CN109971736B - 与草莓软化相关的氨基己糖苷酶及编码基因、制备与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了两个来源于草莓(Fragaria×ananassa qing xiang)的氨基己糖苷酶基因序列及其制备方法和应用，即利用基因工程的技术方法，将该氨基己糖苷酶的基因克隆到毕赤酵母表达载体上，获得可异源表达该酶的毕赤酵母重组菌株，用该菌株异源表达制备的氨基己糖苷酶，能以p‑硝基苯基‑N‑乙酰‑β‑D‑氨基葡萄糖胺或P‑硝基苯基‑N‑乙酰‑β‑D‑氨基半乳糖胺为底物进行反应。本发明还提供了氨基己糖苷酶在控制采后果实软化及保鲜剂活性筛选方面的应用，属于果实保鲜领域。

Description

与草莓软化相关的氨基己糖苷酶及编码基因、制备与应用

技术领域

本发明属于果实保鲜领域，具体涉及两个与草莓软化相关的氨基己糖苷酶编码基因及其制备与应用。本发明提供了两个草莓氨基己糖苷酶的重组质粒和重组基因工程菌株，还提供了草莓氨基己糖苷酶在草莓保鲜剂筛选和糖链降解方面的应用。

背景技术

草莓属蔷薇科草莓属的多年生草本植物，是经济价值较高的小浆果，果实柔软多汁，因富含多种人体必需营养物质，在我国素有“水果皇后”的美誉。然而草莓含水量高、果皮薄，耐贮藏性差，采后极易因机械损伤和病菌侵染而腐烂变质，常温下仅可保存1-3天即失水萎缩，逐渐软化腐烂。由于草莓成熟期短,上市集中，耐贮性差,缩短了销售期及供应加工时间,限制了草莓的远销和草莓种植业规模化发展。因此,延长草莓果实的贮藏期或货架寿命,是生产中急待解决的问题。目前控制草莓采后保鲜的最有效手段是冷藏结合化学杀菌剂处理，但由于化学杀菌剂残留带来的诸多食品安全问题，迫切需要研究新型的绿色环保采后保鲜剂。然而高效的保鲜剂筛选方法的缺乏成为限制绿色环保保鲜剂开发的主要技术瓶颈。

果实采后的成熟软化作为果实一项重要的生命活动，是一个极其复杂而又受到高度调控的发育过程。大量研究表明这一过程是由内在和外部环境因素所共同决定的主动过程，因而可以通过发现控制果实采后保鲜的关键因子，建立基于这些关键因子的保鲜剂筛选方法。乙烯是调节呼吸跃变型果实成熟的重要植物激素，可以经过系列的信号传递和一定的内部机制控制果实的成熟软化。因此研究人员以是否可以将果实自身乙烯信号途径进行阻断，开发了系列乙烯阻断类保鲜剂，目前广泛应用的1-MCP，即为乙烯途径的阻断剂，能有效抑制蔬果产生的乙烯，从而大大的延长了蔬果的贮藏期，同时有效的减少了果蔬的腐烂。然而草莓属于非呼吸跃变型果实，乙烯在这类果实成熟软化过程中并不发挥关键作用，因此以乙烯途径阻断为作用靶点的保鲜剂筛选方法并不适合草莓保鲜剂的开发。

β-D-N乙酰己糖胺酶(β-N-Acetylhexosaminidase/β-hexosaminidase，β-hex)(EC3.2.1.52)属于糖苷水解酶20家族成员，水解位于N-糖蛋白非还原性末端的N-乙酰-D-己糖胺残基(N-acetylglucosamine，GlcNAc)。β-hex的酶活性在果实成熟软化过程中显著上升，这在西红柿、辣椒中都有报道。研究人员利用RNAi技术抑制了番茄和辣椒中β-hex基因的表达，结果转基因果实衰老软化速率下降，果实硬度提高了近2倍，货架期延长；而过表达该基因的果实衰老软化时间提前，软化速率加快。然而目前在草莓中β-hex的酶及编码基因还尚无报道，其在草莓软化过程中的变化规律如何尚不清楚，更没有将其应用于草莓保鲜剂筛选的相关报道。

本专利提供了两个与草莓软化相关的氨基己糖苷酶及其编码基因，基于这两种酶的基因和酶活的表达在草莓采后软化过程中的变化规律，本专利提供了一种草莓保鲜剂的筛选方法，具体是将氨基己糖苷酶的基因表达作为草莓保鲜剂的筛选指标，通过对该基因的抑制作用情况，判断化合物的保鲜作用。这是首次将氨基己糖苷酶作为调控作用靶标的，一种基于调控果实内在成熟软化机制的保鲜剂筛选方法，这种筛选方法具有针对性强、高效、安全、快捷的优势，具有很高的实用价值和应用前景，解决了现有技术中针对草莓果实的保鲜剂筛选方法缺乏的问题，对于非呼吸跃变型果实的保鲜剂筛选也具有借鉴意义。本专利同时还提供了两个草莓氨基己糖苷酶的重组质粒和重组基因工程菌株，及重组氨基己糖苷酶在糖链降解中的应用。

