstellung von funktionellem Plasminogen durch eine Zelle im Vergleich zu einer Produktion durch den Wildtyp dieser Zelle verstanden. In der Regel spricht man von einer Überexpression dann, wenn das exprimierte Fremdgen bei intrazellulärer Produktion etwa 1 - 40 % des gesamten zellulären Proteins der Wirtszelle ausmacht.
Unter „Expressionsvektor" sind solche Vektoren zu verstehen, die nach Einbringen in eine geeignete Wirtszelle die Transkription des in den Vektor einklonierten Fremdgens und die darauffolgende Translation der gebildeten mRNA (Boten-RNA) erlauben. Expressionsvektoren enthalten in der Regel die für die Expression von Genen in Zellen von Prokaryonten oder Eukaryonten erforderlichen Kontrollsignale.
Zur Kontrolle der Genexpression in Hefen wie z. B. Pichia pastoris werden in der vorliegenden Erfindung bevorzugt durch Methanol induzierbare Promotoren wie z. B. der AOX1 -Promotor oder besonders bevorzugt konstitutive Promotoren wie z. B. der YPTl-Promotor oder der GAP -Promotor verwendet. Insbesondere bevorzugt ist der konstitutive GAP-Promotor.
„AOX1" ist ein Gen der Alkoholoxidase 1 aus P. pastoris;
„GAP" ist ein Gen der Glyceraldehyd-3-phosphat Dehydrogenase aus P. pastoris und
„YPT1" ist ein Gen eines GTP-Bindeproteins aus P. pastoris.
Für die sekretorische Produktion in Hefen werden häufig die Signalpeptide der von den Genen PHO-1, SUC-2, PHA-E oder alpha-MF codierten Proteine verwendet.
„PHO1" ist ein Gen der sauren Phosphatase aus P. pastoris;
„SUC-2" ist ein Gen der sekretorischen Invertase aus S. cerevisiae;
„PHA-E" ist ein Gen der sauren Phosphatase von Phaseolus vulgaris Agglutinis; und
„alpha-MF" ist ein Gen des alpha-Mating Factors aus S. cerevisiaea.
Besonders bevorzugt sind die Kodons für die Schnittstellen von Proteasen und Kodons für die Schnittstellen zur Abspaltung des Propeptids für die Protease Kex 2 oder die Protease Ste 13. Besonders bevorzugt erfolgt die Verknüpfung in Schritt a) oben mit Kodons, die für eine Kex 2 Schnittstelle und zusätzlich zwei Ste 13 Schnittstellen kodieren. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung stammt das für das Signalpeptid oder Präpropeptid kodierende Nukleinsauremolekul aus Hefe, insbesondere der Hefe Saccharomyces cerevisiae. Eine noch bevorzugtere Ausführungsform ist auf ein für das Signalpeptid oder das Präpropeptid kodierendes Nukleinsauremolekul gerichtet, das für das Signalpeptid oder Präpropeptid des α-Faktors der Hefe Saccharomyces cerevisiae kodiert. Das in Schritt a) oben beschriebene entstandene Fusionsprodukt wird vorzugsweise durch PCR amplifiziert und danach weiterhin bevorzugt gereinigt.
In WO02/50290 wird die rekombinante Herstellung von Mini- und Microplasminogen mit dem für Hefe geeigneten Expressionsvektor pPICZαAD Dder den induzierbaren AOXl -Promotor und das Präpropeptid des Hefe alpha-Faktors enthält, offenbart. Diese kleineren Varianten von Plasminogen besitzen entweder gar keine (wie Microplasminogen) oder nur eine Kringle- Domäne (wie Miniplasminogen). Der Expressionsvektor pPICZαAD enthält die Schnittstellen für die Proteasen Kex2 und Stel3. Bei der Klonierung der entsprechenden
Expressionsvektoren von Mini- und Microplasminogen wurden jedoch die Stel3-Schnittstellen deletiert.
Für induzierbare Expressionssysteme in Hefe sind eine Reihe von Promotoren bekannt. Hierzu zählen unter anderem der AOXl -Promotor, AOX2, CUP1 (Koller A, Valesco J, Subramani S.,Yeast 2000: 16(7), 651-6), PHO1 (EP0495208), HIS4 (US 4885242), FLD1 (Shen et al., Gene 1998: 216(1), 93-10) und der XYLl-Promotor (Den Haan and Van Zyl, Appl. Microbiol. Biotechnol. 2001: 57(4), 521-7).
Mit Hilfe des Methanol-induzierbaren AOXl -Promotors kann die heterologe Proteinproduktion gezielt gesteuert und eine homogene Biomasse erreicht werden. Bevor die Expression des Fremdproteins induziert wird, können die Wirtsorganismen eine hohe Wachstumsdichte ohne Selektionsnachteile, welche durch die Expression eines Fremdproteins entstehen würde, erreichen.
Im Gegensatz zu ihren kleineren Varianten, welche in WO02/50290 unter Kontrolle des AOXl -Promotors exprimiert werden, beinhaltet das in der vorliegenden Erfindung rekombinant hergestellte Glu- und Lys-Plasminogen alle fünf Kringle-Domänen, was ihre rekombinante Herstellung aus den folgenden Gründen schwierig macht:
- Möglicher Verlust der Expresssionskassette aufgrund von Wachstumsnachteilen für die Wirtsorganismen bei der Expression der Fremdproteine;
- Proteolytische Degradierung der exprimierten Proteine und
- Geringe Ausbeute.
Aufgrund der dargestellten Nachteile, ist die Herstellung von Glu- oder Lys-Plasminogen in WO02/50290 nicht offenbart worden. Diese Schwierigkeiten wurden in der vorliegenden Erfindung u. a. dadurch gelöst, dass das rekombinante Protein ein Signalpeptid eine Kex2 und mindestens eine Stel3-, bevorzugt zwei Stel3 Protease-Schnittstellen beinhaltet. Weiterhin wurde in einer bevorzugten Ausführungsform als weitere C-Quelle eine Glycerol-Zufütterung zwischen 0,1 und 10 ml/h, bevorzugt zwischen 0,5 und 5 ml/h, weiter bevorzugt zwischen 0,8 und 1,5 ml/h durchgeführtund das Kulturmedium auf neutralen pH von 7,0 gepuffert. Es wurde auf ausreichenden Sauerstoffeintrag geachtet.
In einer bevorzugten Ausführungsform wurde darauf geachtet, die rekombinante Nukleinsäure nicht in Anschluss an den 5 '-Bereich des AOXl -Gens, sondern in Anschluss an den 5 '-Bereich des Glyceraldeydphosphat-Dehydrogenase-Gens aus P. pastorisza. integrieren. Hierbei wurde kein induzierbarer, sondern ein konstitutiver Promoter verwendet. Konstitutive Promotoren, die in Hefe aktiv sind und verwendet werden können sind der GAP-Promotor, der YPT1- Promόtor (Sears et al., Yeast 1998: 14(8), 783-90), der TKL-Promotor (Den Haan and Van Zyl, Appl. Microbiol. Biotechnol. 2001: 57(4), 521-7), der ACT-Promotor (Kang et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 2001 : 55(6), 734-41) und der PMAl-Promotor (Yeast 2000 : 16(13), 1191-203). Bevorzugte Promotoren sind der GAP-Promotor und der YPTl-Promotor. Ein besonders bevorzugter Promoter ist der GAP-Promoter.
Im Gegensatz zu einem induzierbaren Promoter hat ein konstitutiver Promoter den Nachteil, dass das zu exprimierende Fremdprotein konstirutiv, also während der gesamten Wachsrumsphase hergestellt wird. Hierdurch entstehen Nachteile für die Wirtszelle, was sich u. a. in einem verlangsamten Wachstum ausdrückt. Aufgrund des herrschenden Selektionsdrucks, haben Wirtszellen, die die rekombinante Expressionskassette verloren haben einen Vorteil und können die rekombinanten Wirtszellen überwachsen. Hierdurch kann eine heterogene Mischpopulation entstehen, die vermieden werden soll. Überraschenderweise wurde jedoch festgestellt, dass der konstitutive GAP-Promoter gemäss einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung eine höhere Ausbeute ermöglicht.
Während bei Verwendung des AOXl -Promotors Ausbeuten an Lys-Plasminogen nach 120 Stunden Induktion von mindestens 17 U/1 (≡ 1,5 mg/1) weiter bevorzugt 120 U/1 (≡ 11 mg/1), weiter bevorzugt 180 U/1 (= 16 mg/1), ferner weiter bevorzugt 200 U/1 (≡ 18 mg/1), weiter bevorzugt 220 U/1 (≡ 20 mg/1), ferner weiter bevorzugt 240 U/1 (≡ 22 mg/1), insbesondere bevorzugt 260 U/1 (≡24 mg/1) und weiter insbesondere bevorzugt 280 U/1 (≡ 25,5 mg/1) erhalten wurden, lagen die Ausbeuten bei Verwendung eines konsumtiven Promotors, insbesondere des GAP -Promotors, wesentlich höher. In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein konstitutiver Promotor, z. B. der GAP- Promotor operativ mit einer Nukleinsäure verbunden, welche für mindestens den funktionellen Teil der Plasminogen-Sequenz kodiert, und welche mit einer Nukleinsäuresequenz fusioniert ist, die mindestens für ein Signalpeptid kodiert, wobei die für das funktionelle Plasminogen kodierende Nukleinsäuresequenz und die für mindestens das Signalpeptid kodierende Nukleinsäuresequenz mit Kodons für Schnittstellen von Proteasen verknüpft sind, welche die Abspaltung des Signalpeptids gewährleisten.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird ein konstitutiver Promotor, z. B. der GAP -Promotor mit der Nukleinsäuresequenz des Micro-, Mini-, Lys- oder Glu-Plasminogens operativ verknüpft, welche mit der Nukleinsäuresequenz eines Signalpeptids aus der Hefe fusioniert ist.
Überraschenderweise wurde diesbezüglich festgestellt, dass der konstitutive GAP-Promoter gemäss einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung eine um das ca. 10- fache höhere Ausbeute ermöglicht (s. Beispiel 7c, Herstellung von Lys-Plasminogen, 1375 U/1, was umgerechnet 125 mg/1 ergibt). In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird als weitere C-Quelle eine Glycerol-Zufütterung zwischen 0,1 und 10 ml/h, bevorzugt zwischen 0,5 und 5 ml/h, weiter bevorzugt zwischen 0,8 und 1,5 ml/h durchgeführtund das Kulturmedium auf neutralen pH von 7,0 gepuffert. Die Wachstumsrate μ [1/h] erreicht dabei Werte zwischen 0,002 und 0,10, bevorzugt zwischen 0,004 und 0,020, weiter bevorzugt zwischen 0,008 und 0,010.
Bei Verwendung des GAP -Promotors wurden Ausbeuten an Lys-Plasminogen von mindestens 660 U/1 (60 mg/1), bevorzugt 1000 U/1 (≡ 91 mg/1), bevorzugt 1500 U/1 (≡ 136 mg/1), weiter bevorzugt 2000 U/1 (≡ 182 mg/ml), bevorzugt 2500 U/1 (≡ 227 mg/1), insbesondere bevorzugt und weiter insbesondere bevorzugt 2750 U/1 (≡ 250 mg/1) nach einer Fermentationszeit von 250 Stunden erhalten.
Bei der rekombinaten Herstellung von Mini- und Microplasminogen wurden entsprechend höhere Ausbeuten erhalten. Die Ausbeuten bei Miniplasminogen liegen zwischen 100 mg bis 2 g pro Liter, bevorzugt von 300 mg/1 - 1,5 g/1, weiter bevorzugt von 400 mg/1 - 1 g/1 ferner weiter bevorzugt von 500 mg/1 - 800 mg/1 und insbesondere bevorzugt von 600 - 700 mg/1. Die Ausbeuten von Microplasminogen liegen ferner mindestens 10% über denen von Miniplasminogen. Geringfügig schlechtere Ausbeuten im Vergleich zu Lys-Plasminogen lieferte die rekombinante Herstellung von Glu-Plasminogen.
Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich zur Herstellung von Mini-, Micro-, Lys- und Glu- Plasminogen. Bevorzugte Ausführungsformen richten sich daher auf die rekombinante Herstellung von Mini-, Micro-, Lys- und Glu-Plasminogen, welche jeweils an eine Signal- oder Präprosequenz gekoppelt sind, in einem Expressionsvektor, der einen konsumtiven Promotor, z. B. den GAP-Promotor enthält. In einer weiterhin bevorzugten Ausführungsform besteht die Signalsequenz aus dem Signalpeptid oder Präpropeptid des alpha-Faktors der Hefe Saccharomyces cerevisiae. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird ein konstitutiver Promotor, z. B. der GAP-Promotor, operativ mit einer Nukleinsäure der Sequenzen Seq. ID. Nr. 7 oder 9 oder einer der Sequenzen Seq. ID. Nr. 13 oder 15 oder einer der Sequenzen Seq. ID. Nr. 50 bis 59 verbunden und in einem geeigneten Expressionsvektor exprimiert.
In einer weiterhin bevorzugten Ausführungsform wird ein konstitutiver Promotor, z. B. der GAP-Promotor operativ mit einer Nukleinsäure verbunden, welche für mindestens den funktionellen Teil der Plasminogen Sequenz kodiert. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird ein konstitutiver Promotor, z. B. der GAP-Promotor, operativ mit einer Nukleinsäure der Sequenzen Seq. ID. Nr. 13, 15, 7 und 9 oder einer der Sequenzen Seq. ID. Nr. 50 bis 59 oder der Sequenz Seq. ID. Nr. 11 verbunden und in einem geeigneten Expressionsvektor exprimiert
Glu-Plasminogen (Daten berechnet mit dem Programm EditSeq™ (DNASTAR)) Molekulargeicht: 88431.67 Dalton 791 Aminosäuren
7.121 Isoelektrischer Punkt bei pH 7.0: 1.351 Glycosylierungsstellen: O-268, N-308, O-365 (Die Nummerierung bezieht sich auf das 810 AS-lang Prä-Plasminogen)
Lys-Plasminogen (Daten berechnet mit dem Programm EditSeq™ (DNASTAR)) Molekulargeicht: 79655.71 Daltons 714 Aminosäuren
7.492 Isoelektrischer Punkt bei pH 7.0: 5.287 Glycosylierungsstellen: O-268, N-308, O-365 (Die Nummerierung bezieht sich auf das 810 AS-lange Prä-Plasminogen)
Mini-Plasminogen (Daten berechnet mit dem Programm EditSeq™ (DNASTAR)) Molekulargewicht 38169.63 Daltons 348 Aminosäuren
7.203 Isoelektrischer Punkt bei pH 7.0: 0.893 Keine Glycosylierungsstellen mehr Micro-Plasminogen (Daten berechnet mit dem Programm EditSeq™ (DNASTAR)) Molekulargewicht 27230.41 Daltons 249 Aminosäuren
7.934 Isoelektrischer Punkt bei pH 7.0: 3.733 Keine Glycosylierungsstellen mehr.
Im folgenden wird das erfindungsgemäße Verfahren im einzelnen beschrieben.
Das in Schritt a) der vorliegenden Erfindung entstandene Fusionsprodukt kann außerdem in einen für Mikroorganismen geeigneten Expressionsvektor eingefügt werden. Dieser Expressionsvektor wird bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe, umfassend pPICZαA, B und C und pPICZ A, B und C und pGAPZαA, B und C und pGAPZA, B und C und pPIC6αA, B und C und pPIC6A, B und C sowie pAO815, pPIC3,5K und pPIC9K. Die Einführung in den Expressionsvektor erfolgt wiederum bevorzugt durch Ligation. Das PCR-Produkt sowie der Expressionsvektor werden vorzugsweise mit den Restriktionsendonukleasen Kspl und Xhόi geschnitten, bevor sie mit einer T4 DNA-Ligase ligiert werden. Die ligierte Nukleinsäure kann durch Elektroporation in einen Mikroorganismus, vorzugsweise E. coli, transformiert werden und aus den so erhaltenen transformierten Stämmen kann die DNA isoliert und durch endonukleolytische Spaltung vorzugsweise mit Xhol oder Sful und Kspl, getrennt werden. Die so erhaltene Nukleinsäure kann ein Plasmid sein, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe pMHS476.1, pSM54.2, pSM49.8, pSM82.1, pSM58.1, pAC37.1, pJW9.1, pPLGl.l, pPLG2.1, pPLG3.2, pPLG4.2, pPLG5.3, pPLG6.1, pPLG7.1, pPLG8.3, pPLG9.1, pPLGlO.l, pPLG11.2, pPLG12.1, pPLG13.1, pPLG14.2, pPLG15.1, pPLG16.3, pPLG17.2, pPLG18.1, pPLG19.2 und pPLG20.1. Als Primer für die oben genannte Amplifϊkation werden bevorzugt zwei Oligonukleotidprimer, ausgewählt aus der Gruppe, umfassend N034 (Sequence ID-Nummer 1), N036 (Sequence-ID-Nummer 2), N036a (Sequence-ID-Nummer 19), N036b (Sequence-ID- Nummer 20), N036c (Sequence-ID-Nummer 21), N036d (Sequence-ID-Nummer 22), N036e (Sequence-ID-Nummer 23), N036f (Sequence-ID-Nummer 24), N036g (Sequence-ID-Nummer 25), N036h (Sequence-iD-Nummer 26), N036i (Sequence-ID-Nummer 27), N036j (Sequence- ID-Nummer 28), N057 (Sequence ID-Nummer 3), N037 (Sequence ID-Nummer 4), N035 (Sequence ID-Nummer 5) und N056 (Sequence ID-Nummer 6) eingesetzt. Die folgenden Ausführungsformen sind gemäß der vorliegenden Erfindung besonders bevorzugt:
- Kodons, die für die Schnittstelle der Protease Kex2 kodieren und das Plasminogenfüsionsgen, das die in Sequence ID-Nummer 7 oder 13 dargestellte Nukleinsäureabfolge aufweist.
- Kodons, die für die Schnittstelle der Protease Kex2 kodieren und das Plasminogenfusionsprotein, das die in Sequence ID-Nummer 8 oder 14 dargestellte Amionsäureabfolge aufweist. - Kodons, die für die Schnittstelle der Protease Kex2 und der Protease Stel3 kodieren und das Plasminogenfusionsgen, das die in Sequence ID-Nummer 9 oder 15 dargestellte Nukleinsäureabfolge aufweist.
- Kodons, die für die Protease Kex2 und die Protease Stel3 kodieren und das Plasminogenfusionprotein, das die in Sequence ID-Nummer 10 oder 16 dargestellte Aminosäureabfolge aufweist.
Vorzugsweise wird das oben erwähnte Plasmid, das aus der oben erwähnten Gruppe bevorzugt ausgewählt ist, in einen mikrobiellen Wirt transformiert. Die Transformation kann beispielsweise durch Elektroporation durchgeführt werden. Vorzugsweise ist der verwendete Mikroorganismus ein eukaryontischer Mikroorganismus, der zur Abteilung der Pilze zählt. Bevorzugte Mikroorganismen gehören zu den Ascomycota, bevorzugt Saccharomycotina und davon bevorzugt die Klasse der Saccharomycetes, weiter bevorzugt die Ordnung der Saccharomycetales, mehr bevorzugt die Familie der Saccharomycetaceae und davon besonders bevorzugt die Gattungen Pichia, Saccharomyces, Hansenula und Aspergillus.
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die für mindestens den funktionellen Teil des Plasminogens kodierende Nukleinsäuresequenz aus einem mit dem im oben beschriebenen Schritt a) entstandenen Fusionsprodukt transformierten mikrobiellen Wirtsorganismus überexprimiert und mindestens der funktionelle Teil von Plasminogen wird sezerniert, wobei er vorzugsweise ins Kulturmedium sezerniert wird. Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist der funktioneile Teil der Nukleinsäuresequenz von Plasminogen eine der Sequenzen ID-Nummer 60, 61, 62, 63, 64, 65 oder 66. Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform entspricht der funktioneile Teil der Nukleinsäuresequenz von Plasminogen der vollständigen Plasminogensequenz. Vorzugsweise wird mit dem rekombinanten Herstellungsverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung ein humanes funktionelles Plasminogen hergestellt.
Dieses Plasminogen, das durch das rekombinante Herstellungsverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung erhältlich ist, oder das daraus durch die Einwirkung von Proteasen entstehende Plasmin kann zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Wunden, insbesondere zur Behandlung von langsam oder schlecht heilenden Wunden, für die Behandlung thrombotischer Ereignisse, oder für die Vorbeugung thrombotischer Ereignisse verwendet werden.
Zudem wurde erkannt, daß das erfindungsgemäß hergestellte Plasminogen sowie das daraus erhaltene Plasmin anti-koagulative Eigenschaften aufweisen. Diese vorteilhaften Eigenschaften ermöglichen zudem die Verwendung des Plasminogens und/oder Plasmins als anti- thrombotische sowie anti-koagulative Wirkstoffe zur Prophylaxe und/oder Behandlung von Herzinfarkt, Thrombose, Restenose, Hypoxie, Ischämie, Koagulationsnekrose, Entzündungen der Blutgefäße sowie zur Behandlung nach einem Herzinfarkt, nach einer Bypass-Operation, nach einer Angioplastie sowie nach einer Ballondilatation. Das Plasminogen kann auch zur thrombolytischen Therapie beim akuten Herzinfarkt, zur Rekanalisierung arteriovenöser Shunts und zur Wiedereröffnung (Reperfusion) verschlossener Koronararterien beim akuten Herzinfarkt eingesetzt werden. Weitere Verwendungen des erfindungsgemäß hergestellten Plasminogens umfassen die Prophylaxe und Behandlung von akuter Lungenembolie, von frischen oder älteren Gerinnsel bei Venenthrombosen, akuter und subakuter arterieller Thrombosen, Venenthrombosen, akuter arterieller Verschlüsse der Extremitäten, chronisch occlusiver Arteriopathien, Thrombosierung von arteriovenösen Shunts, tiefen Venenthrombosen des Beckens und der Extremitäten, Frühthrombosen im Bereich desobliterierter Gefäße, akuter Zentralgefäßverschluss am Auge, Konjunktivitis bei Plasminogen Typ I-Mangel, Verbrennungen und Erfrierungen, Verätzungen sowie disseminierter intravasaler Gerinnung im Schock.
Bevorzugt werden Plasminogen und/oder Plasmin bei diesen Indikationen zusammen mit einem Antikoagulant eingesetzt. Als Antikoagulantien eignen sich Heparin, Heparinderivate oder Acetylsalicylsäure.
Die vorliegende Erfindung ist daher auch auf pharmazeutische Zusammensetzungen gerichtet, umfassend ein Plasminogen, das gemäß dem rekombinanten Herstellungsverfahren der vorliegenden Erfindung hergestellt wurde, oder das daraus entstehende Plasmin, gegebenenfalls in Kombination mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger, Zusatzstoff und/oder Lösungsmittel. Zudem können die pharmazeutischen Zusammensetzungen vorzugsweise einen antikoagulativen Wirkstoff, insbesondere Heparin, Heparinderivate oder Acetylsalicylsäure enthalten.
Das erfindungsgemäß hergestellte Plasminogen und/oder das daraus erhältliche Plasmin werden bei der äußeren Wundbehandlung bevorzugt in pharmazeutischen Zusammensetzungen verwendet, welche für die topische Anwendung geeignet sind. Dabei werden Plasminogen und/oder Plasmin in einer Konzentration von 0,01 - 500 U pro Gramm pharmazeutischer Zusammensetzung, bevorzugt 0,1 - 500 U, weiter bevorzugt 0,1 - 250 U, ferner weiter bevorzugt 0,5 - 250 U pro Gramm pharmazeutischer Zusammensetzung und insbesondere bevorzugt in einer Konzentration von 1 - 150 U Plasminogen und/oder Plasmin pro Gramm pharmazeutischer Zusammensetzung verwendet. Werden anstelle von halbfesten
Zubereitungen in Form von beispielsweise Salben, Pasten, Gelen usw. Pflaster oder sonstige Verbandsmaterialien verwendet, so gelten die oben angegebenen Konzentrationsbereiche pro 2 cm Pflasteroberfläche bzw. Oberfläche des Verbandsmaterials. Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen werden mit den üblichen festen oder flüssigen Trägerstoffen oder Verdünnungsmitteln und den üblicherweise verwendeten pharmazeutischen Hilfsstoffen entsprechend der gewünschten Applikationsart in einer geeigneten Dosierung in bekannter Weise hergestellt. Die bevorzugten pharmazeutischen Formulierungen oder Zubereitungen liegen in einer Darreichungsform vor, die zur lokalen äußeren Applikation geeignet ist. Solche Darreichungsformen sind beispielsweise Salben, Pasten, Gele, Filme, Dispersionen, Emulsionen, Suspensionen oder spezielle Formulierungen, wie beispielsweise nanodisperse Systeme in Form von Liposomen, Nanoemulsionen oder Lipid-Nanopartikeln, sowie tensidfreie Formulierungen, polymerstabilisierte oder feststoffstabilisierte Emulsionen.
Verfahren zur Herstellung diverser Formulierungen sowie die verschiedenen Applikationsmethoden sind dem Fachmann bekannt und beispielsweise in "Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton PA" eingehend beschrieben.
Bei einer Verwendung der pharmazeutischen Zusammensetzungen zur Prophylaxe und/oder Behandlung von Herzinfarkt, Thrombose, Restenose, Hypoxie, Ischämie, Koagulationsnekrose, Entzündungen der Blutgefäße, akutem Herzinfarkt sowie zur Behandlung nach einem Herzinfarkt, nach einer Bypass-Operation, nach einer Angioplastie sowie nach einer Ballondilatation eignen sich die für die parenterale Applikation hergestellten Zubereitungen.
Zudem eigenen sich die pharmazeutischen Zusammensetzungen bei diversen systemischen Anwendungen umfassend den Einsatz bei akuter Lungenembolie, thrombolytischer Therapie beim akuten Herzinfarkt, f ischen oder älteren Gerinnsel bei Venenthrombosen, akuter und subakuter arterieller Thrombosen, Rekanalisierung arteriovenöser Shunts, Venenthrombosen, Wiedereröffnung (Reperfusion) verschlossener Koronararterien beim akuten Herzinfarkt, akuter arterieller Verschlüsse der Extremitäten, chronisch occlusiver Arteriopathien, Thrombosierung von arteriovenösen Shunts, tiefen Venenthrombosen des Beckens und der Extremitäten, Frühthrombosen im Bereich desobliterierter Gefäße, akuter Zentralgefäßverschluss am Auge, Konjunktivitis bei Plasminogen Typ I-Mangel, Verbrennungen, Verätzungen und Erf ierungen, disseminierter intravasaler Gerinnung im Schock.
Eine weitere Anwendungsmöglichkeit bietet sich bei Plasminogen-Mangel, wie z. B. erworbenem oder congenitalem Plasminogen-Mangel (homozygoter Typ-I-Plasminogen- Mangel), der z. B. zu Conjungtivitis lignosa oder Thrombophilie führen kann. Hierbei besteht die Möglichkeit, durch beispielsweise intravenöse Gabe des rekombinanten Plasminogens, einschließlich der Formen Glu-, Lys-, Mini- und Microplasminogen sowie der davon abgeleiteten Varianten, die Krankheit zu behandeln. (Heinz et al., Klin. Monatsblatt Augenheilkunde 2002, 219(3): 156-8).
