CN103952407A - 一种解除葡萄糖抑制效应的gal1启动子及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种解除葡萄糖抑制效应的GAI1启动子及其应用。本发明通过选择性删除GAI1启动子上的相关蛋白质结合位点，解除了葡萄糖对于半乳糖诱导效应的抑制，从而可以利用该游离质粒表达系统大规模生产外源目的蛋白，降低培养基成本，提高表达产量，缩短诱导时间。

Description

一种解除葡萄糖抑制效应的GAL1启动子及其应用

技术领域

本发明属于基因工程和生物技术领域，具体涉及一种解除葡萄糖抑制效应的GAL1启动子及其在生产牛乳铁蛋白抗菌肽LfcinB上的应用。

背景技术

抗菌肽是在诱导条件下, 生物体免疫防卫系统产生的小分子活性肽类，广泛分布于植物，动物以及人类。抗菌肽是由基因编码、由核糖体合成的。目前已经发现、鉴定的抗菌肽已超过千种，大多带净正电荷。从结构上看可以分为α-螺旋型、β-折叠型、富含二硫键的、富含脯氨酸的等多种类型。抗菌肽对革兰氏阴性及阳性细菌均有很强的杀灭作用，有些抗菌肽还可以特异性地抑制某些肿瘤细胞的生长。抗菌肽可以用于医药卫生、食品工业等方面。在医药卫生方面，抗菌肽与抗生素最大的不同之处在于抗菌肽的应用可以解决抗药性的问题。具有与抗生素完全不同杀菌机理的抗菌肽的应用或许可以为这些问题的解决提供途径。在食品工业上抗菌肽的应用主要是食品添加剂。抗菌肽的杀菌能力很强，并且对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌有广泛的杀菌作用，因此可以代替传统的食品防腐剂，起到保鲜作用。同时又由于它是一种肽，可以被消化道消化、吸收对人体无害。此外，抗菌肽在、畜牧业、农业等各个方都有十分广泛的应用。研究其大规模生产具有十分积极的意义。

 酿酒酵母在食品业使用有数千年的历史，也是生物学研究的模式生物之一。随着DNA重组技术的发展, 酿酒酵母已被广泛地应用于外源蛋白表达的宿主，其是真核生物，无内毒素，长久以来在食品和酿酒工业中广泛应用；胞外分泌表达蛋白，简化了表达产物的分离纯化。随着基因工程技术的发展，酿酒酵母已被广泛地应用于外源蛋白表达的宿主。酿酒酵母中参与半乳糖代谢的有关GAL基因的转录是被紧密调控的，它们在没有半乳糖的培养条件下不被表达；而在半乳糖存在条件下，其表达水平可提高约1000倍。GAL1可调控启动子是目前广泛使用的酵母菌可控性启动子表达系统之一。使用的最广泛的酵母启动子是GAL基因体系中的GAL1、GAL10和GAL7，这些启动子的表达受到半乳糖的高度诱导，但却严格被葡萄糖所阻遏。葡萄糖是一种直接可以被利用的单糖，也是一种代谢中间产物，可以直接进入糖酵解途径产生能量为生物体所利用；对很多生物来说葡萄糖也是一种优先被利用的碳源，而半乳糖并不能在高浓度葡萄糖存在时作为碳源同时被利用，因为代谢半乳糖有关酶的基因的表达受到葡萄糖的抑制，也就是所谓的“葡萄糖的抑制”现象。GAL1启动子的上游阻遏序列（URS）也是通过阻遏蛋白Mig1调节Gal4p的抑制作用。葡萄糖会引起由非磷酸化形式的Mig1介导的GAL基因的几乎完全转录抑制，关闭GAL1启动子的表达，从而有效地终止半乳糖的利用。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种解除葡萄糖抑制效应的pYES2质粒。

本发明的另一个目的在于提供上述质粒在生产牛乳铁蛋白肽LfcinB上的应用。

本发明所采取的技术方案是：

一种解除GAL1启动子葡萄糖抑制效应的方法，其是通过去除GAL1启动子的上游阻遏序列URS1而实现的。

所述GAL1启动子上游阻遏序列URS1的核苷酸序列为：TTAGCCTTATTT CTGGGGTAAT TAATC。

由上述方法制备得到的一种解除葡萄糖抑制效应的GAL1启动子。

一种解除葡萄糖抑制效应的pYES2质粒，其是通过去除pYES2质粒中的GAL1启动子的上游阻遏序列URS1所得。

一种在酵母细胞中表达牛乳铁蛋白抗菌肽LfcinB的重组质粒M-pYES2-α-LfcinB，其是通过在pYES2质粒中接入牛乳铁蛋白抗菌肽LfcinB基因序列和α信号肽基因序列、去除pYES2质粒中的GAL1启动子的上游阻遏序列URS1所得。