发明内容

本发明的第一个目的是提供两个草莓来源的氨基己糖苷酶β-hex1与β-hex2及其编码基因。

本发明的第二个目的是提供一种制备氨基己糖苷酶β-hex1与β-hex2的方法。

本发明的第三个目的是提供氨基己糖苷酶在草莓保鲜剂筛选中的应用。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

本发明所提供的氨基己糖苷酶基因β-hex1，来源于草莓(Fragaria×ananassaqing xiang)，其核苷酸序列具有如下特征中的一种或二种：

1)具有序列表中SEQ ID NO.1的脱氧核糖核酸(DNA)序列；

2)编码SEQ ID NO.2氨基酸序列的脱氧核糖核酸(DNA)序列；

3)对序列表中SEQ ID NO.1的脱氧核糖核酸(DNA)序列进行一个或几个核苷酸取代、缺失或添加而得到的编码具有氨基己糖苷酶活性的核苷酸序列。

本发明所提供的氨基己糖苷酶基因β-hex2，来源于草莓(Fragaria×ananassaqing xiang)，其核苷酸序列具有如下特征中的一种或二种：

1)具有序列表中SEQ ID NO.3的脱氧核糖核酸(DNA)序列；

2)编码SEQ ID NO.4氨基酸序列的脱氧核糖核酸(DNA)序列；

3)对序列表中SEQ ID NO.3的脱氧核糖核酸(DNA)序列进行一个或几个核苷酸取代、缺失或添加而得到的编码具有氨基己糖苷酶活性的核苷酸序列。

本发明还提供了草莓氨基己糖苷酶β-hex1的氨基酸序列，具有如下特征中的一种或二种以上：

1)序列表SEQ ID NO.2从氨基端开始的第66-597位氨基酸残基序列；

2)对序列表中SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列进行一个或几个氨基酸取代、缺失或添加而形成的具有氨基己糖苷酶活性的氨基酸序列。

本发明提供的草莓氨基己糖苷酶β-hex2的氨基酸序列，具有如下特征中的一种或二种以上：

1)序列表中SEQ ID NO.4从氨基端开始的第64-637位氨基酸残基序列；

2)对序列表中SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列进行一个或几个氨基酸取代、缺失或添加而形成的具有氨基己糖苷酶活性的氨基酸序列。

本发明还提供了制备重组酶β-hex1和β-hex2的方法，是将氨基己糖苷酶的基因克隆入重组表达载体，导入宿主细胞，获得重组表达的氨基己糖苷酶；所述的重组表达载体，是指酵母表达载体、枯草杆菌表达载体、植物表达载体、昆虫表达载体、或哺乳动物细胞表达载体。

用于重组表达氨基己糖苷酶的重组菌或转基因细胞系，是指酵母菌宿主细胞(如Saccharomyces cerevisiae、Pichia pastoris、Kluyveromyces lactis等)、枯草杆菌宿主细胞(如Bacillus subtilis R25、Bacillus subtilis 9920等)、昆虫细胞(如Bombyxmori，Antharaea eucalypti等)，哺乳动物细胞(如中国仓鼠卵巢细胞CHO，幼小仓鼠肾脏细胞BHK、中国仓鼠肺细胞CHL等)中的一种。

本发明所提供的重组酶β-hex1和β-hex2为N-糖基化修饰蛋白。

本发明还提供了一种以上述氨基己糖苷酶基因作为检测指标的，草莓保鲜剂的筛选方法。在草莓采后贮藏期，上述的氨基己糖苷酶基因和酶活都显著升高，可应用于采后草莓保鲜剂的筛选，具体是将氨基己糖苷酶的基因表达作为草莓保鲜剂的筛选指标，通过对该基因的抑制作用情况，判断化合物的保鲜作用。

本发明同时也提供了重组氨基己糖苷酶的几种用途，具体如下：

1)用于断裂几丁质或几丁寡糖的β-1,4糖苷键，获得氨基葡萄糖；

2)用于断裂糖蛋白上修饰糖链中末端乙酰氨基葡萄糖的水解，进行糖链构型解析；

3)用于杀虫剂。

本发明具有的优点和有益效果：

本专利提供的草莓保鲜剂筛选方法，通过将草莓氨基己糖苷酶的基因表达作为草莓保鲜剂的筛选指标，由外源物质对该基因的抑制作用，来判断化合物的保鲜作用。是首次将氨基己糖苷酶作为调控作用靶标的，一种基于调控果实内在成熟软化机制的保鲜剂筛选方法，这种筛选方法具有针对性强、高效、安全、灵敏、快捷的优势，具有很高的实用价值和应用前景，解决了现有技术中针对草莓果实的保鲜剂筛选方法缺乏的问题，对于非呼吸跃变型果实的保鲜剂筛选也具有借鉴意义。

附图说明

图1：β-Hex1与β-Hex2琼脂糖凝胶电泳图；

图2：β-Hex1与β-Hex2表达及纯化的SDS-PAGE图；A:1：β-Hex1表达；2：Mark；3：β-Hex2表达。B：β-Hex1纯化图：1：流穿液；2:20mM；3:40mM；4:60mM；5:80mM；6:100mM；7：Mark。C：β-Hex2纯化图：1：浓缩液；2：流穿液；3:20mM；4:40mM；5:60mM；6:80mM；7:100mM；8：Mark。