In einer weiteren Anwendungsmöglichkeit, kann bei Verabreichung von Plasminogen ein Rückgang der Pseudomembranen und die Normalisierung der Atemwege, sowie die verbesserte Wundheilung erzielt werden. Diese Applikation wurde für ein neugeborenes Kind beschrieben (The New England Journal of Medicine 1998, 339, 23, 1679-1686).
Somit wird das rekombinant hergestellte Plasminogen eventuell zusammen mit dem daraus gewonnenen Plasmin oder auch nur Plasmin in pharmazeutischen Zusammensetzungen verwendet, welche zur Prophylaxe und/oder Behandlung von akuter Lungenembolie, thrombolytischer Therapie beim akuten Herzinfarkt, frischen oder älteren Gerinnsel bei Venenthrombosen, akuter und subakuter arterieller Thrombosen, Rekanalisierung arteriovenöser Shunts, Venenthrombosen, Wiedereröffnung (Reperfusion) verschlossener Koronararterien beim akuten Herzinfarkt, akuter arterieller Verschlüsse der Extremitäten, chronisch occlusiver Arteriopathien, Thrombosierung von arteriovenösen Shunts, tiefen Venenthrombosen des Beckens und der Extremitäten, Frühthrombosen im Bereich desobliterierter Gefäße, akuter Zentralgefäßverschluss am Auge, Konjunktivitis bei Plasminogen Typ I-Mangel, Verbrennungen, Verätzungen und Erfrierungen, disseminierter intravasaler Gerinnung im Schock geeignet sind.
Das erfindungsgemäß rekombinant hergestellte Plasminogen wird bevorzugt in pharmazeutischen Zusammensetzungen verwendet, welche zur topischen Behandlung von Verbrennungen, Erfrierungen, Verätzungen, Verletzungen und/oder Wunden, insbesondere schlecht heilender Wunden geeignet sind. Dabei wird das rekombinante Plasminogen bevorzugt zusammen mit mindestens einem Aktivator (Plasminogenaktivatoren wie beispielsweise Urokinase oder Streptokinase) eingesetzt. Eine andere bevorzugte Möglichkeit besteht darin, das erfindungsgemäß hergestellte Plasminogen vor seiner Verwendung ganz oder teilweise mittels eines Aktivators in Plasmin umzuwandeln und als Plasmin oder Plasmin mit Plasminogen in den hierin beschriebenen Indikationen und Formulierungen einzusetzen.
Als parenterale Applikationen kommen vor allem die intravenöse, intravasale, intraperitoneale, subkutane sowie die intramuskuläre Verabreichung in Betracht. Bei den parenteralen Formulierungen insbesondere in Form von Lösungen zur Injektion oder Infusion wird das Protein in einer Konzentration von 0,1 - 100 Millionen Units, bevorzugt 10 bis 100 Millionen Units pro 10 ml Lösung, weiter bevorzugt 1 bis 10 Millionen Units pro 10 ml Lösung und insbesondere bevorzugt 3 bis 5 Millionen Units pro 10 ml Lösung. Bei zur oralen Applikation geeigneten Formulierungen wird das Protein in einer Konzentration von 0,1 bis 100.000 Units pro Gramm Formulierung, bevorzugt 100 bis 80.000 Units pro Gramm Formulierung und insbesondere bevorzugt 1.000 bis 50.000 Units pro Gramm Formulierung eingesetzt.
Weitere vorteilhafte Formulierungen stellen beispielsweise Protease-enthaltende Pflaster, Verbände oder sonstige Verbandsmaterialien dar. Diese Formulierungen eignen sich insbesondere für die topische Anwendung bei der Wundbehandlung, oder zur Behandlung von Verbrennungen, Erfrierungen, Verätzungen und/oder Verletzungen. Das erfindungsgemäß rekombinant hergestellte Plasminogen wird bevorzugt in den pharmazeutischen Zusammensetzungen, insbesondere den Wundheilmitteln, Pflastern sowie Verbandsmaterialien, zusammen mit mindestens einem Aktivator (Plasminogenaktivatoren wie beispielsweise Urokinase oder Streptokinase) eingesetzt oder vorher in Plasmin mittels der oben beschriebenen Aktivatoren umgewandelt und als Plasmin eventuell zusammen mit Plasminogen und eventuell mit mindestens einem Aktivator in und/oder auf den pharmazeutischen Zusammensetzungen und Formulierungen verwendet. Insbesondere bevorzugt ist die Verwendung von Plasminogen, bevorzugt Plasminogen mit einem Aktivator, oder Plasmin oder Plasmin zusammen mit Plasminogen und einem Aktivator in und/oder auf Pflastern und Verbandsmaterialien, welche zur Wundbehandlung, insbesondere zur Behandlung schlecht heilender Wunden, sowie zur Behandlung von Verbrennungen, Erfrierungen, Verätzungen oder sonstiger Verletzungen geeignet sind.
Die Verbandsmaterialien, Wundheilverbände oder Pflaster enthalten der erfindungsgemäß hergestellte Plasminogen und/oder daraus gewonnenes Plasmin in einer Konzentration von 0,01
— 500 Units Plasminogen und/oder Plasmin pro cm2 der pharmazeutischen Formulierung, bevorzugt 0,1 bis 500 Units Plasminogen und/oder Plasmin pro cm2 Verbandsmaterial bzw. Pflaster. Weiter bevorzugt ist das Pasminogen und/oder Plasmin in einer Konzentration von 0,1 - 250 Units, ferner weiter bevorzugt von 0,5 - 250 Units und insbesondere bevorzugt von 1
— 150 Units Plasminogen und/oder ein daraus entstehendes Plasmin pro cm2 pharmazeutischer Formulierung in dem Pflaster oder Verbandsmaterial enthalten.
Für die Aktivierung von 1 mg Plasminogen werden zwischen 100 μg und 1 ng Urokinase eingesetzt, bevorzugt werden zwischen 10 μg und 10 ng Urokinase eingesetzt. Für die Aktivierung von 1 mg Plasminogen werden zwischen 1 mg und 1 μg Streptokinase eingesetzt, bevorzugt werden zwischen 300 μg und 3 μg Streptokinase eingesetzt. Für die Aktivierung von 1 mg Plasminogen werden zwischen 100 μg und 10 ng Protease aus S. griseus eingesetzt, bevorzugt werden zwischen 10 μg und 100 ng Protease aus S. griseus eingesetzt. Für die Aktivierung von 1 mg Plasminogen werden zwischen 100 μg und 10 ng Protease VIII eingesetzt, bevorzugt werden zwischen 10 μg und 100 ng Protease VIII. Vorzugsweise ist die für den funktionellen Teil des Plasminogens kodierende Nukleinsäuresequenz eine DNA-Sequenz.
Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem die folgenden Plasmide:
Plasmid pPLGl.l
Plasmid pPLG2.1
Plasmid pPLG3.2
Plasmid pPLG4.2
Plasmid ρPLG5.3
Plasmid pPLG6.1
Plasmid ρPLG7.1
Plasmid pPLG8.3
Plasmid ρPLG9.1
Plasmid pPLGl 0.1
Plasmid pPLGl 1.2
Plasmid pPLGl 2.1
Plasmid pPLGl 3.1
Plasmid pPLGl 4.2
Plasmid pPLGl 5.1
Plasmid pPLGl 6.3
Plasmid pPLGl 7.2
Plasmid pPLGl 8.1
Plasmid pPLGl 9.2
Plasmid pPLG20.1
Plasmid pMHS476.1 (Hinterlegungsnummer: DSM 14678)
Plasmid pSM54.2 (Hinterlegungsnummer: DSM 14682)
Plasmid pSM49.8 (Hinterlegungsnummer: DSM 14681)
Plasmid ρSM82.1 (Hinterlegungsnummer: DSM 14679)
Plasmid ρSM58.1 (Hinterlegungsnummer: DSM 14680)
Plasmid ρAC37.1 (Hinterlegungsnummer: DSM 15369)
Plasmid pJW9.1 (Hinterlegungsnummer: DSM 15368).
(Die Hinterlegungsnummern beziehen sich auf die Hinterlegung bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg lb, D-38124 Braunschweig)
Des weiteren betrifft die vorliegende Erfindung eine zur Expression geeignete DNA-Sequenz, die mindestens die für den funktionellen Teil von Plasminogen kodierende Nukleinsäuresequenz umfasst, erhältlich durch das rekombinante Herstellungsverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung. Sie betrifft außerdem den mikrobiellen Wirtsorganismus, der das im oben beschriebenen Schritt a) erhaltene Fusionsprodukt und eine davon abgeleitete Nukleinsäuresequenz umfasst. Ferner betrifft die vorliegende Erfindung einen Vektor, ein DNA-Molekül, oder ein RNA-Molekül, welches das in dem oben beschriebenen Schritt a) erhaltene Fusionsprodukt oder eine davon abgeleitete Nukleinsäuresequenz umfasst.
Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Screening- Verfahren zur Identifizierung von Plasminogenaktivatoren, insbesondere Plasminogen-aktivierenden Proteasen, wobei das funktionelle Plasminogen, hergestellt gemäß dem oben beschriebenen rekombinanten Herstellungsverfahren, verwendet wird. Vorzugsweise wird hierfür nach Vorinkubation der Proteasen mit dem funktionellen Plasminogen, wie hergestellt gemäß der vorliegenden Erfindung, die resultierende Piasminaktivität gemessen. Die resultierende Piasminaktivität kann mit einem synthetischen Peptidsubstrat gemessen werden. Besonders bevorzugt wird die resultierende Piasminaktivität mit N-Tosyl-Gly-Pro-Lys-pNA gemessen.
Die Erfindung wird durch die Zeichnungen näher erläutert, die folgendes darstellen:
Fig. 1 : Physikalische Karte des Plasmids pMHS476.1 (5682 bp). Das Gen des Präpropeptids des alpha-Faktors ist durch die Kodons für eine Kex2-Schnittstelle mit dem humanen Lys-Plasminogen-Gen verbunden und steht unter der Kontrolle des AOXl -Promotors.
Fig. 2 : Physikalische Karte des Plasmids pSM54.2 (5694 bp). Das Gen des Präpropeptids des alpha-Faktors ist durch die Kodons für eine Kex2-Schnittstelle und zwei Stel3- Schnittstellen mit dem humanen Lys-Plasminogen-Gen verbunden und steht unter der Kontrolle des AOXl -Promotors.
Fig. 3 : Physikalische Karte des Plasmids pSM49.8 (5715 bp). Das humane Präplasminogen-Gen steht unter der Kontrolle des AOXl -Promotors.
Fig. 4 : Physikalische Karte des Plasmids pSM82.1 (5913 bp).
Das Gen des Präpropeptids des alpha-Faktors ist durch die Kodons für eine Kex2- Schnittstelle mit dem humanen Lys-Plasminogen-Gen verbunden und steht unter der Kontrolle des AOXl -Promotors.
Fig. 5 : Physikalische Karte des Plasmids pSM58.1 (5925 bp). Das Gen des Präpropeptids des alpha-Faktors ist durch die Kodons für eine Kex2-Schnittstelle und zwei Stel3- Schnittstellen mit dem humanen Glu-Plasminogen-Gen verbunden und steht unter der Kontrolle des AOXl -Promotors. Fig. 6 : Physikalische Karte des Plasmids pAC37.1 (11400 bp). Das Gen des Präpropeptids des alpha-Faktors ist durch die Kodons für eine Kex2-Schnittstelle und zwei Stel3- Schnittstellen mit dem humanen Lys-Plasminogen-Gen verbunden und steht unter der Kontrolle des AOXl -Promotors.
Fig. 7 : Physikalische Karte des Plasmids pJW9.1 (5925 bp). Das Gen des Präpropeptids des alpha-Faktors ist durch die Kodons für eine Kex2-Schnittstelle und zwei Stel3- Schnittstellen mit dem humanen Lys-Plasminogen-Gen verbunden und steht unter der Kontrolle des GAP-Promotors.
Fig. 8 : Physikalische Karte des Plasmids pPLGl.l. Das Gen des Präpropeptids des alpha- Faktors ist durch die Kodons für eine Kex2-Schnittstelle und zwei Stel3- Schnittstellen mit dem humanen Mini-Plasminogens-Gen verbunden und steht unter der Kontrolle des AOXl -Promotors.
Fig. 9 : Physikalische Karte des Plasmids pPLGl 1.2. Das Gen des Präpropeptids des alpha- Faktors ist durch die Kodons für eine Kex2-Schnittstelle und zwei Stel3- Schnittstellen mit dem humanen Mini-Plasminogens-Gen verbunden und steht unter der Kontrolle des GAP-Promotors.
Fig. 10 : Nachweis der Fibrinolyse- Aktivität im Klärhofassay.
Als Wirtsorganismen kommen erfindungsgemäß alle Mikroorganismen in Betracht, die in der Lage sind, die Glykosylierung und, wenn gewünscht, die Sekretion von Proteinen durchzuführen. Beispielhaft seien hier genannt: S. cerevisiae, P. pastoris, P. methanolica und H. polymorpha oder der filamentöse Pilz Aspergillus sp.
Insbesondere kommt eine Verwendung des gemäß dem vorliegenden Herstellungsverfahrens hergestellten funktionellen Plasminogens bzw. Plasmins in einer pharmazeutischen Formulierung in Betracht. In einer solchen Formulierung kann das funktionelle Plasminogen auf dem Fachmann bekannte Weise mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger oder Hilfsstoff sowie weiteren geeigneten Hufs- oder Zusatzstoffen vermischt sein.
Die Kex2-Schnittstelle gewährleistet das Abspalten des Propeptids durch die im Golgi-Apparat lokalisierte Protease Kex2. Diese auch als Protease YscF oder als Kexin bezeichnete Protease ist Proprotein-prozessierende Serin-Protease, die C-terminal von basischen Aminosäurenpaaren schneidet (z.B.: Lys-Arg). Die Stel3-Schnittstelle gewährleistet das Abspalten des Propeptids durch die im Golgi- Apparat lokalisierte Protease Stel3. Stel3 (auch als Protease YscVI oder Dipeptidylaminopeptidase A bezeichnet) ist im späten Golgi lokalisiert und entfernt schrittweise N-terminale Xaa-Ala Dipeptide, z.B. vom unreifen α-Faktor der Hefe S. cerevisiae.
Außer den Schnittstellen für die Proteasen Kex2 und Ste 13 können weitere Schnittstellen eingefügt werden, die von im endoplasmatischen Retikulum oder im Golgi- Aparat lokalisierten Proteasen als Substrat erkannt werden.
Es ist ebenfalls möglich, ausschließlich eine für den Transport in das Endoplasmatische
Retikulum verantwortliche Signalsequenz (Präpeptid) mit dem Plasminogen-Gen zu fusionieren, d. h. das Propeptid z. B. des Mating-Faktors der Hefe S. cerevisiae ist nicht zwingend nötig.
Die in den Beispielen erwähnten mikrobiologischen, molekularbiologischen und proteinchemischen Methoden sind dem Fachmann wohlbekannt. Als Referenz seien folgende Nachschlagewerke erwähnt: Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor press, 1989 (10); Gassen & Schrimpf, Gentechnische Methoden, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, 1999 (11); EasySelect™ Pichia Expression Kit Instruction Manual, Invitrogen, Groningen, Niederlande, Katalog-Nr, Kl 740-01. Die Pichia pastoris- Stämme und Expressionssysteme stammen ebenfalls von Invitrogen und sind im o. g. Instruction Manual beschrieben.
Kurz gefasst handelt es sich bei pPICZA, B und C um 3.3 kb Pichia pastoris Expressionsvektoren. Die Vektoren tragen ein Zeocin-Resistenzgen für die direkte Selektion von PtcÄt -Transformanten. Die Vektoren tragen außerdem eine C-terminale tag-Sequenz, die eine schnelle Reinigung und den Nachweis von Fusionsproteinen ermöglicht. Bei pPICZalpha A, B und C handelt es sich um 3,6 kb Pichia pastoris Expressionsvektoren, die ebenfalls das Zeocin-Resistenzgen sowie die oben erwähnte C-terminale tag-Sequenz tragen. Zudem enthalten sie das alpha-Faktor Sekretionsignal von Saccharomyces cerevisiae für einen effizienten Transport von Proteinen ins Medium.
Das Plasminogen kann außerdem aktiviert werden. Dafür kann das Plasminogen beispielsweise mit einer Protease inkubiert werden, die mit dem erfindungsgemäßen Screeningverfahren identifiziert wurde.
Vorzugsweise wird dafür das Plasminogen mit Protease aus S. griseus, mit Protease VIII oder Protease XVIII, mit Ficin, Metalloendopeptidase, Clostripain, mit Endoproteinase Glu-C, Protease XIII, Proteinase A, Trypsin, Endoproteinase Asp-N oder Elastase inkubiert. Es ist weiterhin denkbar, Plasminogen zu aktivieren, indem Plasminogen mit einer der Proteasen t-PA, u-PA, oder vb-PA (Vampirfledermaus-PA) inkubiert wird.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird das Plasminogen aktiviert, indem es mit Staphylokinase oder mit Streptokinase inkubiert wird. Streptokinase oder Staphylokinase bilden mit Plasminogen einen 1:1 Komplex. Durch diese Komplexbildung erfährt das im Komplex gebundene Plasminogen eine Konformationsveränderung, so dass es proteolytisch aktiv wird und in der Lage ist, Plasminogen zu Plasmin zu aktivieren.
Das gemäß dem vorliegenden rekombinanten Herstellungsverfahren hergestellte funktionelle Plasminogen oder das aktivierte funktionelle Plasmin ist in der Lage, Fibrin zu hydrolysieren. Ferner ist es in der Lage, ProMatrixmetalloproteasen und Wachstumsfaktoren zu aktivieren.
Die Erfindung wird nachfolgend durch Beispiele näher erläutert.
Beispiel la: Amplifizierung des Lys-Plasminogen-Gens mit Einbau der Kodons für eine Kex2-Schnittstelle am 5 '-Ende
Das Plasmid pPLGKG (Forsgren et al, FEBS Lett. 1987 Mar 23;213(2):254-60 (2)), das das Gen für Prä-Glu-Plasminogen enthält, wurde aus dem Stamm E. coli HB101(pPLGKG) unter Verwendung des QIAGEN Plasmid Midi-Kits (QIAGEN, Hilden) isoliert. 150 ng pPLGKG- DNA wurden mit 10 U der Restriktionsendonuklease EcoRI (Röche, Mannheim) linearisiert und anschließend mit dem QIAquick PCR-Purification Kit (QIAGEN, Hilden) gereinigt. Zur Amplifizierung des Plasminogen-Gens wurde das Oligonukleotid-Primer-Paar N034 (Seq. ID No. 1) und N036 (Seq. ID No. 2) verwendet. Der Oligonukleotid-Primer N036 trägt neben den zum Plasminogen-Gen komplementären Basen die Kodons für die Kex2-Schnittstelle. Zur PCR wurden 0,5 U J -DNA-Poiymerase (Hybaid, Heidelberg), je 400 nM der Oligonukleotid- Primer, je 200 μM dNTP, 3 ng linearisierte pPLGKG-DNA und der zugehörige Reaktionspuffer in einem Endvolumen von 50 μl eingesetzt. Die Primer-Binde-Temperatur betrug 58°C.
Das entstandene PCR-Produkt wurde durch Agarose-Gelelektrophorese auf die erwartete Größe hin untersucht und mit dem QIAquick PCR-Purification Kit gereinigt.
Beispiel lb: Klonierung des Plasminogen-Gens in den Vektor pPICZαA
400 ng des PCR-Produkts wurden mit je 10 U der Restriktionsendonukleasen Kspl und Xhό (Röche, Mannheim) geschnitten. 300 ng DNA des Plasmids pPICZαAA (Invitrogen, Groningen, Niederlande), das die Präpropeptidsequenz des α-Faktors von S. cerevisiae enthält, wurden ebenfalls mit 10 U der Restriktionsendonukleasen Kspl und Xhό geschnitten. Die so behandelte DNA wurde in einem 0,9 %-igen Agarosegel elektrophoretisch getrennt und die erhaltenen Fragmente wurden mit dem QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN, Hilden) aus dem Gel extrahiert. Die Vektor-DNA wurde mit der Insert-DNA vereinigt und mit 1 U T4- DNA-Ligase (Röche, Mannheim) bei 4°C über Nacht ligiert.
Die DNA des Ligierangs-Ansatzes wurde danach mit dem QIAquick PCR-Purification Kit gereinigt und zur Transformation von E. coli JM109 durch Elektroporation eingesetzt.
Die elektroporierten E. coli JM109-Zellen wurden 1 h bei 37°C in 1 ml SOC-Medium inkubiert, anschließend auf LB-Agar-Festmedium mit 20 μg/μl Zeocin (Invitrogen, Groningen, Niederlande) ausplattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert.
Aus einem der so erhaltenen E. co/z-Stämme wurde mit dem QIAGEN Plasmid Mini-Kit (QIAGEN, Hilden) die DNA isoliert und 300 ng nach endonukleolytischer Spaltung mit den Enzymen Xhol und Kspl durch Agarosegelelektrophorese getrennt. Das isolierte Plasmid beinhaltete ein Fragment der erwarteten Größe und wurde als pMHS476.1 bezeichnet (Abb.l). Die korrekte Sequenz des Fusionsgens aus dem Präpropeptid-Gen des alpha-Faktors der Hefe Saccharomyces cerevisiae und dem Lys-Plasminogen-Gen sowie den Kodons für die Schnittstellen-Sequenz der Protease Kex2 wurde durch Sequenzanalyse bestätigt (Seq. ID No. 7).
Beispiel lc: Transformation von Pichia pastoris mit dem Plasmid pMHS476.1
Mit dem QIAGEN Plasmid Midi-Kit wurde aus dem Stamm E. coli JM109 (pMHS476.1) Plasmid-DNA des Plasminogen-Expressionsvektors pMHS476.1 isoliert. 10 μg pMHS476.1- DNA wurden mit 100 U Pmel (New England Biolabs, Frankfurt) linearisiert und nach dem im EasySelect™ Pichia Expression Kit Instruction Manual wiedergegebenen Protokoll zur Elektroporation von Pichia pastoris KM71H his 4:: HIS 4 arg 4 aoxl:: ARG 4 Genotyp von Pichia pastoris Y- 11430 ( Northern Regional Research Laboratories, Peoria, USA) eingesetzt. Die auf YPDS-Festmedium (EasySelect™ Pichia Expression Kit Instruction Manual) mit 100 μg/ml Zeocin nach drei bis vier Tagen gewachsenen Kolonien wurden auf YPD- Festmedium mit 100 μg/ml Zeocin ausgestrichen und zur Beimpfung von Flüssigkulturen eingesetzt. Die Kolonien wurden als Pichia pastoris KM71H/pMHS476.1-l/a bezeichnet, wobei „a" für die fortlaufende Nummerierung der Kolonien beginnend bei 1 steht. Beispiel ld: Anzucht von Pichia pastoris KM71H pMHS476.1-l/l bis -1/3 und Induktion der Plasminogen-Gen-Expression
Zur Herstellung der Vorkulturen wurden 100 ml BMGY-Medium (EasySelect™ Pichia Expression Kit Instruction Manual) in 1 1 Schikane-Kolben bei 28°C und 250 rpm bis zu einer OD600 = 20 - 30 inkubiert. Anschließend wurden die Vorkulturen bei 4645 g und 4°C 10 min zentrifugiert. Die so geernteten Zellen wurden in BMMY-Medium (0,5 % Methanol) resuspendiert, um eine Biofeuchtmasse-Konzentration von 80 g/1 zu erhalten. 60 ml dieser Hauptkulturen wurden in 300 ml Schikanekolben bei 28°C und 250 rpm für 118 h inkubiert. Nach 24 und 72 Stunden wurden 2% Methanol zugegeben. Die Schikanekolben und die hohe Drehzahl von 250 rpm wurden verwendet, um einen ausreichenden Sauerstoffeintrag zu gewährleisten, der bei Verwendung des AOX-Promotors notwendig ist.
Beispiel le: Messung der Plasminogen-Aktivität im Überstand der Hauptkulturen nach Aktivierung mit Streptokinase
Die Proben der Hauptkulturen wurden 10 min bei 16 000 g zentrifugiert. 300 μl des Überstands wurden 20 min bei 37°C mit 1 μl Streptokinase (S8026) (Sigma, Deisenhofen) inkubiert. Zu 750 μl 100 mM Natriumphosphat-Puffer pH 8, 0,36 mM CaCl2, 0,9% NaCl wurden 100 μl N- Tosyl-Gly-Pro-Lys-pNA-Lösung (9,5 mg gelöst in 75 mg Glycin/10 ml, 2% Tween® 20) pipettiert und 10 min bei 37°C inkubiert. Zum Start der Reaktion wurden 250 μl des mit Streptokinase vorbehandelten Überstands zugegeben und bei 37°C weiter inkubiert. Die Extinktionszunahme wurde photometrisch bei 405 nm gemessen. Zur Bestimmung von Kontrollwerten wurden Überstände einer parallel angezogenen P. pastoris KM71H-Kultur sowie Überstände ohne Streptokinase-Aktivierung verwendet. Für die nach 72 h Induktion gezogenen Proben wurden folgende Aktivitätswerte bestimmt (1 U/1 = 1 μmol N-Tosyl-Gly- Pro-Lys-pNA-Umsatz pro Minute pro Liter Kulturüberstand): KM71H/pMHS476.1-1/1: 2 U/1; KM71H/pMHS476.1-l/2: 2 U/1; KM71H/pMHS476.1-1/3: 1 U/1. Nach 118 h Induktion konnten folgende Aktivitätswerte bestimmt werden: KM71H/pMHS476.1-1/1: 7 U/1; KM71H/pMHS476.1-l/2: 9 U/1; KM71H/pMHS476.1-l/3: 8 U/1.
Beispiel 2a: Amplifizierung des Lys-Plasminogen-Gens mit Einbau der Kodons einer Kex2-Schnittstelle und zweier Stel3-Schnittstellen am 5'-Ende
Die Amplifizierung des Lys-Plasminogen-Gens zur Klonierung in den Vektor pPICZαA mit Einbau der Kodons für eine Kex2-Schnittstelle und zwei Stel3-Schnittstellen wurde mit den beiden Oligonukleotid-Primern N034 und N057 (Seq. ID No. 3) unter Verwendung der in Beispiel la geschilderten Bedingungen durchgeführt. Der Oligonukleotid-Primer N057 trägt neben den zum Plasminogen-Gen komplementären Basen die Kodons für die Kex2- Schnittstelle und die Ste 13 -Schnittstellen.
Beispiel 2b: Klonierung des wie in Beispiel 2a beschrieben amplifϊzierten Lys- Plasminogen-Gens in den Vektor pPICZαA
Die Klonierung des Lys-Plasminogen-Gens in den Vektor pPICZαA zur Herstellung eines Fusionsgens aus dem Gen des Präpropeptids des alpha-Fakors der Hefe S. cerevisiae und dem humanen Plasminogen-Gen mit Einbau der Kodons für die Schnittstellen der Proteasen Kex2 und Stel3 wurde analog zu der in Beispiel lb beschriebenen Klonierung durchgeführt. Das erhaltene Plasmid wurde als pSM54.2 bezeichnet (Abb.2). Die korrekte Sequenz (Seq. ID No. 9) wurde durch Sequenzanalyse bestätigt.