所述重组质粒M-pYES2-α-LfcinB的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示。

含有上述重组质粒M-pYES2-α-LfcinB的酿酒酵母宿主菌。

一种生产牛乳铁蛋白抗菌肽LfcinB的方法，包括如下步骤：

（1）将重组质粒M-pYES2-α-LfB转化酵母感受态细胞；

（2）诱导表达牛乳铁蛋白抗菌肽LfcinB。

步骤（2）的具体操作为：挑选单克隆接种于YPD完全培养基， 28～32℃，50～250 r/min震荡培养45～55h，离心，收集酵母菌，分别用含4%半乳糖的SC培养基和和SC- U诱导培养基悬浮，使菌液终浓度达到OD₆₀₀=0. 3～0.5，置于18～22℃， 150～250 r/min的摇床诱导3～5h。

本发明的有益效果是：含有重组质粒M-pYES2-α-LfcinB的酿酒酵母宿主菌在培养基中有葡萄糖存在的条件下能够高效、快速、稳定的分泌表达牛乳铁蛋白肽LfcinB，表达的抗菌肽LfcinB对大肠杆菌DH5α有很明显的抑菌效果。

附图说明

图1为M- pYES2-α-LfcinB基因的PCR产物的电泳图（M为DNA Marker，1为M- pYES2-α-LfcinB的PCR产物）；

图2为M- pYES2-α-LfcinB工程菌诱导上清对大肠杆菌DH5α抑菌活性检测图（其中，1为10μg 氨苄青霉素，2为诱导培养基200μl，3为未诱导的工程菌4h，200μl上清，4为重组质粒pYES2-α-LfcinB转化的工程菌诱导4h，200μl上清，5为重组质粒M- pYES2-α-LfcinB转化的工程菌诱导4h 200μl上清）；

图3 为改造后工程菌诱导上清Tricine-SDS-PAGE电泳图（其中，M为Protein Marker，1为诱导上清25ml，2为未诱导上清25ml）。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。

一、    表达载体pYES2- α的构建       

以pPICZαA质粒（购自Invitrogen公司）为模板，依照α -信号肽的DNA序列（如SEQ ID NO:1所示），按酿酒酵母的密码子偏好性设计合成1条上游引物和1条下游引物，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，序列如下：

P1：5′- CCC AAGCTT ACGATGAGATTTCCTTCAAT -3′（SEQ ID NO:2），

P2：5′- GC TCTAGA GAATTC AGCTTCAGCCTCTCTT -3′（SEQ ID NO:3）。

其中，斜体部分表示上游部分引入的Hind III限制性酶切位点，以及下游部分引入的Xba I和EcoR I限制性酶切位点。Hind III酶切位点和Xba I酶切位点是用于将α -信号肽插入pYES2质粒中。

PCR反应条件为：94℃预变性5 min之后，加入Taq酶，94℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，进行30个循环，最后72℃延伸10 min，4℃保存。设置阴性对照：用无菌水代替模板。反应结束后，取3 μl PCR产物，用1.0%的琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物。

将pYES2质粒和凝胶回收的α -信号肽分别进行双酶切，酶切产物经凝胶回收后用T4 DNA连接酶连接，连接产物转入E.coli DH5α感受态细胞后，氨苄青霉素筛选阳性克隆。经菌液PCR初步鉴定，PCR扩增所得的DNA片段条带单一，大小与预期设计结果一致。抽提质粒，经上海生工生物工程技术服务有限公司测序，确定构建的pYES2- α质粒序列正确。

二、    质粒pYES2-α-LfcinB的构建

1 、引物的设计与合成

根据牛乳铁蛋白肽的氨基酸序列及其在酿酒酵母中表达的密码子偏好性设计全长基因序列（如SEQ ID NO:4所示）以及引物如下：

P3：5’-CCGCTCGAGAAAAGATTTAAATGTAG-3’（SEQ ID NO:5）(下划线部分为Xho1酶切位点)；

P4：5’-GGAATTCTTAAAAAGCTCTTCTAACACAAG 3’ （SEQ ID NO:6）（下划线部分为EcoR1酶切位点）。

LfcinB基因序列及引物由上海生工生物工程有限公司合成。

2、LfcinB基因的扩增

以合成的LfcinB基因为模板，PCR扩增LfcinB基因，反应条件为：94℃ 变性5min；94℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸 60s，共30个循环；72℃再延伸10min。PCR产物经1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测，并回收纯化PCR产物。