图3：PNGaseF酶切重组β-Hex1，β-Hex2的SDS-PAGE图；1：β-hex1纯化蛋白；9：β-hex2纯化蛋白；2：β-hex1对照(不加酶)8：β-hex2对照(不加酶)；3：β-hex1实验组(变性条件)7:β-hex2实验组(变性条件)；4：β-hex1实验组(天然条件)6:β-hex2实验组(天然条件)；5：Mark。

图4：预测β-hex1(左)，β-hex2(右)PyMOL蛋白模型结构图；

图5：温度对β-Hex1，β-Hex2酶活的影响

图6：pH对β-Hex1，β-Hex2酶活的影响

图7：实施例9中β-Hex在草莓采后成熟软化阶段酶活力变化图

图8：实施例9中β-Hex1和β-Hex2在草莓采后成熟软化阶段基因表达变化图

图9：实施例9中草莓采后成熟过程中果实硬度变化图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明进一步说明

实施例1草莓氨基己糖苷酶β-hex1与β-hex2全长基因克隆

对NCBI数据库中氨基己糖苷酶基因序列进行多序列比对分析，设计RF克隆引物：

β-hex1-FR-F:5’GGGTATCTCTCGAGAAAAGAAAAGTCAAAGCCCCCGTCACGTA-3’

β-hex1-FR-R:5’-TCAATGATGATGATGATGATGTTGAACGTAACACGAGC-3’

β-hex2-FR-F:5’-GGGTATCTCTCGAGAAAAGATCCATCAATGTGTGGCCC-3’

β-hex2-FR-R:5’-TCAATGATGATGATGATGATGAGCCACATTAACTGTG-3’

提取草莓(Fragaria×ananassa qing xiang)的mRNA，以反转后的cDNA为模板，扩增编码氨基己糖苷酶β-hex1与β-hex2的基因序列(不包括信号肽基因)。PCR反应条件为：94℃ 3min，1个循环；94℃ 30s，65℃ 30s每个循环降0.5℃，72℃ 3min，30个循环；72℃5min，1个循环。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析后(见图1)，对目的片段进行切胶回收。

实施例2重组质粒pPICZαA-β-Hex1，pPICZαA-β-Hex2的构建

将纯化的PCR产物与T载体pMD19-T进行TA连接，连接产物转化E.coli Top10，经筛选和菌落PCR鉴定获得阳性克隆子，同时提取质粒测序。将测序正确的质粒和空载体pPICZαA(购自Invitrogen公司)分别用限制性内切酶Xho I和Not I进行双酶切，胶回收试剂盒纯化酶切产物，在T4DNA连接酶的作用下，将纯化的酶切产物进行连接，连接产物转化大肠杆菌Top10感受态细胞后，涂布于含有25μg/ml博来霉素(Zeocin，Invitrogen公司)的LLB(酵母粉5g/L，胰蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L，琼脂粉15g/L)固体培养基上，37℃培养12h，菌落PCR进行验证。挑取阳性单克隆接入含有25μg/ml Zeocin的液体LLB培养基中培养，提取质粒。将重组质粒分别用限制性内切酶Xho I和Not I进行酶切，1％琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，得到条带大小正确的酶切产物，初步证明构建的重组质粒正确，然后将该重组质粒送去测序，测序结果表明构建的重组质粒正确。

实施例3重组质粒电转化至毕赤酵母X-33

测序正确的重组质粒分别命名为pPICZαA-β-Hex1和pPICZαA-β-Hex2，采用质粒抽提试剂盒进行质粒的提取。用限制性内切酶SacI对抽提的重组质粒进行线性化。将纯化后的线性化重组质粒pPICZαA-β-Hex1和pPICZαA-β-Hex2分别电转化到毕赤酵母受体菌X-33中，进行培养，单菌落出现后，挑取进行菌落PCR验证。PCR扩增产物用1琼脂糖电泳检测。

实施例4重组菌株的诱导表达

将阳性克隆单菌落接种至20ml BMGY(酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，YNB13.4g/L，10％甘油100ml，4×10^-5％生物素，100.0mM pH 6.0的磷酸盐缓冲液100ml)培养基中，30℃，220rpm培养至OD600＝2-6，4℃1500rpm离心10min，收集菌体，用BMMY重悬菌体，纱布封口，放于摇床中，30℃，220r/min进行诱导表达。每24h向培养基中添加无水甲醇100μL。分别于：0h、24h、48h、72h、96h进行取样。取样量为80μL，12 000g离心5min，收集上清。诱导96h后，4℃，12000rpm离心10min收集上清，SDS-PAGE检测诱导表达效果，如图所示，两个酶都表达成功，分子量大小不同，但很接近，在70-90kDa之间(图2A)，比预期蛋白的理论分子量大(预期分子量约69.54kDa/71kDa)，推测这与蛋白翻译后糖基化修饰有关。