Beispiel 2c: Transformation von Pichia pastoris mit dem Plasmid pSM54.2
Wie in Beispiel lc für pMHS476.1 beschrieben, wurde Pichia pastoris KM71H mit dem Plasmid pSM54.2 transformiert. Die erhaltenen Kolonien wurden als Pichia pastoris KM71H/pSM54.2-l/a bezeichnet, wobei „a" wiederum für die fortlaufende Nummerierung der Kolonien beginnend bei 1 steht.
Beispiel 2d: Kultivierung von Pichia pastoris KM71H/pSM54.2-l/l bis -1/3 und Induktion des Plasminogen-Gens
Die Herstellung der Vorkulturen und der Hauptkulturen sowie die Induktion mit Methanol erfolgte analog zu den in Beispiel ld beschriebenen Bedingungen.
Beispiel 2e: Messung der Plasminogen-Aktivität in den Proben der Hauptkulturen nach Aktivierung mit Streptokinase
Die Plasminogenaktivität nach Aktivierung mit Streptokinase wurde wie in Beispiel le für KM71H/pMHS476.1-l/l bis -1/3 beschrieben bestimmt. Für die nach 72 h Induktion gezogenen Proben wurden folgende Aktivitätswerte erhalten: KM71H/pSM54.2-l/l: 2 U/1; KM71H/pSM54.2-l/2: 8 U/1; KM71H/pSM54.2-l/3: 6 U/1. Nach 118 h Induktion konnten folgende Aktivitätswerte bestimmt werden: KM71H/ρSM54.2-l/l: 8 U/1; KM71H/pSM54.2- 1/2: 17 U/1; KM71H/pSM54.2-l/3: 13 U/1. Beispiel 3a: Amplifizierung des Plasminogen-Gens mit eigener Signalsequenz und Klonierung in den Vektor pPICZA; Transformation von Pichia pastoris
Die Amplifizierung des Plasminogen-Gens einschließlich der für das eigene Signalpeptid kodierenden Sequenz (Prä-Plasminogen) zur Klonierung in den Vektor pPICZA wurde mit den beiden Oligonukleotid-Primern N034 und N037 (Seq. ID No. 4) unter Verwendung der in Beispiel la geschilderten Bedingungen durchgeführt.
Die Klonierung des Prä-Plasminogen-Gens in den Vektor pPICZA wurde analog zu der in Beispiel lb beschriebenen Klonierung durchgeführt, wobei sowohl der Vektor als auch das PCR-Produkt mit den Restriktionsendonukleasen Sful und Kspl geschnitten wurden. Das erhaltene Plasmid wurde als pSM49.8 bezeichnet (Abb.3). Die korrekte Sequenz (Seq. ID No. 11) wurde durch Sequenzanalyse bestätigt.
Wie in Beispiel lc für pMHS476.1 beschrieben, wurde Pichia pastoris KM71H mit dem Plasmid pSM49.8 transformiert. Die erhaltenen Kolonien wurden als Pichia pastoris KM71H/pSM49.8-l/a bezeichnet, wobei „a" wiederum für die fortlaufende Nummerierung der Kolonien beginnend bei 1 steht.
Beispiel 4a: Amplifizierung des humanen GIu-Plasminogen-Gens mit Einbau der Kodons einer Kex2-Schnittstelle und Klonierung in den Expressionsvektor pPICZα(alpha)A; Transformation von Pichia pastoris
Die Amplifizierung des Glu-Plasminogen-Gens zur Klonierung in den Vektor pPICZαA mit Einbau der Kodons für eine Kex2-Schnittstelle wurde mit den beiden Oligonukleotid-Primern N034 und N035 (Seq. ID No. 5) unter Verwendung der in Beispiel la geschilderten Bedingungen durchgeführt. Der Oligonukleotid-Primer N035 trägt neben den zum Glu- Plasminogen-Gen komplementären Basen die Kodons für die Kex2-Schnittstelle.
Die Klonierung des Glu-Plasminogen-Gens in den Vektor pPICZαA zur Herstellung eines Fusionsgens aus dem Gen des Präpropeptids des alpha-Fakors der Hefe S. cerevisiae und dem humanen Glu-Plasminogen-Gen mit Einbau der Kodons für die Schnittstellen der Protease Kex2 wurde analog zu der in Beispiel lb beschriebenen Klonierung durchgeführt.
Das erhaltene Plasmid wurde als pSM82.1 bezeichnet (Abb.4). Die korrekte Sequenz (Seq. ID No. 13) wurde durch Sequenzanalyse bestätigt. Wie in Beispiel lc für pMHS476.1 beschrieben, wurde Pichia pastoris KM71H mit dem Plasmid pSM82.1 transformiert. Die erhaltenen Kolonien wurden als Pichia pastoris KM71H/pSM82.1/a bezeichnet, wobei „a" wiederum für die fortlaufende Nummerierung der Kolonien beginnend bei 1 steht.
Beispiel 5a: Amplifizierung des humanen Glu-Plasminogen-Gens mit Einbau der Kodons einer Kex2-Schnittstelle und zweier Stel3-Schnittstellen am 5 '-Ende und Klonierung in den Expressionsvektor pPICZαA; Transformation von Pichia pastoris
Die Amplifizierung des Glu-Plasminogen-Gens zur Klonierung in den Vektor pPICZαA mit Einbau der Kodons für eine Kex2-Schnittstelle und zweier Stel3-Schnittstellen wurde mit den beiden Oligonukleotid-Primern N034 und N056 (Seq. ID No. 6) unter Verwendung der in Beispiel la geschilderten Bedingungen durchgeführt. Der Oligonukleotid-Primer N056 trägt neben den zum Glu-Plasminogen-Gen komplementären Basen die Kodons für die Kex2- und die Stel3-Schnittstellen.
Die Klonierung des Glu-Plasminogen-Gens in den Vektor pPICZαA zur Herstellung eines Fusionsgens aus dem Gen des Präpropeptids des alpha-Fakors der Hefe S. cerevisiae und dem humanen Glu-Plasminogen-Gen mit Einbau der Kodons für die Schnittstellen der Proteasen Kex2 und Stel3 wurde analog zu der in Beispiel lb beschriebenen Klonierung durchgeführt. Das erhaltene Plasmid wurde als pSM58.1 bezeichnet (Abb.5). Die korrekte Sequenz (Seq. ID No. 15) wurde durch Sequenzanalyse bestätigt.
Wie in Beispiel lc für pMHS476.1 beschrieben, wurde Pichia pastoris KM71H mit dem Plasmid pSM58.1 transformiert. Die erhaltenen Kolonien wurden als Pichia pastoris KM71H/pSM58.1/a bezeichnet, wobei „a" wiederum für die fortlaufende Nummerierung der Kolonien beginnend bei 1 steht.
Beispiel 6a: Einfügen des Lys-Plasminogen-Gens aus pSM54.2 in den Vektor pPIC9K
150 ng des Vektors pPIC9K (Invitrogen, Groningen, Niederlande) wurden mit je 10 U der Restriktionsendonukleasen Sαcl und Notl (beide Röche Diagnostics, Mannheim) geschnitten. 300 ng des Plasminogen-Expressionsplasmids pSM54.2 (siehe Beispiel 2b) wurden ebenfalls mit den Enzymen Sßd und Notl geschnitten. Die so behandelte DNA wurde durch Gelelektrophorese mit einem 0,9%-igen Agarosegel getrennt. Das jeweils größere Fragment wurde mithilfe des QIAgen Gel Extraction Kits (Qiagen, Hilden) aus dem Gel extrahiert. Die beiden Fragmente wurden vereinigt und mit 1 U T4-DNA-Ligase über Nacht bei 4°C ligiert. Die Transformation von E. coli DH5α, die Isolierung und die Charakterisierung des resultierenden Plasmids erfolgte analog zur Beschreibung in Beispiel lb, wobei anstelle des Antibiotikums Zeocin das Antibiotikum Ampicillin zur Selektion von Transformanten verwendet wurde. Das derart konstruierte Plasmid wurde mit pAC37.1 (Abb. 6) bezeichnet.
Beispiel 6b: Transformation von Pichia pastoris mit dem Plasmid pAC37.1
Wie in Beispiel lc für die Transformation von Pichia pastoris KM71H mit pMHS476.1 beschrieben, wurde Pichia pastoris KM71 mit dem mit der Restriktionsendonuklease SaR linearisierten Plasmid pAC37.1 transformiert. Die transformierten Zellen wurden auf dem Histidin-freien Medium MD-Agar (Multi-Copy Pichia Expression Kit Instruction Manual) ausplattiert und inkubiert. Die erhaltenen Kolonien wurden als Pichia pastoris KM71/pAC37.1-3/a bezeichnet, wobei „a" wiederum für die fortlaufende Nummerierung der Kolonien beginnend bei 1 steht.
Beispiel 6c: Kultivierung von Pichia pastoris KM71/pAC37.1-3/l und Induktion des Plasminogen-Gens
Die Herstellung der Vorkulturen und der Hauptkulturen sowie die Induktion mit Methanol erfolgte analog zu den in Beispiel ld beschriebenen Bedingungen. Die Induktion erfolgte über 216 h. Begonnen wurde mit einer Methanolkonzentration von 0,5%, nach 24 h und danach im Abstand von 48 h wurden 2% Methanol nachgefüttert.
Beispiel 6d: Messung der Plasminogen-Aktivität in den Proben der Hauptkulturen nach Aktivierung mit Streptokinase
Die Plasminogenaktivität nach Aktivierung mit Streptokinase wurde wie in Beispiel le für KM71H/ρMHS476.1-l/l bis -1/3 beschrieben bestimmt. Für die nach 120 h Induktion gezogenen Probe 120 U/1 Aktivität erhalten. Nach 216 h Induktion konnten 190 U/1 Aktivität gemessen werden.
Beispiel 6e: Induktion von Pichia pastoris KM71/pAC37.1-3/l in Minimal-Medium (BSM) und Messung der Plasminogen-Aktivität in den Proben der Hauptkulturen nach Aktivierung mit Streptokinase
Nach der Anzucht von Pichia pastoris KM71/pAC37.1-3/l in BMGY-Komplex-Medium (siehe Beispiel ld) wurden 80 g der abzentrifügierten Zellen in 100 ml BSM-Minimal-Medium für die Induktionsphase resuspendiert. Das BSM (Basal Salts Medium) -Minimal-Medium ist folgendermaßen zusammengesetzt:
H3PO4, 85 %: 26,0 mL/L; CaC12-2H2O: 0,6 g/L; K2SO4: 18,0 g/L; MgSO4-7H2O:14,0 g/L;
KOH: 4,0 g/L; Glycerin: 20 mL/L; Antischaum: 1,0 mL/L; Spurenlösung: 8,0 mL/L;
Biotinlösung (0,2 g/L): 8,0 mL/L.
Zusammensetzung der Spurenlösung: H2SO4: 5,0 mL/L; CuSO4-5H2O: 6,0 g/L; KI: 0,08 g/L;
MnSO4-H2O: 3,0 g/L; Na2MoO4: 0,2 g/L; H3BO3: 0,02 g/L; CoC12 : 0,5 g/L; ZnC12: 20,0 g/L; FeSO4-7H2O: 65,0 g/L.
Zur Induktion wurden täglich 2% Methanol zugegeben. Die Plasminogenaktivität nach
Aktivierung mit Streptokinase wurde wie in Beispiel le für KM71H/pMHS476.1-l/l bis -1/3 beschrieben bestimmt. Nach 120 Stunden Induktion wurden 193 U/1 Plasminogen-Aktivität bestimmt, nach 168 h konnten 289 U/L gemessen werden.
Beispiel 6f: Nachweis der Plasminogen-Aktivität in den Proben der Hauptkulturen nach Aktivierung mit Streptokinase im Fibrinolyse-Klärhof-Test
Zur Vorbereitung des Fibrinolyse-Klärhof-Tests (Stack, M. S., Pizzo, S. V., und Gonzalez- Gronow, M. (1992): Effect of desialylation on the biological properties of human plasminogen. Biochem. J. 284, 81-86) (13) wurden 1,5 g GTG-Low-Melting-Agarose in 75 ml 50 mM Natrium-Phosphat-Puffer pH 7,4 durch Aufkochen geschmolzen. 35 ml einer Fibrinogen- Lösung (225 mg/37,5 ml 50 mM Natrium-Phosphat-Puffer pH 7,4) wurden blasenfrei mit 350 μl Thrombinlösung (10 U/ml in 50 mM Natrium-Phosphat-Puffer pH 7,4) vermischt, in die Agarose-Lösung eingerührt und in eine Petrischale gegossen. Nach Erstarren des Fibrinagars wurden 1 mm große Löcher in den Agar gestochen.
Um die Fibrinolyse- Aktivität des rekombinant hergestellten Plasminogens nach Streptokinase- Aktivierung nachzuweisen, wurden in die Löcher je 20 μl folgender Lösungen pipettiert und 20 h bei 37°C inkubiert:
1 : 0,5 mg/ml Plasminogen (Röche, Mannheim)
2: Kulturüberstand KM71/ρAC37.1-3/l aus Beispiel 6e
3: 0,5 mg/ml Plasminogen, Streptokinase-aktiviert
4: Kulturüberstand KM71/pAC37.1-3/1 aus Beispiel 6e, Streptokinase-aktiviert
5: 0,25 mg/ml Plasminogen, Streptokinase-aktiviert
6: Kulturüberstand KM71/pAC37.1-3/l aus Beispiel 6e, 1:2 verdünnt, Streptokinase- aktiviert
7 : 0, 125 mg/ml Plasminogen, Streptokinase-aktiviert
8: Kulturüberstand KM71H, wie in Beispiel 6e für KM71/pAC37.1-3/l beschrieben hergestellt, Streptokinase-aktiviert Zur Aktivierung mit Streptokinase wurden zu 40 μl der jeweiligen Lösungen 2 μl Streptokinase
(100 U/μl, Sigma, Deisenhofen) pipettiert und bei 37°C 60 min inkubiert.
Die durch fibrinolytische Aktivität entstandenen Klärhöfe sind in Abb. 8 gezeigt.
Beispiel 6g: Reinigung des rekombinant in Pichia pastoris KM71/pAC37.1-3/l hergestellten Plasminogens durch Affinitätschromatographie
50 ml des Kulturüberstands von Pichia pastoris KM71/pAC37.1-3/1 aus Beispiel 6c/6d wurde bei 4°C gegen 4 L 50 mM Natrium Phosphatpuffer pH 7,5 dialysiert. Nach 24 h wurde der Dialysepuffer gewechselt und weitere 24 h dialysiert. Das Dialysat wurde anschließend durch einen 0,02 μm Filter gepresst und danach auf eine mit 50 mM Natrium Phosphatpuffer pH 7,5 äquilibrierte Lysin-SepharoseTM 4B-Säule (Durchmesser: 16 mm, Höhe: 95 mm) (Amersham Biosciences) aufgetragen. Mit 50 mM Natrium Phosphatpuffer, pH 7,5, 0,5 M NaCl wurden unspezifisch gebundene Proteine von der Säule gewaschen. Das gebundene Plasminogen wurde mit 50 mM Natrium Phosphatpuffer pH 7,5, 0,01 M ε-Aminocapronsäure eluiert. Einzelne Proben wurden durch 7,5%-ige SDS-PAGE mit anschließender Silberfärbung analysiert (Fig . 11). Das in den Fraktionen enthaltene rekombinante Plasminogen befindet sich im Gel auf der Höhe des als Referenz aufgetragenen human-Plasminogens (s. Fig. 11).
Fig. 11 zeigt ein 7,5 %iges SDS-PAGE der Reinigungsfraktionen aus Beispiel 6g. In Fig. 11 haben die verwendeten Abkürzungen folgende Bedeutungen:
M: Größenstandard (von oben nach unten: 116 kDa, 66 kDa, 45 kDa, 35 kDa.)
D: Dialysat,
N: nichtbindende Fraktion,
W: Waschfraktion,
F1-F5 Plasminogenhaltige Elutionsfraktionen,
Plg: Plasminogen (American Diagnostica, Pfungstadt).
Beispiel 6h: Fermentation von Pichia pastoris KM71/pAC37.1-3/l zur Evaluierung des pH- Wertes und des Substrat-Einflusses
50 ml YEP-G-Medium (10 g/1 Hefeextrakt, 20 g/1 Caseinpepton, 20 g/1 Glycerol) in einem 1 1- Weithalskolben ohne Schikanen wurden mit 2 ml Glycerolkryokultur Pichia pastoris KM71/ρAC37.1-3/l beimpft und 9 h bei 30°C und 300 rpm inkubiert. 5 ml dieser Kultur wurden verwendet, um 50 ml MG-Medium (5 g/1 Yeast-Nitrogen-Base w/o amino acids, 20 g/1 Glycerol, 2,5 ml/1 Biotinlösung (0,2g/l)) in einem 1 1 Weithalsschüttelkolben ohne Schikanen zu inokulieren. Diese zweite Vorkultur wurde bei 30°C und 300 rpm für 16 h inkubiert. Die Hauptkultur wurde in der Multifermenteranlage „stirrer-pro" (DASGIP, Jülich) fermentiert, die die parallele Fermentation von vier Kulturen bei unterschiedlichen Bedingungen erlaubt. Dazu wurden je 150 ml BSM-Medium (siehe Beispiel 6e) mit 15 ml der zweiten Vorkultur inokuliert. Die Fermentationen wurden bei pH 6 gestartet, der Ziel-pH- Wert wurde nach Beginn der Substratdosierung angesteuert. Die unterschiedlichen Bedingungen und Ergebnisse der Parallelfermentationen sind in Tab.l dargestellt.
Tabellel
Versuch pH Substrat Feedrate OD600 Plasminogenkonzentration
I 6 Methanol Profil 187 1,4 mg/1
II 7 Methanol Profil 160 6,1 mg/1
III 6 Methanol/Glycerol l ml/h 270 10,1 mg/1
TV 6 Methanol Profil 130 3,4 mg/1
In Versuch IV wurde dem Medium 30 g/1 Pepton zugegeben. Vor dem Beginn der Methanoldosierung wurde für 4 h mit einer konstanten Rate von 24 ml/h Glycerol-Feedmedium (500 g/1 wasserfreies Glycerol, 10 ml/1 Spurenlösung, 10 ml /l Biotinlösung [siehe Beispiel 6e]) zudosiert. Für das Profil in den Versuchen I, II und IN wurde folgender Term in als Dosierfunktion eingegeben: f(x)=Pl+(P2/l+exρ(-P3(t-P4))))+(P5/(l+exρ(-P6(t-P7)))) mit P1=0; P2=0,7; P3=0,2; P4= 5; P5=P6=P7=0. Aus Tabelle 1 wird ersichtlich, dass die Plasminogenkonzentrationen bei neutralem pH-Wert bzw. gemischter Glyerol/Methanoldosierung am höchsten ist.
Beispiel 7a: Einfügen des Lys-Plasminogen-Gens aus pAC37.1 in den Vektor pGAPZαA
150 ng des Vektors pGAPZαA (Invitrogen, Groningen, Niederlande) wurden mit je 10 U der Restriktionsendonukleasen Xhol und Notl (beide Röche Diagnostics, Mannheim) geschnitten. 300 ng des Plasminogen-Expressionsplasmids pAC37.1 (siehe Beispiel 6a) wurden ebenfalls mit den Enzymen Xhol und Notl geschnitten. Die so behandelte DNA wurde durch Gelelektrophorese mit einem 0,9%-igen Agarosegel getrennt. Das 2715 bp große Plasminogen- Gen-Fragment aus ρAC37.1 sowie das 3073 bp große Vektorfragment aus pGAPZαA wurden mithilfe des QIAgen Gel Extraction Kits (Qiagen, Hilden) aus dem Gel extrahiert. Die beiden Fragmente wurden vereinigt und mit 1 U T4-DNA-Ligase über Nacht bei 4°C ligiert. Die Transformation von E. coli DH5α, die Isolierung und Charakterisierung des resultierenden Plasmids erfolgte analog zur Beschreibung in Beispiel lb. Das derart konstruierte Plasmid wurde mit pJW9.1 (Abb.7) bezeichnet.
Beispiel 7b: Transformation von Pichia pastoris mit dem Plasmid pJW9.1
Wie in Beispiel lc für die Transformation von Pichia pastoris KM71H mit pMHS476.1 beschrieben, wurde Pichia pastoris KM71H mit dem mit der Restriktionsendonuklease Blnl linearisierten Plasmid pJW9.1 transformiert. Die transformierten Zellen wurden auf YPDS- Agar mit 100 μg/ml Zeocin (EasySelect™ Pichia Expression Kit Instruction Manual) ausplattiert und inkubiert. Die erhaltenen Kolonien wurden als Pichia pastoris KM71H/ JW9.1-a bezeichnet, wobei „a" wiederum für die fortlaufende Nummerierung der Kolonien beginnend bei 1 steht.
Beispiel 7c: Fermentation von Pichia pastoris KM71H/pJW9.1-3 zur Evaluierung des pH- Wertes bei und der Glycerol-Zufütterungs-Rate
Die Vorkulturen und die Fermentation im „Stirrer-pro" wurden wie in Beispiel 6i beschrieben durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tagelle 2 dargestellt.
Tabelle 2
Versuch pH Substrat Feedrate OD600 Plasminogenkonzentration
I 6,5 Glycerol l ml/h 220 18,6 mg/1
II 7,0 Glycerol l ml/h 203 22,2 mg/1
III 6,5 Glycerol 0,5 ml/h 142 10,1 mg/1
IV 7,0 Glycerol 0,5 ml/h 99 3,8 mg/1
Auch bei Glycerol-Fütterung wurden durch Fermentation bei neutralem pH- Wert die besten Ausbeuten erhalten, wobei der Einfluss der Substratdosierung (Feedrate) auf die Produktbildung deutlich zu sehen ist.
Beispiel 7d: Fermentation von Pichia pastoris KM71H/pJTW9.1-3
50 ml YEP-G-Medium (10 g/1 Hefeextrakt, 20 g/1 Caseinpepton, 20 g/1 Glycerol) in einem 1 1- Weithalskolben ohne Schikanen wurden mit Pichia pastoris KM71H/pJW9.1-3 beimpft und 9 h bei 30°C und 300 rpm inkubiert. 10 ml dieser Kultur wurden verwendet, um.40 ml MG- Medium (5 g/1 Yeast-Nitrogen-Base w/o amino acids, 20 g/1 Glycerol, 2,5 ml/1 Biotinlösung (0,2g/l)) in einem 1 1 Weithalsschüttelkolben ohne Schikanen zu inokulieren. Diese Kultur wurde bei 30°C und 300 rpm für 16 h inkubiert.
3 1 BSM-Medium (siehe Beispiel 6e) wurden mit 30 ml dieser Kultur in einem 7,5 1 Laborfermenter (Typ Labfors, ors AG, CH) beimpft. Die Fermentation wurde bei 25°C und einer konstanten Begasungsrate von 3,2 1/min durchgeführt. Nach 24 h wurde Glycerollösung (500g/l Glycerol, 10 ml/1 Spurenlösung, 10 ml/1 Biotinlösung [siehe Beispiel 6e]) zudosiert. Die Dosierungsrate wurde von 10 ml/h im Verlauf der Fermentation schrittweise auf 45 ml/h erhöht. Nach 250 h konnten 1375 U/1 Plasminogen-Aktivität nach Streptokinase-Aktivierung gemessen werden.
Beispiel 8: Identifizierung von Plasminogenaktivatoren
24 im Handel erhältliche Proteasen wurden auf Ihre Eignung zur Plasminogen-Aktivierung getestet. Die Versuche dazu wurden in 100 mM Natriumphosphat-Puffer pH 8, 0,36 mM CaCl2, 0,9% NaCl durchgeführt.
Die in pulveriger Form gelieferten Proteasen wurden in Puffer gelöst, die in Lösung gelieferten Proteasen wurden direkt eingesetzt bzw. bei Bedarf mit Puffer verdünnt. 25 μl der Protease- Lösungen wurden mit 25 μl Plasminogen gemäß der vorliegenden Erfindung (20 mg/ml) vermischt und bei 37°C 10 min inkubiert. Anschließend wurde die Plasmin- Aktivität bzgl. des Substrats N-Tosyl-Gly-Pro-Lys-pNA bestimmt. Dazu wurden zu 850 μl Puffer 200 μl Substratlösung (9,5 mg N-Tosyl-Gly-Pro-Lys-pNA, gelöst in 75 mg Glycin/10 ml, 2% Tween® 20) pipettiert, mit den 50 μl des vorinkubierten Plasminogen-Protease-Gemisches versetzt und weiter bei 37°C inkubiert. Die Zunahme der Extinktion wurde photometrisch bei 405 nm gemessen. Zur Messung der durch die Proteasen bedingten Extinktionszunahmen wurden Kontrollen durchgeführt, bei denen anstelle des vorinkubierten Plasminogen- Proteasegemisches ein ebenfalls vorinkubiertes Puffer-Proteasegemisch verwendet wurde.
Die Proteasen Protease aus S. griseus, Protease VIII, Protease XXIII, Protease XLX, Protease XVIII, Ficin, Metalloendopeptidase, Clostripain, Glu-C, Protease XIII, Chymopapain, Chymotrypsin, Protease X, Bromelain, Kallikrein und Proteinase A wurden von Sigma, Deisenhofen bezogen; Trypsin, Papain, Asp-N, Dispase I, Lys-C, Thrombin und Elastase stammten von Röche, Mannheim, die Proteinase K wurde von QIAGEN, Hilden geliefert. Die hergestellten Protease-Stammlösungen hatten die in der Tabelle angegebenen Proteinkonzentrationen. Der Verdünnungsfaktor F gibt an, in welchem Verhältnis die Stammlösungen für die Messungen verdünnt wurden.
Folgende Plasmin-Aktivitäten konnten nach Aktivierung bestimmt werden (1 U/mg = 1 μmol N-Tosyl-Gly-Pro-Lys-pNA-Umsatz pro Minute pro mg Protein): Tabelle3
Protease Plasmin- Aktivität n cProtein rmg/ml] F
Protease aus S. , griseus 613,3 U/mg 0,77 1000
Protease VIII 9 U/mg 3,58 1000
Protease XXIII * 7,8 50000
Protease XLX * 2,78 100
Protease XVIII 0,7 U/mg 1,79 100
Ficin 0,01 U/mg 0,81 1
Metalloendopeptidase 8,9 U/mg 0,01 1
Clostripain 1,7 U/mg 0,25 1
Endopoteinase ' Glu-C 0,6 U/mg 0,81 1
Protease XIII 0,01 U/mg 0,43 1
Chymopapain * 2,02 1
Chymotrypsin * 0,14 1
Protease X * 2,01 1
Bromelain * 0,81 1
Kallikrein * 0,56 1
Proteinase A 0,02 U/mg 0,36 1
Trypsin l l kU/mg 3,40 100000
Papain * 0,64 10
Endoproteinase Asp-N 4,3 U/mg 0,004 1
Dispase I * 0,2 1
Endoproteinase Lys-C * 0,01 1
Thrombin 83,0 U/mg 0,59 500
Elastase 0,63 U/mg 0,36 5
Proteinase K * 3,60 100
* Für die Proteasen Protease XXIII, Protease XLX, Chymopapain, Endoproteinase Lys-C, Chymotrypsin, Papain, Dispase I, Protease X, Bromelain, Kallikrein und Proteinase K konnte keine Plasminogen- Aktivierung nachgewiesen werden. Beispiel 9: Pharmazeutische Formulierungen
Das in den folgenden Beispielen verwendete rekombinante funktionelle Plasminogen wurde mit Hilfe des erfinderischen Herstellungsverfahren erhalten. Hierbei bezieht sich die Bezeichnung „Plasminogen" sowohl auf rekombinantes Micro-, Mini-, Lys- oder Glu- Plasminogen und die Bezeichnung „Plasmin" auf Plasmin, das durch proteolytische Spaltung von rekombinantem Micro-, Mini-, Lys- oder Glu-Plasminogen gewonnen wurde. Die Aktivierung von Micro-, Mini-, Lys- oder Glu-Plasminogen kann unter Verwendung derselben Plasminogenaktivatoren, insbesondere Plasminogen-aktivierenden Proteasen, wie oben beschrieben erhalten werden ist aber nicht beschränkt darauf, wobei das Verhältnis an Units Aktivator zu Units Plasminogen (Micro-, Mini-, Lys- oder Glu-Plasminogen) ungefähr 1: 1000 beträgt.