3、重组表达质粒pYES2-α-LfcinB的构建

用普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目的基因片段，经EcoR1及Xho1双酶切后，与同样经EcoR1及Xho1双酶切的pYES2-α载体连接，获得重组质粒pYES2-α-LfcinB，转化感受态大肠杆菌DH5α，挑取单菌落，于37℃摇床过夜培养。提取质粒，双酶切鉴定，阳性克隆菌株送生工生物工程（上海）有限公司测序。测序结果经OMIGA生物学软件进行序列分析，并与GenBank中登录的目的基因的同源性进行比较。测序正确的质粒命名为pYES2-α-LfcinB。

三、重组质粒pYES2-α-LfcinB质粒的改造 

     以pYES2-α-LfcinB质粒为模板，根据URS1序列设计引物进行反向PCR：引物如下所示：

P5：5’- AAAACTAATCGCATTATCATCCTATGG -3’（SEQ ID NO:7）；

P6：5’- AGCGAAGCGATGATTTTTGATC -3’（SEQ ID NO:8）。

反应条件：94℃ 5min，94℃ 30s，57℃ 30s，18个循环，72℃ 12.5min，72℃ 10min，用Pfu DNA聚合酶催化反应。2%琼脂糖凝胶电泳鉴定反应产物，显示在目标位置有一条清晰的条带。胶回收该条带，然后对回收的DNA片段用T4多聚核苷酸激酶进行磷酸化，最后用T4 DNA连接酶连接，即得到改造的重组质粒M-pYES2-α-LfcinB，其核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示。本操作的的目的在于去除GAL1启动子的上游阻遏序列URS1：TTAGCCTTATTT CTGGGGTAAT TAATC（SEQ ID NO:10）。

四、重组质粒M-pYES2-α-LfcinB的扩增

将M-pYES2-α-LfcinB转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞：1、将制备好的感受态细胞置于冰中融化。2、转移100μl感受态细胞至灭菌处理的试管内。3、加入用于转化的DNA5ul。4、冰中放置30min，42℃放置45-60s，冰中放置2-3min。 5、加入预温好的液体LB培养基，37℃(60-225rpm)振荡培养1h，取适量涂布LB（AMP⁺）固体培养基中，37℃过夜培养。待转化成功后，挑取单克隆于LB（AMP⁺）液体培养基中，振荡培养12h，提取质粒，并测序。

五、改造的重组质粒转化酿酒酵母宿主菌

将重组质粒M- pYES2-α-LfB与制备好的INSc1酵母感受态细胞混合，加至电击杯轻敲杯体，擦干外壁，Bio-rad电转化仪调至真菌档PIC选项，电击，迅速加入500 μl山梨醇，混合均匀，涂布到SC-U平板上，30℃培养。

从SC-U平板上选5个单菌落做编号标记，用枪头挑取少量菌体加到PCR体系中，PCR引物：

P5：5’-AAAACTAATCGCATTATCATCCTATGG-3’（SEQ ID NO:7）；

P6：5’- AGCGAAGCGATGATTTTTGATC-3’（SEQ ID NO:8）。

反应条件：94℃ 5min，94℃ 30s，57℃ 30s，18个循环，72℃ 12.5min，72℃ 10min。1.2%琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物，筛选出阳性菌落。

   六、诱导表达及活性检测

挑选单克隆接种于YPD完全培养基，30℃，200r/min震荡培养48h， 4℃、3000rpm离心10 min，收集酵母菌，分别用含4%半乳糖的SC培养基和SC-U诱导培养基悬浮，使菌液终浓度达到OD₆₀₀=0.4，置于20℃，200r/min的摇床诱导。4h后取300 μl诱导菌液上清3000rpm离心6min，取200 μl上清加入牛津杯中。

对上述转化菌的未诱导菌液、以及未改造的重组质粒pYES2-α-LfcinB转化的工程菌的诱导菌液，以同样条件离心取上清做抑菌活性检测，检测结果见图2。结果表明，M- pYES2-α-LfB转化的工程菌经过4h的诱导有很强的抑菌活性，而未诱导菌液及未改造的菌株的菌液均未显示出活性。

用10%TCA沉淀目的蛋白，Tricine-SDS-PAGE检测（见图3），检测结果表明：在3.129 kD处有条明确的LfcinB诱导表达条带，而未诱导菌液在同一位置处没有条带，说明本实验成功解除了葡萄糖抑制，表达了LfcinB并且具有较高的产量。

<110>  广东希普生物科技股份有限公司

<120>  一种解除葡萄糖抑制效应的GAL1启动子及其应用

<130> 

<160>  10   

<170>  PatentIn version 3.5

 