实施例5重组表达蛋白的纯化及功能验证

按照GE Healthcare公司提供的纯化方法用Ni-NTAsepharose^TM excel column对上清进行纯化，获得纯化蛋白。纯化过程为：5倍体积Binding缓冲液(50mM醋酸钠缓冲液，pH7.4，300mM NaCl，10mM咪唑)预先冲洗柱子，上清过Ni-NTA柱后，依次用Binding缓冲液、和不同浓度的咪唑洗脱缓冲液洗脱目的蛋白，SDS-PAGE检测纯化效果。SDS电泳图上(图2B，图2C)，约80kDa处呈现较清晰的蛋白条带，其它位置未见蛋白条带，表明纯化的效果很好，BCA蛋白浓度试剂盒进行蛋白浓度的测定。

实施例6重组氨基己糖苷酶活性的测定

酶活测定方法：50uL缓冲液，200uL底物于50℃水浴5min后，加入适量重组酶，50℃水浴15min，加1mL 500mM碳酸钠终止反应，在410nm处测定吸光值。以每分钟产生1nmol的对硝基苯酚的量为一个酶活力单位。β-氨基已糖胺酶底物为p-nitrophenyl-D-N-acetylglucosaminopyranoside(pNP-GlcNAc)。

实施例7重组β-氨基已糖胺酶N-糖基化修饰的鉴定

用糖苷酶PNGase F对纯化的β-Hex进行酶切处理。从图3中可以看出，纯化β-Hex1，β-Hex2的分子量约80kDa，比预期蛋白理论分子量69，71kDa大。当用糖苷酶PNGase F在变性条件下对β-Hex1，β-Hex2进行酶切处理后，β-Hex1，β-Hex2的分子量降低到大约70kDa，与预期蛋白理论分子量相符，说明β-Hex1，β-Hex2是N-糖基化修饰的蛋白。当用糖苷酶PNGase F在天然条件下对β-Hex1，β-Hex2进行酶切处理后，β-Hex1，β-Hex2的分子量有所降低(约70kDa)，与变性条件下一致，说明β-Hex1，β-Hex2都有N-糖基化修饰位点，且糖链并未产生空间位阻，在天然条件下，糖苷酶PNGase F能接近糖基化位点，将糖链切除。为了明确去N-糖基化对酶β-Hex1，β-Hex2活性影响，用PNGaseF酶对β-Hex1，β-Hex2处理前后的酶进行了活性检测，结果显示用PNGaseF酶切之后，糖基化酶β-Hex1，β-Hex2的活性大幅降低，去糖基化的β-Hex1，β-Hex2的酶活性降低为糖基化酶的10.03％和27.48％，说明糖基化对于β-Hex1，β-Hex2的活性保持非常重要。

实施例8重组表达蛋白酶学性质研究

(1)温度对酶活的影响

以pNP-GlcNAc为底物进行酶活力测定，在20-70度范围内，随着反应温度的逐渐升高，β-Hex1，β-Hex2酶的活性呈现出先升高然后逐渐下降的趋势，当反应温度为50℃时，β-Hex1，β-Hex2酶的活性均达到最大值。本实验结果说明β-Hex1，β-Hex2酶活的最适温度为50℃。随着反应温度的下降或上升，β-Hex1，β-Hex2酶的相对活性明显下降(图5)。

(2)pH对酶活的影响

以pNP-GlcNAc为底物进行酶活力测定，在pH2-7范围内，随着反应pH的逐渐升高，β-Hex1，β-Hex2酶的活性呈现出先逐渐升高然后逐渐下降的趋势，β-Hex1、β-Hex2分别在pH4和pH 5时，活性达到最大值。当pH较小时β-Hex1，β-Hex2的酶活相对较高，当pH升高到5以后时酶活迅速降低(图6)。

实施例9草莓β-氨基已糖苷酶酶活和基因在草莓采后贮藏期的变化规律

根据克隆得到的草莓β-氨基已糖苷酶的基因序列，设计qPCR引物如下：

β-hex1-F GTTCCACCTACTCTTCATACCCT

β-hex1-R CTGCACCACAACTCTGACTTTA

β-hex2-F CATTCTTTCCCGCTAGTCGTG

β-hex2-R AGATGTCCTGTTCCTGGTTCG

使用荧光实时定量PCR仪，按SYBR Green Supermix说明进行RT-qPCR扩增反应，检测采后草莓不同贮藏时间β-hex1和β-hex2的基因表达情况。结果显示在6天的贮藏时间内，随着贮藏时间的增加，β-Hex1、β-Hex2的基因表达量均呈现逐渐升高的趋势，在采后第6天表达量最高。

进行草莓中β-氨基已糖苷酶粗酶的提取，取果肉，放入研钵中加液氮充分研磨，转到离心管中。加入8m/L醋酸缓冲液，并加入0.5％PVP，于4℃过夜提取。酶活测定方法同实施例6。测定结果显示，随着贮藏时间的增加，在考察时间内，草莓中β-氨基已糖苷酶粗酶活性呈现逐渐增加的趋势。

实验同时检测了草莓在贮藏期硬度的变化，随着贮藏时间的增加，草莓的硬度呈现下降的趋势，采后第6天硬度降低至1.15N，仅为采摘当天的25.6％。草莓中β-Hex基因表达量与果实硬度呈负相关。