Das Plasminogen kann sowohl proteolytisch, d. h. durch die Proteasen tissue-Plasminogen- Aktviator, Urokinase oder die im Patent beschriebenen Proteasen Protease VIII oder Protease aus S. griseus aktiviert werden, als auch durch Komplexierung mit Streptokinase oder Staphylokinase.
Beispiel 9a: Pharmazeutische Formulierungen
Hydrogele
Basisformulierung für Hydrogele (100g)
Plasminogen 100 U
Plasminogenaktivatoren) 0,1 U
Hydroxyethylcellulose 10 000 3,5 g optional Konservierung (Sorbinsäure/Kaliumsorbat 0,1-0,4%», PHB-Ester 0,1%). gereinigtes Wasser ad 100,0
Die Hydroxyethylcellulose bzw. stattdessen Hypromellose bzw. Methylcellulose können alternativ in einer Menge von 0,5 - 15,0 g eingesetzt werden.
Gel
Plasminogen 1000 U
Plasminogenaktivatoren) 1 U
Glycerol (85%) 150,0 g
Hydroxyethylcellulose 10 000 32,5 g optional Konservierung (Sorbinsäure/Kaliumsorbat 0,1-0,4%, PHB-Ester 0,1%)
Ringerlösung ohne Laktat zu 1000,0g
alternativ: 100g enthalten:
Plasminogen 100 U
Plasminogenaktivator(en) 0,1 U
Hydroxyethylcellulose 30 000 2,5 g
Glycerol 85% 10,0 g optional Konservierung (Sorbinsäure/Kaliumsorbat 0,1-0,2%, PHB-Ester 0,1%) gereinigtes Wasser ad 100,0
alternativ:
100g Gel enthalten:
Plasminogen 100 U
Plasminogenaktivator(en) 0,1 U
Polyacrylsäure 1 g
Propylenglykol 8 g
Mittelkettige Triglyceride 8 g
Diethylamin (zur pH-Einstellung) q.s. optional Konservierung (Sorbinsäure/Kaliumsorbat 0,1-0,2%, PHB-Ester 0,1%)
2-Propanol 0 - 1 g
Wasser zu 100g
Hydrophile Salbe (Macrogolsalbe)
50g enthalten
Plasminogen 50 U
Plasminogenaktivator(en) 0,05 U
Macrogol 400 30,0 g
Macrogol 4000 10,0 g optional Konservierung (Sorbinsäure/Kaliumsorbat 0,1-0,2%, PHB-Ester 0,1%) gereinigtes Wasser ad 50,0 g
alternativ:
wasserfreie Macrogolsalbe
100g enthalten:
Plasminogen 100 U
Plasminogenaktivatoren) 0,1 U
Macrogol 300 50 g
Macrogol 1500 zu 100 g alternativ
Wasseraufnehmende Salbe
Plasminogen 100 U
Plasminogenaktivator(en) 0,1 U
Cetylstearylalkohol 29 g
Paraffin, dickflüssiges 34 g
Vaselin, weißes zu 100 g
Hydrophobe Salbe
Plasminogen 100 u
Plasminogenaktivatoren) 0,1 u
Vaseline 80,0 g
Paraffin dünnflüssig zu 100,0 g
Hydrophobe Paste
Plasminogen 100 U Plasminogenaktivator(en) 0,1 U Hypromellose 400 20 g Vaseline, weißes zu 100 g
alternativ
Plasminogen 100 U
Plasminogenaktivator( en) 0,1 U
Carbomer (z.B. Carbopol 974p) 15 g
Paraffin, dickflüssiges 40 g weißes Vaselin zu 100,0 g
Creme:
Plasminogen 100 U
Plasminogenaktivator en) 0,1 U
Mittelkettige Triglyceride 20 g
Emulgierender Cetylstearylalkohol 10 g
Lanolin 10 g
Sorbitol 10 g optional Konservierung (Sorbinsäure/Kaliumsorbat 0,1-0,2%, PHB-Ester 0,1%)
Wasser gereinigtes zu 100 g Nichtionische hydrophile Creme
Plasminogen 100 u
Plasminogenaktivator(en) 0,1 u
Cetylalkohol 20 g
2- Ethyllauromyristat 10 g
Glycerol 85% 6 g
Kaliumsorbat 0,14 g
Citronensäure 0,07 g
Wasser ad 100 g
Nichtionische Creme
Plasminogen 100 U Plasminogenaktivator en) 0,1 U Polysorbat 60 5 g Cetylstearylalkohol 10 g Glycerol 85% 10 g Vaselin, weißes 25 g optional Konservierung (Sorbinsäure/Kaliumsorbat 0,1-0,2%», PHB-Ester 0,1%) Wasser ad 100 g
Liposomale Formulierung
Plasminogen 100 U
Plasminogenaktivator( en) 0,1 U
Sojalecithin, Hühnerlecithin 15 g optional Konservierung
(Sorbinsäure/Kaliumsorbat 0,1-0,2%, PHB-Ester 0,1%», bzw. Diazodinylharnstoff l-2g)
Wasser zu 100,0 g
Kapsel eine Kapsel mit 0,25g Pulver/Granulat enthält:
Plasminogen 5 U
Plasminogenaktivator(en) 0,005 U
Stärke 0,1 g
Siliciumdioxid 0,02 g
Magnesiumstearat 0,002 g
Polymethacrylat-Copolymerisate/Polymethacrylsäure 0,015 g
Triethylcitrat 0,0005 g
Talkum 0,001 g
Cellulose, mikrokristalline zu 0,25 g alternativ
eine Kapsel mit 0,25g Pulver/Granulat enthält:
Plasminogen 5 U
Plasminogenaktivator en) 0,005 U
Siliciumdioxid 0,01 g
Magnesiumstearat 0,002 g
Polymethacrylat-Copolymerisate/Polymethacrylsäure 0,015 g
Triethylcitrat 0,0001 g
Talkum 0.001 mg
Mannitol zu 0,25 g
Tablette
100mg Tablettengranulat enthalten
Plasminogen 5 U
Plasminogenaktivator( en) 0,005 U
Stärke 30 mg
Siliciumdioxid 2 mg
Magnesiumstearat 4 mg
Polymethacrylat-Copolymerisate/Polymethacrylsäure 5 mg
Triethylcitrat 0-1 mg
Talkum 0.0001 mg
Cellulose mikrokristalline zu 100 mg
Pellets
100g Pellets enthalten:
Plasminogen 2000 U
Plasminogenaktivator( en) 2 U
Stärke 20 g
Sucrosestearat 20 g
Siliciumdioxid 2 g
Magnesiumstearat 3 g
Polyvinylpyrrolidon 0 - l g
Polymethacrylat-Copolymerisate/Polymethacrylsäure 5 g
Talkum 0,2 g
Triethylcitrat 0,1 g
Cellulose, mikrokristalline zu 100 g Injektionslösung
Plasminogen 500 U
Plasminogenaktivator(en) 0,5 U
Ethanol 0 - l g
Propylenglykol 10 g
Polyethylenglykol 0 - l g
Natriumchlorid q.s. optional Puffer (Natriumhydrogenphosphat/Natriumdihydrogenphosphat) gereinigtes Wasser zu 100 ml
Anstelle von Micro-, Mini-, Lys- oder Glu-Plasminogen kann bei den aufgezählten Formulierungen auch die gleiche Menge bezogen auf die Aktivität an Plasmin eingesetzt werden. Wird Plasmin direkt verwendet, so brauchen in der pharmazeutischen Formulierung keine Plasminogenaktivator(en) enthalten zu sein.
Beispiel 9b: Pharmazeutische Formulierungen a) Hydrogele
Basisformulierung für Hydrogele (100 g) Plasmin 100 U
Hydroxyethylcellulose 400 2,5 - 5,0 g gereinigtes Wasser zu 100,0 g
Die Quellungszeit beträgt 1 bis 3 h.
Möglich ist die Verwendung von 1 - 1000 U Plasmin pro Gramm Hydrogel.
b) Hydrophile Salbe
Basisformulierung einer hydrophilen Salbe (1000 g):
Plasmin 1000 U wasserfreies Glycerol 85,0 g
HydroxyethylcelluloselO.000 32,5 g optional Polyhexanid 0,2 Gew.%
Ringerlösung ohne Lactat zu 1000,0 g
Polyhexanid kann als antimikrobieller Wirkstoff optional in einer Konzentration bis 0,2
Gew.% zugegeben werden.
Anstelle von Hydroxyethylcellulose 10.000 (Natrosol 250® HX PHARM) kann auch
Hydroxyethylcellulose 400 (z.B. Tylose® H 300 oder Natrosol 250® HX PHARM)
Möglich ist die Verwendung von 1 - 10000 U Plasmin pro Gramm Salbe. c) Salbe
Basisformulierung für Salbe (50 g)
Plasmin 50 U
Macrogol 400 30,0 - 32,5 g
Macrogol 4000 12,5 - 7,5 g gereinigtes Wasser zu 50,0 g
Zubereitung:
12,5 g Macrogol 4000 und 30,0 g Macrogol 400 (bei weichen Salben 7,5 g Macrogol 4000 und 32,5 g Macrogol 400) werden in einer Salbenschale im Wasserbad erwärmt, bis das Macrogol geschmolzen ist. Nach dem Abkühlen wird die entsprechende Menge an Plasmin, das mit Hilfe des erfinderischen Verfahrens hergestellt wurde, gelöst in 7,5 g gereinigtem Wasser zugesetzt und anschließend homogenisiert.
Φ Kapseln
Basisformulierung für 0,5 g
Plasmin 5 U
Lactose 0,42 g
Stärke 0,06 g
Magnesiumstearat 0,02 g
Möglich ist die Verwendung von 0,1 - 100 U Plasmin pro Kapsel.
e) Injektionslösung / Infusionslösung Basisformulierung für 100 ml
Plasmin 500 U
Ethanol 0,01 g
Propylenglykol 30 ml gereinigtes Wasser zu 100 ml.
Möglich ist die Verwendung von 1 - 500 U Plasmin pro ml Lösung.
Anstelle von Plasmin kann auch Micro-, Mini-, Lys- oder Glu-Plasminogen in den für das Plasmin genannten Mengen bezogen auf die Aktivität in Units eingesetzt werden, wenn zugleich mindestens ein Plasminogenaktivator zugesetzt wird, in einer Menge von 1 : 10000 bis 1 : 100, bevorzugt in einer Menge von 1: 1000 bezogen auf die Plasminogen-Aktivität. Beispiel 10a: Amplifizierung und Klonierung verschiedener Formen des Mini- und des Microplasminogen-Gens und Klonierung in den Vektor pPICZαA; Transformation von Pichia pastoris
Mini- und Microplasminogen sind verkürzte Plasminogen-Derivate, denen N-terminale Domänen fehlen, die aber dennoch zu aktivem Plasmin aktivierbar sind.. Die Amplifizierung der Mini- und Microplasminogen-Gene zur Klonierung in den Vektor pPICZαA wurde mit dem Oligonukleotid-Primer N034 für das 3 '-Ende und je einem der Primer N036a-j (Seq. ID No. 19 bis 28) für das jeweilige 5'-Ende unter Verwendung der in Beispiel la geschilderten Bedingungen durchgeführt. Die Oligonukleotid-Primer N036a,c,e,g,i tragen neben den zum Plasminogen-Gen komplementären Basen die Kodons für die Kex2-Schnittstelle, die Primer N036b,d,f,hj tragen zusätzlich im Anschluss an die Kodons für die Kex2-Schnittstelle die Kodons für zwei Stel3-Schnittstellen. Der Primer N034 trägt des Weiteren eine Kspϊ- Schnittstelle, die Primer N036 a-j tragen eine J^ol-Schnittstelle.
Die Klonierung der Mini- und Microplasminogen-Gene in den Vektor pPICZαA wurde analog zu der in Beispiel lb beschriebenen Klonierung durchgeführt, wobei sowohl der Vektor als auch das jeweilige PCR-Produkt mit den und Kspl geschnitten wurden. Zusammenfassend sind die verwendeten Primer, die Namen des Plasminogen- Derivats, die kodierten Protease-Schnittstellen, die Bezeichnung der erhaltenen Plasmide und die N-Terminale Aminosäure des sezernierten Plasminogen-Derivats folgender Tabelle zu entnehmen.
5 '-Primer 3 '-Primer Name Protease- Plasmidname N-Terminale Schnittstelle Aminosäure*
N036a N034 Miniplasminogen Kex2 pPLGl.l A463
N036b N034 Miniplasminogen Kex2, 2xStel3 pPLG2.1 A463
N036c N034 Microplasminogen Kex2 pPLG3.2 K550
N036d N034 Microplasminogen Kex2, 2xStel3 pPLG4.2 K550
N036e N034 Microplasminogen Kex2 pPLG5.3 L551
N036f N034 Microplasminogen Kex2, 2xStel3 pPLG6.1 L551
N036g N034 Microplasminogen Kex2 pPLG7.1 A562
N036h N034 Microplasminogen Kex2, 2xStel3 pPLG8.3 A562
N036i N034 Microplasminogen Kex2 pPLG9.1 S564
N036J N034 Microplasminogen Kex2, 2xStel3 pPLGlO.l S564
* Die Nummerierung bezieht sich auf das 810 Aminosäuren lange Präplasminogen (Seq. ID No. 12) Beispielhaft ist in Fig 8 das Plasmid pPLGl.l dargestellt.
Wie in Beispiel lc für pMHS476.1 beschrieben, wurde Pichia pastoris KM71H mit dem
Plasmid pPLGl.l transformiert. Die resultierenden Kolonien wurden als Pichia pastoris
KM71H/pPLGl.l-l/a bezeichnet, wobei „a" wiederum für die fortlaufende Nummerierung der
Kolonien beginnend bei 1 steht.
Zur Generierung von Stämmen auf Basis der Plasmide pPLG2.1, pPLG3.2, pPLG4.2, pPLG5.3, pPLGό.l, pPLG7.1, pPLG8.3, pPLG9.1 und pPLGlO.l wurde entsprechend der
Herstellung des Stamms KM71H/pPLGl.l-l/a vorgegangen.
Oligonukleotid-Primer N036a-j
N036a AAAAACTCGAGAAAAGAGCACCTCCGCCTGTTG
N036b AAAAACTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTGCACCTCCGCCTGTTG
N036c AAAAACTCGAGAAAAGAAAACTTTACGACTACTG
N036d AAAAACTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTAAACTTTACGACTACTG
N036e AAAAACTCGAGAAAAGACTTTACGACTACTGTG
N036f AAAAACTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTCTTTACGACTACTGTG
N036g AAAAACTCGAGAAAAGAGCCCCTTCATTTGATTGTG
N036h AAAAACTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTGCCCCTTCATTTGATTGTG
N036i AAAAACTCGAGAAAAGATCATTTGATTGTGGGAAGCC
N036j AAAAACTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTTCATTTGATTGTGGGAAGCC.
Beispiel 10b: Amplifizierung und Klonierung verschiedener Formen des Mini- und des Microplasminogen-Gens und Klonierung in den Vektor pGAPZαA; Transformation von Pichia pastoris
Die Amplifizierung der Mini- und Microplasminogen-Gene zur Klonierung in den Vektor pGAPZαA wurde mit dem Oligonukleotid-Primer N034 für das 3 '-Ende und je einem der Primer N036a-j (Seq. ID No. 19 bis 28) für das jeweilige 5'-Ende unter Verwendung der in Beispiel la geschilderten Bedingungen durchgeführt. Die Oligonukleotid-Primer N036a,c,e,g,i tragen neben den zum Plasminogen-Gen komplementären Basen die Kodons für die Kex2- Schnittstelle, die Primer N036b,d,f,h,j tragen zusätzlich im Anschluss an die Kodons für die Kex2-Schnittstelle die Kodons für zwei Ste 13 -Schnittstellen. Der Primer N034 trägt des Weiteren eine i&pI-Schnittstelle, die Primer N036 a-j tragen eine J^ol-Schnittstelle.
Die Klonierung der Mini- und Microplasminogen-Gene in den Vektor pGAPZαA wurde analog zu der in Beispiel lb beschriebenen Klonierung durchgeführt, wobei sowohl der Vektor als auch das jeweilige PCR-Produkt mit den Restriktionsendonukleasen Xhol und Kspl geschnitten wurden. Zusammenfassend sind die verwendeten Primer, die Namen der Plasminogen-Derivate, die kodierten Protease-Schnittstellen, die Bezeichnung der erhaltenen Plasmide und die N-Terminale Aminosäure des sezemierten Plasminogen-Derivats folgender Tabelle zu entnehmen.
5 '-Primer 3 '-Primer Name Protease- Plasmidname N-Terminale Schnittstelle Aminosäure*
N036a N034 Miniplasminogen Kex2 pPLG11.2 A463
N036b N034 Miniplasminogen Kex2, 2xStel3 pPLG12.1 A463
N036c N034 Microplasminogen Kex2 pPLGB.l K550
N036d N034 Microplasminogen Kex2, 2xStel3 pPLG14.2 K550
N036e N034 Microplasminogen Kex2 pPLG15.1 L551
N036f N034 Microplasminogen Kex2, 2xStel3 pPLG16.3 L551
N036g N034 Microplasminogen Kex2 pPLG17.2 A562
N036h N034 Microplasminogen Kex2, 2xStel3 pPLGIS.l A562
N036i N034 Microplasminogen Kex2 pPLG19.2 S564
N036J N034 Microplasminogen Kex2, 2xStel3 pPLG20.1 S564
* Die Nummerierung bezieht sich auf das 810 Aminosäuren lange Präplasminogen (Seq. ID
No. 12)
Beispielhaft ist in Fig. 9 das Plasmid pPLGl 1.2 dargestellt.
Wie in Beispiel 7a für pJW9.1 beschrieben, wurde Pichia pastoris KM71H mit dem durch die
Restriktionsendonuklease Blnl linearisierten Plasmid pPLG11.2 transformiert. Die resultierenden Kolonien wurden als Pichia pastoris KM71H/pPLG11.2-l/a bezeichnet, wobei
„a" wiederum für die fortlaufende Nummerierung der Kolonien beginnend bei 1 steht.
Zur Generierung von Stämmen auf Basis der Plasmide pPLG12.1, pPLG13.1, pPLG14.2, pPLG15.1, pPLG16.3, pPLG17.2, pPLG18.1, pPLG19.2 und pPLG20.1 wurde entsprechend der Herstellung des Stamms KM71H/pPLGl.l-l/a vorgegangen.