<210>  1

<211>  267

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  1

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<210>  2

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<212>  DNA

<213>  人工序列

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<212>  DNA

<213>  人工序列

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<212>  DNA

<213>  人工序列

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gttagaagag ctttt                                                        75

 

 

<210>  5

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<212>  DNA

<213>  人工序列

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<212>  DNA

<213>  人工序列

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<212>  DNA

<213>  人工序列

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<212>  DNA

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<212>  DNA

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tgatagcgtt gatgattctt cattggtcag aaaattatga acggtttctt ctattttgtc     5040

tctatatact acgtatagga aatgtttaca ttttcgtatt gttttcgatt cactctatga     5100

atagttctta ctacaatttt tttgtctaaa gagtaatact agagataaac ataaaaaatg     5160

tagaggtcga gtttagatgc aagttcaagg agcgaaaggt ggatgggtag gttatatagg     5220

gatatagcac agagatatat agcaaagaga tacttttgag caatgtttgt ggaagcggta     5280

ttcgcaatgg gaagctccac cccggttgat aatcagaaaa gccccaaaaa caggaagatt     5340

gtataagcaa atatttaaat tgtaaacgtt aatattttgt taaaattcgc gttaaatttt     5400

tgttaaatca gctcattttt taacgaatag cccgaaatcg gcaaaatccc ttataaatca     5460

aaagaataga ccgagatagg gttgagtgtt gttccagttt ccaacaagag tccactatta     5520

aagaacgtgg actccaacgt caaagggcga aaaagggtct atcagggcga tggcccacta     5580

cgtgaaccat caccctaatc aagttttttg gggtcgaggt gccgtaaagc agtaaatcgg     5640

aagggtaaac ggatgccccc atttagagct tgacggggaa agccggcgaa cgtggcgaga     5700

aaggaaggga agaaagcgaa aggagcgggg gctagggcgg tgggaagtgt aggggtcacg     5760

ctgggcgtaa ccaccacacc cgccgcgctt aatggggcgc tacagggcgc gtggggatga     5820

tccactagta cgatgagatt tccttcaatt tttactgctg ttttattcgc agcatcctcc     5880

gcattagctg ctccagtcaa cactacaaca gaagatgaaa cggcacaaat tccggctgaa     5940

gctgtcatcg gttactcaga tttagaaggg gatttcgatg ttgctgtttt gccattttcc     6000

aacagcacaa ataacgggtt attgtttata aatactacta ttgccagcat tgctgctaaa     6060

gaagaagggg tatctctcga gaaaagagag gctgaagctt ttaaatgtag aagatggcaa     6120

tggagaatga aaaaattggg tgctccatct attacttgtg ttagaagagc tttt           6174

 

 

<210>  10

<211>  27

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  10

ttagccttat ttctggggta attaatc                                           27

Claims (9)

1.一种解除GAL1启动子葡萄糖抑制效应的方法，其是通过去除GAL1启动子的上游阻遏序列URS1而实现的。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述GAL1启动子上游阻遏序列URS1的核苷酸序列为：TT AGCCTTATTT CTGGGGTAAT TAATC。

3.一种解除葡萄糖抑制效应的GAL1启动子，其是由权利要求1或2所述的方法制备得到。

4.一种解除葡萄糖抑制效应的pYES2质粒，其是通过去除pYES2质粒中的GAL1启动子的上游阻遏序列URS1所得。

5.一种在酵母细胞中表达牛乳铁蛋白抗菌肽LfcinB的重组质粒M-pYES2-α-LfcinB，其是通过在pYES2质粒中接入牛乳铁蛋白抗菌肽LfcinB基因序列和α信号肽基因序列、去除pYES2质粒中的GAL1启动子的上游阻遏序列URS1所得。

6.根据权利要求5所述的重组质粒M-pYES2-α-LfcinB，其特征在于，所述重组质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示。

7.一种含有权利要求5或6所述重组质粒M-pYES2-α-LfcinB的酿酒酵母宿主菌。

8.一种生产牛乳铁蛋白抗菌肽LfcinB的方法，包括如下步骤：

（1）将权利要求5或6所述的重组质粒M-pYES2-α-LfB转化酵母感受态细胞；

（2）诱导表达牛乳铁蛋白抗菌肽LfcinB。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤（2）的具体操作为：挑选单克隆接种于YPD完全培养基， 28～32℃，50～250 r/min震荡培养45～55h，离心，收集酵母菌，分别用含4%半乳糖的SC培养基和和SC- U诱导培养基悬浮，使菌液终浓度达到OD₆₀₀=0. 3～0.5，置于18～22℃， 150～250 r/min的摇床诱导3～5h。