实施例10.以氨基己糖苷酶为指标的草莓寡糖类保鲜剂筛选

由于草莓在采后贮藏第4天的硬度值和氨基己糖苷酶基因的表达量和采摘当天相比发生显著变化。因此本实施例中用不同浓度的壳寡糖、清水及过氧乙酸对采后草莓进行浸泡处理(1min)，晾干，之后常温贮藏。所用草莓是经过严格挑选后的，无破损无腐烂，新鲜度一致，成熟度约7成熟的果实。每组草莓为45颗，其中10颗用作为采后4天氨基己糖苷酶基因的测定，具体方法参照实施例9，30颗用于硬度的测定(TMS-PRO型质构仪)，另每组取5颗，共30颗，不经处理，进行采摘当天硬度的测定及氨基己糖苷酶基因表达量的测定。

结果如表1显示，COS50ppm和100ppm浓度处理之后β-Hex的基因表达与对照组相比受到显著的抑制，相应的水果的硬度与对照相比也呈现较明显的减缓软化。基因表达量的抑制程度与果实硬度的下降基本呈相反趋势，但是基因表达量变化相对于硬度的变化更显著、灵敏，提示该基因可作为保鲜剂筛选指标。

表1.不同处理对草莓贮藏4天后β-Hex基因表达量和硬度变化的影响

序列表

SEQ ID NO.1

氨基己糖苷酶β-Hex1脱氧核糖核酸序列

(a)序列特征

长度：1812核苷酸

类型：核苷酸

链型：单链

(b)分子类型：DNA

·ATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCTGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTCCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTATCTCTCGAGAAAAGAAAAGTCAAAGCCCCCGTCACGTACTTATGGCCGTTGCCGGCGGAGTATACTTCCGGCAACGAGACGCTCTCCGTTGACCCGGCGCTATCTCTCGTCGTCGGCGGGAACGGGGGCGGCTCCGGCATTCTGAAGGTAGCGTTTGATCGCTACAAGGCGATTATATTTAATGGGGTTAGTGGGATTGGTAGGATCAAGCAAAAGAAGGGGAGCTATGATATTAGTAAAGTCAGAGTTGTGGTGCAGTCTGCGAGCGAAGATCTTAATCTTGGTGTGGATGAGAGCTATACTCTGTTTGTGTTGAGGAAAGATGGGAAAGCTATTGTCGGGGAGGCGACTATTGAGGCAAATACAGTGTATGGTGCGCTGCGGGGGTTAGAGACGTTCAGCCAGCTGTGCACTTTTAACTATGAGACTAAATCAATGCAAGTACATAAGTCACCCTGGAACATACGAGACAAACCCAGGTTTGCATATCGAGGGCTCTTGCTTGATACATCAAGGCACTATTTACCAATTGACGTAATTAAGCAAGTAATTGAATCAATGTCATATGCTAAACTTAATGTTCTTCATTGGCACGTCATTGATAAAGAGTCATTTCCTCTAGAAGTACCTACATTTCCCAAATTGTGGAAAGGTTCATATTCACAGTGGGAGAGATACACCGTCGAAGATGCATATGAAGTTGTCAACTTTGCAAAAACTAGAGGCATCAATGTTATGGCAGAAGTAGATGTCCCTGGTCATGCAGAATCATGGGGCACTGGATATCCTGATCTCTGGCCTTCCTCTTCCTGTACCCAGCCTCTTGATGTTTCAAAGAATTTCACTTTTGACGTGCTTTCTGGCATTCTGACAGATTTGAGAAAGATTTTCCCCTTCGAGCTTTTCCACTTGGGTGGTGATGAAGTTAATACAACTTGCTGGGAAGATACTCCACATGTAAATAAATGGCTTGAGCAACAGAACATGACTGCCAAAGGCGCCTATCAATATTTTGTTCTCAAAGCACAAGAAATAGCTATTTCCAAAAATTGGACCCCTGTCAACTGGGAAGAAACCTTCAACACCTTCCCAACGAAGCTCAATCCAAAGACTGTAGTGCATAACTGGTTGGGGGGAGGGGTTTGTCCAAAGGCCGTTGATCAAGGTTTCAGATGCATTTTCAGCAATCAAGGTGTTTGGTATCTTGACCATCTAGATGTCCCTTGGGATGTTACGTACAATGCTGATCCACTTGAAGGAATACATGATTCTTCCAAGCAAAAGCTTGTCCTGGGAGGTGAAGTATGCATGTGGGGTGAGACTGCTGATCCATCAAATGTTCAGCAAACAATATGGCCTCGAGCTGCAGCAGCTGCAGAGCGCCTGTGGAGCACAAAGGAGTCGACTACTGGAAAAAGTAGTAACAAAACCGCGCTACCTCGGCTACACTACTTCAGATGCCTTTTGAATAGGCGTGGAGTTCAAGCCGCTCCAGTTGAAAACTTCTATGCTCGAAGTGCACCAACTGGTGCTGGCTCGTGTTACGTTCAACATCATCATCATCATCATTGA