Sequenzprotokoll
Sequenz 1: Oligonukleotid-Primer N034
AAAAACCGCGGTCAATTATTTCTCATCACTCCC
Sequenz 2: Oligonukleotid-Primer N036
AAAAACTCGAGAAAAGAAAAGTGTATCTCTCAGAGTG
Sequenz 3: Oligonukleotid-Primer N057
AAAAACTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTAAAGTGTATCTCTCAGAGTG
Sequenz 4: Oligonukleotid-Primer N037
AAAAATTCGAAAAATGGAACATAAGGAAGTGG
Sequenz 5: Oligonukleotid-Primer N035
AAAAACTCGAGAAAAGAGAGCCTCTGGATGACTAT
Sequenz 6: Oligonukleotid-Primer N056
AAAAACTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTGAGCCTCTGGATGACTAT
Sequenz 7: humanes Lys-Plasminogen-Fusionsgen mit den Kodons für die Kex2-
Schnittstelle und dem Gen der Signal-Sequenz des alpha-Faktors der Hefe Saccharomyces cerevisiae
ATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCTGTTTTATTCGCAGCATCGTCCGCATTAGCTGCT CCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGT TACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAAT AACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTA TCTCTCGAGAAAAGAAAAGTGTATCTCTCAGAGTGCAAGACTGGGAATGGAAAGAACTAC AGAGGGACGATGTCCAAAACAAAAAATGGCATCACCTGTCAAAAATGGAGTTCCACTTCT CCCCACAGACCTAGATTCTCACCTGCTACACACCCCTCAGAGGGACTGGAGGAGAACTAC TGCAGGAATCCAGACAACGATCCGCAGGGGCCCTGGTGCTATACTACTGATCCAGAAAAG AGATATGACTACTGCGACATTCTTGAGTGTGAAGAGGAATGTATGCATTGCAGTGGAGAA AACTATGACGGCAAAATTTCCAAGACCATGTCTGGACTGGAATGCCAGGCCTGGGACTCT CAGAGCCCACACGCTCATGGATACATTCCTTCCAAATTTCCAAACAAGAACCTGAAGAAG AATTACTGTCGTAACCCCGATAGGGAGCTGCGGCCTTGGTGTTTCACCACCGACCCCAAC AAGCGCTGGGAACTTTGCGACATCCCCCGCTGCACAACACCTCCACCATCTTCTGGTCCC ACCTACCAGTGTCTGAAGGGAACAGGTGAAAACTATCGCGGGAATGTGGCTGTTACCGTT TCCGGGCÄCACCTGTCAGCACTGGAGTGCACAGACCCCTCACACACATAACAGGACACCA GAAAACTTCCCCTGCAAAAATTTGGATGAAAACTACTGCCGCAATCCTGACGGAAAAAGG GCCCCATGGTGCCATACAACCAACAGCCAAGTGCGGTGGGAGTACTGTAAGATACCGTCC TGTGACTCCTCCCCAGTATCCACGGAACAATTGGCTCCCACAGCACCACCTGAGCTAACC CCTGTGGTCCAGGACTGCTACCATGGTGATGGACAGAGCTACCGAGGCACATCCTCCACC ACCACCACAGGAAAGAAGTGTCAGTCTTGGTCATCTATGACACCACACCGGCACCAGAAG ACCCCAGAAAACTACCCAAATGCTGGCCTGACAATGAACTACTGCAGGAATCCAGATGCC GATAAAGGCCCCTGGTGTTTTACCACAGACCCCAGCGTCAGGTGGGAGTACTGCAACCTG AAAAAATGCTCAGGAACAGAAGCGAGTGTTGTAGCACCTCCGCCTGTTGTCCTGCTTCCA GATGTAGAGACTCCTTCCGAAGAAGACTGTATGTTTGGGAATGGGAAAGGATACCGAGGC AAGAGGGCGACCACTGTTACTGGGACGCCATGCCAGGACTGGGCTGCCCAGGAGCCCCAT AGACACAGCATTTTCACTCCAGAGACAAATCCACGGGCGGGTCTGGAAAAAAATTACTGC CGTAACCCTGATGGTGATGTAGGTGGTCCCTGGTGCTACACGACAAATCCAAGAAAACTT TACGACTACTGTGATGTCCCTCAGTGTGCGGCCCCTTCATTTGATTGTGGGAAGCCTCAA GTGGAGCCGAAGAAATGTCCTGGAAGGGTTGTGGGGGGGTGTGTGGCCCACCCACATTCC TGGCCCTGGCAAGTCAGTCTTAGAACAAGGTTTGGAATGCACTTCTGTGGAGGCACCTTG ATATCCCCAGAGTGGGTGTTGACTGCTGCCCACTGCTTGGAGAAGTCCCCAAGGCCTTCA TCCTACAAGGTCATCCTGGGTGCACACCAAGAAGTGAATCTCGAACCGCATGTTCAGGAA ATAGAAGTGTCTAGGCTGTTCTTGGAGCCCACACGAAAAGATATTGCCTTGCTAAAGCTA AGCAGTCCTGCCGTCΆTCACTGACAAAGTAΆTCCCAGCTTGTCTGCCATCCCCAAΆTTAT GTGGTCGCTGACCGGACCGAATGTTTCATCACTGGCTGGGGAGAAACCCAAGGTACTTTT GGAGCTGGCCTTCTCAAGGAAGCCCAGCTCCCTGTGATTGAGAATAAAGTGTGCAATCGC TATGAGTTTCTGAATGGAAGAGTCCAATCCACCGAACTCTGTGCTGGGCATTTGGCCGGA GGCACTGACAGTTGCCAGGGTGACAGTGGAGGTCCTCTGGTTTGCTTCGAGAAGGACAAA TACATTTTACAAGGAGTCACTTCTTGGGGTCTTGGCTGTGCACGCCCCAATAAGCCTGGT GTCTATGTTCGTGTTTCAAGGTTTGTTACTTGGATTGAGGGAGTGATGAGAAATAATTGA
Sequenz 8: humanes Lys-Plasminogen mit Kex2-Schnittstelle und dem Signal-Peptid des alpha-Faktors der Hefe Saccharomyces cerevisiae
MRFPSIFTAVLFAASSAAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDV AVLPFSNSTKNGLLFINTTIASIAAKEEGVS EKR VYLSECKTGNGK Y RGT SKTK GITCQKWSSTSPHRPRFSPATHPSEG EE YCRNPDNDPQG PWCYTTDPEKRYDYCDILECEEECMHCSGENYDGKISKTMSGLECQA DS QSPffi GYIPSKFPNKNLKKNYCRNPDRELRP CFTTDPNKR ELCDIPR CTTPPPSSGPTYQCLKGTGEKTYRGNVÄVTVSGHTCQH SAQTPHTHNRTP ENFPCKN DE YCRNPDGKRAP CHTTNSQVRWEYCKI SCDSSPVSTEQ LAPTAPPELTPWQDCYHGDGQSYRGTSSTTTTGKKCQS SSM PHRHQK TPENYPNAG T YCRNPDADKGP CFTTDPSVR EYCN KCSGTEASV VAPPPWL PDVETPSEEDCMFGNGKGYRG RATTV GTPCQD AAQEPH RHSIFTPETNPRAGLEK YCRNPDGDVGGP CYTTNPRKLYDYCDVPQCA APSFDCGKPQVEPKKCPGRWGGCVAHPHSWP QVSLRTRFGMHFCGGTL ISPEWVLTAAHCLEKSPRPSSYKVILGAHQEVNLEPHVQEIEVSR FLEP TRKDIAL KLSSPAVITDKVIPACLPSPNYWADRTECFITGWGETQGTF GAGLLKEAQLPVIEN VCNRYEFLNGRVQSTELCAGHLAGGTDSCQGDSG GP VCFE DKYI QGVTS GLGCARPNKPGVYVRVSR VT IEGVMKN*
Sequenz 9: humanes Lys-Plasminogen-Fusionsgen mit den Kodons für die Kex2- Schnittstelle und zwei Stel3-Schnittstellen und dem Gen für die Signal- Sequenz des alpha-Faktors der Hefe Saccharomyces cerevisiae ATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCTGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCT CCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAΆACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGT TACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAΆCAGCACAAAT AACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCΆGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTA CTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTAAAGTGTATCTCTCAGAGTGCAAGACTGGGAAT GGAΆAGAACTACAGAGGGACGATGTCCAAAACAAAAAATGGCATCACCTGTCAAAAATGG AGTTCCACTTCTCCCCACAGACCTAGATTCTCACCTGCTACACACCCCTCAGAGGGACTG GAGGAGAACTACTGCAGGAATCCAGACAACGATCCGCAGGGGCCCTGGTGCTATACTACΤ GATCCAGAAAAGAGATATGACTACTGCGACATTCTTGAGTGTGAAGAGGAATGTATGCAT TGCAGTGGAGAAAACTATGACGGCAAAATTTCCAAGACCATGTCTGGACTGGAATGCCAG GCCTGGGACTCTCAGAGCCCACACGCTCATGGATACATTCCTTCCAAATTTCCAAACAAG AACCTGAAGAAGAATTACTGTCGTAACCCCGATAGGGAGCTGCGGCCTTGGTGTTTCACC ACCGACCCCAACAAGCGCTGGGAACTTTGCGACATCCCCCGCTGCACAACACCTCCACCA TCTTCTGGTCCCACCTACCAGTGTCTGAAGGGAACAGGTGAAAACTATCGCGGGAATGTG GCTGTTACCGTTTCCGGGCACACCTGTCAGCACTGGAGTGCACAGACCCCTCACACACAT AACAGGACACCAGAAAACTTCCCCTGCAAAAATTTGGATGAAAACTACTGCCGCAATCCT GACGGAAAAAGGGCCCCATGGTGCCATACAACCAACAGCCAAGTGCGGTGGGAGTACTGT AAGATACCGTCCTGTGACTCCTCCCCAGTATCCACGGAACAATTGGCTCCCACAGCACCA CCTGAGCTAACCCCTGTGGTCCAGGACTGCTACCATGGTGATGGACAGAGCTACCGAGGC ACATCCTCCACCACCACCACAGGAAAGAAGTGTCAGTCTTGGTCATCTATGACACCACAC CGGCACCAGAAGACCCCAGAAAACTACCCÄAATGCTGGCCTGACAATGAACTACTGCAGG AATCCAGATGCCGATAAAGGCCCCTGGTGTTTTACCACAGACCCCAGCGTCAGGTGGGAG TACTGCAACCTGAAAAAATGCTCAGGAACAGAAGCGAGTGTTGTAGCACCTCCGCCTGTT GTCCTGCTTCCAGATGTAGAGACTCCTTCCGAAGAAGACTGTATGTTTGGGATGGGAAA GGATACCGAGGCAAGAGGGCGACCACTGTTACTGGGACGCCATGCCAGGACTGGGCTGCC CAGGAGCCCCATAGACACAGCATTTTCACTCCAGAGACAAATCCACGGGCGGGTCTGGAA AAAAATTACTGCCGTAACCCTGATGGTGATGTAGGTGGTCCCTGGTGCTACACGACAAAT CCAAGAAAACTTTACGACTACTGTGATGTCCCTCAGTGTGCGGCCCCTTCATTTGATTGT GGGAAGCCTCAAGTGGAGCCGAAGAAATGTCCTGGAAGGGTTGTGGGGGGGTGTGTGGCC CACCCACATTCCTGGCCCTGGCAAGTCAGTCTTAGAACAAGGTTTGGAATGCACTTCTGT GGAGGCACCTTGATATCCCCAGAGTGGGTGTTGACTGCTGCCCACTGCTTGGAGAAGTCC CCAAGGCCTTCATCCTACAAGGTCATCCTGGGTGCACACCAAGAAGTGAATCTCGAACCG CATGTTCAGGAAATAGAAGTGTCTAGGCTGTTCTTGGAGCCCACACGAAAAGATATTGCC TTGCTAAAGCTAAGCAGTCCTGCCGTCATCACTGACAAAGTAATCCCAGCTTGTCTGCCA TCCCCAAATTATGTGGTCGCTGΆCCGGACCGAATGTTTCATCACTGGCTGGGGAGAAACC CAAGGTACTTTTGGAGCTGGCCTTCTCAAGGAAGCCCAGCTCCCTGTGATTGAGAATAAA GTGTGCAΆTCGCTATGAGTTTCTGAATGGAAGAGTCCAATCCACCGAACTCTGTGCTGGG CΆTTTGGCCGGAGGCACTGACAGTTGCCAGGGTGACAGTGGAGGTCCTCTGGTTTGCTTC GAGAAGGACAAATACATTTTACAAGGAGTCACTTCTTGGGGTCTTGGCTGTGCACGCCCC AATAAGCCTGGTGTCTATGTTCGTGTTTCAAGGTTTGTTACTTGGATTGAGGGAGTGATG AGAAATAATTGA
Sequenz 10: humanes Lys-Plasminogen mit Stel3 und Kex2-Schnittstellen und dem Signal-Peptid des alpha-Faktors der Hefe Saccharomyces cerevisiae RFPSIFTAVLFAASSALAAPVN TTEDETAQIPAEAVIGYSD EGDFDV AV PFSNSTNNGL FI TTIASIAAKEEGVSLEKREAEAKVY SECKTGN GK1 -TRGTMSKTKNGITCQKWSSTSPHRPRFSPATHPSEG EENYCRNPDN DPQGPWCYTTDPEKRYDYCDILECEEEC HCSGENYDGKISKTMSG ECQ ATiTOSQSPHAHGYIPSKFPNKl r KKNYCRNPDRELRP CFTTDPN R ELC DIPRCTTPPPSSGPTYQCLKGTGENYRGNVAVTVSGHTCQH SAQTPHTH KKTPENFPC N DE YCRNPDG RAP CHTTNSQVR EYC IPSCDSSPV STEQLAPTAPPELTPWQDCYHGDGQSYRGTSSTTTTG CQSWSSMTPH RHQKTPEJSTYPNAG TMNYCRNPDADKGP CFTTDPSVRWEYCN KKCSGT EAS APPPWLLPDVETPSEEDCMFGNGKGYRGK_RATTWGTPCQDWAA QEPHRHS I FTPETNPRAGLEKNYCRNPDGDVGGP CYTTNPRK YDYCDV PQCAAPSFDCGKPQVEPKKCPGRWGGCVAHPHS P QVSLRTRFGMHFC GGTLISPΞWV TAAHCLEKSPRPSSYKVI GAHQEVNLEPHVQEIEVSRL FLΞPTRKDIA LKLSSPAVITDKVIPAC PSPNYWADRTECFITG GET QGTFGAGL KEAQLPVIENKVCNRYEF NGRVQSTE CAGHLΆGGTDSCQ GDSGGP VCFEKD YILQGVTSWG GCARPNKPGVYVRVSRFVTWIEGV
RNN*
Sequenz 11: humanes Prä-Plasminogen-Gen
ATGGAACATAAGGAAGTGGTTCTTCTACTTCTTTTATTTCTGAAATCAGGTCAAGGAGAG CCTCTGGATGACTATGTGAATACCCAGGGGGCTTCACTGTTCAGTGTCACTAAGAAGCAG CTGGGAGCAGGAAGTATAGAΆGAATGTGCAGCAAAATGTGAGGAGGACGAAGAATTCACC TGCAGGGCATTCCAATATCACAGTAAAGAGCAACAATGTGTGATAATGGCTGAAAACAGG AAGTCCTCCATAATCATTAGGATGAGAGATGTAGTTTTATTTGΆAAAGAAAGTGTATCTC TCAGAGTGCΆAGACTGGGAATGGAAAGAACTACAGAGGGACGATGTCCAAAACAAAAAAT GGCATCACCTGTCAAAAATGGAGTTCCACTTCTCCCCACAGΆCCTAGATTCTCACCTGCT ACACACCCCTCAGAGGGACTGGAGGAGAACTACTGCAGGAATCCAGACAACGATCCGCAG GGGCCCTGGTGCTATACTACTGATCCAGAAAAGAGATATGACTACTGCGACATTCTTGAG TGTGAAGAGGAATGTATGCATTGCAGTGGAGAAAACTATGACGGCAAAATTTCCAAGACC ATGTCTGGACTGGAΆTGCCAGGCCTGGGACTCTCAGAGCCCACACGCTCATGGATACATT CCTTCCAAATTTCCAAACAAGAACCTGAAGAAGAATTACTGTCGTAACCCCGATAGGGAG CTGCGGCCTTGGTGTTTCACCACCGACCCCAACAAGCGCTGGGAACTTTGCGACATCCCC CGCTGCACAACACCTCCACCATCTTCTGGTCCCACCTACCAGTGTCTGAAGGGAACAGGT GAAAACTATCGCGGGAATGTGGCTGTTACCGTTTCCGGGCACACCTGTCAGCACTGGAGT GCACAGACGCCTCACACACATAACAGGACACCAGAAAACTTCCCCTGCAAAAATTTGGAT GAAΆACTACTGCCGCAATCCTGΆCGGAΆAAAGGGCCCCATGGTGCCATACAACCAACAGC CAAGTGCGGTGGGAGTACTGTAΆGATACCGTCCTGTGACTCCTCCCCAGTATCCACGGAA CAATTGGCTCCCACAGCACCACCTGAGCTAACCCCTGTGGTCCAGGACTGCTACCATGGT GATGGACAGAGCTACCGAGGCACATCCTCCACCACCACCACAGGAAAGAAGTGTCAGTCT TGGTCATCTATGACACCACACCGGCACCAGAAGACCCCAGAAAACTACCCAAATGCTGGC CTGACAATGAACTACTGCAGGAATCCAGATGCCGATAAAGGCCCCTGGTGTTTTACCACA GACCCCAGCGTCAGGTGGGAGTACTGCAACCTGAAAAAATGCTCAGGAACAGAAGCGAGT GTTGTAGCACCTCCGCCTGTTGTCCTGCTTCCAGATGTAGAGACTCCTTCCGAAGAAGAC TGTATGTTTGGGAATGGGAAAGGATACCGAGGCAAGAGGGCGACCACTGTTACTGGGACG CCATGCCAGGACTGGGCTGCCCAGGAGCCCCATAGACACAGCATTTTCACTCCAGAGACA AATCCACGGGCGGGTCTGGAAAAAAATTACTGCCGTAACCCTGATGGTGATGTAGGTGGT CCCTGGTGCTACACGACAAATCCAAGAAAACTTTACGACTACTGTGATGTCCCTCAGTGT GCGGCCCCTTCATTTGATTGTGGGAAGCCTCAAGTGGAGCCGAAGAAATGTCCTGGAAGG GTTGTGGGGGGGTGTGTGGCCCACCCACATTCCTGGCCCTGGCAAGTCAGTCTTAGAACA AGGTTTGGAATGCACTTCTGTGGAGGCACCTTGATATCCCCAGAGTGGGTGTTGACTGCT GCCCACTGCTTGGAGAAGTCCCCAΆGGCCTTCATCCTACAΆGGTCATCCTGGGTGCACAC CAAGAAGTGAATCTCGAACCGCATGTTCAGGAΆATAGAAGTGTCTAGGCTGTTCTTGGAG CCCACACGAAAAGATATTGCCTTGCTAAAGCTAAGCAGTCCTGCCGTCATCACTGACAAA GTAATCCCAGCTTGTCTGCCATCCCCAAATTATGTGGTCGCTGACCGGACCGAATGTTTC ATCACTGGCTGGGGAGAAACCCAAGGTACTTTTGGAGCTGGCCTTCTCAAGGAAGCCCAG CTCCCTGTGATTGAGAATAAAGTGTGCAATCGCTATGAGTTTCTGAATGGAAGAGTCCAA TCCACCGAACTCTGTGCTGGGCATTTGGCCGGAGGCACTGACAGTTGCCAGGGTGACAGT GGAGGTCCTCTGGTTTGCTTCGAGAAGGACAAATACATTTTACAAGGAGTCACTTCTTGG GGTCTTGGCTGTGCACGCCCCAATAAGCCTGGTGTCTATGTTCGTGTTTCAAGGTTTGTT ACTTGGATTGAGGGAGTGATGAGAAATAATTGA
Sequenz 12: humanes Prä-Plasminogen
EHKEVV L FLKSGQGEP DDYVNTQGASLFSVTKKQ GAGSIEECA AKCΞEDEEFTCRAFQYHSKEQQCVIMAENRKSS11IRMRDW FEKKVYL SΞC TGNGKNYRGTMSKTKNGITCQ SSTSPHRPRFSPATHPSEGLEEN YCRPDKIDPQGPWCYTTDPEKRYDYCDI ECEEECMHCSGENYDGKISKT SGLECQADSQSPHAHGYIPSKFPNKNLKKNYCRNPDRELRPWCFTTDP NKRE CDIPRCTTPPPSSGPTYQC KGTGENYRGNVAVTVSGHTCQH S AQTPHTHNRTPENFPC DEKTYCRNPDGKRAP CHTTNSQVR EYCKIP SCDSSPVSTEQLAPTAPPE TPWQDCYHGDGQSYRGTSSTTTTGKKCQS WSSM PHRHQKTPE YPNAGLT NYCRPDAD GP CFTTDPSVREYCN KCSGTEASWAPPPW LPDVETPSEEDC FGNGKGYRGKRATTV GT PCQDAAQEPHRHSIFTPETNPRAGLEKNYCRNPDGDVGGP CYTTNPRK LYDYCDVPQCAAPSFDCGKPQVEP KCPGRWGGCVAHPHSWP QVSLRT RFG HFCGGTLISPE VTAAHCLEKSPRPSSYKVI GAHQEV LEPHVQ EIEVSRLF EPTRDIA KLSSPAVITDKVIPACLPSPWYWADRTECF ITG GETQGTFGAGLL EAQ PVIENKVCRYEFLNGRVQSTELCAGHLA GGTDSCQGDSGGPLVCFE D YILQGV S GGCARPNKPGVYVRVSRFV TWIEGVMRNN*
Sequenz 13: humanes Glu-Plasminogen-Fusionsgen mit den Kodons für die Kex2-
Schnittstelle und dem Gen für die Signal-Sequenz des alpha-Faktors der Hefe Saccharomyces cerevisiae
ATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCTGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCT
CCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGT TACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAAT AACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTA TCTCTCGAGAAΆΆGAGAGCCTCTGGΆTGACTATGTGAATACCCAGGGGGCTTCACTGTTC AGTGTCACTAAGAAGCAGCTGGGAGCAGGAΆGTATAGAAGAATGTGCAGCAAAATGTGAG GAGGACGAAGAATTCACCTGCAGGGCATΤCCAΑTATCACAGTAAAGAGCAACAATGTGTG ATAATGGCTGAAΆACAGGAAGTCCTCCATAATCATTAGGATGAGAGATGTAGTTTTATTT GAAAAGAAAGTGTATCTCTCAGAGTGCAAGACTGGGAATGGAAAGAACTACAGAGGGACG ATGTCCAAAACAAAAAΆTGGCATCACCTGTCAAAAΆTGGAGTTCCACTTCTCCCCACAGA CCTAGATTCTCACCTGCTACACACCCCTCAGAGGGACTGGAGGAGAACTACTGCAGGAAT CCAGACAACGATCCGCAGGGGCCCTGGTGCTATACTACTGATCCAGAAAAGAGATATGAC TACTGCGACATTCTTGAGTGTGAAGAGGAATGTATGCATTGCAGTGGAGAAAACTATGAC GGCAAAATTTCCAAGACCATGTCTGGACTGGAATGCCAGGCCTGGGACTCTCAGAGCCCA CACGCTCATGGATACATTCCTTCCAAATTTCCAAACAAGAΆCCTGAAGAAGAATTACTGT CGTAACCCCGATAGGGAGCTGCGGCCTTGGTGTTTCACCACCGACCCCAACAAGCGCTGG GAACTTTGCGACATCCCCCGCTGCACAACACCTCCACCATCTTCTGGTCCCACCTACCAG TGTCTGAAGGGAACAGGTGAAAACTATCGCGGGAATGTGGCTGTTACCGTTTCCGGGCAC ACCTGTCAGCACTGGAGTGCACAGACCCCTCACACACATAACAGGACACCAGAAAACTTC CCCTGCAAAAATTTGGATGAAAACTACTGCCGCAATCCTGACGGAAAAAGGGCCCCATGG TGCCATACAACCAACAGCCAAGTGCGGTGGGAGTACTGTAAGATACCGTCCTGTGACTCC TCCCCAGTATCCACGGAACAATTGGCTCCCACAGCACCACCTGAGCTAACCCCTGTGGTC CAGGACTGCTACCATGGTGATGGACAGAGCTACCGAGGCACATCCTCCACCACCACCACA GGAAAGAAGTGTCAGTCTTGGTCATCTATGACACCACACCGGCACCAGAAGACCCCAGAA AACTACCCAAATGCTGGCCTGACAATGAACTACTGCAGGAATCCAGATGCCGATAAAGGC CCCTGGTGTTTTACCACAGACCCCAGCGTCAGGTGGGAGTACTGCAACCTGAAAAAATGC TCAGGAACAGAAGCGAGTGTTGTAGCACCTCCGCCTGTTGTCCTGCTTCCAGATGTAGAG ACTCCTTCCGAAGAAGACTGTATGTTTGGGAATGGGAAAGGATACCGAGGCAAGAGGGCG ACCACTGTTACTGGGACGCCATGCCAGGACTGGGCTGCCCAGGAGCCCCATAGACACAGC ATTTTCACTCCAGAGACAAATCCACGGGCGGGTCTGGAAAAAAATTACTGCCGTAACCCT GATGGTGATGTAGGTGGTCCCTGGTGCTACACGACAAATCCAAGAAAACTTTACGACTAC TGTGATGTCCCTCAGTGTGCGGCCCCTTCATTTGATTGTGGGAAGCCTCAAGTGGAGCCG AAGAAATGTCCTGGAAGGGTTGTGGGGGGGTGTGTGGCCCACCCACATTCCTGGCCCTGG CAAGTCAGTCTTAGAACAAGGTTTGGAATGCACTTCTGTGGAGGCACCTTGATATCCCCA GAGTGGGTGTTGACTGCTGCCCACTGCTTGGAGAAGTCCCCAAGGCCTTCATCCTACAAG GTCATCCTGGGTGCACACCAAGAAGTGAATCTCGAACCGCATGTTCAGGAAATAGAAGTG TCTAGGCΓGTTCTTGGAGCCCACACGAAAAGATATTGCCTTGCTAAAGCTAAGCAGTCCT GCCGTCATCACTGACAAAGTAATCCCAGCTTGTCTGCCATCCCCAAATTATGTGGTCGCT GACCGGACCGAATGTTTCATCACTGGCTGGGGAGAAACCCAAGGTACTTTTGGAGCTGGC CTTCTCAAGGAAGCCCAGCTCCCTGTGATTGAGAATAAAGTGTGCAATCGCTATGAGTTT CTGAATGGAAGAGTCCAATCCACCGAACTCTGTGCTGGGCATTTGGCCGGAGGCACTGAC AGTTGCCAGGGTGACAGTGGAGGTCCTCTGGTTTGCTTCGAGAAGGACAAATACATTTTA CAAGGAGTCACTTCTTGGGGTCTTGGCTGTGCACGCCCCAATAAGCCTGGTGTCTATGTT CGTGTTTCAAGGTTTGTTACTTGGATTGAGGGAGTGATGAGAAATAATTGA
Sequenz 14: humanes Glu-Plasminogen mit Kex2-Schnittstelle und dem Signal-Peptid des alpha-Faktors derHefe Saccharomyces cerevisiae
MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSD EGDFDV AVIIPFSNSTLWGLFINTTIASIAAKEEGVSLEKREPLDDYVNTQGAS F SVKKQ GAGSIΞECAACEEDEEFTCRAFQYHSKEQQCVIMAENRKSSI IIRMRDVV FEKKVYLSEC TGNGKNYRGTMSKTKNGITCQ SSTSPHR PRFSPATHPSEG EE YCRNPDNDPQGPWCYTTDPE RYDYCDILECEEE CFFLCSGENYDGKISKMSGECQAWDSQSPHAHGYIPS FPNNIJKKYC RNPDRE RPWCFTTDPNKRWE CDIPRCTTPPPSSGPTYQCLKGTGENYR GNVAVVSGHTCQH SAQTPHTHNRTPENFPCKLTTDENYCRNPDGKRAP CHTTNSQVR EYCKIPSCDSSPVSTEQLAPTAPPE TPWQDCYHGDGQS YRGTSSTTTTGKKCQSWSSMTPHRHQKTPENYPNAGLTMNYCRNPDADKG P CFTTDPSVR EYCNLKKCSGTEASWAPPPWL PDVETPSEEDCMFG NG GYRGRATTVTGTPCQDAAQEPHRHSIFTPETNPRAG EKNYCRNP DGDVGGPWCYTTNPRKLYDYCDVPQCAAPSFDCGKPQVEPKKCPGRWGG CVAHPHS P QVS RTRFGHFCGGTLISPEWVLTAAHC EKSPRPSSYK VI GAHQEVN EPHVQEIEVSRLF EPTRDIALLK SSPAVITDKVIPA CLPSPISΓYVVADRTECFITGGETQGTFGAGLL EAQLPVIENVCNRYEF LNGRVQSTELCAGHLAGGTDSCQGDSGGPLVCFEKDKYILQGV S GLGC ARPNKPGVYVRVSRFVWIEGV RNN* Sequenz 15: humanes Glu-Plasminogen-Fusionsgen mit den Kodons für die Kex2- Schnittstelle und zwei Stel3-Schnittstellen und dem Gen für die Signal- Sequenz des alpha-Faktors der Hefe Saccharomyces cerevisiae
ATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCTGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCT CCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGT TACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAAT AACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTA TCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTGAGCCTCTGGATGACTATGTGAATACCCAGGGG
GCTTCACTGTTCAGTGTCACTAAGAAGCAGCTGGGAGCAGGAAGTATAGAAGAATGTGCA GCAAAATGTGAGGAGGACGAAGAATTCACCTGCΆGGGCATTCCAATATCACAGTAAAGΆG CAACAATGTGTGATAΆTGGCTGAAΆACAGGAΆGTCCTCCATAΆTCATTAGGATGAGAGAT GTAGTTTTATTTGAAAAGAAAGTGTATCTCTCAGAGTGCAAGACTGGGAATGGAAAGAAC TACAGAGGGACGATGTCCAAAACAAAAAATGGCATCACCTGTCAAAAATGGAGTTCCACT TCTCCCCACAGACCTAGATTCTCACCTGCTACACACCCCTCAGAGGGACTGGAGGAGAAC TACTGCAGGAATCCAGACAACGATCCGCAGGGGCCCTGGTGCTATACTACTGATCCAGAA AAGAGATATGACTACTGCGACATTCTTGAGTGTGAAGAGGAATGTATGCATTGCAGTGGA GAAAACTATGACGGCAAAATTTCCAAGACCATGTCTGGACTGGAATGCCAGGCCTGGGAC TCTCAGAGCCCACACGCTCATGGATACATTCCTTCCAAATTTCCAAACAAGAACCTGAAG AAGAATTACTGTCGTAACCCCGATAGGGAGCTGCGGCCTTGGTGTTTCACCACCGACCCC AACAAGCGCTGGGAACTTTGCGACATCCCCCGCTGCACAACACCTCCACCATCTTCTGGT CCCACCTACCAGTGTCTGAAGGGAACAGGTGAAAACTATCGCGGGAATGTGGCTGTTACC GTTTCCGGGCACACCTGTCAGCACTGGAGTGCACAGACCCCTCACACACATAACAGGACA CCAGAAAACTTCCCCTGCAAAAATTTGGATGAAAACTACTGCCGCAATCCTGACGGAAAA AGGGCCCCATGGTGCCATACAACCAACAGCCAAGTGCGGTGGGAGTACTGTAAGATACCG TCCTGTGACTCCTCCCCAGTATCCACGGAACAATTGGCTCCCACAGCACCACCTGAGCTA ACCCCTGTGGTCCAGGACTGCTACCATGGTGATGGACAGAGCTACCGAGGCACATCCTCC ACCACCACCACAGGAAAGAAGTGTCAGTCTTGGTCATCTATGACACCACACCGGCACCAG AAGACCCCAGAAAACTACCCAAATGCTGGCCTGACAATGAACTACTGCAGGAATCCAGAT GCCGATAAAGGCCCCTGGTGTTTTACCACAGACCCCAGCGTCΆGGTGGGAGTACTGCAAC CTGAAAAAATGCTCAGGAACAGAAGCGAGTGTTGTAGCACCTCCGCCTGTTGTCCTGCTT CCAGATGTAGAGACTCCTTCCGAAGAAGACTGTATGTTTGGGAATGGGAAAGGATACCGA GGCAAGAGGGCGACCACTGTTACTGGGACGCCATGCCAGGACTGGGCTGCCCAGGAGCCC CATAGACACAGCATTTTCACTCCAGAGACAAATCCACGGGCGGGTCTGGAΆAAAAATTAC TGCCGTAACCCTGATGGTGATGTAGGTGGTCCCTGGTGCTACACGACAAATCCAAGAAAΆ CTTTACGACTACTGTGATGTCCCTCAGTGTGCGGCCCCTTCATTTGATTGTGGGAAGCCT CAAGTGGAGCCGAAGAAATGTCCTGGAAGGGTTGTGGGGGGGTGTGTGGCCCACCCACAT TCCTGGCCCTGGCAAGTCAGTCTTAGAACAAGGTTTGGAATGCACTTCTGTGGAGGCACC TTGATATCCCCAGAGTGGGTGTTGACTGCTGCCCACTGCTTGGAGAAGTCCCCAAGGCCT TCATCCTACAAGGTCATCCTGGGTGCACACCAAGAAGTGAATCTCGAACCGCATGTTCAG GAAATAGAAGTGTCTAGGCTGTTCTTGGAGCCCACACGAAAAGATATTGCCTTGCTAAAG CTAAGCAGTCCTGCCGTCATCACTGACAAAGTAATCCCAGCTTGTCTGCCATCCCCAAAT TATGTGGTCGCTGACCGGACCGAATGTTTCATCACTGGCTGGGGAGAAACCCAAGGTACT TTTGGAGCTGGCCTTCTCAAGGAAGCCCAGCTCCCTGTGATTGAGAATAAAGTGTGCAAT CGCTΆTGAGTTTCTGAATGGAAGAGTCCAATCCACCGAACTCTGTGCTGGGCATTTGGCC GGAGGCACTGACAGTTGCCAGGGTGACAGTGGAGGTCCTCTGGTTTGCTTCGAGAAGGAC AAATACATTTTACAAGGAGTCACTTCTTGGGGTCTTGGCTGTGCACGCCCCAATAAGCCT GGTGTCTATGTTCGTGTTTCAAGGTTTGTTACTTGGATTGAGGGAGTGATGAGAAATAAT