SEQ ID NO.2

氨基己糖苷酶β-Hex1氨基酸序列

(a)序列特征

长度：603氨基酸

类型：氨基酸

链型：单链

(b)分子类型：蛋白

·MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVSLEKRKVKAPVTYLWPLPAEYTSGNETLSVDPALSLVVGGNGGGSGILKVAFDRYKAIIFNGVSGIGRIKQKKGSYDISKVRVVVQSASEDLNLGVDESYTLFVLRKDGKAIVGEATIEANTVYGALRGLETFSQLCTFNYETKSMQVHKSPWNIRDKPRFAYRGLLLDTSRHYLPIDVIKQVIESMSYAKLNVLHWHVIDKESFPLEVPTFPKLWKGSYSQWERYTVEDAYEVVNFAKTRGINVMAEVDVPGHAESWGTGYPDLWPSSSCTQPLDVSKNFTFDVLSGILTDLRKIFPFELFHLGGDEVNTTCWEDTPHVNKWLEQQNMTAKGAYQYFVLKAQEIAISKNWTPVNWEETFNTFPTKLNPKTVVHNWLGGGVCPKAVDQGFRCIFSNQGVWYLDHLDVPWDVTYNADPLEGIHDSSKQKLVLGGEVCMWGETADPSNVQQTIWPRAAAAAERLWSTKESTTGKSSNKTALPRLHYFRCLLNRRGVQAAPVENFYARSAPTGAGSCYVQHHHHHH

SEQ ID NO.3

氨基己糖苷酶β-Hex2脱氧核糖核酸序列

(a)序列特征

长度：1932核苷酸

类型：核苷酸

链型：单链

(b)分子类型：DNA

·ATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCTGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTCCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTATCTCTCGAGAAAAGATCCATCAATGTGTGGCCCATGCCAAGAAACTTCTCGTGGCCTCAGCCGCAGGCCAACCCCCTCTCCCCTAATTTCAACATCATATCCCCAGATCATCGCTACCTCTCCTCCGCCGCCAAACGCTACCAGCATCTTATTCTCACCGAGCACCACCGCCCCCTGGTGAACCCCTCCTCCTCCGTCCGCCTCAACACTTCTGCTCCGCCGCTGCTCAGCCTCGCCATCACAGTTTCCGACCTCACCGCTCCGCTTCACCATGGTGTGGACGAGTCGTACACGCTTACGATCCCCGCCGCCGGGGGAACCGCCCATCTGACGGCGCAGACCGCATGGGGCGCCATGAGGGGTCTCGAGACATTGTCGCAGCTGGTGTGGGGGGATCCGTCCCTTGTGGCCGTGGGGGTGTACGTGTGGGACTCCCCACTGTTCGGGCACAGAGGGCTCATGCTTGACACTTCTAGGAACTACTACCAAGTTGAGGATTTGCTTAGGACCATCGAGGCCATGAGCGCCAATAAGCTCAATGTGTTCCATTGGCACATCACCGACTCCCATTCTTTCCCGCTAGTCGTGCCTTCCGAGCCTGAATTGGCCTCCAAAGGGTCCTATGGATCTAGTATGCAGTACTCTCCCGCTGATGTCACCAAGATTGTCGAGTTTGGTTTGGAGCATGGTGTCCGGGTTCTCCCGGAAATCGACTCACCTGGCCATACAGGATCATGGGCTGCAGCCTATCCCGATATAGTATCATGCGCAAATATGTTCTGGTGGCCAGCAGGAGCTGTCTGGGGTGACCGACTCGCGTCCGAACCAGGAACAGGACATCTAAATCCTTTGAACCCCAAGACCTATCAAGTAATCAAAAACGTTATCCATGACGTGGCGACATTATTCCCTGAACCATTTTACCATGCGGGTGCTGATGAGATCATACCAGGTTGTTGGAAAGCGGATCCAACCATTCAATCCTTCTTATCTAAGGGAGGAACTCTTAGTCAGCTACTTGAGCTTTTTGTCAATTCCACATTCCCTTACATTGTATCTCATAACAAGACAGTGGTATACTGGGAAGACGTGTTACTAGATGATAACATTAAGGTGCAATCATCAGTTCTTCCTCGAGAGAGTACCATCCTACAGACATGGAACAATGGACACAACAACACTAAACGAATTGTGTCTTCTGGGTACCGTACAATTGTGTCATCCTCAGATTTCTACTACTTGGATTGTGGTCACGGTGACTTTCTTGGAAACGATAGCATGTACGATCAACAAACTCCTAGTCATGACACAAAAAATGGAGGGTCATGGTGCGGGCCTTTCAAAACATGGCAAACCATATATAATTATGATATTACATATGGTCTAACTGAGGATGAGGCTAAATTGGTATTAGGTGGAGAGGTGGCGCTTTGGTCTGAGCAAGCGGATCCAACAGTTTTGGATGCACGAATTTGGCCACGAGCTTCAGCAATGGCAGAGTCATTGTGGTCAGGTAACCGGGATGATAAAGGTATGAAGAGATTTGGAGAGGCAACTGATCGCTTCAATGAATGGAGGAGTAGAATTGTCGATAGAGGTGTCAGAGCTGAACCTATTCAGCCACTTTGGTGTATTAGGAACCCAGGGATGTGCAACACAGTTAATGTGGCTCATCATCATCATCATCATTGA

SEQ ID NO.4

氨基己糖苷酶β-Hex2氨基酸序列

(a)序列特征

长度：643氨基酸

类型：氨基酸

链型：单链

(b)分子类型：蛋白

·MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVSLEKRSINVWPMPRNFSWPQPQANPLSPNFNIISPDHRYLSSAAKRYQHLILTEHHRPLVNPSSSVRLNTSAPPLLSLAITVSDLTAPLHHGVDESYTLTIPAAGGTAHLTAQTAWGAMRGLETLSQLVWGDPSLVAVGVYVWDSPLFGHRGLMLDTSRNYYQVEDLLRTIEAMSANKLNVFHWHITDSHSFPLVVPSEPELASKGSYGSSMQYSPADVTKIVEFGLEHGVRVLPEIDSPGHTGSWAAAYPDIVSCANMFWWPAGAVWGDRLASEPGTGHLNPLNPKTYQVIKNVIHDVATLFPEPFYHAGADEIIPGCWKADPTIQSFLSKGGTLSQLLELFVNSTFPYIVSHNKTVVYWEDVLLDDNIKVQSSVLPRESTILQTWNNGHNNTKRIVSSGYRTIVSSSDFYYLDCGHGDFLGNDSMYDQQTPSHDTKNGGSWCGPFKTWQTIYNYDITYGLTEDEAKLVLGGEVALWSEQADPTVLDARIWPRASAMAESLWSGNRDDKGMKRFGEATDRFNEWRSRIVDRGVRAEPIQPLWCIRNPGMCNTVNVAHHHHHH

本发明将两个来源于草莓(Fragaria×ananassa qing xiang)的氨基己糖苷酶基因克隆到毕赤酵母表达载体上，获得可异源表达该酶的毕赤酵母重组菌株，用该菌株异源表达制备的氨基己糖苷酶，能以p-硝基苯基-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖胺或P-硝基苯基-N-乙酰-β-D-氨基半乳糖胺为底物进行反应。本发明还提供了氨基己糖苷酶在控制采后果实软化及保鲜剂活性筛选方面的应用，属于果实保鲜领域。

序列表

<110> 中国科学院大连化学物理研究所

<120> 与草莓软化相关的氨基己糖苷酶及编码基因、制备与应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1812

<212> DNA

<213> 草莓(Fragaria×ananassa qing xiang)