TGA Sequenz 16: humanes Glu-Plasminogen mit Stel3 und Kex2-Schnittstellen und dem Signal-Peptid des alpha-Faktors der Hefe Saccharomyces cerevisiae RFPSIFTÄVLFAASSA AAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDV AVLPFSNSTNNG LFINTTIASIAAKEEGVSLEKREAEAEPLDDYVNTQG ASLFSV KKQ GAGSIEECAAKCEEDΞEFTCRAFQYHSKEQQCVIMAENR KSS11IR RDVVLFEKKVY SEC TGNGKNYRGTMSKT NGITCQKWSST SPHRPRFSPATHPSEGLEΞNYCRNPDNDPQGP CYTTDPEKRYDYCDILE CEEECMHCSGENYDGKISKTMSGLECQAWDSQSPHAHGYIPSKFPNKNLK KNYCRNPDRELRP CFTTDPN R ELCDIPRCTTPPPSSGPTYQCLKGTG ENYRGNVAVTVSGHTCQH SAQTPHTHNRTPENFPCK DE YCRNPDGK RAPWCHTTNSQVRWEYCKIPSCDSSPVSTEQ APTAPPELTPWQDCYHG DGQSYRGTSSTTTTGKKCQSWSSMTPHRHQKTPENYPNAGLTMNYCRNPD AD GPWCFTTDPSVR EYCN KKCSGTEASWAPPPW LPDVETPSEED CMFGNGKGYRG RATTVTGTPCQD AAQEPHRHSIFTPETNPRAGLEK Y CR PDGDVGGP CYTTNPRKLYDYCDVPQCAAPSFDCGKPQVEPKKCPGR WGGCVAHPHS P QVSLRTRFG HFCGGTLISPEWVLTAAHCLE SPRP SSYKVILGAHQEVN EPHVQEIEVSRLFLEPTRKDIALLKLSSPAVITDK VIPACLPSPNYWADRTECFITGWGETQGTFGAGLLKEAQ PVIENKVCN RYEFLNGRVQSTE CAGHLAGGTDSCQGDSGGPLVCFEKDKYILQGVTSW GLGCARPNKPGVYVRVSRFVTWIEGVMRNN*
Sequenz 17: Sequenz des ins Medium sezemierten Glu-Plasminogen (pSM49.8, pSM58.1 und pSM82.1)
EPLDDYVNTQGAS FSVTKKQLGAGSIEECAAKCEΞDEEFTCRAFQYHSK EQQCVI AE RKSS11IRMRDVV FEKKVY SECKTGNGKNYRGTMSKT NGITCQK SSTSPHRPRFSPATHPSEGLEENYCR PDNDPQGP CYTTDP EKRYDYCDILECEEECiyiHCSGENYDGKISKTMSG ECQAWDSQSPHAHGY IPSKFPNINLKK YCRNPDRELRP CFTTDPN RWE CDIPRCTTPPPSS GPTYQC KGTGElvrYRGNVAVTVSGHTCQHWSAQTPHTHNRTPENFPCKNL DE YCRNPDGKRAP CHTTNSQVR EYCKIPSCDSSPVSTΞQLAPTAPPE LTPWQDCYHGDGQSYRGTSSTTTTGKKCQSWSS TPHRHQKTPENYPNA GLT lSrYCRNPDAD GPWCFTTDPSVR EYCiN KKCSGTEASVVAPPPVVL LPDVETPSEEDC FGNGKGYRGKRATTVTGTPCQD AAQEPHRHSIFTPE TNPRAGLEKNYCR PDGDVGGP CYTTNPRK YDYCDVPQCAAPSFDCGK PQVEPK CPGRWGGCVAHPHSWP QVS RTRFGMHFCGGTLISPE V T AAHCLE SPRPSSYKVILGAHQEVNLEPHVQEIEVSRLFLEPTRKDIALL KLSSPAVITDKVIPACLPSPNYWADRTECFITG GETQGTFGAG LKEA QLPVIENKVCNRYEFLNGRVQSTELCAGHLAGGTDSCQGDSGGPLVCFEK DKYILQGVTS G GCARPNKPGVYVRVSRFVT IEGVMRHN*
Sequenz 18: Sequenz des ins Medium sezemierten Lys-Plasminogen (pMHS476.1, pSM54.2, pAC37.1 und pJW9.1)
KVY SECKTGNGK YRGT SKTK GITCQKWSSTSPHRPRFSPATHPSEG LEE YCRNPDNDPQGP CYTTDPE RYDYCDI ECEEECMHCSGENYDGK ISKTMSGLECQA DSQSPHAHGYIPSKFP KNLKKNYCR PDRE RPWCF TTDPNKRWE CDIPRCTTPPPSSGPTYQCLKGTGENYRGNVAVTVSGHTC QH SAQTPHTHNRTPENFPCKIJLDElSrϊCRNPDGKRAP CHTTNSQVR ΞY CKIPSCDSSPVSTEQLAPTAPPE TPWQDCYHGDGQSYRGTSSTTTTG KCQS SSMTPHRHQ TPENYPNAGTMNYCRNPDADKGP CFTTDPSVR EYCNK CSGTEASWAPPPWLLPDVETPSEEDCMFGNGKGYRGKRATT VTGTPCQDAAQEPHRHSIFTPETNPRAGLEKNYCRNPDGDVGGP CYTT NPR LYDYCDVPQCAAPSFDCGKPQVEPKKCPGRWGGCVAHPHS PWQV S RTRFGHFCGGT ISPE VLTAAHCLEKSPRPSSYKVILGAHQEVN E PHVQEIEVSRLFLEPTRKDIAL KLSSPAVITDKVIPACLPSPNYWADR TECFITGWGETQGTFGAG LKEAQLPVIEN VCNRYEFLNGRVQSTE CA GHLAGGTDSCQGDSGGPLVCFEKDKYILQGVTS G GCARPNKPGVYVRV SRFVTWIΞGVMRNN*
Sequenz 19: Oligonukleotid-Primer N036a
AAAAACTCGAGAAAAGAGCACCTCCGCCTGTTG
Sequenz 20: Oligonukleotid-Primer N036b
AAAAACTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTGCACCTCCGCCTGTTG
Sequenz 21: Oligonukleotid-Primer N036c
AAAAACTCGAGAAAAGAAAACTTTACGACTACTG
Sequenz 22: Oligonukleotid-Primer N036d
AAAAACTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTAAACTTTACGACTACTG
Sequenz 23: Oligonukleotid-Primer N036e
AAAAACTCGAGAAAAGACTTTACGACTACTGTG
Sequenz 24: Oligonukleotid-Primer N036f
AAΆΆACTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTCTTTACGACTΆCTGTG
Sequenz 25: Oligonukleotid-Primer N036g
AAAAACTCGAGAAAAGAGCCCCTTCATTTGATTGTG
Sequenz 26: Oligonukleotid-Primer N036h
AAAAACTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTGCCCCTTCATTTGATTGTG
Sequenz 27: Oligonukleotid-Primer N036i
AAAAACTCGAGAAAAGATCATTTGATTGTGGGAAGCC Sequenz 28: Oligonukleotid-Primer N036j
AAAAACTCGΆGAAAAGAGAGGCTGAΆGCTTCATTTGATTGTGGGAAGCC
Sequenz 29: Mini-Plasminogen (pPLGl.l und pPLG2.1)
APPPW PDVETPSΞEDCMFGNGKGYRG RATTVTGTPCQDWAAQEPHR HS I FTPETNPRAGLE YCRNPDGDVGGP CYTTNPRKLYDYCDVPQCAA PSFDCG PQVEPKKCPGRWGGCVAHPHS P QVSLRTRFG HFCGGTLI SPE VLTAAHCLEKSPRPSSYKVI GAHQEVNLEPHVQEIEVSR FLEPT RKDIAL K SSPAVITDKVIPAC PSPNYWADRTECFITGWGETQGTFG AGL EAQ PVIENKVC RYEF NGRVQSTELCAGHLAGGTDSCQGDSGG PLVCFEKDKYILQGVTS GLGCARPN PGVYVRVSRFVT IEGVMRNN*
Sequenz 30: Micro-Plasminogen (ρPLG3.2 und pPLG4.2)
KLYDYCDVPQCAAPSFDCGKPQVEP KCPGRWGGCVAHPHS P QVS R TRFG HFCGGTLISPEWVTAAHC EKSPRPSSY VILGAHQEVNLEPHV QEIEVSRLFLΞPTRDIALKLSSPAVITDKVIPACLPSPNYVVADRTEC FITGWGETQGTFGAG KEAQLPVIENKVCNRYEFNGRVQSTELCAGHL AGGTDSCQGDSGGPLVCFEKDKYI QGVTS GLGCARPNKPGVYVRVSRF VTWIEGVMRNN*
Sequenz 31: Micro-Plasminogen (pPLG5.3 und pPLGό.l)
LYDYCDVPQCAAPSFDCGKPQVEPK CPGRWGGCVAHPHS P QVSLRT RFGMHFCGGTLISPEWVLTAAHCLEKSPRPSSYKVILGAHQEVNEPHVQ EIEVSR F EPTRKDIALL SSPAVITDKVIPACLPSPNYWADRTECF ITGGETQGTFGAGLLKEAQLPVIENKVCNRYEFLNGRVQSTΞ CAGHLA GGTDSCQGDSGGPVCFEKDKYILQGVTSWGLGCARPN PGVYVRVSRFV TWIΞGVMRNN*
Sequenz 32: Micro-Plasminogen (pPLG7.1 und pPLG8.3)
APSFDCGKPQVEP KCPGRWGGCVAHPHS PWQVS RTRFGMHFCGGTL ISPEWVLTAAHCLE SPRPSSYKVILGAHQEVNLEPHVQEIEVSRLFLEP TRKDIALL SSPAVITDKVIPACLPSPNYWADRTECFITG GETQGTF GAG KEAQLPVIEN VCNRYEFLNGRVQSTELCAGHLAGGTDSCQGDSG GPVCFEKDKYILQGVTSWGLGO PNIPGVYVRVSRFVTWIEGvMRlTO
Sequenz 33: Micro-Plasminogen (pPLG9.1 und pPLGlO.l)
SFDCGKPQVEP KCPGRWGGCVAHPHS PWQVSLRTRFG HFCGGTLIS PE VLTAAHCLEKSPRPSSY VILGAHQEVNLEPHVQEIEVSR FLEPTR IΦIA L SSPAVITDKVIPAC PSPlSrYV ÄDRTECFITG GETQGTFGA GLL ΞAQ PVIENKVCNRYEFLNGRVQSTELCAGH AGGTDSCQGDSGGP LVCFEi KYILQGVTS G Gα^PNKPGVYVRVSRFVT IEGVMRNN*
Sequenz 34: DNA-Sequenz des alpha-Faktors aus der Hefe Saccharomyces cerevisiae in pPICZαA bis zur Kex2-Schnittstelle.
ATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCTGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTC CAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTA CTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAAC GGGTTATTGTTTATAΆATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTATCTC
TCGAG
Sequenz 35: Aminosäure-Sequenz des alpha-Faktors aus der Hefe Saccharomyces cerevisiae in pPICZαA bis zur Kex2-Schnittstelle.
MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSNST N G FINTTIASIAAKEEGVSLE
Sequenz 36: DNA-Sequenz der Kex2-Schnittstelle
AAAAGA
Sequenz 37: DNA-Sequenz der Stel3-Schnittstellen
GAGGCTGAAGCT
Sequenz 38: Aminosäure-Sequenz der Kex2-Schnittstelle
KR
Sequenz 39: Aminosäure-Sequenz der Stel3-Schnittstellen
EAEA
Sequenz 40: Aminosäure-Sequenzen des humanen Mini-Plasminogens wie in pPLGl.l mit Kex2-Schnittstelle und dem Präpro-Peptid des alpha-faktors der Hefe Saccharomyces cerevisiae
MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSD EGDFDV AVLPFSNSTNNGLLFI TTIASIAAKEEGVSLEKRAPPPW PDVETPS EEDC FGNGKGYRGKRATTVTGTPCQD AAQEPHRHSIFTPETNPRAGLE KNYCR PDGDVGGP CYTTNPRK YDYCDVPQCAAPSFDCGKPQVEPKKC PGRWGGCVAHPHS P QVSLRTRFGMHFCGGTLISPE V TAAHCLEKS PRPSSYKVILGAHQEVNLEPHVQEIEVSR F EPTRKDIAL K SSPAVI TDKVIPACLPSPNYWADRTECFITGWGETQGTFGAGLLKEAQ PVIENK VCNRYEFLNGRVQSTELCAGHLAGGTDSCQGDSGGPLVCFEKDKYI QGV TSWGLGCARPNKPGVYVRVSRFVTWIEGVMRSTN* Sequenz 41: Aminosäure-Sequenz des humanen Mmi-Plasminogens wie in pPLG2.1mit Kex2-Schnittstelle und zwei Stel-Schnittstellen und dem Präpro-Peptid des alpha-Faktors der Hefe Saccharomyces cerevisiae
MRFPSIFTAVLFAASSA AAPVOTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDV AV PFSNSTNNG LFINTTIASIAAKEEGVS EKREAEAAPPPWLLPDV ETPSEEDCMFGNGKGYRGKRATTVTGTPCQD AAQEPHRHSIFTPETNPR AGLEKNYCRNPDGDVGGP CYTTNPRKLYDYCDVPQCAAPSFDCGKPQVE PKKCPGRWGGCVAHPHS P QVS RTRFG HFCGGTLISPE VLTAAHC LEKSPRPSSYKVILGAHQEVNLEPHVQEIEVSRLF EPTRKDIALLKLSS PAVITDKVIPACLPSPNYWADRTECFITGWGETQGTFGAGL KEAQLPV IENKVCNRYEF NGRVQSTE CAGH AGGTDSCQGDSGGP VCFΞKDKYI LQGVTS GLGCARPNKPGVYVRVSRFVT IΞGV RNN*
Sequenz 42: Aminosäure-Sequenz des humanen Micro-Plasminogens wie in pPLG3.2 mit Kex2-Schnittstelle und dem Präpro-Peptid des alpha-Faktors der Hefe Saccharomyces cerevisiae
MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSNSTNN GL FINTTIASIAAKEEGVSLΞKRKLYDYCDVPQCAAPSFDCGKPQVEPKKCPGRWGGCV AHPHS P QVSLRTRFG HFCGGTLISPEWVLTAAHC EKSPRPSSYKVILGAHQEVN EP HVQEIEVSRLFLEPTRKDIAL KLSSPAVITDKVIPACLPSPNYWADRTECFITG GETQ GTFGAGLLKEAQLPVIENKVC RYEFLNGRVQSTE CAGH AGGTDSCQGDSGGPLVCFEK DKYILQGVTS G GCARPNKPGVYVRVSRFVT IEGVMRNN*
Sequenz 43: Aminosäure-Sequenz des humanen Micro-Plasminogens wie in pPLG4.2 mit Kex2-Schnittstelle und zwei Stel3-Schnittstellen und dem Präpro-Peptid des alpha-Faktors der Hefe Saccharomyces cerevisiae
^FPSIFTAVLFAASSA AAPV TTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAV PFS NSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVSLEKREAEAKLYDYCDVPQCAAPSFDCGKPQV EPKKCPGRWGGCVAHPHS P QVSLRTRFGMHFCGGT ISPE VLTAAHCLEKSP RPSSYKVILGAHQEVNLEPHVQEIEVSRLFLΞPTRKDIALLKLSSPAVITDKVIPA CLPSPNYWADRTECFITG GETQGTFGAGLLKEAQLPVIENKVCNRYEFLNGRVQ STE CAGH AGGTDSCQGDSGGPLVCFEKDKYI QGVTS GLGCARPNKPGVYVRV SRFVTWIEGVMR N*
Sequenz 44: Aminosäure-Sequenz des humanen Micro-Plasminogens wie in pPLG5.3 mit Kex2-Schnittstelle und dem Präpro-Peptid des alpha-Faktors der Hefe Saccharomyces cerevisiae
MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSNSTNN GLLFINTTIASIAAKEEGVS EKRLYDYCDVPQCAAPSFDCGKPQVEPKKCPGRWGGCVA HPHS PWQVS RTRFGMHFCGGTLISPEWVLTAAHCLEKSPRPSSYKVILGAHQEVN EPH VQEIEVSRLF EPTRKDIALLKLSSPAVITDKVIPACLPSPNYWADRTECFITG GETQG TFGAGLKEAQLPVIENKVCNRYEFLNGRVQSTELCAGHAGGTDSCQGDSGGPLVCFEKD
KYI QGVTS GLGCARPNKPGVYVRVSRFVT IEGVRNN*
Sequenz 45: Aminosäure-Sequenz des humanen Micro-Plasminogens wie in pPLG6.1 mit Kex2-Schnittstelle und zwei Stel3-Schnittstellen und dem Präpro-Peptid des alpha-Faktors der Hefe Saccharomyces cerevisiae
MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAV PFS NSTNNG LFINTTIASIAAKEEGVSLEKREAEALYDYCDVPQCAAPSFDCGKPQVE PKKCPGRVVGGCVAHPHS P QVS RTRFGHFCGGTLISPE VLTAAHCLEKSPR PSSYVILGAHQEVNLEPHVQEIΞVSRLFLEPTRKDIALLKLSSPÄVITDKVIPAC PSPNYWADRTECFITG GETQGTFGAG LKEAQLPVIENKVCNRYEFLNGRVQS TE CAGHLAGGTDSCQGDSGGPLVCFEKDKYI QGVTS GLGCARPNKPGVYVRVS RFVTWIEGVMRNN*
Sequenz 46: Ammosäure-Sequenz des humanen Micro-Plasminogens wie in pPLG7.1 mit Kex2-Schnittstelle und dem Präpro-Peptid des alpha-Faktors der Hefe Saccharomyces cerevisiae
MRFPSIFTAV FAASSA AAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSD EGDFDVAVLPFSNSTNN GL FINTTIASIAAKEEGVSLEKRAPSFDCGKPQVEPKKCPGRWGGCVAHPHSWPWQVS RTRFGMHFCGGTLISPE VLTAAHC EKSPRPSSYKVILGAHQEVN EPHVQEIEVSRLFL EPTRKDIAL K SSPAVITD VIPAC PSPKΓYWADRTECFITG GETQGTFGAGLLKEAQ LPVIENKVC RYEFLNGRVQSTE CAGHIIAGGTDSCQGDSGGP VCFEKDKYI QGVTS G LGCÄRPNKPGVYVRVSRFVTWIEGV RNN*
Sequenz 47: Aminosäure-Sequenz des humanen Micro-Plasminogens wie in pPLG8.3 mit Kex2-Schnittstelle und zwei Stel3-Schnittstellen und dem Präpro-Peptid des alpha-Faktors der Hefe Saccharomyces cerevisiae
MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSNSTNN G FIKFTTIASIAAKEEGVS EKREAEAAPSFDCGKPQVEPKKCPGRWGGCVAHPHSWPW QVS RTRFGMHFCGGT ISPE V TAAHCLEKSPRPSSYKVI GAHQΞVNLEPHVQEIEVS R FLEPTRKDIAL KLSSPÄVITDKVIPACLPSPNYWADRTECFITG GETQGTFGAG KEAQ PVIENKVCNRYEFLNGRVQSTELCAGHLAGGTDSCQGDSGGP VCFE DKYILQGV TS GLGO PNKPGVYVRVSRFVTWIEGVMRNN*
Sequenz 48: Aminosäure-Sequenz des humanen Micro-Plasminogens wie in pPLG9.1 mit Kex2-Schnittstelle und dem Präpro-Peptid des alpha-Faktors der Hefe Saccharomyces cerevisiae
KRFPSIFTAVLFAASSALAAPVlrrTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSNSTNN G FINTTIASIAAKEEGVS EKRSFDCGKPQVEPKKCPGRWGGCVAHPHS PWQVS RT RFGMHFCGGTLISPEWV TAAHCLEKSPRPSSYKVI GAHQEVNLEPHVQEIEVSRLFLEP
TRKDIALLK SSPAVITDKVIPAC PSPNYWADRTECFITG GETQGTFGAGL KEAQLP VIENKVCNRYEF NGRVQSTE CAGHLAGGTDSCQGDSGGP VCFEKDKYI QGVTS G G (^ARPNKPGVYVRVSRFVTWIEGV RNN*
Sequenz 49: Aminosäure-Sequenz des humanen Micro-Plasminogens wie in pPLGlO.l mit Kex2-Schnittstelle und zwei Stel3-Schnittstellen und dem Präpro-Peptid des alpha-Faktors der Hefe Saccharomyces cerevisiae
Π^FPSIF AV FAASSAIJ PVN T EDETAQIPAEA IGYSD EGDFDVAV PFSNSTNN G LFINTTIASIAAKEEGVS EKREAEASFDCGKPQVΈPKKCPGRWGGCVAHPHSWPWQV SLRTRFGMHFCGGTLISPEWV TAAHCLEKSPRPSSYKVILGAHQEV LEPHVQEIEVSRL F EPTRKDIAL K SSPAVITDKVIPAC PSPNYWADRTECFITGWGETQGTFGAGLLKE AQ PVIENKVCNRYΞFLNGRVQSTELCAGH AGGTDSCQGDSGGPLVCFEKDKYI QGVTS G GCARPNKPGVYVRVSRFVT IEGVMRNN*
Sequenz 50: Nukleinsäure-Sequenz des humanen Mini-Plasminogen-Gens wie in pPLGl.l mit den Kodons für die Kex2-Schnittstelle und dem Gen des Präpro-Peptids des alpha-Faktors der Hefe Saccharomyces cerevisiae
ATGAGATTTCCTTCAΆTTTTTACTGCTGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTC CAGTCAΆCACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTA CTCAGATTTAGAΆGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAAC GGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTATCTC TCGAGAAAAGAGCACCTCCGCCTGTTGTCCTGCTTCCAGATGTAGAGACTCCTTCCGAAGA AGACTGTATGTTTGGGAATGGGAAAGGATACCGAGGCAAGAGGGCGACCACTGTTACTGGG ACGCCATGCCAGGACTGGGCTGCCCAGGAGCCCCATAGACACAGCATTTTCΆCTCCAGAGA CAAATCCACGGGCGGGTCTGGAAAAAAATTACTGCCGTAACCCTGATGGTGATGTAGGTGG TCCCTGGTGCTACACGACAAATCCAAGAAAACTTTACGACTACTGTGATGTCCCTCAGTGT GCGGCCCCTTCATTTGATTGTGGGAAGCCTCAAGTGGAGCCGAAGAAATGTCCTGGAAGGG TTGTGGGGGGGTGTGTGGCCCACCCACATTCCTGGCCCTGGCAAGTCAGTCTTAGAACAAG GTTTGGAATGCACTTCTGTGGAGGCACCTTGATATCCCCAGAGTGGGTGTTGACTGCTGCC CACTGCTTGGAGAAGTCCCCAAGGCCTTCATCCTACAAGGTCATCCTGGGTGCACACCAAG AAGTGAATCTCGAACCGCATGTTCAGGAΆATAGAΆGTGTCTAGGCTGTTCTTGGAGCCCAC ACGAAAAGATATTGCCTTGCTAAAGCTAΆGCAGTCCTGCCGTCATCACTGACAAAGTAATC CCΆGCTTGTCTGCCATCCCCAAATTATGTGGTCGCTGACCGGACCGAATGTTTCATCACTG GCTGGGGAGΆAACCCAAGGTACTTTTGGAGCTGGCCTTCTCAAGGΆAGCCCAGCTCCCTGT GATTGAGAATAAAGTGTGCAATCGCTATGAGTTTCTGAATGGAAGAGTCCAATCCACCGAA CTCTGTGCTGGGCATTTGGCCGGAGGCACTGACAGTTGCCAGGGTGACAGTGGAGGTCCTC TGGTTTGCTTCGAGAAGGACAAATACATTTTACAAGGAGTCACTTCTTGGGGTCTTGGCTG GCACGCCCCAATAAGCCTGGTGTCTATGTTCGTGTTTCAAGGTTTGTTACTTGGΆTTGAG GGAGTGATGAGAAATAATTGA
Sequenz 51: Nukleinsäure-Sequenz des humanen Mini-Plasminogen-Gens wie in pPLG2.1 mit den Kodons für die Kex2-Schnittstelle und die Stel3-Schnittstellen und dem Gen des Präpro-Peptids des alpha- Faktors der Hefe Saccharomyces cerevisiae
ATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCTGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTC CAGTCAACACTACAΆCAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTA CTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAAC GGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTATCTC TCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTGCACCTCCGCCTGTTGTCCTGCTTCCAGATGTAGAGAC TCCTTCCGAAGAAGACTGTATGTTTGGGAATGGGAAAGGATACCGAGGCAAGAGGGCGACC ACTGTTACTGGGACGCCATGCCAGGACTGGGCTGCCCAGGAGCCCCATAGACACAGCATTT TCACTCCAGAGACAAATCCACGGGCGGGTCTGGAAΆAAAATTACTGCCGTAACCCTGATGG TGATGTAGGTGGTCCCTGGTGCTACACGACAAΆTCCAAGAAAACTTTACGACTACTGTGAT GTCCCTCAGTGTGCGGCCCCTTCATTTGATTGTGGGAAGCCTCAAGTGGAGCCGAAGAAAT GTCCTGGAAGGGTTGTGGGGGGGTGTGTGGCCCACCCACATTCCTGGCCCTGGCAAGTCAG TCTTAGAACAΆGGTTTGGAATGCACTTCTGTGGAGGCACCTTGATATCCCCAGAGTGGGTG TTGACTGCTGCCCACTGCTTGGAGAAGTCCCCAAGGCCTTCATCCTACAAGGTCATCCTGG GTGCACACCAAGAAGTGAATCTCGAACCGCATGTTCAGGAAATAGAAGTGTCTAGGCTGTT CTTGGAGCCCACACGAΆAAGATATTGCCTTGCTAAAGCTAΆGCAGTCCTGCCGTCATCACT GACAAAGTAATCCCAGCTTGTCTGCCATCCCCAAATTATGTGGTCGCTGACCGGACCGAAT GTTTCATCACTGGCTGGGGAGAAACCCAAGGTACTTTTGGAGCTGGCCTTCTCAAGGAAGC CCAGCTCCCTGTGATTGAGAATAAΆGTGTGCAATCGCTATGAGTTTCTGAATGGAAGAGTC CAATCCACCGAACTCTGTGCTGGGCATTTGGCCGGAGGCACTGACAGTTGCCAGGGTGACA GTGGAGGTCCTCTGGTTTGCTTCGAGAAGGACAAATACATTTTACAAGGAGTCACTTCTTG GGGTCTTGGCTGTGCACGCCCCAATAAGCCTGGTGTCTATGTTCGTGTTTCAΆGGTTTGTT ACTTGGATTGAGGGAGTGATGAGAAATAATTGA
Sequenz 52: Nuklemsäure-Sequenz des humanen Micro-Plasminogen-Gens wie in pPLG3.2 mit den Kodons für die Kex2-Schnittstelle und dem Gen des Präpro-Peptids des alpha-Faktors der Hefe Saccharomyces cerevisiae
ATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCTGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTC CAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTA CTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAAC GGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTATCTC TCGAGAAAAGAAAACTTTACGACTACTGTGATGTCCCTCAGTGTGCGGCCCCTTCATTTGA TTGTGGGAAGCCTCAAGTGGAGCCGAAGAAATGTCCTGGAAGGGTTGTGGGGGGGTGTGTG GCCCACCCACATTCCTGGCCCTGGCAAGTCAGTCTTAGAACAAGGTTTGGAATGCACTTCT GTGGAGGCACCTTGATATCCCCAGAGTGGGTGTTGACTGCTGCCCACTGCTTGGAGAAGTC CCCAAGGCCTTCATCCTACAAGGTCATCCTGGGTGCACACCAAGAAGTGAATCTCGAACCG CATGTTCAGGAAATAGAAGTGTCTAGGCTGTTCTTGGAGCCCACACGAAAAGATATTGCCT TGCTAAAGCTAAGCAGTCCTGCCGTCATCACTGACAAAGTAATCCCAGCTTGTCTGCCATC CCCAAATTATGTGGTCGCTGACCGGACCGAATGTTTCATCACTGGCTGGGGAGAAACCCAA GGTACTTTTGGAGCTGGCCTTCTCAAGGAAGCCCAGCTCCCTGTGATTGAGAATAAAGTGT GCAΆTCGCTATGAGTTTCTGAATGGAAGAGTCCAATCCACCGAACTCTGTGCTGGGCATTT GGCCGGAGGCACTGACAGTTGCCAGGGTGACAGTGGAGGTCCTCTGGTTTGCTTCGAGAAG GACAAATACATTTTACAAGGAGTCACTTCTTGGGGTCTTGGCTGTGCACGCCCCAATAAGC CTGGTGTCTATGTTCGTGTTTCAAGGTTTGTTACTTGGATTGAGGGAGTGATGAGAAATAA
TTGA
Sequenz 53: Nukleinsäure-Sequenz des humanen Micro-Plasminogen-Gens wie in pPLG4.2 mit den Kodons für die Kex2-Schnittstelle und die Stel3-Schnittstellen und dem Gen des Präpro-Peptids des alpha- Faktors der Hefe Saccharomyces cerevisiae
ATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCTGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTC CAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTA CTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAAC GGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTATCTC TCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTAAACTTTACGACTACTGTGATGTCCCTCAGTGTGCGGC CCCTTCATTTGATTGTGGGAAGCCTCAAGTGGAGCCGAAGAAATGTCCTGGAAGGGTTGTG GGGGGGTGTGTGGCCCACCCACATTCCTGGCCCTGGCAAGTCAGTCTTAGAACAAGGTTTG GAATGCACTTCTGTGGAGGCACCTTGATATCCCCAGAGTGGGTGTTGACTGCTGCCCACTG CTTGGAGAAGTCCCCAAGGCCTTCATCCTACAAGGTCATCCTGGGTGCACACCAAGAAGTG AATCTCGAACCGCATGTTCAGGAAATAGAAGTGTCTAGGCTGTTCTTGGAGCCCACACGAA AAGATATTGCCTTGCTAAAGCTAAGCAGTCCTGCCGTCATCACTGACAAAGTAATCCCAGC TTGTCTGCCATCCCCAAATTATGTGGTCGCTGACCGGACCGAATGTTTCATCACTGGCTGG GGAGAAACCCAAGGTACTTTTGGAGCTGGCCTTCTCAAGGAAGCCCAGCTCCCTGTGATTG AGAATAAΆGTGTGCAATCGCTATGAGTTTCTGAATGGAAGAGTCCAATCCACCGAACTCTG TGCTGGGCATTTGGCCGGAGGCACTGACAGTTGCCAGGGTGACAGTGGAGGTCCTCTGGTT TGCTTCGAGAAGGACAAATACATTTTACAAGGAGTCACTTCTTGGGGTCTTGGCTGTGCAC GCCCCAATAAGCCTGGTGTCTATGTTCGTGTTTCAAGGTTTGTTACTTGGATTGAGGGAGT GATGAGAAATAATTGA
Sequenz 54: Nukleinsäure-Sequenz des humanen Micro-Plasminogen-Gens wie in pPLG5.3 mit den Kodons für die Kex2-Schnittstelle und dem Gen des Präpro-Peptids des alpha-Faktors der Hefe Saccharomyces cerevisiae
ATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCTGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTC
CAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTA CTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAAC GGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTATCTC TCGAGAAAAGACTTTACGACTACTGTGATGTCCCTCAGTGTGCGGCCCCTTCATTTGATTG TGGGAAGCCTCAAGTGGAGCCGAAGAAATGTCCTGGAAGGGTTGTGGGGGGGTGTGTGGCC CACCCACATTCCTGGCCCTGGCAAGTCAGTCTTAGAACAAGGTTTGGAATGCACTTCTGTG GAGGCACCTTGATATCCCCAGAGTGGGTGTTGACTGCTGCCCACTGCTTGGAGAAGTCCCC AAGGCCTTCATCCTACAAGGTCATCCTGGGTGCACACCAAGAAGTGAATCTCGAACCGCAT GTTCAGGAAATAGAAGTGTCTAGGCTGTTCTTGGAGCCCACACGAAAAGATATTGCCTTGC TAAAGCTAAGCAGTCCTGCCGTCATCACTGACAAAGTAATCCCAGCTTGTCTGCCATCCCC AAATTATGTGGTCGCTGACCGGACCGAATGTTTCATCACTGGCTGGGGAGAAACCCAAGGT ACTTTTGGAGCTGGCCTTCTCAAGGAAGCCCAGCTCCCTGTGATTGAGAATAAAGTGTGCA ATCGCTATGAGTTTCTGAATGGAAGAGTCCAATCCACCGAACTCTGTGCTGGGCATTTGGC CGGAGGCACTGACAGTTGCCAGGGTGACAGTGGAGGTCCTCTGGTTTGCTTCGAGAAGGAC AAATACATTTTACAAGGAGTCACTTCTTGGGGTCTTGGCTGTGCACGCCCCAATÄAGCCTG GTGTCTATGTTCGTGTTTCAAGGTTTGTTACTTGGATTGAGGGAGTGATGAGAAATAATTG
A Sequenz 55: Nukleinsäure-Sequenz des humanen Micro-Plasminogen-Gens wie in pPLG6.1 mit den Kodons für die Kex2-Schnittstelle und die Stel3-Schnittstellen und dem Gen des Präpro-Peptids des alpha- Faktors der Hefe Saccharomyces cerevisiae
ATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCTGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTC CAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTA CTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAAC GGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTATCTC TCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTCTTTACGACTACTGTGATGTCCCTCAGTGTGCGGCCCC TTCATTTGATTGTGGGAAGCCTCAAGTGGAGCCGAAGAAATGTCCTGGAAGGGTTGTGGGG GGGTGTGTGGCCCACCCACATTCCTGGCCCTGGCAAGTCAGTCTTAGAACAAGGTTTGGAA TGCACTTCTGTGGAGGCACCTTGATATCCCCAGAGTGGGTGTTGACTGCTGCCCACTGCTT GGAGAAGTCCCCAAGGCCTTCATCCTACAAGGTCATCCTGGGTGCACACCAAGAAGTGAAT CTCGAACCGCATGTTCAGGAAATAGAAGTGTCTAGGCTGTTCTTGGAGCCCACACGAAAAG ATATTGCCTTGCTAAAGCTAAGCAGTCCTGCCGTCATCACTGACAAAGTAATCCCAGCTTG TCTGCCATCCCCAAATTATGTGGTCGCTGACCGGACCGAATGTTTCATCACTGGCTGGGGA GAAACCCAAGGTACTTTTGGAGCTGGCCTTCTCAAGGAAGCCCAGCTCCCTGTGATTGAGA ATAAAGTGTGCÄATCGCTATGAGTTTCTGAATGGAAGAGTCCAATCCACCGAACTCTGTGC TGGGCATTTGGCCGGAGGCACTGACAGTTGCCAGGGTGACAGTGGAGGTCCTCTGGTTTGC TTCGAGAAGGACAAATACATTTTACAAGGAGTCACTTCTTGGGGTCTTGGCTGTGCACGCC CCAATAAGCCTGGTGTCTATGTTCGTGTTTCAAGGTTTGTTACTTGGATTGAGGGAGTGAT GAGAAATAATTGA
Sequenz 56: Nukleinsäure-Sequenz des humanen Micro-Plasminogen-Gens wie in pPLG7.1 mit den Kodons für die Kex2-Schnittstelle und dem Gen des Präpro-Peptids des alpha-Faktors der Hefe Saccharomyces cerevisiae
ATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCTGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTC CAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTA CTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAAC GGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTATCTC TCGAGAAAAGAGCCCCTTCATTTGATTGTGGGAAGCCTCAAGTGGAGCCGAAGAAATGTCC TGGAAGGGTTGTGGGGGGGTGTGTGGCCCACCCACATTCCTGGCCCTGGCAAGTCAGTCTT AGAACAAGGTTTGGAATGCACTTCTGTGGAGGCACCTTGATATCCCCAGAGTGGGTGTTGA CTGCTGCCCACTGCTTGGAGAAGTCCCCAAGGCCTTCATCCTACAAGGTCATCCTGGGTGC ACACCAAGAAGTGAATCTCGAACCGCATGTTCAGGΆAATAGAAGTGTCTAGGCTGTTCTTG GAGCCCACACGAAAAGATATTGCCTTGCTAAAGCTAAGCAGTCCTGCCGTCATCACTGACA AAGTAATCCCAGCTTGTCTGCCATCCCCAAATTATGTGGTCGCTGACCGGACCGAATGTTT CATCACTGGCTGGGGAGAAΆCCCAAGGTACTTTTGGAGCTGGCCTTCTCAAGGAAGCCCAG CTCCCTGTGATTGAGAATAAAGTGTGCAATCGCTATGAGTTTCTGAATGGAΆGAGTCCAAT CCACCGAACTCTGTGCTGGGCATTTGGCCGGAGGCACTGACAGTTGCCAGGGTGACAGTGG AGGTCCTCTGGTTTGCTTCGAGAAGGACAAATACATTTTACAAGGAGTCACTTCTTGGGGT CTTGGCTGTGCACGCCCCAATAAGCCTGGTGTCTATGTTCGTGTTTCAAGGTTTGTTACTT GGATTGAGGGAGTGATGAGAAATAATTGA
Sequenz 57: Nuklemsäure-Sequenz des humanen Micro-Plasminogen-Gens wie in pPLG8.3 mit den Kodons für die Kex2-SchnittsteUe und die Stel3-Schnittstellen und dem Gen des Präpro-Peptids des alpha- Faktors der Hefe Saccharomyces cerevisiae
ATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCTGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTC CAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTA CTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAAC GGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTATCTC TCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTGCCCCTTCATTTGATTGTGGGAAGCCTCAAGTGGAGCC GAAGAAATGTCCTGGAAGGGTTGTGGGGGGGTGTGTGGCCCACCCACATTCCTGGCCCTGG CAAGTCAGTCTTAGAACAAGGTTTGGAATGCACTTCTGTGGAGGCACCTTGATATCCCCAG AGTGGGTGTTGACTGCTGCCCACTGCTTGGAGAAGTCCCCAAGGCCTTCATCCTACAAGGT CATCCTGGGTGCACACCAAGAAGTGAATCTCGAACCGCATGTTCAGGAAATAGAAGTGTCT AGGCTGTTCTTGGAGCCCACACGAAAAGATATTGCCTTGCTAAAGCTAAGCAGTCCTGCCG TCATCACTGACAAAGTAATCCCAGCTTGTCTGCCATCCCCAAATTATGTGGTCGCTGACCG GACCGAATGTTTCATCACTGGCTGGGGAGAAACCCAAGGTACTTTTGGAGCTGGCCTTCTC AAGGAAGCCCAGCTCCCTGTGATTGAGAATAAAGTGTGCAATCGCTATGAGTTTCTGAATG GAAGAGTCCAATCCACCGAACTCTGTGCTGGGCATTTGGCCGGAGGCACTGACAGTTGCCA GGGTGACAGTGGAGGTCCTCTGGTTTGCTTCGAGAAGGACAAATACATTTTACAAGGAGTC ACTTCTTGGGGTCTTGGCTGTGCACGCCCCAATAAGCCTGGTGTCTATGTTCGTGTTTCAA GGTTTGTTACTTGGATTGAGGGAGTGATGAGAAATAATTGA
Sequenz 58: Nukleinsäure-Sequenz des humanen Micro-Plasminogen-Gens wie in pPLG9.1 mit den Kodons für die Kex2-Schnittstelle und dem Gen des Präpro-Peptids des alpha-Faktors der Hefe Saccharomyces cerevisiae
ATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCTGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTC CAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTA CTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAAC GGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAΆGGGGTATCTC TCGAGAAAAGATCATTTGATTGTGGGAAGCCTCAAGTGGAGCCGAAGAAATGTCCTGGAAG GGTTGTGGGGGGGTGTGTGGCCCACCCACATTCCTGGCCCTGGCAAGTCAGTCTTAGAACA AGGTTTGGAATGCACTTCTGTGGAGGCACCTTGATATCCCCAGAGTGGGTGTTGACTGCTG CCCACTGCTTGGAGAAGTCCCCAAGGCCTTCATCCTACAAGGTCATCCTGGGTGCACACCA AGAAGTGAATCTCGAΆCCGCATGTTCAGGAAATAGAΆGTGTCTAGGCTGTTCTTGGAGCCC ACACGAAAAGATATTGCCTTGCTAAAGCTAAGCAGTCCTGCCGTCATCACTGACAAAGTAA TCCCAGCTTGTCTGCCATCCCCAAATTATGTGGTCGCTGACCGGACCGAATGTTTCATCAC TGGCTGGGGAGAAACCCAAGGTACTTTTGGAGCTGGCCTTCTCAAGGAAGCCCAGCTCCCT GTGATTGAGAATAAAGTGTGCAATCGCTATGAGTTTCTGAΆTGGAAGAGTCCAATCCACCG AACTCTGTGCTGGGCATTTGGCCGGAGGCACTGACAGTTGCCAGGGTGACAGTGGAGGTCC TCTGGTTTGCTTCGAGAAGGACAAATACATTTTACAAGGAGTCACTTCTTGGGGTCTTGGC TGTGCACGCCCCAATAAGCCTGGTGTCTATGTTCGTGTTTCAAGGTTTGTTACTTGGATTG AGGGAGTGATGAGAAATAATTGA
Sequenz 59: Nuklemsäure-Sequenz des humanen Micro-Plasminogen-Gen wie in pPLGlO.l mit den Kodons für die Kex2-Schnittstelle und die Stel3-Schnittstellen und dem Gen des Präpro-Peptids des alpha- Faktors der Hefe Saccharomyces cerevisiae
ATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCTGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTC CAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTA CTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAAC GGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTATCTC TCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTTCATTTGATTGTGGGAAGCCTCAAGTGGAGCCGAAGAA ATGTCCTGGAAGGGTTGTGGGGGGGTGTGTGGCCCACCCACATTCCTGGCCCTGGCAAGTC AGTCTTAGAACAAGGTTTGGAATGCACTTCTGTGGAGGCACCTTGATATCCCCAGAGTGGG TGTTGACTGCTGCCCACTGCTTGGAGAAGTCCCCAAGGCCTTCATCCTACAAGGTCATCCT GGGTGCACACCAAGAAGTGAATCTCGAACCGCATGTTCAGGAAATAGAAGTGTCTAGGCTG TTCTTGGAGCCCACACGAAAAGATATTGCCTTGCTAAAGCTAAGCAGTCCTGCCGTCATCA CTGACAAAGTAATCCCAGCTTGTCTGCCATCCCCAAATTATGTGGTCGCTGACCGGACCGA ATGTTTCATCACTGGCTGGGGAGAAACCCAAGGTACTTTTGGAGCTGGCCTTCTCAAGGAA GCCCAGCTCCCTGTGATTGAGAATAAAGTGTGCAATCGCTATGAGTTTCTGAATGGAAGAG TCCAATCCACCGAACTCTGTGCTGGGCATTTGGCCGGAGGCACTGACAGTTGCCAGGGTGA CAGTGGAGGTCCTCTGGTTTGCTTCGAGAAGGACAAATACATTTTACAAGGAGTCACTTCT TGGGGTCTTGGCTGTGCACGCCCCAATAAGCCTGGTGTCTATGTTCGTGTTTCAAGGTTTG TTACTTGGATTGAGGGAGTGATGAGAAATAATTGA
Sequenz 60: Nukleinsäure-Sequenz des humanes Mini-Plasminogen-Gens wie in pPLGl.l und pPLG2.1
GCACCTCCGCCTGTTGTCCTGCTTCCAGATGTAGAGACTCCTTCCGAAGAAGACTGTATG TTTGGGAATGGGAAAGGATACCGAGGCAAGAGGGCGACCACTGTTACTGGGACGCCATGC CAGGACTGGGCTGCCCAGGAGCCCCATAGACACAGCATTTTCACTCCAGAGACAAATCCA CGGGCGGGTCTGGAAAAAAATTACTGCCGTAACCCTGATGGTGATGTAGGTGGTCCCTGG TGCTACACGACAAATCCAAGAAAACTTTACGACTACTGTGATGTCCCTCAGTGTGCGGCC CCTTCATTTGATTGTGGGAAGCCTCAAGTGGAGCCGAAGAAATGTCCTGGAAGGGTTGTG GGGGGGTGTGTGGCCCACCCACATTCCTGGCCCTGGCAAGTCAGTCTTAGAACAAGGTTT GGAATGCACTTCTGTGGAGGCACCTTGATATCCCCAGAGTGGGTGTTGACTGCTGCCCAC TGCTTGGAGAAGTCCCCAAGGCCTTCATCCTACAAGGTCATCCTGGGTGCACACCAAGAA GTGAATCTCGAACCGCATGTTCAGGAAATAGAAGTGTCTAGGCTGTTCTTGGAGCCCACA CGAAAAGATATTGCCTTGCTAAAGCTAAGCAGTCCTGCCGTCATCACTGACAAAGTAATC CCAGCTTGTCTGCCATCCCCAAATTATGTGGTCGCTGACCGGACCGAATGTTTCATCACT GGCTGGGGAGAAACCCAAGGTACTTTTGGAGCTGGCCTTCTCAAGGAAGCCCAGCTCCCT GTGATTGAGAATAAAGTGTGCAATCGCTATGAGTTTCTGAATGGAAGAGTCCAATCCACC GAACTCTGTGCTGGGCATTTGGCCGGAGGCACTGACAGTTGCCAGGGTGACAGTGGAGGT CCTCTGGTTTGCTTCGAGAAGGACAAATACATTTTACAAGGAGTCACTTCTTGGGGTCTT GGCTGTGCACGCCCCAATAAGCCTGGTGTCTATGTTCGTGTTTCAAGGTTTGTTACTTGG ATTGAGGGAGTGATGAGAAATAATTGA
Sequenz 61: Nukleinsäure-Sequenz des humanen Micro-Plasminogen-Gens wie in pPLG3.2 und pPLG4.2
AAACTTTACGACTACTGTGATGTCCCTCAGTGTGCGGCCCCTTCATTTGATTGTGGGAAGC CTCAAGTGGAGCCGAAGAAATGTCCTGGAAGGGTTGTGGGGGGGTGTGTGGCCCACCCACA TTCCTGGCCCTGGCAAGTCAGTCTTAGAACAAGGTTTGGAATGCACTTCTGTGGAGGCACC TTGATATCCCCAGAGTGGGTGTTGACTGCTGCCCACTGCTTGGAGAAGTCCCCAAGGCCTT
CATCCTACAAGGTCATCCTGGGTGCACACCAAGAAGTGAATCTCGAACCGCATGTTCAGGA AATAGAAGTGTCTAGGCTGTTCTTGGAGCCCACACGAAAAGATATTGCCTTGCTAAAGCTA AGCAGTCCTGCCGTCATCACTGACAAAGTAΆTCCCAGCTTGTCTGCCATCCCCAAΆTTATG TGGTCGCTGACCGGACCGAATGTTTCATCACTGGCTGGGGAGAAACCCAAGGTACTTTTGG AGCTGGCCTTCTCAAGGAAGCCCAGCTCCCTGTGATTGAGAATAAAGTGTGCAATCGCTAT GAGTTTCTGAATGGAAGAGTCCAATCCACCGAACTCTGTGCTGGGCATTTGGCCGGAGGCA CTGACAGTTGCCAGGGTGACAGTGGAGGTCCTCTGGTTTGCTTCGAGAAGGACAAATACAT TTTACAAGGAGTCACTTCTTGGGGTCTTGGCTGTGCACGCCCCAATAAGCCTGGTGTCTAT GTTCGTGTTTCAAGGTTTGTTACTTGGATTGAGGGAGTGATGAGAAATAATTGA
Sequenz 62: Nukleinsäure-Sequenz des humanen Micro-Plasminogen-Gens wie in pPLG5.3 und pPLG6.1
CTTTACGACTACTGTGATGTCCCTCAGTGTGCGGCCCCTTCATTTGATTGTGGGAAGCCTC AAGTGGAGCCGAAGAAATGTCCTGGAAGGGTTGTGGGGGGGTGTGTGGCCCACCCACATTC CTGGCCCTGGCAAGTCAGTCTTAGAACAAGGTTTGGAATGCACTTCTGTGGAGGCACCTTG ATATCCCCAGAGTGGGTGTTGACTGCTGCCCACTGCTTGGAGAAGTCCCCAAGGCCTTCAT CCTACAAGGTCATCCTGGGTGCACACCAAGAAGTGAATCTCGAACCGCATGTTCAGGAAAT AGAAGTGTCTAGGCTGTTCTTGGAGCCCACACGAAAAGATATTGCCTTGCTAAAGCTAAGC AGTCCTGCCGTCATCACTGACAAAGTAATCCCAGCTTGTCTGCCATCCCCAAATTATGTGG TCGCTGACCGGACCGAATGTTTCATCACTGGCTGGGGAGAAACCCAAGGTACTTTTGGAGC TGGCCTTCTCAAGGAAGCCCAGCTCCCTGTGATTGAGAATAAAGTGTGCAATCGCTATGAG TTTCTGAATGGAAGAGTCCAATCCACCGAACTCTGTGCTGGGCATTTGGCCGGAGGCACTG ACAGTTGCCAGGGTGACAGTGGAGGTCCTCTGGTTTGCTTCGAGAAGGACAAATACATTTT ACAAGGAGTCACTTCTTGGGGTCTTGGCTGTGCACGCCCCAATAAGCCTGGTGTCTATGTT CGTGTTTCAAGGTTTGTTACTTGGATTGAGGGAGTGATGAGAAATAATTGA
Sequenz 63: Nukleinsäure-Sequenz des humanen Micro-Plasminogen-Gens wie in pPLG7.1 und pPLG8.3
GCCCCTTCATTTGATTGTGGGAAGCCTCAAGTGGAGCCGAAGAAATGTCCTGGAAGGGTTG TGGGGGGGTGTGTGGCCCACCCACATTCCTGGCCCTGGCAAGTCAGTCTTAGAACAAGGTT TGGAATGCACTTCTGTGGAGGCACCTTGATATCCCCAGAGTGGGTGTTGACTGCTGCCCAC TGCTTGGAGAAGTCCCCAAGGCCTTCATCCTACAAGGTCATCCTGGGTGCACACCAAGAAG TGAATCTCGAACCGCATGTTCAGGAAATAGAAGTGTCTAGGCTGTTCTTGGAGCCCACACG AAAAGATATTGCCTTGCTAAAGCTAAGCAGTCCTGCCGTCATCACTGACAAAGTAATCCCA GCTTGTCTGCCATCCCCAAATTATGTGGTCGCTGACCGGACCGAATGTTTCATCACTGGCT GGGGAGAAACCCAAGGTACTTTTGGAGCTGGCCTTCTCAAGGAAGCCCAGCTCCCTGTGAT TGAGAATAAAGTGTGCAATCGCTATGAGTTTCTGAATGGAAGΆGTCCAATCCACCGAACTC TGTGCTGGGCATTTGGCCGGAGGCACTGACAGTTGCCAGGGTGACAGTGGAGGTCCTCTGG TTTGCTTCGAGAAGGACAAATACATTTTACAAGGAGTCACTTCTTGGGGTCTTGGCTGTGC ACGCCCCAATAAGCCTGGTGTCTATGTTCGTGTTTCAAGGTTTGTTACTTGGATTGAGGGA GTGATGAGAAATAATTGA
Sequenz 64: Nuklemsäure-Sequenz des humanen Micro-Plasminogen-Gens wie in pPLG9.1 und pPLGlO.l
TCATTTGATTGTGGGAAGCCTCAAGTGGAGCCGAAGAAATGTCCTGGAAGGGTTGTGGGGG GGTGTGTGGCCCACCCACATTCCTGGCCCTGGCAAGTCAGTCTTAGAACAAGGTTTGGAAT GCACTTCTGTGGAGGCACCTTGATATCCCCAGAGTGGGTGTTGACTGCTGCCCACTGCTTG GAGAAGTCCCCAAGGCCTTCATCCTACAAGGTCATCCTGGGTGCACACCAAGAAGTGAATC TCGAACCGCATGTTCAGGAAATAGAAGTGTCTAGGCTGTTCTTGGAGCCCACACGAAAAGA TATTGCCTTGCTAAAGCTAAGCAGTCCTGCCGTCATCACTGACAAAGTAATCCCAGCTTGT CTGCCATCCCCAAATTATGTGGTCGCTGACCGGACCGAATGTTTCATCACTGGCTGGGGAG AAACCCAAGGTACTTTTGGAGCTGGCCTTCTCAAGGAAGCCCAGCTCCCTGTGATTGAGAA TAAAGTGTGCAATCGCTATGAGTTTCTGAATGGAΆGAGTCCAATCCACCGAACTCTGTGCT GGGCATTTGGCCGGAGGCACTGACAGTTGCCAGGGTGACAGTGGAGGTCCTCTGGTTTGCT TCGAGAAGGACAAATACATTTTACAAGGAGTCACTTCTTGGGGTCTTGGCTGTGCACGCCC CAATAAGCCTGGTGTCTATGTTCGTGTTTCAAGGTTTGTTACTTGGATTGAGGGAGTGATG AGAAATAATTGA
Sequenz 65: Nukleinsäuresequenz des humanen Glu-Plasminogen-Gens
GAGCCTCTGGATGACTATGTGAATACCCAGGGGGCTTCACTGTTCAGTGTCACTAAGAAG CAGCTGGGAGCAGGAAGTATAGAAGAATGTGCAGCAAAATGTGAGGAGGACGAAGAATTC ACCTGCAGGGCATTCCAATATCACAGTAAAGAGCAACAATGTGTGATAATGGCTGAAAAC AGGAAGTCCTCCATAATCATTAGGATGAGAGATGTAGTTTTATTTGAAAAGAΆAGTGTAT CTCTCAGAGTGCAAGACTGGGAATGGAAAGAACTACAGAGGGACGATGTCCAAAACAAAA AATGGCATCACCTGTCAAAAATGGAGTTCCACTTCTCCCCACAGACCTAGATTCTCACCT GCTACACACCCCTCAGAGGGACTGGAGGAGAACTACTGCAGGAATCCAGACAACGATCCG CAGGGGCCCTGGTGCTATACTACTGATCCAGAAAAGAGATATGACTACTGCGACATTCTT GAGTGTGAAGAGGAATGTATGCATTGCAGTGGAGAAAACTATGACGGCAAAATTTCCAAG ACCATGTCTGGACTGGAATGCCAGGCCTGGGACTCTCAGAGCCCACACGCTCATGGATAC ATTCCTTCCAAATTTCCAAACAAGAACCTGAAGAAGAATTACTGTCGTAACCCCGATAGG GAGCTGCGGCCTTGGTGTTTCACCACCGACCCCAACAAGCGCTGGGAACTTTGCGACATC CCCCGCTGCACAACACCTCCACCATCTTCTGGTCCCACCTACCAGTGTCTGAAGGGAACA GGTGAAAACTATCGCGGGAATGTGGCTGTTACCGTTTCCGGGCACACCTGTCAGCACTGG AGTGCACAGACCCCTCACACACATAACAGGACACCAGAAAACTTCCCCTGCAAAAATTTG GATGAAAACTACTGCCGCAATCCTGACGGAAAAAGGGCCCCATGGTGCCATACAACCAAC AGCCAAGTGCGGTGGGAGTACTGTAAGATACCGTCCTGTGACTCCTCCCCAGTATCCACG GAACAATTGGCTCCCACAGCACCACCTGAGCTAACCCCTGTGGTCCAGGACTGCTACCAT GGTGATGGACAGAGCTACCGAGGCACATCCTCCACCACCACCACAGGAAAGAAGTGTCAG TCTTGGTCATCTATGACACCACACCGGCACCAGAAGACCCCAGAAAACTACCCAAATGCT GGCCTGACAATGAACTACTGCAGGAATCCAGATGCCGATAAAGGCCCCTGGTGTTTTACC ACAGACCCCAGCGTCAGGTGGGAGTACTGCAACCTGAAAAAATGCTCAGGAACAGAAGCG AGTGTTGTAGCACCTCCGCCTGTTGTCCTGCTTCCAGATGTAGAGACTCCTTCCGAAGAA GACTGTATGTTTGGGAATGGGAAAGGATACCGAGGCAAGAGGGCGACCACTGTTACTGGG ACGCCATGCCAGGACTGGGCTGCCCAGGAGCCCCATAGACACAGCATTTTCACTCCAGAG ACAAATCCACGGGCGGGTCTGGAAAAAAATTACTGCCGTAACCCTGATGGTGATGTAGGT GGTCCCTGGTGCTACACGACAAATCCAAGAAAACTTTACGACTACTGTGATGTCCCTCAG TGTGCGGCCCCTTCATTTGATTGTGGGAAGCCTCAΆGTGGAGCCGAAGAAATGTCCTGGA AGGGTTGTGGGGGGGTGTGTGGCCCACCCACATTCCTGGCCCTGGCAAGTCAGTCTTAGA ACAAGGTTTGGAATGCACTTCTGTGGAGGCACCTTGATATCCCCAGAGTGGGTGTTGACT GCTGCCCACTGCTTGGAGAAGTCCCCAAGGCCTTCATCCTACAAGGTCATCCTGGGTGCA CACCAAGAAGTGAATCTCGAACCGCATGTTCAGGAAATAGAAGTGTCTAGGCTGTTCTTG GAGCCCACACGAAAΆGATATTGCCTTGCTAAΆGCTAAGCAGTCCTGCCGTCATCACTGAC AAAGTAATCCCAGCTTGTCTGCCATCCCCAAATTATGTGGTCGCTGACCGGACCGAATGT TCATCACTGGCTGGGGAGAAACCCAAGGTACTTTTGGAGCTGGCCTTCTCAAGGAAGCC CAGCTCCCTGTGATTGAGAATAΆAGTGTGCAATCGCTATGAGTTTCTGAΆTGGAAGAGTC CAATCCACCGAΆCTCTGTGCTGGGCATTTGGCCGGAGGCACTGACAGTTGCCAGGGTGAC AGTGGAGGTCCTCTGGTTTGCTTCGAGAAGGACAAATACATTTTACAΆGGAGTCACTTCT TGGGGTCTTGGCTGTGCACGCCCCAATAAGCCTGGTGTCTATGTTCGTGTTTCAAGGTTT GTTACTTGGATTGAGGGAGTGATGAGAAATAATTGA Sequenz 66: Nukleinsäuresequenz des humanen Lys-Plasminogen-Gens
AΆAGTGTATCTCTCAGAGTGCAAGACTGGGAATGGAAAGAACTACAGAGGGACGATGTCC AAAACAAΆAAATGGCATCACCTGTCAΆAAATGGAGTTCCACTTCTCCCCACAGACCTAGA TTCTCACCTGCTACACACCCCTCAGAGGGACTGGAGGAGAACTACTGCAGGAATCCAGAC AACGATCCGCAGGGGCCCTGGTGCTATACTACTGATCCAGAAAAGAGATATGACTACTGC GACATTCTTGAGTGTGAΆGAGGAATGTATGCATTGCAGTGGAGAAAACTATGACGGCAAΆ ATTTCCAAGACCATGTCTGGACTGGAATGCCAGGCCTGGGACTCTCAGAGCCCACACGCT CATGGATACATTCCTTCCAAATTTCCAACAΆGAACCTGAAGAAGAATTACTGTCGTAAC CCCGATAGGGAGCTGCGGCCTTGGTGTTTCACCACCGACCCCAACAAGCGCTGGGAACTT TGCGACATCCCCCGCTGCACAACACCTCCACCATCTTCTGGTCCCACCTACCAGTGTCTG AAGGGAACAGGTGAAAACTATCGCGGGAΆTGTGGCTGTTACCGTTTCCGGGCACACCTGT CAGCACTGGAGTGCACAGACCCCTCACACACATAACAGGACACCAGAAAACTTCCCCTGC AAAAATTTGGATGAAAACTACTGCCGCAATCCTGACGGAAAAAGGGCCCCATGGTGCCAT ACAACCAACAGCCAΆGTGCGGTGGGAGTACTGTAAGATACCGTCCTGTGACTCCTCCCCA GTATCCACGGAACAATTGGCTCCCACAGCACCACCTGAGCTAACCCCTGTGGTCCAGGAC TGCTACCATGGTGATGGACAGAGCTACCGAGGCACATCCTCCACCACCACCACAGGAAAG AAGTGTCAGTCTTGGTCATCTATGACACCACACCGGCACCAGAAGACCCCAGAAAACTAC CCAAATGCTGGCCTGACAATGAACTACTGCAGGAATCCAGATGCCGATAAAGGCCCCTGG TGTTTTACCACAGACCCCAGCGTCAGGTGGGAGTACTGCAACCTGAAAAAATGCTCAGGA ACAGAAGCGAGTGTTGTAGCACCTCCGCCTGTTGTCCTGCTTCCAGATGTAGAGACTCCT TCCGAAGAΆGACTGTATGTTTGGGAΆTGGGAAAGGATACCGAGGCAAGAGGGCGACCACT GTTACTGGGACGCCATGCCAGGACTGGGCTGCCCAGGAGCCCCATAGACACAGCATTTTC ACTCCAGAGACAAATCCACGGGCGGGTCTGGAAAAAAATTACTGCCGTAACCCTGATGGT GATGTAGGTGGTCCCTGGTGCTACACGACAAATCCAΆGAAAACTTTACGACTACTGTGAT GTCCCTCAGTGTGCGGCCCCTTCATTTGATTGTGGGAAGCCTCAAGTGGAGCCGAAGAAA TGTCCTGGAAGGGTTGTGGGGGGGTGTGTGGCCCACCCACATTCCTGGCCCTGGCAAGTC AGTCTTAGAΆCAΆGGTTTGGAATGCACTTCTGTGGAGGCACCTTGATATCCCCAGAGTGG GTGTTGACTGCTGCCCACTGCTTGGAGAAGTCCCCAAGGCCTTCATCCTACAAGGTCATC CTGGGTGCACACCAAGAAGTGAATCTCGAACCGCATGTTCAGGAAATAGAAGTGTCTAGG CTGTTCTTGGAGCCCACACGAAAAGATATTGCCTTGCTAAAGCTAAGCAGTCCTGCCGTC ATCACTGACAAAGTAATCCCAGCTTGTCTGCCATCCCCAAATTATGTGGTCGCTGACCGG ACCGAATGTTTCATCACTGGCTGGGGAGAAACCCAAGGTACTTTTGGAGCTGGCCTTCTC AAGGAAGCCCAGCTCCCTGTGATTGAGAATAAAGTGTGCAATCGCTATGAGTTTCTGAAT GGAAGAGTCCAATCCACCGAACTCTGTGCTGGGCATTTGGCCGGAGGCACTGACAGTTGC CAGGGTGACAGTGGAGGTCCTCTGGTTTGCTTCGAGAAGGACAAΆTACATTTTACAAGGA GTCACTTCTTGGGGTCTTGGCTGTGCACGCCCCAATAAGCCTGGTGTCTATGTTCGTGTT CAAGGTTTGTTACTTGGATTGAGGGAGTGATGAGAAATAATTGA Literaturverzeichnis