<400> 1

atgagatttc cttcaatttt tactgctgtt ttattcgcag catcctccgc attagctgct 60

ccagtcaaca ctacaacaga agatgaaacg gcacaaattc cggctgaagc tgtcatcggt 120

tactcagatt tagaagggga tttcgatgtt gctgttttgc cattttccaa cagcacaaat 180

aacgggttat tgtttataaa tactactatt gccagcattg ctgctaaaga agaaggggta 240

tctctcgaga aaagaaaagt caaagccccc gtcacgtact tatggccgtt gccggcggag 300

tatacttccg gcaacgagac gctctccgtt gacccggcgc tatctctcgt cgtcggcggg 360

aacgggggcg gctccggcat tctgaaggta gcgtttgatc gctacaaggc gattatattt 420

aatggggtta gtgggattgg taggatcaag caaaagaagg ggagctatga tattagtaaa 480

gtcagagttg tggtgcagtc tgcgagcgaa gatcttaatc ttggtgtgga tgagagctat 540

actctgtttg tgttgaggaa agatgggaaa gctattgtcg gggaggcgac tattgaggca 600

aatacagtgt atggtgcgct gcgggggtta gagacgttca gccagctgtg cacttttaac 660

tatgagacta aatcaatgca agtacataag tcaccctgga acatacgaga caaacccagg 720

tttgcatatc gagggctctt gcttgataca tcaaggcact atttaccaat tgacgtaatt 780

aagcaagtaa ttgaatcaat gtcatatgct aaacttaatg ttcttcattg gcacgtcatt 840

gataaagagt catttcctct agaagtacct acatttccca aattgtggaa aggttcatat 900

tcacagtggg agagatacac cgtcgaagat gcatatgaag ttgtcaactt tgcaaaaact 960

agaggcatca atgttatggc agaagtagat gtccctggtc atgcagaatc atggggcact 1020

ggatatcctg atctctggcc ttcctcttcc tgtacccagc ctcttgatgt ttcaaagaat 1080

ttcacttttg acgtgctttc tggcattctg acagatttga gaaagatttt ccccttcgag 1140

cttttccact tgggtggtga tgaagttaat acaacttgct gggaagatac tccacatgta 1200

aataaatggc ttgagcaaca gaacatgact gccaaaggcg cctatcaata ttttgttctc 1260

aaagcacaag aaatagctat ttccaaaaat tggacccctg tcaactggga agaaaccttc 1320

aacaccttcc caacgaagct caatccaaag actgtagtgc ataactggtt ggggggaggg 1380

gtttgtccaa aggccgttga tcaaggtttc agatgcattt tcagcaatca aggtgtttgg 1440

tatcttgacc atctagatgt cccttgggat gttacgtaca atgctgatcc acttgaagga 1500

atacatgatt cttccaagca aaagcttgtc ctgggaggtg aagtatgcat gtggggtgag 1560

actgctgatc catcaaatgt tcagcaaaca atatggcctc gagctgcagc agctgcagag 1620

cgcctgtgga gcacaaagga gtcgactact ggaaaaagta gtaacaaaac cgcgctacct 1680

cggctacact acttcagatg ccttttgaat aggcgtggag ttcaagccgc tccagttgaa 1740

aacttctatg ctcgaagtgc accaactggt gctggctcgt gttacgttca acatcatcat 1800

catcatcatt ga 1812

<210> 2

<211> 1932

<212> DNA

<213> 草莓(Fragaria×ananassa qing xiang)

<400> 2

atgagatttc cttcaatttt tactgctgtt ttattcgcag catcctccgc attagctgct 60

ccagtcaaca ctacaacaga agatgaaacg gcacaaattc cggctgaagc tgtcatcggt 120

tactcagatt tagaagggga tttcgatgtt gctgttttgc cattttccaa cagcacaaat 180

aacgggttat tgtttataaa tactactatt gccagcattg ctgctaaaga agaaggggta 240

tctctcgaga aaagatccat caatgtgtgg cccatgccaa gaaacttctc gtggcctcag 300

ccgcaggcca accccctctc ccctaatttc aacatcatat ccccagatca tcgctacctc 360

tcctccgccg ccaaacgcta ccagcatctt attctcaccg agcaccaccg ccccctggtg 420

aacccctcct cctccgtccg cctcaacact tctgctccgc cgctgctcag cctcgccatc 480

acagtttccg acctcaccgc tccgcttcac catggtgtgg acgagtcgta cacgcttacg 540

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ggtctcgaga cattgtcgca gctggtgtgg ggggatccgt cccttgtggc cgtgggggtg 660

tacgtgtggg actccccact gttcgggcac agagggctca tgcttgacac ttctaggaac 720

tactaccaag ttgaggattt gcttaggacc atcgaggcca tgagcgccaa taagctcaat 780

gtgttccatt ggcacatcac cgactcccat tctttcccgc tagtcgtgcc ttccgagcct 840

gaattggcct ccaaagggtc ctatggatct agtatgcagt actctcccgc tgatgtcacc 900

aagattgtcg agtttggttt ggagcatggt gtccgggttc tcccggaaat cgactcacct 960

ggccatacag gatcatgggc tgcagcctat cccgatatag tatcatgcgc aaatatgttc 1020

tggtggccag caggagctgt ctggggtgac cgactcgcgt ccgaaccagg aacaggacat 1080

ctaaatcctt tgaaccccaa gacctatcaa gtaatcaaaa acgttatcca tgacgtggcg 1140

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aaagcggatc caaccattca atccttctta tctaagggag gaactcttag tcagctactt 1260

gagctttttg tcaattccac attcccttac attgtatctc ataacaagac agtggtatac 1320

tgggaagacg tgttactaga tgataacatt aaggtgcaat catcagttct tcctcgagag 1380

agtaccatcc tacagacatg gaacaatgga cacaacaaca ctaaacgaat tgtgtcttct 1440

gggtaccgta caattgtgtc atcctcagat ttctactact tggattgtgg tcacggtgac 1500

tttcttggaa acgatagcat gtacgatcaa caaactccta gtcatgacac aaaaaatgga 1560

gggtcatggt gcgggccttt caaaacatgg caaaccatat ataattatga tattacatat 1620

ggtctaactg aggatgaggc taaattggta ttaggtggag aggtggcgct ttggtctgag 1680

caagcggatc caacagtttt ggatgcacga atttggccac gagcttcagc aatggcagag 1740

tcattgtggt caggtaaccg ggatgataaa ggtatgaaga gatttggaga ggcaactgat 1800

cgcttcaatg aatggaggag tagaattgtc gatagaggtg tcagagctga acctattcag 1860

ccactttggt gtattaggaa cccagggatg tgcaacacag ttaatgtggc tcatcatcat 1920

catcatcatt ga 1932

Claims (1)

1.氨基己糖苷酶编码基因在筛选草莓保鲜剂中的应用，其特征在于：具体为将氨基己糖氨酶的基因表达作为草莓保鲜剂的筛选指标，通过对所述氨基己糖氨酶基因的抑制作用情况，判断化合物的保鲜作用；

所述氨基己糖苷酶编码基因为氨基己糖苷酶基因β-Hex1或氨基己糖苷酶基因β-Hex2；

所述氨基己糖苷酶基因β-Hex1编码的氨基己糖苷酶氨基酸序列为序列表中SEQ IDNO.2所示的第86-597位氨基酸序列；

所述氨基己糖苷酶基因β-Hex2编码的氨基己糖苷酶氨基酸序列为序列表中SEQ IDNO.4所示的第86-637位氨基酸序列。

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