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Claims

Patentansprüche
1. Rekombinantes Herstellungsverfahren für ein funktionelles Plasminogen in Mikroorganismen, das mindestens den folgenden Schritt umfasst:
a) Fusion einer mindestens für den funktionellen Teil des Plasminogens kodierenden Nukleinsäuresequenz mit einer Nukleinsäuresequenz, die für mindestens ein Signalpeptid kodiert, wobei die für das funktionelle Plasminogen kodierende Nukleinsäuresequenz und die für mindestens das Signalpeptid kodierende Nukleinsäuresequenz mit Kodons für Schnittstellen von Proteasen verknüpft sind, welche die Abspaltung des Signalpeptids gewährleisten.
2. Rekombinantes Herstellungsverfahren gemäß Anspruch 1, wobei die für mindestens für den funktionellen Teil des Plasminogens kodierende Nukleinsäuresequenz die proteolytische Domäne von Plasminogen oder eine Mutante oder ein Fragment derselben enthält.
3. Rekombinantes Herstellungsverfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die für mindestens für den funktionellen Teil des Plasminogens kodierende Nukleinsäuresequenz für Glu- oder Lys-Plasminogen kodiert.
4. Rekombinantes Herstellungsverfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die für mindestens ein Signalpeptid kodierende Nukleinsäuresequenz für ein Präpropeptid, ein Präpeptid oder ein Propeptid kodiert und/oder wobei die Kodons für Schnittstellen von Proteasen für die Protease Kex 2 und/oder Ste 13 kodieren.
5. Rekombinantes Herstellungsverfahren gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass das für mindestens ein Signalpeptid kodierende Nukleinsauremolekul für das Signalpeptid des alpha-Faktors oder von SUC2, PHA-E oder PH01 aus der Hefe Saccharomyces cerevisiae kodiert.
6. Rekombinantes Herstellungsverfahren gemäß einem oder mehrerer der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens 20 mg/1 funktionelles Glu- oder Lys-Plasminogen hergestellt werden.
7. Rekombinantes Herstellungsverfahren gemäß einem oder mehrerer der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens 120 U/1 funktionelles Lys- Plasminogen nach einem Herstellprozess von 120 Stunden hergestellt werden.
8. Rekombinantes Herstellungsverfahren gemäß einem oder mehreren der vorstehenden Ansprüche, wobei als Primer für die Amplifikation zwei Oligonukleotid-Primer, ausgewählt aus der Gruppe umfassend N036a (Seq. ID No. 19), N036b (Seq. ID No. 20), N036c (Seq. ID No. 21), N036d (Seq. ID No. 22), N036e (Seq. ID No. 23), N036f (Seq. ID No. 24), N036g (Seq. ID No. 25), N036h (Seq. ID No. 26), N036i (Seq. ID No. 27) und N036J (Seq. ID No. 28), verwendet werden.
9. Rekombinantes Herstellungsverfahren gemäß einem oder mehreren der vorstehenden Ansprüche, wobei als Primer für die Amplifikation zwei Oligonukleotid-Primer, ausgewählt aus der Gruppe umfassend N034 (Seq. ID No. 1), N036 (Seq. ID No. 2), N057 (Seq. ID No. 3), N037 (Seq. ID No. 4), N035 (Seq. ID No. 5) und N056 (Seq. ID No. 6), sowie aus der Gruppe umfassend N036a (Seq. ID No. 19), N036b (Seq. ID No. 20), N036c (Seq. ID No. 21), N036d (Seq. ID No. 22), N036e (Seq. ID No. 23), N036f (Seq. ID No. 24), N036g (Seq. ID No. 25), N036h (Seq. ID No. 26), N036i (Seq. ID No. 27) und N036J (Seq. ID No. 28), verwendet werden.
10. Rekombinantes Herstellungsverfahren gemäß einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei das in Schritt a) entstandene Fusionsprodukt in einen für Mikroorganismen geeigneten Expressionsvektor eingefügt wird.
11. Rekombinantes Herstellungsverfahren gemäß Anspruch 10, wobei der Expressionsvektor für Pilze geeignet ist.
12. Rekombinantes Herstellungsverfahren gemäß Anspruch 10 oder 11, wobei der Expressionsvektor einen induzierbaren oder konstitutiven Promoter enthält.
13. Rekombinantes Herstellungsverfahren gemäß Anspruch 10 oder 11, wobei der Expressionsvektor den konstitutiven GAP-Promoter aus P. pastoris enthält.
14. Rekombinantes Herstellungsverfahren gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die so erhaltene Nukleinsäure ein Plasmid, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe pPLG11.2, pPLG12.1, pPLG13.1, pPLG14.2, pPLG15.1, pPLG16.3, pPLG17.2, pPLG18.1, pPLG19.2, pPLG20.1, pAC37.1, pJW9.1, pMHS476.1, pSM54.2, pSM49.8, pSM 82.1 und pSM58.1, ist.
15. Rekombinantes Herstellungsverfahren gemäß einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Kodons für die Schnittstelle der Protease Kex2 kodieren und das Plasminogen-Fusionsgen die in Seq. ID No. 7, 13, 50, 52, 54, 56 oder 58 dargestellte Nukleinsäureabfolge aufweist.
16. Rekombinantes Herstellungsverfahren gemäß einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Kodons für die Schnittstelle der Protease Kex2 kodieren und das Plasminogen-Fusionsprotein die in Seq. ID No. 8, 14, 40, 42, 44, 46 oder 48 dargestellte Aminosäureabfolge aufweist.
17. Rekombinantes Herstellungsverfahren gemäß einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Kodons für die Schnittstelle der Protease Kex2 und der Protease Stel3 kodieren und das Plasminogen-Fusionsgen die in Seq. ID. No. 9, 15, 51, 53, 55 oder 57 dargestellte Nukleinsäureabfolge aufweist.
18. Rekombinantes Herstellungsverfahren gemäß einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Kodons für die Schnittstelle der Protease Kex2 und der Protease Stel3 kodieren und das Plasminogen-Fusions-Protein die in Seq. ID No. 10, 16, 41, 43, 45, 47 oder 49 dargestellte Aminosäureabfolge aufweist.
19. Rekombinantes Herstellungsverfahren gemäß einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei ein zu den Mikroorganismen zählender Wirt mit dem in Anspruch 14 erhaltenen Plasmid transformiert wird.
20. Rekombinantes Herstellungsverfahren gemäß einem oder mehreren der vorstehenden Ansprüche, wobei der verwendete Wirtsorganismus ein eukaryontischer Mikroorganismus ist.
21. Rekombinantes Herstellungsverfahren gemäß Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass der verwendete Wirtsorganismus zur Abteilung der Pilze zählt.
22. Rekombinantes Herstellungsverfahren gemäß Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass der verwendete Wirtsorganismus zur Gattung Pichia, Saccharomyces, Hansenula, Candida oder Aspergillus zählt.
23. Rekombinantes Herstellungsverfahren gemäß Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass der verwendete Wirtsorganismus zur Art Pichia pastoris, Pichia methanolica, Hansenula polymorpha, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae oder Aspergillus nidulans zählt.
24. Rekombinantes Herstellungsverfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei aus einem mit dem in Schritt a) entstandenen Fusionsprodukt transformierten mikrobiellen Wirtsorganismus die für mindestens den funktionellen Teil des Plasminogens kodierende Nukleinsäuresequenz überexprimiert und mindestens der funktionelle Teil von Plasminogen sezerniert wird.
25. Rekombinantes Herstellungsverfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei der funktionelle Teil der Nukleinsäuresequenz von Plasminogen eine der Sequenzen Seq. ID No 60, 61, 62, 63, 64, 65 oder 66 ist.
26. Rekombinantes Herstellungsverfahren gemäß einem oder mehreren der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass ein humanes funktionelles Plasminogen hergestellt wird.
27. Rekombinantes Herstellungsverfahren gemäß einem oder mehreren der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass ein humanhomologes funktionelles Plasminogen hergestellt wird.
28. Plasmid pPLG11.2, Plasmid pPLG12.1, Plasmid pPLG13.1, Plasmid pPLG14.2, Plasmid pPLG15.1, Plasmid pPLG16.3, Plasmid pPLG17.2, Plasmid pPLG18.1, Plasmid pPLG19.2 oder Plasmid pPLG20.1.
29. Plasmid pMHS476.1, Plasmid pSM54.2, Plasmid pSM49.8, Plasmid pSM82.1
30. Plasmid pSM58.1, Plasmid pAC37.1, Plasmid pJW9.1
31. Nukleinsäuresequenz erhältlich durch das rekombinante Herstellungsverfahren gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 27, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäuresequenz, die mindestens für den funktionellen Teil von Plasminogen kodiert mit einem Promoter, der in Hefe aktiv ist und weiterhin mit einer Nukleinsäuresequenz, die für mindestens ein Signalpeptid kodiert, operativ verbunden ist, wobei die für das funktionelle Plasminogen kodierende Nukleinsäuresequenz und die für mindestens das Signalpeptid kodierende Nukleinsäuresequenz mit Kodons für die Schnittstellen der Proteasen Kex2 und Stel3 verknüpft sind.
32. Plasminogen erhältlich durch das rekombinante Herstellungsverfahren gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 27.
33. Plasminogen gemäß Absprach 32, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um Microplasminogen, Miniplasminogen, Lys-Plasminogen, Glu-Plasminogen oder ein Plasminogenderivat handelt.
34. Plasminogenderivat gemäß Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, dass es die funktionelle proteolytische Domäne des Plasminogens enthält und mindestens eine Deletion und/oder mindestens einen Aminosäureaustausch beinhaltt und/oder mit mindestens einer weiteren Aminosäure oder mindestens einem Peptid oder mindestens einem Protein fusioniert ist.
35. Plasminogenderivat gemäß Anspruch 33 oder 34, dadurch gekennzeichnet, dass es durch mindestens einen Plasminogenaktivator zu aktivem Plasmin aktiviert werden kann.
36. Plasminogenderivat gemäß einem der Anspruch 33 - 35, dadurch gekennzeichnet, dass es mindestens die funktionelle proteolytische Domäne von Plasminogen beinhaltet und eine Sequenzhomologie von über 80%», bevorzugt von über 90% und insbesondere bevorzugt von über 95% zu Micro-, Mini-, Lys- oder Glu-Plasminogen aufweist.
37. Plasmin erhältlich durch Aktivierung von Plasminogen oder einem Plasminogenderivat gemäß eines der Ansprüche 32 - 36 unter Verwendung von mindestens einem Plasminogenaktivator.
38. Mikrobieller Wirtsorganismus, enthaltend das in Schritt a) gemäß einem der Ansprüche 1 bis 27 erhaltene Fusionsprodukt oder eine davon abgeleitete Nukleinsäuresequenz.
39. Mikrobieller Wirtsorganismus gemäß Anspruch 38 dadurch gekennzeichnet, dass er ausgewählt ist aus der Gruppe Pichia pastoris, Pichia methanolica, Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae und Aspergillus nidulans.
40. Verwendung eines gemäß einem der Ansprüche 1 bis 27 hergestellten funktionellen Plasminogens und/oder dem daraus entstehenden Plasmin zur Herstellung eines Medikaments.
41. Verwendung eines gemäß einem der Ansprüche 1 bis 27 hergestellten funktionellen Plasminogens und/oder dem daraus entstehenden Plasmin zur Behandlung von Wunden, thrombotischen Ereignissen oder in der Vorbeugung thrombotischer Ereignisse.
42. Verwendung eines gemäß einem der Ansprüche 1 bis 27 hergestellten funktionellen Plasminogens und/oder dem daraus entstehenden Plasmin als anti-thrombotische sowie anti-koagulative Wirkstoffe.
43. Verwendung insbesondere gemäß Anspruch 42 zur Prophylaxe und/oder Behandlung von Herzinfarkt, Schlaganfall, Thrombose, Venenthrombosen, Restenose, Hypoxie, Ischämie, Koagulationsnekrose, Entzündungen der Blutgefäße, akuter Lungenembolie, akuter und subakuter arterieller Thrombosen, frischen oder älteren Gerinnsel bei Venenthrombosen, tiefen Venenthrombosen des Beckens und der Extremitäten, Frühthrombosen im Bereich desobliterierter Gefäße, akuter Zentralgefaßverschluss am Auge, Konjunktivitis bei Plasminogen Typ I-Mangel, Verbrennungen, Verätzungen und Erfrierungen, disseminierter intravasaler Gerinnung im Schock, akuter arterieller Verschlüsse der Extremitäten, chronisch occlusiver Arteriopathien, Thrombosierung von arteriovenösen Shunts sowie zur Behandlung nach einem Herzinfarkt, nach einer Bypass-Operation, nach einer Angioplastie sowie nach einer Ballondilatation, zur thrombolytischen Therapie beim akuten Herzinfarkt, zur Rekanalisierung arteriovenöser Shunts sowie zur Reperfusion verschlossener Koronararterien beim akuten Herzinfarkt.
44. Verwendung gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 40 bis 43 in Kombination mit einem Antikoagulant.
45. Verwendung gemäß Anspruch 44, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Antikoagulant um Heparin, Heparinderivate oder Acetylsalicylsäure handelt.
46. Verwendung eines gemäß einem der Ansprüche 1 bis 27 hergestellten funktionellen Plasminogens und/oder dem daraus entstehenden Plasmin zum Einbringen in Verbandsmaterialien, Pflaster oder zur Verwendung in Kombination mit Wundheilmitteln.
47. Verbandsmaterialien, Wundheilverbände und Pflaster enthaltend gemäß einem der Ansprüche 1 bis 27 hergestelltes funktionelles Plasminogen und/oder daraus gewonnenes Plasmin.
48. Verbandsmaterialien, Wundheilverbände und Pflaster gemäß Anspruch 47, enthaltend 0,01 - 500 U Plasminogen und/oder ein daraus entstehendes Plasmin pro cm2 pharmazeutischer Formulierung, bevorzugt 0,1 - 250 Units und insbesondere bevorzugt 1 - 150 Units Plasminogen und/oder ein daraus entstehendes Plasmin pro cm pharmazeutischer Formulierung.
49. Verwendung der Verbandsmaterialien, Wundheilverbände und Pflaster gemäß Anspruch 47 oder 48 zur Behandlung von Verbrennungen, Erfrierungen, Verätzungen, Verletzungen und/oder Wunden.
50. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend ein Plasminogen und/oder ein daraus entstehendes Plasmin, hergestellt gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 27, und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger, Zusatzstoff und/oder ein Lösungsmittel sowie gegebenenfalls antikoagulativen Wirkstoffen.
51. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 50, geeignet zur oralen, topischen oder parenteralen, intravasalen, insbesondere intravenösen, intraperitonealen, subkutanen oder intramuskulären Anwendung.
52. Pharmazeutische Zusammensetzung geeignet zur topischen Applikation gemäß Ansprach 51, enthaltend 0,01 - 500 U Plasminogen und/oder ein daraus entstehendes Plasmin pro Gramm der pharmazeutischen Zusammensetzung, bevorzugt 0,1 - 250 Units und insbesondere bevorzugt 1 - 150 Units Plasminogen und/oder ein daraus entstehendes Plasmin pro Gramm der pharmazeutischen Zusammensetzung.
53. Pharmazeutische Zusammensetzung geeignet zur oralen Applikation gemäß Ansprach 51, enthaltend 0,1 - 100.000 U Plasminogen und/oder ein daraus entstehendes Plasmin pro Gramm der pharmazeutischen Zusammensetzung, bevorzugt 100 - 80.000 Units und insbesondere bevorzugt 1.000 - 50.000 Units Plasminogen und/oder ein daraus entstehendes Plasmin pro Gramm der pharmazeutischen Zusammensetzung.
54. Pharmazeutische Zusammensetzung geeignet zur Injektion oder Infusion gemäß Anspruch 51, enthaltend 0,1 - 100 Millionen U Plasminogen und/oder ein daraus entstehendes Plasmin pro 10 ml Lösung, bevorzugt 1 - 10 Millionen Units und insbesondere bevorzugt 3 - 5 Millionen Units Plasminogen und/oder ein daraus entstehendes Plasmin pro 10 ml der Injektions- oder Infusionslösung.
55. Verwendung der pharmazeutischen Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 50 bis 54 zur Prophylaxe und/oder Behandlung von Herzinfarkt, Schlaganfall, Thrombose, Venenthrombosen, Restenose, Hypoxie, Ischämie, Koagulationsnekrose, Entzündungen der Blutgefäße, akuter Lungenembolie, akuter und subakuter arterieller Thrombosen, frischen oder älteren Gerinnsel bei Venenthrombosen, tiefen Venenthrombosen des Beckens und der Extremitäten, Frühthrombosen im Bereich desobliterierter Gefäße, akuter Zentralgef ßverschluss am Auge, Konjunktivitis bei Plasminogen Typ I-Mangel, Verbrennungen, Verätzungen und Erfrierungen, disseminierter intravasaler Gerinnung im Schock, akuter arterieller Verschlüsse der Extremitäten, chronisch occlusiver Arteriopathien, Thrombosierung von arteriovenösen Shunts sowie zur Behandlung nach einem Herzinfarkt, nach einer Bypass-Operation, nach einer Angioplastie sowie nach einer Ballondilatation, zur throrhbolytischen Therapie beim akuten Herzinfarkt, zur Rekanalisierang arteriovenöser Shunts sowie zur Reperfusion verschlossener Koronararterien beim akuten Herzinfarkt.
56. Vektor, umfassend das in Schritt a) gemäß Ansprach 1 erhaltene Fusionsprodukt oder eine davon abgeleitete Nukleinsäuresequenz.
57. DNA-Molekül, umfassend das in Schritt a) gemäß Ansprach 1 erhaltene Fusionsprodukt oder eine davon abgeleitete Nukleinsäuresequenz.
58. RNA-Molekül, umfassend das in Schritt a) gemäß Ansprach 1 erhaltene Fusionsprodukt oder eine davon abgeleitete Nukleinsäuresequenz.
59. Screeningverfahren zur Identifizierung von Plasminogenaktivatoren unter Verwendung des funktionellen Plasminogens gemäß Anspruch 36 oder 37.
60. Screeningverfahren gemäß Anspruch 59 dadurch gekennzeichnet, dass nach Vorinkubation der Proteasen mit dem funktionellen Plasminogen gemäß Anspruch 35 oder 36 die resultierende Plasmin- Aktivität gemessen wird.
61. Screeningverfahren nach Anspruch 59 oder 60, dadurch gekennzeichnet, dass die resultierende Plasmin- Aktivität mit einem synthetischen Peptidsubstrat gemessen wird.
62. Screeningverfahren nach Ansprach 61, dadurch gekennzeichnet, dass die resultierende Plasmin- Aktivität mit N-Tosyl-Gly-Pro-Lys-pNA gemessen wird.
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